WO1995034665A2 - Chimäres peptid-nukleinsäure-fragment, verfahren zu seiner herstellung, sowie seine verwendung zur zielgerichteten nukleinsäureeinbringung in zellorganellen und zellen - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid

Definitions

  • Chimeric peptide-nucleic acid fragment process for its preparation, and its use for the targeted introduction of nucleic acid into cell organelles and cells
  • This invention relates to a chimeric peptide nucleic acid fragment, the process for its preparation and its use for the targeted introduction of nucleic acids into cell organelles and cells.
  • DNA molecules can have a special property that allows doubling in a cell under certain conditions.
  • a special structural element contributes to this Point of origin of DNA replication at (ori, origin), the presence of which gives the ability to replicate DNA (KJ Marians (1992), "Prokaryotic DNA replication", Annu. Rev. Biochem. 6] _: 673-719; ML DePamphilis (1993), "Eukaryotic DNA replication: anatomy of an origin", Annu. Rev. Biochem. 62: 29-63; H.
  • the 3 'hydroxyl group of the terminal ribonucleotide of this RNA chain serves as a' primer 'for the synthesis of new DNA by a DNA polymerase.
  • DNA-unwinding proteins de-spiral the DNA double helix (JC Wang (1985), “DNA topoisomerases", Annu. Rev. Biochem. 54: 665-697).
  • the separated single strands are stabilized in their conformation by DNA-binding proteins (JW Chase and KR Williams (1986), "Single-stranded DNA binding proteins required for DNA replication", Annu. Rev. Biochem. 55: 103-136) to enable a trouble-free function of the DNA polymerases (TS Wang (1991), "Eukaryotic DNA polymerases", Annu. Rev.
  • a multienzyme complex the holoenzyme of DNA polymerase III, synthesizes most of the new DNA.
  • the RNA part of the chimeric RNA-DNA molecule is then cleaved from the DNA polymerase III. Removing the RNA from the newly created DNA chains creates gaps between the DNA fragments. These gaps are filled by DNA polymerase I, which can rebuild DNA from a single-stranded template. While one of the two newly synthesized DNA strands is continuously built up during replication (5'-3 'direction, lead strand), Ogawa and Okazaki observed that a large part of the newly synthesized counter strand (3'-5' direction, delay strand) short DNA fragments (T. Ogawa and T.
  • the DNA replication of many plasmids is controlled via an origin of replication, which does not synthesize the delay strand (3'-5 'direction) and can initiate the synthesis of two continuous DNA strands bidirectionally (each in 5'- 3 'direction along the two matrices).
  • the prerequisite for complete DNA replication is the cyclic form of the nucleic acid. It ensures that the DNA polymerases return to the starting point at the end of the new synthesis of the complementary DNA strands, where ligases now ensure the covalent linkage of the ends of the two newly synthesized daughter strands.
  • linear-cyclic nucleic acids An interesting form of linear-cyclic nucleic acids is known from smallpox viruses: so-called 'hairpin loops' at the ends of their linear genomes mean that they have a cyclic molecular structure while maintaining a predominantly linear conformation (DN Black et al. (1986), "Genomic relationship between capripoxviruses ", Virus Res. 5: 277-292; JJ Esposito and JC Knight (1985),” Orthopoxvirus DNA: a comparison of restriction profiles and maps ", Virology 143: 230-251).
  • Covalently closed 'hairpin' nucleic acids have not only been found in smallpox viruses, but also for the ribosomal RNA from Tetrahymena (EH Blackburn and JG Gall (1978), "A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena", J. Mol. Biol. 120: 33-53), and the genomes of the parvoviruses (SE Straus et al. (1976), "Concatemers of altemating plus and minus Strands are intermediates in adenovirus-associated virus DNA synthesis", Proc. Natl Acad. Sci. USA 73: 742-746; P. Tattersall and DC Ward (1976), "Rolling hairpin model for replication of parvovirus and linear chromosomal DNA ", Nature 263: 106-109).
  • nucleic acids With the plasmids or nucleic acid constructs known to date, however, it is not possible to introduce nucleic acids into cells or cell organelles in a targeted manner via the protein import route. However, this is, for example, a prerequisite for treating changes in the mitochondrial genome of patients with neuromuscular and neurodegenerative diseases at the genetic level, or for being able to carry out targeted mutagenesis in mitochondria or other cell organelles.
  • the object of the present invention was therefore to develop a Konstnikt based on nucleic acid, which allows the targeted introduction of nucleic acids into cells and compartments of eukaryotic cells.
  • a method is to be provided for how this constituent can get into cell compartments or cells.
  • the nucleic acid introduced should be such that it can also be taken up as a replicable nucleic acid via cellular protein import routes.
  • properties should be present which lead to controlled transcription and / or replication in cells or in defined target compartments of a cell.
  • the method is to be used for the therapy of genetic diseases (changes in the mitochondrial genome) and for targeted mutagenesis in eukaryotic and prokaryotic cells.
  • the invention is intended to meet the following requirements:
  • the introduced nucleic acid (plasmid molecule) should be replicable -
  • the introduced nucleic acid (plasmid molecule) should be transcribable
  • the introduced nucleic acid (plasmid molecule) should be stable against nucleases
  • the protein In order to be able to transport a protein within a cell from the place of origin to another compartment or another cell organelle (e.g. the site of action), the protein is usually synthesized as a preprotein (R. Zimmermann et al. (1983), " Biosynthesis and assembly of nuclear-coded mitochondrial membrane proteins in Neurospora crassa ", Methods Enzymol. 97: 275-286).
  • the preprotein In addition to the matured amino acid sequence, the preprotein has a so-called signal sequence. This signal sequence is specific for the target compartment and ensures that the preprotein can be recognized by surface receptors.
  • the natural barrier 'membrane' is then overcome by translocating the preprotein through an active (multiple transport proteins' are involved in this process) or a passive process (direct passage without the involvement of other proteins) through the membrane.
  • the signal sequence is then usually separated off at the site of action by a specific peptidase, provided that it is not itself a component of the matured protein.
  • the matured protein can now develop its enzymatic activity.
  • nucleic acid is not subject to any restriction, ie any desired or known nucleic acid can be used.
  • a cell-, compartment- or membrane-specific signal sequence is coupled to the desired nucleic acid, whereby a chimeric peptide-nucleic acid fragment arises.
  • the coupling between a nucleic acid and a peptide via the ⁇ -Maleimidocaproic acid-N-hydroxysuccinimdester modified ⁇ -amino group of a synthetic KDEL peptide can take place (K.
  • the nucleic acid is preferably integrated into an existing genome via homologous recombination, or is itself the carrier of the genetic elements, which ensures autonomous initiation of replication and transcription. Only the last variant fulfills the criterion of universal applicability, since recombination into an existing cellular genome is only possible under certain conditions and in selected cells.
  • cyclic DNA Since the DNA polymerases return to the starting point at the end of the new synthesis of the daughter strands and thus ensure complete DNA replication. While the use of a double-stranded cyclic plasmid fulfills all physical criteria for a successful replication in every target compartment of the cell, this physical DNA form contrasts with the size capacity of the import pore, which is crucial for the targeted translocation: the compact diameter of a superhelical plasmid is comparable to globular proteins and makes translocation through a membrane system via the protein import route seem hopeless.
  • the solution is to use it linear-cyclic DNA molecules that have modified (cyclized) ends, but still only have the diameter of linear DNA molecules. On the one hand, these do not represent an obstacle to the size of the import pore, on the other hand, these linear-cyclic DNA molecules have all the physical requirements to be able to form replicative and transcription-active plasmids in the mitochondria.
  • Nucleic acid which can preferably include the following further information:
  • the selection of the signal sequence depends on which membrane or membrane system is to be overcome and which target compartment of the cell (cell nucleus, mitochondrion, chloroplast) or cell organelle is to be reached. Proteins that are to be inserted into one of the four mitochondrial compartments (outer mitochondrial membrane, intermembrane space, inner mitochondrial membrane, matrix space), for example, have compartment-specific signal sequences. Signal sequences which contain a cell-, compartment- or membrane-specific recognition signal are generally selected for the introduction of nucleic acids and thereby directing the attached nucleic acid to its place of action (eg inner side of the inner mitochondrial membrane or matrix space). There is a choice of signal sequences that can transport proteins in the presence or absence of a membrane potential.
  • the pure signal sequence is sufficient for the transport into the target compartment.
  • signal sequences are preferably selected which additionally have a cell- or compartment-specific peptide cleavage site. In the most favorable case, this 'cleavage point' lies within the signal sequence, but can also be added to it by additional amino acids in order to ensure that the signal sequence is split off after reaching the target compartment (e.g. the signal sequence of human OTC can be extended by another ten amino acids of the matured OTC become). This ensures that the nucleic acid in the target compartment can be separated from the signal peptide and that the action of the nucleic acid is fully developed.
  • the selected signal sequence is produced biologically (purification of natural signal sequences or cloning and expression of the signal sequence in a eukaryotic or prokaryotic expression system), but preferably by a chemical-synthetic route.
  • the signal peptide is coupled via a coupling agent, which is generally via amino acids, preferably via amino acids with reactive side groups, preferably via a single cysteine or lysine at the carboxy-terminal end of the signal peptide connected is.
  • a bifunctional crosslinker preferably a heterobifunctional crosslinker, is used as the coupling reagent Cysteins as a coupling point on the signal peptide has a second reactive group, preferably an amino-reactive group, in addition to a thiol-reactive group (e.g. m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide ester, MBS and its derivatives).
  • the nucleic acid also has a coupling site that should be compatible with the selected crosslinker.
  • the oligonucleotide should have an amino or thiol function.
  • the coupling group of the nucleic acid can be introduced via the chemical synthesis of the oligonucleotide and is generally located at the 5 'end, at the 3' end, but preferably directly on a modified base, e.g. B.
  • the reactive group compatible with the crosslinker used is at least distanced from the 5 'or 3' end of the oligonucleotide or the modified base by a C2 spacer unit, but preferably by a C6 spacer unit.
  • the nucleic acid (oligonucleotide) with a reactive coupling group comprises at least two nucleotides.
  • the chemically synthesized nucleic acids can be protected by a sulfurizing reagent (Beaucage reagent *, MWG-Biotech).
  • a sulfurizing reagent Beaucage reagent *, MWG-Biotech.
  • the phosphorus diester bonds of the nucleic acid are converted into phosphorothioate bonds.
  • This oligonucleotide can then be used for the enzymatic amplification of nucleic acids, extended by further linking reactions with other nucleic acids or used directly.
  • the nucleic acid (oligonucleotide) should have a hybridization-capable secondary structure, preferably without internal homologies, in order to be able to form a linear single-strand structure. This ensures that the nucleic acid (oligonucleotide) of the chimeric peptide-nucleic acid fragment can develop a biochemical / therapeutic effect without further nucleic acid coupling.
  • nucleic acids oligonucleotides
  • the sequence is preferably partially palindromic, with a smooth 5 '-3' end ('blunt end'), overhanging 3 'end (' sticky end '), but preferably with overhanging, phosphorylated 5' end (' sticky end '), very preferably with an overhanging 5' end comprising 4 nucleotides and which has no self-homology (palindromic sequence). This allows a stable, monomeric secondary structure ('hairpin loop') to be formed.
  • the overhanging 5 'end serves to couple defined nucleic acids, antisense oligonucleotides, but preferably transcribable and replicable genes.
  • the oligonucleotide carries at the apex of the 'loop' a modified base which carries a group reactive towards the crosslinker, preferably an amino-modified 2'-deoxythymidine.
  • the amino function of this modified base enables the coupling reaction between MBS and oligonucleotide.
  • the chimeric peptide nucleic acid fragment is suitable for the targeted introduction of nucleic acids into cells and cell organelles (e.g. cell nucleus, chloroplast), in particular for the introduction of ribonucleic acids (mRNAs, 'antisense' oligonucleotides) and deoxyribonucleic acids (complete genes, 'antisense 'Oligonucleotides). It is particularly suitable for introducing transcribable and processable genes into Mitochondria, but especially for introducing replicative, transcription-active and processable linear-cyclic nucleic acids (plasmids).
  • plasmids replicative, transcription-active and processable linear-cyclic nucleic acids
  • a transcribable gene is coupled to the nucleic acid containing the reactive coupling site or to the chimeric peptide-nucleic acid fragment.
  • a gene preferably a cloned gene, which consists of a mitochondrial promoter, preferably the promoter of the light DNA strand (O L , nt 490 - nt 369) and the gene to be expressed in a processable form, preferably a mitochondrial Gen, preferably a mitochondrial transfer RNA, preferably the mitochondrial tRNA Leu (UUR) (nt 3204 - nt 3345), exists (S. Anderson et al.
  • the coupling to the nucleic acid containing the reactive coupling site or to the chimeric peptide-nucleic acid fragment can be coupled via a 'blunt-end' ligation, but preferably a 'sticky-end' ligation .
  • the nucleic acid to be coupled has at least one end which can be coupled, which preferably consists of a 5 'overhang comprising 4 nucleotides and has no self-homology (palindromic sequence).
  • a nucleic acid is preferably selected which has different 5' overhangs, which preferably comprise 4 nucleotides and have no self-homology. Nucleic acids whose 5 'ends also have no homology with one another are very preferably used. Two different 'hairpin loops' are then preferably used for the modification of the ends (cyclization), one specific (complementary) for the 'left' plasmid end, the other specific for the 'right' plasmid end of the nucleic acid.
  • the phosphorodiester bonds of the nucleic acid can be substituted by phosphorothioate bonds and thus protected if modified phosphorothioate nucleotides are already used in the enzymatic amplification.
  • a method which has the following steps is suitable for producing the chimeric peptide-nucleic acid fragment:
  • the chimeric peptide nucleic acid fragment can be produced by the following steps:
  • nucleic acid in another embodiment, which is a linear cyclic nucleic acid in the form of a plasmid, the selection of the nucleic acid depends on which genetic information is to be expressed in which cell and in which target compartment of the cell.
  • nucleic acids that are to be transcribed must have a suitable promoter. If, for example, a gene is to be expressed in the mitochondrial matrix, a mitochondrial promoter can be selected, preferably the promoter of the light mtDNA strand. The control the transcription takes place in other cell compartments (eg cell nucleus, chloroplast) by compartment-specific promoters.
  • transcription regulation sequences preferably mitochondrial transcription regulation sequences.
  • these sequences comprise at least binding sites for factors that initiate transcription (transcription initiation factor) and the binding site for the RNA synthesizer. If a transcription is to be initiated in the mitochondria, binding sequences of the mitochondrial transcription factors and the RNA polymerase, in particular the mitochondrial transcription factor 1 and the mitochondrial RNA polymerase, are suitable here.
  • the transcription can be controlled by compartment-specific transcription regulation sequences.
  • the plasmid has transcription regulation sequences, which are preferably added in the 3 'direction to the transcription initiation site (promoter).
  • the control elements are suitable for the H and L strand transcription of the mitochondrial genome, but preferably the so-called 'conserved sequence blocks 1 , which terminate the transcription of the L strand and at the same time the Enable transition to DNA replication.
  • the transcription is interrupted at a suitable point behind the 3 'end of the expression-capable gene / genes.
  • a suitable transcription termination site preferably arranged in the 3 'direction to the promoter.
  • the binding sequence for a bidirectionally acting transcription termination factor is particularly suitable for regulated expression.
  • a binding motif is preferred here mitochondrial transcription termination factor selected.
  • the use of a transcription termination factor binding sequence suppresses the formation of 'antisense RNA' of the head-to-head linked dimeric plasmids.
  • the selection of transformed cells can be checked by expressing a reporter gene.
  • reporter or selection genes are expression-capable genes, the expression of which leads to a macroscopic change in the phenotype.
  • genes that trigger resistance to antibiotics for example.
  • the resistance genes for oligomycin (OLI) or chloramphenicol (CAP) are particularly suitable for use in a mitochondrial transformation system.
  • the mitochondrial chloramphenicol resistance gene appears to be a particularly suitable selection gene in this context, since CAP-sensitive cell lines already change their phenotype with a proportion of approximately 10% of the 16 S rRNA CAP + gene.
  • Replication of the nucleic acid can be achieved by an initiation site for DNA replication (origin of replication).
  • a peptide-nucleic acid fragment in the form of a plasmid must therefore have at least one origin of replication.
  • the orientation of the origin of replication can be arranged independently of the expression-capable gene (genes), but the origin of replication is preferably arranged in the 3 'direction to the promoter.
  • a suitable origin of replication for a mitochondrial transformation plasmid would be a mitochondrial origin of replication.
  • the origin of the replication of the heavy mtDNA strand, which preferably has at least one conserved sequence block, is particularly suitable here.
  • Replication can be controlled via so-called regulatory sequences for replication.
  • the plasmid must have at least one such sequence motif, which is preferably arranged in the 3 'direction to the promoter and to the origin of replication.
  • a mitochondrial replication regulation sequence is particularly suitable here.
  • a motif is preferably used that at least contains one of the 'termination associated sequences'.
  • replication is preferably initiated via at least one compartment-specific origin of replication and controlled via compartment-specific replication regulation sequences.
  • the plasmid nucleic acid In order to allow different genes to be cloned into the plasmid molecule, the plasmid nucleic acid must also have a suitable cloning module (multiple cloning site) which has as different as possible recognition sequences for restriction endonucleases. Rare recognition sequences that do not occur elsewhere on the plasmid are particularly suitable here.
  • the cloning module can be installed at any point on the transformation plasmid. If the area of the cloning site is to be integrated into the transcription of the selection gene, the insertion of the multiple cloning site in the 3 'direction to the promoter and in the 5' direction to the transcription termination site is suitable. The integration of the multiple cloning site in the 5 'direction to the selection gene is particularly suitable since, when using the selection system, the region of the multiple cloning site is transcribed at the same time.
  • a linear nucleic acid plasmid that can be converted into a cyclic nucleic acid is suitable for this.
  • the plasmid ends can be cyclized using so-called ligation-capable (phosphorylated) ends of the nucleic acid.
  • a 'blunt-end' nucleic acid or a nucleic acid with 3 'overhanging ends is particularly suitable for this purpose.
  • the overhanging ends should each comprise at least one nucleotide.
  • 5 'overhanging ends are preferably used are formed from four nucleotides. These preferably have no self-homology (palindromic sequence) and are also preferably not complementary to one another in order to suppress dimer formation in a later nucleic acid linkage.
  • the cyclization of the prepared plasmid ends is mediated by synthetic oligonucleotides.
  • synthetic oligonucleotides These have a partial self-homology (partial palindromic sequence) and are therefore capable of forming so-called 'hai in-loop' structures.
  • the partially palindromic sequence leads to the formation of a stable, preferably monomeric, secondary structure ('hairpin loop'), with a smooth 5'-3 'end (blunt end), an overhanging 3' end ('sticky end') '), but preferably with an overhanging 5' end.
  • These oligonucleotides are particularly suitable if they have a 5 'phosphorylated end.
  • the linear plasmid DNA can now be converted into a linear-cyclic system using synthetic oligonucleotides with a hairpin-loop structure.
  • the ends of the two oligonucleotides are preferably complementary to one end of the prepared plasmid nucleic acid.
  • two different 'hairpin loops' are preferably used, one specific (complementary) for the 'left' plasmid end, one specific (complementary) for the 'right' plasmid end in order to suppress dimer formation.
  • At least one of the two hairpin-loop oligonucleotides can have at least one modified nucleotide.
  • this coupling site (modified nucleotide) is located at one of the unpaired positions of the 'loop'.
  • a chemically reactive group in particular an amino or thiol diffusion, is suitable as the coupling point.
  • the recognition sequence for the restriction endonuclease Bsa I (GGTCTCN, N 5 ) is particularly suitable.
  • the use of a cloned nucleic acid which already has the recognition sequences for a restriction endonuclease, preferably Bsa I, is suitable here. This means that the enzymatic amplification can be dispensed with and the nucleic acid obtained via a plasmid preparation / restriction enzyme treatment can be used directly.
  • the cloned nucleic acid preferably already contains the recognition sequence for the restriction endonuclease Bsa I at both ends.
  • the primary goal here is to separate the cyclized plasmid molecules from unreacted starting materials.
  • the use of DNA-degrading enzymes has proven to be suitable in this connection, and the use of enzymes which have a 5'-3 'or 3'-5'-exonuclease activity is particularly recommended here.
  • the use of exonuclease III leads to the complete hydrolysis of unreacted starting materials, while the cyclized plasmid DNA remains intact (no free 5 'or 3' ends).
  • the reaction products can be purified either by electrophoretic or chromatographic processes, but also by precipitation. There are different cleaning methods to choose from.
  • the cyclized nucleic acid conjugated with the coupling agent and the signal peptide can be treated with an exonuclease, preferably exonuclease III, and then purified by chromatographic, electrophoretic purification or precipitation.
  • the cyclized plasmid DNA can be treated with an exonuclease, preferably exonuclease III, purified, and then with the coupling agent and the Conjugate signal peptide and be purified by chromatographic, electrophoretic purification or precipitation.
  • the linkage with a signal peptide can be realized, which directs the transformation plasmid into the desired cell compartment in vivo.
  • the transformation plasmid can first be reacted with the modified oligonucleotide (ligation) and then conjugation with the coupling agent and the signal peptide, or the modified oligonucleotide is first conjugated with the coupling agent and the signal peptide and then for the cyclization of the transformation plasmid end used (ligation).
  • the cell membrane can be overcome by the transformation system (cellular transformation) using various methods.
  • the 'particle gun' system or microinjection are suitable, but electroporation and lipotransfection are preferred. All methods ensure the introduction of the linear cyclic peptide nucleic acid plasmid into the cytosol of the cell, from where the plasmid is directed to the target site (target compartment) by the conjugated signal peptide.
  • this method offers for the first time the possibility of introducing nucleic acids into cells and cell organelles in a targeted manner.
  • the target compartment to be reached (cytosol, nucleus, mitochondrium, chloroplast, etc.) can be determined by the choice of the signal sequence.
  • this process is characterized by its universal applicability.
  • Both prokaryotic and eukaryotic cells and cell systems can be treated with the translocation vector. Since a natural membrane transport system is used for targeted infiltration, there is no need to treat the cells or cell organelles with membrane-permeabilizing agents (eg calcium chloride method, see above).
  • the plasmid When using a replicative and transcription-active nucleic acid, the plasmid only unfolds its full size after the completion of the first replication cycle: as a true cyclic plasmid (artificial chromosome) it now has double genetic information (head-to-head linked plasmid dimers).
  • this behavior is deliberately induced and is of crucial importance since the genes to be expressed have to compete with the defective genes in the cells.
  • the system impresses in that it does not have to be integrated into a genome via a recombination process, such as retroviral systems, in order to become replicative.
  • uncontrollable side effects undesired recombination
  • the use of this plasmid system can therefore be promised without any major security risk.
  • signal peptide of the ornithine transcarbamylase of the rat and a DNA sequence suitable for the introduction.
  • signal peptide of rat ornithine transcarbamylase 32 amino acids
  • the peptide sequence is shown in the international single-letter code
  • Middle a partially palindromic DNA sequence of 39 nucleotides suitable for the introduction with an amino-modified T at nucleotide position 22
  • Bottom Pronounced secondary structure of the oligonucleotide with an overhanging 5 'end and a modified nucleotide at the apex of the' loop '.
  • Fig. 2 Structure of the amino-modified 2'-deoxythymidine.
  • R Nucleic acid residues.
  • 3 Schematic representation of the chimeric peptide-nucleic acid fragment, consisting of amino-modified oligonucleotide (39 nucleotides) with a pronounced hairpin loop, crosslinker and signal peptide.
  • CL Crosslinker.
  • MCS Multiple cloning site of pBluescript *
  • mtTF binding site of the mitochondrial transcription factor
  • RNA-Pol binding site of the mitochondrial RNA polymerase
  • Leucine Mitochondrial transfer RNA gene for leucine (UUR); Sac II, Apa
  • 5b Sequence of the cloned tRNA Leu (u ⁇ R) gene.
  • 6a / b Representation of the 32 P radiation of the DNA and of the enzyme activities for adenylate kinase, cytochrome c oxidase and malate dehydrogenase (y-axes) in 11 fractions (x-axes) of a mitochondrial sucrose gradient density centrifugation .
  • the proportion of the respective radiation / Enzyme activity expressed as a percentage of the total radiation / enzyme activity applied to the gradient.
  • ADK adenylate kinase
  • COX cytochrome c oxidase
  • MDH malate dehydrogenase.
  • oligonucleotides contain recognition sequences for the restriction endonucleases Xho I and Pst I, the ends of the amplified nucleic acid can be modified so that on the one hand they are compatible with a vector arm of pBluescript and on the other hand they are compatible with the hybrid of the oligonucleotides MCS / TTS 1 and 2 . In addition to a multiple cloning site, these also contain a transcription termination sequence which is responsible for the regulated transcription. The ligation product is then transformed into E.
  • the oligonucleotides MCS 1 and 2 were produced synthetically and contain recognition sequences for nine different restriction endonucleases, as well as a sequence motif which is able to bi-directionally prevent transcription.
  • the oligonucleotides are complementary and can therefore form a hybrid.
  • the overhanging ends are part of the recognition sequences for the restriction endonucleases Pst I and Barn HI.
  • the ends of the amplified nucleic acid can be modified so that they are compatible with the multiple cloning site (MCS) of the peptide-nucleic acid plasmid (plasmid 1).
  • MCS multiple cloning site
  • the ligation product is then transformed into E. coli XL1 Blue. Following the plasmid isolation of insert-bearing E. coli colonies, the nucleic acids were subjected to RFLP and sequence analysis and are available for the experiments described.
  • 13a reaction sequence of the cyclization of the nucleic acid portion and the conjugation of the nucleic acid portion with a signal peptide.
  • the nucleic acid portion of the peptide nucleic acid plasmid can be obtained via a plasmid preparation or an enzymatic amplification. In both cases, treatment with the restriction endonuclease Bsa I leads to an intermediate which can be ligated. This can be implemented directly with the monomerized hairpin loops.
  • the reaction product is separated from non-specific (non-cyclic) reaction products and starting materials by an exonuclease III treatment, purified and conjugated to the signal peptide via a crosslinker.
  • one of the two reaction product is separated from non-specific (non-cyclic) reaction products and starting materials by an exonuclease III treatment, purified
  • 'hairpin-loops' are first conjugated to the signal peptide via a crosslinker before the cyclizing ligation reaction is carried out.
  • the reaction product is cleaned by an exonuclease III treatment.
  • Fig. 14 Monomerization of a hairpin loop oligonucleotide.
  • the synthetic hairpin loops HP 1 and 2 can be monomerized by thermal or alkaline denaturation.
  • a standard agarose gel is shown in this figure: Lane 1, molecular weight standard ( ⁇ X 174 RF DNA treated with the restriction endonuclease Hae III); Lane 2: HP 1,
  • Fig. 15b Review of the purified ligation product by a Mae III-RFLP analysis.
  • This figure shows a standard agarose gel: lane 1, enzymatically amplified nucleic acid fraction after a Mae /// treatment; Lane 2: purified ligation product of the enzymatically amplified nucleic acid fraction after a Mae III treatment; Lane 3: purified product of plasmid DNA ligation after Mae III treatment; Lane 4, molecular weight standard ( ⁇ X 174 RF DNA treated with the restriction endonuclease Hae III).
  • Fig. 16 Transcription and replication of the peptide nucleic acid plasmid.
  • This figure shows a standard agarose gel: lane 1, molecular weight standard ( ⁇ DNA treated with the restriction endonucleases Hind III and Eco RI); Lane 2, untreated peptide nucleic acid plasmid; Lane 3: transcription products of the peptide nucleic acid plasmid obtained in vitro; lane 4: replication and transcription products of the peptide nucleic acid plasmid obtained in vitro; Lane 5, replication and transcription products of the peptide nucleic acid plasmid obtained in vivo; Lane 6, untreated peptide nucleic acid plasmid.
  • the Overcome the mitochondrial double membrane system with a DNA translocation vector For this purpose, the mitochondrial signal sequence of ornithine transcarbamylase (AL Horwich et al. (1983), "Molecular cloning of the cDNA coding for rat ornithine transcarbamoylase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4258-4262) (enzyme of the urea cycle, naturally located in the matrix of the mitochondria) chemically manufactured and cleaned. As a reactive group for later connection to the DNA, the original sequence was expanded to include a cysteine at the C terminus (see FIG. 1).
  • the sequence is partially palindromic with an overhanging, phosphorylated 5 'end (see Figure 1). This allows a so-called 'hairpin loop' to be formed.
  • the overhanging 5 'end serves to ligate defined nucleic acids to this oligonucleotide, which can then be imported into the mitochondria.
  • the oligonucleotide carries a modified base at the apex of the loop (see FIG. 1). It is an amino-modified 2'-deoxythymidine (see Figure 2). The amino function of the modified base enables the coupling reaction between MBS and oligonucleotide.
  • the three reaction partners (oligonucleotide, MBS and peptide) are linked in individual reaction steps.
  • oligonucleotide 50 pmol
  • MBS 10 nmol dissolved in DMSO
  • reaction time 60 min .
  • reaction temperature 20 ° C
  • Unreacted MBS is separated off via a 'Nick Spin Column R ' (Sephadex G 50, Pharmacia), which was equilibrated with 50 mM potassium phosphate (pH 6.0).
  • the eluate contains the desired reaction product and is reacted with the peptide (2.5 nmol) in a further reaction step (reaction time: 60 min .; reaction temperature: 20 ° C.). The was stopped Reaction by adding dithiothreitol (2 mM).
  • the coupling product (chimera, see FIG. 3) was separated from unreacted starting materials by preparative gel electrophoresis and isolated from the gel by electroelution (see FIG. 4). Different nucleic acids can now be coupled to the overhanging 5 'end of the oligonucleotide by simple ligation.
  • dsDNA 283 bp long double-stranded DNA
  • PCR enzymatic reaction
  • a DNA fragment cloned in pBluescript R (Stratagene) was used as template DNA, which, in addition to the human mitochondrial promoter of the light strand (P L , nt 902 - nt 369), contains the gene for the mitochondrial transfer RNA leucine (tRNA Leu (UUR) , nt 3204 - nt 4126) (see Figure 5).
  • Two oligonucleotides were used as amplification primers, primer 1 having a non-complementary 5 'end (see FIG. 5).
  • the dsDNA was modified by the 3'-5 'exonuclease activity of the T4-DNA polymerase (incubation in the presence of 1 mM dGTP), which can produce overhanging 5' ends under conditions known to the person skilled in the art (C. Aslanidis et al. (1990) "Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR)", Nucleic. Acids. Res. 18: 6069-6074).
  • the PCR-amplified DNA could be assembled using the T4 DNA ligase.
  • the free 5'-OH group of the ligated DNA was radioactively phosphorylated by an enzymatic reaction (A. Novogrodsky et al. (1966), "The enzymatic phosphorylation of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid. I. Phosphorylation at 5 "-hydroxyl termini", J. Biol. Chem. 241 .: 2923-2932; A. Novogrodsky et al.
  • the supernatant was transferred to cooled centrifuge beakers and centrifuged at 8000 g.
  • the isolated mitochondria were resuspended in 200 ml of the same buffer and centrifuged again at 8000 g.
  • the clean mitochondrial pellet was resuspended in an equal volume of the same buffer and energized by adding 25 mM succinate, 25 mM pyruvate and 15 mM malate.
  • the protein content of the suspension was determined using a Bradford test kit * (Pierce). 200 ⁇ g mitochondrial protein (energized mitochondria) were together with 10 pmol of the chimeric at 37 ° C. for 60 min.
  • the individual fractions of the gradient were analyzed to localize the chimeras and mitochondria.
  • the adenylate kinase, the cytochrome c oxidase and the malate dehydrogenase activity were determined as markers of the mitochondria, while the chimera could be identified by measuring the 32 P radiation (see FIG. 6).
  • An analogous experiment to determine the unspecific DNA incorporation was carried out with the same DNA that was not linked to the signal peptide (see FIG. 6). It was derived from the measurements that 65% of the chimeras used specifically segregated with the mitochondria, while the non-specific DNA incorporation was less than 5% of the DNA used.
  • the re-isolated mitochondria were divided into the three compartments outer mitochondrial membrane / intermembrane space, inner mitochondrial membrane and Fractionated matrix space.
  • the mitochondria were incubated with digitonin (final concentration: 1.2% w / v digitonin) and the resulting mitoplasts were separated using sucrose gradient density centrifugation, collected in fractions and the activities of marker enzymes (adenylate kinase: intermembrane space; cytochrome c oxidase: inner mitochondrial membrane; Dehydrogenase: matrix space) according to Schnaitmann and Greenawalt (C.
  • the isolated mitoplasts (loss of the outer membrane and the intermembrane space) were lysed by Lubrol R (0.16 mg / mg protein; ICN) and separated into the compartments inner mitochondrial membrane (pellet) and matrix space (supernatant) by ultracentrifugation at 144000 g.
  • the compartments were assigned by measuring the activities of the cytochrome c oxidase (inner mitochondrial membrane) and the malate dehydrogenase (matrix space).
  • the chimeras were measured by detecting the 2 P radiation in the scintillation counter and showed 75% segregation with the matrix of the mitochondria, while 25% of the chimeras remained associated with the inner membrane of the mitochondria (incomplete translocation).
  • Example 2 Introduction of a regenerative and transcription-active chimeric peptide nucleic acid fragment (plasmid) into the mitochondria of living cells
  • dsDNA 3232 bp long double-stranded vector DNA
  • the region of the mitochondrial genome was amplified via two modified oligonucleotides (primer 1, hybridized with nucleotides 15903-15924 of the human mtDNA, contains an extension at the 5 'end by the sequence TGTAGctgcag to introduce a Pst I site; primer 2, hybridizes with nucleotides 677-657 of the human mtDNA, includes at the 5 'end an extension by the sequence TTGCATGctcgagGGTCTCAGGG for the introduction of an Xho I interface), which is the promoter of the light DNA strand, the origin of the mtDNA replication of the heavy strand , the regulatory motifs for transcription (CODs, 'conserved sequence blocks 1 ), and the regulatory body for DNA replication (' TAS ', termination associated sequences, (DC Wallace (1989), "Report of the committee on human mitochondrial DNA", Cytogenet Cell Genet.
  • primer 1 hybridized with nucleotides 15903-15924
  • MCS / TTS The multiple cloning site
  • MCS / TTS 1 and 2 Two complementary oligonucleotides
  • FIG. 9 the two oligonucleotides form hybrids which, after phosphorylation with T4 DNA polynucleotide kinase, can be used for the ligation.
  • the hybrids are characterized in this context by 5'- and 3'-single-strand overhanging ends, which are complementary to a Pst I, on the one hand others are complementary to a Bam HI interface (see FIG. 9).
  • the synthetic oligonucleotides MCS / TTS 1 and 2 also contain a bidirectional mitochondrial transcription termination sequence (see FIG. 9). It is arranged in the 3 'direction to the MCS and ensures that the transcription is interrupted at this point and that correctly terminated transcripts are created. This sequence motif also ensures that no 'antisense RNA' is expressed in the cyclic plasmid system.
  • reporter gene was inserted into the multiple cloning site for experimental verification of replication and transcription.
  • the chloramphenicol-resistant human mitochondrial 16 S ribosomal RNA was selected as the reporter gene, which differs from the naturally occurring ribosomal RNA only by a modified nucleotide (polymorphism).
  • the polymerase chain reaction was used to convert a DNA extract of chloramphenicol-resistant HeLa cells into a fragment with two modified oligonucleotides (primer 3, hybridized with nucleotides 1562-1581 of mitochondrial DNA, at the 5 'end around the CCTCTaagctt sequence to introduce a Hind ⁇ i -Interface extended; primer 4, hybridized with nucleotides 3359-3340, amplified at the 5 'end by the sequence GCATTactagt to introduce an At I-interface) amplified under conditions known to the person skilled in the art.
  • the amplification product comprised the two flanking tRNA genes (tRNA VaI and tRNA Leu ).
  • the amplified DNA was treated with the restriction endonucleases Hind III and Bei I, purified by precipitation and with the pBluescript plasmid 1 treated with Hind III and Bei I (see FIGS. 8, 9 and 10) in a stoichiometry of 1: 1 in a ligation reaction under conditions known to those skilled in the art.
  • the cloning strategy is shown in Figure 11.
  • E. coli colonies could be isolated and characterized.
  • the corresponding plasmid DNA was subjected to dideoxy sequencing under conditions known to the person skilled in the art (see FIG. 12).
  • the cloning insert mitochondrial transformation plasmid
  • the insert DNA could be amplified by means of the polymerase chain reaction via two oligonucleotides (primers 2 and 5; nucleotide sequence of primer 5: GATCCGGTCTCATTTTATGCG).
  • the oligonucleotides are then slowly thawed at 4 ° C. and are then 99% present in the desired monomeric 'shark-in-loop' structure (see FIG. 14).
  • the plasmid DNA was cyclized together with the two monomerized 'hai ⁇ in-loops' (HP 1 and 2) in a single reaction.
  • the molar ratio of plasmid DNA to the two 'hai ⁇ in loops' was 1: 100: 100 (plasmid: HPl: HP2).
  • the individual reactants could be assembled under conditions known to the person skilled in the art (see FIG. 15).
  • the ligation products were purified by treatment with exonuclease HI (reaction conditions: 37 ° C., 60 min.). While nucleic acids with free 3 'ends are degraded by the nuclease, the plasmid DNA associated with the two' hai ⁇ in loops' remains stable towards the 3 '-5' exonuclease activity of the enzyme.
  • the only reaction product (see FIG. 15a) was separated using preparative agarose gel electrophoresis and purified by electroelution or using QIAquick (Qiagen) according to the manufacturer's recommendation.
  • the ligation product was checked using an RFLP analysis (restriction fragment length polymorphism).
  • the ligated and purified plasmid DNA was treated with the restriction endonuclease Mae III under conditions known to the person skilled in the art.
  • the DNA has five cleavage sites, so that fragments of different sizes are formed, which can be analyzed using an agarose gel (4%).
  • FIG. 15b shows an example of the Mae III cleavage pattern that is obtained after the ligation of the plasmid DNA with the two hai ⁇ in loops 1 .
  • the DNA bands marked with arrowheads represent the left and right ends of the amplified (lane 1) and the linear-cyclic (lane 2 and 3) mitochondrial plasmid.
  • the nucleic acid conjugate the circularized plasmid with the synthetic signal peptide of rat ornithine transcarbamylase (H 2 N-MLSNLRILLNKAALRKAHTSMVRNFRYGK-PVQSQVQLKPRDLC-COOH
  • the nucleic acid with a 20-fold molar excess of m-maleimidobenzoyl-in-hydroxysaminophenocyclin. incubated at 20 ° C (incubation medium: 50 mM potassium phosphate pH 7.8).
  • the excess coupling agent was separated by a "nick spin column" (Pharmacia-LKB) under conditions known to the person skilled in the art.
  • the conjugation of the "activated" Nucleic acid was obtained by reacting the nucleic acid with a 50-fold molar excess of the signal peptide at 20 ° C. (incubation medium: 50 mM potassium phosphate pH 6.8). After 45 min. the reaction was terminated by the addition of 1 mM dithiothreitol and the conjugate was available for the following experiments.
  • the plasmid had to be introduced into eukaryotic cells.
  • a chloramphenicol-sensitive B-lymphocyte or fibroblast cell culture was transfected via lipotransfection with the peptide-nucleic acid plasmid: 1 ⁇ g of the radioactively labeled peptide-nucleic acid plasmid (the label was identified as 32 P-label during the kinase reaction of the 'hai ⁇ in loops' (HPl) was pre-incubated together with 2-6 ⁇ l LipofectAmine R (Gibco-BRL) in 200 ⁇ l serum-free Optimem R (Gibco-BRL) (15 min., 20 ° C).
  • the polycationic lipid of the LipofectAmine R reagent forms DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2- (sperminecarboxamido) -ethyl] - N, N-dimethyl-l-propanaminium trifluoroacetate) with the support of the neutral lipid DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine ) unilamellar liposomes, which are able to complex the DNA.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • the transfection medium was then replaced by 5 ml of DMEM medium (Gibco-BRL), which had previously been supplemented with 10% fetal calf serum and 100 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • the transformation efficiency was determined by measuring the 32 P radiation of the construct. As a rule, a cellular incorporation rate of 80-85% was measured. This means that 80-85% of the chimeric construct was associated with the transformed cells and 15-20% of the chimeric peptide-DNA plasmid remained in the supernatant of the transfection reaction.
  • chloramphenicol-resistant colonies formed in the transformed cells.
  • the resistant cells were separated and expanded under conditions known to the person skilled in the art. From about 1 * 10 5 cells could sufficient DNA can be obtained from conditions known to the person skilled in the art to carry out genotyping.
  • the isolated DNA was separated by agarose gel electrophoresis and transferred to a nylon membrane (Southern blot). The nucleic acids were detected by hybridization with a specific, radioactively labeled probe (see FIG. 16).
  • this figure shows an 'in vitro' transcription (lane 3), an 'in vitro' replication (lane 4) and the intermediates obtained in vivo (isolated Nucleic acids of a transformed clone) is shown. While the three smaller bands can be generated in vitro by incubating the circularized vector with the four nucleoside triphosphates (RNA) and a mitochondrial enzyme extract (lane 3), the addition of the deoxynucleoside triphosphates to the reaction mixture is observed to produce a dimer, circular plasmid ( largest band in lane 4): an identical picture emerges when analyzing the nucleic acids that can be obtained from transformed cell colonies (lane 5). Sequence analysis confirmed that the largest DNA band in lanes 4 and 5 is actually the dimeric and therefore replicated mitochondrial plasmid.
  • RNA nucleoside triphosphates
  • a mitochondrial enzyme extract a mitochondrial enzyme extract

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Abstract

Um Erbgut zielgerichtet in Zellorganellen einzuführen, wird die entsprechende Nukleinsäure an ein zell-, kompartiment- oder membranspezifisches Peptid gebunden. Unter Ausnutzung der natürlichen Proteintransportwege wird die Nukleinsäure von dem Peptid zum Zielkompartiment dirigiert und durch die Membran (das Membransystem) transportiert. Damit die Nukleinsäure eine Replikations- und Transkriptionsaktivität in Zellen und Zellorganellen entfalten und über die Protein-Importroute eingeschleust werden kann, muß sie zum einen über alle notwendigen genetischen Elemente verfügen und zum anderen die Größenkapazität der Importpore nicht übersteigen. Die Kombination dieser Voraussetzungen führte zur Entwicklung eines linear-zyklischen Plasmidsystems, das zum einen alle notwendigen genetischen Elemente beherbergt und zum anderen durch seine pseudo-lineare Struktur (zyklisierte DNA-Enden) über die Protein-Importroute aufgenommen werden kann und anschließend zyklische Replikationsintermediate zu bilden vermag. Das Verfahren ermöglicht durch beliebige Kombination von Nukleinsäuren und kompartimentspezifischen Proteinsequenzen die zielgerichtete Einbringung von Nulkeinsäuren in Zellen und Zellorganellen und damit die Verwendung dieses Systems sowohl in der zielgerichteten Mutagenese als auch zur molekularen Therapie genetischer Erkrankungen.

Description

Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment, Verfahren zu seiner Herstellung, sowie seine Verwendung zur zielgerichteten Nukleinsäureeinbringung in Zellorganellen und Zellen
Diese Erfindung betrifft ein chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment, das Verfahren zu seiner Herstellung, sowie seine Verwendung zur zielgerichteten Nukleinsäureeinbringung in Zellorganellen und Zellen.
Es ist bekannt, daß zelluläre Membransysteme weitestgehend impermeabel für Nukleinsäuren sind. Durch physikalische Prozesse (Transformation) und biologische Vorgänge (Infektion) können Zellmembranen aber sehr effizient überwunden werden. Der Transformation, also dem unmittelbaren Aufnehmen der nackten Nukleinsäure durch die Zelle geht eine Behandlung der Zellen voraus. Unterschiedliche Methoden zur Erzeugung dieser 'kompetenten Zellen' stehen zur Verfügung. Die meisten Verfahren basieren auf den Beobachtungen von Mandel und Higa (M. Mandel et al. (1970), "Calcium-dependent bacteriophage DNA infection", J. Mol. Biol. 53: 159-162), die erstmals zeigen konnten, daß die Ausbeuten bei der Aufnahme von Lambda-DNA durch Bakterien in Gegenwart von Calciumchlorid ganz wesentlich gesteigert werden. Diese Methode ist erstmals auch von Cohen et al. (S.N. Cohen et al. (1972), "Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA", Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 69: 2110-2114) für Plasmid-DNA erfolgreich eingesetzt und durch viele Modifikationen verbessert worden (M. Dagert et al. (1979), "Prolonged ineubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells", Gene 6: 23-28). Eine andere Transformationsmethode beruht auf der Beobachtung, daß hochfrequente Wechselstromfelder Zellmembranen aufbrechen können (Elektroporation). Diese Technik läßt sich ausnutzen, um nackte DNA nicht nur in prokaryotische Zellen, sondern auch in eukaryotische Zellsysteme einzuschleusen (K. Shigekawa et al. (1988), "Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: a general approach to the introduetion of macromolecules into cells", Biotechniques 6: 742-751). Zwei sehr sanfte Methoden zur DNA-Einbringung in eukaryotische Zellen wurden von Capecchi (M.R. Capecchi, (1980), "High effϊciency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells", Cell 22: 479-488) und Klein et al. (T.M. Klein et al. (1987), "High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells", Nature 327: 70-73) entwickelt: sie beruhen einmal auf der direkten Injektion der DNA in die einzelne Zelle (Mikroinjektion), sowie auf der Beschießung einer Zellpopulation mit Mikroprojektilen aus Wolfram, an deren Oberfläche die betreffenden Nukleinsäure gebunden wurde ('Shotgun'). Parallel zur physikalischen Transformation von Zellen haben sich die biologischen Infektionsmethoden bewährt. Dazu zählen insbesondere die hocheffiziente virale Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen (K.L. Berkner, (1988), "Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes", Biotechniques 6: 616-629; L.K. Miller, (1989), "Insect baculoviruses: powerful gene expression vectors", Bioessays JJ,: 91-95; B. Moss et al. (1990), "Product review. New mammalian expression vectors", Nature 348: 91-92) und die über Liposomen vermittelte Lipofektion (R.J. Mannino et al. (1988), "Liposome mediated gene transfer", Biotechniques 6: 682-690; P.L. Feigner et al. (1987), "Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure", Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 84: 7413-7417). Alle bisher beschriebenen Methoden behandeln das Überwinden der prokaryotischen oder eukaryotischen Plasmamembran durch nackte oder verpackte Nukleinsäuren. Während mit dem Einschleusen der Nukleinsäure in die prokaryotische Zelle der Wirkort bereits erreicht ist, finden in der kompartimentierten eukaryotischen Zelle weitere biochemische Prozesse statt, die unter bestimmten Bedingungen das Eindringen der Nukleinsäure in den Zellkern unterstützen (z. B. viraler Infektionsweg bei HTV). Analoge Infektionsprozesse, bei denen exogene Nukleinsäuren aktiv in andere Zellorganellen eingeschleust werden (z. B. in Mitochondrien), wurden bisher nicht beschrieben.
Neben der Einbringung der Nukleinsäure in die Zelle bzw. die Zellorganelle spielt die Transkription und vor allem die Replikation der eingeführten Nukleinsäure eine entscheidende Rolle. In diesem Zusammenhang ist bekannt, daß DNA-Moleküle über eine besondere Eigenschaft verfügen können, die unter bestimmten Bedingungen in einer Zelle eine Verdoppelung zuläßt. Hierzu trägt ein besonderes Strukturelement, der Ursprungspunkt der DNA-Replikation bei (ori, origin), dessen Anwesenheit die Fähigkeit zur DNA-Replikation verleiht (K.J. Marians (1992), "Prokaryotic DNA replication", Annu. Rev. Biochem. 6]_: 673-719; M.L. DePamphilis (1993), "Eukaryotic DNA replication: anatomy of an origin", Annu. Rev. Biochem. 62: 29-63; H. Echols und M.F. Goodman (1991), "Fidelity mechanisms in DNA replication", Annu. Rev. Biochem. 60: 477-511). Der streng kontrollierte Prozeß der DNA-Replikation beginnt in E. coli beispielsweise mit der Bindung eines Proteins (K. Geider und H. Hoffmann Berling (1981), "Proteins Controlling the helical structure of DNA", Annu. Rev. Biochem. 50: 233-260) an die hochspezifische Initiationsstelle und definiert damit den Startpunkt für eine spezifische RNA-Polymerase (Primase). Sie synthetisiert einen kurzen RNA-Strang (-10 Nukleotide, 'Primer'), der zu einem der DNA-Matrizenstränge komplementär ist. Die 3 '-Hydroxylgruppe des terminalen Ribonukleotids dieser RNA-Kette dient als 'Primer' für die Synthese neuer DNA durch eine DNA-Polymerase. DNA-entwindende Proteine entspiralisieren die DNA-Doppelhelix (J.C. Wang (1985), "DNA topoisomerases", Annu. Rev. Biochem. 54: 665-697). Die separierten Einzelstränge werden durch DNA-bindende Proteine in ihrer Konformation stabilisiert (J.W. Chase und K.R. Williams (1986), "Single-stranded DNA binding proteins required for DNA replication", Annu. Rev. Biochem. 55: 103-136), um eine störungsfreie Funktion der DNA-Polymerasen zu ermöglichen (T.S. Wang (1991), "Eukaryotic DNA polymerases", Annu. Rev. Biochem. 60: 513-552). Ein Multienzymkomplex, das Holoenzym der DNA-Polymerase-III, synthetisiert den größten Teil der neuen DNA. Der RNA-Teil des chimären RNA-DNA-Moleküls wird anschließend von der DNA-Polymerase III abgespalten. Die Entfernung der RNA von den neu entstandenen DNA-Ketten läßt Lücken zwischen den DNA-Fragmenten entstehen. Diese Lücken werden von der DNA-Polymerase I ausgefüllt, die DNA aus einer Einstrang-Matrize neu aufbauen kann. Während bei der Replikation einer der beiden neu synthetisierten DNA-Stränge kontinuierlich aufgebaut wird (5'-3'-Richtung, Leitstrang), beobachtete Ogawa und Okazaki, daß ein Großteil des neusynthetisierten Gegenstranges (3'-5'-Richtung, Verzögerungsstrang) aus kurzen DNA Fragmenten aufgebaut wurde (T. Ogawa und T. Okazaki (1980), "Discontinuous DNA replication", Annu. Rev. Biochem. 49: 421-457). Sogenannte Primasen initiieren hier durch die Synthese mehrerer RNA-Primer den Beginn der DNA-Synthese des Gegenstranges. Mit fortschreitender Replikation werden diese Fragmente von ihren RNA-Primern befreit, die Lücken geschlossen und von der DNA-Ligase kovalent zu langen Tochtersträngen miteinander verknüpft. Nach der Beendigung des Replikationszyklusses entstehen zwei Chromosome.
Im Unterschied dazu wird die DNA-Replikation von vielen Plasmiden über einen Replikationsursprung gesteuert, der auf die Synthese des Verzögerungsstranges (3'-5'-Richtung) verzichtet und die Synthese von zwei kontinuierlichen DNA-Strängen bidirektional initiieren kann (jeweils in 5'-3'-Richtung entlang der beiden Matrizen). Die Voraussetzung für eine vollständige DNA-Replikation ist hier die zyklische Form der Nukleinsäure. Sie gewährleistet, daß die DNA-Polymerasen am Ende der Neusynthese der komplementären DNA-Stränge wieder an den Ausgangspunkt zurückgelangen, wo nun Ligasen die kovalente Verknüpfung der Enden der beiden neusynthetisierten Tochterstränge gewährleisten.
Eine interessante Form linear-zyklischer Nukleinsäuren ist aus Pockenviren bekannt: durch sogenannte 'hairpin-loops' an den Enden ihrer linearen Genome verfügen sie unter Beibehaltung einer überwiegend linearen Konformation über eine zyklische Molekülstruktur (D.N. Black et al. (1986), "Genomic relationship between capripoxviruses", Virus Res. 5: 277-292; J.J. Esposito und J.C. Knight (1985), "Orthopoxvirus DNA: a comparison of restriction profiles and maps", Virology 143: 230-251). Kovalent geschlossene 'hairpin'-Nukleinsäuren wurden nicht nur in Pockenviren gefunden, sondern auch für die ribosomale RNA aus Tetrahymena (E.H. Blackburn und J.G. Gall (1978), "A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena", J. Mol. Biol. 120: 33-53), und den Genomen der Parvoviren (S.E. Straus et al. (1976), "Concatemers of altemating plus and minus Strands are intermediates in adenovirus-associated virus DNA synthesis", Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 73: 742-746; P. Tattersall und D.C. Ward (1976), "Rolling hairpin model for replication of parvovirus and linear chromosomal DNA", Nature 263: 106-109) beschrieben.
Mit den bisher bekannten Plasmiden oder Nukleinsäurekonstrukten ist es aber nicht möglich, Nukleinsäuren zielgerichtet über die Protein-Importroute in Zellen oder Zellorganellen einzubringen. Dies ist aber zum Beispiel Voraussetzung dafür, Veränderungen des mitochondrialen Genoms von Patienten mit neuromuskulären und neurodegenerativen Erkrankungen auf genetischer Ebene behandeln, oder eine zielgerichtete Mutagenese in Mitochondrien oder anderen Zellorganellen durchführen zu können.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand deshalb darin, ein Konstnikt auf Nukleinsäure-Basis zu entwickeln, das das gerichtete Einschleusen von Nukleinsäuren in Zellen und Kompartimente eukaryotischer Zellen erlaubt. Außerdem soll ein Verfahren bereitgestellt werden, wie dieses Konstnikt in Zellkompartimente oder Zellen gelangen kann. Weiterhin sollte die eingeführte Nukleinsäure so beschaffen sein, daß sie auch als replikationsfahige Nukleinsäure über zelluläre Protein-Importwege aufgenommen werden kann. Außerdem sollten Eigenschaften vorhanden sein, die zu einer gesteuerten Transkription und/oder Replikaton in Zellen bzw. in definierten Zielkompartimenten einer Zelle führen. Das Verfahren soll zur Therapie von genetischen Erkrankungen (Veränderungen am mitochondrialen Genom) und zur zielgerichteten Mutagenese in eukaryotischen und prokaryotischen Zellen eingesetzt werden. Die Erfindung soll folgende Anforderungen:
- universelle Anwendbarkeit
- zell-, kompartiment- und membranspezifisches Einschleusungsverhalten
- hohe Effektivität - geringe Immunogenität
- Minimierung des Infektionsrisikos
- die eingeführte Nukleinsäure (Plasmidmolekül) soll replizierbar sein - die eingeführte Nukleinsäure (Plasmidmolekül) soll transkribierbar sein
- die eingeführte Nukleinsäure (Plasmidmolekül) soll gegen Nukleasen stabil sein
- die Struktur der eingeführten Nukleinsäure (Plasmidmolekül) sollte universell verwendbar sein
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Patentansprüche 1), 25), 54), 56), 58), 60) und 61). Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Um ein Protein innerhalb einer Zelle vom Entstehungsort gezielt zu einem anderen Kompartiment oder einer anderen Zellorganelle (z. B. den Wirkort) befördern zu können, wird das Protein in der Regel als Präprotein synthetisiert (R. Zimmermann et al. (1983), "Biosynthesis and assembly of nuclear-coded mitochondrial membrane proteins in Neurospora crassa", Methods Enzymol. 97: 275-286). Neben der maturierten Aminosäuresequenz verfügt das Präprotein über eine sogenannte Signalsequenz. Diese Signalsequenz ist spezifisch für das Zielkompartiment und sorgt dafür, daß das Präprotein durch Oberflächenrezeptoren erkannt werden kann. Das natürliche Hindernis 'Membran' wird dann überwunden, indem das Präprotein durch einen aktiven (mehrere Transport-Proteine' sind an diesem Prozeß beteiligt) oder passiven Prozeß (direkter Durchtritt ohne Beteiligung weiterer Proteine) durch die Membran transloziert wird. Am Wirkort wird dann die Signalsequenz in der Regel durch eine spezifische Peptidase abgetrennt, sofern sie nicht selbst Bestandteil des maturierten Proteins ist. Das maturierte Protein kann nun seine enzymatische Aktivität entfalten.
Es wurde von den Erfindern erkannt, daß dieser Mechanismus ausgenutzt werden kann, um Nukleinsäuren zielgerichtet durch Membranen zu schleusen. Dabei unterliegt die Nukleinsäure keiner Beschränkung, das heißt es kann jede gewünschte bzw. bekannte Nukleinsäure verwendet werden. Dazu wird eine zell-, kompartiment- oder membranspezifische Signalsequenz an die gewünschte Nukleinsäure gekoppelt, wobei ein chimäresPeptid-Nukleinsäure-Fragment entsteht. In diesem Zusammenhang ist bekannt, daß die Kopplung zwischen einer Nukleinsäure und einem Peptid über die mit ε-Maleimidocapronsäure-N-hydroxysuccinimdester modifizierte α-Aminogruppe eines synthetischen KDEL-Peptides erfolgen kann (K. Arar et al, (1993), "Synthesis of oligonucleotide-peptide conjugates containing a KDEL signal sequence", Tetrahedron Lett. 34: 8087-8090). Diese Verknüpfungsstrategie ist für die Nukleinsäureeinbringung in Zellorganellen und Zellen jedoch völlig unbrauchbar, da hierbei Translokation analog zum natürlichen Proteintransport erfolgen soll. Mit der Blockierung der α-Aminogruppe eines synthetischen Peptides durch eine Nukleinsäure ist ein derartiger Transport nicht zu erwarten. Von den Erfindern wurde deshalb eine Kopplung über eine Carboxy-terminale Aminosäure gewählt. Das gewährleistet zum einen eine 'lineare' Verknüpfung, zum anderen steht das freie Amino-terminale Ende des Signalpeptids damit für die essentiellen Schritte der Importreaktion zur Verfügung.
Um den beschriebenen Transportmechanismus auch für die Einbringung von replikativen und transkriptionsaktiven Nukleinsäuren nutzbar machen zu können, wird die Nukleinsäure vorzugsweise über eine homologe Rekombination in ein vorhandenes Genom integriert, oder ist selbst Träger der genetischen Elemente, die eine autonome Initiation von Replikation und Transkription gewährleistet. Nur die letzte Variante erfüllt das Kriterium der universellen Anwendbarkeit, da eine Rekombination in ein vorhandenes zelluläres Genom nur unter bestimmten Bedingungen und in ausgewählten Zellen gelingt.
Eine Möglichkeit bietet hier die Verwendung zyklischer DNA, da die DNA-Polymerasen am Ende der Neusynthese der Tochterstränge wieder an den Ausgangspunkt zurückgelangen und damit eine vollständige DNA-Replikation gewährleisten. Während die Verwendung eines doppelsträngigen zyklischen Plasmides alle physikalischen Kriterien für eine erfolgreiche Replikation in jedem Zielkompartiment der Zelle erfüllt, steht dieser physikalischen DNA-Form jedoch die Größenkapazität der Importpore gegenüber, die entscheidend an der zielgerichteten Translokation beteiligt ist: bereits der kompakte Durchmesser eines superhelikalen Plasmides ist dem globulärer Proteine vergleichbar und läßt eine Translokation durch ein Membransystem über die Protein-Importroute aussichtslos erscheinen. Der Lösungsansatz besteht hier in der Verwendung linear-zyklischer DNA-Moleküle, die über modifizierte (zyklisierte) Enden verfügen, trotzdem aber nur den Durchmesser linearer DNA-Moleküle aufweisen. Diese stellen zum einen kein Hindernis für die Größe der Importpore dar, zum anderen verfügen diese linear-zyklischen DNA-Moleküle über alle physikalischen Voraussetzungen, um in den Mitochondrien replikative und transkriptionsaktive Plasmide bilden zu können.
Für die Konstruktion des erfindungsgemäßen chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragmentes, sowie für die Konstruktion eines replikativen und transkriptionsaktiven Nukleinsäureanteils (Plasmid) benötigt man vorzugsweise:
- Signalpeptid bzw. Signalsequenz (zell-, kompartiment- oder membranspezifisch) - Kopplungsagenz
- Nukleinsäure (Oligonukleotid), die vorzugsweise die folgenden weiteren Informationen umfaßen kann:
- Informationen zur Initiation und Regulation von Transkription und Replikation
- Informationen für die Termination der Transkription und Replikation - multiple Klonierungsstelle für eine zusätzlich einzufügende (zu expremierende)
Nukleinsäure
- Modifikationsmöglichkeiten, so daß 'hairpin-loops' angefügt werden können (Zyklisierung der Enden), die eine Verknüpfung zum Signalpeptid zulassen
Die Auswahl der Signalsequenz hängt davon ab, welche Membran bzw. welches Membransystem überwunden und welches Zielkompartiment der Zelle (Zellkern, Mitochondrion, Chloroplast) oder der Zellorganelle erreicht werden soll. Proteine, die zum Beispiel in eines der vier mitochondrialen Kompartimente (äußere Mitochondrienmembran, Intermembranraum, innere Mitochondrienmembran, Matrixraum) eingeführt werden sollen, besitzen kompartimentspezifische Signalsequenzen. Für die Einbringung von Nukleinsäuren werden im allgemeinen Signalsequenzen ausgewählt, die ein zell-, kompartiment- oder membranspezifisches Erkennungssignal enthalten und dadurch die angehängte Nukleinsäure an ihren Wirkungsort dirigieren (z.B. innere Seite der inneren Mitochondrienmembran oder Matrixraum). Zur Auswahl stehen Signalsequenzen, die Proteine in Gegenwart oder Abwesenheit eines Membranpotentials transportieren können. Für die Nukleinsäureeinbringung werden Signalsequenzen bevorzugt, die unabhängig von Membranpotentialen arbeiten, z.B. die Signalsequenz der Ornithintranscarbamylase (OTC) für den Transport in den Matrixraum der Mitochondrien (A.L. Horwich et al. (1983), "Molecular cloning of the cDNA coding for rat ornithine transcarbamoylase", Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 80: 4258-4262; J.P. Kraus et al. (1985), "A cDNA clone for the precursor of rat mitochondrial ornithine transcarbamylase: comparison of rat and human leader sequences and conservation of catalytic sites", Nucleic. Acids. Res. L3: 943-952). Grundsätzlich ist für den Transport in das Zielkompartiment die reine Signalsequenz ausreichend. Bevorzugt werden aber Signalsequenzen ausgewählt, die zusätzlich über eine zell- oder kompartimentspezifische Peptidasespaltstelle verfügen. Diese 'Spaltstelle' liegt im günstigsten Fall innerhalb der Signalsequenz, kann aber auch an diese durch zusätzliche Aminosäuren angefügt werden, um nach dem Erreichen des Zielkompartimentes das Abspalten der Signalsequenz sicherzustellen (z.B. kann die Signalsequenz der menschlichen OTC um weitere zehn Aminosäuren der maturierten OTC verlängert werden). Damit wird gewährleistet, daß die Nukleinsäure im Zielkompartiment von dem Signalpeptid abgetrennt werden kann und sich damit die Wirkung der Nukleinsäure voll entfaltet. Hergestellt wird die ausgewählte Signalsequenz auf biologischem (Reinigung natürlicher Signalsequenzen oder Klonierung und Expression der Signalsequenz in einem eukaryotischen oder prokaryotischen Expressionssystem), bevorzugt aber auf chemisch-synthetischem Weg.
Um eine lineare chemische Verknüpfung zwischen Nukleinsäure und Signalpeptid zu gewährleisten, erfolgt die Kopplung des Signalpeptids über ein Kopplungsagenz, das im allgemeinen über Aminosäuren, bevorzugt über Aminosäuren mit reaktiven Seitengruppen, bevorzugt über ein einzelnes Cystein oder Lysin am Carboxy-terminalen Ende des Signalpeptides mit diesem verbunden ist. Als Kopplungsreagenz dient ein bifunktioneller Crosslinker, bevorzugt ein heterobifunktioneller Crosslinker, der bei Verwendung eines Cysteins als Kopplungsstelle am Signalpeptid neben einer thiolreaktiven Gruppe über eine zweite reaktive Gruppe, bevorzugt eine aminoreaktive Gruppierung verfügt (z. B. m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester, MBS und seine Derivate).
Auch die Nukleinsäure verfügt über eine Kopplungsstelle, die kompatibel zum ausgewählten Crosslinker sein sollte. Bei der Verwendung von MBS sollte das Oligonukleotid über eine Amino- oder Thiolfunktion verfügen. Die Kopplungsgruppe der Nukleinsäure kann über die chemische Synthese des Oligonukleotids eingeführt werden und ist im allgemeinen am 5 '-Ende, am 3 '-Ende, bevorzugt aber direkt an einer modifizierten Base lokalisiert, z. B. als 5'-Aminolinker (TFA-Aminolinker AmiditeR, 1 ,6-(N-Trifluoroacetylamino)-hexyl-ß-Cyanoethyl-N,N-Diisopropyl Phosphoramidite, Pharmacia) oder als 5'-Thiollinker (THIOL-C6 Phosphoramidit*, MWG Biotech) an einer freien 5'-Hydroxy/Phosphatgruppe, als 3 '-Aminolinker (3 '-Aminomodifier-C7-CPG- SynthesesäulenR, MWG Biotech) an einer freien 3 '-Hydroxy/Phosphatgruppe, bevorzugt aber als arninomodifiziertes Basenanalogon, bevorzugt aminomodifiziertes Deoxyuridin (Amino-Modifier-dTR, 5 '-Dimemoxy-trityl-5-[N-(trifluoroacetylaminohexyl)-3-acryl- imido]-2'-desoxy uridin, 3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite, Glen Research) innerhalb der Sequenz. Die zum verwendeten Crosslinker kompatible reaktive Gruppe ist dabei mindestens durch eine C2-Spacer Einheit, bevorzugt aber durch eine C6-Spacer Einheit vom 5'- oder 3 '-Ende des Oligonukleotids oder der modifizierten Base distanziert. Die Nukleinsäure (Oligonukleotid) mit reaktiver Kopplungsgruppe umfaßt dabei mindestens zwei Nukleotide.
Um die Stabilität der Nukleinsäure (Oligonukleotid) gegenüber zellulären und extrazellulären Nukleasen zu erhöhen, können die chemisch synthetisierten Nukleinsäuren durch ein sulfurzierendes Reagenz (Beaucage-Reagenz*, MWG-Biotech) geschützt werden. Bei der chemischen Synthese werden dabei die Phosphordiester-Bindungen der Nukleinsäure in Phosphorthioat-Bindungen umgewandelt. Dieses Oligonukleotid läßt sich dann für die enzymatische Amplifizierung von Nukleinsäuren einsetzen, durch weitere Verknüpfungsreaktionen mit anderen Nukleinsäuren verlängern oder direkt verwenden. Um das chimäre Peptid-Nukleinsäure-Fragment direkt einzusetzen, sollte die Nukleinsäure (Oligonukleotid) über eine hybridisierungsfahige Sekundärstruktur verfügen, bevorzugt ohne interne Homologien, um eine lineare Einzelstrangstruktur ausbilden zu können. Damit wird sichergestellt, daß die Nukleinsäure (Oligonukleotid) des chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragmentes ohne weitere Nukleinsäureankopplungen eine biochemische/therapeutische Wirkung entfalten kann.
Zur Kopplung mit der Signalsequenz werden aber bevorzugt Nukleinsäuren (Oligonukleotide) eingesetzt, die über zwei weitere Eigenschaften verfügen:
1. Die Sequenz ist bevorzugt partiell palindromisch, mit einem glatten 5 '-3 '-Ende ('blunt end'), überhängendem 3'- Ende ('sticky end'), bevorzugt aber mit überhängendem, phosphorylierten 5 '-Ende ('sticky end'), ganz bevorzugt mit einem 4 Nukleotide umfassenden überhängenden 5'-Ende, das keine Selbsthomologie (palindromische Sequenz) aufweist. Dadurch kann sich eine stabile, monomere Sekundärstruktur ('hairpin-loop') ausbilden. Das überhängende 5 '-Ende dient dazu, definierte Nukleinsäuren, Antisense-Oligonukleotide, bevorzugt aber transkribierbare und replizierbare Gene anzukoppeln.
2. Das Oligonukleotid trägt im Scheitelpunkt des 'loops' eine modifizierte Base, die eine zum Crosslinker reaktive Gruppierung trägt, bevorzugt ein aminomodifiziertes 2'-Deoxythymidin. Die Aminofunktion dieser modifizierten Base ermöglicht dabei die Kopplungsreaktion zwischen MBS und Oligonukleotid.
Das chimäre Peptid-Nukleinsäure-Fragment eignet sich zum gezielten Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen und Zellorganellen (z. B. Zellkern, Chloroplast), insbesondere zum Einbringen von Ribonukleinsäuren (mRNAs, 'Antisense '-Oligonukleotide) und Desoxyribonukleinsäuren (vollständigen Gene, 'Antisense'-Oligonukleotide). Besonders eignet er sich zum Einschleusen von transkribierbaren und prozessierbaren Genen in Mitochondrien, ganz besonders aber zum Einschleusen von replikativen, transkriptionsaktiven und prozessierbaren linear-zyklischen Nukleinsäuren (Plasmiden).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird an die Nukleinsäure, enthaltend die reaktive Kopplungsstelle, oder an das chimäre Peptid-Nukleinsäure-Fragment ein transkribierbares Gen angekoppelt werden. Bevorzugt geschieht dies durch die Amplifizierung eines Gens, bevorzugt eines klonierten Gens, das aus einem mitochondrialen Promotor, bevorzugt dem Promotor des leichten DNA Stranges (OL, nt 490 - nt 369) und dem zu expremierenden Gen in einer prozessierbaren Form, bevorzugt einem mitochondrialen Gen, bevorzugt einer mitochondrialen transfer RNA, bevorzugt der mitochondrialen tRNALeu(UUR) (nt 3204 - nt 3345), besteht (S. Anderson et al. (1981), "Sequence and organization of the human mitochondrial genome", Nature 290: 457-465). Nach der enzymatischen Amplifizierung des Gens kann die Kopplung an die Nukleinsäure, enthaltend die reaktive Kopplungsstelle, oder an das chimäre Peptid-Nukleinsäure-Fragment über eine 'blunt-end'-Ligation, bevorzugt aber eine 'sticky-end'-Ligation, angekoppelt werden. Dazu verfügt die anzukoppelnde Nukleinsäure über mindestens ein kopplungsfähiges Ende, das bevorzugt aus einem 4 Nukleotide umfassenden 5'-Überhang besteht und keine Selbsthomologie (palindromische Sequenz) aufweist. Sollen beide Enden mit 'hairpin-loops' gekoppelt werden, so wird bevorzugt eine Nukleinsäure ausgewählt, die über unterschiedliche 5'-Überhänge verfügt, die bevorzugt 4 Nukleotide umfassen und keine Selbsthomologie aufweisen. Ganz bevorzugt werden Nukleinsäuren verwendet, deren 5'-Enden auch zueinander keine Homologie besitzen. Für die Modifikation der Enden (Zyklisierung) werden dann bevorzugt zwei unterschiedliche 'hairpin-loops' verwendet, wobei einer spezifisch (komplementär) für das 'linke'-Plasmidende, der andere spezifisch für das 'rechte'-Plasmidende der Nukleinsäure ist. Um die Stabilität der Nukleinsäure gegenüber zellulären und extrazellulären Nukleasen zu erhöhen, können die Phosphordiester-Bindungen der Nukleinsäure durch Phosphorthioat-Bindungen substituiert und damit geschützt werden, wenn bereits bei der enzymatischen Amplifizierung modifizierte Phosphorthioat-Nukleotide verwandt werden. Zur Herstellung des chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragments eignet sich ein Verfahren, daß die folgenden Schritte aufweist:
(a) Umsetzung einer Nukleinsäure (Oligonukleotid), enthaltend eine funktioneile Kopplungsgruppe, mit einem Kopplungsagenz. (b) Umsetzung des Konstruktes aus (a) mit Aminosäuren am
Carboxy-terminalen Ende eines Peptids, enthaltend eine Signalsequenz, ausgenommen eine KDEL-Signalsequenz, und
(c) wahlweise Verlängerung des chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragments aus (b) um weitere DNA- oder RNA-Fragmente.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das chimäre Peptid-Nukleinsäure- Fragment durch folgende Schritte hergestellt werden:
(a) Wahlweise Verlängerung der Nukleinsäure, enthaltend eine funktionelle Kopplungsgruppe, um weitere DNA- oder RNA-Fragmente.
(b) Umsetzung der Nukleinsäure mit funktioneller Kopplungsgruppe oder der verlängerten Nukleinsäure aus (a) mit einem Kopplungsagenz.
(c) Umsetzung des Konstruktes aus (b) mit Aminosäuren am Carboxy-terminalen Ende eines Peptids, verfügen, enthaltend eine Signalsequenz, ausgenommen eine KDEL-Signalsequenz.
In einer anderen Ausführungsform, bei der es sich um eine linear zyklische Nukleinsäure in Form eines Plasmids handelt, hängt die Auswahl der Nukleinsäure davon ab, welche genetische Information man in welcher Zelle und in welchem Zielkompartiment der Zelle exprimieren will. In diesem Zusammenhang müssen Nukleinsäuren, die transkribiert werden sollen, über einen geeigneten Promotor verfügen. Soll ein Gen zum Beispiel in der mitochondrialen Matrix exprimiert werden, so kann ein mitochondrialer Promotor ausgewählt werden, bevorzugt der Promotor des leichten mtDNA-Stranges. Die Steuerung der Transkription erfolgt in anderen Zellkompartimenten (z.B. Zellkern, Chloroplast) durch kompartimentspezifische Promotoren.
Die Regulation der Transkription erfolgt in der Regel durch sogenannte Transkriptions-Regulationssequenzen, bevorzugt mitochondriale Transkriptions- Regulationssequenzen. Im allgemeinen umfassen diese Sequenzen mindestens Bindungsstellen für Faktoren, die die Transkription initiieren (Transkriptions- initiationsfaktor), sowie die Bindungsstelle für den RNA-Syntheseapparat. Soll eine Transkription in den Mitochondrien eingeleitet werden, eignen sich hier Bindungssequenzen der mitochondrialen Transkriptionsfaktoren und der RNA- Polymerase, besonders des mitochondrialen Transkriptionsfaktors 1 und der mitochondrialen RNA-Polymerase. In anderen Zellkompartimenten (z.B. Zellkern, Chloroplast) kann die Transkription durch kompartimentspezifische Transkriptions- Regulationssequenzen kontrolliert werden.
Um die Transkription regulieren zu können, verfügt das Plasmid über Transkriptions-Regulationssequenzen, die bevorzugt in 3 '-Richtung zu der Transkriptions- Initiationsstelle (Promotor) angefügt sind. Soll zum Beispiel die Transkription eines mitochondrialen Transformationsplasmids reguliert werden, so eignen sich die Kontrollelemente für die H- und L-Strang Transkription des mitochondrialen Genoms, bevorzugt aber die sogenannten 'conserved sequence blocks1, die die Transkription des L-Stranges terminieren und gleichzeitig den Übergang zur DNA-Replikation ermöglichen. Um die ausschließliche Transkription des gewünschten Gens (ggfs. der gewünschten Gene bei einer polycistronischen Transkription) zu induzieren, wird die Transkription an einer geeigneten Stelle hinter dem 3 '-Ende des expressionsfahigen Gens / der Gene unterbrochen. Das wird durch das Einfügen einer geeigneten Transkriptions- Terminationsstelle, bevorzugt in 3'-Richtung zum Promotor angeordnet, erreicht. Für die regulierte Expression eignet sich hier besonders die Bindungssequenz für einen bidirektional wirkenden Transkriptions-Terminations-Faktor. Für die Transkriptions- Termination in den Mitochondrien wird hier bevorzugt ein Bindungsmotiv eines mitochondrialen Transkriptions-Terminationsfaktors ausgewählt. Gleichzeitig wird mit der Verwendung einer Transkriptions-Terminationsfaktor-Bindungssequenz die Bildung von 'Antisense-RNA' der Kopf-Kopf verknüpften dimeren Plasmide unterdrückt.
Die Kontrolle der Selektion transformierter Zellen kann über die Expression eines Reportergens erfolgen. Als Reporter- oder Selektionsgen eignen sich insbesondere expressionsfähige Gene, deren Expression zu einer makroskopischen Änderung des Phänotypes führen. Zur Auswahl stehen hier zum Beispiel Gene, die Antibiotikaresistenzen auslösen. Insbesondere die Resistenzgene für Oligomycin (OLI) oder Chloramphenicol (CAP) sind für die Anwendung in einem mitochondrialen Transformationssystem geeignet. Als besonders geeignetes Selektionsgen erscheint in diesem Zusammenhang das mitochondriale Chloramphenicolresistenzgen, da CAP-sensitive Zellinien ihren Phänotyp bereits bei einem Anteil von ca. 10 % des 16 S rRNACAP+-Gens ändern.
Die Replikation der Nukleinsäure läßt sich durch eine Initiationsstelle für die DNA-Replikation (Replikationsursprung) realisieren. Das chimäre
Peptid-Nukleinsäure-Fragment in Form eines Plasmids muß daher über mindestens einen Replikationsursprung verfügen. Die Orientierung des Replikationsursprunges kann dabei unabhängig von dem expressionsfahigen Gen (Genen) angeordnet sein, bevorzugt wird der Replikationsursprung aber in 3 '-Richtung zum Promotor angeordnet. Ein geeigneter Replikationsursprung für ein mitochondriales Transformationsplasmid wäre ein mitochondrialer Replikationsursprung. Im besonderen eignet sich hier der Ursprung der Replikation des schweren mtDNA-Stranges, der bevorzugt über mindestens einen 'conserved sequence block' verfügt. Die Replikation läßt sich über sogenannte Regulationssequenzen für die Replikation kontrollieren. Dazu muß das Plasmid über mindestens ein derartiges Sequenzmotiv verfügen, das bevorzugt in 3'-Richtung zum Promotor und zum Replikationsursprung angeordnet ist. Soll die Replikation in den Mitochondrien reguliert werden, eignet sich hier besonders eine mitochondriale Replikations-Regulationssequenz. Bevorzugt wird ein Motiv verwendet, das mindestens eine der 'termination associated sequences' beinhaltet. In anderen Zellkompartimenten (z.B. Zellkern, Chloroplast) wird die Replikation bevorzugt über mindestens einen kompartimentspezifischen Replikationsursprung initiiert und über kompartimentspezifische Replikations-Regulationssequenzen kontrolliert.
Um die Klonierung unterschiedlicher Gene in das Plasmidmolekül zu erlauben, muß die Plasmidnukleinsäure auch über ein geeignetes Klonierungsmodul (multiple Klonierungsstelle) verfügen, das über möglichst unterschiedliche Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen verfügt. Besonders geeignet sind hier seltene Erkennungssequenzen, die nicht an anderen Stellen des Plasmids vorkommen. Das Klonierungsmodul kann an einer beliebigen Stelle des Transformationsplasmids eingebaut werden. Soll der Bereich der Klonierungsstelle in die Transkription des Selektionsgens integriert werden, eignet sich die Insertion der multiplen Klonierungsstelle in 3 '-Richtung zu dem Promotor und in 5'-Richtung zu der Transkriptions-Terminationsstelle. Besonders geeignet ist die Integration der multiplen Klonierungsstelle in 5'-Richtung zu dem Selektionsgen, da es dabei bei der Verwendung des Selektionssystems gleichzeitig zu einer Transkription des Bereichs der multiplen Klonierungsstelle kommt.
Um bei der Verwendung einer Nukleinsäure die autonome Replikation in jedem Zielkompartiment einer Zelle zu erlauben, muß gewährleistet werden, daß die DNA-Replikationsenzyme nach der Synthese des Tochterstranges wieder an den Syntheseausgangspunkt zurückgelangen, um die kovalente Verknüpfung des 3'- mit dem 5'-Ende des neu synthetisierten Tochterstranges durch entsprechende Enzyme sicherzustellen. Dazu eignet sich ein lineares Nukleinsäureplasmid, das sich in eine zyklische Nukleinsäure überführen läßt. Eine Zyklisierung der Plasmidenden kann über die Verwendung sogenannter ligationsfähiger (phosphorylierter) Enden der Nukleinsäure erfolgen. Besonders geeignet ist hierzu die Verwendung einer 'blunt-end'-Nukleinsäure oder einer Nukleinsäure mit 3 '-überhängenden Enden, bevorzugt aber einer Nukleinsäure mit 5 '-überhängenden Enden. Die überhängenden Enden sollten dabei jeweils mindestens ein Nukleotid umfassen. Bevorzugt werden aber 5'-überhängende Enden verwendet, die aus vier Nukleotiden gebildet werden. Diese verfügen bevorzugt über keine Selbsthomologie (palindromische Sequenz) und sind auch bevorzugt zueinander nicht komplementär, um bei einer späteren Nukleinsäureverknüpfung die Dimerenbildung zu unterdrücken.
Die Zyklisierung der vorbereiteten Plasmidenden wird über synthetische Oligonukleotide vermittelt. Diese verfügen über eine partielle Selbsthomologie (partiell palindromische Sequenz) und sind dadurch zur Ausbildung sogenannter 'hai in-loop'-Strukturen befähigt. Die partiell palindromische Sequenz führt zu der Ausbildung einer stabilen, bevorzugt monomeren, Sekundärstruktur ('hairpin-loop'), mit einem glatten 5'-3'-Ende (blunt-end), einem überhängenden 3'-Ende ('sticky-end'), bevorzugt aber mit einem überhängenden 5'-Ende. Besonders eignen sich diese Oligonukleotide, wenn sie über ein phosphoryliertes 5'-Ende verfügen. Unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden mit 'hairpin-loop'-Struktur kann nun die lineare Plasmid-DNA in ein linear-zyklisches System überführt werden. Die Enden der beiden Oligonukleotide sind bevorzugt jeweils zu einem Ende der vorbereiteten Plasmidnukleinsäure komplementär. Bevorzugt werden hierzu zwei unterschiedliche 'hairpin-loops' eingesetzt, einer spezifisch (komplementär) für das 'linke'-Plasmidende, einer spezifisch (komplementär) für das 'rechte'-Plasmidende, um die Dimerenbildung zu unterdrücken. Mindestens eines der beiden 'hairpin-loop' Oligonukleotide kann über mindestens ein modifiziertes Nukleotid verfügen. Dieses stellt die Kopplungsstelle zu einem Signalpeptid sicher, damit der Nukleinsäuretransport über die Protein-Importroute vermittelt werden kann. Idealerweise sitzt diese Kopplungsstelle (modifiziertes Nukleotid) an einer der ungepaarten Positionen des 'loops'. Als Kopplungsstelle eignet sich eine chemisch reaktive Gruppe, insbesondere eine Amino- oder Thiolfiinktion.
Um die Enden des Transformationsplasmids für die Modifizierung (Zyklisierung) vorzubereiten, muß sichergestellt werden, daß die Enden des Plasmids mit den Enden der Oligonukleotide ('hairpin-loops') komplementär sind. Das gelingt zum einen durch die Amplifizierung der Plasmid-DNA mit geeigneten Oligonukleotiden, die über mindestens eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease verfügen. Es eignen sich hier Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, die nicht wiederholt in der Plasmidsequenz auftreten. Besonders geeignet ist die Verwendung von Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen, die überhängende Enden ('sticky-ends') generieren, insbesondere derer, die 5 '-überhängende Enden, bevorzugt außerhalb der eigenen Erkennungssequenz, erzeugen. In diesem Zusammenhang eignet sich besonders die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Bsa I (GGTCTCN,N5). Zum anderen eignet sich hier die Verwendung einer Monierten Nukleinsäure, die bereits über die Erkennungssequenzen für eine Restriktionsendonuklease, bevorzugt Bsa I, verfügt. Damit kann die enzymatische Amplifizierung entfallen und die über eine Plasmidpräparation/Restriktions- enzymbehandlung gewonnene Nukleinsäure direkt Verwendung finden. Bevorzugt beinhaltet die klonierte Nukleinsäure an beiden Enden bereits die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Bsa I.
Für die Reinigung des Transformationsplasmids stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Das Ziel ist hier in erster Linie, die zyklisierten Plasmidmoleküle von nicht umgesetzten Edukten abzutrennen. Die Verwendung von DNA-abbauenden Enzymen hat sich in diesem Zusammenhang als geeignet erwiesen, besonders empfiehlt sich hier die Verwendung von Enzymen, die über eine 5'-3'- oder 3'-5'-Exonukleaseaktivität verfügen. Insbesondere die Verwendung der Exonuklease III führt zu der vollständigen Hydrolyse nicht umgesetzter Edukte, während die zyklisierte Plasmid-DNA intakt verbleibt (keine freien 5'- oder 3'-Enden). Die Reaktionsprodukte lassen sich entweder über elektro- phoretische oder chromatographische Verfahren, aber auch durch eine Fällung reinigen. Zur Auswahl stehen hier unterschiedliche Reinigungsverfahren. Zum einen kann die zyklisierte und mit dem Kopplungsagenz und dem Signalpeptid konjugierte Nukleinsäure mit einer Exonuklease, bevorzugt Exonuklease III, behandelt und anschließend über eine chromatographische, elektrophoretische Reinigung, bzw. eine Fällung gereinigt werden. Zum anderen kann auch die zyklisierte Plasmid DNA mit einer Exonuklease, bevorzugt Exonuklease III, behandelt, gereinigt und anschließend mit dem Kopplungsagenz und dem Signalpeptid konjugiert und über eine chromatographische, elektrophoretische Reinigung, bzw. eine Fällung gereinigt werden.
Durch die Verwendung modifizierter Oligonukleotide kann die Verknüpfung mit einem Signalpeptid realisiert werden, das das Transformationsplasmid in das gewünschte Zellkompartiment in vivo dirigiert. Zu diesem Zweck kann entweder das Transformationsplasmid zuerst mit dem modifizierten Oligonukleotid umgesetzt werden (Ligation) und danach die Konjugation mit dem Kopplungsagenz und dem Signalpeptid erfolgen, oder das modifizierte Oligonukleotid wird zuerst mit dem Kopplungsagenz und dem Signalpeptid konjugiert und anschließend für die Zyklisierung der Transformations- plasmidenden eingesetzt (Ligation) .
Die Überwindung der Zellmembran durch das Transformationssystem (zelluläre Transformation) kann über verschiedene Verfahren erfolgen. Es eignen sich hier das 'Particle-Gun' System oder die Mikroinjektion, bevorzugt aber die Elektroporation und die Lipotransfektion. Alle Methoden gewährleisten die Einbringung des linear-zyklischen Peptid-Nukleinsäureplasmids in das Zytosol der Zelle, von wo aus das Plasmid durch das konjugierte Signalpeptid an seinen Wirkort (Zielkompartiment) dirigiert wird.
Gegenüber den in der Beschreibungseinleitung erwähnten Transformations- und Infektionsmethoden des Standes der Technik bietet dieses Verfahren erstmals die Möglichkeit, Nukleinsäuren zielgerichtet in Zellen und Zellorganellen einzuführen. Welches Zielkompartiment dabei erreicht werden soll (Cytosol, Nukleus, Mitochondrium, Chloroplast, etc.) kann durch die Wahl der Signalsequenz bestimmt werden. Neben dem kompartiment- und zellspezifischen Einschleusungsverhalten zeichnet sich dieses Verfahren durch seine universelle Anwendbarkeit aus. Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen und Zellsysteme können mit dem Translokationsvektor behandelt werden. Da bei der zielgerichteten Einschleusung ein natürliches Transportsystem der Membranen benutzt wird, erübrigt sich die Behandlung der Zellen oder Zellorganellen mit membranpermeabilisierenden Agenzien (z.B. Calciumchlorid-Methode, s.o.). Bei der Verwendung einer replikativen und transkriptionsaktiven Nukleinsäure, entfaltet das Plasmid erst nach der Vollendung des ersten Replikationszyklusses seine volle Größe: als echtes zyklisches Plasmid (künstliches Chromosom) verfügt es nun über die doppelte genetische Information (Kopf-Kopf verknüpfte Plasmiddimere). Insbesondere im Hinblick auf die Verwendung dieses Systems für eine somatische Gentherapie ist dieses Verhalten bewußt induziert und von entscheidender Bedeutung, da die zu exprimierenden Gene mit den defekten Genen der Zellen kompetitieren müssen. Neben dieser höchstmöglichen Effektivität besticht das System dadurch, daß es nicht wie zum Beispiel retrovirale Systeme über einen Rekombinationsvorgang in ein Genom integriert werden muß, um replikativ werden zu können. Dadurch werden unkontrollierbare Nebeneffekte (unerwünschte Rekombination) bereits im Vorfeld weitestmöglich unterdrückt. Die Anwendung dieses Plasmidsystems kann daher ohne großes Sicherheitsrisiko in Aussicht gestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird insbesondere durch die Figuren erläutert, welche zeigen:
Fig. 1: Signalpeptid der Ornithintranscarbamylase der Ratte, sowie eine für die Einschleusung geeignete DNA-Sequenz. Oben: Signalpeptid der Ornithintranscarbamylase der Ratte (32 Aminosäuren), verlängert um zehn N-terminale Aminosäuren des maturierten Proteins und ein zusätzliches Cystein als Kopplungsstelle. Dargestellt ist die Peptidsequenz im internationalen Einbuchstabencode; Mitte: eine für die Einschleusung geeignete, partiell palindromische DNA-Sequenz aus 39 Nukleotiden mit einem aminomodifizierten T an Nukleotidposition 22; Unten: ausgeprägte Sekundärstruktur des Oligonukleotids mit überhängendem 5 '-Ende und einem modifizierten Nukleotid im Scheitelpunkt des 'Loops'.
Fig. 2: Struktur des aminomodifizierten 2'-Deoxythymidin. R: Nukleinsäurereste. Fig. 3: Schematische Darstellung des chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragmentes, bestehend aus aminomodifiziertem Oligonukleotid (39 Nukleotide) mit ausgeprägtem 'Hairpin-Loop', Crosslinker und Signalpeptid. CL: Crosslinker.
Fig. 4: Elektrophoretische Auftrennung des Kopplungsproduktes aus aminomodifiziertem Oligonukleotid (39 Nukleotide), m-Maleimidobenzoyl-N- hydroxy-succinimidester (MBS) und Signalpeptid der Ornithintrans¬ carbamylase der Ratte (42 Aminosäuren, verlängert um ein Cystein am C-Terminus).
Fig. 5a: Ablaufdiagramm der Peptid-DNA-Fusion, Klonierung, Amplifizierung und Kopplung des einzuschleusenden transkribierbaren und prozessierbaren mitochondrialen tRNA-Gens (S. Anderson et al. (1981), "Sequence and organization of the human mitochondrial genome", Nature 290: 457-465). CL:
Crosslinker (MBS); MCS: Multiple Klonierungsstelle von pBluescript*
(Stratagene); mtTF: Bindungsstelle des mitochondrialen Transkriptionsfaktors; RNA-Pol: Bindungsstelle der mitochondrialen RNA-Polymerase; tRNA
Leucin: Gen der mitochondrialen transfer RNA für Leucin (UUR); Sac II, Apa
I, Eco RI: Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen; Nummerierung der klonierten mitochondrialen Sequenzen erfolgte in Anlehnung an die veröffentlichte Sequenz des menschlichen mitochondrialen Genoms (S. Anderson et al. (1981), "Sequence and organization of the human mitochondrial genome", Nature 290: 457-465).
Fig. 5b: Sequenz des klonierten tRNALeu(uυR)-Gens.
Fig. 6a/b: Darstellung der 32P-Strahlung der DNA, sowie der Enzymaktivitäten für Adenylat-Kinase, Cytochrom c-Oxidase und Malat-Dehydrogenase (y-Achsen) in 11 Fraktionen (x- Achsen) einer Mitochondrien-Sucrosegradientendichte- zentrifugation. Dargestellt ist der Anteil der jeweiligen Strahlung/ Enzymaktivität, ausgedrückt als prozentualer Anteil der Gesamtstrahlung/ Enzymaktivität, die auf den Gradienten aufgetragen wurde. ADK: Adenylat-Kinase; COX: Cytochrom c-Oxidase; MDH: Malat-Dehydrogenase.
Fig. 7a/b: Darstellung der 32P-Strahlung der DNA, sowie der Enzymaktivitäten für Adenylat-Kinase, Cytochrom c-Oxidase und Malat-Dehydrogenase (y-Achsen) in 11 Fraktionen (x-Achsen) einer Mitoplasten-Sucrosegradientendichtezentri- fugation. Dargestellt ist der Anteil der jeweiligen Strahlung/Enzymaktivität, ausgedrückt als prozentualer Anteil der Gesamtstrahlung/Enzymaktivität, die auf den Gradienten aufgetragen wurde. ADK: Adenylat-Kinase; COX: Cytochrom c-Oxidase; MDH: Malat-Dehydrogenase.
Fig. 8: Klonierung des Nukleinsäureanteils des Peptid-Nukleinsäure-Plasmids in pBluescript (Plasmid 1). Unter Verwendung der zwei Oligonukleotide (Primer 1 und 2) wurde aus mitochondrialer HeLa-DNA der Genabschnitt von Nukleotid 15903 bis Nukleotid 677 enzymatisch amplifiziert (beinhaltet: Promotor, gekennzeichnet durch die Bindungsstellen für die mitochondrialen
Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase; Replikationsursprung, gekennzeichnet durch die sogenannten 'conserved sequence blocks'; Regulation der DNA-Replikation, gekennzeichnet durch die TAS'-Motive). Da die Oligonukleotide Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen Xho I und Pst I enthalten, können die Enden des amplifizierten Nukleinsäure so modifiziert werden, daß sie zum einen kompatibel zu einem Vektorarm von pBluescript, zum anderen kompatibel zu dem Hybrid der Oligonukleotide MCS/TTS 1 und 2 sind. Diese beinhalten neben einer multiplen Klonierungsstelle auch eine Transkriptions-Terminationssequenz, die für die regulierte Transkription verantwortlich ist. Das Ligationsprodukt wird anschließend in E. coli XL1 Blue transformiert. Im Anschluß an die Plasmid-Isolierung inserttragender E. coli Kolonien wurden die Nukleinsäuren einer RFLP- und Sequenzanalyse unterzogen. Fig. 9: Sequenz der Oligonukleotide MCS/TTS 1 und 2. Die Oligonukleotide MCS 1 und 2 wurden synthetisch hergestellt und beinhalten Erkennungssequenzen für neun verschiedene Restriktionsendonukleasen, sowie ein Sequenzmotiv, welches die Transkription bidirektional zu unterbinden vermag. Die Oligonukleotide sind komplementär und können dadurch ein Hybrid ausbilden.
Die überhängenden Enden sind Teil der Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen Pst I und Barn HI.
Fig. 10: Nukleotidsequenz des Nukleinsäureanteils des Peptid-Nukleinsäureplasmids (Plasmid 1).
Fig. 11: Klonierung des Reportergens in den Nukleinsäureanteil des Peptid- Nukleinsäureplasmids in pBluescript (Plasmid 2). Unter Verwendung der zwei Oligonukleotide (Primer 3 und 4) wurde aus einem DNA-Extrakt einer menschlichen CAP-resistenten Zellinie der Genabschnitt von Nukleotid 1562 bis Nukleotid 3359 enzymatisch amplifiziert (beinhaltet: Teil des 12 S rRNA Gens, tRNAVal-Gen, 16 S rRNACAP+-Gen, tRNA^u-Gen, Teil des ND 1-Gens).
Da die Oligonukleotide Erkennungssequenzen für die Restriktions¬ endonukleasen Hind HI und Bei I enthalten, können die Enden der amplifizierten Nukleinsäure so modifiziert werden, daß sie kompatibel zu der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des Peptid-Nukleinsäure-Plasmids sind (Plasmid 1). Das Ligationsprodukt wird anschließend in E. coli XL1 Blue transformiert. Im Anschluß an die Plasmid-Isolierung inserttragender E. coli Kolonien wurden die Nukleinsäuren einer RFLP- und Sequenzanalyse unterzogen und stehen für die beschriebenen Experimente zur Verfügung.
Fig. 12: Nukleotidsequenz des Nukleinsäureanteils des Peptid-Nukleinsäure-Plasmids inklusive des Reportergens (Plasmid 2). Fig. 13a: Reaktionsablauf der Zyklisierung des Nukleinsäureanteils, sowie die Konjugation des Nukleinsäureanteils mit einem Signalpeptid. Der Nukleinsäureanteil des Peptid-Nukleinsäureplasmids kann über eine Plasmidpräparation oder eine enzymatische Amplifizierung gewonnen werden. In beiden Fällen führt die Behandlung mit der Restriktionsendonuklease Bsa I zu einem ligationsfähigen Zwischenprodukt. Dieses kann direkt mit den monomerisierten 'hairpin-loops' umgesetzt werden. Das Reaktionsprodukt wird durch eine Exonuklease III Behandlung von unspezifischen (nicht zyklischen) Reaktionsprodukten und Edukten abgetrennt, gereinigt und über einen Crosslinker mit dem Signalpeptid konjugiert. Alternativ kann einer der beiden
'hairpin-loops' zuerst über einen Crosslinker mit dem Signalpeptid konjugiert werden, bevor die zyklisierende Ligationsreaktion durchgeführt wird. Auch hier schließt sich eine Reinigung des Reaktionsproduktes durch eine Exonuklease III Behandlung an.
Fig. 13b: Struktur und Sequenz der 'hairpin-loop' Oligonukleotide HP 1 und 2.
Fig. 14: Monomerisierung eines 'hairpin-loop'-Oligonukleotids. Die synthetischen 'hairpin-loops' HP 1 und 2 können durch eine thermische oder alkalische Denaturierung monomerisiert werden. Dargestellt ist in dieser Figur ein Standard- Agarosegel: Spur 1, Molekulargewichtsstandard (ΦX 174 RF DNA behandelt mit der Restriktionsendonuklease Hae III); Spur 2: HP 1,
Syntheseprodukt; Spur 3: HP 1, thermisch monomerisiert.
Fig. 15a: Ligationsreaktion zwischen dem Nukleinsäureanteil des Peptid- Nukleinsäureplasmids (Plasmid 2) und den 'hairpin-loops' HP 1 und 2. Dargestellt ist in dieser Figur ein Standard- Agarosegel: Spur 1, klonierter Nukleinsäureanteil des Peptid-Nukleinsäureanteils in pBluescript behandelt mit der Restriktionsendonuklease Bsa I; Spur 2: Ligation der Reaktionsprodukte aus Spur 1 mit den 'hairpin-loops' HP 1 und 2; Spur 3, Behandlung der Reaktionsprodukte aus Spur 2 mit Exonuklease III; Spur 4, Molekulargewichtsstandard (λ DNA behandelt mit den Restriktionsendo¬ nukleasen Hind III und Eco RI).
Fig. 15b: Überprüfung des gereinigten Ligationsproduktes durch eine Mae III-RFLP Analyse. Dargestellt ist in dieser Figur ein Standard- Agarosegel: Spur 1, enzymatisch amplifizierter Nukleinsäureanteil nach einer Mae ///-Behandlung; Spur 2: gereinigtes Ligationsprodukt des enzymatisch amplifizierten Nukleinsäureanteils nach einer Mae III-Behandlung; Spur 3: gereinigtes Produkt der Plasmid-DNA-Ligation nach einer Mae III-Behandlung; Spur 4, Molekulargewichtsstandard (ΦX 174 RF DNA behandelt mit der Restriktions¬ endonuklease Hae III). Fig. 16: Transkription und Replikation des Peptid-Nukleinsäureplasmids. Dargestellt ist in dieser Figur ein Standard- Agarosegel: Spur 1, Molekular¬ gewichtsstandard (λ DNA behandelt mit den Restriktionsendonukleasen Hind III und Eco RI); Spur 2, unbehandeltes Peptid-Nukleinsäureplasmid; Spur 3: in vitro erhaltene Transkriptionsprodukte des Peptid-Nukleinsäureplasmids, Spur 4: in vitro erhaltene Replikations- und Transkriptionsprodukte des Peptid-Nukleinsäureplasmids; Spur 5, in vivo erhaltene Replikations- und Transkriptionsprodukte des Peptid-Nukleinsäureplasmids; Spur 6, unbe- handeltes Peptid-Nukleinsäureplasmid.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert, die die Erfindung jedoch in keinster Weise beschneiden sollen.
Beispiel 1:
Einführung eines chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragmentes in die Mitochondrien
Um den Nachweis erbringen zu können, daß Nukleinsäuren durch das oben beschriebene Verfahren zielgerichtet durch Membranen transportiert werden können, wurde die Überwindung des mitochondrialen Doppelmembransystems mit einem DNA-Translokationsvektor studiert. Dazu wurde die mitochondriale Signalsequenz der Ornithintranscarbamylase (A.L. Horwich et al. (1983), "Molecular cloning of the cDNA coding for rat ornithine transcarbamoylase", Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 80: 4258-4262) (Enzym des Harnstoffzyklus, natürlicherweise in der Matrix der Mitochondrien lokalisiert) chemisch hergestellt und gereinigt. Als reaktive Gruppe zur späteren Verbindung mit der DNA wurde die Originalsequenz um ein Cystein am C-Terminus erweitert (siehe Figur 1). Damit wurde gewährleistet, daß die Kopplung des heterobifunktionellen Crosslinkers (MBS) nur an die Thiol-Gruppe des einzigen Cysteins erfolgen kann. Als Verknüpfungspartner wurde ein DNA-Oligonukleotid (39 Nukleotide) ausgewählt, das sich durch zwei besondere Merkmale auszeichnet:
1. Die Sequenz ist partiell palindromisch mit einem überhängenden, phosphorylierten 5 '-Ende (siehe Figur 1). Dadurch kann sich ein sogenannter 'hairpin-loop' ausbilden. Das überhängende 5 '-Ende dient dazu, definierte Nukleinsäuren an dieses Oligonukleotid zu ligieren, die dann in die Mitochondrien importiert werden können.
2. Das Oligonukleotid trägt im Scheitelpunkt des 'Loops' eine modifizierte Base (siehe Figur 1). Es handelt sich dabei um ein aminomodifiziertes 2'-Deoxythymidin (siehe Figur 2). Die Aminofunktion der modifizierten Base ermöglicht dabei die Kopplungsreaktion zwischen MBS und Oligonukleotid.
Die Verknüpfung der drei Reaktionspartner (Oligonukleotid, MBS und Peptid) erfolgt in einzelnen Reaktionsschritten. Zuerst wird das Oligonukleotid (50 pmol) in einem Puffer (100 μl; 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.6) zusammen mit MBS (10 nmol gelöst in DMSO) umgesetzt (Reaktionszeit: 60 min.; Reaktionstemperatur: 20°C). Nicht umgesetztes MBS wird über eine 'Nick-Spin-ColumnR' (Sephadex G 50, Pharmacia), die mit 50 mM Kaliumphosphat (pH 6.0) equilibriert wurde, abgetrennt. Das Eluat enthält das gewünschte Reaktionsprodukt und wird in einem weiteren Reaktionsschritt mit dem Peptid (2.5 nmol) umgesetzt (Reaktionszeit: 60 min.; Reaktionstemperatur: 20°C). Abgestoppt wurde die Reaktion durch die Zugabe von Dithiothreitol (2 mM). Das Kopplungsprodukt (Chimäre, siehe Figur 3) wurde über eine präparative Gelelektrophorese von nicht umgesetzten Edukten abgetrennt und durch eine Elektroelution aus dem Gel isoliert (siehe Figur 4). An das überhängende 5 '-Ende des Oligonukleotids lassen sich nun durch einfache Ligation unterschiedliche Nukleinsäuren ankoppeln.
Für das im Folgenden beschriebene Experiment wurde eine 283 bp lange doppelsträngige DNA (dsDNA) über eine enzymatische Reaktion (PCR) amplifiziert. Als Matrizen DNA diente dazu ein in pBluescriptR (Stratagene) Moniertes DNA-Fragment, das neben dem menschlichen mitochondrialen Promotor des leichten Stranges (PL, nt 902 - nt 369) das Gen für die mitochondriale transfer RNA Leucin (tRNALeu(UUR), nt 3204 - nt 4126) enthielt (siehe Figur 5). Als Amplifizierungsprimer dienten zwei Oligonukleotide, wobei Primer 1 über ein nichtkomplementäres 5 '-Ende verfügte (siehe Figur 5). Die Modifikation der dsDNA erfolgte durch die 3'-5'-Exonukleaseaktivität der T4-DNA-Polymerase (Inkubation in Gegenwart von 1 mM dGTP), die unter dem Fachmann bekannten Bedingungen überhängende 5 '-Enden erzeugen kann (C. Aslanidis et al. (1990), "Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR)", Nucleic. Acids. Res. 18: 6069-6074).
Zusammen mit dem bereits konjugierten Peptid-MBS-Oligonukleotid konnte die PCR-amplifizierte DNA unter Verwendung der T4-DNA-Ligase zusammengefügt werden. Um die Verknüpfungspartner nach der Einbringung in die Mitochondrien einfach detektieren zu können, wurde die freie 5'-OH Gruppe der ligierten DNA durch eine enzymatische Reaktion radioaktiv phosphoryliert (A. Novogrodsky et al. (1966), "The enzymatic phosphorylation of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid. I. Phosphorylation at 5"-hydroxyl termini", J. Biol. Chem. 241.: 2923-2932; A. Novogrodsky et al. (1966), "The enzymatic phosphorylation of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid. π. Further properties of the 5'-hydroxyl polynucleotide kinase", J. Biol. Chem. 241 : 2933-2943). Für die Isolierung von Mitochondrien wurde eine frische Rattenleber zerkleinert, in 25 mM HEPES, 250 mM Saccharose, 2mM EDTA, 52 μM BSA suspendiert und in einem Glashomogenisator (50 ml) homogenisiert. Zellmembranen, Zelltrümmer und Zellkerne wurden bei 3000 g abzentrifugiert und der Überstand für eine weitere Zentriftigation vorbereitet. Dazu wurde der Überstand in gekühlte Zentrifugenbecher überführt und bei 8000 g zentrifugiert. Die isolierten Mitochondrien wurden in 200 ml desselben Puffers resuspendiert und erneut bei 8000 g zentrifugiert. Das saubere Mitochondrienpellet wurde in einem gleichen Volumen desselben Puffers resuspendiert und durch Zugabe von 25 mM Succinat, 25 mM Pyruvat und 15 mM Malat energetisiert. Der Proteingehalt der Suspension wurde über einen Bradford-Testkit* (Pierce) bestimmt. 200 μg mitochondriales Protein (energetisierte Mitochondrien) wurden zusammen mit 10 pmol des Chimären bei 37°C für 60 min. inkubiert (0.6 M Sorbitol, 10 mM Kaliumphophat pH 7.4, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 % BSA). Die Mitochondrien wurden durch eine Zentrifugation bei 8000 g reisoliert, in 0.6 M Sorbitol, 10 mM Kaliumphophat pH 7.4, 2 mM MgCl2, 1 % BSA, 10 U/ml DNAse I resuspendiert und 30 min. bei 37°C inkubiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt, um unspezifisch anhaftende Moleküle zu entfernen. Zum Nachweis, daß das Chimäre mit den Mitochondrien assoziiert ist, wurden die reisolierten Mitochondrien über eine Sucrosegradientendichtezentrifugation aufgereinigt. Zur Lokalisierung des Chimären und der Mitochondrien wurden die einzelnen Fraktionen des Gradienten analysiert. Als Marker der Mitochondrien wurde die Adenylat-Kinase, die Cytochrom-c Oxidase und die Malat-Dehydrogenase Aktivität bestimmt, während das Chimäre über die Messung der 32P-Strahlung identifiziert werden konnte (siehe Figur 6). Ein analoges Experiment zur Bestimmung des unspezifischen DNA-Einbaus wurde mit der gleichen DNA ausgeführt, die nicht mit dem Signalpeptid verbunden war (siehe Figur 6). Aus den Messungen wurde abgeleitet, daß 65 % des eingesetzten Chimären spezifisch mit den Mitochondrien segregierte, während der unspezifische DNA Einbau weniger als 5 % der eingesetzten DNA betrug. Um zu zeigen, daß das Chimäre nicht nur mit der Oberfläche der Mitochondrien (Membran, Import-Rezeptor) assoziiert ist, wurden die reisolierten Mitochondrien in die drei Kompartimente äußere Mitochondrierimembran/Intermembranraum, innere Mitochondrienmembran und Matrixraum fraktioniert. Dazu wurden die Mitochondrien mit Digitonin (Endkonzentration: 1.2 % w/v Digitonin) inkubiert und die entstandenen Mitoplasten über eine Sucrosegradientendichtezentriftigation aufgetrennt, in Fraktionen gesammelt und die Aktivitäten von Markerenzymen (Adenylat-Kinase: Intermembranraum; Cytochrom c Oxidase: innere Mitochondrienmembran; Malat-Dehydrogenase: Matrixraum) nach Schnaitmann und Greenawalt (C. Schnaitman et al. (1968), "Enzymatic properties of the inner and outer membranes of rat liver mitochondria", J. Cell Biol. 3_8: 158-175; C. Schnaitman et al. (1967), "The submitochondrial localization of monoamine oxidase. An enzymatic marker for the outer membrane of rat liver mitochondria", J. Cell Biol. 32: 719-735) bestimmt (siehe Figur 7). Ein analoges Experiment zur Bestimmung des unspezifischen DNA-Einbaus wurde mit der gleichen DNA ausgeführt, die nicht mit dem Signalpeptid verbunden war (siehe Figur 7). Aus den Messungen wurde abgeleitet, daß 45% des Chimären mit den Mitoplasten assoziiert ist, während die unspezifisch anhaftende DNA mit weniger als 3 % abgeschätzt werden konnte. Die isolierten Mitoplasten (Verlust der äußeren Membran und des Intermembranraums) wurden durch LubrolR (0.16 mg/mg Protein; ICN) lysiert und durch eine Ultrazentrifugation bei 144000 g in die Kompartimente innere Mitochondrienmembran (Pellet) und Matrixraum (Überstand) getrennt. Die Zuordnung der Kompartimente erfolgte über die Messung der Aktivitäten der Cytochrom-c Oxidase (innere Mitochondrienmembran) und der Malat-Dehydrogenase (Matrixraum). Die Messung des Chimären erfolgte über die Detektierung der 2P-Strahlung im Szintillationszähler und ergab zu 75 % eine Segregation mit der Matrix der Mitochondrien, während 25 % des Chimären mit der inneren Membran der Mitochondrien assoziiert blieb (unvollständige Translokation).
Beispiel 2: Einführung eines reυlikativen und transkriptionsaktiven chimären Peptid- Nukleinsäure-Fragmentes (Plasmid) in die Mitochondrien lebender Zellen
Um den Nachweis erbringen zu können, daß ein lineares Peptid-Nukleinsäure-Plasmid mit zyklisierten Enden ('hairpin-loops') Membranen in vivo über die Protein-Importroute überwinden und trotz der chemischen Kopplung mit einem Signalpeptid transkribiert und repliziert werden kann, wurde das Transkriptions- und Replikationsverhalten nach der Transfektion von Zellen und dem Import in die Matrix der Mitochondrien studiert. Dazu wurde das Signalpeptid der mitochondrialen Ornithintranscarbamylase synthetisch hergestellt, gereinigt und mit einem Nukleinsäure-Plasmid verknüpft.
Voraussetzung für die Überprüfung des korrekten Transkriptions- und Replikationsverhaltens ist die physikalische Struktur des Plasmids: für das im folgenden beschriebene Experiment wurde eine 3232 bp lange doppelsträngige Vektor-DNA (dsDNA) in pBluescript11 (Stratagene) kloniert. Dazu wurde der Bereich des mitochondrialen Genoms über zwei modifizierte Oligonukleotide amplifiziert (Primer 1, hybridisiert mit den Nukleotiden 15903-15924 der menschlichen mtDNA, beinhaltet am 5'-Ende eine Verlängerung um die Sequenz TGTAGctgcag zur Einfuhrung einer Pst I-Schnittstelle; Primer 2, hybridisiert mit den Nukleotiden 677-657 der menschlichen mtDNA, beinhaltet am 5'-Ende eine Verlängerung um die Sequenz TTGCATGctcgagGGTCTCAGGG zur Einführung einer Xho I-Schnittstelle), der den Promotor des leichten DNA-Stranges, den Ursprung der mtDNA-Replikation des schweren Stranges, die Regulationsmotive für die Transkription (CSB's, 'conserved sequence blocks1), sowie die Regulationsstelle für die DNA Replikation ('TAS', termination associated sequences, (D.C. Wallace (1989), "Report of the committee on human mitochondrial DNA", Cytogenet. Cell Genet. 5 .: 612-621) enthielt (siehe Figur 8). Hinter diesem Fragment (3 '-Richtung) wurde eine multiple Klonierungsstelle eingefügt, die ein einfaches Verknüpfen mit einem zu exprimierenden Gen erlauben soll. Die multiple Klonierungsstelle (MCS/TTS) wurde über eine chemische Synthese von zwei komplementären Oligonukleotiden erzeugt (MCS/TTS 1 und 2), die Erkennungssequenzen für verschiedene Restriktionsendonukleasen enthalten (siehe Figur 9). Unter dem Fachmann bekannten Bedingungen bilden die beiden Oligonukleotide Hybride, die nach Phosphorylierung mit T4 DNA Polynukleotidkinase für die Ligation eingesetzt werden können. Die Hybride zeichnen sich in diesem Zusammenhang durch 5'- und 3'-einzelstrangüberhängende Enden aus, die zum einen komplementär zu einer Pst I, zum anderen komplementär zu eine Bam HI Schnittstelle sind (siehe Figur 9). Zusammen mit der multiplen Klonierungsstelle beinhalten die synthetischen Oligonukleotide MCS/TTS 1 und 2 auch eine bidirektionale mitochondriale Transkriptions-Terminationssequenz (siehe Figur 9). Sie ist in 3'-Richtung zur MCS angeordnet und gewährleistet, daß die Transkription an dieser Stelle unterbrochen wird und damit korrekt terminierte Transkripte entstehen. Außerdem gewährleistet dieses Sequenzmotiv, daß im zyklischen Plasmidsystem keine 'Antisense-RNA' exprimiert wird. Die Ligationsreaktion zwischen pBluescript, PCR-amplifiziertem Fragment und der MCS/TTS-Hybride erfolgte in einer Stöchiometrie von 1:2:2 unter dem Fachmann bekannten Bedingungen. Nach der Transformation konnten mehrere E. coli Kolonien (Klone) isoliert und charakterisiert werden. Dazu wurden die entsprechenden Plasmid-DNA unter dem Fachmann bekannten Bedingungen einer Didesoxysequenzierung (Figur 10) unterworfen.
Für die experimentelle Überprüfung der Replikation und Transkription wurde in die multiple Klonierungsstelle ein sogenanntes Reportergen eingefügt. Als Reportergen wurde die chloramphenicolresistente menschliche mitochondriale 16 S ribosomale RNA ausgewählt, die sich von der natürlich auftretenden ribosomalen RNA nur durch ein modifiziertes Nukleotid unterscheidet (Polymorphismus). Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion wurde aus einem DNA-Extrakt chloramphenicolresistenter HeLa-Zellen ein Fragment mit zwei modifizierten Oligonukleotiden (Primer 3, hybridisert mit den Nukleotiden 1562-1581 der mitochondrialen DNA, am 5'-Ende um die Sequenz CCTCTaagctt zur Einführung einer Hind πi-Schnittstelle verlängert; Primer 4, hybridisiert mit den Nukleotiden 3359-3340, am 5'-Ende um die Sequenz GCATTactagt zur Einführung einer Bei I-Schnittstelle verlängert) unter dem Fachmann bekannten Bedingungen amplifiziert. Um eine korrekte Prozessierung des späteren Transkriptes zu gewährleisten, umfasste das Amplifizierungsprodukt die beiden flankierenden tRNA-Gene (tRNAVaI und tRNALeu). Die amplifizierte DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen Hind III und Bei I behandelt, durch eine Fällung gereinigt und mit dem mit Hind III und Bei I behandelten pBluescript-Plasmid 1 (siehe Figur 8, 9, und 10) in einer Stöchiometrie von 1 :1 in einer Ligationsreaktion unter dem Fachmann bekannten Bedingungen eingesetzt. Die Klonierungsstrategie ist in Figur 11 dargestellt.
Mehrere E. coli Kolonien (Klone) konnten isoliert und charakterisiert werden. Dazu wurde die entsprechende Plasmid-DNA unter dem Fachmann bekannten Bedingungen einer Didesoxysequenzierung unterworfen (siehe Figur 12). Um die Monierte DNA für die Anwendung an Zellkulturen und Mitochondrien vorzubereiten, wurde das Klonierungsinsert (mitochondriales Transformationsplasmid) durch die Verwendung der Restriktionsendonuklease Bsa I von dem pBluescript-Vektor unter dem Fachmann bekannten Bedingungen abgetrennt. Alternativ konnte die Insert-DNA über zwei Oligonukleotide (Primer 2 und 5; Nukleotidsequenz von Primer 5: GATCCGGTCTCATTTTATGCG) durch die Polymerase Kettenreaktion amplifiziert werden. Bei der Verwendung von S-dNTPs erlaubte das die Herstellung von 'thionierter' DNA, die gegenüber zellulären Nukleasen stabilisiert ist. In beiden Fällen führt die anschließende Verwendung der Restriktionsendonuklease Bsa I zu zwei unterschiedlichen 5'-Überhänge. Diese sind zu den verwendeten Ηairpin-loops' komplementär, um eine Zyklisierung der linearen Nukleinsäure zu erreichen (siehe Figur 13a und b). Die Oligonukleotide werden über eine chemische Synthese hergestellt. Dadurch besitzen sie keine phosphorylierten 5'-Enden und müssen durch eine Kinase-Reaktion unter dem Fachmann bekannten Bedingungen phosphoryliert werden (um später die zelluläre Transformation überprüfen zu können, wurde zum Teil bei dieser Reaktion [γ-32P]-ATP als Substrat verwendet, um das Plasmid radioaktiv zu markieren). Die 'haiφin-loop'-Struktur der Oligonukleotide bildet sich zu einem großen Anteil spontan aus, da die palindromische Sequenz in der Lage ist mit sich selbst zu hybridisieren. Dimere der 'hairpin-loops' können aber auch in Monomere überführt werden, indem sie in einem möglichst großen Volumen (<0.1 μM) mindestens 5 min. bei 93 °C denaturiert und sofort durch Einfrierern in einer festen Matrix fixiert werden. Anschließend werden die Oligonukleotide langsam bei 4°C aufgetaut und liegen dann zu 99 % in der gewünschten monomeren 'haiφin-loop'-Struktur vor (siehe Figur 14). Die Zyklisierung der Plasmid-DNA erfolgte zusammen mit den beiden monomerisierten 'haiφin-loops' (HP 1 und 2) in einem Reaktionsansatz. Das molare Verhältnis von Plasmid-DNA zu den beiden 'haiφin-loops' lag dabei bei 1 :100:100 (Plasmid:HPl:HP2). Unter Verwendung der T4-DNA-Ligase konnten die einzelnen Reaktionspartner unter dem Fachmann bekannten Bedingungen zusammengefügt werden (siehe Figur 15). Die Reinigung der Ligationsprodukte erfolgte durch eine Behandlung mit Exonuklease HI (Reaktionsbedingungen: 37°C, 60 min.). Während Nukleinsäuren mit freien 3'-Enden durch die Nuklease abgebaut werden, bleibt die mit den beiden 'haiφin-loops' verbundene Plasmid DNA gegenüber der 3 '-5 '-Exonuklease Aktivität des Enzyms stabil. Das einzige Reaktionsprodukt (siehe Figur 15a) wurde über eine präparative Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und durch eine Elektroelution oder unter Verwendung von QIAquick (Qiagen) nach Empfehlung des Herstellers gereinigt.
Die Übeφrüfung des Ligationsproduktes erfolgte über eine RFLP-Analyse (Restriktionsfragment-Längenpolymoφhismus). Dazu wurde die ligierte und gereinigte Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuklease Mae III unter dem Fachmann bekannten Bedingungen behandelt. Die DNA verfügt über fünf Spaltstellen, so daß Fragmente unterschiedlicher Größen entstehen, die über ein Agarosegel (4 %) analysiert werden können. Figur 15b zeigt exemplarisch das Mae III-Spaltmuster, daß nach der Ligation der Plasmid-DNA mit den beiden 'haiφin-loops1 erhalten wird. Die mit Pfeilspitzen markierten DNA-Banden representieren dabei das linke und das rechte Ende des amplifizierten (Spur 1) und des linear-zyklischen (Spur 2 und 3) mitochondrialen Plasmids.
Zur Konjugation des zirkularisierten Plasmids mit dem synthetischen Signalpeptid der Ratten-Ornithintranscarbamylase (H2N-MLSNLRILLNKAALRKAHTSMVRNFRYGK- PVQSQVQLKPRDLC-COOH) wurde die Nukleinsäure mit dem 20 fachen molaren Überschuß an m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimdester (Kopplungsagenz) für 60 min. bei 20°C (Inkubationsmedium: 50 mM Kaliumphosphat pH 7.8) inkubiert. Das überschüssige Kopplungsagenz wurde durch eine "Nick-Spin-Säule' (Pharmacia-LKB) unter dem Fachmann bekannten Bedingungen abgetrennt. Die Konjugation der 'aktivierten' Nukleinsäure erfolgte durch die Umsetzung der Nukleinsäure mit dem 50-fachen molaren Überschuß des Signalpeptids bei 20°C (Inkubationsmedium: 50 mM Kaliumphosphat pH 6.8). Nach 45 min. wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1 mM Dithiothreitol beendet und das Konjugat stand für die folgenden Experimente zur Verfügung.
Um die Verwendbarkeit des Peptid-Nukleinsäure-Plasmids in vivo zeigen zu können, mußte das Plasmid in eukaryotische Zellen eingeschleust werden. Dazu wurde eine chloramphenicolsensitive B-Lymphozyten- oder Fibroblastenzellkultur über eine Lipotransfektion mit dem Peptid-Nukleinsäure-Plasmid transfiziert: 1 μg des radioaktiv markierten Peptid-Nukleinsäure-Plasmids (die Markierung wurde als 32P-Markierung während der Kinase-Reaktion des 'haiφin-loops' (HPl) eingeführt) wurde zusammen mit 2-6 μl LipofectAmineR (Gibco-BRL) in 200 μl serumfreiem OptimemR (Gibco-BRL) vorinkubiert (15 min., 20°C). Während der Inkubation bildet das polykationische Lipid des LipofectAmineR Reagenz DOSPA (2,3-Dioleyloxy-N-[2-(sperminecarboxamido)-ethyl]- N,N-dimethyl-l-propanaminiumtrifluoroacetat) mit der Unterstützung des neutralen Lipids DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) unilamellare Liposomen aus, die die DNA zu komplexierern vermögen. Anschließend wurde der Reaktionsansatz zu den vorbereiteten Zellen gegeben, die auf eine Dichte von ca. 2.5* 106 Zellen pro 0.8 ml eingestellt worden waren (35 mm Kulturschalen, 4 h, 37°C, CO2 Inkubator). Das Transfektionsmedium wurde anschließend durch 5 ml DMEM Medium (Gibco-BRL) ersetzt, das zuvor mit 10 % fötalem Kälberserum und 100 μg/ml Chloramphenicol supplementiert wurde. Die Transformationseffizienz wurde durch Messung der 32P-Strahlung des Konstrukts bestimmt. In der Regel wurde eine zelluläre Einbaurate von 80-85 % gemessen. Dies bedeutet, daß 80-85 % des chimären Konstruktes mit den transformierten Zellen assoziiert waren und 15-20 % des chimären Peptid-DNA-Plasmids im Überstand der Transfektionsreaktion verblieben.
Nach ca. 21-28 Tagen bildeten sich in den transformierten Zellen chloramphenicolresistente Kolonien aus. Unter dem Fachmann bekannten Bedingungen wurden die resistenten Zellen vereinzelt und vermehrt. Aus ca. 1*105 Zellen konnte unter dem Fachmann bekannten Bedingungen ausreichend DNA gewonnen werden, um eine Genotypisierung vorzunehmen. Dazu wurde die isolierte DNA über eine Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen (Southern-blot). Die Nukleinsäuren wurden über eine Hybridisierung mit einer spezifischen, radioaktiv markierten Sonde detektiert (siehe Figur 16). Neben dem eingeführten zirkularisierten 'linearen' Vektor (Spur 2 und 6) sind in dieser Abbildung eine 'in vitro' Transkription (Spur 3), eine 'in vitro' Replikation (Spur 4), sowie die 'in vivo' erhaltenen Intermediate (isolierte Nukleinsäuren eines transformierten Klons) dargstellt. Während die drei kleineren Banden in vitro durch die Inkubation des zirkularisierten Vektors mit den vier Nukleosidtriphosphaten (RNA) und eines mitochondrialen Enzymextraktes erzeugt werden können (Spur 3), beobachtet man bei der zusätzlichen Zugabe der Desoxynukleosidtriphosphate zum Reaktionsansatz die Entstehung eines Dimeren, zirkulären Plasmids (größte Bande in Spur 4): ein identisches Bild ergibt sich bei der Analyse der Nukleinsäuren, die aus transformierten Zellkolonien gewonnen werden können (Spur 5). Daß es sich bei der größten DNA-Bande in Spur 4 und 5 tatsächlich um das dimere und daher replizierte mitochondriale Plasmid handelt, konnte durch eine Sequenzanalyse bestätigt werden.
Als Kontrollexperiment diente ein Lipotransfektionsansatz, bei dem das unkonjugierte, nicht mit dem Signalpeptid verbundene, Plasmid eingesetzt wurde. Wie erwartet, wurde dieses Plasmid nicht in die Mitochondrien der transfizierten Zellen aufgenommen und führte demzufolge nicht zur Ausbildung chloramphenicolresistenter Zellen. Diese Zellen stellten das Wachstum nach 10 Tagen ein und starben innerhalb der darauffolgenden 8 bis 10 Tage vollständig ab.

Claims

Patentansprüche
1) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment umfaßend:
(a) Zell-, kompartiment- oder membranspezifisches Signalpeptid ausgenommen eine KDEL-Signalsequenz, (b) Kopplungsagenz,
(c) Nukleinsäure (Oligonukleotid), wobei die Kopplung des Signalpeptids über das Kopplungsagenz erfolgt, das über Aminosäuren am Carboxy-terminalen Ende des Signalpeptides mit diesem verbunden ist, wodurch die zielgerichtete Nukleinsäureeinbringung in Zellorganellen und Zellen gewährleistet wird.
2) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure aus mindestens zwei Basen besteht.
3) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure über eine hybridisierungsfähige Sekundärstruktur verfügt.
4) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure über eine palindromische Sequenz verfügt.
5) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure einen 'haiφin-loop' ausbilden kann.
6) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure mit sich selbst hybridisieren und ein überhängendes 3 '- oder 5 '-Ende ('sticky end') ausbilden kann. 7) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Nukleinsäure um eine Ribonukleinsäure, bevorzugt um eine Desoxyribonukleinsäure handelt.
8) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure chemisch modifizierte 'Phosphorthioat' Bindungen besitzt.
9) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine reaktive Kopplungsgruppe trägt.
10) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Kopplungsgruppe eine Aminofunktion enthält, wenn das Kopplungsagenz eine aminoreaktive Gruppierung enthält.
11) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Kopplungsgruppe eine Thiolfunktion enthält, wenn das Kopplungsagenz eine thiolreaktive Gruppierung enthält.
12) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsgruppierung mindestens über einen
C2-Spacer, bevorzugt aber einen C6-Spacer an die Nukleinsäure gebunden vorliegt.
13) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsgruppierung am 3 '-Hydroxy/Phosphat-Terminus oder am 5 '-Hydroxy/Phosphat-Terminus der Nukleinsäure, bevorzugt aber an der Base lokalisiert ist.
14) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 10-13, dadurch gekennzeichnet, daß an das 5 '-Ende und/oder 3 '-Ende definierte Nukleinsäuren, Antisense-Olignukleotide, messenger RNAs oder transkribierbare und/oder replizierbare Gene angekoppelt werden. 15) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die anzukoppelnde Nukleinsäure chemisch modifizierte 'Phosphorthioat' Bindungen enthält.
16) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das anzukoppelnde Gen einen Promotor, bevorzugt einen mitochondrialen Promotor, enthält.
17) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalpeptid über eine reaktive Aminosäure am Carboxy-terminalen Ende, bevorzugt ein Lysin oder Cystein verfügt, wenn das Kopplungsagenz eine amino- oder thiolreaktive Gruppierung enthält.
18) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalpeptid ein zell- , kompartiment- oder membranspezifisches Erkennungssignal trägt.
19) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalpeptid eine zell-, kompartiment- oder membranspezifische Peptidasespaltstelle besitzt.
20) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid aus dem kompartimentspezifisch spaltbaren Signalpeptid der menschlichen mitochondrialen Ornithintranscarbamylase, verlängert um ein künstliches Cystein am C-Terminus, besteht.
21) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1 -20, dadurch gekennzeichnet, daß das Kopplungsagenz ein bifunktioneller, bevorzugt ein heterobifunktioneller Crosslinker ist. 22) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-21 , dadurch gekennzeichnet, daß das Kopplungsagenz thiolreaktive und/oder aminoreaktive Gruppierungen enthält, wenn das Signalpeptid und die Nukleinsäure Thiol- und/oder Aminogruppen als Kopplungsstellen tragen.
23) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-22, dadurch gekennzeichnet, daß das Kopplungsagenz m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxy- succinimidester oder ein Derivat desselben ist.
24) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 1-23, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül unter Ausnutzung natürlicher Transportmechanismen Membranen mit und ohne Membranpotential überwinden kann.
25) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment in Form eines linear zyklischen Plasmids, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid mindestens einen Replikationsursprung umfaßt und daß beide Enden des Nukleinsäureanteils zyklisiert sind, wobei mindestens ein zyklisiertes Ende über ein modifiziertes Nukleotid verfügt, das über ein Kopplungsagenz an ein zell-, kompartiment- oder membranspezifisches Signalpeptid gekoppelt werden kann.
26) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Nukleinsäureanteil weiter mindestens einen Promotor umfaßt, bevorzugt einen mitochondrialen Promotor, ganz bevorzugt den mitochondrialen Promotor des leichten Stranges.
27) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Neukleinsäureanteil weiter Transkriptions- Regulationssequenzen umfaßt, bevorzugt mitochondriale Transkriptions- Regulationssequenzen. 28) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-27, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptions-Regulationssequenzen über mindestens eine Bindungsstelle eines Transkriptionsinitiationsfaktors verfügen.
29) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-28, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptions-Regulationssequenzen über mindestens eine
Bindungsstelle für den RNA-Syntheseapparat verfügen, bevorzugt über die Bindungsstelle für den mitochondrialen Transkriptionsfaktor 1 und die mitochondriale RNA-Polymerase.
30) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-29, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptions-Regulationssequenzen in 3 '-Richtung zum
Promotor angeordnet sind.
31) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-30, dadurch gekennzeichnet, daß die Regulation der Transkription durch Elemente der mitochondrialen H- und L-Strang Transkriptionskontrolle übernommen wird.
32) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß als Transkriptionskontrollelemente die sogenannten 'conserved-sequence-blocks' der L-Strang Transkription fungieren.
33) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-32, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid weiter mindestens eine Transkriptions-
Terminationsstelle umfaßt.
34) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-33, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptions-Terminationsstelle über eine Bindungs¬ sequenz eines mitochondrialen Transkriptions-Terminationsfaktors verfügt. 35) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptions-Terminationsstelle über die Bindungs¬ sequenz eines bevorzugt bidirektional-wirkenden Transkriptions-Terminations- faktors verfügt.
36) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-35, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Replikationsursprung um einen mitochondrialen Replikationsursprung handelt, bevorzugt um den Replikationsursprung des schweren mtDNA-Stranges handelt, der über mindestens einen 'conserved sequence block' verfügt.
37) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-36, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid weiter mindestens eine Regulationssequenz für die Replikation umfaßt.
38) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-37, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Regulationssequenz für die Replikation um ein mitochondriales Sequenzmotiv handelt.
39) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-38, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid weiter ein Selektionsgen umfaßt, bevorzugt ein Antibiotikaresistenzgen, bevorzugt das Oligomycin- oder Chloramphenicol- resistenzgen.
40) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-39, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid weiter eine multiple Klonierungsstelle enthält, die die Expression von 'Fremdgenen' zuläßt. 41) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-40, dadurch gekennzeichnet, daß die multiple Klonierungsstelle Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen beinhaltet, die bevorzugt nicht an einer anderen Stelle des Plasmids vorkommen.
42) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-41 , dadurch gekennzeichnet, daß die multiple Klonierungsstelle in 3 '-Richtung zum Promotor und in 5'-Richtung zur Transkriptions-Terminationsstelle angeordnet ist.
43) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-42, dadurch gekennzeichnet, daß die multiple Klonierungsstelle in 5 '-Richtung zum Selektionsgen angeordnet ist.
44) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-43, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure-Fragment über ligationsfahige (phosphorylierte) Enden verfügt.
45) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-44, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure-Fragment über 'blunt-ends' oder
3 '-überhängende Enden, bevorzugt 5 '-überhängende Enden verfügt.
46) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-45, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure-Fragment über 4 Nukleotide umfassende 5'-Überhänge verfügt, die keine Selbsthomologie (palindromische Sequenz) aufweisen und auch zueinander nicht komplementär sind.
47) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-46, dadurch gekennzeichnet, daß die Enden des Nukleinsäure-Fragments über synthetische Oligonukleotide zyklisiert werden. 48) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-47, dadurch gekennzeichnet, daß die überhängenden 5'-Enden der beiden Oligonukleotide jeweils zu einem unterschiedlichen Ende der Nukleinsäure komplementär sind.
49) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-48, dadurch gekennzeichnet, daß zwei unterschiedliche 'haiφin-loops' für die Zyklisierung eingesetzt werden, wobei einer spezifisch (komplementär) für das 'linke'-Plasmidende, der andere spezifisch für das 'rechte'-Plasmidende der Nukleinsäure ist.
50) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-49, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte Nukleotid bevorzugt innerhalb des 'loops' lokalisiert ist.
51) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach einem der Ansprüche 25-50, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmid-DNA mit geeigneten Oligonukleotiden enzymatisch amplifiziert wird, die über mindestens eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease verfügen, die bevorzugt nicht wiederholt in der
Plasmidsequenz auftritt.
52) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 51 , dadurch gekennzeichnet, daß die zu verwendende Restriktionsendonuklease überhängende Enden generiert, bevorzugt 5 '-überhängende Enden, wobei die Spaltstelle bevorzugt außerhalb der Erkennungssequenz lokalisiert ist.
53) Chimäres Peptid-Nukleinsäure-Fragment nach Anspruch 51 oder 52, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Restriktionsendonuklease um Bsa I handelt. 54) Verfahren zur Herstellung eines chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragments nach einem der Ansprüche 1-53, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Umsetzung einer Nukleinsäure (Oligonukleotid), enthaltend eine funktioneile Kopplungsgruppe, mit einem Kopplungsagenz. (b) Umsetzung des Konstruktes aus (a) mit Aminosäuren am
Carboxy-terminalen Ende eines Peptids, enthaltend eine Signalsequenz, ausgenommen eine KDEL-Signalsequenz, und (c) wahlweise Verlängerung des chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragments aus (b) um weitere DNA- oder RNA-Fragmente.
55) Verfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA in Schritt (c) um ein PCR amplifiziertes DNA-Fragment, enthaltend den menschlichen mitochondrialen Promotor des leichten Stranges (PL), sowie das Gen für die mitochondriale transfer RNA Leucin (tRNALeu(UUR)), handelt.
56) Verfahren zur Herstellung eines chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragments nach einem der Ansprüche 1-53, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
(a) Wahlweise Verlängerung der Nukleinsäure, enthaltend eine funktionelle Kopplungsgruppe, um weitere DNA- oder RNA-Fragmente.
(b) Umsetzung der Nukleinsäure mit funktioneller Kopplungsgruppe oder der verlängerten Nukleinsäure aus (a) mit einem Kopplungsagenz. (c) Umsetzung des Konstruktes aus (b) mit Aminosäuren am
Carboxy-terminalen Ende eines Peptids, enthaltend eine Signalsequenz, ausgenommen eine KDEL-Signalsequenz.
57) Verfahren nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA in Schritt (a) um ein PCR amplifiziertes DNA-Fragment, enthaltend den menschlichen mitochondrialen Promotor des leichten Stranges (PL), sowie das Gen für die mitochondriale transfer RNA Leucin (tRNALeu^^), handelt. 58) Verwendung der chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragmente nach einem der
Ansprüche 1-53 zur zielgerichteten Nukleinsäureeinbringung in Zellorganellen und Zellen, gekennzeichnet durch die Umsetzung des Fragmentes mit Zellen oder vorbehandelten Zellkompartimenten.
59) Verwendung nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet daß es sich bei den vorbehandelten Zellkompartimenten um energetisierte Mitochondrien handelt.
60) Verwendung des chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragments nach einem der Ansprüche 1-59 zur Einbringung in eukaryotische Zellen.
61 ) Verwendung des chimären Peptid-Nukleinsäure-Fragments nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß das 'Particle Gun' System, Elektroporation,
Mikroinjektion oder Lipotransfektion zur Einbringung in eukaryotische Zellen angewendet wird.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041150A2 (en) * 1996-04-27 1997-11-06 The University Of Newcastle Upon Tyne Gene therapy for mitochondrial dna deffects using peptide nucleic acids
WO2003092736A2 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 Pantheco A/S Peptide nucleic acid conjugates with transporter peptides
WO2003097671A1 (en) * 2002-03-29 2003-11-27 Creagene Inc. Cytoplasmic transduction peptides and uses thereof

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19605279A1 (de) * 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Zielzellspezifische Vektoren für die Einschleusung von Genen in Zellen, Arzneimittel enthaltend derartige Vektoren und deren Verwendung
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
WO2003006477A1 (en) * 2001-07-12 2003-01-23 University Of Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
US8283444B2 (en) 2003-10-24 2012-10-09 Wake Forest University Non-viral delivery of compounds to mitochondria
US20060046247A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-02 Rapp Jeffrey C Protecting avians from pathogens
WO2006026238A2 (en) * 2004-08-25 2006-03-09 Avigenics, Inc. Rna interference in avians
DE102004043155A1 (de) * 2004-09-03 2006-03-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Hochspezifisch mit DNA interagierende Enzym-Konjugate mit programmierbarer Spezifität
JP5080103B2 (ja) * 2007-02-27 2012-11-21 株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモ ヌクレオチド修飾微小管の合成方法および保存方法
US11491231B2 (en) * 2017-03-31 2022-11-08 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Peptide-oligonucleotide chimeras (POCs) as programmable biomolecular constructs for the assembly of morphologically-tunable soft materials
US11608519B2 (en) 2018-07-30 2023-03-21 Tokitae Llc Specific detection of deoxyribonucleic acid sequences using novel CRISPR enzyme-mediated detection strategies

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991014696A1 (en) * 1990-03-29 1991-10-03 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5569754A (en) * 1993-06-11 1996-10-29 Board Of Regents, University Of Tx Systems RNA import elements for transport into mitochondria
US5807746A (en) 1994-06-13 1998-09-15 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991014696A1 (en) * 1990-03-29 1991-10-03 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMISTRY, Bd. 87, 1990 Seiten 3410-14, E.WAGNER ET AL. 'Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells' *
J.CELL.BIOL., Bd. 113, Nr. 5, 1991 Seiten 1025-32, H.STENMARK ET AL. 'Peptides fused to the Amino-Terminal End of Diphteria Toxin are Translocated to the Cytosol' *
PROC.NATL.ACAD.SCI., Bd. 81, 1984 Seiten 7412-16, M.TAKIGUCHI ET AL. 'Molecular cloning and nucleotide sequence of cDNA for rat ornithine carbanoyltransferase precursor' *
TETRAHEDRON LETTERS, Bd. 34, Nr. 50, 1993 Seiten 8087-90, K.ARAR ET AL. 'Synthesis of Oligonucleotide-Peptide Conjugates Containing a KDEL Signal Sequence' *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041150A2 (en) * 1996-04-27 1997-11-06 The University Of Newcastle Upon Tyne Gene therapy for mitochondrial dna deffects using peptide nucleic acids
WO1997041150A3 (en) * 1996-04-27 1997-12-04 Univ Newcastle Gene therapy for mitochondrial dna deffects using peptide nucleic acids
WO2003097671A1 (en) * 2002-03-29 2003-11-27 Creagene Inc. Cytoplasmic transduction peptides and uses thereof
US7101844B2 (en) 2002-03-29 2006-09-05 Creagene, Inc. Cytoplasmic transduction peptides and uses thereof
WO2003092736A2 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 Pantheco A/S Peptide nucleic acid conjugates with transporter peptides
WO2003092736A3 (en) * 2002-05-01 2004-06-24 Pantheco As Peptide nucleic acid conjugates with transporter peptides

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DE19520815C2 (de) 1996-07-25
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US20010008771A1 (en) 2001-07-19
DE19520815A1 (de) 1995-12-21
US6921816B2 (en) 2005-07-26
WO1995034665A3 (de) 1996-02-22
AU2667995A (en) 1996-01-05

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