CN110684789B

CN110684789B - 融合基因、重组载体及其制备方法、镉离子全细胞生物传感器及其制备方法与应用

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Publication number: CN110684789B
Application number: CN201911019006.2A
Authority: CN
Inventors: 伍贤军; 李萍萍; 蒋苏丹; 黄鑫
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Zhongyi Suzhou Environmental Technology Co ltd
Priority date: 2019-10-24
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2039-10-24
Also published as: CN110684789A

Abstract

本发明提供一种融合基因、重组载体及其制备方法、镉离子全细胞生物传感器及其制备方法与应用。所述融合基因包括启动子O/P以及转录因子CadC、藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、裂合酶CpcS、血红素氧化酶HO1与胆绿素还原酶PebS的编码基因，将所述融合基因插入载体转入宿主细胞后，能够得到一种镉离子全细胞生物传感器，所述镉离子全细胞生物传感器能够通过肉眼识别颜色和仪器检测荧光强度两种方式来判断环境中镉离子的浓度。所述重组载体包含上述融合基因。所述镉离子全细胞生物传感器包含上述重组载体。所述镉离子全细胞生物传感器的应用包括：采用所述镉离子全细胞生物传感器检测水溶液中镉离子的浓度。

Description

融合基因、重组载体及其制备方法、镉离子全细胞生物传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种融合基因、重组载体及其制备方法、镉离子全细胞生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

近几十年来，基于经典的重组DNA技术开发的检测和监测重金属污染的细菌报告体发展很快。细菌易于培养繁殖，而且是单细胞的。其设计原理是细菌外排蛋白家族对重金属的特异性响应，触发了金属应答转录或双组分信号传导，启动插入的报告基因表达。通常，细菌报告体由一个感应输入信号的模块和一个将输入信号转换成输出信号的报告模块组成，它们都在实现所设计细胞的底盘单元内。当重金属存在于环境中时，细菌吸收重金属进入胞内，金属调节蛋白(金属传感转录因子)就会感受到它们的存在，并解除抑制或激活启动子，以启动下游报告基因的表达，并转化成理化信号，如颜色、生物发光和荧光等。这些信号的强度和重金属离子的浓度存在剂量效应关系，通过这种关系就能获取环境中重金属离子以及生物有效性重金属离子的含量信息。

报告模块的选择应考虑灵敏度和测量的便利性。目前有两种不同的报告方法。其一是报告基因编码酶能够催化可测量产物的形成，例如，β半乳糖酶和荧光素酶分别催化有色产物和光的产生。在另一种方法中，蛋白质本身是可被测量的产物(例如，绿色荧光蛋白GFP发射的荧光)。

专利文献CN 102911906A中所公开的微生物传感器报告系统是萤火虫荧光素酶，它催化荧光素底物发光。镉离子诱导传感器细胞，使得荧光素酶得以表达并催化荧光素发光。发光强度依赖于镉离子浓度，发光强度使用化学发光仪进行检测。然而这种方法的发光强度仍然较低，也依赖于大型仪器检测，不能通过肉眼对颜色进行判断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合基因，将该融合基因插入载体转入宿主细胞后，能够得到一种镉离子全细胞生物传感器，所述镉离子全细胞生物传感器能够通过肉眼识别颜色和仪器检测荧光强度两种方式来判断环境中镉离子的浓度。

本发明的目的还在于提供一种重组载体，包含上述融合基因，可用于转化宿主细胞以制备镉离子全细胞生物传感器。

本发明的目的还在于提供一种上述重组载体的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种镉离子全细胞生物传感器，包含上述重组载体，能够通过肉眼识别颜色和仪器检测荧光强度两种方式来判断环境中镉离子的浓度。

本发明的目的还在于提供一种镉离子全细胞生物传感器的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种镉离子全细胞生物传感器的应用，采用所述镉离子全细胞生物传感器检测水溶液中镉离子的浓度，具有较高的应用价值。

为实现以上目的，本发明首先提供一种融合基因，包括启动子O/P、转录因子CadC的编码基因、藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的编码基因、裂合酶CpcS的编码基因、血红素氧化酶HO1的编码基因以及胆绿素还原酶PebS的编码基因，在所述融合基因的5’端到3’端的方向上，所述启动子O/P设于所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、所述裂合酶CpcS、所述胆绿素还原酶PebS中至少一个蛋白的编码基因之前，所述启动子O/P的DNA序列如序列表中序列1所示，所述转录因子CadC的氨基酸序列如序列表中序列8所示，所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的氨基酸序列如序列表中序列9所示，所述裂合酶CpcS的氨基酸序列如序列表中序列10所示，所述血红素氧化酶HO1的氨基酸序列如序列表中序列11所示，所述胆绿素还原酶PebS的氨基酸序列如序列表中序列12所示。

具体的，将所述启动子O/P设于所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、所述裂合酶CpcS、所述胆绿素还原酶PebS中至少一个蛋白的编码基因之前的原因在于：

本发明的目的在于利用Cd²⁺来调控结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB的合成，Cd² ⁺与启动子O/P以及转录因子CadC构成了一调控系统(下文简称为Cd²⁺调控系统)，当环境中不存在Cd²⁺时，转录因子CadC能够结合于启动子O/P上，阻遏下游基因的转录翻译，当环境中存在Cd²⁺时，Cd²⁺与转录因子CadC发生特异性结合，转录因子CadC从启动子O/P上脱落，从而解除对下游基因的翻译阻遏。

已知PEB-CpcB在宿主细胞内的合成方法为：

采用能够合成血红素的宿主细胞，通过转基因的方式在宿主细胞内生物合成藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、裂合酶CpcS、血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PebS。宿主细胞内自行合成的血红素在血红素氧化酶HO1和胆绿素还原酶PebS的作用下转化为藻红色素PEB，藻红色素PEB在裂合酶CpcS的作用下连接到藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB上，得到结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB。

因此切断上述合成路径中的任何一个环节即可实现Cd²⁺对PEB-CpcB合成的调控，由于血红素氧化酶HO1在大多生物内都能自行合成，因此即使环境中缺少Cd²⁺也不能完全阻断血红素氧化酶HO1的合成，也即是说不能通过Cd²⁺调控系统来调控血红素氧化酶HO1合成的方式来实现PEB-CpcB在宿主细胞内合成的调控。

而藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、裂合酶CpcS、胆绿素还原酶PebS仅在蓝细菌及其噬菌体中有合成，在其它微生物中基本不存在合成路径。因此，只要调控宿主细胞中原本不能合成并且是PEB-CpcB合成路径中必需的蛋白(即藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、裂合酶CpcS、胆绿素还原酶PebS)，即可实现PEB-CpcB合成的调控。

另外，本申请之所以在融合基因中插入血红素氧化酶HO1的原因在于：血红素氧化酶HO1虽然在大多数微生物中都有表达，但是在很多微生物(包括大肠杆菌)中的表达量都很低，不能满足藻红色素PEB合成的要求。

在本发明一些实施例中，在所述融合基因的5’端到3’端的方向上，所述启动子O/P位于所述转录因子CadC、所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的编码基因、所述裂合酶CpcS的编码基因、所述血红素氧化酶HO1的编码基因以及所述胆绿素还原酶PebS的编码基因之前，例如所述融合基因的序列为序列表中序列7所示的序列，这种融合基因设计的方式比较简单，利用一个启动子(O/P)、一种诱导物(Cd²⁺)即可实现所有蛋白的转录表达，并且，采用Cd²⁺调控系统同时调控藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、裂合酶CpcS、血红素氧化酶HO1以及胆绿素还原酶PebS的表达，能够确保PEB-CpcB合成得到最准确的调控。

在本发明一些实施例中，所述转录因子CadC的编码基因的序列如序列表中序列2所示，所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的编码基因的序列如序列表中序列3所示，所述裂合酶CpcS的编码基因的序列如序列表中序列4所示，所述血红素氧化酶HO1的编码基因的序列如序列表中序列5所示，所述胆绿素还原酶PebS的编码基因的序列如序列表中序列6所示。

在本发明一些实施例中，所述融合基因包括如序列表中序列7所示的DNA序列。

具体的，如序列表中序列7所示的DNA序列包括从5’端到3’端依次排列的如序列表中序列1所示的启动子O/P、如序列表中序列2所示的所述转录因子CadC的编码基因、如序列表中序列3所示的所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的编码基因、如序列表中序列4所示的所述裂合酶CpcS的编码基因、如序列表中序列5所示的所述血红素氧化酶HO1的编码基因、如序列表中序列6所示的所述胆绿素还原酶PebS的编码基因。该排列方式的优点在于：利用一个启动子O/P即可实现下游所有基因(包括转录因子CadC的编码基因、藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的编码基因、血红素氧化酶HO1的编码基因、胆绿素还原酶PebS的编码基因以及裂合酶CpcS的编码基因)的转录翻译，最大程度的简化了融合基因的设计。

本发明还提供一种重组载体，包括载体以及插入所述载体内的如上文所述的融合基因。

在本发明一些实施例中，所述载体为质粒，优选的，所述质粒为pETDuet-1。

本发明还提供一种上述重组载体的制备方法，包括：获取所述融合基因中的所有DNA片段与载体，将所述融合基因中的所有DNA片段分一次或多次插入所述载体中。

具体的，可以将所述融合基因中的所有DNA片段依次插入所述载体中，也可以将所有DNA片段融合在一起后一次性插入所述载体中，也可以将部分DNA片段融合在一起分多次插入所述载体中。

本发明还提供一种镉离子全细胞生物传感器，包括能够合成血红素的宿主细胞以及位于所述宿主细胞内的如上文所述的重组载体。

在自然界中，含有血红素的宿主细胞非常广泛，包括绝大多数的好氧微生物以及植物、动物细胞等。

在本发明一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选的，所述大肠杆菌为E.coli.BL21(DE3)。

本发明还提供一种所述镉离子全细胞生物传感器的制备方法，包括：获取所述宿主细胞与所述重组载体，采用转化法将所述重组载体转化进入所述宿主细胞内。

可选的，所述转化法可以为氯化钙转化法或电转化法。

本发明还提供一种上述镉离子全细胞生物传感器的应用，包括：采用所述镉离子全细胞生物传感器检测水溶液中镉离子的浓度。

本发明的有益效果：本发明提供一种融合基因、重组载体及其制备方法、镉离子全细胞生物传感器及其制备方法与应用。所述融合基因包括启动子O/P以及转录因子CadC、藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB、裂合酶CpcS、血红素氧化酶HO1与胆绿素还原酶PebS的编码基因，将所述融合基因插入载体转入宿主细胞后，能够得到一种镉离子全细胞生物传感器，所述镉离子全细胞生物传感器能够通过肉眼识别颜色和仪器检测荧光强度两种方式来判断环境中镉离子的浓度。所述重组载体包含上述融合基因，可用于转化宿主细胞以制备镉离子全细胞生物传感器。所述镉离子全细胞生物传感器包含上述重组载体，能够通过肉眼识别颜色和仪器检测荧光强度两种方式来判断环境中镉离子的浓度。所述镉离子全细胞生物传感器的应用包括：采用所述镉离子全细胞生物传感器检测水溶液中镉离子的浓度，具有较高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。

图1示出了本发明实施例的镉离子大肠杆菌报告体检测的环境镉离子浓度与荧光强度关系的标准曲线；

图2示出了本发明实施例的镉离子大肠杆菌报告体在不同的镉离子浓度条件下展现出的不同颜色。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

藻蓝蛋白是蓝细菌中的捕光天线蛋白，藻蓝色素被共价结合在脱辅基蛋白上，展现出明亮的蓝色，发射出强烈的荧光，吸光性能好，量子产率高，其荧光强度比荧光素强30倍，在可见光区有很宽的激发及发射范围。

藻蓝蛋白可以通过基因工程的方式在大肠杆菌等宿主细胞内生物合成。

大肠杆菌等微生物本身含有血红素底物，血红素在血红素氧化酶HO1和胆绿素还原酶PebS的作用下转化为藻红色素PEB，藻红色素PEB能够在裂合酶CpcS的作用下连接到藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB上。研究表明，由于藻红色素微环境的改变，结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB在绿光激发下展现出明亮的橙色荧光，其量子产率接达到0.98，远高于GFP(0.6左右)，并且在白光(例如日光、灯光)下呈现出明亮的红色。

现有技术没有公开利用结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB作为报告子的全细胞生物传感器(例如细菌报告体)，也没有公开利用颜色和荧光双报告系统检测重金属含量的方法。

本发明实施例所要解决的问题是针对现有的技术提出一种新的镉离子全细胞生物传感器的制备方法，即引入结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB作为报告模块，制备一种既能通过肉眼判断又能通过荧光检测来获得环境中镉离子浓度的新型的镉离子大肠杆菌报告体。

为实现以上发明目的，本发明实施例提供一种镉离子大肠杆菌报告体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、通过分子设计方法将源自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)所携带的质粒pI258中的cad操纵子的启动子元件O/P、转录因子CadC的编码基因cadC、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa FACHB351)藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的编码基因cpcB融合，并插入到表达载体pETDuet-1中，得到新的表达载体pETDuet-O/P-cadC-cpcB。

步骤2、将藻红色素合成酶编码基因ho1-pebS和裂合酶CpcS的编码基因cpcS进行融合后，通过分子设计适当的连接肽，与步骤1)所得表达载体pETDuet-O/P-cadC-cpcB中的融合基因O/P-cadC-cpcB的C端再次融合，得到重组质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS。

其中，藻红色素合成酶编码基因ho1-pebS指的是念株藻Nostoc sp.PCC7120中的血红素氧化酶HO1的编码基因ho1与噬藻体P-SSM4中发现的胆绿素还原酶PebS的编码基因pebS的融合基因。

当表达质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS转入细菌通过Cd²⁺诱导表达时，Cd²⁺能够结合转录因子CadC而解除转录因子CadC对启动子O/P的转录抑制，从而触发下游基因cpcB的表达。

由于血红素氧化酶HO1与胆绿素还原酶PebS的作用，使得大肠杆菌体内合成的血红素转化成藻红色素PEB，又由于裂合酶CpcS的作用，使得藻红色素PEB连接到藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB上，从而产生具有明亮红色和强烈荧光的结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB。

步骤3、将步骤2所得到的重组质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS转入大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌BL21(DE3)在添加100μg/mL氨苄抗生素的LB培养基中长到OD₆₀₀为1.0时，添加不同浓度的Cd²⁺，在摇床转速为220rpm，16℃的条件下诱导表达5小时，位于不同浓度的Cd²⁺环境中的大肠杆菌细胞产生不同强度的荧光，同时呈现出不同深浅的红色。

上述实施例中，所述启动子O/P的DNA序列如序列表中序列1所示，所述转录因子CadC的编码基因cadC的序列如序列表中序列2所示，所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的编码基因cpcB的序列如序列表中序列3所示所示，所述裂合酶CpcS的编码基因cpcS的序列如序列表中序列4所示，所述血红素氧化酶HO1的编码基因ho1的序列如序列表中序列5所示，所述胆绿素还原酶PebS的编码基因pebS的序列如序列表中序列6所示。

所述转录因子CadC的氨基酸序列如序列表中序列8所示，所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白β亚基CpcB的氨基酸序列如序列表中序列9所示，所述裂合酶CpcS的氨基酸序列如序列表中序列10所示，所述血红素氧化酶HO1的氨基酸序列如序列表中序列11所示，所述胆绿素还原酶PebS的氨基酸序列如序列表中序列12所示。

所述重组质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS中插入的融合基因O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS的DNA序列如序列表中序列7所示。其中，cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS片段翻译后的氨基酸序列如序列表中序列13所示。

具体的，所述步骤1包括：

步骤11、从NCBI数据库中获取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)镉抗性基因CadA的启动子及转录因子编码基因O/P-cadC的基因序列(GenBank登录号：CP022905)，以此设计引物，并在引物的5’端引入两个酶切位点BamHⅠ和ClaⅠ、3’端引入两个酶切位点XbaⅠ和Hind III，以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组DNA为模板进行PCR扩增O/P-cadC片段。再以BamHⅠ和HindIII位点为切口把O/P-cadC片段插入克隆载体pUC57，得到克隆质粒pUC57-O/P-cadC。该质粒在O/P-cadC片段两端保留了酶切位点ClaⅠ和XbaⅠ。故克隆质粒pUC57-O/P-cadC可以用ClaⅠ和XbaⅠ双酶切，亚克隆基因片段O/P-cadC到表达载体pETDuet-1中，获得表达载体pETDuet-O/P-cadC。设计引物利用KOD-Plus突变试剂盒(TOYOBO)突变cadC的终止密码子，并且将酶切位点XbaⅠ修改成SalⅠ。

步骤12、从NCBI数据库中获取盐泽螺旋藻Spirulina subsalsa FACHB351中藻蓝蛋白β亚基CpcB的编码基因cpcB(GenBank登录号：AY244667)，以此设计引物，并在引物上引入酶切位点SalⅠ和Nde I，并突变cpcB的终止密码子，以盐泽螺旋藻Spirulina subsalsaFACHB351基因组DNA为模板，扩增cpcB片段。再以SalⅠ和Nde I双酶切把cpcB插入经过同样SalⅠ和Nde I双酶切的表达载体pETDuet-O/P-cadC中，构建新的表达质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB。

具体的，所述步骤2包括：

步骤21、从NCBI数据库中获取噬藻体P-SSM4中胆绿素还原酶PebS的编码基因pebS，公司合成这段基因，并在基因的5’和3’上引入酶切位点EcoR V和XhoⅠ，再以EcoR V和XhoⅠ双酶切把pebS插入经过同样EcoR V和XhoⅠ双酶切的表达载体pET30a上，构建新的表达质粒pET30a-pebS。

步骤22、从NCBI数据库中获取念株藻Nostoc sp.PCC7120中血红素氧化酶HO1的编码基因ho1，以此设计引物，在引物上引入酶切位点Bgl II和Nco I，并突变ho1的终止密码子，以Nostoc sp.PCC7120基因组DNA为模板，扩增ho1片段。再以Bgl II和Nco I双酶切把ho1插入经过同样Bgl II和Nco I双酶切的表达载体pET30a-pebS上，构建新的表达质粒pET30a-ho1-pebS。

步骤23、从NCBI数据库中获取念株藻Nostoc sp.PCC7120中克隆藻胆蛋白裂合酶CpcS的编码基因cpcS，以此设计引物，在引物上引入酶切位点以Nde I和Bgl III，并突变cpcS的终止密码子，以Nostoc sp.PCC7120基因组DNA为模板，扩增cpcS片段。再以Nde I和Bgl II双酶切把ho1插入经过同样以Nde I和Bgl II双酶切的表达载pET30a-ho1-pebS上，构建新的表达质粒pET30a-cpcS-ho1-pebS。

步骤24、用Nde I和XhoⅠ双酶切表达质粒pET30a-cpcS-ho1-pebS，获得基因片段cpcS-ho1-pebS，将基因片段cpcS-ho1-pebS插入经过同样Nde I和XhoⅠ双酶切的表达质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB中，构建最终的重组质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS。

具体的，所述步骤3包括：

步骤31、将重组质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS转入E.coli BL21(DE3)细胞，在固体LB培养基上进行筛选转化子细胞，制备镉离子大肠杆菌报告体。

步骤32、挑取转化子单克隆在5mL LB液体试管培养基中过夜培养，摇床转速150rpm，温度为37度。

步骤33、接种200μL过夜培养的菌液到若干个5mL LB液体培养基中，培养到OD600为0.6，终止培养。

步骤34、选取若干个含有菌液的液体培养基，加不同浓度(如10^-9mM、10^-8mM、10^- ⁷mM、10^-6mM等)的镉离子，在摇床转速为220rpm，16℃的条件下诱导表达5小时。离心去培养基留沉淀，用去离子水清洗2次细胞。用高清相机对沉淀进行拍照，记录细菌标准颜色，结果如图2所示。从图2可以看出，当环境中镉离子浓度从1nM到100μM逐渐增加时，本发明实施例的镉离子大肠杆菌报告体的颜色逐渐加深。

步骤35、将5ml菌液离心得到的沉淀用200μL去离子水悬浮，用多功能酶标仪(SYNERGY H1)和96孔板检测555nm的荧光，激发为480nm。根据浓度和荧光强度的关系，制定标准曲线，结果如图1所示。从图1可以看出，当环境中镉离子浓度从0.001nM到100μM逐渐增加时，本发明实施例的镉离子大肠杆菌报告体发出的荧光强度逐渐增强。

步骤36、选取若干个含有菌液的液体培养基，加入未知镉离子浓度的样品在摇床转速为220rpm，16℃的条件下诱导表达5小时。离心去培养基留沉淀，用去离子水清洗2次细胞。用多功能酶标仪(SYNERGY H1)和96孔板检测555nm的荧光，激发光为480nm。根据如图2所示的标准颜色定性样品中镉离子的浓度范围，根据如图1所示的标准曲线准确定量镉离子浓度。

本发明技术方案采用结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB作为细菌报告体的报告模块，不仅能够通过强烈的荧光来进行定量检测环境中镉离子的浓度，在仪器条件不够的情况下，也能够通过肉眼识别辨识度很高的红色来判断环境中镉离子的浓度范围。即通过一个细菌报告体兼容了两种报告模块。

由于荧光素酶需要催化荧光素底物反应后才能发光，并且需要通过仪器进行检测，而GFP家族在日光、灯光等普通光照条件下也没有明显的颜色，所以结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB作为报告模块，无论和荧光素酶相比，还是和GFP家族相比，都具有明显的优势。

从图1的数据来看，本发明实施例的镉离子大肠杆菌报告体对镉离子的最低检出浓度可达到10^-9mM，即0.001nM，相对于现有的镉离子全细胞生物传感器来说，灵敏度大大提高(现有文献记录镉离子全细胞生物传感器检出的最低镉离子浓度是0.1nM)。

另外，从图2的数据看以看出，环境中不同的镉离子浓度能够使镉离子大肠杆菌报告体展现出一定的颜色差异，总体来说，随着环境中镉离子浓度的逐渐提升，镉离子大肠杆菌报告体呈现出逐渐加深的红色，因此可以通过肉眼识别镉离子大肠杆菌报告体的颜色深浅对环境中镉离子的浓度做一定的判断。

综上所述，本发明实施例制备了重组质粒pETDuet-O/P-cadC-cpcB-cpcS-ho1-pebS，并将其转入大肠杆菌中，制得采用结合藻红色素的藻蓝蛋白PEB-CpcB作为报告模块的镉离子大肠杆菌报告体，所述镉离子大肠杆菌报告体具有红色和荧光双重报告的特点，使用方便，仪器依赖程度低。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 融合基因、重组载体及其制备方法、镉离子全细胞生物传感器及其制备方法与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 203

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

gtgtattttt taataaatta ttttacttat tgaaatgtat tattttctaa tgtcataccc 60

tggtcaaaac cgttcgtttt tgagactaga attttatgcc ctacttactt cttttatttt 120

cattcaaata tttgcttgca tgatgagtcg aaaatggtta taatacactc aaataaatat 180

ttgaatgaag atgggatgat aat 203

<210> 2

<211> 363

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 2

atgaaaaaga aagatacttg tgaaattttt tgttatgacg aagaaaaggt taatcgaata 60

caaggggatt tacaaacagt tgatatttct ggtgttagcc aaattttaaa ggctattgcc 120

gatgaaaata gagcaaaaat tacttacgct ctgtgtcagg atgaagagtt gtgtgtttgt 180

gatatagcaa atatcttagg tgttacgata gcaaatgcat ctcatcattt acgtacgctt 240

tataagcaag gggtggtcaa ctttataaaa gaaggaaaac tagctttata ttctttaggt 300

gatgaacata tcaggcagat aatgatgatc gccctagcac ataagaaaga agtgaaggtc 360

aat 363

<210> 3

<211> 516

<212> DNA

<213> Spirulina subsalsa

<400> 3

atgtttgacg catttacaag ggttgtttct caagcagact ctcgcggcga attcctgagc 60

ggcgaacaat tagacgcttt atccgccatg gttgctgacg gcaacaaacg cttagacgtg 120

gtaaaccgca tcaccagcaa ctctgctgct atcgtgactg acgctgctcg cgctctgttc 180

gctgaacagc ctcaactggt gcaacccggt ggaaatgcct acaccaaccg tcgtatggct 240

gcttgtttgc gtgatatgga aatcatcctg cgctatgtta gctacgctac cttagctggc 300

gatgctagtg ttctcgaaga tcgttgctta aacggtctgc gtgaaaccta ccaagctctg 360

ggcgttcctg gtgcttctgt ggctgctggc gttgccaaaa tgaaagatgc ggcggttaaa 420

atcgctaacg accccaacgg gatcacccaa ggggattgca gccaattaat gtctgaagtt 480

gctagctact tcgatcgcgc tgctgctgct gttgcc 516

<210> 4

<211> 564

<212> DNA

<213> Nostoc sp. PCC7120

<400> 4

aatattgaag aattttttga attgagtgca ggtaaatggt tttctcatcg taccagtcat 60

catttagctt ttaagcaatc ggaagatggc aagtctgatc tggtaattga gtcactagcc 120

gcagatcatc cagaagtcat caagttgtgc gaattgtacg aagttcctgc tagtgctgct 180

tcatgcggtg cgagggttag ctggaacggt actatggaat gggatgaaga aaaacatact 240

ggatctacag tgttagctac tgtaccagat gtggataatc ccaacgaagg tagattactg 300

cgggaaatgg gttatgccga gaaagcccct gtagctggac gttacaagat gggcgacgat 360

ggcgctttga ctctgacgac agagtacgaa accatgtggt cagaagaacg cttatggttt 420

gctagcccta atttacggat gcgcgtcagt gtcttaaagc gttttggggg ctttagtatg 480

gcttccttta cttctgagat tcggatgggc ggaagtccgg ctgcggcgaa agctgaggaa 540

gcggctaatt ctgcatcaag tgga 564

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> Nostoc sp. PCC7120

<400> 5

atgagcagca atttagcaaa caaactacgt gtaggtacga aaaaagccca cacaatggca 60

gaaaatgtag gttttgtcaa atgcttctta aaaggagtgg cagaaaaaag ctcttaccgg 120

aagctagtgg ccaacttcta ctacgtctac tccgcaatgg aagaggagat ggaaaagcat 180

agccagcacc caattgtttc taaaataaac ttttcccaac tgaatcgtaa gcagactcta 240

gagcaagacc tgagttacta ttacggcgct aactggcggg aacaaattca actgtcgcca 300

gcaggtgaag cttacgtaca acgcattcgg gaaatctctg caaccgaacc agaattgttg 360

attgcccact cttacacccg ttatttaggt gatttatccg ggggacaaat tctcaaaaac 420

attgctgtga cagcgatgaa tttgaatgat gggcaaggaa ctgcatttta tgagttcgca 480

gatatttctg atgagaaagc ttttaaggct aaatatcgtc caacattaga tgagttggca 540

attgatgaag cgacaggcga tcgcattgtt gatgaagcta acgccgcttt tggtatgaac 600

atgaaaatgt tccaagaact agaagggaac ctcatcaagg caatcggcat gatgctgttc 660

aacaccttga ctcgcaagcg cacacgcggc gctaccgaac tagccactgc agagtat 717

<210> 6

<211> 702

<212> DNA

<213> Cyanophage P-SSM4

<400> 6

atgactaaaa acccaagaaa taacaaacca aaaaagattt tagattcatc ttataaatct 60

aaaacaatct ggcaaaatta tattgatgct ctatttgaaa catttccaca gttagaaata 120

tctgaggtat gggcaaaatg ggatggtggg aacgtcacta aggacggtgg agatgctaaa 180

cttacagcaa atatccgtac aggagaacac tttctaaagg caagagaggc acacatagta 240

gatcctaact ctgacatata caataccata ctctatccta aaacaggagc agatctgcct 300

tgttttggta tggatctgat gaagtttagt gataagaagg tcattatagt atttgacttc 360

cagcatccaa gagagaagta tctgttctct gttgatggac tacccgaaga tgatggtaag 420

tatagattct ttgaaatggg taatcatttc tctaagaata tctttgtaag atactgtaaa 480

cctgatgaag tggatcaata tcttgatacc tttaaattat acttgacaaa gtataaagag 540

atgatagata acaataaacc tgttggtgaa gataccacag tctatagtga ctttgatact 600

tatatgactg aacttgatcc tgttagagga tatatgaaga ataagtttgg tgagggtaga 660

tcagaggcat ttgtaaacga tttccttttt tcatacaaat ga 702

<210> 7

<211> 3131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgtattttt taataaatta ttttacttat tgaaatgtat tattttctaa tgtcataccc 60

tggtcaaaac cgttcgtttt tgagactaga attttatgcc ctacttactt cttttatttt 120

cattcaaata tttgcttgca tgatgagtcg aaaatggtta taatacactc aaataaatat 180

ttgaatgaag atgggatgat aatatgaaaa agaaagatac ttgtgaaatt ttttgttatg 240

acgaagaaaa ggttaatcga atacaagggg atttacaaac agttgatatt tctggtgtta 300

gccaaatttt aaaggctatt gccgatgaaa atagagcaaa aattacttac gctctgtgtc 360

aggatgaaga gttgtgtgtt tgtgatatag caaatatctt aggtgttacg atagcaaatg 420

catctcatca tttacgtacg ctttataagc aaggggtggt caactttata aaagaaggaa 480

aactagcttt atattcttta ggtgatgaac atatcaggca gataatgatg atcgccctag 540

cacataagaa agaagtgaag gtcaatgtcg acatgtttga cgcatttaca agggttgttt 600

ctcaagcaga ctctcgcggc gaattcctga gcggcgaaca attagacgct ttatccgcca 660

tggttgctga cggcaacaaa cgcttagacg tggtaaaccg catcaccagc aactctgctg 720

ctatcgtgac tgacgctgct cgcgctctgt tcgctgaaca gcctcaactg gtgcaacccg 780

gtggaaatgc ctacaccaac cgtcgtatgg ctgcttgttt gcgtgatatg gaaatcatcc 840

tgcgctatgt tagctacgct accttagctg gcgatgctag tgttctcgaa gatcgttgct 900

taaacggtct gcgtgaaacc taccaagctc tgggcgttcc tggtgcttct gtggctgctg 960

gcgttgccaa aatgaaagat gcggcggtta aaatcgctaa cgaccccaac gggatcaccc 1020

aaggggattg cagccaatta atgtctgaag ttgctagcta cttcgatcgc gctgctgctg 1080

ctgttgccca tatgaatatt gaagaatttt ttgaattgag tgcaggtaaa tggttttctc 1140

atcgtaccag tcatcattta gcttttaagc aatcggaaga tggcaagtct gatctggtaa 1200

ttgagtcact agccgcagat catccagaag tcatcaagtt gtgcgaattg tacgaagttc 1260

ctgctagtgc tgcttcatgc ggtgcgaggg ttagctggaa cggtactatg gaatgggatg 1320

aagaaaaaca tactggatct acagtgttag ctactgtacc agatgtggat aatcccaacg 1380

aaggtagatt actgcgggaa atgggttatg ccgagaaagc ccctgtagct ggacgttaca 1440

agatgggcga cgatggcgct ttgactctga cgacagagta cgaaaccatg tggtcagaag 1500

aacgcttatg gtttgctagc cctaatttac ggatgcgcgt cagtgtctta aagcgttttg 1560

ggggctttag tatggcttcc tttacttctg agattcggat gggcggaagt ccggctgcgg 1620

cgaaagctga ggaagcggct aattctgcat caagtggaga tctgggtggc ggccgctcta 1680

gaactagtgg atcccccggg gtaatgagca gcaatttagc aaacaaacta cgtgtaggta 1740

cgaaaaaagc ccacacaatg gcagaaaatg taggttttgt caaatgcttc ttaaaaggag 1800

tggcagaaaa aagctcttac cggaagctag tggccaactt ctactacgtc tactccgcaa 1860

tggaagagga gatggaaaag catagccagc acccaattgt ttctaaaata aacttttccc 1920

aactgaatcg taagcagact ctagagcaag acctgagtta ctattacggc gctaactggc 1980

gggaacaaat tcaactgtcg ccagcaggtg aagcttacgt acaacgcatt cgggaaatct 2040

ctgcaaccga accagaattg ttgattgccc actcttacac ccgttattta ggtgatttat 2100

ccgggggaca aattctcaaa aacattgctg tgacagcgat gaatttgaat gatgggcaag 2160

gaactgcatt ttatgagttc gcagatattt ctgatgagaa agcttttaag gctaaatatc 2220

gtccaacatt agatgagttg gcaattgatg aagcgacagg cgatcgcatt gttgatgaag 2280

ctaacgccgc ttttggtatg aacatgaaaa tgttccaaga actagaaggg aacctcatca 2340

aggcaatcgg catgatgctg ttcaacacct tgactcgcaa gcgcacacgc ggcgctaccg 2400

aactagccac tgcagagtat cccatggtaa tgactaaaaa cccaagaaat aacaaaccaa 2460

aaaagatttt agattcatct tataaatcta aaacaatctg gcaaaattat attgatgctc 2520

tatttgaaac atttccacag ttagaaatat ctgaggtatg ggcaaaatgg gatggtggga 2580

acgtcactaa ggacggtgga gatgctaaac ttacagcaaa tatccgtaca ggagaacact 2640

ttctaaaggc aagagaggca cacatagtag atcctaactc tgacatatac aataccatac 2700

tctatcctaa aacaggagca gatctgcctt gttttggtat ggatctgatg aagtttagtg 2760

ataagaaggt cattatagta tttgacttcc agcatccaag agagaagtat ctgttctctg 2820

ttgatggact acccgaagat gatggtaagt atagattctt tgaaatgggt aatcatttct 2880

ctaagaatat ctttgtaaga tactgtaaac ctgatgaagt ggatcaatat cttgatacct 2940

ttaaattata cttgacaaag tataaagaga tgatagataa caataaacct gttggtgaag 3000

ataccacagt ctatagtgac tttgatactt atatgactga acttgatcct gttagaggat 3060

atatgaagaa taagtttggt gagggtagat cagaggcatt tgtaaacgat ttcctttttt 3120

catacaaatg a 3131

<210> 8

<211> 121

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 8

Met Lys Lys Lys Asp Thr Cys Glu Ile Phe Cys Tyr Asp Glu Glu Lys

1 5 10 15

Val Asn Arg Ile Gln Gly Asp Leu Gln Thr Val Asp Ile Ser Gly Val

20 25 30

Ser Gln Ile Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Arg Ala Lys Ile Thr

35 40 45

Tyr Ala Leu Cys Gln Asp Glu Glu Leu Cys Val Cys Asp Ile Ala Asn

50 55 60

Ile Leu Gly Val Thr Ile Ala Asn Ala Ser His His Leu Arg Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Lys Gln Gly Val Val Asn Phe Ile Lys Glu Gly Lys Leu Ala Leu

85 90 95

Tyr Ser Leu Gly Asp Glu His Ile Arg Gln Ile Met Met Ile Ala Leu

100 105 110

Ala His Lys Lys Glu Val Lys Val Asn

115 120

<210> 9

<211> 172

<212> PRT

<213> Spirulina subsalsa FACHB351

<400> 9

Met Phe Asp Ala Phe Thr Arg Val Val Ser Gln Ala Asp Ser Arg Gly

1 5 10 15

Glu Phe Leu Ser Gly Glu Gln Leu Asp Ala Leu Ser Ala Met Val Ala

20 25 30

Asp Gly Asn Lys Arg Leu Asp Val Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ser

35 40 45

Ala Ala Ile Val Thr Asp Ala Ala Arg Ala Leu Phe Ala Glu Gln Pro

50 55 60

Gln Leu Val Gln Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala

65 70 75 80

Ala Cys Leu Arg Asp Met Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala

85 90 95

Thr Leu Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly

100 105 110

Leu Arg Glu Thr Tyr Gln Ala Leu Gly Val Pro Gly Ala Ser Val Ala

115 120 125

Ala Gly Val Ala Lys Met Lys Asp Ala Ala Val Lys Ile Ala Asn Asp

130 135 140

Pro Asn Gly Ile Thr Gln Gly Asp Cys Ser Gln Leu Met Ser Glu Val

145 150 155 160

Ala Ser Tyr Phe Asp Arg Ala Ala Ala Ala Val Ala

165 170

<210> 10

<211> 188

<212> PRT

<213> Nostoc sp. PCC7120

<400> 10

Asn Ile Glu Glu Phe Phe Glu Leu Ser Ala Gly Lys Trp Phe Ser His

1 5 10 15

Arg Thr Ser His His Leu Ala Phe Lys Gln Ser Glu Asp Gly Lys Ser

20 25 30

Asp Leu Val Ile Glu Ser Leu Ala Ala Asp His Pro Glu Val Ile Lys

35 40 45

Leu Cys Glu Leu Tyr Glu Val Pro Ala Ser Ala Ala Ser Cys Gly Ala

50 55 60

Arg Val Ser Trp Asn Gly Thr Met Glu Trp Asp Glu Glu Lys His Thr

65 70 75 80

Gly Ser Thr Val Leu Ala Thr Val Pro Asp Val Asp Asn Pro Asn Glu

85 90 95

Gly Arg Leu Leu Arg Glu Met Gly Tyr Ala Glu Lys Ala Pro Val Ala

100 105 110

Gly Arg Tyr Lys Met Gly Asp Asp Gly Ala Leu Thr Leu Thr Thr Glu

115 120 125

Tyr Glu Thr Met Trp Ser Glu Glu Arg Leu Trp Phe Ala Ser Pro Asn

130 135 140

Leu Arg Met Arg Val Ser Val Leu Lys Arg Phe Gly Gly Phe Ser Met

145 150 155 160

Ala Ser Phe Thr Ser Glu Ile Arg Met Gly Gly Ser Pro Ala Ala Ala

165 170 175

Lys Ala Glu Glu Ala Ala Asn Ser Ala Ser Ser Gly

180 185

<210> 11

<211> 239

<212> PRT

<213> Nostoc sp. PCC7120

<400> 11

Met Ser Ser Asn Leu Ala Asn Lys Leu Arg Val Gly Thr Lys Lys Ala

1 5 10 15

His Thr Met Ala Glu Asn Val Gly Phe Val Lys Cys Phe Leu Lys Gly

20 25 30

Val Ala Glu Lys Ser Ser Tyr Arg Lys Leu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr

35 40 45

Val Tyr Ser Ala Met Glu Glu Glu Met Glu Lys His Ser Gln His Pro

50 55 60

Ile Val Ser Lys Ile Asn Phe Ser Gln Leu Asn Arg Lys Gln Thr Leu

65 70 75 80

Glu Gln Asp Leu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ala Asn Trp Arg Glu Gln Ile

85 90 95

Gln Leu Ser Pro Ala Gly Glu Ala Tyr Val Gln Arg Ile Arg Glu Ile

100 105 110

Ser Ala Thr Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ala His Ser Tyr Thr Arg Tyr

115 120 125

Leu Gly Asp Leu Ser Gly Gly Gln Ile Leu Lys Asn Ile Ala Val Thr

130 135 140

Ala Met Asn Leu Asn Asp Gly Gln Gly Thr Ala Phe Tyr Glu Phe Ala

145 150 155 160

Asp Ile Ser Asp Glu Lys Ala Phe Lys Ala Lys Tyr Arg Pro Thr Leu

165 170 175

Asp Glu Leu Ala Ile Asp Glu Ala Thr Gly Asp Arg Ile Val Asp Glu

180 185 190

Ala Asn Ala Ala Phe Gly Met Asn Met Lys Met Phe Gln Glu Leu Glu

195 200 205

Gly Asn Leu Ile Lys Ala Ile Gly Met Met Leu Phe Asn Thr Leu Thr

210 215 220

Arg Lys Arg Thr Arg Gly Ala Thr Glu Leu Ala Thr Ala Glu Tyr

225 230 235

<210> 12

<211> 233

<212> PRT

<213> Cyanophage P-SSM4

<400> 12

Met Thr Lys Asn Pro Arg Asn Asn Lys Pro Lys Lys Ile Leu Asp Ser

1 5 10 15

Ser Tyr Lys Ser Lys Thr Ile Trp Gln Asn Tyr Ile Asp Ala Leu Phe

20 25 30

Glu Thr Phe Pro Gln Leu Glu Ile Ser Glu Val Trp Ala Lys Trp Asp

35 40 45

Gly Gly Asn Val Thr Lys Asp Gly Gly Asp Ala Lys Leu Thr Ala Asn

50 55 60

Ile Arg Thr Gly Glu His Phe Leu Lys Ala Arg Glu Ala His Ile Val

65 70 75 80

Asp Pro Asn Ser Asp Ile Tyr Asn Thr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Gly

85 90 95

Ala Asp Leu Pro Cys Phe Gly Met Asp Leu Met Lys Phe Ser Asp Lys

100 105 110

Lys Val Ile Ile Val Phe Asp Phe Gln His Pro Arg Glu Lys Tyr Leu

115 120 125

Phe Ser Val Asp Gly Leu Pro Glu Asp Asp Gly Lys Tyr Arg Phe Phe

130 135 140

Glu Met Gly Asn His Phe Ser Lys Asn Ile Phe Val Arg Tyr Cys Lys

145 150 155 160

Pro Asp Glu Val Asp Gln Tyr Leu Asp Thr Phe Lys Leu Tyr Leu Thr

165 170 175

Lys Tyr Lys Glu Met Ile Asp Asn Asn Lys Pro Val Gly Glu Asp Thr

180 185 190

Thr Val Tyr Ser Asp Phe Asp Thr Tyr Met Thr Glu Leu Asp Pro Val

195 200 205

Arg Gly Tyr Met Lys Asn Lys Phe Gly Glu Gly Arg Ser Glu Ala Phe

210 215 220

Val Asn Asp Phe Leu Phe Ser Tyr Lys

225 230

<210> 13

<211> 975

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Lys Lys Lys Asp Thr Cys Glu Ile Phe Cys Tyr Asp Glu Glu Lys

1 5 10 15

Val Asn Arg Ile Gln Gly Asp Leu Gln Thr Val Asp Ile Ser Gly Val

20 25 30

Ser Gln Ile Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Arg Ala Lys Ile Thr

35 40 45

Tyr Ala Leu Cys Gln Asp Glu Glu Leu Cys Val Cys Asp Ile Ala Asn

50 55 60

Ile Leu Gly Val Thr Ile Ala Asn Ala Ser His His Leu Arg Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Lys Gln Gly Val Val Asn Phe Ile Lys Glu Gly Lys Leu Ala Leu

85 90 95

Tyr Ser Leu Gly Asp Glu His Ile Arg Gln Ile Met Met Ile Ala Leu

100 105 110

Ala His Lys Lys Glu Val Lys Val Asn Val Asp Met Phe Asp Ala Phe

115 120 125

Thr Arg Val Val Ser Gln Ala Asp Ser Arg Gly Glu Phe Leu Ser Gly

130 135 140

Glu Gln Leu Asp Ala Leu Ser Ala Met Val Ala Asp Gly Asn Lys Arg

145 150 155 160

Leu Asp Val Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ser Ala Ala Ile Val Thr

165 170 175

Asp Ala Ala Arg Ala Leu Phe Ala Glu Gln Pro Gln Leu Val Gln Pro

180 185 190

Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg Asp

195 200 205

Met Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala Thr Leu Ala Gly Asp

210 215 220

Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly Leu Arg Glu Thr Tyr

225 230 235 240

Gln Ala Leu Gly Val Pro Gly Ala Ser Val Ala Ala Gly Val Ala Lys

245 250 255

Met Lys Asp Ala Ala Val Lys Ile Ala Asn Asp Pro Asn Gly Ile Thr

260 265 270

Gln Gly Asp Cys Ser Gln Leu Met Ser Glu Val Ala Ser Tyr Phe Asp

275 280 285

Arg Ala Ala Ala Ala Val Ala His Met Asn Ile Glu Glu Phe Phe Glu

290 295 300

Leu Ser Ala Gly Lys Trp Phe Ser His Arg Thr Ser His His Leu Ala

305 310 315 320

Phe Lys Gln Ser Glu Asp Gly Lys Ser Asp Leu Val Ile Glu Ser Leu

325 330 335

Ala Ala Asp His Pro Glu Val Ile Lys Leu Cys Glu Leu Tyr Glu Val

340 345 350

Pro Ala Ser Ala Ala Ser Cys Gly Ala Arg Val Ser Trp Asn Gly Thr

355 360 365

Met Glu Trp Asp Glu Glu Lys His Thr Gly Ser Thr Val Leu Ala Thr

370 375 380

Val Pro Asp Val Asp Asn Pro Asn Glu Gly Arg Leu Leu Arg Glu Met

385 390 395 400

Gly Tyr Ala Glu Lys Ala Pro Val Ala Gly Arg Tyr Lys Met Gly Asp

405 410 415

Asp Gly Ala Leu Thr Leu Thr Thr Glu Tyr Glu Thr Met Trp Ser Glu

420 425 430

Glu Arg Leu Trp Phe Ala Ser Pro Asn Leu Arg Met Arg Val Ser Val

435 440 445

Leu Lys Arg Phe Gly Gly Phe Ser Met Ala Ser Phe Thr Ser Glu Ile

450 455 460

Arg Met Gly Gly Ser Pro Ala Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala Asn

465 470 475 480

Ser Ala Ser Ser Gly Asp Leu Gly Gly Gly Arg Ser Arg Thr Ser Gly

485 490 495

Ser Pro Gly Val Met Ser Ser Asn Leu Ala Asn Lys Leu Arg Val Gly

500 505 510

Thr Lys Lys Ala His Thr Met Ala Glu Asn Val Gly Phe Val Lys Cys

515 520 525

Phe Leu Lys Gly Val Ala Glu Lys Ser Ser Tyr Arg Lys Leu Val Ala

530 535 540

Asn Phe Tyr Tyr Val Tyr Ser Ala Met Glu Glu Glu Met Glu Lys His

545 550 555 560

Ser Gln His Pro Ile Val Ser Lys Ile Asn Phe Ser Gln Leu Asn Arg

565 570 575

Lys Gln Thr Leu Glu Gln Asp Leu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ala Asn Trp

580 585 590

Arg Glu Gln Ile Gln Leu Ser Pro Ala Gly Glu Ala Tyr Val Gln Arg

595 600 605

Ile Arg Glu Ile Ser Ala Thr Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ala His Ser

610 615 620

Tyr Thr Arg Tyr Leu Gly Asp Leu Ser Gly Gly Gln Ile Leu Lys Asn

625 630 635 640

Ile Ala Val Thr Ala Met Asn Leu Asn Asp Gly Gln Gly Thr Ala Phe

645 650 655

Tyr Glu Phe Ala Asp Ile Ser Asp Glu Lys Ala Phe Lys Ala Lys Tyr

660 665 670

Arg Pro Thr Leu Asp Glu Leu Ala Ile Asp Glu Ala Thr Gly Asp Arg

675 680 685

Ile Val Asp Glu Ala Asn Ala Ala Phe Gly Met Asn Met Lys Met Phe

690 695 700

Gln Glu Leu Glu Gly Asn Leu Ile Lys Ala Ile Gly Met Met Leu Phe

705 710 715 720

Asn Thr Leu Thr Arg Lys Arg Thr Arg Gly Ala Thr Glu Leu Ala Thr

725 730 735

Ala Glu Tyr Pro Met Val Met Thr Lys Asn Pro Arg Asn Asn Lys Pro

740 745 750

Lys Lys Ile Leu Asp Ser Ser Tyr Lys Ser Lys Thr Ile Trp Gln Asn

755 760 765

Tyr Ile Asp Ala Leu Phe Glu Thr Phe Pro Gln Leu Glu Ile Ser Glu

770 775 780

Val Trp Ala Lys Trp Asp Gly Gly Asn Val Thr Lys Asp Gly Gly Asp

785 790 795 800

Ala Lys Leu Thr Ala Asn Ile Arg Thr Gly Glu His Phe Leu Lys Ala

805 810 815

Arg Glu Ala His Ile Val Asp Pro Asn Ser Asp Ile Tyr Asn Thr Ile

820 825 830

Leu Tyr Pro Lys Thr Gly Ala Asp Leu Pro Cys Phe Gly Met Asp Leu

835 840 845

Met Lys Phe Ser Asp Lys Lys Val Ile Ile Val Phe Asp Phe Gln His

850 855 860

Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Phe Ser Val Asp Gly Leu Pro Glu Asp Asp

865 870 875 880

Gly Lys Tyr Arg Phe Phe Glu Met Gly Asn His Phe Ser Lys Asn Ile

885 890 895

Phe Val Arg Tyr Cys Lys Pro Asp Glu Val Asp Gln Tyr Leu Asp Thr

900 905 910

Phe Lys Leu Tyr Leu Thr Lys Tyr Lys Glu Met Ile Asp Asn Asn Lys

915 920 925

Pro Val Gly Glu Asp Thr Thr Val Tyr Ser Asp Phe Asp Thr Tyr Met

930 935 940

Thr Glu Leu Asp Pro Val Arg Gly Tyr Met Lys Asn Lys Phe Gly Glu

945 950 955 960

Gly Arg Ser Glu Ala Phe Val Asn Asp Phe Leu Phe Ser Tyr Lys

965 970 975

Claims

1.一种镉离子全细胞生物传感器，其特征在于，包括能够合成血红素的宿主细胞以及位于所述宿主细胞内的重组载体；

所述重组载体包括载体以及插入所述载体内的融合基因，所述融合基因为序列表中序列7所示的DNA序列。

2.如权利要求1所述的镉离子全细胞生物传感器，其特征在于，所述载体为质粒。

3.如权利要求2所述的镉离子全细胞生物传感器，其特征在于，所述质粒为pETDuet-1。

4.如权利要求1所述的镉离子全细胞生物传感器，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

5.如权利要求4所述的镉离子全细胞生物传感器，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli.BL21(DE3)。

6.如权利要求1-5任一项所述的镉离子全细胞生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：获取所述宿主细胞与所述重组载体，采用转化法将所述重组载体转化进入所述宿主细胞内。

7.一种如权利要求1-5任一项所述的镉离子全细胞生物传感器的应用，其特征在于，采用所述镉离子全细胞生物传感器检测水溶液中镉离子的浓度。