CN109136247B

CN109136247B - 一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法

Info

Publication number: CN109136247B
Application number: CN201810900752.1A
Authority: CN
Inventors: 贾晓强; 赵婷婷
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: CN109136247A

Abstract

本发明提供一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子P_pbr表达调控。由双向筛选系统表达验证和表达优化结果得铅离子与铅结合蛋白结合筛选条件为铅离子50μM、氨苄青霉素100μg/mL；锌离子与铅结合蛋白结合减弱的优化压力筛选条件为锌离子50μM、蔗糖10％，与锌离子结合较强的细胞因蔗糖敏感抑制生长。优化条件为铅结合蛋白定向进化的压力筛选条件，用于减弱非目标金属离子锌离子的干扰，实现铅结合蛋白的特异性定向进化；为该类金属调控蛋白的特异性优化提供了新的筛选工具。

Description

一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法

技术领域

本发明涉及一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，为提高金属调控蛋白的特异性结合提供帮助。

背景技术

铅结合蛋白源于耐金属贪铜菌Cupriavidus metallidurans CH34质粒pMOL30的铅抗性操纵子pbr，该操纵子可同时实现铅离子摄取、转出和富集，形成了该菌株针对铅离子的主要防线。铅结合蛋白PbrR操纵着P_pbr启动子下游结构基因pbrABCD的铅离子依赖的诱导转录，对于铅离子的调控起到了关键作用。铅结合蛋白PbrR表达后形成同源二聚体与操纵子DNA结合，当铅离子存在时其改变蛋白质与DNA复合物的构象导致DNA解开螺旋呈现打开结构，启动下游基因的表达。随着铅结合蛋白PbrR研究的发展，基于其构建的金属特异性生物传感器对于重金属铅离子监测领域具有重要的现实的应用价值。铅结合蛋白PbrR属于MerR家族，但研究表明MerR家族负责锌、镉和铅吸收和泵出的蛋白往往同时转运三种金属离子。因此铅结合蛋白PbrR作为金属响应元件虽然可以选择性识别铅离子，对于非目标金属离子锌离子等也具有一定的结合能力，局限了该金属调控蛋白对于金属离子特异性检测的应用潜力。

近些年一些巧妙的双向筛选系统设计应用于转录调控蛋白的压力选择定向进化，调整改造蛋白的化合物结合特异性，产生能分别被各种不同小分子化合物所诱导的调控蛋白且已经取得明显成效。Collins等人应用catA-bli-bla组成的筛选系统进行定向进化彻底改变了群体感应转录激活剂LuxR的响应特异性，野生型LuxR响应3OC6HSL激活下游基因表达，筛选得到的变体LuxR-G2E-R67M不再响应3OC6HSL，而是结合直链酰基HSL激活基因表达，该筛选系统为识别目标LuxR变体提供了一种有效可行的筛选方法。同时随着反向筛选标记的研究发展，由正反向筛选标记组成的双向筛选系统可作为一种优化的筛选系统应用于该类转录调控蛋白的定向筛选进化中。在特定的筛选条件下，含有反向筛选标记表达的细胞会死亡，而不含或难以表达该基因的细胞能够存活下来，可用于双向筛选标记的反向筛选，避免了选择合适抗性基因用于反向筛选的问题。因此，正反向筛选标记构成的双向筛选系统可考虑应用于铅结合蛋白PbrR特异性增强的定向改造中，进一步提高天然金属调控蛋白的应用价值。

本发明涉及的用于铅结合蛋白PbrR定向进化的双向筛选系统构建方法中，利用抗性基因作为正向筛选标记、研究较早较深入的果聚糖蔗糖酶基因作为反向筛选标记用于构建双向筛选系统，正向筛选标记表达氨苄青霉素抗性使其在抗性条件下存活，反向筛选标记表达可使得细胞对蔗糖敏感从而抑制生长。经过表达验证和条件优化，本方法可优化获得合适的筛选条件，它可作为条件压力选择应用于铅结合蛋白PbrR的特异性增强定向进化中。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的金属调控蛋白铅结合蛋白的特异性优化方法，即构建双向筛选系统并优化筛选条件，应用于模拟自然选择压力下的铅结合蛋白的定向进化。

本发明的技术方案如下：

一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，其受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子P_pbr的表达调控。

用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，包括如下步骤：

(1)利用大肠杆菌E.coli DH5α作为宿主，构建以铅结合蛋白基因pbrR和启动子P_pbr的SEQ ID No.1的核苷酸序列、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列、果聚糖蔗糖酶基因sacB核苷酸序列为SEQ ID No.3的顺序排列的筛选质粒底盘细胞；

(2)金属铅离子条件下的双向筛选系统表达验证，同浓度铅锌离子条件下的双向筛选系统条件优化以优选合适的筛选条件。

所述步骤(1)的筛选质粒底盘细胞构建包括扩增带有同源区域的基因片段、Gibson Assembly连接片段、转化验证筛选质粒。

所述步骤(2)中的金属离子条件下的双向筛选系统表达验证和条件优化，依据目标金属离子铅离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，直接水解氨苄青霉素表达氨苄青霉素抗性，铅结合蛋白与铅离子结合的细胞正常存活；干扰金属离子锌离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，添加蔗糖细胞敏感抑制生长，锌离子与铅结合蛋白结合减弱的细胞通过压力选择进化存活。其中包括铅离子正向筛选标记的表达验证、铅离子反向筛选标记的表达验证、铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化、铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化。

具体说明如下：

步骤(1)的筛选质粒底盘细胞构建，包括扩增基因片段、Gibson Assembly连接片段、转化验证筛选质粒，具体操作如下：

①扩增基因片段：设计带有同源片段约20bp的引物，具体引物设计如表1所示，利用高保真聚合酶分别扩增基因片段基础的载体骨架基因片段(引物H1F和H1R)、铅结合蛋白基因pbrR和启动子P_pbr的SEQ ID No.1的核苷酸序列(引物H2F和H2R)、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列(引物H3F和H3R)和果聚糖蔗糖酶基因sacB的核苷酸序列SEQ ID No.3(引物H4F和H4R)，然后切胶回收各基因片段；

表1设计的引物序列

②Gibson Assembly连接片段：依据Gibson Assembly原理连接含有同源区域的基因片段构建成环状质粒；

③转化验证筛选质粒：利用热激法将连接体系转化至宿主细胞大肠杆菌E.coliDH5α，菌落PCR验证阳性克隆，得到正确的筛选质粒底盘细胞。

步骤(2)的金属离子条件下的双向筛选系统表达验证和条件优化，包括铅离子正向筛选标记的表达验证、铅离子反向筛选标记的表达验证、铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化、铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化，具体方法如下：

①铅离子正向筛选标记的表达验证：铅离子结合铅结合蛋白可表达氨苄青霉素抗性，细胞存活。以1％比例转接OD₆₀₀约为0.6的菌液至添加铅离子和氨苄青霉素的LB液体培养基，铅离子终浓度设置为0、1、5、10、20、50μM的浓度梯度，氨苄青霉素溶液终浓度为100μg/mL，37℃、220rpm条件培养测定筛选质粒底盘细胞生长曲线。

②铅离子反向筛选标记的表达验证：铅离子结合铅结合蛋白可表达下游的反向筛选标记，蔗糖添加使细胞敏感而抑制生长。以1％比例转接OD₆₀₀约为0.6的菌液至添加铅离子和蔗糖的LB液体培养基，铅离子终浓度设置为0、5、20、50μM的浓度梯度，蔗糖比例10％，30℃、220rpm条件培养测定筛选质粒底盘细胞生长曲线。

③铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化：以1％比例转接OD₆₀₀约为0.6的菌液至添加氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基，铅离子、锌离子浓度都分别设置为20μM和50μM并分别添加进行37℃、220rpm条件下的摇瓶培养。

④铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化：以1％比例转接OD₆₀₀约为0.6的菌液至添加蔗糖10％的LB液体培养基，铅离子、锌离子浓度都分别设置为20μM和50μM并分别添加进行30℃、220rpm条件下的摇瓶培养。

合适的优化筛选条件确定：铅结合蛋白与铅离子结合的优化压力条件为铅离子50μM、氨苄青霉素100μg/mL，与铅离子结合的细胞可存活；铅结合蛋白与锌离子结合减弱的优化压力条件为锌离子50μM、蔗糖10％，与锌离子结合的细胞生长受到抑制，而结合减弱的细胞可通过不断的压力选择培养而累积存活。

本发明提出了一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，将双向筛选系统与铅结合蛋白结合构建了筛选质粒底盘细胞，双向筛选系统的表达验证及条件优化确定了可行且有效的优化筛选条件，可应用于减弱锌离子干扰的铅结合蛋白的特异性压力定向进化，同时为铅结合蛋白所属家族的金属调控蛋白的特异性优化提供了新的筛选工具和设计思路。

附图说明

图1：含有双向筛选系统的筛选质粒图谱；

图2：用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统的工作原理图，根据反应原理铅离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，直接水解氨苄青霉素表达氨苄青霉素抗性，铅离子与铅结合蛋白结合，细胞正常存活；干扰金属离子锌离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，添加蔗糖细胞敏感抑制生长，而锌离子与铅结合蛋白结合有所减弱的细胞能够通过压力筛选在蔗糖环境存活；

图3：铅离子浓度梯度下正向筛选标记的表达验证生长曲线；

图4：铅离子浓度梯度下反向筛选标记的表达验证生长曲线；

图5：同浓度铅锌离子浓度下正向筛选标记的表达优化生长曲线；

图6：同浓度铅锌离子浓度下反向筛选标记的表达优化生长曲线。

具体实施方式

基于天然菌株耐金属贪铜菌Cupriavidus metallidurans CH34天然质粒pMOL30中操纵子pbr上的基因结构，铅结合蛋白基因和双向筛选系统标记基因分别位于启动子P_pbr的上下游，以大肠杆菌E.coli DH5α作为宿主细胞构建了筛选质粒底盘细胞，经由双向筛选系统表达优选出适宜压力筛选条件，可用于实现铅结合蛋白特异性增强的压力选择定向进化。

底盘细胞为E.coli DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。

本发明构建筛选质粒所用载体骨架片段源于pZE21质粒，人工全合成的铅结合蛋白基因pbrR和启动子P_pbr源于公司合成质粒pUC57-G7-kan，正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp源于pZE12质粒，反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB源自pK18mobsacB质粒。

LB液体培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

卡那霉素储存液：称量0.1g硫酸卡那霉素至10mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，经0.22μm水系滤膜过滤除菌后分装至2mL离心管，贮存于-20℃冰箱备用，储存液浓度为10mg/mL，待LB液体培养基温度降低至50℃后添加。

氨苄青霉素储存液：称量1g硫酸卡那霉素至10mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，经0.22μm水系滤膜过滤除菌后分装至2mL离心管，贮存于-20℃冰箱备用，储存液浓度为100mg/mL，待LB液体培养基温度降低至50℃后添加。

蔗糖10％的LB液体培养基：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，蔗糖100g，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

硝酸铅溶液：称量0.1656g硝酸铅，1％硝酸溶液溶解定容至100mL，配制浓度为5mmol/L。

硝酸锌溶液：称量0.1487g六水合硝酸锌，1％硝酸溶液溶解定容至100mL，配制浓度为5mmol/L。

下面根据本发明的方法，结合具体的实施例对本发明做进一步说明：

实施例1含有双向筛选系统的筛选质粒底盘细胞构建

人工全合成的铅结合蛋白基因pbrR和启动子P_pbr，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；氨苄青霉素抗性基因amp，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；果聚糖蔗糖酶基因sacB，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。将SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列以及载体骨架基因片段通过Gibson Assembly方式连接，筛选阳性克隆得到筛选质粒，其质粒图谱如图1所示。用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统的筛选机制如图2所示。

利用高保真DNA聚合酶配置反应体系，通过聚合酶链式反应分别扩增基因片段：载体骨架基因片段(引物H1F和H1R)、铅结合蛋白基因pbrR和启动子P_pbr的SEQ ID No.1的核苷酸序列(引物H2F和H2R)、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列(引物H3F和H3R)和果聚糖蔗糖酶基因sacB的核苷酸序列SEQ ID No.3(引物H4F和H4R)。PCR反应体系使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，1％琼脂糖凝胶电泳分别切下四个目标条带；分别放入干净离心管后等体积加入PN溶液，50℃水浴溶解；溶解后的溶液转移至吸附柱中静置吸附1min，12000rpm离心1min后倒掉废液；向吸附柱中加入漂洗液600μL，静置2min，12000rpm离心1min后倒掉废液；再次12000rpm离心2min去除残余漂洗液，吸室温放置晾干；转移吸附柱至新离心管中，滴加双蒸水30μL至吸附膜中央50℃洗脱5min，12000rpm离心2min收集各基因片段。

将回收后的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列以及载体骨架基因片段通过Gibson Assembly方式连接，可直接连接四个基因片段形成环状质粒。回收后的片段与含有三种酶的Master Mix混合孵育，三种酶分别为核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶，核酸外切酶在DNA片段5’端降解产生长粘性末端，同源序列退火结合，DNA聚合酶负责进一步修补gap，最后DNA连接酶实现无痕拼接，形成完整的双链DNA分子。连接反应体系为：10μL

HiFi DNA Assembly Master Mix，6μL ddH₂O，四个回收后的基因片段各1μL。反应条件为50℃连接15min。

连接体系转化感受态细胞E.coli DH5α，通过引物H2F和H4R进行菌落PCR筛选阳性克隆并测序验证，得到正确的含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的筛选质粒底盘细胞。

实施例2金属铅离子条件下的双向筛选系统的表达验证

含有双向筛选系统的筛选质粒底盘细胞接入卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中37℃、220rpm培养过夜，再转接至50mL LB液体培养基中直至细胞生长到OD₆₀₀约为0.6。

(1)铅离子正向筛选标记的表达验证：将OD₆₀₀约为0.6的菌液以1％比例转接至50mL的添加了硝酸铅溶液和氨苄青霉素溶液的LB液体培养基，铅离子终浓度设置为0、1、5、10、20、50μM的浓度梯度，氨苄青霉素溶液终浓度为100μg/mL，每个样品设置三个平行。37℃、220rpm条件下进行摇瓶培养，每隔3h用紫外可见光分光光度计测定波长600nm下的吸光度OD₆₀₀，记录生长曲线，如图3所示。

(2)铅离子反向筛选标记的表达验证：将OD₆₀₀约为0.6的菌液以1％比例转接至50mL的添加了硝酸铅溶液和蔗糖的LB液体培养基，铅离子终浓度设置为0、5、20、50μM的浓度梯度，蔗糖比例为10％。每个样品设置三个平行，30℃、220rpm条件下进行摇瓶培养，每隔3h用紫外可见光分光光度计测定波长600nm下的吸光度OD₆₀₀，测定生长曲线，见图4。

根据反应原理：铅结合蛋白PbrR表达后形成二聚体与操纵子DNA结合，而当铅离子存在时与铅离子结合使得蛋白与DNA复合物的构象改变，DNA解开螺旋呈现打开结构，启动下游基因的表达，即添加铅离子启动了双向筛选系统的表达，正向筛选标记直接表达氨苄青霉素抗性，反向筛选标记表达使得细胞对蔗糖敏感而抑制生长。

根据铅离子正向筛选标记的表达验证生长曲线(图3)，添加氨苄青霉素浓度100μg/mL，筛选质粒底盘细胞在0μM铅离子下细胞不生长，添加铅离子并随着浓度升高开始生长时间缩短，1μM铅离子条件下开始生长时间为24h，铅离子浓度为20、50μM培养开始生长时间缩短至12h，后续细胞生长依次进入对数期、稳定期。铅离子的添加使得正向筛选标记基因得以表达催化水解氨苄青霉素，细胞存活，浓度升高则基因表达量增加，细胞开始生长提前并加快。根据铅离子反向筛选标记的表达验证生长曲线(图4)，添加蔗糖比例10％，随着铅离子的添加和浓度升高细胞表达反向筛选标记而蔗糖敏感导致抑制生长，尤其铅离子浓度为50μM时细胞从开始生长便表现出明显的生长抑制。双向筛选标记的表达验证结果与反应原理预测结果保持一致，双向筛选系统符合铅结合蛋白定向进化的设计。

实施例3金属铅锌离子条件下的双向筛选系统的表达优化

含有双向筛选系统的筛选质粒底盘细胞接入卡那霉素抗性的LB培养基中37℃、220rpm培养过夜，再转接至50mL LB液体培养基中直至细胞生长到OD₆₀₀约为0.6。

(1)铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化：将OD₆₀₀约为0.6的菌液以1％比例转接至50mL的添加氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基，分别添加硝酸铅溶液和硝酸锌溶液至终浓度分别为20μM、50μM，每个样品设置三个平行。37℃、220rpm条件下进行摇瓶培养，每隔3h用紫外可见光分光光度计测定波长600nm下的吸光度OD₆₀₀，绘制生长曲线，如图5所示。

(2)铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化：将OD₆₀₀约为0.6的菌液以1％比例转接至50mL的添加蔗糖10％的LB液体培养基，分别添加硝酸铅溶液和硝酸锌溶液至终浓度分别为20μM、50μM，每个样品设置三个平行，30℃、220rpm条件下进行摇瓶培养，每隔3h用紫外可见光分光光度计测定波长600nm下的吸光度OD₆₀₀，绘制生长曲线，见图6。

进一步的双向筛选标记表达优化结果(图5和图6)表明培养基内添加100μg/mL氨苄青霉素后，同浓度下的铅离子、锌离子培养细胞均可以生长，当浓度为50μM时开始生长时间提前且铅锌离子的生长差异减小，天然的铅结合蛋白PbrR也可一定程度的结合锌离子，结合能力略低于铅离子；添加10％蔗糖培养，浓度50μM的铅离子、锌离子条件都在起始便表现出明显的生长抑制。

综合双向筛选系统的表达验证优化结果确定了最优的筛选条件：铅结合蛋白与铅离子结合的压力筛选条件为铅离子50μM、氨苄青霉素100μg/mL；铅结合蛋白与锌离子结合减弱的压力筛选条件为锌离子50μM、蔗糖10％。利用最优筛选条件进行筛选质粒底盘细胞的铅锌离子条件下的反复传代培养，在不断压力选择条件下锌离子对于铅结合蛋白的干扰不断减弱，最终实现铅结合蛋白的特异性定向进化。

序列表

SEQ ID NO.01

TCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCCTAGTCGCTTGGATGGGCGGTGGTCCCCCGCGTATCACACACGCAGTCCGACAGTCCCTGCAGAATCCCGCACGATTGGGCGGGCCTGGCACCAGAACAGGCTTCGCGCAGTTCCACCAAATGGTGCTTCAGTTCGAGCAAAGCTCCGATCCGAGATTCGACCTGACGGATGTGCTCATCCAAGAGCATATTGACTTCACCGCAATCCTGGTCGGGCCGCTTCCGGTAACTCAATAAGGTCCGTACGTCGCTCAACGGCATATCCAGAGACCGGCAGTGACGAATGAACTGCAAGCGCTCCACGTGCTCCTCGCCATACAGGCGAAAATTCCCCCGGCTGCGGCCCGGCGGCGGCAACAGCCCTTCTTGTTCGTAGAAGCGAATGGTCACCACCGGGCATGCGGTGCGCTTGGCAAGCTCGCCGATCTGGATATTCATGGCGTCGGATGGGAGATGTCTTGACTCTATAGTAACTAGAGGGTGTTAAATCGGCAACGCGAGATGAATACACACAAGGGGTTGCC

SEQ ID NO.02

ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAA

SEQ ID NO.03

CCGAAAGAGGAGAAATTAATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGCGCAACTCAAGCGTTTGCGAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGAAACATACGGCATTTCCCATATTACACGCCATGATATGCTGCAAATCCCTGAACAGCAAAAAAATGAAAAATATCAAGTTTCTGAATTTGATTCGTCCACAATTAAAAATATCTCTTCTGCAAAAGGCCTGGACGTTTGGGACAGCTGGCCATTACAAAACGCTGACGGCACTGTCGCAAACTATCACGGCTACCACATCGTCTTTGCATTAGCCGGAGATCCTAAAAATGCGGATGACACATCGATTTACATGTTCTATCAAAAAGTCGGCGAAACTTCTATTGACAGCTGGAAAAACGCTGGCCGCGTCTTTAAAGACAGCGACAAATTCGATGCAAATGATTCTATCCTAAAAGACCAAACACAAGAATGGTCAGGTTCAGCCACATTTACATCTGACGGAAAAATCCGTTTATTCTACACTGATTTCTCCGGTAAACATTACGGCAAACAAACACTGACAACTGCACAAGTTAACGTATCAGCATCAGACAGCTCTTTGAACATCAACGGTGTAGAGGATTATAAATCAATCTTTGACGGTGACGGAAAAACGTATCAAAATGTACAGCAGTTCATCGATGAAGGCAACTACAGCTCAGGCGACAACCATACGCTGAGAGATCCTCACTACGTAGAAGATAAAGGCCACAAATACTTAGTATTTGAAGCAAACACTGGAACTGAAGATGGCTACCAAGGCGAAGAATCTTTATTTAACAAAGCATACTATGGCAAAAGCACATCATTCTTCCGTCAAGAAAGTCAAAAACTTCTGCAAAGCGATAAAAAACGCACGGCTGAGTTAGCAAACGGCGCTCTCGGTATGATTGAGCTAAACGATGATTACACACTGAAAAAAGTGATGAAACCGCTGATTGCATCTAACACAGTAACAGATGAAATTGAACGCGCGAACGTCTTTAAAATGAACGGCAAATGGTACCTGTTCACTGACTCCCGCGGATCAAAAATGACGATTGACGGCATTACGTCTAACGATATTTACATGCTTGGTTATGTTTCTAATTCTTTAACTGGCCCATACAAGCCGCTGAACAAAACTGGCCTTGTGTTAAAAATGGATCTTGATCCTAACGATGTAACCTTTACTTACTCACACTTCGCTGTACCTCAAGCGAAAGGAAACAATGTCGTGATTACAAGCTATATGACAAACAGAGGATTCTACGCAGACAAACAATCAACGTTTGCGCCGAGCTTCCTGCTGAACATCAAAGGCAAGAAAACATCTGTTGTCAAAGACAGCATCCTTGAACAAGGACAATTAACAGTTAACAAATAA

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 629

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctagggcgg cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac 60

gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg atgccctagt cgcttggatg 120

ggcggtggtc ccccgcgtat cacacacgca gtccgacagt ccctgcagaa tcccgcacga 180

ttgggcgggc ctggcaccag aacaggcttc gcgcagttcc accaaatggt gcttcagttc 240

gagcaaagct ccgatccgag attcgacctg acggatgtgc tcatccaaga gcatattgac 300

ttcaccgcaa tcctggtcgg gccgcttccg gtaactcaat aaggtccgta cgtcgctcaa 360

cggcatatcc agagaccggc agtgacgaat gaactgcaag cgctccacgt gctcctcgcc 420

atacaggcga aaattccccc ggctgcggcc cggcggcggc aacagccctt cttgttcgta 480

gaagcgaatg gtcaccaccg ggcatgcggt gcgcttggca agctcgccga tctggatatt 540

catggcgtcg gatgggagat gtcttgactc tatagtaact agagggtgtt aaatcggcaa 600

cgcgagatga atacacacaa ggggttgcc 629

<210> 2

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840

tcactgatta agcattggta a 861

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgaaagagg agaaattaat gaacatcaaa aagtttgcaa aacaagcaac agtattaacc 60

tttactaccg cactgctggc aggaggcgca actcaagcgt ttgcgaaaga aacgaaccaa 120

aagccatata aggaaacata cggcatttcc catattacac gccatgatat gctgcaaatc 180

cctgaacagc aaaaaaatga aaaatatcaa gtttctgaat ttgattcgtc cacaattaaa 240

aatatctctt ctgcaaaagg cctggacgtt tgggacagct ggccattaca aaacgctgac 300

ggcactgtcg caaactatca cggctaccac atcgtctttg cattagccgg agatcctaaa 360

aatgcggatg acacatcgat ttacatgttc tatcaaaaag tcggcgaaac ttctattgac 420

agctggaaaa acgctggccg cgtctttaaa gacagcgaca aattcgatgc aaatgattct 480

atcctaaaag accaaacaca agaatggtca ggttcagcca catttacatc tgacggaaaa 540

atccgtttat tctacactga tttctccggt aaacattacg gcaaacaaac actgacaact 600

gcacaagtta acgtatcagc atcagacagc tctttgaaca tcaacggtgt agaggattat 660

aaatcaatct ttgacggtga cggaaaaacg tatcaaaatg tacagcagtt catcgatgaa 720

ggcaactaca gctcaggcga caaccatacg ctgagagatc ctcactacgt agaagataaa 780

ggccacaaat acttagtatt tgaagcaaac actggaactg aagatggcta ccaaggcgaa 840

gaatctttat ttaacaaagc atactatggc aaaagcacat cattcttccg tcaagaaagt 900

caaaaacttc tgcaaagcga taaaaaacgc acggctgagt tagcaaacgg cgctctcggt 960

atgattgagc taaacgatga ttacacactg aaaaaagtga tgaaaccgct gattgcatct 1020

aacacagtaa cagatgaaat tgaacgcgcg aacgtcttta aaatgaacgg caaatggtac 1080

ctgttcactg actcccgcgg atcaaaaatg acgattgacg gcattacgtc taacgatatt 1140

tacatgcttg gttatgtttc taattcttta actggcccat acaagccgct gaacaaaact 1200

ggccttgtgt taaaaatgga tcttgatcct aacgatgtaa cctttactta ctcacacttc 1260

gctgtacctc aagcgaaagg aaacaatgtc gtgattacaa gctatatgac aaacagagga 1320

ttctacgcag acaaacaatc aacgtttgcg ccgagcttcc tgctgaacat caaaggcaag 1380

aaaacatctg ttgtcaaaga cagcatcctt gaacaaggac aattaacagt taacaaataa 1440

Claims

1.一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，其特征如下：

1)利用大肠杆菌E.coli DH5α作为宿主，构建以铅结合蛋白基因pbrR和启动子P_pbr的SEQ ID No.1的核苷酸序列、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列、果聚糖蔗糖酶基因sacB核苷酸序列为SEQ ID No.3的顺序排列的筛选质粒底盘细胞；

2)采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，其受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子P_pbr的表达调控；

3)双向筛选条件是铅结合蛋白与铅离子结合的优化压力条件为铅离子50μM、氨苄青霉素100μg/mL；铅结合蛋白与锌离子结合减弱的优化压力条件为锌离子50μM、蔗糖10％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是筛选质粒底盘细胞构建包括扩增带有同源区域的基因片段、Gibson Assembly连接片段、转化验证筛选质粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是双向筛选系统表达验证和条件优化依据目标金属离子铅离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，直接水解氨苄青霉素表达氨苄青霉素抗性，铅结合蛋白与铅离子结合的细胞正常存活；干扰金属离子锌离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，添加蔗糖细胞敏感抑制生长，锌离子与铅结合蛋白结合减弱的细胞通过压力筛选进化存活。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是包括铅离子正向筛选标记的表达验证、铅离子反向筛选标记的表达验证、铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化、铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化。