TWI408228B - 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法 - Google Patents
用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI408228B TWI408228B TW099137264A TW99137264A TWI408228B TW I408228 B TWI408228 B TW I408228B TW 099137264 A TW099137264 A TW 099137264A TW 99137264 A TW99137264 A TW 99137264A TW I408228 B TWI408228 B TW I408228B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- intein
- protein
- host cell
- sequence
- egfp
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 212
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 128
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 17
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 37
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 52
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 50
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 101800001661 Endonuclease PI-MtuI Proteins 0.000 claims description 4
- 101800002094 Mxe GyrA intein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010013829 alpha subunit DNA polymerase III Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 claims description 3
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 101150093191 RIR1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100302210 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RNR1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 claims description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 78
- 108010063679 ice nucleation protein Proteins 0.000 abstract description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 8
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 72
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 30
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 101150076598 dnaB gene Proteins 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 4
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 4
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 4
- 230000016434 protein splicing Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006910 ice nucleation Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006996 Aryldialkylphosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010008184 Aryldialkylphosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000806601 Homo sapiens V-type proton ATPase catalytic subunit A Proteins 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100037466 V-type proton ATPase catalytic subunit A Human genes 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 108010085318 carboxymethylcellulase Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical group [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- -1 silencers Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010082913 S-layer proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001224 bacterial fimbriae Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000033383 cell-cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical group 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- VXPLXMJHHKHSOA-UHFFFAOYSA-N propham Chemical compound CC(C)OC(=O)NC1=CC=CC=C1 VXPLXMJHHKHSOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
- C12Y305/02002—Dihydropyrimidinase (3.5.2.2), i.e. hydantoinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本發明是有關於用於生產一標的蛋白質(target protein)的核酸建構物(nucleic acid constructs)、重組型載體(recombinant vectors)以及方法，其中一用於表現一包含有冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)、內含肽(intein)以及該標的蛋白質的融合基因產物(fusion gene product)的融合基因序列(fusion gene sequence)被導入至一宿主細胞(host cell)內，藉此而使得該融合基因產物被展示在所形成的重組型宿主細胞的表面上。該標的蛋白質可以藉由誘導該內含肽自我-切割(self-cleave)而從融合基因產物被切出並且易於被分離以及純化。
隨著生物技術的快速發展，許多生命科學領域的研究已將焦點由基因轉向蛋白質，也因此蛋白質的分離以及純化已成為一項備受關注並且被深入研究的技術。近年來，已有各種蛋白質分離以及純化技術被發展出，然而蛋白質會因為來源[例如，微生物發酵液(microbial fermented broth)、植物細胞、動物細胞、尿液(urine)以及血液(blood)]的差異而含有不同的雜質以及蛋白質濃度，這使得現有的蛋白質分離以及純化操作程序存在有不同程度的困難度與複雜性。
為了簡化蛋白質分離以及純化的操作程序，現今的蛋白質工程大多利用基因重組技術來生產一具有一感興趣之標的蛋白質以及一被添加至該標的蛋白質之N-或C-端的親和性標幟(affinity tag)的融合蛋白質。所得到的融合蛋白質可藉由親和性層析法(affinity chromatography)來進行回收，但是親和性層析法所使用的親合性管柱(affinity column)相當昂貴，僅適用於小規模的生產。此外，為了收取標的蛋白質，通常會在親和性標幟與標的蛋白質之間加入一蛋白酶切割位址(protease cleavage site)[諸如，因子Xa切割位址(factor Xa cleavage site)或菸草蝕紋病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶位址]，繼而利用對該蛋白酶切割位址具有特異性的蛋白酶(諸如，因子Xa蛋白酶或TEV蛋白酶)來切除親和性標幟。然而，蛋白酶的價格十分昂貴並且移除蛋白酶所涉及的步驟較為繁雜，此種分離以及純化標的蛋白質的方法並不符合經濟效益。
由於重組型蛋白質的生產攸關生技工業的產業競爭力，如何降低重組型蛋白質的生產成本、簡化生產作業程序並且提高蛋白質產量已成為生物技術產業上的一個亟待努力的研發方向。
內含肽(intein)是一種自催化的蛋白質剪接以及切割要素(autocatalytic protein splicing and cleavage element)，自從在啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae
)中首次被發現之後，至今已有約100種內含肽在真細菌(eubacteria)、古菌(archea)以及真核單細胞生物(eukaryotic unicellular organisms)中被鑑定出。
蛋白質剪接以及切割皆為轉譯後加工處理事件(posttranslational processing events)。蛋白質剪接主要是將內含肽從一前驅物蛋白質(precursor protein)切出，繼而將分別位於該內含肽的N-端處以及C-端處的N-外顯肽(N-extein)以及C-外顯肽(C-extein)接合在一起。蛋白質切割(protein cleavage)可被區分為N-端切割反應(N-terminal cleavage reaction)以及C-端切割反應(C-terminal cleavage reaction)，其中N-端切割反應意指將N-外顯肽從前驅物蛋白質切出，而C-端切割反應意指將C-外顯肽從前驅物蛋白質切出。當一標的蛋白質呈融合至內含肽的形式被生成時，可以藉由加入親核劑(nucleophilic agents)[諸如硫醇(thiols)]或者透過pH以及溫度的調動(shift)而造成蛋白質剪接或切割，藉此可以在無需使用到蛋白酶的情況下獲得該標的蛋白質。
內含肽已成為一種用於純化蛋白質的強力工具，它的一個商業化產品是IMPACTTM
-CN系統(IMPACTTM
-CN system)(NEW ENGLAND BioLabs Inc.,USA,Cat. No. E6900S)。IMPACTTM
-CN系統主要是將一標的蛋白質融合至一可自我切割的內含肽標幟(self-cleavable intein tag)[由一源自於啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae
)的VMA1內含肽以及一幾丁質結合領域(chitin binding domain,CBD)所構成]，藉此而生成一融合前驅物(fusion precursor)。接著，所生成的融合前驅物藉由使用一含有幾丁質珠粒(chitin beads)的幾丁質管柱(chitin column)而被分離出。最後，在硫醇[諸如二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)或半胱胺酸(cysteine)]的存在下，令該融合前驅物中的VMA1內含肽進行自我-切割，而使得該標的蛋白質從該融合前驅物中被釋放。IMPACTTM
-CN系統必須使用價格昂貴的幾丁質管柱而造成純化過程中耗費的成本過高，且管柱製程在規模放大(scale up)上有所限制，並不適合使用於工業上大量生產，因此不符合經濟效益。
近年來，微生物細胞-表面展示系統(microbial cell-surface display system)逐漸受到矚目，並且已被廣為應用在活性疫苗發展(live vaccine development)、肽存庫篩選(peptide library screening)、使用全細胞生物催化劑(whole cell biocatalyst)的生物轉化(bioconversion)以及生物吸附(bioadsorption)等方面。微生物細胞-表面展示系統主要是由載體蛋白(carrier protein)[又被稱為定位要素(anchoring motifs)]、過客蛋白(passenger protein)(亦即，標的蛋白質)以及宿主(host)所組成。一般而言，載體蛋白通常是與訊息轉導(signal transduction)、表面接附(surface adherence)、細胞-細胞辨識(cell-cell recognition)、免疫反應(immunoreaction)以及用於分子輸送之離子通道(ion channels for molecule transportation)有關的細胞表面蛋白(cell surface proteins)。常見的載體蛋白包括細菌繖毛(bacterial fimbriae)、S-層蛋白(S-layer proteins)、冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)以及某些外膜蛋白(outer membrane proteins)(Sang Yup Leeet al.
(2003),TRENDS in Biotechnology
,21:45-52；Po-Hung Wuet al.
(2006),Biotechnology and Bioengineering
,95:1138-1147)。標的蛋白質可以藉由N-端融合(N-terminal fusion)、C-端融合(C-terminal fusion)或夾心式融合(sandwich fusion)的方式與載體蛋白融合而形成一融合蛋白質，當該融合蛋白質被表現時，該標的蛋白質會與載體蛋白一起被展示於宿主細胞的表面上。
在各種已知的蛋白質分離與純化技術當中，利用微生物細胞-表面展示系統來生產蛋白質不僅可以簡化生產流程，還能夠降低生產成本，因而已被認為具有可供應用於蛋白質工程領域上的潛力。例如，US 2005/0015830 A1揭示一種在一植物中或者在植物細胞中生產一感興趣之蛋白質或多肽的方法，其包括：(i)將一植物或植物細胞轉形(transforming)或轉染(transfecting)以一具有一編碼一融合蛋白質的編碼區域的核苷酸序列(nucleotide sequence)，該融合蛋白質包含有該感興趣之蛋白質或多肽、一用於將該融合蛋白質標靶至非原生質體(apoplast)的訊號肽(signal peptide)，以及一能夠將該融合蛋白質結合至一細胞壁組。分(cell wall component)的多肽；(ii)增富(enriching)具有被表現以及被結合的融合蛋白質的細胞壁組分；以及(iii)分離該感興趣之蛋白質或多肽，或者一包含有該感興趣之蛋白質或多肽的蛋白質。特別地，該感興趣之蛋白質或多肽可含有一或多個親和性肽標幟(affinity peptide tag)(例如，內含肽或其部分)。依據此件美國專利早期公開案的說明書，該步驟(iii)涉及至少一肽鍵的切割，因此，該融合蛋白質可進一步包含有一容許該融合蛋白質切割的切割序列(cleavage sequence)，其中該融合蛋白質切割可以藉由內含肽-媒介的切割(intein-mediated cleavage)而被達致。然而，植物細胞的培養較為不易，還必須進行增富步驟來提高具有被表現以及被結合的融合蛋白質的細胞壁組分的濃度，且經由分離所得到的蛋白質並非純質的感興趣之蛋白質或多肽而含有其他組份(例如，訊號肽)。因此，該件美國專利早期公開案較不利於應用在快速、大量且價廉地生產感興趣的蛋白質。
TW I304810揭示一種以油體為基礎的蛋白質純化方法(oil body-based purification of proteins)，其包括下列步驟：(a)製備一多肽，其包含一結合油體之油膜蛋白質(oleosin)、一連接至該油膜蛋白質的內含肽以及一連接至該內含肽的目標多肽，該內含肽為Mxe
GyrA或Ssp
DnaB；(b)將該多肽與油體混合而產生油體混合物；(c)將油體混合物從其餘細胞萃取物之碎片分離；(d)將該目標多肽從油體混合物中切割出來；以及(e)將該目標多肽從其餘油體混合物中分離。依據該件台灣專利案的說明書，該油膜蛋白質被使用作為載體蛋白，而內含肽可以是Mxe
GyrA內含肽。然而，該件台灣專利案必須額外添加液態油(liquid oil)作為油體供用於進行混合及萃取分離，不但提高了程序操作的複雜度，也徒增油脂原料成本及後續分離油體的步驟。
冰核蛋白是一種源自於冰核活性細菌(ice-nucleation active bacteria)[如假單胞菌屬(Pseudomonas
)、黃桿菌屬(Xanthomonas
)以及伊文氏桿菌屬(Erwinia
)]的細胞膜-結合的蛋白質(membrane-bound protein)，它會在過冷的水(supercooled water)中催化冰的形成(formation of ice)並且對植物造成霜害(frost injury)。冰核蛋白主要是由下面3種不同的結構領域(structural domains)所組成：(1)會與外膜的磷脂質部分(phospholipid moiety)交互作用的特異性N-端區域(specific N-terminal region) INPN；(2)高度親水性(highly hydrophilic)並且被暴露於最外層膜的C-端領域(C-terminal domain) INPC；以及(3)作用有如冰成核作用(ice nucleation)的模版(template)的中央領域(central domain)。目前冰核蛋白已成功地藉由C-端融合而作為載體蛋白被用來展示左聚糖蔗糖酶(levansucrase)、羧甲基纖維素酶(carboxymethylcellulase,CMCase)、類凝血酶(salmobin)以及有機磷水解酶(organophosphorus hydrolase,OPH)(Sang Yup Leeet al.
(2003)，同上述；Po-Hung Wuet al
.(2006)，同上述)。
基於在蛋白質工程領域上對於大量生產重組型蛋白質仍存在有一個需求，若能以冰核蛋白作為微生物細胞-表面展示系統的載體蛋白，同時利用內含肽能夠進行自我-切割的特性來發展出一種無需添加額外成分，僅藉由離心而以高效率、低成本的方式來生產一所欲的標的蛋白質的方法，將會是吾人所企望達成的。
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於生產一標的蛋白質的方法，其包括：將一用於表現一包含有冰核蛋白、內含肽以及該標的蛋白質的融合基因產物的融合基因序列導入至一宿主細胞內，其中該融合基因序列沿著一轉錄方向依序地包含有下列編碼區域：
(i) 一編碼冰核蛋白的第一編碼區域；
(ii) 一編碼內含肽的第二編碼區域；以及
(iii)一編碼該標的蛋白質的第三編碼區域；將所形成的重組型宿主細胞培養於一適於該融合基因序列表現的培養條件下，俾以容許該融合基因產物被展示在該重組型宿主細胞的表面上；對該重組型宿主細胞進行一處理，俾以誘導該內含肽進行自我-切割，而使得該標的蛋白質從該融合基因產物中被切出並且被釋放至細胞外；以及收穫被釋放的該標的蛋白質。
在第二個方面，本發明提供一種編碼一包含有冰核蛋白、內含肽以及一標的蛋白質之融合蛋白質的核酸建構物，它包含有一沿著一轉錄方向依序地包含有下列編碼區域(coding regions)的核酸序列：
(i) 一編碼冰核蛋白的第一編碼區域；
(ii) 一編碼內含肽的第二編碼區域；以及
(iii) 一編碼該標的蛋白質的第三編碼區域。
在第三個方面，本發明提供一種重組型載體，其包含有一如上所述的核酸建構物。
在第四個方面，本發明提供一種用於生產一標的蛋白質的重組型宿主細胞，它是藉由以一如上所述的重組型載體來轉形一宿主細胞而被生成的。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。
如本文中所用的，術語“標的蛋白質(target protein)”意指一感興趣的蛋白質(protein of interest)，它是要被分離以及純化的對象(subject)。
如本文中所用的，術語“冰核蛋白(ice nucleation protein)”意指具有全長序列(full-length sequences)的冰核蛋白與含有N端和C端-領域截短的部分(N terminal and C terminal domains-truncated portions)(亦即INPNC)、帶有5個額外內部重複單元(internal repeating units)的INPNC或冰核蛋白的N領域(亦即，INPN)，以及帶有2個額外內部重複單元的INPN。關於可供應用於本發明中的冰核蛋白，可以參考，例如Po-Hung Wuet al
.(2006),Biotechnology and Bioengineering
,95:1138-1149。
如本文中所用的，術語“基因(gene)”意指一DNA序列，包括但不限於：一可被轉錄成mRNA[它可被轉譯成多肽鏈(polypeptide chains)]、被轉錄成rRNA或tRNA，或者供酵素以及其他涉及DNA複製(DNA replication)、轉錄(transcription)以及調節(regulation)的蛋白質作為辨識位址(recognition sites)的DNA序列。這個定義包括各種不同的序列多型性(sequence polymorphisms)、突變和/或序列變異體(sequence variants)，其中該等改變(alternation)不會影響基因產物(gene product)的功能。該術語“基因(gene)”被意欲包括不只編碼基因產物的區域還有調節區域包括，例如：啟動子、終止區域(termination regions)、轉譯調節序列(translational regulatory sequences)[諸如，核糖體結合位址以及內部核糖體進入位址(internal ribosome entry sites)]、增強子(enhancers)、默化子(silencers)、絕緣子(insulators)、邊界要素(boundary elements)、複製源點(replication origins)、基質附著位址(matrix attachment sites)，以及基因座控制區域(locus control regions)。該術語“基因”進一步包括所有插入子(intron)以及其他被剪接自mRNA轉錄本(mRNA transcripts)的DNA序列，還有由選擇性剪接位址(alternative splice site)所導致的變異體。該術語“基因(gene)”包括，但不限於：結構基因(structural genes)、免疫基因(immunity genes)以及分泌(輸送)基因[secretory(transport)genes]。
如本文中所用的，術語“融合基因(fusion gene)”意指一DNA節段(DNA segment)，其中兩個或多個基因被融合在一個單一開放閱讀架構內以用於編碼兩個或多個藉由一或多個肽鍵(peptide bond)而被結合的蛋白質。而如本文中所用的，術語“融合基因產物(fusion gene product)”以及“融合蛋白質(fusion protein)”可被交替地使用，並且意指由一融合基因所編碼的蛋白質以及多肽。
“細胞”、“宿主細胞”、“轉形宿主細胞(transformed host cell)”以及“重組型宿主細胞(recombinant host cell)”等術語可被互換使用，而且不僅指特定的個體細胞(individual cells)還包括繼代培養的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。子代細胞可能在後續世代中因為突變作用或環境影響而發生特定的遺傳修飾(genetic modification)，而致使子代細胞事實上可能與母細胞並不相一致，但子代細胞仍被涵蓋在本文中所用的術語的範疇內。
如本文中所用的，術語“轉錄方向(transcription direction)”意指核苷酸由5’到3’加入至新生之RNA轉錄本(nascent RNA transcripts)的方向。
如本文中所用的，術語“編碼區域(coding region)”意指核苷酸序列，它編碼由於一mRNA分子的轉譯而在新生多肽(nascent polypeptide)中被發現到的胺基酸序列。
如本文中所用的，“核酸(nucleic acid)”或“核酸序列(nucleic acid sequence)”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且包含已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(aritificial chemical mimics)。
如本文中所用的，術語“重組型載體(recombinant vector)”以及“表現載體(expression vector)”可被交換地使用，並且意指任一種重組型表現系統，它可於活體外(in vitro
)或活體內(in vivo
)，在任一種勝任的宿主細胞(competent host cell)內組成地(constitutively)或可誘導地(inducibly)表現一被選定的核酸序列。該重組型載體可為一線性或環形表現系統，且涵蓋保持游離基因(episomal)形式或是被整合至宿主細胞的基因組內的表現系統。該重組型表現系統可具有或不具有自我複製的能力，它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。
如本文中所用的，術語“啟動子(promoter)”可與術語“啟動子序列(promoter sequence)”交替地使用，並且意指一DNA序列，其通常是位在一DNA聚合物內所存在的一個基因之前方，並且提供一用於起始該基因的轉錄以生成mRNA的位址(site for initiation of the transcription of said gene into mRNA)。適用於本發明的啟動子序列可以是一組成性啟動子(constitutive promoter)或是一可誘導的啟動子(inducible promoter)。
如本文中所用的，術語“上游(upstreamm)”以及“下游(downstream)”意指核苷酸序列的一要素的位置。“上游”表示一個要比參考要素(reference element)更加5’的要素。“下游”表示一個要比參考要素更加3’的要素。
如本文中所用的，術語“轉形(transformation)”可與術語“轉染(transfection)”交替地使用，並且泛指將一核酸分子引入一選定的宿主細胞內的方式。依據本技藝中已知的技術，一核酸分子(例如，一重組型DNA建構物或一重組型載體)可藉由多種技術而被引入至一選定的宿主細胞內，例如磷酸鈣或氯化鈣媒介的轉染作用(transfection)、電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞擊法(particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用(liposome-mediated transfection)、利用細菌噬菌體的轉染作用或其他方法。
隨著生命科學領域的研究焦點由基因轉往蛋白質，蛋白質的分離以及純化已成為一項備受關注並且被深入研究的技術。然而，現今用於蛋白質分離以及純化的操作程序普遍耗時過久且效率不佳，不適合應用在學術研究以及大量生產。因此，若能以高效率、低成本的方式來生產一標的蛋白質，咸信將有助於提升學術研究發展以及蛋白質工程產業的競爭力。
於是，本發明提供一種用於生產一標的蛋白質的方法，其包括：將一用於表現一包含有冰核蛋白、內含肽以及該標的蛋白質的融合基因產物的融合基因序列導入至一宿主細胞內，其中該融合基因序列沿著一轉錄方向依序地包含有下列編碼區域：
(i) 一編碼冰核蛋白的第一編碼區域；
(ii) 一編碼內含肽的第二編碼區域；以及
(iii) 一編碼該標的蛋白質的第三編碼區域；將所形成的重組型宿主細胞培養於一適於該融合基因序列表現的培養條件下，俾以容許該融合基因產物被展示在該重組型宿主細胞的表面上；對該重組型宿主細胞進行一處理，俾以誘導該內含肽進行自我-切割，而使得該標的蛋白質從該融合基因產物中被切出並且被釋放至細胞外；以及收穫被釋放的該標的蛋白質。
如本文中所用的，術語“培育(cultivation)”、“培育(cultivating)”以及“培養(culturing)”可被交替地使用。
依據本發明，該第二編碼區域所編碼的內含肽是選自於下列所構成的群組：S
sp DnaB內含肽、S
sp DnaE內含肽、Mxe
GyrA內含肽、VMA內含肽、Mtu
RecA內含肽、P
sp Pol-I內含肽、PI-pful內含肽、PI-pfull內含肽以及Mth
RIRl內含肽。在本發明的一個較佳具體例中，該第二編碼區域編碼S
sp DnaB內含肽。
依據本發明，該融合基因序列的導入包含下列步驟：構築一可於該宿主細胞內表現並且包含有該融合基因序列的重組型載體；以及將該重組型載體輸送至該宿主細胞內。
依據本發明，該重組型載體進一步包含有一啟動子序列，該啟動子序列坐落在該融合基因序列的上游處用以控制該融合基因序列的表現。較佳地，該啟動子序列是選自於下列所構成的群組：T7啟動子、T5啟動子以及lac
啟動子。在本發明的一個較佳具體例中，該啟動子序列是T7啟動子。
依據本發明，該重組型宿主細胞的處理包含下列步驟：收取該重組型宿主細胞；以及在一第一溫度下培育所收取的該重組型宿主細胞歷時一段時間，其中該第一溫度不同於一適於該融合基因產物表現的第二溫度。
在本發明的一個較佳具體例中，該第一溫度是落在15~37℃的範圍內，而該第二溫度是落在18~37℃的範圍內。較佳地，該第一溫度為37℃，而該第二溫度為25℃。
依據本發明，該重組型宿主細胞的處理包含下列步驟：收取該重組型宿主細胞；以及在一第一pH值下培育所收取的該重組型宿主細胞歷時一段時間，其中該第一pH值不同於一適於該融合基因序列表現的第二pH值。
在本發明的一個較佳具體例中，該第一pH值是落在6~10的範圍內，而該第二pH值是落在6~8.5的範圍內。較佳地，該第一pH值是落在8~10的範圍內，而該第二pH值為7。
在本發明的一個較佳具體例中，該宿主細胞是大腸桿菌細胞(Escherichia coli
cell)。
本發明亦提供一種可供用於上述方法的實施的核酸建構物，它包含有一沿著一轉錄方向依序地包含有下列編碼區域的核酸序列：
(i)一編碼冰核蛋白的第一編碼區域；
(ii)一編碼內含肽的第二編碼區域；以及
(iii)一編碼該標的蛋白質的第三編碼區域。
較佳地，該第二編碼區域所編碼的內含肽是選自於下列所構成的群組：S
sp DnaB內含肽、S
sp DnaE內含肽、Mxe
GyrA內含肽、VMA內含肽、Mtu
RecA內含肽、P
sp Pol-I內含肽、PI-pful內含肽、PI-pfull內含肽以及Mth
RIR1內含肽。在本發明的一個較佳具體例中，該第二編碼區域編碼S
sp DnaB內含肽。
依據本發明，該核酸建構物進一步包含有一啟動子序列，該啟動子序列坐落在該核酸序列的上游處用以控制該核酸序列的表現。較佳地，該啟動子序列是選自於下列所構成的群組：T7啟動子、T5啟動子以及lac
啟動子。在本發明的一個較佳具體例中，該啟動子序列是T7啟動子。
本發明亦提供一種重組型載體，其包含有一如上所述的核酸建構物。
依據本發明，該重組型載體進一步包含有下列至少一者：一抗生素-抗性.基因(an antibiotic-resistance gene)、一增強子序列(an enhancer sequence)、一聚腺苷酸化位址(a polyadenylation site)以及一調節序列(a regulatory sequence)。較佳地，該重組型載體進一步包含有一抗生素-抗性基因。在本發明的一個較佳具體例中，該抗生素-抗性基因是康那黴素-抗性基因(kanamycin-resistance gene)。
本發明亦提供一種用於生產一標的蛋白質的重組型宿主細胞，它是藉由以一如上所述的重組型載體來轉形一宿主細胞而被生成的。在本發明的一個較佳具體例中，該重組型宿主細胞是大腸桿菌細胞。
較佳實施例之詳細說明本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
1.本發明中所採用的實驗方法以及用於DNA選殖(DNA cloning)的相關技術，是參考本技藝中所詳知的教科書：Sambrook J,Russell DW(2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，例如使用限制酶(restriction enzymes)的DNA切割反應(DNA cleavage reaction)、使用T4 DNA接合酶的DNA接合作用(DNA ligation with T4 DNA ligase)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)、硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)以及質體轉形(plasmid transformation)等，而這些技術都是熟悉此項技術人士可根據本身的專業素養來實施者。
2.下面實施例中所使用的LB肉湯培養基(LB broth)是購自於Scharlau Chemie。
3.下面實施例中所使用的限制酶Eco
RI以及Xho
I是購自於New England Biolabs,Inc.。
4.下面實施例中被使用來進行聚合酶鏈反應的引子是由源資國際生物科技股份有限公司(Tri-I Biotech,Inc.)所合成。
5.下列實驗材料是購自於吉恩馬克(GENEMARK)：凝膠洗提套組(Gel Elution Kit)(Cat. No. DP03)；pOSI-T PCR選殖套組(pOSI-T PCR Cloning kit)(Cat. No. OS-01)，包含有pOSI-T載體(pOSI-T vector)[3,313 bps，它帶有Lac啟動子(Lac promoter,Plac
)以及康那黴素-抗性開放閱讀架構(Kanamycin-Resistance ORF)]；以及Plasmid Miniprep純化套組II(Plasmid Miniprep Purification Kit II)(Cat. No. DP01)。
6. 下列實驗材料是購自於Epicentre Technologies：T4 DNA 接合酶(T4 DNA ligase)、10X反應緩衝液以及ATP溶液(ATP solution)。
7. 質體pJO1-OSP1(5,297 bps)是由國立中興大學曾志正教授所提供，它具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列，並且帶有一編碼一DnaB內含肽(DnaB intein)的集胞藻屬物種dnaB
基因(Synechocystis
spdnaB
gene,S
spdnaB
gene)；質體pInaXNCl-aglA2(8,132 bps)是由國立清華大學吳文騰教授(Po-Hung Wuet al
.(2006),Biotechnology and Bioengineering
,95:1138-1149)所提供，它具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列，並且帶有一編碼一截短的冰核蛋白(truncated INP，下稱INPNC)[它是由冰核蛋白的N端領域(N terminal domain)以及C端領域(C terminal domain)所構成]的ina
NC基因；而質體pEGFP(3,355 bps)是購自於Clontech Laboratories,Inc.，它具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列，並且帶有lac
啟動子(lac
promoter,P lac
)、增強的綠色螢光蛋白質(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因、多重選殖位址(Multiple Cloning Site,MCS)、胺苄青黴素抗性基因(ampicillin resistance gene,Ampr
)以及限制酶Eco
RI切割位址(restriction enzymeEco
RI cutting site)。
8. 下面實施例中所使用的大腸桿菌DH5α(Escherichia coli
DH5α)是購自於Gibco BRL，而大腸桿菌DH1(DE3)是購自於Life Technologies。
9.勝任大腸桿菌細胞的製備(preparation of competentE
.coli
cells)：首先，將選定的大腸桿菌接種至LB肉湯培養基中，並於37℃下以150 rpm進行震盪培養過夜。之後，吸取800 μL的隔夜培養物(overnight culture)至40 mL的新鮮LB肉湯培養基中，並於37℃下以150 rpm進行震盪培養。當所形成的培養物的細胞密度到達大約0.2~0.4(OD600
)時，將培養物吸取至無菌離心管中，繼而於4℃下以5,000 rpm來進行離心歷時10分鐘。之後，倒除上清液並加入20 mL的冰冷氯化鈣(CaCl2
)(0.1 M)以充份懸浮菌體，藉此而得到一懸浮液。接著，將所得到的懸浮液靜置於冰上歷時1小時，繼而在4℃下以5,000 rpm來進行離心歷時10分鐘。之後，倒除上清液並加入4 mL的冰冷氯化鈣[0.1 M，含有15%甘油(glycerol)]以充份懸浮菌體，藉此而得到一含有經氯化鈣處理的勝任大腸桿菌細胞(CaCl2
-treated competentE
.coli
cell)的懸浮液。最後，將所得到的含有勝任大腸桿菌細胞的懸浮液分裝至微量離心管(每管100 μL)並且保存於-80℃下備用。
10.轉形(transformation)：將上面第9項當中所得到之分裝有勝任大腸桿菌細胞懸浮液的微量離心管從-80℃下取出並置於冰上歷時至少15分鐘，使得該勝任大腸桿菌細胞懸浮液被解凍。接著，在無菌操作台上，將選定的質體與勝任大腸桿菌細胞懸浮液混合均勻，繼而置於冰上歷時1小時。之後，將所形成的混合物置於42℃水浴下歷時2分鐘，繼而將該混合物轉移至冰上靜置歷時5分鐘。接著，將200 μL的LB肉湯培養基加入至該混合物中並予以混合均勻，繼而於37℃下以150 rpm進行震盪培養歷時1小時。之後，將所形成的培養物塗佈於含有50 μg/mL康那黴素(kanamycin)的固態瓊脂培養盤(solid agar plates)上，並於37℃下培養歷時12至16小時。
dnaB
-egfp
DNA片段包含有經融合的完整的S
spdnaB
基因以及完整的egfp
基因，它的構築過程如圖1所示並且被詳細說明如下。
根據質體pJO1-OSP1(它具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列)的S
spdnaB
基因(在核苷酸殘基位置4578至5057處)，以及質體pEGFP(它具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列)的egfp
基因(在核苷酸殘基位置289至1008處)而分別設計出如下面表1中所示的4個引子。
以質體pJO1-OSP1作為模版(template)，並且以上面表1中所示的Int F引子以及Int-EGFP R引子來進行使用下面表2中所示之反應條件的聚合酶鏈反應，藉此而擴增出一個含有完整的Ssp dnaB
基因以及部分的egfp
基因的PCR產物(505 bp)。
於完成PCR之後，該PCR產物是藉由1.2%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來確認分子量大小的正確性。接著，經確認的PCR產物藉由使用凝膠洗提套組而從瓊脂糖凝膠中被純化與回收。
另外，以質體pEGFP作為模版，並且以上面表1中所示的Int-EGFP F引子以及EGFP R引子來進行使用下面表3中所示之反應條件的聚合酶鏈反應，藉此而擴增出一個含有完整的egfp
基因以及部分的S
spdnaB
基因的PCR產物(747 bps)。
於完成PCR之後，該PCR產物是藉由1.2%瓊脂糖凝膠電泳來確認分子量大小的正確性。接著，經確認的PCR產物藉由使用凝膠洗提套組而從瓊脂糖凝膠中被純化與回收。
將經回收之含有完整的S
spdnaB
基因與部分的egfp
基因的PCR產物以及含有完整的egfp
基因與部分的S
spdnaB
基因的PCR產物分別溶於經滅菌的ddH2
O中，並且以上面表1中所示的Int F引子以及EGFP R引子來進行使用下面表4中所示之反應條件的聚合酶鏈反應，藉此而得到一個含有經融合的S
spdnaB
基因與egfp
基因的dnaB
-egfp
DNA片段(1,218 bps)，其中，依據PCR引子的設計，在S
spdnaB
基因的上游處(5’方向)被加有一個Eco
RI切割位址(在核苷酸殘基位置4至9處，gaattc)，而在egfp
基因的下游處(3’方向)被加有一個Xho
I切割位址(在核苷酸殘基位置1,210至1,215處，ctcgag)。
於完成PCR之後，該dnaB-egfp
DNA片段是藉由1.2%瓊脂糖凝膠電泳來確認分子量大小的正確性。接著，經確認的dnaB-egfp
DNA片段藉由使用凝膠洗提套組而從瓊脂糖凝膠中被純化與回收。
在本實施例第A項當中所得到的dnaB-egfp
DNA片段依據製造商的操作指南使用pOSI-T PCR選殖套組而被併入至pOSI-T載體(pOSI-T vector)中，藉此而得到一重組型載體pT-INT-EGFP。接著，選用大腸桿菌DH5α並依據上面“一般實驗材料與方法”的「9.勝任大腸桿菌細胞的製備」當中所述的方法來製備出勝任大腸桿菌DH5α細胞(competentE. coli
DH5α cells)。之後，依據上面“一般實驗材料與方法”的「10.轉形」當中所述的方法，勝任大腸桿菌DH5α細胞以該重組型載體pT-INT-EGFP來轉形並予以培養，藉此而得到大腸桿菌轉形株(E. coli
transformants) DH5α/pT-INT-EGFP。
之後，以白金勾環沾取固態瓊脂培養盤上的抗-康那黴素菌落(kanamycin-resistant colonies)，繼而以白金勾環上所沾取到的菌體的染色體DNA(genomic DNA)作為模版，並且以上面表1中所示的Int F引子以及EGFP R引子來進行使用上面表4中所示之反應條件的聚合酶鏈反應，藉此而擴增出一含有dnaB-egfp
DNA片段的PCR產物(1,218 bp)。接著，該PCR產物藉由1.2%瓊脂糖凝膠電泳來確認分子量大小的正確性。
之後，由固態瓊脂培養盤上挑出經瓊脂糖凝膠電泳確認的抗-康那黴素菌落並予以接種至含有50 μg/mL康那黴素的LB肉湯培養基內，繼而於37℃下進行培養歷時16小時。之後，收取培養物並使用Plasmid Miniprep純化套組II來抽取重組型載體pT-INT-EGFP。該重組型載體pT-INT-EGFP是委託源資國際生物科技股份有限公司來進行定序分析，而被證實帶有一具有如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列的dnaB-egfp
融合基因(dnaB-egfp
fusion gene)。
使用限制酶Eco
RI以及Xho
I來切割從本實施例第B項中所得到的重組型載體pT-INT-EGFP，而得到一個含有dnaB
-egfp
融合基因的DNA片段(1,206 bp)。此外，使用限制酶Eco
RI以及Xho
I來切割載體pInaXNC-aglA2，而得到一個含有ina
NC基因的DNA片段(6,033 bp)。之後，將該含有dnaB
-egfp
融合基因的DNA片段以及該含有ina
NC基因的DNA片段[莫耳比(molar ratio)=1：1]加入至微量離心管中，繼而加入0.5 μL的T4 DNA接合酶(2U/μL)、2 μL的10X反應緩衝液以及0.5 μL的25 mM ATP溶液並予以混合均勻，最後加入滅菌的ddH2
O至總體積為20 μL。然後，於16℃下進行接合反應歷時16小時，繼而置於70℃的乾浴(dry bath)中歷時5~10分鐘以完成接合反應，藉此而得到重組型載體pINPNC-INT-EGFP。
之後，選用大腸桿菌DH1(DE3)並依據上面“一般實驗材料與方法”的「9.勝任大腸桿菌細胞的製備」當中所述的方法來製備出勝任大腸桿菌DH1(DE3)細胞(competentE. coli
DH1(DE3) cells)。接著，依據上面“一般實驗材料與方法”的「10.轉形」當中所述的方法，勝任大腸桿菌DH1(DE3)細胞以該重組型載體pINPNC-INT-EGFP來轉形並予以培養，藉此而得到大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP。所得到的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的重組型載體pINPNC-INT-EGFP是委託源資國際生物科技股份有限公司來進行定序分析，而被證實具有如圖2所示的質體架構。
將實施例1中所得到的重組型大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP接種至含有50 μg/mL康那黴素的LB肉湯培養基中，繼而於37℃下以150 rpm進行震盪培養。當培養物的細胞密度到達大約1(OD600
)時，加入適量的IPTG至一最終濃度為1 mM，然後於18℃下以150 rpm繼續震盪培養歷時24小時，俾以誘導大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP生產融合蛋白質INPNC-INT-EGFP。另外，未加入IPTG的培養物被用作為對照組(control)並進行相同的實驗。
之後，吸取適量之經IPTG誘導的培養物滴於一載玻片上，繼而以一蓋玻片予以覆蓋。接著，使用一螢光顯微鏡(Nikon,TE 2000-S)並且在一為488 nm的激發波長(excitation wavelength)與一為510 mm的放射波長(emission wavelength)下來觀察融合蛋白質INPNC-INT-EGFP表現情形。
另外，分別吸取1 mL之未經IPTG誘導的培養物以及經IPTG誘導的培養物作為蛋白質樣品A以及蛋白質樣品B，繼而加入等體積的2X樣品裝填緩衝液(2X sample loading buffer)並予以混合均勻，然後以沸水加熱歷時5分鐘，即可供用於進行下面的「C、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析」。最後，剩餘的培養物則被拿來進行下面的「B、DnaB內含肽自我-切割的誘導(induction of DnaB intein self-cleavage)」
於本實施例第A項當中所得到的培養物以8,000 rpm來進行離心歷時10分鐘之後，收集沉澱物並以反應緩衝液(reaction buffer)[含有20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA以及1 M NaCl，pH 8.5]予以清洗共計3次。然後，加入10 mL的反應緩衝液(pH 7.5)以充分懸浮菌體，所形成的懸浮液於37℃下以50 rpm進行培育，俾以誘導DnaB內含肽的自我-切割。
於第3天收取所形成的反應混合物，繼而以12,000 rpm來進行離心歷時1分鐘之後，分別收取沉澱物[含有菌體部分(bacterial fraction)的蛋白質]與上清液[含有胞外部分(extracellular fraction)的蛋白質]作為蛋白質樣品C以及蛋白質樣品D，接而加入等體積的2X樣品裝填緩衝液並予以混合均勻，然後以沸水加熱歷時5分鐘，即可供用於進行下面的「C、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析」。
本實驗是使用迷你-蛋白質Tetra電泳系統(Mini-Protein Tetra electrophoresis system)(Bio-Rad)並且參照Laemmli(1970),Nature
,227:680-685當中所述的方法來進行。首先，製備一聚丙烯醯胺凝膠片，它分為2層，分別是12%的SDS-PAGE分離凝膠(SDS-PAGE separating gel)以及5%的SDS-PAGE聚積凝膠(SDS-PAGE stacking gel)。之後，分別取10 μL的上面第A與B項當中所得到的蛋白質樣品A~D並予以裝填至樣品槽(sample well)內，使用緩衝液[藉由將Tris羥甲基胺基甲烷(Tris hydroxymethyl aminomethane)、3.03 g甘胺酸以及1 g SDS溶於1L的去離子水中而被獲得]並於70 V的電壓下進行電泳歷時0.3小時，繼而於140 V的電壓下進行電泳歷時1.3小時。之後，取出凝膠片並且使用一含有3%的考馬斯亮藍R-250(Coomassie brilliant blue R-250)的10%冰醋酸(glacial acetic acid)溶液於50 rpm下來進行染色歷時至少1小時。接著，以ddH2
O來洗滌經染色的凝膠片，繼而使用去染緩衝液(destain buffer)於50 rpm下進行脫色。以一為30分鐘的時間間隔來更換新鮮的去染緩衝液，直到凝膠片的背景顏色呈現透明為止。最後，以玻璃紙將經去染的凝膠片封片保存。
圖3顯示經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP使用一螢光顯微鏡在一為488 nm的激發波長與一為510 mm的放射波長下所觀察到的融合蛋白質INPNC-INT-EGFP表現情形。從圖3可見，大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的菌體呈現綠色螢光。這個實驗結果顯示：經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP能夠生產融合蛋白質INPNC-INT-EGFP，並且該融合蛋白質INPNC-INT-EGFP可藉由INPNC而被固定於大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的外膜上，同時，在該融合蛋白質INPNC-INT-EGFP中的EGFP仍然保有發射綠色螢光的活性。
圖4是一蛋白質電泳圖，其顯示經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP所生產的蛋白質的SDS-PAGE電泳結果，其中徑M是蛋白質階梯標記(protein ladder marker)(116、66、45、35、25、18以及14 kDa)；徑1是未經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的培養物(蛋白質樣品A)；徑2是經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的培養物(蛋白質樣品B)，箭頭指示融合蛋白質INPNC-INT-EGFP的位置；徑3是經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP在歷經DnaB內含肽自我-切割之後，所形成的反應混合物經離心後而收取到之含有菌體部分的蛋白質的沉澱物(蛋白質樣品C)；以及徑4是經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP在歷經DnaB內含肽自我-切割反應之後，所形成的反應混合物經離心後而收取到之含有胞外部分(extracellular fraction)的蛋白質的上清液(蛋白質樣品D)，箭頭指示EGFP的位置。
已知INPNC、DnaB內含肽以及EGFP的分子量分別為27 kDa、18 kDa以及29 kDa，發明人據此推算融合蛋白質INPNC-INT-EGFP的分子量約為74 kDa。從圖4可見，相較於對照組(徑1)，經IPTG誘導的重組型大腸桿菌菌株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的培養物(徑2)在66 kDa與116 kDa之間出現一個明顯的蛋白質訊號，這個蛋白質的分子量經推算為74 kDa。這個實驗結果顯示：經IPTG誘導的重組型大腸桿菌菌株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP能夠生產融合蛋白質INPNC-INT-EGFP。
另外，經IPTG誘導的重組型大腸桿菌菌株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP在歷經DnaB內含肽的自我-切割之後，所得到的含有菌體部分的蛋白質的蛋白質樣品C不具有對應於融合蛋白質INPNC-INT-EGFP的蛋白質訊號，而含有胞外部分的蛋白質的蛋白質樣品D在25 kDa與35 kDa之間出現一個明顯的蛋白質訊號，這個蛋白質的分子量經推算為29 kDa，與EGFP的分子量相符。這個實驗結果顯示：DnaB內含肽在歷經pH值改變(亦即，pH值由8.5調動至7.5)之後能夠誘導自我-切割，使得EGFP從融合蛋白質INPNC-INT-EGFP被切下，進而由細胞表面被釋放至胞外。
將實施例1中所得到的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分成5組並分別接種至含有50 μg/mL胺芐青黴素的LB肉湯培養基內，繼而於37℃下以150 rpm進行震盪培養。當培養物的細胞密度到達大約1(OD600
)時，加入適量的IPTG至一最終濃度為1 mM，然後於18℃下以150 rpm繼續震盪培養歷時24小時，俾以誘導大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP生產融合蛋白質INPNC-INT-EGFP。將所形成的培養物以8,000 rpm來進行離心歷時10分鐘之後，收集沉澱物並以反應緩衝液(pH 8.5)予以清洗共計3次。然後，分別將10 mL之具有不同pH值(pH 6、7、8、9以及10)的反應緩衝液加入至各組的沉澱物中以充分懸浮菌體，接而於37℃下以50 rpm來進行培育，俾以誘導DnaB內含肽的自我-切割。
在培育的第0、1、2、3、4、5、6、7以及8天時分別吸取1 mL之各組所形成的反應混合物，繼而以12,000 rpm來進行離心歷時3分鐘之後，收取上清液並以螢光分光光度計(fluorescence spectrophotometer)(F-2500,Hitachi)來進行螢光發射分析(fluorescence emission assay)。螢光分光光度計所使用的操作條件如下：激發波長(excitationn wavelength)為488 nm；發射波長(emission wavelength)為500-520 nm；激發光狹縫(Ex slit)與發射光狹縫(Em slit)均為2.5 nm；以及電壓為400 V。所得到的實驗結果被顯示於圖5中。
從圖5可見，當經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分別被轉移至一pH值為6、7、8、9以及10的培育條件下時，螢光強度會隨著培育時間的增長而逐漸地上升。特別地，當大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分別被轉移至一pH值為8、9以及10的培育條件下並予以培育歷時1天之後，螢光強度即呈現顯著地上升，而當大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分別被轉移至一pH值為6以及7的培育條件下時，螢光強度在培育的第6天起才開始明顯地上升。這個實驗結果顯示：當大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP被轉移至具有一範圍落在8~10的pH值的培育條件下時，可以增進DnaB內含肽的自我-切割，藉此而獲得較多的EGFP。
發明人推論：使用大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP所生產的融合蛋白質INPNC-INT-EGFP可分為3個部分：(1)截短的冰核蛋白；(2) DnaB內含肽；以及(3) EGFP，其中截短的冰核蛋白是由冰核蛋白的N-端領域以及C-端領域所構成。因此，當融合蛋白質INPNC-INT-EGFP被表現於大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的外膜時，截短的冰核蛋白暴露在胞外的胺基酸長度要比完整的冰核蛋白所具者還短，造成DnaB內含肽相對較為接近大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的外膜，存在於細胞膜上的糖苷(glycoside)或膜蛋白會形成立體空間障礙而不利於DnaB內含肽進行自我-切割。然而，當大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP被轉移至pH值分別為8、9以及10的培育條件下時，因為由脂質雙層所構成的細胞膜可能易受鹼性侵蝕，而造成剝離，致使在細胞膜上由糖苷或膜蛋白所形成的立體空間障礙得以被排除，進而增進DnaB內含肽的自我-切割。
將實施例1中所得到的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分成4組並分別接種至含有50 μg/mL康那黴素的LB肉湯培養基內，繼而於37℃下以150 rpm進行震盪培養。當培養物的細胞密度到達大約1(OD600
)時，加入適量的IPTG至一最終濃度為1 mM，然後於18℃下以150 rpm繼續震盪培養歷時24小時，俾以誘導大腸桿菌轉形株DHI(DE3)/pINPNC-INT-EGFP生產融合蛋白質INPNC-INT-EGFP。將所形成的培養物以8,000 rpm來進行離心歷時10分鐘之後，收集沉澱物並以反應緩衝液(pH 8.5，25℃)予以清洗共計3次。然後，將10 mL反應緩衝液(pH 9)分別加入至各組的沉澱物中以充分懸浮菌體，接而分別於不同的溫度(15℃、25℃、30℃以及37℃)下以50 rpm來進行培育，俾以誘導DnaB內含肽的自我-切割。
在培育的第0、1、2、3、4、5、6、7以及8天時分別吸取1 mL之各組所形成的反應混合物，繼而以12,000 rpm來進行離心歷時3分鐘之後，收取上清液並以螢光分光光度計來進行螢光發射分析，螢光發射分析的操作條件是參照上面第A項當中所述者。所得到的實驗結果被顯示於圖6中。
從圖6可見，當經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分別被轉移至溫度為15℃、25℃、30℃以及37℃的培育條件下時，螢光強度會隨著培育時間的增長而逐漸地上升。在所有的培育溫度下，螢光強度在前4天的趨勢極為相似，但是自第5天起，被培育在37℃下的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的螢光強度明顯地上升。這個結果顯示：當大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP被轉移至溫度為37℃的培育條件下時，可以增進DnaB內含肽的自我-切割，藉此而獲得較多的EGFP。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
<110> 國立中興大學
<120> 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法
<130> pINPNC-INT-EGFP
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5297
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 質體pJO1-OSP1
<220>
<221> Ssp dnaB基因
<222> (4578)..(5057)
<400> 1
<210> 2
<211> 8132
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 質體pInaXNC1-aglA2
<220>
<221> inaNC基因
<222> (5131)..(5871)
<220>
<221> 限制_位址
<222> (5872)..(5877)
<223> 被EcoRI所辨識
<220>
<221> 限制_位址
<222> (7971)..(7976)
<223> 被XhoI所辨識
<300>
<301> Po-Hung Wu et al.
<303> Biotechnology and Bioengineering
<304> 95
<306> 1138-1149
<307> 2006-07-01
<400> 2
<210> 3
<211> 3355
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 質體pEGFP
<220>
<221> egfp基因
<222> (289)..(1008)
<400> 3
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR的Int F引子
<220>
<221> 限制_位址
<222> (4)..(9)
<223> 被EcoRI所辨識
<400> 4
<210> 5
<211> 34
<212>DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR的Int-EGFP R引子
<400> 5
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR的Int-EGFP F引子
<400> 6
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR的EGFP R引子
<220>
<221> 限制_位址
<222> (4)..(9)
<223> 被XhoI所辨識
<400> 7
<210> 8
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> dnaB-egfp DNA片段
<220>
<221> 限制_位址
<222> (4)..(9)
<223> 被EcoRI所辨識
<220>
<221> 限制_位址
<222> (1210)..(1215)
<223> 被XhoI所辨識
<400> 8
圖1示意地顯示利用聚合酶鏈反應來製備含有經融合的集胞藻屬物種dnaB
基因(Synechocystis
spdnaB
gene,S
spdnaB
gene)以及增強的綠色螢光蛋白質基因(enhanced green fluorescent protein gene,egfp
gene)的dnaB
-egfp
DNA片段的流程；
圖2顯示重組型質體pINPNC-INT-EGFP的載體架構，其中各代碼所代表的意思如下：Kan，康那黴素抗性基因(kanamycin resistance gene)；以及Nde
I、Eco
RI與Xho
I分別意指各個限制酶的切割位址；
圖3顯示經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP使用螢光顯微鏡在一為488 nm的激發波長與一為510 mm的放射波長下所觀察到的融合蛋白質INPNC-INT-EGFP表現情形，其中比例尺為100 μm；
圖4是一蛋白質電泳圖，其顯示經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP所生產的蛋白質的SDS-PAGE電泳結果，其中徑M是蛋白質階梯標記(protein ladder marker)(116、66、45、35、25、18以及14kDa)；徑1是未經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的培養物(蛋白質樣品A)；徑2是經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP的培養物(蛋白質樣品B)，箭頭指示融合蛋白質INPNC-INT-EGFP的位置；徑3是經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP在歷經DnaB內含肽自我-切割之後，所形成的反應混合物經離心後而收取到之含有菌體部分的蛋白質的沉澱物(蛋白質樣品C)；以及徑4是經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP在歷經DnaB內含肽自我-切割的反應之後，所形成的反應混合物經離心後而收取到之含有胞外部分(extracellular fraction)的蛋白質的上清液(蛋白質樣品D)，箭頭指示EGFP的位置；
圖5顯示經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分別被轉移至一pH值為6、7、8、9以及10的培育條件下之後，在不同的培育時間點所測得的螢光強度；以及
圖6顯示經IPTG誘導的大腸桿菌轉形株DH1(DE3)/pINPNC-INT-EGFP分別被轉移至一溫度為15℃、25℃、30℃以及37℃的培育條件下之後，在不同的培育時間點所測得的螢光強度。
Claims (24)
- 一種用於生產一標的蛋白質的方法，其包括：將一用於表現一包含有冰核蛋白、內含肽以及該標的蛋白質的融合基因產物的融合基因序列導入至一宿主細胞內，其中該融合基因序列沿著一轉錄方向依序地包含有下列編碼區域：(i) 一編碼冰核蛋白的第一編碼區域；(ii) 一編碼內含肽的第二編碼區域；以及(iii) 一編碼該標的蛋白質的第三編碼區域；將所形成的重組型宿主細胞培養於一適於該融合基因序列表現的培養條件下，俾以容許該融合基因產物被展示在該重組型宿主細胞的表面上；對該重組型宿主細胞進行一處理，俾以誘導該內含肽進行自我-切割，而使得該標的蛋白質從該融合基因產物中被切出並且被釋放至細胞外；以及收穫被釋放的該標的蛋白質。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中該第二編碼區域所編碼的內含肽是選自於下列所構成的群組：S sp DnaB內含肽、S sp DnaE內含肽、Mx e GyrA內含肽、VMA內含肽、Mtu RecA內含肽、P sp Pol-I內含肽、PI-pful內含肽、PI-pfull內含肽以及Mth RIR1內含肽。
- 如申請專利範圍第2項的方法，其中該第二編碼區域編碼S sp DnaB內含肽。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中該融合基因序列的導入包含下列步驟：構築一可於該宿主細胞內表現並且包含有該融合基因序列的重組型載體；以及將該重組型載體輸送至該宿主細胞內。
- 如申請專利範圍第4項的方法，其中該重組型載體進一步包含有一啟動子序列，該啟動子序列坐落在該融合基因序列的上游處用以控制該融合基因序列的表現。
- 如申請專利範圍第5項的方法，其中該啟動子序列是選自於下列所構成的群組：T7啟動子、T5啟動子以及lac 啟動子。
- 如申請專利範圍第6項的方法，其中該啟動子序列是T7啟動子。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中該重組型宿主細胞的處理包含下列步驟：收取該重組型宿主細胞；以及在一第一溫度下培育所收取的該重組型宿主細胞歷時一段時間，其中該第一溫度不同於一適於該融合基因序列表現的第二溫度。
- 如申請專利範圍第8項的方法，其中該第一溫度是落在15~37℃的範圍內，而該第二溫度是落在18~37℃的範圍內。
- 如申請專利範圍第9項的方法，其中該第一溫度為37℃，而該第二溫度為25℃。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中該重組型宿主細胞的處理包含下列步驟：收取該重組型宿主細胞；以及在一第一pH值下培育所收取的該重組型宿主細胞歷時一段時間，其中該第一pH值不同於一適於該融合基因序列表現的第二pH值。
- 如申請專利範圍第11項的方法，其中該第一pH值是落在6~10的範圍內，而該第二pH值是落在6~8.5的範圍內。
- 如申請專利範圍第12項的方法，其中該第一pH值是落在8~10的範圍內，而該第二pH值為7。
- 如申請專利範圍第1項的方法，其中該宿主細胞是大腸桿菌細胞。
- 一種編碼一包含有冰核蛋白、內含肽以及一標的蛋白質之融合蛋白質的核酸建構物，它包含有一沿著一轉錄方向依序地包含有下列編碼區域的核酸序列：(i) 一編碼冰核蛋白的第一編碼區域；(ii) 一編碼內含肽的第二編碼區域；以及(iii) 一編碼該標的蛋白質的第三編碼區域。
- 如申請專利範圍第15項的核酸建構物，其中該第二編碼區域所編碼的內含肽是選自於下列所構成的群組：S sp DnaB內含肽、S sp DnaE內含肽、Mxe GyrA內含肽、VMA內含肽、Mtu RecA內含肽、P sp Po1-I內含肽、PI-pfu1內含肽、PI-pfull內含肽以及Mth RIR1內含肽。
- 如申請專利範圍第16項的核酸建構物，其中該第二編碼區域編碼S sp DnaB內含肽。
- 如申請專利範圍第15項的核酸建構物，其進一步包含有一啟動子序列，該啟動子序列坐落在該核酸序列的上游處用以控制該核酸序列的表現。
- 如申請專利範圍第18項的核酸建構物，其中該啟動子序列是選自於下列所構成的群組：T7啟動子、T5啟動子以及lac 啟動子。
- 如申請專利範圍第19項的核酸建構物，其中該啟動子序列是T7啟動子。
- 一種重組型載體，其包含有一如申請專利範圍第15至20項中任一項的核酸建構物。
- 如申請專利範圍第21項的重組型載體，其進一步包含有下列至少一者：一抗生素-抗性基因、一增強子序列、一聚腺苷酸化位址以及一調節序列。
- 一種用於生產一標的蛋白質的重組型宿主細胞，它是藉由以一如申請專利範圍第21項的重組型載體來轉形一宿主細胞而被生成的。
- 如申請專利範圍第23項的重組型宿主細胞，它是大腸桿菌細胞。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW099137264A TWI408228B (zh) | 2010-10-29 | 2010-10-29 | 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法 |
| US13/284,800 US8759028B2 (en) | 2010-10-29 | 2011-10-28 | Expression cassette, recombinant host cell and process for producing a target protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW099137264A TWI408228B (zh) | 2010-10-29 | 2010-10-29 | 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201217532A TW201217532A (en) | 2012-05-01 |
| TWI408228B true TWI408228B (zh) | 2013-09-11 |
Family
ID=45997181
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW099137264A TWI408228B (zh) | 2010-10-29 | 2010-10-29 | 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8759028B2 (zh) |
| TW (1) | TWI408228B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TR201815211T4 (tr) | 2010-07-08 | 2018-11-21 | Baxalta GmbH | Hücre kültüründe rekombinant adamts13 üretmeye yönelik yöntem. |
| US10913940B2 (en) | 2016-04-11 | 2021-02-09 | University Of Virginia | Compositions and methods for pesticide degradation |
| US20190352365A1 (en) * | 2017-01-18 | 2019-11-21 | Savior Lifetec Corporation | Expression construct and method for producing proteins of interest |
| US11649265B2 (en) | 2017-04-28 | 2023-05-16 | Agrospheres, Inc. | Compositions and methods for the encapsulation and scalable delivery of agrochemicals |
| US11624061B2 (en) | 2017-04-28 | 2023-04-11 | Agrospheres, Inc. | Compositions and methods for enzyme immobilization |
| CN111263814A (zh) | 2017-09-25 | 2020-06-09 | 农业球体公司 | 用于可规模化生产和递送生物制剂的组合物和方法 |
| CA3049553A1 (en) * | 2018-07-18 | 2020-01-18 | Joenel Alcantara | Recombinant polypeptide-enriched chloroplasts or accumulated lipid particles and methods for producing the same in algae |
| CN111534464A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-08-14 | 内蒙古工业大学 | 野油菜黄单胞菌感受态细胞的制备方法 |
| CN116731126B (zh) * | 2023-01-30 | 2024-02-23 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 |
-
2010
- 2010-10-29 TW TW099137264A patent/TWI408228B/zh active
-
2011
- 2011-10-28 US US13/284,800 patent/US8759028B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 2003年12月10日，Functional Display of Foreign Protein on Surface of Escherichia coli Using N-Terminal Domain of Ice Nucleation Protein，Lin Li，Biotechnol Bioeng. 2004 Jan 20;85(2):214-21. * |
| 2007年11月01日，Purification of green fluorescent protein using a two-intein system，Zhonglin Zhao，Appl Microbiol Biotechnol (2008) 77:1175-1180 * |
| 2009年06月01日，蘇雲金芽孢桿菌自溶素蛋白用於建構表面展示系統的研究，邵小虎，華中農業大學微生物學系碩士論文。 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201217532A (en) | 2012-05-01 |
| US8759028B2 (en) | 2014-06-24 |
| US20120107875A1 (en) | 2012-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI408228B (zh) | 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法 | |
| Sizova et al. | A Streptomyces rimosus aphVIII gene coding for a new type phosphotransferase provides stable antibiotic resistance to Chlamydomonas reinhardtii | |
| WO2018213771A1 (en) | Genome editing system | |
| AU2016274452A1 (en) | Thermostable Cas9 nucleases | |
| CN113728098A (zh) | 具有ruvc结构域的酶 | |
| US20200385743A1 (en) | GENE THERAPY DNA VECTOR VTvaf17, METHOD OF PRODUCTION; ESCHERICHIA COLI STRAIN SCS110-AF, METHOD OF PRODUCTION; ESCHERICHIA COLI STRAIN SCS110-AF/VTvaf17 BEARING GENE THERAPY DNA VECTOR VTvaf17, METHOD OF PRODUCTION | |
| KR101952470B1 (ko) | 변경된 점성 표현형을 갖는 사상균 | |
| US11236363B2 (en) | Hybrid proteins and uses thereof | |
| Koo et al. | Expression of bovine lactoferrin N-lobe by the green alga, Chlorella vulgaris | |
| Kushnir et al. | Artificial linear episome-based protein expression system for protozoon Leishmania tarentolae | |
| CN104250288B (zh) | 两亲性α螺旋自组装肽及其应用 | |
| CN111378047A (zh) | 一种提高蛋白表达的融合标签蛋白及其应用 | |
| KR20160056149A (ko) | 재설계 유전자회로와 세포 간 상호작용을 이용한 유해 환경물질의 감지방법 | |
| US20160186196A1 (en) | Method and composition for generating programmed cell death resistant algal cells | |
| US11203760B2 (en) | Gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 and the method for obtaining thereof | |
| EP3878958A1 (en) | Crispr-cas nucleases from cpr-enriched metagenome | |
| Ladygin | Efficient transformation of mutant cells of Chlamydomonas reinhardtii by electroporation | |
| US9273090B1 (en) | Heterologous expression of cellular adhesion molecules | |
| Sun et al. | Influence of 5′ sequences on expression of the Tet repressor in Giardia lamblia | |
| CA3069630A1 (en) | Recombinant polypeptide enriched algal chloroplasts, methods for producing the same and uses thereof | |
| WO2018138316A1 (en) | New compositions, methods and uses | |
| US9249421B2 (en) | Artificial biological materials produced by self-assembly of photosynthetic unicells | |
| US20210308282A1 (en) | Gene therapy dna vectors based on vtvaf17 | |
| WO2022269557A1 (en) | Recombinant algae and production of spider silk protein from the recombinant algae | |
| Yuzbasheva et al. | Protein display on the Yarrowia lipolytica yeast cell surface using the cell wall protein YlPir1 |