FI94260B - Bombyx morin nuclear polyhedrosis -yhdistelmävirus ja menetelmiä proteiinien valmistamiseksi tätä käyttäen - Google Patents
Bombyx morin nuclear polyhedrosis -yhdistelmävirus ja menetelmiä proteiinien valmistamiseksi tätä käyttäen Download PDFInfo
- Publication number
- FI94260B FI94260B FI864624A FI864624A FI94260B FI 94260 B FI94260 B FI 94260B FI 864624 A FI864624 A FI 864624A FI 864624 A FI864624 A FI 864624A FI 94260 B FI94260 B FI 94260B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- bmnpv
- protein
- gene encoding
- recombinant
- structural gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 197
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 111
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 title abstract 4
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims abstract description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 64
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 17
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 10
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 10
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 241000255791 Bombyx Species 0.000 claims description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 claims description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 15
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 83
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 19
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 18
- 239000002585 base Substances 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 14
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 12
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 11
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 10
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 7
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 7
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 7
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- YXOLAZRVSSWPPT-UHFFFAOYSA-N Morin Chemical compound OC1=CC(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 YXOLAZRVSSWPPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000007708 morin Nutrition 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 2-pyridinylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=N1 BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N 0.000 description 2
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N Gly-Asp-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N Pro-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 2
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-5-thiocyanatobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(SC#N)=CC=C1[N+]([O-])=O NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NINQYGGNRIBFSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QOIGKCBMXUCDQU-KDXUFGMBSA-N Ala-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O QOIGKCBMXUCDQU-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N Arg-Ala-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N C1CCCCC1 Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- XABFFGOGKOORCG-CIUDSAMLSA-N Cys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XABFFGOGKOORCG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QJUDRFBUWAGUSG-SRVKXCTJSA-N Cys-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)N QJUDRFBUWAGUSG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N Cys-Gly-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- MXPBQDFWIMBACQ-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O MXPBQDFWIMBACQ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N Glu-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N Gly-Pro-Ala-Gly-Pro Natural products C1CCC(C(O)=O)N1C(=O)CNC(=O)C(C)NC(=O)C1CCCN1C(=O)CN CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Glu Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- YJNDFEWPGLNLNH-IHRRRGAJSA-N Met-Tyr-Cys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YJNDFEWPGLNLNH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- JEGFCFLCRSJCMA-IHRRRGAJSA-N Phe-Arg-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JEGFCFLCRSJCMA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KAHUBGWSIQNZQQ-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KAHUBGWSIQNZQQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KRYSMKKRRRWOCZ-QEWYBTABSA-N Phe-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KRYSMKKRRRWOCZ-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- DXWNFNOPBYAFRM-IHRRRGAJSA-N Phe-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N DXWNFNOPBYAFRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MRYUJHGPZQNOAD-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 MRYUJHGPZQNOAD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N Ser-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- OMRWDMWXRWTQIU-YJRXYDGGSA-N Thr-Tyr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O OMRWDMWXRWTQIU-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLOYGOZDPGYWFO-LAEOZQHASA-N Val-Asp-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VLOYGOZDPGYWFO-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N Val-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N Val-Cys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010091092 arginyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 108010079413 glycyl-prolyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108010007375 seryl-seryl-seryl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
94260
Bombyx morin nuclear polyhedrosis -yhdistelmävirus ja menetelmiä proteiinien valmistamiseksi tätä käyttäen Tämä keksintö koskee Bombyx morin (silkkiäistoukka) 5 nuclear polyhedrosis -yhdistelmäviruksia sekä menetelmiä proteiinien tuottamiseksi näitä yhdistelmäviruksia käyttäen.
Menetelmä peptidien tuottamiseksi Bombyx morin nuclear polyhedrosis -virusta (BmNPV) käyttäen on jo jul-10 kaistu (viite 1; tässä lainatut viitteet löytyvät tämän julkaisun lopusta).
Keskeisenä piirteenä tässä menetelmässä on yhdis-telmä-BmNPV:n muodostaminen halutun proteiinin rakennegee-nin kanssa korvaamalla polyhedraalista proteiinia koodit-15 tavan rakennegeenin osa yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen ja saattamalla rekombinantti lisääntymään viljellyissä silkkiäistoukissa (Bombyx mori), jolloin niissä muodostuu haluttua proteiinia. Tämä menetelmä ei kuitenkaan ole täysin tyydyttävä haluttujen proteiinien saantojen kannalta. 20 Lisäksi fuusioitujen proteiinien valmistaminen
Escherichia coli -bakteerissa on jo olemassa olevaa käytäntöä. Saantojen ei kuitenkaan voida sanoa parantuneen (viitteet 2-8).
Tämä keksintö siis koskee Bombyx morin nuclear po-25 lyhedrosis -yhdistelmävirusta (BmNPV), jolle on tunnusomaista, että se sisältää seuraavat osat toiminnallisesti liitettyinä seuraavassa järjestyksessä 5'-päästä 3'-päähän: (i) 5 ' -ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunpe-30 rin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit- tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen koko-35 naisena tai toiminnallisen osan siitä; 2 94260 (iii) kytkijäemässekvenssin, joka koodittaa kytki-jäpeptidin tai -aminohappoja; (iv) translaation aloituskodonin; (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on 5 eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne- geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia, ja (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo-dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää 10 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n muodostamiseksi.
Tämä keksintö koskee myös menetelmää sellaisen fuusioidun proteiinin tuottamiseksi joka koostuu koko poly-hedraalisesta proteiinista tai sen toiminnallisesta osas-15 ta, kytkijäpeptidistä tai -aminohapoista sekä geenituotteesta. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että (A) yhdistelmä-BmNPV, joka sisältää seuraavat osat toiminnallisesti liitettyinä seuraavassa järjestyksessä 20 5'-päästä 3'-päähän: (i) 5'-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit-tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n 25 muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen kokonaisena tai toiminnallisen osan siitä; (iii) -kytki jäemässekvenssin, joka koodittaa kytki-jäpeptidin tai -aminohappoja; 30 (iv) translaation aloituskodonin; : (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne-geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia, ja (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alun-35 perin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo- • ·« I* IN I «iti· I l l«l · 3 94260 dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n muodostamiseksi, saatetaan lisääntymään Bombyx mori -soluiinjavil-5 jelmässä tai elävissä silkkiäistoukissa, (B) tuotetaan fuusioitu proteiini, ja (C) eristetään fuusioitu proteiini.
Lisäksi tämä keksintö koskee menetelmää sellaisen geenituotteen (halutun proteiinin) tuottamiseksi, joka on 10 eksogeeninen BmNPV:n suhteen. Tässä keksinnön mukaisessa menetelmässä tuotetaan edellä kuvatulla tavalla fuusioitu protieiini ja pilkotaan fuusioitu proteiini sen kytkevästä kohdasta, jolloin saadaan geenituote.
Tämä keksintö koskee edelleen plasmidia, jolle on 15 tunnusomaista, että se sisältää seuraavat osat toiminnallisesti liitettyinä seuraavassa järjestyksessä 5’-päästä 3’-päähän: (i) 5'-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit- 20 tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen kokonaisena tai toiminnallisen osan siitä; 25 (lii) mahdollisesti kytkijäemässekvenssin, joka koodittaa kytkijäpeptidin tai -aminohappoja; (iv) translaation aloituskodonin; (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne- 30 geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia ja joka ·· mahdollisesti sisältää geenituotteen terminaattorin emäs- sekvenssin, ja (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo- 35 dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää • » 4 94260 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n muodostamiseksi. Vielä lisäksi tämä keksintö koskee menetelmää yhdistelmä-BmNPV:n DNA:n tuottamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että kotransfektoidaan viljelty 5 Bombyx mori -solulinja tai eläviä silkkiäistoukkia BmNPV:n DNA:11a ja plasmidilla, joka sisältää seuraavat osat toi-minallisesti liitettyinä seuraavassa järjestyksessä 5'-päästä 3’-päähän: (i) 5'-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunpe-10 rin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit-tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n muodostamiseksi; ( ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen koko-15 naisena tai toiminnallisen osan siitä; (iii) mahdollisesti kytkijäemässekvenssin, joka koodittaa kytkijäpeptidin tai -aminohappoja; (iv) translaation aloituskodonin; (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on 20 eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne- geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia ja joka mahdollisesti sisältää geenituotteen terminaattorin emäs-sekvenssin, ja (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alun-25 perin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo- dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n muodostamiseksi.
Mukana olevista piirroksista 30 kuviot 1-6 esittävät kaaviomaisesti tiettyjen plas- ·· midien muodostamiskaaviot yhdistelmävirusten tuottamista varten esimerkin muodossa annettuina, kuviot 7 ja 8 esittävät halutun fuusioidun proteiinin elektroforeesikuvion.
35 Silkinviljelijät tuntevat BmNPV:n hyvin. Allekir joittaneet ovat eristäneet tyypillisen kannan, kannan T3.
• · 5 94260 Tämän kannan virus-DNA (BmNPV-DNA) on talletettu ATCC:hen USArssa ja sen talletusnumero on ATCC 40188.
Polyhedraalisen proteiinin rakennegeenin sisältävän osan eristämiseksi tästä virus-DNA:sta sopii mm. EcoRI-5 käsittely, kuten viitteessä 1 on kuvattu. E. coli -kanta (E. coli K12JM83 DGB-0036), joka kantaa plasmidia pBmE36, johon on liitetty virus-DNA:n EcoRI-EcoRI-fragmentti (noin 10 500 emäsparia), on talletettu talletuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial 10 Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan, jossa sen talletusnumero on FERM BP-813.
Lisäksi, kuten viitteessä 1 on kuvattu, kun pBmE36-plasmidia käsitellään HindlII:lla, saadaan siitä noin 15 3 900 emäsparin pituinen fragmentti, joka sisältää poly hedraalisen proteiinin rakennegeenin. Sitten fragmentti liitetään kaupallisesti saatavana olevaan plasmidiin pUC9 (saatavana kaupallisesti Pharmacia P-L Biochemicals -yhtiöstä). Liitosta seuraavat EcoRI:lla pilkkominen, Bal31-20 käsittely (jolla voidaan tuottaa eripituisia fragmentteja käsittelyaikaa säätämällä) ja edelleen HindIII:lla pilkkominen tai vastaavat menetelmät tuottavat fragmentin, joka sisältää joko polyhedraalisen proteiinin geenin kokonaan tai osan sitä.
25 Halutun proteiinin rakennegeeni voidaan liittää ko konaiseen polyhedraalisen proteiinin geeniin tai osaan sitä käyttämällä sopivaa kytkijää (DNA) (viite 19) ja tuotetusta fuusioidusta proteiinista saadaan, kun se sopivia keinoja käyttäen pilkotaan siitä peptidi- tai aminohappo-30 kohdasta (kytkevä osa), joka vastaa kytkijäemässekvenssiä, haluttu proteiini, joka sitten voidaan eristää tavanomaisin menetelmin. Kun fuusioitua proteiinia voidaan käyttää sellaisenaan, ei luonnollisestikaan tarvita pilkkomispro-sessia. Tällaisessa tapauksessa kytkijää ei välttämättä 35 tarvita.
r«< 6 94260
Hyvin tunnettuja kytkijää vastaavina peptideinä tai aminohappoina (kytkevä osa), keinoina pilkkoa tai hajottaa se ovat mm. sekvenssi Ile-Glu-Gly-Arg ja veren hyytymistekijä Xa (josta tästä lähtien käytetään lyhennettä "F-Xa"), 5 joka pystyy pilkkomaan sekvenssin; Pro-Ama-Gly-Pro (jossa Ama on mikä tahansa aminohappo) ja kollagenaasi, joka pystyy pilkkomaan sekvenssin; Arg tai Phe ja trypsiini, joka pystyy pilkkomaan aminohapon jälkeisen peptidisidoksen; Tyr tai Phe ja kymotrypsiini, joka pystyy pilkkomaan ami-10 nohapon jälkeisen peptidisidoksen; Pro-Arg ja trombiini, joka pystyy pilkkomaan aminohappojen jälkeisen peptidisidoksen; tryptofaani ja N-bromisukkinimidi, joka pystyy hajottamaan aminohapon jälkeisen peptidisidoksen; ja me-tioniini ja syanogeenibromidi, joka pystyy hajottamaan 15 aminohapon jälkeisen peptidisidoksen (viitteet 2-10). Kytkevä osa ja pilkkomis- tai hajotuskeinot eivät rajoitu yllä mainittuihin ja monia muita sopivia, eri peptidien tai aminohappojen ja eri kemiallisten tai entsymaattisten menetelmien yhdistelmiä voidaan myös käyttää kytkevänä 20 osana ja pilkkomis- tai hajotuskeinona, vastaavasti.
Edullisesti haluttu proteiini ei saisi sisältää mitään peptidiä tai aminohappoa, jonka kohdalta proteiini voisi hajota altistettaessa se yllä mainitun kaltaisille kytkevän osan pilkkomis- tai hajottamismenetelmille. On ·. 25 kuitenkin mahdollista hajottaa fuusioitu proteiini rajoi tetusti käyttäen sopivasti rajoitettuja, kohtuullisia olosuhteita, jolloin saavutetaan päämäärä.
Tässä käytettynä termi "haluttu proteiini" voi olla eukaryoottinen proteiini, edullisesti imettäväisproteiini. 30 Määrättyjä esimerkkejä halutuista proteiineista ovat eri : fysiologisesti aktiiviset aineet sekä aineet, joita voi daan käyttää diagnostisina reagensseina, kuten interferonit (IFNt), kasvaimen nekroositekijä (TNF), interleukiinit ja muut lymfokiinit, insuliini, kasvuhormoni ja muut hor-35 monit, hepatiittirokote, influenssarokote ja lukuisat muut 7 94260 antigeeniproteiinit, kudosplasminogeeniä aktivoiva tekijä (TPA), somatomediinit, entsyymit, jotka soveltuvat teolliseen käyttöön, kuten steroideja muuttavat entsyymit, asylaasit, amylaasit, lipaasit ja vastaavat, ruoka-ainei-5 den lisäaineet ja ravintolisäaineet ym. Jotkut näistä aineista saattavat sisältää sokeriketjun. Tämän keksinnön mukaisesti proteiinit tuotetaan eukaryoottisissa soluissa. Kun käytetään eukaryoottisolusta peräisin olevaa geeniä, tuotettu geeni voi käydä läpi saman modifikaation tai salt) mat modifikaatiot kuin eukaryootissa in vivo tapahtuvat modifikaatiot. Siksi tämän keksinnön avulla tuotettujen tuotteiden voidaan sanoa olevan käyttökelpoisempia verrattuna bakteereissa tuotettuihin tuotteisiin.
Näitä proteiineja koodittavat geenit voivat olla 15 luonnossa esiintyvistä materiaaleista eristettyjä kromo-somaalisia DNA:itä, luonnosta peräisin olevien mRNA:iden välivaiheen kautta valmistettuja cDNA:ita, kemiallisesti syntetisoituja DNA:itä tai DNA:itä, jotka on valmistettu äsken mainittujen esimerkkien yhteydessä käytettyjen mene-20 telmien sopivalla yhdistelmällä (viitteet 18 ja 19).
Silloin kun tuote eroaa aminohapposekvenssiltään (substituutio, deleetio tai additio) aiotusta materiaalista, mutta sillä on kuitenkin vaaditut toiminnot, kuten fysiologinen aktiivisuus, modifikaatio voidaan tarkoituksel-·_ 25 lisesti tehdä tällaisen vaikutuksen aikaansaamiseksi. Esi merkiksi kun on tarkoitus hajottaa yllä mainittuun kytkevään osaan liittyvä metioniini syanogeenibromidilla, halutun proteiinin metioniinitähde tai metioniinitähteet voidaan korvata toisella aminohappotähteellä tai toisilla 30 aminohappotähteillä tai ne voidaan jättää pois. Tässä ta- pauksessa on viisasta tutkia peptidi, joka tuotetaan yllä olevan käsitteen mukaisesti muodostetun emässekvenssin perusteella sen suhteen, onko sen aktiivisuus sopiva aiottuun tarkoitukseen vai ei.
35 Tietyissä tapauksissa osa aminohappotähteestä voi jäädä haluttuun proteiinituotteeseen, kuten käy esimerkik- 8 94260 si hajotettaessa kysteiini kemiallisesti 2-nitro-5-tio-syaanibentsoehapolla. Myös tässä tapauksessa tuote olisi viisasta tutkia aktiivisuuden suhteen, kuten yllä on mainittu, jotta voidaan määrittää, sopiiko tuote aiottuun 5 tarkoitukseen vai ei.
Plasmidit (yhdistelmäplasmidit), jotka kantavat emässekvenssiä, joka sisältää Bombyx morin nuclear poly-hedrosis -viruksen DNA:n (BmNPV-DNA) kokonaisen polyhed-raalisen proteiinin geenin tai osan sitä sekä halutun pro-10 teiinin rakennegeenin yhteenliitettynä (joko kytkijä sijoitettuna väliin tai ilman kytkijää), siis siihen liitetyn fuusioidun proteiinin geenin, voidaan tuottaa käyttämällä tavanomaisia yhdistelmä-DNA-menetelmiä, restriktio-entsyymejä ja muita aineita, jotka ovat kaupallisesti saa-15 tavilla. Tällaisia plasmideja voidaan rutiinisti tuottaa tässä myöhemmin kuvattujen esimerkkien avulla.
Yhdistelmävirusten tuottamiseksi yllä olevia plasmideja käyttäen muodostetun Bombyx mori -solulinjan solut sekainfektoidaan rekombinaatioon käytetyllä plasmidilla ja 20 BmNPV:llä, jonka jälkeen tarvittaessa eristetään yhdistel-mävirus esimerkiksi plakkimenetelmällä (viite 11) tai lai-mennusmenetelmällä (viite 12). Edullisia muodostettuja Bombyx mori -solulinjoja, joita voidaan käyttää, ovat mm. tunnetut Bm-solut (BM-N-solut, jotka on kuvattu viitteissä . 25 1, 11 ja 13; talletettu ATCC-nrolla CRL-8910) ja BM-N-so- lut, jotka on talletettu ATCC-nrolla CRL-8851. Halutun materiaalin tuottamiseksi silkkiäistoukissa, silkkiäistou-kat altistetaan virusinfektiolle injektoimalla virus (joko yhdistelmä- ja ei-yhdistelmävirusten seos tai siitä eris-30 tetty yhdistelmävirus), joka on saatettu lisääntymään vil-• jellyissä soluissa, niihin ihon kautta tai niiden ruumiin onteloon tai antamalla virus ravinnon kanssa suun kautta. Sitten silkkiäistoukkia ruokitaan keinotekoisella ravinnolla tai silkkiäispuun lehdillä sopiva aika, jotta halut-35 tua fuusioitua proteiinia kehittyisi. Yleensä fuusioitu proteiini ei liukene veteen ja on suspendoituneena silk- 9 94260 kiäistoukan ruumiinnesteessä, josta se voidaan eristää tai puhdistaa tavanomaisilla tavoilla, kuten kromatografisesti (ioninvaihtohartsi, affiniteetti, geelisuodatus jne.), sentrifugoimalla, uuttamalla ja vastaavilla tavoilla.
5 Kun silkkiäistoukka jauhetaan ja sekoitetaan liuot- timeen, kuten SDS:n vesipitoiseen liuokseen, urean vesipitoiseen liuokseen, vesipitoiseen emäksiseen liuokseen tai vastaavaan tai jauhetaan tällaisessa liuottimessa, fuusioitu proteiini voidaan eristää tai puhdistaa yllä kuva-10 tulla tavalla liuoksesta. Kun on tarkoitus pilkkoa fuusioitu proteiini, pilkkomis/hajotusprosessi voidaan suorittaa yllä kuvatulla tavalla.
Seuraavat esimerkit, joissa insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF-I ja IGF-II) sekä α-interferoni ovat ha-15 luttuja proteiineja, annetaan tämän keksinnön valaisemiseksi yksityiskohtaisemmin. Tulee kuitenkin huomata, ettei näiden esimerkkien tarkoituksena ole millään lailla rajoittaa keksinnön piiriä. Plasmidien muodostamiskaaviot on esitetty kuvioissa 1-5. Ellei toisin ole mainittu, DNA-20 sekvenssin 5' (ylöspäin)-puoli on esitetty vasemmalla puolella ja 3’ (alaspäin)-puoli oikealla puolella tavanomaisen käytännön mukaisesti.
Synteesi, pilkkominen, seulonta, eristys ja muut polyhedraalisen proteiinin geenin, haluttujen proteiinien ’ 25 geenien sekä fuusioitujen proteiinien geenien käsittelyt voidaan suorittaa viitteessä 1 kuvattuja menetelmiä käyttäen samoin kuin tavanomaisia geenimanipulointimenetelmiä käyttäen (vrt. esim. viitteet 18 ja 19).
Esimerkki 1 30 A. Polyhedrilnlgeenln sisältämättömän plasmidin i muodostaminen
Plasmidi pBmE36 (viite 1) pilkottiin EcoRl:llä ja pilkkomistuote tehtiin tylppäpäiseksi käyttäen DNA-poly-meraasi I:tä (Klenow-fragmentti) dNTP-molekyylien (neljä 35 deoksinukleosiditrifosfaattilajia) läsnä ollessa. Osittainen hajotus HindIII:lla ja sen jälkeinen agaroosigeeli- « » 10 94260 elektroforeesi tuotti polyhedriinigeenin sisältävän fragmentin. T4-ligaasia käyttäen tämä fragmentti liitettiin pUC9-fragmenttiin, joka oli saatu pilkkomalla pUC9 (saatavissa Pharmacia P-L Biochemicals -yhtiöstä) EcoRIrllä, 5 tekemällä pilkkomistuote tylppäpäiseksi Klenow-fragmenttia käyttäen sekä pilkkomalla se edelleen HindIII:lla, jolloin saatiin liittämistuote. Saatua liittämistuotetta käytettiin transformoimaan Escherichia colin K-12JM83-kanta. Sitten plasmidi otettiin talteen ja nimettiin p9BmE36:ksi. 10 (Yllä oleva menetelmä on kuvattu viitteessä 19.)
EcoRV-tunnistuskohta ja Aatl-tunnistuskohta muodostettiin p9BmE36:een aloituskodonin ATG ja lopetuskodonin TAA kohtiin, vastaavasti, in vitro -mutageneesin avulla (viite 14). p9BmE36 käsiteltiin DNaasi I:llä etidiumbromi-15 din läsnä ollessa, jolloin saatiin nurrettu (nicked) plasmidi (viite 14), joka sitten liitettiin yhteen seuraavien kahden kemiallisesti syntetisoidun DNA-fragmentin kanssa: ACCTATAGAT^TCCCGAATTA (21 meeri) ja
20 EcoRV
GGTCCGGCGTAGg|cCTTAAAACAC ( 24 meeri)
AatI
25 Tämän jälkeen käsittely polymeraasi l:llä ja T4- ligaasilla tuotti heterodupleksiplasmidin, jota sitten käytettiin transformoimaan E. colin K-12JM83-kanta. Trans-formointi suoritettiin uudelleen halutun mutantin saamiseksi. Näin saatiin plasmidi p9BmM36.
30 Polyhedriinigeenin eliminoimiseksi p9BmM36:sta ja monikytkijän liittämiseksi syntetisoitiin kemiallisesti seuraavat kaksi DNA-fragmenttia (molemmat 38-meerejä):
CTAAGAGCTCCCGGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG j a 35 CCTATCTAGATATCCATGGAATTCCCGGGAGCTCTTAG
11 94260 Nämä kaksi fragmenttia ovat komplementaarisia toistensa kanssa ja sisältävät Sacl-, Smal-, EcoRI-, Ncol-, EcoRV- ja Xbal-tunnistuskohdat.
Yllä olevat kaksi fragmenttia fosforyloitiin vas-5 taavista 5'-päistään T4-kinaasia käyttäen, jonka jälkeen ne liitettiin yhteen. Yhteenliitetty tuote liitettiin T4-ligaasin läsnä ollessa polyhedriinigeenin sisältämättömään fragmenttiin, joka oli saatu pilkkomalla pBmM36 EcoRV:llä ja Aatlzllä. Tällä menetelmällä saatiin muodostetuksi 10 Bglll-tunnistuskohta ja Aatl-tunnistuskohta kytkijän 5’-puolelle ja 3’-puolelle, vastaavasti. Saatua plasmidia käytettiin transformoimaan E. colin K-12JM83-kanta, jonka jälkeen se otettiin talteen ja nimettiin pBM030:ksi.
pBM030:n DNA-sekvenssi ja monikytkijäosan pilkkou-15 tumiskohdat on esitetty alla verrattuna p9BmE36:n poly-hedriinigeeniosaan.
p9BmE36 --------tgtaataaaaaaacctataaat^tg| - pBM030 --------TGTAATAAAAAAACCTATAlGATjcTA -
20 E@i II
|
Polyhedraalisen -proteiinin geeni-|taa|---- 25 AGAGCljcCcjsGGjAATTcbATGGAT^TcIrAGATAGGCCTlrAAl---
Sacl Smal EcoRI Ncol EcoRV Xbal Aa tl Peräisin synteettisestä i ----DNA:sta >! 30 B. Osittain puutteellisen polyhedriinigeenin sisäl tävän plasmidin muodostaminen
Plasmidi p9H18 (viite 1) pilkottiin EcoRI:llä, jonka jälkeen se käsiteltiin Bal31:llä, jolloin osa emäspa-reista pilkkoutumiskohdan jommaltakummalta puolelta pois-35 tettiin. Vaihtelemalla Bal31-käsittelyaikaa tuotettiin eripituisia fragmentteja. Nämä fragmentit käsiteltiin 12 94260
Hlndlll:lla ja erotettiin 0,7 % agaroosigeelielektroforee-silla, jonka jälkeen ne uutettiin geelistä, jolloin saatiin eripituisia virusperäisiä DNA-fragmentteja.
Plasmidi pUC9 käsiteltiin Smal:llä ja HindIII:lla, 5 jonka jälkeen saadut fragmentit liitettiin aikaisemmin saatuihin DNA-fragmentteihin (joissa oli tylppä pää ja Hindlll-pää). Näin tuotettuja plasmideja käyttäen transformoitiin E. colin K-12JM83-kanta, jota sitten kasvatettiin. Plasmidit otettiin talteen ja jokaisen virusperäisen 10 insertti-DNA-fragmentin emäsjärjestys 3'-päästä lukien määritettiin dideoksimenetelmällä (viite 15) käyttäen alu-ketta (15-emäksinen M13:n sekvenssointialuke), jolloin virusperäinen polyhedraaligeenin osa identifioitiin. Näin löydettiin Serebryani et ai:n (viite 16) kuvaamaa polyhed-15 raalisen proteiinin aminohapposekvenssiä vastaava emässek-venssi virusperäisten DNA-fragmenttien emässekvenssien joukosta. Myös translaation aloituskodoni ATG ja lopetus-kodoni TAA identifioitiin.
Bal31-käsittelyajan pituudesta riippuen saatujen 20 eri plasmidien (p9B-sarjan plasmidit) joukosta ne plasmidit, joista puuttui 212, 338, 662 ja 727 emäsparia poly-hedriinigeenin translaation aloituskodonista ATG alaspäin nimettiin p9B240:ksi, p9B120:ksi, p9B115:ksi ja p9B086:ksi, vastaavasti. Polyhedriinigeenin pituus on 738 25 emäsparia mukaan lukien lopetuskodoni TAA.
94260 123 40
ATGCCGAATT ATTCATACAC CCCCACCATC GGGCGTACTT
ACGTGTACGA CAATAAATAT TACAAAAACT TGGGCTGTCT
5 TATCAAAAAC GCCAAGCGCA AGAAGCACCT AGTCGAACAT
GAACAAGAGG AGAAGCAATG GGATCTTCTA GACAACTACA
TGGTTGCGCA AGATCCCTTT TTAGGACCGG GCAAAAACCA
AAAACTTACC CTTTTTAAAG AAATTCGCAG TGTGAAACCC 1 o p9B240·^—
GATACCATGA AGTTAATCGT CAACTGGAGC GGCAAAGAGT
TTTTGCGTGA AACTTGGACC CGTTTTGTTG AGGACAGCTT
CCCCATTGTA AACGACCAAG AGGTGATGGA CGTGTACCTC 15 p9Bl20^r-
GTCGCCAACC TCAAACCCAC ACGCCCCAAC AGGTGCTACA AGTTCCTCGC TCAACACGCT CTTAGGTGGG AAGAAGACTA CGTGCCCCAC GAAGTAATCA GAATTATGGA GCCATCCTAC
20
GTGGGCATGA ACAACGAATA CAGAATTAGT CTGGCTAAAA
AGGGCGGCGG CTGCCCAATC ATGAACATCC ACAGCGAGTA
CACCAACTCG TTCGAGTCGT TTGTGAACCG CGTCATATGG
25 GAGAACTTCT ACAAACCCAT CGTTTACATC GGCACAGACT
CTGCCGAAGA AGAGGAAATC CjTAATTGAGG TTTCTCTCGT p9BH5^
TTTCAAAATA AAGGAGTTTG CACCAGACGC GCCTCTGTTC
30 ACTGGTGCGG CGTATTAA
p9B036 14 94260 C. α-lnterferonlsta ja polyhedraallsesta proteiinista muodostuneen fuusioidun proteiinin geenin muodostaminen plFN2B310 (viite 1) pilkottiin Smaltllä ja a-IFN-5 J-fragmentti eristettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tämä liitettiin Smal:llä pilkottuun pBM030:een T4-ligaasia käyttäen ja saatua plasmidia käytettiin transformoimaan E. colin K-12JM83-kanta. Yhdistelmäplasmidi nimettiin pBT310:ksi sen jälkeen kun oli varmistettu, että se sisäl-10 si a-IFN-J-geenin oikeassa suunnassa liitettynä.
pBT310 pilkottiin BglII:lla ja pilkkomistuote tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-fragmenttia käyttäen dNTP-mo-lekyylien läsnä ollessa, jonka jälkeen se pilkottiin Scaltllä. a-IFN-J-geenin sisältävä fragmentti eristettiin 15 agaroosigeelielektroforeesilla.
p9B086 pilkottiin EcoRI:llä ja Scal:llä ja polyhed-riinigeenin sisältävä fragmentti eristettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tämä fragmentti tehtiin tylppäpäiseksi Sl-nukleaasia käyttäen ja liitettiin yllä mainittuun a-20 IFN-J-geenin sisältävään fragmenttiin T4-ligaasia käyt täen. E. colin K-12JM83-kanta transformoitiin saadulla plasmidilla. Sitten dideoksimenetelmällä varmistettiin, että näin saadun plasmidin liitoskohdan DNA-sekvenssi oli oikea. Plasmidi nimettiin pIFNF086:ksi.
25 Liitoskohdan DNA-sekvenssi oli seuraava: 086 1
Polyhedriinigeeni---GGTj-GGG-GAT-CTA-AGA-GCT- CCC-GGG-ATG-GCC--- (a=INF-J) 30 Met-Ala--- D. IGF-I;stä ja polyhedraallsesta proteiinista muodostuvan fuusioidun proteiinin geenin muodostaminen
Plasmidi pIGFOOl otettiin talteen E. colin K12 35 MC1061 IGF001 -kannasta (FERM BP-932) ja pilkottiin Sällillä. Pilkkomistuote tehtiin tylppäpäiseksi Klenow- 15 94260 fragmenttia käyttäen dNTP-molekyylien läsnä ollessa sekä pilkottiin Avail:11a ja IGF-I:n geenin sisältävä fragmentti eristettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
pBM030 pilkottiin erikseen EcoRV:llä ja Sacl:llä.
5 Kävi ilmi, että aminohapposekvenssi Ile-Glu-Gly-
Arg tulisi viedä polyhedraalisen proteiinin ja IGF-I:n väliin fuusioitua proteiinia muodostettaessa, jotta fuusioitu proteiini voitaisiin tunnistaa ja pilkkoa veren hyytymistekijä Xa:lla (F-Xa). Tätä tarkoitusta varten syn-10 tetisoitiin kemiallisesti seuraavat kaksi DNA-fragmenttia: ATTGAAGGCAGAG (13 meeri) ja GACCTCTGCCTTCAATAGCT (20 meeri).
15 Nämä kaksi fragmenttia ovat komplementaarisia tois tensa kanssa ja yhteenliittämisen jälkeen muodostavat 5'-puolelle kohesiivisen pään, joka voidaan kytkeä Sacl-pilk-koutumispäähän, ja 3'-puolelle kohesiivisen pään, joka voidaan kytkeä Avall-pilkkoutumispäähän.
20 Nämä kaksi fragmenttia fosforyloitiin kumpikin 5'- päästään T4-kinaasia käyttäen, jonka jälkeen ne liitettiin yhteen. Yhteenliitetty tuote, yllä mainittu IGF-l-frag-mentti ja yllä mainittu pilkottu pBM030 liitettiin yhteen T4-ligaasia käyttäen. E. colin K-12JM83-kanta transformoi-’ 25 tiin liittämistuotteella, jolloin saatiin plasmidi. DNA- sekvenssointi dideoksimenetelmällä vahvisti, että liitos F-Xa-tunnistuskohdan ja IGF-I-geenin välillä tässä plasmi-dissa (pIGF-1030) oli oikea. PIGF-I030 pilkottiin Bglll:lla, jonka jälkeen se tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-30 fragmenttia käyttäen dNTP-molekyylien läsnä ollessa sekä pilkottiin Scal:llä ja IGF-I-geenin sisältävä fragmentti eristettiin agaroosigeelielektroforeesilla.
p9B086 pilkottiin erikseen EcoRI:llä ja Scal:llä ja tehtiin tylppäpäiseksi Sl-nukleaasia käyttäen ja polyhyd-35 riinigeenin sisältävä fragmentti eristettiin agaroosigee-lielektroforeesilla ja liitettiin yllä mainittuun IGF-I- 16 94260 geenin sisältävään fragmenttiin T4-ligaasia käyttäen. Saatua plasmidia käyttäen transformoitiin E. colin K-12JM83-kanta ja oikean liitoksen avulla muodostetun fuusioidun proteiinin geenin sisältävä plasmidi otettiin tal-5 teen ja nimettiin pIGF-IF086:ksi. Liitoskohdan DNA-sek- venssi on esitetty alla.
---- Polyhedriinigeeni —GGTGGGGATCTAAGAGCT- ATT-GAA-GGC-AGA-GGT-CCA-GAA-ACC-TTG-10 Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu- I-F-Xa-1 I_IGF-I- E. IGF-II:sta ja eripituisista polyhedraalisista proteiineista muodostettujen fuusioitujen proteiinien gee-15 nien muodostaminen
Plasmidi pEGF002 otettiin talteen E. coli K12 MC1061 IGF002 -kannasta (FERM BP-933), hajotettiin osittain Sall:llä, tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-fragmenttia käyttäen dNTP-molekyylien läsnä ollessa ja pilkottiin sit-20 ten HaeIII:lla, jonka jälkeen ajettiin polyakryyliamidi-geelielektroforeesi, jolla IGF-II-geenin sisältävä fragmentti eristettiin. Tämä fragmentti liitettiin Smal:llä pilkottuun pBM030:een T4-ligaasia käyttäen ja liittämis-tuotetta käytettiin transformoimaan E. colin K-12JM83-kan-25 ta. Näin saadun transformantin vahvistettiin kantavan plasmidia (pIGF-11030), johon oli liitetty IGF-II-geeni oikeassa suunnassa.
pIGF-11030 hajotettiin osittain EcoRI:llä, jonka jälkeen se pilkottiin Scal:llä ja IGF-II-geenin sisältävä 30 fragmentti eristettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tä mä fragmentti liitettiin T4-ligaasin läsnä ollessa fragmenttiin, joka sisälsi osan polyhedriinigeeniä ja joka oli eristetty agaroosigeelielektroforeesin avulla sen jälkeen, kun sekä p9B240, p9B120 että p9B115 oli pilkottu EcoRI:llä 35 ja Scal:llä.
17 94260 E. coli K-12JM83 -kanta transformoitiin saaduilla plasmideilla. DNA-sekvenssointi dideoksimenetelmällä vahvisti, että saatujen transformanttien kantamat plasmi-dit sisälsivät vastaavat fuusioitujen proteiinien geenit 5 oikeassa suunnassa muodostettuina.
Nämä plasmidit nimettiin pIGF-IIF240:ksi, pIGF-IIF120:ksi ja pIGF-IIF115:ksi, vastaavasti.
Jokaisen plasmidin liitoskohdan DNA-sekvenssi on esitetty alla: 10 PIGF-IIF240 -ACCC3GGAATTC-ATG-GCT---
240 Met-Ala----IGF- II
15 PIGF-IIF120 -GACCGGGAATTC-ATG-GCT---
120^J Met-Ala----IGF- II
20 PIGF-IIF115 -ATCCpGGAATTC-ATG-GCT---
115 Met-Ala----IGF- II
’ 25
Esimerkki 2
Bm-solujen transfektio
BmNPV T3 -kannan virus-DNA (ATCC nro 40188) ja pIFNF086 sekoitettiin moolisuhteessa 1:100 liuoksiin I ja 30 II, joiden koostumukset ovat seuraavat, vastaavasti: I. Tislattu vesi 2,1 ml
Kantaja-DNA (lohen kives, 1 mg/ml) 50 μΐ
BmNPV-DNA 10 μΐ PIFNF086-DNA 50 μg 35 2 mol/1 kalsiumkloridi 300 μg % 18 94260 II. 50 mmol/1 HEPES-puskuri (pH 7,1), joka sisälsi 0,28 mol/1 natriumkloridia 2,5 ml
Fosfaattipuskuri (35 mmol/1 Na2HP04 -35 mmol/1 NaH2P04) 50 μΐ 5 1 ml:n annos saatua suspensiota lisättiin 4 ml:aan
Bm-soluviljelyväliainetta (TC-10-väliaine, joka sisälsi 10 % vasikan sikiön seerumia; viite 17) ja seos lisättiin Bm-soluihin (ATCC nro CRL-8910, 2 x 106 solua), jolloin yllä oleva DNA saatettiin Bm-soluihin. 20 tunnin kuluttua 10 väliaine korvattiin tuoreella väliaineella. Kun viljelmää 011 inkuboitu vielä viisi päivää, väliaine otettiin talteen ja sentrifugoitiin ja supernatantista tehtiin plakki-määritys (viite 11), jonka avulla yhdistelmävirus otettiin talteen kloonina. Tämä nimettiin vIFNF086:ksi.
15 Yhdistelmäviruskloonit VIGF-IF086, VIGF-IIF240, VIGF-IIF120 ja VIGF-IIF115 saatiin yllä kuvatulla tavalla käyttäen pIGF-IF086:ta, pIGF-IIF240:tä, pIGF-IIF120:tä ja PIGF-IIF115:tä, vastaavasti.
Esimerkki 3 20 Bm-solut (ATCC nro CRL-8910, 2 x 106 solua) infek- toitiin vIFNF086:lla lisäämällä niihin vIFNF086-suspensio (5 x 107 pfu). 30 minuutin kuluttua supernatantti heitettiin pois, 4,5 ml:n annos tuoretta väliainetta lisättiin ja inkubointia jatkettiin 25°C:ssa neljän päivän ajan. Tä-25 män jälkeen viljelmä sentrifugoitiin (1 000 rpm, 10 min) sakan saamiseksi. Tuore 500 μ1:η annos väliainetta lisättiin sakkaan ja viiden peräkkäisen jäädytys-sulatusvaiheen jälkeen seos sentrifugoitiin (15 000 rpm, 10 min). Näin saatuun sakkaan lisättiin 200 μΐ 4 % natriumdodekyylisul-30 faatti (SDS) - 10 % merkaptoetanoli -seosta. Viiden μ1:η • annosta saatua liuosta käytettiin näytteenä SDS-14 % ak-ryyliamidigeelielektroforeesissa.
Elektroforeesin jälkeen havaittiin geelissä viiva, joka vastasi odotettua fuusioitua proteiinia. Niinpä vii-35 van tiheys mitattiin densitometriä käyttäen ja sitä ver- • 19 94260 rattiin jokaisen merkkiaineen tiheyteen (jokainen merkkiaine sisälsi 1 pg proteiinia). Näin saannoksi arvioitiin 0,3 mg/ml alunperin saatua soluviljelylientä. Koska IFN:n osuus tässä fuusioidussa proteiinissa on noin 40 % mole-5 kyylipainon mukaan laskettuna, tämä saanto vastaisi jokseenkin 0,12 mg/ml:n IFN-saantoa onnistuneen pilkkomisen ja IFN:n talteenoton jälkeen. Tämä saanto on yli 20 kertaa suurempi verrattuna arvoon 5 x 1Q6 yksikköä/ml (joka vastaa 0,05 mg/ml), joka annetaan raportissa IFN:n ekspressiosta 10 Bombyx mori -soluissa (viite 1). vIGF-IF086:lla, VIGF-IIF240:llä, vIGF-11120:llä ja VIGF-IIF115:llä infek-toiduissa Bm-soluissa tuotettujen fuusioitujen proteiinien saannot mitattuna yllä kuvatulla tavalla olivat 0,5 mg, 0,1 mg, 0,4 mg ja 0,5 mg ml soluviljelmälientä 15 kohti, vastaavasti tai ilmaistuna näiden fuusioitujen proteiinien sisältämän IGF-I:n tai IGF-II:n määränä 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml ja 0,1 mg/ml, vastaavasti .
Esimerkki 4 20 A. Fuusioidun proteiinin ekspressio Bm-soluissa
Bm-solut (ATCC nro CRL-8910, 2 x 106 solua) infek-toitiin vIGF-IIF120:llä lisäämällä niihin vIGF-IIF120-sus-pensio (5 x 107 pfu). 30 minuutin kuluttua virus poistettiin, 4,5 ml:n annos tuoretta väliainetta lisättiin, inku-25 bointia jatkettiin 25°C:ssa neljän päivän ajan ja viljely-liemi sentrifugoitiin (1 000 rpm, 10 minuuttia). Näin talteen otettuun sakkaan lisättiin 500 pl tuoretta väliainetta. Viiden peräkkäisen jäädytys-sulatusvaiheen jälkeen seos sentrifugoitiin (15 000 rpm, 10 min) sakan saamisek-30 si. Tämä sakka pestiin tislatulla vedellä, liuotettiin 0,5 % SDS:ään ja liuoksesta ajettiin korkeapainenestekro-matografia (HPLC; TSK Gel Phenyl 5PWRP; Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd; liuotinsysteemi: 0,1 % trifluorietik-kahappo - 20 - 75 % asetonitriilin lineaarinen pitoisuus-35 gradientti). Näin kerättiin 2 ml:n fraktio, joka sisälsi fuusioidun proteiinin.
20 94260 B. Hajotus syanogeenibromidilla (BrCN) Tähän fraktioon lisättiin 50 μΐ 1 % SDS, seos konsentroitiin kuiviin ja konsentraatti liuotettiin 50 pl:aan tislattua vettä. 15 μ1:η annokseen liuosta lisättiin 35 μΐ 5 muurahaishappoa ja 45 μΐ 70 % muurahaishappoa, jonka jälkeen lisättiin vielä 5 μΐ syanogeenibromidiliuosta (200 pmol/ml) 70 %:ssa muurahaishapossa. Kun reaktioseok-sen oli annettu reagoida 24 tuntia huoneen lämpötilassa, se konsentroitiin kuiviin, konsentraatti liuotettiin 10 7,5 pl:aan tislattua vettä ja liuoksesta ajettiin elektro foreesi, jossa IGF-II:ta vastaava viiva havaittiin.
Niinpä fraktiosta, joka oli saatu uuttamalla VIGF-IIF120:llä infektoidut Bm-solut vesipitoisella SDS-liuoksella ja osittain puhdistamalla korkeapainenestekro-15 matografisesti, saatiin SDS - 16 % polyakryyliamidigeeli-elektroforeesissa noin 23 K:n viiva, joka vastasi poly-hedraalisen proteiinin (osittain) ja IGF-II:n muodostamaa fuusioitua proteiinia, kun taas syanogeenibromidihajotuksen tuotteesta saatiin IGF-II:ta vastaava noin 7 K:n viiva 20 sekä useita 10 - 14 K:n viivoja, jotka oletettavasti johtuivat polyhedraalisen proteiinin hajoamistuotteista (ks. kuviot 8, jossa A on merkkiaineet, B on fuusioitu proteiini ja C on syanogeenibromidilla hajotettu tuote).
C. IGF-IP:n N-pään määrittäminen 25 Yllä kuvatulla tavalla saatiin noin 20 mg fuusioi tua proteiinia 50 ml:sta vIGF-IIF120:llä infektoitujen Bm-solujen viljelmää, fuusioitu proteiini hajotettiin syanogeenibromidilla ja reaktioseos konsentroitiin.
Konsentraatti liuotettiin 5 ml:aan 200 mmol/1 pyri-30 diini-etikkahappopuskuria (pH 3,0) ja liuoksesta ajettiin l pylväskromatografia (SP-Toyopearl; Toyo Soda Manufacturing
Co., Ltd; liuotinsysteemi: 200 mmol/1 pyridiini-etikkahap-popuskuri (pH 3,0) - 2,0 mol/1 pyridiinietikkahappopuskuri (pH 5,0) sisältäen lineaarisen pitoisuusgradientin). Näin 35 kerättiin fraktio, joka sisälsi IGF-II:ta. Tämä fraktio kylmäkuivattiin, liuotettiin tislattuun veteen ja liuok- 21 94260 sesta ajettiin korkeapainenestekromatografia (HPLC; ODS-120T; Toyo Manufacturing Co., Ltd.; lluotlnsysteemi: 0,1 % trifluorietikkahappo - 10 - 65 % asetonitrlilin lineaarinen pitoisuusgradientti). Saadun puhtaan IGF-II:n 5 peptidisekvenssi määritettiin (470A Protein Sequencer;
Applied Biosystems). Näin varmistettu IGF-II:n aminotermi-naalinen aminohappojärjestys on esitetty alla.
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu 10 Leu Val Asp Thr Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser
Esimerkki 5 A. Fuusioidun proteiinin ekspressio Bm-soluissa 15 Plasmidi pEGFOOl otettiin talteen E. colin K12 MC1061 IGF 001 -kannasta (FERM BP-932) ja hajotettiin Sällillä. Pilkkomistuote tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-fragmenttia käyttäen dNTP-molekyylien läsnä ollessa sekä pilkottiin Avail:11a ja IGF-I-geenin sisältävä fragmentti 20 eristettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla. PIGF-IIF120 pilkottiin erikseen EcoRVillä ja EcoRIillä IGF-II-geenin sisältävän fragmentin poistamiseksi. Kävi ilmi, että aminohapposekvenssi Gly-Pro-Ala tulisi toistuvasti viedä polyhedraalisen proteiinin ja IGF-I:n väliin 25 fuusioitua proteiinia muodostettaessa, niin että kollage- naasi, joka tunnistaa aminohapposekvenssin Pro-Ama-Gly-Pro (Ama: mikä tahansa aminohappo) ja pilkkoo Ama:n ja Gly:n välistä, voisi tunnistaa ja pilkkoa fuusioidun proteiinin. Tähän tarkoitukseen syntetisoitiin kemiallisesti 30 seuraavat kaksi DNA-fragmenttia: AATTGGGCCCAGCTGGTCCAGCTGGTCCCGCGGGTGAATTCATTGAAGGCAGAG (54 meeri) GACCTCTGCCTTCAATGAATTCACCCGCGGGACCAGCTGGACCAGCTGGGCCC 35 (53 meeri) • 22 94260 Nämä fragmentit ovat komplementaarisia toistensa kanssa ja yhteenliittämisen jälkeen muodostavat 5’ -puolelle kohesiivisen pään, joka voidaan liittää EcoRI-pilkko-mispäähän, ja 3'-puolelle kohesiivisen pään, joka voidaan 5 liittää AvalI-pilkkomispäähän.
Nämä kaksi fragmenttia fosforyloitiin kumpikin 5'-päistään T4-kinaasia käyttäen, jonka jälkeen ne liitettiin yhteen. Yhteenliitetty tuote, yllä mainittu IGF-I-fragmentti ja yllä mainittu pilkottu pIGF-IIF120 liitet-10 tiin yhteen T4-ligaasia käyttäen. E. coli K-12JM83 -kanta transformoitiin yhdistämistuotteella plasmidin tuottamiseksi, joka nimettiin pIGF-lF120:ksi. DNA-sekvenssointi dideoksimenetelmää käyttäen varmisti, että liitoskohta kollagenaasin tunnistuskohdan ja IGF-I-geenin välillä oli 15 oikea. Liitoskohdan DNA-sekvenssi on esitetty alla.
_ Kollagenaasin tun-_ nistuskohta l201 Φ i
20 GACCGG GAA TTG GGC CCA GCT GGT CCA GCT GGT CCC GCG GGT GAA
Glu Leu Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu TTC ATT GAA GGC AGA GGT CCA-----
Phe Ile Glu Gly Arg Gly Pro 25 I-» IFG-I
Esimerkissä 2 kuvatulla tavalla saatiin yhdistel-mävirus vIGF-IF120 pIGF-IF120:tä käyttäen.
Esimerkissä 4 (a) kuvatulla tavalla Bm-solut infek-30 toitiin vIGF-IF120:llä ja jäädytys-sulatusvaiheen jälkeen Bm-solut otettiin talteen 50 ml:sta viljelmälientä ja sentrifugoitiin (15 000 rpm, 10 min) sakan saamiseksi. Tämä sakka liuotettiin 6 mol/1 guanidiinihydrokloridiliuok-seen ja sentrifugoitiin (15 000 rpm, 5 min) jäännöksen 35 poistamiseksi. Liuos dialysoitiin tislattua vettä vastaan 23 94260 ja saatu sakka otettiin talteen sentrifugoimalla (15 000 rpm, 10 min).
B. Pilkkominen kollagenaasilla Näin saatu sakka liuotettiin 800 pl:aan 10 mol/1 5 urealiuosta, jonka jälkeen liuokseen lisättiin 100 μΐ 200 mmol/1 kalsiumkloridia, 200 μΐ 250 mmol/1 Tris-hyd-rokloridipuskuria (pH 7,4) ja 900 μΐ kollagenaasiliuosta (Sigma Chemical Co; 1 500 μ/l). Kahden tunnin 30°C:ssa in-kuboinnin jälkeen tämä seos sentrifugoltlin (15 000 rpm, 10 5 min) supernatantin talteenottoa varten. Tästä superna- tantista ajettiin ioninvaihtokromatografia (DEAE-Toyo-pearl; Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd; liuotinsysteemi: 25 mmol/1 Tris-hydrokloridipuskuri (pH 7,4)). Näin otettiin talteen fraktio, joka sisälsi IGF-I:n yhdessä amino-15 päässä olevien ylimääräisten aminohappotähteiden kanssa (josta tästä lähtien käytetään lyhennystä "IGF-IP").
C. IGF-IP:n N-pään määritys
Fraktio, joka sisälsi IGF-IP:n, konsentroitiin ja konsentraatista ajettiin korkeapainenestekromatografia 20 (HPLC; RPSC; Beckman Co; liuotinsysteemi: 0,1 % trifluo-rietikkahappo - 10 - 65 % asetonitriilin pitoisuusgra-dientti). Saadun puhtaan IGF-IP:n peptidisekvenssi määritettiin (470A Protein Sequencer; Applied Biosystems) ja kävi ilmi, että kollagenaasi oli pilkkonut fuusioidun pro-25 teiinin odotetusta kohdasta. Näin varmistettu IGF-IP:n aminoterminaalinen aminohapposekvenssi on esitetty alla. Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Phe-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu.
Esimerkki 6 30 Polyhedriini-IGF-I-fuusioidun proteiinin ekspressio ; Bombyx mori -silkkiäistoukissa
Silkkiäistoukat (Bombyx mori) infektoitiin iholle 5. toukka-asteen päivänä 1 vIGF-IF086-suspensiolla annoksella 0,5 ml/pää (107 pfu), jonka jälkeen niitä ruokittiin 35 silkkiäispuun lehdillä 25°C:ssa kolmen päivän ajan. Sitten 24 94260 näytteenottoneula työnnettiin vatsan lisäkkeeseen (abdominal appendage) ja ruumiinneste otettiin talteen jäillä jäähdytettyyn Eppendorf-putkeen. Ruumiinneste sentrifu-goitiin (15 000 rpm, 10 min), sakka liuotettiin 200 pl:aan 5 4 % SDS - 10 % merkaptoetanoliseosta ja 2 μ1:η annosta saatua liuosta käytettiin näytteenä SDS - 14 % akryyliami-digeelielektroforeesissa. Fuusioitua proteiinia vastaava viiva havaittiin geelissä elektroforeesin jälkeen. Niinpä viivan tiheys mitattiin densitometriä käyttäen ja sitä 10 verrattiin kunkin merkkiaineen tiheyteen (jokainen viiva sisälsi 1 pg proteiinia). Siten saanto arvioitiin 5 mg:ksi ml ruumiinnestettä kohti. (Molekyylipainoon perustuvat laskelmat osoittavat, että IGF-I voitaisiin ottaa talteen tästä fuusioidusta proteiinista saannolla 1 mg/ml IGF-I:n 15 erottamisen jälkeen.) SDS - 14 % polyakryyliamidigeelielektroforeesissa BmNPV-T3-kannalla infektoiduista silkkiäistoukista saadusta ruumiinnesteestä saatiin selvä viiva molekyylipainon noin 30 K kohdalla, mikä vastaa polyhedraalista proteii-20 nia, kun taas VIGF-IF086:11a infektoitujen silkkiäistouk- kien ruumiinnesteestä ei saatu lainkaan viivaa, joka vastaisi polyhedraalista proteiinia, mutta geelissä näkyi noin 36 K:n viiva, joka oli ominainen polyhedraalisesta proteiinista ja IGF-I:stä muodostuneelle fuusioidulle pro-25 teiinille (ks. kuvio 7, jossa A on merkkiaineet, B on VIGFIF086:11a infektoitu ruumiinneste ja C on BmNPV-T3:lla infektoitu ruumiinneste).
Yllä olevissa esimerkeissä käytettyjen jokaisen IGF-II:n synteettisen geenin DNA-sekvenssi on esitetty 30 alla yhdessä vastaavien aminohapposekvenssien kanssa.
IGF-I
25 94260
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly ---TCGAATTC ATG GGT CCA GAA ACC TTG TGT GGT
Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe Val Cys
5 GCT GAA TTG GTT GAC GCT TTG CAA TTC GTT TGT
Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr
GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTC AAC AAG CCA ACT
Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin
10 GGT TAC GGA TCC TCT TCC AGA AGA GCT CCA CAA
Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser
ACT GGT ATC GTC GAT GAA TGT TGT TTC AGA TCT
^ Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala TGT GAC TTG AGA AGA TTG GAA ATG TAC TGT GCT
Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala
CCA TTG AAG CCA GCT AAG TCT GCT TAG TCGACTG
IGF-II
20
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu
—AATTC ATG GCT TAC AGA CCA TCT GAA ACC TTG
25 Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gin Phe TGT GGT GGT GAA TTG GTC GAC ACC TTG CAA TTC
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg
GTT TGT GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTT TCC AGA
Ο Λ
Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly
CCA GCC TCC AGA GTT TCT AGA AGA TCC AGA GGT
Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp
ATC GTC GAA GAA TGT TGT TTC AGA TCC TGT GAC
-} 5
Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro
TTG GCT TTG TTG GAA ACT TAC TGT GCC ACC CCA
Ala Lys Ser Glu GCC AAG TCC GAA TAG---- 26 94260
Viitteet: 1: Nature 315 (1985) 592 2: Science 198 (1977) 1056 3: JP-patenttihakemusjulkaisu (OPI) nro 145 289/79 5 (Termi "OPI" tässä käytettynä merkitsee "tutkimatonta, julkaistua patenttihakemusta") 4: JP-patenttihakemusjulkaisu (OPI) nro 19 092/80 5: JP-patenttihakemusjulkaisu (OPI) nro 45 395/80 6: JP-patenttihakemusjulkaisu (OPI) nro 104 886/80 10 7: JP-patenttihakemusjulkaisu (OPI) nro 145 221/81 8: JP-patenttihakemusjulkaisu (OPI) nro 166 200/81 9: Nature 309 (1984) 810 10: Nature 285 (1980) 456 11: J. Seric. Sei. Jpn, 53 (1984) 547 15 12: J. Invertebr. Pathol. 29 (1977) 304 13: Appi. Environ. Microbiol. 44 (1982) 227 14: Nucleic Acids Res. 9 (1981) 3647 15: Science 214 (1981) 1205 16: J. Invertebr. Pathol. 30 (1977) 442 20 17: J. Invertebr. Pathol. 25 (1975) 363 18: Am. J. Hum. Genet. 31 (1979) 531 19: Maniatis, T. et al: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)
Claims (5)
- 27 94260
- 1. Bombyx morin nuclear polyhedrosis -yhdistelmä-virus (BmNPV), tunnettu siitä, että se sisältää 5 seuraavat osat toiminnallisesti liitettyinä seuraavassa j är j estyksessä 5'-päästä 3'-päähän: (i) 5’-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit-tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää 10 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen kokonaisena tai toiminnallisen osan siitä; (iii) kytkijäemässekvenssin, joka koodittaa kytki- 15 jäpeptidin tai -aminohappoja; (iv) translaation aloituskodonin; (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne-geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia, ja 20 (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alun perin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo-dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n muodostamiseksi. .25 2. Menetelmä sellaisen fuusioidun proteiinin tuot tamiseksi, joka koostuu koko polyhedraalisesta proteiinista tai sen toiminnallisesta osasta, kytkijäpeptidistä tai aminohapoista sekä geenituotteesta, tunnettu siitä, että 30 (A) yhdistelmä-BmNPV, joka sisältää seuraavat osat toiminnallisesti liitettyinä seuraavassa järjestyksessä 5*-päästä 3'-päähän: (i) 5'-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit- 35 tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää 28 94260 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen kokonaisena tai toiminnallisen osan siitä; 5 (iii) -kytkijäemässekvenssin, joka koodittaa kytki- jäpeptidin tai -aminohappoja; (iv) translaation aloituskodonin; (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne- 10 geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia, ja (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo-dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n 15 muodostamiseksi, saatetaan lisääntymään Bombyx mori -solulinjavil-jelmässä tai elävissä silkkiäistoukissa, (B) tuotetaan fuusioitu proteiini, ja (C) eristetään fuusioitu proteiini.
- 3. Menetelmä sellaisen geenituotteen tuottamiseksi, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen, tunnettu siitä, että (A) yhdistelmä-BmNPV, joka sisältää seuraavat osat toiminnallisesti liitettyinä seuraavassa järjestyksessä .· 25 5'-päästä 3'-päähän: (i) 5'-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit-tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n 30 muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen koko- • ·. naisena tai toiminnallisen osan siitä; (iii) kytkijäemässekvenssin, joka koodittaa kytki-jäpeptidin tai -aminohappoja; 35 (iv) translaation aloituskodonin; 29 94260 (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne-geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia, ja (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alun-5 perin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo- dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n muodostamiseksi, saatetaan lisääntymään Bombyx mori-solulinjaviljel- 10 mässä tai elävissä silkkiäistoukissa, (B) tuotetaan fuusioitu proteiini, ja (C) pilkotaan fuusioitu proteiini sen kytkevästä kohdasta, jolloin saadaan geenituote.
- 4. Plasmidi, tunnettu siitä, että se si- 15 sältää seuraavat osat toiminnallisesti liitettyinä seuraa-vassa järjestyksessä 5'-päästä 3'-päähän: (i) 5'-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit-tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää 20 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen kokonaisena tai toiminnallisen osan siitä; (iii) mahdollisesti kytkijäemässekvenssin, joka .· 25 koodittaa kytkijäpeptidin tai -aminohappoja; • · (iv) translaation aloituskodonin; (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne-geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia ja joka 30 mahdollisesti sisältää geenituotteen terminaattorin emäs- ; sekvenssin, ja • · (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koodi ttavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää 35 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n muodostamiseksi. 30 94260
- 5. Menetelmä yhdistelmä-BmNPV:n DNA:n tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kotransfektoidaan viljelty Bombyx mori -solulinja tai eläviä silkkiäistoukkia BmNPV:n DNA:11a ja plasmidilla, joka sisältää seuraavat 5 osat toiminallisesti liitettyinä seuraavassa järjestykses sä 5'-päästä 3'-päähän: (i) 5'-ylävirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy ylävirtaan polyhedraalista proteiinia koodit-tavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää 10 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä BmNPV:n muodostamiseksi; (ii) mainitun rakennegeenin promoottorialueen kokonaisena tai toiminnallisen osan siitä; (iii) mahdollisesti kytkijäemässekvenssin, joka 15 koodittaa kytkijäpeptidin tai -aminohappoja; (iv) translaation aloituskodonin; (v) geenin, joka koodittaa geenituotteen, joka on eksogeeninen BmNPV:n suhteen ja joka korvaa koko rakenne-geenin, joka koodittaa polyhedraalista proteiinia ja joka 20 mahdollisesti sisältää geenituotteen terminaattorin emäs-sekvenssin, ja (vi) 3'-alavirran BmNPV DNA-fragmentin, joka alunperin esiintyy alavirtaan polyhedraalista proteiinia koo-dittavasta rakennegeenistä ja jonka koko alunperin riittää ·1 25 yhdistelmän aikaansaamiseksi mainitun yhdistelmä-BmNPV:n • · muodostamiseksi. · 31 94260
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25560785 | 1985-11-14 | ||
| JP25560785 | 1985-11-14 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI864624A0 FI864624A0 (fi) | 1986-11-13 |
| FI864624A FI864624A (fi) | 1987-05-15 |
| FI94260B true FI94260B (fi) | 1995-04-28 |
| FI94260C FI94260C (fi) | 1995-08-10 |
Family
ID=17281082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI864624A FI94260C (fi) | 1985-11-14 | 1986-11-13 | Bombyx morin nuclear polyhedrosis -yhdistelmävirus ja menetelmiä proteiinien valmistamiseksi tätä käyttäen |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5110729A (fi) |
| JP (1) | JPH0797995B2 (fi) |
| KR (1) | KR950001992B1 (fi) |
| CN (1) | CN1032762C (fi) |
| AT (1) | ATE82590T1 (fi) |
| AU (1) | AU604001B2 (fi) |
| BG (1) | BG60255B1 (fi) |
| CA (1) | CA1294231C (fi) |
| DE (1) | DE3687141T2 (fi) |
| DK (1) | DK175184B1 (fi) |
| FI (1) | FI94260C (fi) |
| HU (1) | HU208340B (fi) |
| IE (1) | IE59956B1 (fi) |
| IL (2) | IL80529A0 (fi) |
| NO (1) | NO177540C (fi) |
| PH (1) | PH25470A (fi) |
| PL (1) | PL158590B1 (fi) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03224491A (ja) * | 1990-01-30 | 1991-10-03 | Nippon Nousan Kogyo Kk | ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法 |
| JPH05227967A (ja) * | 1992-02-17 | 1993-09-07 | Katakura Kogyo Kk | カイコからの有用タンパク質の製造方法 |
| CN1064405C (zh) * | 1996-04-08 | 2001-04-11 | 中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所 | 利用家蚕系统生产重组日本血吸虫谷胱甘肽－转移酶 |
| WO1997046589A2 (en) * | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Neorx Corporation | Humanized antibodies that bind to the same antigen as bound by antibody nr-lu-13, and their use in pretargeting methods |
| US6613548B1 (en) | 1998-07-31 | 2003-09-02 | Pierce Biotechnology, Inc. | Fusion products containing insoluble proteinaceous tag |
| US6485937B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-11-26 | The Rockefeller University | System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae |
| WO2001034188A1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-05-17 | University Of Hawaii | Malaria vaccine |
| DK2279753T3 (en) | 2001-10-10 | 2015-11-23 | Novo Nordisk As | The conversion of peptides and glycokonjugering |
| WO2004099231A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| DK1578771T3 (da) | 2001-10-10 | 2013-06-10 | Novo Nordisk As | Remodellering og glycokonjugering af peptider |
| EP1554302A4 (en) * | 2002-05-24 | 2006-05-03 | Restoragen Inc | DNA RECOMBINATION METHODS AND PRODUCTS FOR HIGH-YIELD PRODUCTION OF POLYPEPTIDES |
| AU2003243316A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| ME01366B (me) * | 2003-11-21 | 2013-12-20 | Nps Allelix Corp | POSTUPAK ZA PROIZVODNJU PEPTIDA 2 NALIK NA GLUKAGON l NJIHOVIH ANALOGA |
| US7736633B2 (en) * | 2005-09-28 | 2010-06-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for enhancing effects of colorants and conditioners |
| EP2022339A1 (en) * | 2006-05-19 | 2009-02-11 | Yamaguchi University | Artificial diet for lepidopteran and method for producing the same, lepidopteran and method for producing the same, and biomaterial |
| US7732569B2 (en) | 2006-10-19 | 2010-06-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Zein-based peptide tags for the expression and purification of bioactive peptides |
| US7662913B2 (en) | 2006-10-19 | 2010-02-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Cystatin-based peptide tags for the expression and purification of bioactive peptides |
| US20100234568A1 (en) * | 2006-10-19 | 2010-09-16 | Linda Jane Decarolis | Identification of peptide tags for the production of insoluble peptides by sequence scanning |
| CN102952805B (zh) * | 2012-11-13 | 2015-01-07 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 多角体基因前60bp片段及其应用 |
| CN102952807B (zh) * | 2012-11-13 | 2015-07-08 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 多角体基因前180bp片段及其应用 |
| CN102952806B (zh) * | 2012-11-13 | 2015-01-07 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 多角体基因前120bp片段及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3485810T2 (de) * | 1983-05-27 | 1992-12-10 | Texas A & M University Syst | Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors. |
| US4745051A (en) * | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| ZA848495B (en) * | 1984-01-31 | 1985-09-25 | Idaho Res Found | Production of polypeptides in insect cells |
| JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
| EP0228036A3 (en) * | 1985-12-18 | 1988-09-07 | Microgenesys, Inc. | Method for producing selected polypeptides in virally infected insect cells and polypeptides isolated therefrom |
-
1986
- 1986-11-06 IL IL80529A patent/IL80529A0/xx unknown
- 1986-11-11 PH PH34459A patent/PH25470A/en unknown
- 1986-11-11 NO NO864486A patent/NO177540C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-11-12 PL PL1986262348A patent/PL158590B1/pl unknown
- 1986-11-12 IL IL8061286A patent/IL80612A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-12 CA CA000522713A patent/CA1294231C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-13 DK DK198605436A patent/DK175184B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-11-13 HU HU864686A patent/HU208340B/hu unknown
- 1986-11-13 IE IE299986A patent/IE59956B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-13 FI FI864624A patent/FI94260C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-11-14 JP JP61271110A patent/JPH0797995B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-14 AU AU65183/86A patent/AU604001B2/en not_active Expired
- 1986-11-14 AT AT86115833T patent/ATE82590T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-14 BG BG077132A patent/BG60255B1/bg unknown
- 1986-11-14 CN CN86107784A patent/CN1032762C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-14 DE DE8686115833T patent/DE3687141T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-14 KR KR1019860009615A patent/KR950001992B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-16 US US07/641,795 patent/US5110729A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL158590B1 (pl) | 1992-09-30 |
| IE862999L (en) | 1987-05-14 |
| DK543686D0 (da) | 1986-11-13 |
| CN1032762C (zh) | 1996-09-11 |
| CN86107784A (zh) | 1987-06-03 |
| HU208340B (en) | 1993-09-28 |
| NO864486D0 (no) | 1986-11-11 |
| FI864624A (fi) | 1987-05-15 |
| NO864486L (no) | 1987-05-15 |
| DK175184B1 (da) | 2004-06-28 |
| FI864624A0 (fi) | 1986-11-13 |
| AU6518386A (en) | 1987-05-21 |
| AU604001B2 (en) | 1990-12-06 |
| ATE82590T1 (de) | 1992-12-15 |
| FI94260C (fi) | 1995-08-10 |
| KR870005092A (ko) | 1987-06-04 |
| JPH0797995B2 (ja) | 1995-10-25 |
| PL262348A1 (en) | 1988-01-21 |
| BG60255B2 (en) | 1994-03-24 |
| IL80529A0 (en) | 1987-02-27 |
| IL80612A0 (en) | 1987-02-27 |
| NO177540B (no) | 1995-06-26 |
| KR950001992B1 (ko) | 1995-03-08 |
| NO177540C (no) | 1995-10-04 |
| PH25470A (en) | 1991-07-01 |
| BG60255B1 (bg) | 1994-03-24 |
| IE59956B1 (en) | 1994-05-04 |
| DE3687141T2 (de) | 1993-04-08 |
| CA1294231C (en) | 1992-01-14 |
| US5110729A (en) | 1992-05-05 |
| HUT41845A (en) | 1987-05-28 |
| DE3687141D1 (de) | 1992-12-24 |
| IL80612A (en) | 1995-06-29 |
| DK543686A (da) | 1987-05-15 |
| JPS62208276A (ja) | 1987-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI94260B (fi) | Bombyx morin nuclear polyhedrosis -yhdistelmävirus ja menetelmiä proteiinien valmistamiseksi tätä käyttäen | |
| PL158064B1 (pl) | Sposób wytwarzania ludzkiej proapolipoproteiny A-l PL PL PL PL PL PL PL PL | |
| EP0095361B1 (en) | Cloning vectors for expression of exogenous protein | |
| HU206518B (en) | Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them | |
| JPH0123118B2 (fi) | ||
| EP0222412B1 (en) | Method of producing peptides | |
| FI89184C (fi) | Foerfarande foer produktion av en genprodukt | |
| JP2004518442A (ja) | 過分泌可能なペプチドの製造、および、１またはそれ以上の他の所定のポリペプチドの輸送形態の同時改善のための方法における、過分泌可能なペプチドの使用 | |
| CA1339464C (en) | ¬leu13| motilin, dnas coding for same and methods for producing same | |
| JPH05500615A (ja) | ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法 | |
| EP0264074B1 (en) | Expression vector for insulin-like growth factor i | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| US5340725A (en) | Expression vector for insulin-like growth factor I and method of production | |
| JP2565668B2 (ja) | ペプチド類の製造用ベクター | |
| CA1259043A (en) | Method and means for microbial polypeptide expression | |
| CA2030798A1 (en) | Antimetastatic peptides | |
| JPH06172394A (ja) | 成長ホルモンレセプターの細胞質外ｃ−ドメイン蛋白質 | |
| Moguilevsky et al. | Recombinant Human Proapolipoprotein AI: Experimental Strategies for the Production of an Authentic Molecule | |
| Honda et al. | Method for producing Leu 13! motilin | |
| Honda et al. | DNAs coding for LCU 13! motilin | |
| JPH02219576A (ja) | 魚類成長ホルモン遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| TC | Name/ company changed in patent |
Owner name: DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
|
| MA | Patent expired |