CN117230094A - 一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法 - Google Patents
一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117230094A CN117230094A CN202210641074.8A CN202210641074A CN117230094A CN 117230094 A CN117230094 A CN 117230094A CN 202210641074 A CN202210641074 A CN 202210641074A CN 117230094 A CN117230094 A CN 117230094A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cas12a
- sequence
- spytag
- vector
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 238000010170 biological method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 claims description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 16
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract description 12
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 abstract description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000002819 bacterial display Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法。本发明通过表达冰晶核蛋白(INP)‑SpyCatcher和SpyTag‑Cas12a融合蛋白，利用SpyCatcher和SpyTag的蛋白自组装特性，实现基于INP的Cas12a表面展示。BL21/Cas12a可以与crRNA组成正常的CRISPR‑Cas12a系统，并进行靶核酸序列的识别及单链DNA的反式切割。本发明只需细菌常规培养、诱导和离心便可进行Cas12a的相关应用，因此，本发明为CRISPR相关蛋白的生产提供了一种便捷易用、绿色经济的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，同时涉及合成生物学技术领域。具体涉及开发一种表面展示 Cas12a的方法，旨在研制一种便捷易用、绿色经济的CRISPR工程化平台。
背景技术
基于CRISPR系统的分子诊断因其高特异性和灵敏度而备受关注，所使用的Cas蛋白通常需要细菌表达、纯化后才可使用。目前，Cas蛋白纯化主要依赖于镍亲和层析，存在纯化步骤繁琐、缓冲液配方复杂等问题。同时，Cas蛋白对温度较为敏感，易高温失活，作为分子诊断试剂存在冷链运输和保存不便等问题。Cas蛋白的绿色经济生产对基于CRISPR系统的分子诊断发展具有重要意义。
细菌展示技术可将外源蛋白/多肽展示于细菌表面，已经广泛应用于疫苗、蛋白/多肽文库及其筛选、单链抗体表达、全细胞吸附和生物催化等领域。细菌表面展示技术可以使酶促反应在细菌表面直接发生，可以很好地避免宿主细胞内酶对外源蛋白的影响。但目前没有Cas 蛋白的表面展示研究。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，为工程化CRISPR 平台提供绿色经济的生产方法。
一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，包括如下步骤：
1)构建pET-T7-SpyTag-Cas12a载体
设计长度为4089bp的SpyTag-Cas12a CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；采用全基因合成法合成上述序列并将其克隆至pET28b质粒的Nco I和Blp I酶切位点之间，构建得到pET-T7-SpyTag-Cas12a载体；
2)pET-T7-INP-SpyCatcher-T7-SpyTag-Cas12a载体的构建
设计长度为1966bp的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；采用全基因合成法合成上述SEQ ID NO.2序列，将上述SEQ ID NO.2序列插入SgrA I酶切的 pET-T7-SpyTag-Cas12a载体中；
3)转化与表达
取上述克隆产物转化到大肠杆菌中，并培养；
进行蛋白诱导表达，获得表面展示的Cas12a蛋白。
优选地，步骤3)所述的大肠杆菌菌株为E.coli BL21(DE3)。
本发明通过基因重组技术将SpyTag-Cas12a融合蛋白基因和INP(冰晶核蛋白)-SpyCatcher 细菌表面展示载体蛋白基因克隆至pET质粒中，构建了IPTG调控Cas12a表面表达的表达盒；将该表达盒转入宿主菌即可构建表面展示Cas12a蛋白的工程菌。当向工程菌悬液中添加 crRNA后，Cas12a具有正常的生理功能，可以识别靶核酸序列并激活反式切割活性。在该工程菌的基础上，进一步与自淬灭荧光探针联合使用，能通过荧光信号进行核酸检测。
本发明所述的基因表达盒包含SpyTag-Cas12a融合蛋白和INP-SpyCatcher融合蛋白，以 pET质粒载体为基础构建两个串联的表达盒。在该载体的构建中，融合蛋白表达盒通过无缝克隆的方式插入限制性内切酶处理后的pET载体中，两个融合蛋白表达后可在胞内通过 SpyCatcher/SpyTag进行自组装，然后实现基于INP的Cas12a蛋白表面展示。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明采用细菌表面展示技术，将CRISPR相关蛋白Cas12a展示于大肠杆菌表面，从而实现CRISPR相关蛋白快速制备的目的。
2、本发明所述的表面展示Cas12a的工程细菌制备方法无需复杂的纯化方法便可得到具有Cas12a蛋白功能的工程菌，绿色、经济、环保。
3、本发明所述的表面展示Cas12a工程细菌为大肠杆菌，只需常规的细菌培养和诱导即可等效于Cas12a蛋白进行应用，操作简单、便捷高效。
4、本发明所述的表面展示Cas12a工程细菌可对DNA进行可视化检测，具开发为新型检测平台的潜力。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1Cas12a蛋白表面展示的a)机理图和b)蛋白表达验证。
图2膜蛋白SDS-PAGE照片。
图3TEV酶切验证的a)示意图和b)SDS-PAGE图片。
图4Cas12a反式切割活性a)荧光照片和b)灰度量化。
图5排除蛋白泄漏干扰的a)荧光照片和b)灰度量化。
图6为实施例1的a)荧光照片与b)灰度值量化图。
图7为实施例2的a)荧光照片与b)灰度值量化图。
图8为实施例3的a)荧光照片与b)灰度值量化图。
具体实施方式
本发明的技术方案如下：
(1)pET-T7-SpyTag-Cas12a载体的构建
设计长度为4089bp的SpyTag-Cas12a CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；采用全基因合成法合成上述序列(金斯瑞生物科技股份有限公司)并将其克隆至pET28b质粒的Nco I和Blp I酶切位点之间，构建得到pET-T7-SpyTag-Cas12a载体；SpyTag-Cas12a融合蛋白的表达使用pET载体上固有的T7启动子、lac操纵子、RBS和T7终止子，蛋白表达可由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)调控。
(2)pET-T7-INP-SpyCatcher-T7-SpyTag-Cas12a载体的构建
设计长度为1966bp的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该序列包含T7启动子、lac操纵子、RBS、INP-SpyCatcher CDS序列和T7终止子；采用全基因合成法合成上述序列(金斯瑞生物科技股份有限公司)，使用无缝克隆试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)将上述序列插入pET-T7-SpyTag-Cas12a载体中的SgrA I(TaKaRa公司)酶切位点，操作按照说明书进行；INP-SpyCatcher融合蛋白的表达同样受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)调控。
(3)转化与表达
取上述无缝克隆产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含卡那霉素(75μg/ml，下同)的LB琼脂板，37℃过夜培养；挑取单克隆菌落于含卡那霉素的液体LB培养基中(卡那霉素终浓度75μg/ml，体积3mL)，37℃下200rpm/分钟培养4-6小时；取菌液经过测序验证序列的准确性。
挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃下200rpm/分钟培养至OD 值约为0.5-0.8之间时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行蛋白诱导表达，诱导条件为24℃、 200rpm/分钟、12小时；通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证蛋白表达情况(图1)；使用膜蛋白提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)对工程菌进行膜蛋白提取，并进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证INP-SpyCatcher/SpyTag-Cas12a融合蛋白表达于细菌膜上(图 2)；在INP-SpyCatcher基因序列设计时，在INP与SpyCatcher间插入了TEV酶切位点，利用TEV酶可将表面展示蛋白切割下来；使用TEV酶(上海碧云天生物技术有限公司)并按照说明书要求进行30℃2小时酶切，离心收获反应液上清进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色，验证Cas12a成功展示于细菌外膜(图3)。
(4)表面展示的Cas12a蛋白功能验证
挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃下200rpm/分钟培养至OD 值约为0.5-0.8之间时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行蛋白诱导表达，诱导条件为24℃、 200rpm/分钟、12小时；离心保留菌体，使用PBS缓冲溶液进行重悬洗涤，共三次；最终将菌体重悬于PBS缓冲溶液中，并向菌液中添加CRISPR系统的反应体系，具体组分与终浓度为：crRNA(60nM)、靶DNA(100nM)、镁离子(5mM)和自淬灭单链DNA探针(FQ-ssDNA， 50nM)；溶液混匀后37℃反应45-60分钟；表面展示Cas12a的工程菌其表面Cas12a蛋白具有正常生理功能，可在识别靶DNA后反式切割FQ-ssDNA探针(图4)；通过使用表达 Cas12a-His的工程细菌作为对照，表面展示Cas12a工程菌的反式切割信号并非来自于菌体中融合蛋白的泄漏(图5)，进一步验证了Cas12a蛋白成功展示于细菌外膜。
(5)核酸检测
将上述所得到的工程菌BL21/Cas12a使用上述方法进行培养、诱导和收获，重悬于PBS 缓冲液中，可直接作为Cas12a蛋白使用，并进行核酸检测；具体地，将菌液与上述CRISPR 反应体系混合，当体系中存在靶核酸时，FQ-ssDNA探针被切割，分离的荧光基团可被蓝光激发而产生绿色荧光，使用蓝光LED即可对检测结果进行观察。
实施例1
1)工程细菌的制备：复苏已经转化pET-T7-INP-SpyCatcher-T7-SpyTag-Cas12a载体的工程菌，挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃下200rpm/分钟培养至 OD值约为0.5-0.8之间时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行蛋白诱导表达，诱导条件为24℃、200rpm/分钟、12小时；离心保留菌体，使用PBS缓冲溶液进行重悬洗涤，共三次；最终将菌体重悬于PBS缓冲溶液中。
2)CRISPR反应体系的制备：按照终浓度反应要求配制5x Mix buffer：crRNA 1(300nM) (SEQ ID NO.3)、镁离子(25mM)和FQ-ssDNA探针(250nM)，使用时按5倍稀释使用即可。
3)核酸检测：取上述18μL菌液与5μL 5x Mix buffer混匀，加入2μL待测核酸(SEQID NO.3)，37℃反应45-60分钟即可使用蓝光LED进行结果观察，荧光照片与灰度值量化如图 6所示。
实施例2
1)工程细菌的制备：复苏已经转化pET-T7-INP-SpyCatcher-T7-SpyTag-Cas12a载体的工程菌，挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃下200rpm/分钟培养至OD值约为0.5-0.8之间时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行蛋白诱导表达，诱导条件为24℃、200rpm/分钟、12小时；离心保留菌体，使用PBS缓冲溶液进行重悬洗涤，共三次；最终将菌体重悬于PBS缓冲溶液中。
2)CRISPR反应体系的制备：按照终浓度反应要求配制5x Mix buffer：crRNA 2(300nM) (SEQ ID NO.4)、镁离子(25mM)和FQ-ssDNA探针(250nM)，使用时按5倍稀释使用即可。
3)核酸检测：取上述18μL菌液与5μL 5x Mix buffer混匀，加入2μL待测核酸(SEQID NO.4)，37℃反应45-60分钟即可使用蓝光LED进行结果观察，荧光照片与灰度值量化如图 7所示。
实施例3
1)工程细菌的制备：复苏已经转化pET-T7-INP-SpyCatcher-T7-SpyTag-Cas12a载体的工程菌，挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃下200rpm/分钟培养至 OD值约为0.5-0.8之间时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行蛋白诱导表达，诱导条件为24℃、200rpm/分钟、12小时；离心保留菌体，使用PBS缓冲溶液进行重悬洗涤，共三次；最终将菌体重悬于PBS缓冲溶液中。
2)CRISPR反应体系的制备：按照终浓度反应要求配制5x Mix buffer：crRNA 3(300nM) (SEQ ID NO.5)、镁离子(25mM)和FQ-ssDNA探针(250nM)，使用时按5倍稀释使用即可。
3)核酸检测：取上述18μL菌液与5μL 5x Mix buffer混匀，加入2μL待测核酸(SEQID NO.5)，37℃反应45-60分钟即可使用蓝光LED进行结果观察，荧光照片与灰度值量化如图 8所示。
序列
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
SEQ ID NO：3
crRNA:
SEQ ID NO：4
靶DNA(双链DNA)：
SEQ ID NO：5
crRNA:
SEQ ID NO：6
靶DNA(双链DNA)：
SEQ ID NO：7
crRNA:
SEQ ID NO：8
靶DNA(单链DNA)：
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4092
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctcaca tagtaatggt tgatgcatat aagccgacga aaggcaccag cgaaagcagc 60
ggctccggtt ccggtggttc gggctctggg ggaggtggca tgggcacaca gttcgagggc 120
tttaccaacc tgtatcaggt gagcaagaca ctgcggtttg agctgatccc acagggcaag 180
accctgaagc acatccagga gcagggcttc atcgaggagg acaaggcccg caatgatcac 240
tacaaggagc tgaagcccat catcgatcgg atctacaaga cctatgccga ccagtgcctg 300
cagctggtgc agctggattg ggagaacctg agcgccgcca tcgactccta tagaaaggag 360
aaaaccgagg agacaaggaa cgccctgatc gaggagcagg ccacatatcg caatgccatc 420
cacgactact tcatcggccg gacagacaac ctgaccgatg ccatcaataa gagacacgcc 480
gagatctaca agggcctgtt caaggccgag ctgtttaatg gcaaggtgct gaagcagctg 540
ggcaccgtga ccacaaccga gcacgagaac gccctgctgc ggagcttcga caagtttaca 600
acctacttct ccggctttta tagaaacagg aagaacgtgt tcagcgccga ggatatcagc 660
acagccatcc cacaccgcat cgtgcaggac aacttcccca agtttaagga gaattgtcac 720
atcttcacac gcctgatcac cgccgtgccc agcctgcggg agcactttga gaacgtgaag 780
aaggccatcg gcatcttcgt gagcacctcc atcgaggagg tgttttcctt ccctttttat 840
aaccagctgc tgacacagac ccagatcgac ctgtataacc agctgctggg aggaatctct 900
cgggaggcag gcaccgagaa gatcaagggc ctgaacgagg tgctggccct ggccatccag 960
aagaatgatg agacagccca catcatcgcc tccctgccac acagattcat ccccctgttt 1020
aagcagatcc tgtccgatag gaacaccctg tctttcatcc tggaggagtt taagagcgac 1080
gaggaagtga tccagtcctt ctgcaagtac aagacactgc tgagaaacga gaacgtgctg 1140
gagacagccg aggccctgtt taacgagctg aacagcatcg acctgacaca catcttcatc 1200
agccacaaga agctggagac aatcagcagc gccctgtgcg accactggga tacactgagg 1260
aatgccctgt atgagcggag aatctccgag ctgacaggca agatcaccaa gtctgccaag 1320
gagaaggtgc agcgcagcct gaagcacgag gatatcaacc tgcaggagat catctctgcc 1380
gcaggcaagg agctgagcga ggccttcaag cagaaaacca gcgagatcct gtcccacgca 1440
cacgccgccc tggatcagcc actgcctaca accctgaaga agcaggagga gaaggagatc 1500
ctgaagtctc agctggacag cctgctgggc ctgtaccacc tgctggactg gtttgccgtg 1560
gatgagtcca acgaggtgga ccccgagttc tctgcccggc tgaccggcat caagctggag 1620
atggagcctt ctctgagctt ctacaacaag gccagaaatt atgccaccaa gaagccctac 1680
tccgtggaga agttcaagct gaactttcag atgcctacac tggccagagg ctgggacgtg 1740
aatagagaga agaacaatgg cgccatcctg tttgtgaaga acggcctgta ctatctgggc 1800
atcatgccaa agcagaaggg caggtataag gccctgagct tcgagcccac agagaaaacc 1860
agcgagggct ttgataagat gtactatgac tacttccctg atgccgccaa gatgatccca 1920
aagtgcagca cccagctgaa ggccgtgaca gcccactttc agacccacac aacccccatc 1980
ctgctgtcca acaatttcat cgagcctctg gagatcacaa aggagatcta cgacctgaac 2040
aatcctgaga aggagccaaa gaagtttcag acagcctacg ccaagaaaac cggcgaccag 2100
aagggctaca gagaggccct gtgcaagtgg atcgacttca caagggattt tctgtccaag 2160
tataccaaga caacctctat cgatctgtct agcctgcggc catcctctca gtataaggac 2220
ctgggcgagt actatgccga gctgaatccc ctgctgtacc acatcagctt ccagagaatc 2280
gccgagaagg agatcatgga tgccgtggag acaggcaagc tgtacctgtt ccagatctat 2340
aacaaggact ttgccaaggg ccaccacggc aagcctaatc tgcacacact gtattggacc 2400
ggcctgtttt ctccagagaa cctggccaag acaagcatca agctgaatgg ccaggccgag 2460
ctgttctacc gccctaagtc caggatgaag aggatggcac accggctggg agagaagatg 2520
ctgaacaaga agctgaagga tcagaaaacc ccaatccccg acaccctgta ccaggagctg 2580
tacgactatg tgaatcacag actgtcccac gacctgtctg atgaggccag ggccctgctg 2640
cccaacgtga tcaccaagga ggtgtctcac gagatcatca aggataggcg ctttaccagc 2700
gacaagttct ttttccacgt gcctatcaca ctgaactatc aggccgccaa ttccccatct 2760
aagttcaacc agagggtgaa tgcctacctg aaggagcacc ccgagacacc tatcatcggc 2820
atcgatcggg gcgagagaaa cctgatctat atcacagtga tcgactccac cggcaagatc 2880
ctggagcagc ggagcctgaa caccatccag cagtttgatt accagaagaa gctggacaac 2940
agggagaagg agagggtggc agcaaggcag gcctggtctg tggtgggcac aatcaaggat 3000
ctgaagcagg gctatctgag ccaggtcatc cacgagatcg tggacctgat gatccactac 3060
caggccgtgg tggtgctgga gaacctgaat ttcggcttta agagcaagag gaccggcatc 3120
gccgagaagg ccgtgtacca gcagttcgag aagatgctga tcgataagct gaattgcctg 3180
gtgctgaagg actatccagc agagaaagtg ggaggcgtgc tgaacccata ccagctgaca 3240
gaccagttca cctcctttgc caagatgggc acccagtctg gcttcctgtt ttacgtgcct 3300
gccccatata catctaagat cgatcccctg accggcttcg tggacccctt cgtgtggaaa 3360
accatcaaga atcacgagag ccgcaagcac ttcctggagg gcttcgactt tctgcactac 3420
gacgtgaaaa ccggcgactt catcctgcac tttaagatga acagaaatct gtccttccag 3480
aggggcctgc ccggctttat gcctgcatgg gatatcgtgt tcgagaagaa cgagacacag 3540
tttgacgcca agggcacccc tttcatcgcc ggcaagagaa tcgtgccagt gatcgagaat 3600
cacagattca ccggcagata ccgggacctg tatcctgcca acgagctgat cgccctgctg 3660
gaggagaagg gcatcgtgtt cagggatggc tccaacatcc tgccaaagct gctggagaat 3720
gacgattctc acgccatcga cacgatggtg gccctgatcc gcagcgtgct gcagatgcgg 3780
aactccaatg ccgccacagg cgaggactat atcaacagcc ccgtgcgcga tctgaatggc 3840
gtgtgcttcg actcccggtt tcagaaccca gagtggccaa tggacgccga tgccaatggc 3900
gcctaccaca tcgccctgaa gggccagctg ctgctgaatc acctgaagga gagcaaggat 3960
ctgaagctgc agaacggcat ctccaatcag gactggctgg cctacatcca ggagctgcgc 4020
aacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggagcggcc 4080
gcactcgagt ga 4092
<210> 2
<211> 1966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60
tgtttaactt taagaaggag atatacatat gacattagat aaagctttgg tactaaggac 120
gtgcgcaaat aacatggcgg atcattgcgg tttgatctgg ccggcatcgg gcaccgttga 180
aagccgctac tggcagagca cccgtcgtca cgagaacggt ctggtgggcc ttttgtgggg 240
tgcgggcact tcagcgtttc tgtccgtgca cgcggacgcc cgctggatcg tttgtgaggt 300
tgcggtggct gacatcattt cccttgagga accgggtatg gttaagttcc cgcgtgcaga 360
agttgttcac gtgggcgacc gcatttccgc aagtcatttt atttccgcgc gtcaagcgga 420
cccggcgtct acgtctacga gcacgagcac gagcactctg actccgatgc cgaccgcgat 480
cccaaccccg atgcctgcgg ttgcgagcgt gaccctgccg gtcgccgagc aagcgcgtca 540
tgaggtattt gatgttgcga gcgtcagcgc tgcggctgct ccggtcaaca ccttgccggt 600
gacgacccca cagaatctgc aaaccgctac gtacggctcc accctcagtg gcgataatca 660
cagccgcctg attgcaggtt acggttctaa tgagactgcc ggaaaccact ccgacctgat 720
cggcggtcat gactgcacct taatggcggg cgaccagagc agactgactg cgggcaagaa 780
cagcgtcctg acggctggcg cccgtagcaa actgatcggt tctgaaggtt cgaccttgtc 840
agccggtgag gacagcacct tgatttttcg tctgtgggat ggcaagcgct accgccaact 900
ggttgcccgt accggtgaga acggtgttga ggcagacatc ccgtactatg ttaatgaaga 960
cgacgacatc gtggacaaac cggatgagga tgatgactgg atcgaggtga aggggacgtc 1020
gagcagcata gcaagcagct ctccgagcag tgtggcgggc tccatgagct attaccacca 1080
ccaccaccac catgattatg atattccgac gaccgaaaac ctgtacttcc agggtgctat 1140
ggttgatacc ctgtctggtt tgagctctga acaaggtcaa tccggagata tgaccattga 1200
agaggacagc gcgacccata ttaaattcag caaacgtgat gaggacggca aagaactggc 1260
tggcgccacc atggaactgc gtgatagctc gggtaagacc atcagcactt ggatcagcga 1320
tggtcaggtc aaagatttct atctgtaccc gggtaagtat accttcgtgg aaaccgcggc 1380
gccggacggt tatgaagtgg ccaccgcaat taccttcacc gtgaacgaac agggccaggt 1440
taccgttaac ggcaaggcaa ccaaaggtga cgcacatatc taatgttaat taagttgggc 1500
gttcctaggc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac 1560
cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat 1620
gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 1680
ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg 1740
agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata 1800
aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct 1860
acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctg agcaataact 1920
agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttg 1966
<210> 3
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gguaauuucu acucuuguag aucagacuug uucaacaggc ca 42
<210> 4
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240
cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540
cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840
tcactgatta agcattggta a 861
<210> 5
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gguaauuucu acucuuguag aucucaugga aaacggugua aca 43
<210> 6
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120
attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180
cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaatttc gtatggcaat gaaagacggt 240
gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300
acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360
tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420
aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480
gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540
gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 600
gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 660
<210> 7
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gguaauuucu acucuuguag auuugagccc aagcccuggu au 42
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cataccaggg cttgggctca a 21
Claims (9)
1.一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，包括如下步骤：
1)构建pET-T7-SpyTag-Cas12a载体
设计长度为4089bp的SpyTag-Cas12a CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；采用全基因合成法合成上述序列并将其克隆至pET28b质粒的Nco I和Blp I酶切位点之间，构建得到pET-T7-SpyTag-Cas12a载体；
2)pET-T7-INP-SpyCatcher-T7-SpyTag-Cas12a载体的构建
设计长度为1966bp的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；采用全基因合成法合成上述SEQ ID NO.2序列，将上述SEQ ID NO.2序列插入SgrA I酶切位点的pET-T7-SpyTag-Cas12a载体中；
3)转化与表达
取上述克隆产物转化到大肠杆菌中，并培养；
进行蛋白诱导表达，获得表面展示的Cas12a蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，其特征在于：步骤3)所述的大肠杆菌菌株为E.coli BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，其特征在于：步骤3)采用如下的方法验证是否转化成功：转化后的大肠杆菌，涂布在含卡那霉素的LB琼脂板，37℃过夜培养；挑取单克隆菌落于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃下200rpm/分钟培养4-6小时；取菌液经过测序验证序列的准确性。
4.根据权利要求1所述的一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，其特征在于：步骤3)中，诱导采用IPTG。
5.根据权利要求4所述的一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，其特征在于：步骤3)中，诱导所用的IPTG终浓度为0.05-0.2mM。
6.根据权利要求5所述的一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，其特征在于：诱导条件为20-25℃、150-250rpm/分钟、8-16小时。
7.根据权利要求1所述的一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，其特征在于：步骤3)中，通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色验证蛋白表达情况。
8.根据权利要求7所述的一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法，其特征在于：利用TEV酶将表面展示蛋白切割下来。
9.IPTG调控Cas12a表面表达的载体，所述载体的构建方法包括：
1)构建pET-T7-SpyTag-Cas12a载体
设计长度为4089bp的SpyTag-Cas12a CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；采用全基因合成法合成上述序列并将其克隆至pET28b质粒的Nco I和Blp I酶切位点之间，构建得到pET-T7-SpyTag-Cas12a载体；
2)pET-T7-INP-SpyCatcher-T7-SpyTag-Cas12a载体的构建
设计长度为1966bp的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；采用全基因合成法合成上述SEQ ID NO.2序列，将上述SEQ ID NO.2序列插入SgrA I酶切位点的pET-T7-SpyTag-Cas12a载体中，得到所述的IPTG调控Cas12a表面表达的载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210641074.8A CN117230094A (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210641074.8A CN117230094A (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117230094A true CN117230094A (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=89089877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210641074.8A Pending CN117230094A (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117230094A (zh) |
-
2022
- 2022-06-08 CN CN202210641074.8A patent/CN117230094A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20180033486A (ko) | Crispr 시스템을 이용한 다중 위치 염기서열의 동시 포획 방법 | |
| US6218151B1 (en) | Method for nucleic acid amplification by transcription using displacement, and reagents and kit therefor | |
| CN111748506B (zh) | 产胍基乙酸的工程菌及其构建方法与应用 | |
| Weigel et al. | Cloning and expression in Escherichia coli of isopenicillin N synthetase genes from Streptomyces lipmanii and Aspergillus nidulans | |
| CN107893048B (zh) | 一种产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用 | |
| CN112251464B (zh) | 一种基因点突变的诱导方法 | |
| CN111979259B (zh) | 用于基因表达的氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体 | |
| Srifeungfung et al. | Prevalence of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in HIV-seropositive patients and gonococcal antimicrobial susceptibility: an update in Thailand | |
| WO2021110993A1 (en) | An efficient shuttle vector system for the expression of heterologous and homologous proteins for the genus zymomonas | |
| CN111349646B (zh) | 一种表达耐高温普鲁兰酶的重组质粒及其构建方法和应用 | |
| CN111748546B (zh) | 一种产生基因点突变的融合蛋白及基因点突变的诱导方法 | |
| CN109136247B (zh) | 一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法 | |
| CN106754883B (zh) | 一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法及其试剂盒 | |
| CN117230094A (zh) | 一种制备Cas12a蛋白的合成生物学方法 | |
| US11788113B2 (en) | Fluorescence-based reporters for mutagenesis detection in E. coli | |
| Soffer | Enzymatic expression of genetic units of function concerned with galactose metabolism in Escherichia coli | |
| CN113845584A (zh) | 一种重组禽表皮生长因子的制备方法 | |
| WO2004024912A1 (ja) | トランスグルタミナーゼ生産菌 | |
| CN107988253A (zh) | 一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用 | |
| CN113481114B (zh) | 一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用 | |
| CN109517840B (zh) | 果蝇生殖系统中高效的转录激活系统 | |
| CN113950532A (zh) | 哺乳动物表达载体 | |
| CN114214354A (zh) | 一种双载体表达体系及其构建方法与应用 | |
| CA2045838A1 (en) | Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus | |
| CN115125265B (zh) | 一种产酶菌株及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |