CN106754883B - 一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接方法，DNA片段磷酸化、DNA片段桥接以及连接产物的指数型扩增这些步骤在一管中通过一个类似于PCR的热循环完成。该方法具有以下优点：（1）一步完成连接反应，避免了使用磷酸化引物造成的高昂成本；（2）优化了DNA浓度与桥接引物浓度，缓冲液组分与配比，达到高度可靠且重复性好的连接反应；（3）DNA片段无缝连接，不引入多余核苷酸；（4）非DNA序列依赖；（5）高效的多片段拼接能力；（6）在连接过程当中同时扩增连接产物，大幅增加产物浓度，保证高效率转化以及后续实验需求；（7）价格低廉，较常规的酶切连接方法成本低廉。

Description

一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法及其试 剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法及其试剂盒。

背景技术

DNA拼接技术是当今生物学研究当中最重要的技术方法之一，大部分的分子生物学与细胞生物学都基于这项技术。然而，自从Cohen等研究者在40年前重组了第一个DNA分子，主流的DNA操作方法仍然基于原始的酶切连接方法，传统基于酶切连接克隆方法拥有完善的操作体系，但是在最终拼接产生的DNA产物当中残留有6bp的核苷酸疤痕；同时，这种传统的方法无法满足当今复杂多样的应用要求。例如代谢工程中的多片段连接，合成生物学当中的DNA片段标准化与DNA片段重用，以及高效可靠地拼接不同大小的DNA片段。

基于上述普遍的需求，众多强大的DNA拼接技术不断产生。大体上来讲，这些技术方法可以被分为两大类，一大类是基于酶切连接，另一大类基于同源重叠。在传统的酶切连接基础上，BioBrick标准的建立使得DNA片段被定义为功能化的片段并且按照特定规则进行拼接。另一个例子是Golden Gate拼接方法，这个方法基于Type IIs限制性内切酶对识别序列之后相隔五个核苷酸的位置进行切割，这样6bp的疤痕最终就不会被包括在产物当中。这个方法也实现了多片段的一次性连接。然而这个基于限制性内切酶的方法仍然不可规避序列依赖性的问题，即只有在序列中存在限制性酶切位点的DNA分子才可以被此方法操作拼接。同时，该方法使用的Type IIs限制性内切酶的种类有限，如果在目标序列当中含有限制性酶切位点，则会大大增加构建工作的复杂程度。

由于上述限制性内切酶的有限性与序列依赖性，人们探索了使用同源重叠的方法进行构建。重叠延伸PCR或者CPEC的方法利用设计PCR末端的同源片段进行搭接，然后通过PCR反应完成扩增。近几年拼接最小人类全合成基因组的Gibson Assembly是同源重叠的另一个典型例子。Gibson Assembly利用DNA片段末端20～40bp的同源区域，首先通过5’核苷酸外切酶消化产生可互补的同源区域，退火后含有同源区域的片段搭接在一起，通过DNA聚合酶补齐被消化的同源区域，最后通过Taq连接酶补齐接口处的缺刻完成连接。保证GibsonAssembly特异性的根源在于所要拼接前后DNA分子片段末端与头端的20～40碱基对的核苷酸同源序列。此方法避免了限制性内切酶的使用因此是非序列依赖的，绝大多数的构建工作可通过此方法完成。然而，DNA片段的标准化与重用仍然未能实现，DNA尾端的序列修饰仍然存在。另外，多片段DNA连接仍然不够可靠，多于4片段组装时效率低下，转化子数量非常稀少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法。

本发明的第二个目的是提供一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法，将目标DNA片段、桥接引物、扩增引物、高保真DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶、热稳定性DNA连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，将所述反应体系进行热循环反应获得完整连接产物，当所述完整连接产物为线性DNA时，所述扩增引物分别为完整连接产物的首尾扩增引物；当所述完整连接产物为环状DNA时，所述扩增引物分别为连接产物其中某一接口处5’末端相邻的引物；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；

所述桥接引物的一段序列与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，桥接引物的剩余一段序列与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述多聚核苷酸激酶对目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶对含有缺刻的双链DNA的缺刻处进行连接；所述热循环包括以下条件：80～105℃，0～2min高温变性、30～80℃，0～2min退火、30～80℃，反应时间为完整连接产物的长度与高保真DNA聚合酶的反应速度的比值，循环数为1～60。

本发明建立了一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法(桥接法)，其基本原理如下：

1、首先通过高保真DNA聚合酶PCR获得所有所需要进行拼接的目标DNA片段，过柱纯化，测量每个目标DNA片段的浓度。

2、加入扩增后的每一个目标DNA片段、桥接引物、扩增引物、高保真DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和热稳定性DNA连接酶形成反应体系，用于组装的双链DNA片段与扩增引物首先被多聚核苷酸激酶将5’端磷酸化，同时去除3’端可能存在的磷酸基团。这个过程避免了使用昂贵的5’磷酸化引物，使得价格下降。

3、被磷酸化的双链DNA片段经过变性打开双链，之后温度降低至55度左右的退火温度，此时要被组装的单链DNA片段与相应的桥接引物退火，桥接引物将两个要被组装的单链DNA片段拉在一起(n个片段按照相同原理通过n个桥接引物根据序列特异性按照顺序拉在一起)。之后温度升高至68度反应温度，之前被桥接引物拉在一起的两个单链DNA片段此时中间只缺少一个磷酸二酯键。此温度下热稳定性DNA连接酶将寻找DNA缺刻并对此缺刻处催化形成磷酸二酯键。此过程中，热稳定性DNA连接酶不会对其他平末端DNA或者未磷酸化的DNA进行非特异性连接，热稳定性DNA连接酶只会对双链DNA缺刻(一条链完整，另一条链断裂并且断裂处含有5’端磷酸基团，3’端无磷酸基团)进行特异性连接；这确保了连接反应的特异性。

4、在下一个热循环过程当中，之前的连接产物将自身作为桥接引物引导互补链进行连接反应。由于此过程是指数型增长模型，因此在数次热循环之后，绝大多数的接口处都将被桥接引物引导而完成连接反应。

5、在连接反应完成之后，在相同的热循环过程当中，高保真DNA聚合酶以及扩增引物将大幅扩增产生高浓度的完整连接产物。这个过程中桥接引物不会参与其中是因为桥接引物浓度远远低于扩增引物浓度。两个数量级以上的浓度差别保证了扩增反应不会从最终连接产物的中途由桥接引物开始延伸。

6、最后，对于线性DNA连接产物而言即已经得到目标产物。对于环状DNA连接产物而言，扩增之后的高浓度连接产物将被相应接口处的桥接引物在热循环过程当中引导最终的连接产物完成连接反应成环，得到最终的高浓度环状DNA连接产物。高浓度的线性DNA连接产物可用于之后构建、基因敲除等工作，高浓度的环状DNA连接产物可直接用于转化，高浓度确保了高效率的转化反应。

需要说明的是，本发明上述基因拼接或者基因改造的方法中，也适用于本身含有5’端磷酸基团的目标DNA和本身含有5’端磷酸基团的桥接引物，此时去除反应体系中的多聚核苷酸激酶即可，该目标DNA片段为双链DNA片段或单链DNA片段。此DNA片段末端为平末端或粘性末端。该目标DNA片段产生方法为通过PCR扩增产生或通过对质粒、基因组等双链DNA进行酶切获得。

在不考虑成本的情况下，设计更长的桥接引物将保证更佳的连接效率，但通常桥接引物的总长度不超过100bp。

反应体系中的扩增引物为普通常规引物或5’末端磷酸化的引物。桥接引物为普通常规单链线性DNA或双链线性DNA。该单链线性DNA 3’末端为普通常规3’OH末端或者被修饰的3’末端。所述修饰包涵但不限于3’ddC、3’inverted dT,3’C3 spacer,3’amino等达到可阻止DNA延伸目的的3’末端修饰。

本发明上述基因拼接或者基因改造的方法中，所用的多聚核苷酸激酶是对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；这里可以使用NEB公司生产的T4Polynucleotide Kinase，但任何具有所述功能的多聚核苷酸激酶都可用于本发明，其多聚核苷酸激酶的种类不作具体限定。

所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻的双链DNA的缺刻处进行连接；这里可以使用NEB公司生产的Taq DNA Ligase，但任何具有所述功能的热稳定性DNA连接酶都可用于本发明，其热稳定性DNA连接酶的种类不作具体限定。

所述高保真DNA聚合酶可以使用Vazyme公司生产的Max Super-FidelityDNA Polymerase。但不限于此，任何具有相同功能带有3’到5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶均可用于此处。

由于DNA扩增过程中可能会有一定程度的甲基化，为了进一步提高上述基因拼接或基因改造方法的效率，优选地，所述反应体系中还加入了甲基化DNA内切酶；所述甲基化DNA内切酶对甲基化的DNA进行切割；对于PCR过程中可能残留的模版质粒甲基化DNA进行切割，确保背景DNA残留的完全清除，只留有PCR产生的DNA片段进行连接反应。这个过程降低或消除了最终连接产物转化中的假阳性克隆。

所述甲基化DNA内切酶是对甲基化的DNA进行切割，可以使用NEB公司生产的DpnI，但任何具有所述功能的甲基化DNA内切酶都可用于本发明，其甲基化DNA内切酶的种类不作具体限定。

优选地，上述方法中，所述目标DNA片段的加入摩尔浓度均相同；所述扩增引物的加入摩尔浓度均相同。

更优选地，所述扩增引物与桥接引物的摩尔浓度比例范围也会影响反应效果：若扩增引物与桥接引物的摩尔浓度的比例比较小，桥接引物浓度过高，桥接引物会与扩增引物配对，对相应的DNA进行扩增，导致非特异DNA的产生，影响实验结果；因此，优选地，所述扩增引物与桥接引物的摩尔浓度比例在100：1以上为较优。

另外，目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比例影响最终反应效果，若目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比例比较小，桥接引物在并非类似PCR反应过程中不断被消耗，在桥接法当中桥接引物摩尔浓度始终保持不变，起到类似催化剂的作用。过多的桥接引物在反应最后的循环过程当中由于过高的浓度而与DNA片段互补链相竞争退火，导致连接好的双链DNA解链后不能与自身互补链高效率退火，最终导致产生的完整双链DNA浓度下降，呈现为效率低下；DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比例较大，过低浓度的桥接引物无法在反应起始时与DNA片段本身竞争结合在单链DNA上。由于DNA片段本身长度远长于桥接引物，在退火过程中单链DNA片段先与自身互补链退火，只有适当提高桥接引物浓度才能使桥接引物在退火过程中与DNA片段自身互补链竞争，通过高浓度桥接引物先一步与单链DNA片段退火，使反应开始。这里优选地，所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.5～50。

还有，目标DNA片段与扩增引物的摩尔浓度比例也会影响最终反应效果，若目标DNA片段与扩增引物的摩尔浓度比例比较大，扩增引物无法与高浓度的DNA片段本身竞争进行退火，DNA片段双链打开后在退火过程中与较长链的自身退火互补，阻止扩增引物退火结合；若目标DNA片段与扩增引物的摩尔浓度比例比较小，过高浓度的扩增引物导致在DNA片段模版上的错配和非特异性扩增，另外高浓度的扩增引物自身形成引物二聚体降低扩增效率。因此优选地，所述目标DNA片段与扩增引物的摩尔浓度比例控制在10的六次幂到10的十次幂。

实验发现对于桥接引物，针对具有相同Tm值设计进行实验的效果较好，因此优选地，所述与桥接引物的一段序列和桥接引物的剩余一段序列具有相同的Tm值，所述Tm值的取值范围为50～80℃。

实际上，不同组分的缓冲液成分会影响最终反应效果，因此优选地，本发明所述反应缓冲液含有0～150mM Tris-HCl/Tris-醋酸，0～50mM MgCl₂/醋酸镁，0～50mM KCl/醋酸钾，0～1％Triton X-100，0～10mM NAD⁺，0～10mM dNTP，0～50mM DTT，0～10％PEG-8000，pH为7.6。

更优选地，本发明所述反应缓冲液的组成为：0～150mM Tris-HCl/Tris-醋酸，0～50mM MgCl₂/醋酸镁，0～50mM KCl/醋酸钾，0～1％Triton X-100，0～10mM NAD⁺，0～10mMdNTP，0～50mM DTT，0～10％PEG-8000，pH为7.6。

最优选地，最优选地，所述反应缓冲液的组成为：20nM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM KCl，0.1％Triton X-100，1mM NAD⁺，1mM dNTP，10mM DTT，5％PEG 8000，pH为7.6。

实际类似PCR的热循环反应中，可以采用分子生物学领域常用的反应温度和时间，优选地，本发明所述热循环包括预反应；预加热；高温变性；高温变性、退火、反应的循环；末尾反应；停止反应或低温保存的完整过程，其中预反应温度为35～45度，时间为0～60分钟；预加热温度为60～70度，时间为0～60分钟；高温变性温度为80～105度，时间为0～10分钟；循环中，80～105度，0～2分钟高温变性、30～80度，0～2分钟退火、30～80度，反应时间为完整连接产物的长度与高保真DNA聚合酶的速度的比值；循环数为1～60；末尾反应温度为30～80度，时间为0～30分钟；低温保存为-20～5度。

这里循环中的退火温度是根据桥接引物设计与扩增引物设计进行判断的，退火温度的计算可以直接使用Primer Premier 5等软件，输入相应的DNA序列即可得到相应序列的退火温度；或者也可以通过在线引物设计网站例如NCBI、NEB或thermoFisher等网站进行设计，判断相应序列的退火温度。

更优选地，上述循环反应条件：预反应温度为37度，时间为30分钟；预加热温度为65度，时间为20分钟；高温变性温度为95度，时间为3分钟；循环中，高温变性的温度为95度，时间为30秒，退火的温度为55度，时间为15秒；反应温度为68度，时间应大于相应高保真DNA聚合物扩增出完整连接产物的长度所需要的时间的1.5倍，循环数为30；末尾反应温度为68度，时间为5分钟；低温保存的温度为4度。

本发明还提供一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造试剂盒，一管中包括高保真DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶、热稳定性DNA连接酶、反应缓冲液和一份说明书，其中，说明书中记载了所要连接的目标DNA片段的桥接引物和扩增引物的设计原则，所述桥接引物的一段序列与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，桥接引物的剩余一段序列与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述扩增引物为最终连接产物的首尾扩增引物；或者为最终连接产物其中某一接口处5’末端相邻的引物；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；所述多聚核苷酸激酶对目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶对含有缺刻的双链DNA的缺刻处进行连接。

优选地，所述试剂盒还包括甲基化DNA内切酶；所述甲基化DNA内切酶对甲基化的DNA进行切割。

优选地，所述反应缓冲液含有0～150mM Tris-HCl/Tris-醋酸，0～50mM MgCl₂/醋酸镁，0～50mM KCl/醋酸钾，0～1％Triton X-100，0～10mM NAD⁺，0～10mM dNTP，0～50mMDTT，0～10％PEG-8000，pH为7.6。

更优选地，本发明所述反应缓冲液的组成为：0～150mM Tris-HCl/Tris-醋酸，0～50mM MgCl₂/醋酸镁，0～50mM KCl/醋酸钾，0～1％Triton X-100，0～10mM NAD⁺，0～10mMdNTP，0～50mM DTT，0～10％PEG-8000，pH为7.6。

最优选地，最优选地，所述反应缓冲液的组成为：20nM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM KCl，0.1％Triton X-100，1mM NAD⁺，1mM dNTP，10mM DTT，5％PEG 8000，pH为7.6。

优选地，所述目标DNA片段的加入摩尔浓度均相同；所述扩增引物的加入摩尔浓度均相同。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法，DNA片段磷酸化、DNA片段桥接以及连接产物的指数型扩增这些步骤在一管中由多聚核苷酸激酶、缺刻连接酶以及高保真DNA聚合酶(对于线性DNA连接产物)在桥接引物帮助下通过一个类似于PCR的热循环完成。把要连接的多个片段PCR扩增，纯化，按比例混合之后，整个拼接过程在热循环仪中自动完成，直接得到高浓度线性DNA连接产物或可转化的环状DNA分子，该方法具有以下优点：(1)DNA片段的磷酸化和拼接步骤在一管中反应，一步完成连接反应，避免了使用磷酸化引物造成的高昂成本；(2)优化了DNA浓度与桥接引物浓度，缓冲液组分与配比，达到高度可靠且重复性好的连接反应；(3)DNA片段无缝连接，不引入多余核苷酸；(4)非DNA序列依赖；(5)高效的多片段拼接能力；(7)被拼接的DNA片段末端不引入其它核苷酸，DNA片段可重用于其他构建工作；(8)在连接过程当中同时扩增连接产物，大幅增加产物浓度，保证高效率转化以及后续实验需求；(9)价格低廉，较常规的酶切连接方法成本低廉。

附图说明

图1为利用不同组分缓冲液进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图。

图2为利用不同热循环程序进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图。

图3为利用不同设计原则获得的桥接引物进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图；L1是基于相同Tm值的桥接引物；L2是基于相同长度设计的桥接引物。

图4为不同浓度的桥接引物进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图。

图5为不同浓度的DNA片段进行基因拼接获得的完整连接产物的转化子；图1A是平皿图；图1B为转化子数量统计柱图。

图6为多片段连接获得的转化子电泳图，GPD-dxs-TerADH1(2814bp)片段(泳道1～6)和AlphaSignal-MBP-GFP(2115bp)(泳道8～13)通过Taq DNA聚合酶连接，每个克隆上有两条相应大小的条带。

图7为MBP-GFP连接产物电泳图。

图8为实施例3所述质粒一步定点突变后质粒的测序图。

图9为本发明所述桥接法的反应过程原理图。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

一、反应缓冲液的优化

将表1中所述八组不同组分的缓冲液用于本发明所述基因拼接的方法(除了缓冲液组分为表1中各个组别的组分，其余实验材料和方法均相同)，结果表明：采用第1组到第8组的缓冲液作为本发明所述基因拼接方法的反应缓冲液都可以成功获得形成完整连接产物的转化子，只是形成的完整产物的转化子的数量有所不同，其中，采用第1组的缓冲液，获得的完整产物的转化子的数量最多(表1，图1)，因此，在本发明的下面具体实施例中，可以选用第1组所述缓冲液组分，第1组缓冲液的具体成分如表2。

表1八组不同缓冲液组分

表2

二、热循环程序的优化

将表3所述六种不同的热循环程序用于本发明所述基因拼接的方法(除了热循环程序不同，其余实验材料和方法均相同)，结果表明：较长的反应时间，较多的反应循环数，较低的退火温度和反应温度有利于实验进行。两步的热循环调节和三步的循环条件结果上没有显著的差别(表3，图2)。因此配合PCR反应，采用三步的热循环条件，较长的反应时间，较多的反应循环次数来提高反应效率。

表3

组别	反应条件；循环数	转化子数量
			1	55C 15s、65C 45s；20次	36
2	55C 15s、65C 45s；30次	112
			3	55C 30s、65C 90s；20次	154
4	55C 15s、65C 45s；30次	96
			5	55C 60s；20X	168
6	65C 60s；20X	154

因此，可以确定本发明的热循环条件可以是高温变性：80～105℃，0～2min、退火：30～80℃、0～2min。

更具体地，本发明的下面具体实施例中，热循环条件选用表4的条件。

表4

注：GOTO2是指跳转到55℃进行新一轮的退火-延伸程序。

三、桥接引物的优化

1、桥接引物的设计优化

本发明的桥接引物由两条半桥接引物(桥接引物1和桥接引物2)组成，其中桥接引物1与一条目标DNA的5’磷酸化端互补；桥接引物2与另一条目标DNA的3’去磷酸化端互补，所述桥接引物1和桥接引物2组成连续的一条桥接引物，本发明对桥接引物的设计，设置了2组，第1组为设计具有相同Tm值的桥接引物1和桥接引物2；第2组为设计具有相同长度的桥接引物1和桥接引物2，利用该两组进行本发明所述基因拼接的方法(除了桥接引物设计不同，其余实验材料和方法均相同)，结果表明：第1组实验获得转化子140个，第2组实验获得转化子90个；因此该两组设计均可以获得一定数量的完整连接产物的转化子，因此均可用于本发明的基因拼接方法，另外，利用基于相同Tm值设计的半桥接引物进行实验结果要优于基于相同长度设计的半桥接引物的实验结果(图3)。

2、桥接引物的浓度

DNA片段浓度在反应混合液中固定为10nM；桥接引物浓度梯度分别为：1uM、100nM、10nM、1nM；组别分别为1～4。结果表明：第1组获得转化子数量为556，第2组获得转化子数量为1238，第3组获得的转化子数量为655，第4组获得的转化子数量为15(图4)，研究还发现：桥接引物与DNA片段的浓度比例很重要，若桥接引物与DNA片段的浓度比例过高，会导致连接好的双链DNA解链后不能与自身互补链高效退火，最终导致产生的完整双链DNA的浓度下降，效率低下；而若桥接引物与DNA片段的浓度比例过低，退火过程中单链DNA片段先与自身互补链退火，导致效率低下，甚至不能使桥接引物与单链DNA片段退火反应进行。本发明中需控制桥接引物与DNA片段的摩尔浓度比例为1：0.1～1：100。

四、DNA片段浓度的优化

桥接引物浓度在反应混合液中固定设置为50nM；DNA片段浓度梯度分别为：15nM、1.5nM、0.15nM；组别分别为1～3。结果表明：DNA片段浓度为15nM时获得的转化子数量为11，DNA片段浓度为1.5nM时获得的转化子数量为92，DNA片段浓度为0.15nM时获得的转化子数量为1(图5)。

实施例1环状DNA分子拼接

表5为用到的DNA序列以及相应片段大小，设计引物过程当中，所有半桥接引物的Tm值以及扩增引物的Tm值均为60度。设计得到的桥接引物长度均在30～60bp区间范围内。用到的桥接引物序列与扩增引物序列均如表6。

表5环状DNA分子拼接所用到的片段

表6环状DNA分子拼接所用到的桥接引物和扩增引物

桥接法所用到的具体组分与浓度，热循环程序在表7，缓冲液组分在表8。桥接法一步完成了8个目标片段的一次性拼接，同时获得了高浓度的连接产物，保证了连接的效率。这个特点在传统或者其他新型的任何构建方法当中都有明显优势。

表7反应组分和热循环程序

表8 20ul桥接法反应混合液缓冲液组分

用到的其他试剂盒与protocol均为常规实验方法。PCR使用了Vazyme公司生产的Max Super-Fidelity DNA Polymerase。DNA片段纯化使用了Omega的GelExtraction Mini Kit。DNA浓度测量使用了EpochPlate reader。转化方法使用了常规的化学转化方法，所用到的感受态细胞为本实验室制备，零下80度保存的DH5a感受态细胞。

包括质粒骨架在内的多达8个片段的DNA分子使用本发明所述桥接法一步连接得到10kb以上大小的环状DNA分子。转化涂板过夜培养之后得到了50个以上的转化子。从其中挑取了6个进行菌落PCR，所有6个菌落均含有目标大小的扩增的DNA片段。从中挑取两个阳性克隆摇菌提质粒送测序，两个克隆均含有目标序列且均无插入、缺失、移码等突变(图6)。

本实施例所选取的八个片段，片段可大至数千碱基对，可小至二百碱基对。证明了此方法可容许大小各异的片段一次性连接。所扩增得到的DNA片段没有首末两端的任何额外新引入的多余核苷酸(例如无需引入酶切位点或者同源序列)，因此这些片段可重用于任何相关的其他构建工作。整个过程当中不依赖于DNA序列，也无需考虑DNA片段当中存在的酶切位点等问题。

实施例2线性DNA分子拼接

表9为所用到的DNA序列以及相应片段大小。

表9线性DNA分子拼接所用到的片段

设计引物过程当中，所有半桥接引物的Tm值以及扩增引物的Tm值均为60度。设计得到的桥接引物长度均在30～60bp区间范围内。桥接法中用到的桥接引物序列与扩增引物序列均列表10中。

表10线性DNA分子拼接所用到的桥接引物和扩增引物

对于常规两片段拼接形成融合片段而言，多数情况使用融合PCR。然而融合PCR方法重复性不高，稳定性差。并且对于不同的DNA片段需要摸索参数得到较好地融合反应。然而使用桥接法进行两片段乃至多片段的融合反应，则可在引入桥接引物情况下，使用桥接法混合反应液一步连接扩增得到高浓度连接产物，效率高，可重复性好，不必摸索参数进行反复的融合反应。

对于线性片段拼接，桥接法组分与程序与环状DNA拼接反应相同(见表7，表8)。只不过对于所使用的扩增引物根据需求使用首尾引物以扩增出整个连接产物。

两个DNA分子片段MBP与GFP使用桥接法一步连接得到拼接的线性DNA分子。对所得连接产物直接进行琼脂糖凝胶电泳可观测到正确目标条带大小。对相应的连接产物纯化后DNA测序，未发现插入、缺失、移码等突变情况(图7)。

实验过程当中用到的其他试剂盒与protocol均为常规实验方法。PCR使用了Vazyme公司生产的Max Super-Fidelity DNA Polymerase。DNA片段纯化使用了Omega的Gel Extraction Mini Kit。DNA浓度测量使用了EpochPlate reader。

本实施例所扩增得到的DNA片段没有首末两端的任何额外新引入的多余核苷酸(例如无需引入酶切位点或者同源序列)，因此这些片段可重用于任何相关的其他构建工作。整个过程当中不依赖于DNA序列，也无需考虑DNA片段当中存在的酶切位点等问题。所得到的高浓度连接产物可纯化后直接用于下游构建或其他工作当中。

实施例3质粒DNA分子一步点突变

所用到的质粒DNA为pZS-ssMBP-LKGFP(SEQ ID NO：2)，质粒大小为5967bp。所得到的高浓度突变后环状DNA连接产物可直接用于转化，获得大量转化子。

桥接法中用到的桥接引物序列与扩增引物序列均列在表11中。

表11

原理上来讲，使用桥接法点突变相当于完整桥接法中最后两步骤。引入的带有突变的扩增引物完整扩增出整个质粒，线性的扩增产物在桥接引物的引导下在热循环中完成成环反应得到高浓度目标产物。

对于常规点突变而言，多数情况需要首先进行融合PCR反应，之后进行酶切连接转化，过程繁琐且融合PCR方法重复性不高，稳定性差。使用桥接法进行点突变反应，可直接在引入的扩增引物当中加入相应突变，同时此处接口的桥接引物使用突变后的桥接引物，使用桥接法混合反应液一步突变扩增连接得到高浓度产物，大幅简化操作步骤，使点突变反应一步完成直接用于转化。在点突变反应当中，DpnI被排除在反应组分外，由于DpnI将对甲基化的质粒DNA模版进行切割，阻止产物生成。

表12

表13

本实施例所述的方法，质粒DNA分子使用桥接法一步点突变、扩增、连接得到10kb以上大小的环状DNA分子。转化涂板过夜培养之后得到了200个以上的转化子。从中挑取两个克隆摇菌提质粒送测序，两个克隆均含有相应位点的目标点突变且均无插入、缺失、移码等其他位置突变。图8展示了测序结果，引入C->G点突变。

实验过程当中用到的其他试剂盒与protocol均为常规实验方法。PCR使用了Vazyme公司生产的Max Super-Fidelity DNA Polymerase。DNA片段纯化使用了Omega的Gel Extraction Mini Kit。DNA浓度测量使用了EpochPlate reader。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接改造方法及其试剂盒

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> LKGFP: 线性

<400> 1

ggcggctcaa agactcgtcg tggatccgga ggtggctcaa tggtgagcaa gggcgaggag 60

ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 120

ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 180

atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 240

ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 300

gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 360

aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 420

ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 480

agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 540

atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 600

cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 660

ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 720

gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaa 759

<210> 2

<211> 5967

<212> DNA

<213> pZS-ssMBP-GFP: 环状

<400> 2

tatgtctgaa ttagttgttt tcaaagcaaa tgaactagcg attagtcgct atgacttaac 60

ggagcatgaa accaagctaa ttttatgctg tgtggcacta ctcaacccca cgattgaaaa 120

ccctacaagg aaagaacgga cggtatcgtt cacttataac caatacgctc agatgatgaa 180

catcagtagg gaaaatgctt atggtgtatt agctaaagca accagagagc tgatgacgag 240

aactgtggaa atcaggaatc ctttggttaa aggctttgag attttccagt ggacaaacta 300

tgccaagttc tcaagcgaaa aattagaatt agtttttagt gaagagatat tgccttatct 360

tttccagtta aaaaaattca taaaatataa tctggaacat gttaagtctt ttgaaaacaa 420

atactctatg aggatttatg agtggttatt aaaagaacta acacaaaaga aaactcacaa 480

ggcaaatata gagattagcc ttgatgaatt taagttcatg ttaatgcttg aaaataacta 540

ccatgagttt aaaaggctta accaatgggt tttgaaacca ataagtaaag atttaaacac 600

ttacagcaat atgaaattgg tggttgataa gcgaggccgc ccgactgata cgttgatttt 660

ccaagttgaa ctagatagac aaatggatct cgtaaccgaa cttgagaaca accagataaa 720

aatgaatggt gacaaaatac caacaaccat tacatcagat tcctacctac gtaacggact 780

aagaaaaaca ctacacgatg ctttaactgc aaaaattcag ctcaccagtt ttgaggcaaa 840

atttttgagt gacatgcaaa gtaagcatga tctcaatggt tcgttctcat ggctcacgca 900

aaaacaacga accacactag agaacatact ggctaaatac ggaaggatct gaggttctta 960

tggctcttgt atctatcagt gaagcatcaa gactaacaaa caaaagtaga acaactgttc 1020

accgttagat atcaaaggga aaactgtcca tatgcacaga tgaaaacggt gtaaaaaaga 1080

tagatacatc agagctttta cgagtttttg gtgcatttaa agctgttcac catgaacaga 1140

tcgacaatgt aacagatgaa cagcatgtaa cacctaatag aacaggtgaa accagtaaaa 1200

caaagcaact agaacatgaa attgaacacc tgagacaact tgttacagct caacagtcac 1260

acatagacag cctgaaacag gcgatgctgc ttatcgaatc aaagctgccg acaacacggg 1320

agccagtgac gcctcccgtg gggaaaaaat catggcaatt ctggaagaaa tagcgctttc 1380

agccggcaaa cctgaagccg gatctgcgat tctgataaca aactagcaac accagaacag 1440

cccgtttgcg ggcagcaaaa cccgtacacg cgttttccta ggtttgaatt caaaagatct 1500

cttacatgaa aaaggttctt gacattttaa atccatgtgg tatatgtcat ttttctagga 1560

tctcttacat gaaaaaggtt cttgacattt taaatccatg tggtatatgt catttttcta 1620

ggatctctta catgaaaaag gttcttgaca ttttaaatcc atgtggtata tgtcattttt 1680

ctaggatctc ttacatgaaa aaggttcttg acattttaaa tccatgtggt atatgtcatt 1740

tttctaggat ctcttacatg aaaaaggttc ttgacatttt aaatccatgt ggtatatgtc 1800

atttttctag ctagctttcg gaattaagga ggtaataaat atgaaaataa aaacaggtgc 1860

acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt tccgcctcgg ctctcgccaa 1920

aatcgaagaa ggtaaactgg taatctggat taacggcgat aaaggctata acggtctcgc 1980

tgaagtcggt aagaaattcg agaaagatac cggaattaaa gtcaccgttg agcatccgga 2040

taaactggaa gagaaattcc cacaggttgc ggcaactggc gatggccctg acattatctt 2100

ctgggcacac gaccgctttg gtggctacgc tcaatctggc ctgttggctg aaatcacccc 2160

ggacaaagcg ttccaggaca agctgtatcc gtttacctgg gatgccgtac gttacaacgg 2220

caagctgatt gcttacccga tcgctgttga agcgttatcg ctgatttata acaaagatct 2280

gctgccgaac ccgccaaaaa cctgggaaga gatcccggcg ctggataaag aactgaaagc 2340

gaaaggtaag agcgcgctga tgttcaacct gcaagaaccg tacttcacct ggccgctgat 2400

tgctgctgac gggggttatg cgttcaagta tgaaaacggc aagtacgaca ttaaagacgt 2460

gggcgtggat aacgctggcg cgaaagcggg tctgaccttc ctggttgacc tgattaaaaa 2520

caaacacatg aatgcagaca ccgattactc catcgcagaa gctgccttta ataaaggcga 2580

aacagcgatg accatcaacg gcccgtgggc atggtccaac atcgacacca gcaaagtgaa 2640

ttatggtgta acggtactgc cgaccttcaa gggtcaacca tccaaaccgt tcgttggcgt 2700

gctgagcgca ggtattaacg ccgccagtcc gaacaaagag ctggcaaaag agttcctcga 2760

aaactatctg ctgactgatg aaggtctgga agcggttaat aaagacaaac cgctgggtgc 2820

cgtagcgctg aagtcttacg aggaagagtt ggtgaaagat ccgcgtattg ccgccactat 2880

ggaaaacgcc cagaaaggtg aaatcatgcc gaacatcccg cagatgtccg ctttctggta 2940

tgccgtgcgt actgcggtga tcaacgccgc cagcggtcgt cagactgtcg atgaagccct 3000

gaaagacgcg cagactaatt cgagctcggg cggctcaaag actcgtcgtg gatccggagg 3060

tggctcaatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 3120

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 3180

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 3240

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 3300

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 3360

catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 3420

caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 3480

ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 3540

gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 3600

gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 3660

caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 3720

catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 3780

caagtaactg cagggcgata tcggatctac tagtgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc 3840

cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt 3900

ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 3960

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 4020

ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 4080

ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttg 4140

gatccaaatc tagagtcgac acttgacgtc ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 4200

accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 4260

tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 4320

gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 4380

ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 4440

gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 4500

gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 4560

agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 4620

gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 4680

cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 4740

gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 4800

gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 4860

ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 4920

gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 4980

ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 5040

tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 5100

agagctcgct tggactcctg ttgatagatc cagtaatgac ctcagaactc catctggatt 5160

tgttcagaac gctcggttgc cgccgggcgt tttttattgg tgagaatcca agcactaggg 5220

acagtaagac gggtaagcct gttgatgata ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc 5280

tgaatgacct gtcacgggat aatccgaagt ggtcagactg gaaaatcaga gggcaggaac 5340

tgctgaacag caaaaagtca gatagcacca catagcagac ccgccataaa acgccctgag 5400

aagcccgtga cgggcttttc ttgtattatg ggtagtttcc ttgcatgaat ccataaaagg 5460

cgcctgtagt gccatttacc cccattcact gccagagccg tgagcgcagc gaactgaatg 5520

tcacgaaaaa gacagcgact caggtgcctg atggtcggag acaaaaggaa tattcagcga 5580

tttgcccgag cttgcgaggg tgctacttaa gcctttaggg ttttaaggtc tgttttgtag 5640

aggagcaaac agcgtttgcg acatcctttt gtaatactgc ggaactgact aaagtagtga 5700

gttatacaca gggctgggat ctattctttt tatctttttt tattctttct ttattctata 5760

aattataacc acttgaatat aaacaaaaaa aacacacaaa ggtctagcgg aatttacaga 5820

gggtctagca gaatttacaa gttttccagc aaaggtctag cagaatttac agatacccac 5880

aactcaaagg aaaaggacta gtaattatca ttgactagcc catctcaatt ggtatagtga 5940

ttaaaatcac ctagaccaat tgagatg 5967

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 表6引物a

<400> 3

gactcactat agggaatatt aagcttacca tgagatttcc ttcaattttt actgc 55

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 表6引物b

<400> 4

gaagaagggg tatctctcga gaaaagaatg aaaatcgaag aaggtaaact ggtaat 56

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 表6引物c

<400> 5

cgcagactaa ttcgagctcg ggcggctcaa agactcg 37

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 表6引物d

<400> 6

gcatggacga gctgtacaag taatgagttt aaacccgctg atcct 45

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 表6引物e

<400> 7

cgctacaggg cgcgttcatt atcaatactg ccatttcaaa gaa 43

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 表6引物f

<400> 8

tcgaataaac acacataaac aaacaaaatg agttttgata ttgccaaata cc 52

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 表6引物g

<400> 9

aggcctggct ggcataaggc gcgccacttc taaataa 37

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 表6引物h

<400> 10

ggtcacccgg ccagccggat tagaagccgc cg 32

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 表6引物i

<400> 11

atgagatttc cttcaatttt tactgcag 28

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 表6引物j

<400> 12

ggtaagctta atattcccta tagtgagtcg tatt 34

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 表10引物a

<400> 13

cgcagactaa ttcgagctcg ggcggctcaa agactcg 37

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 表10引物b

<400> 14

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaat 29

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 表10引物c

<400> 15

ttacttgtac agctcgtcca tgccgag 27

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 表11的桥接引物

<400> 16

gctagctttc ggaattaagg aggtaataaa tatgaaaata aaaacaggtg cacgc 55

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 表11扩增引物F

<400> 17

atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatcc 39

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 表11扩增引物R

<400> 18

atttattacc tccttaattc cgaaagctag c 31

Claims (5)

1.一种一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法，其特征在于，将目标DNA片段、桥接引物、扩增引物、高保真DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶、热稳定性DNA连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，将所述反应体系进行热循环反应获得完整连接产物，当所述完整连接产物为线性DNA时，所述扩增引物分别为完整连接产物的首尾扩增引物；当所述完整连接产物为环状DNA时，所述扩增引物分别为连接产物其中某一接口处5’末端相邻的引物；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；

所述桥接引物的一段序列与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，桥接引物的剩余一段序列与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述多聚核苷酸激酶对目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；

所述热循环包括以下条件：预反应温度为37度，时间为30分钟；预加热温度为65度，时间为20分钟；高温变性温度为95度，时间为2分钟；循环中，高温变性的温度为95度，时间为30秒，退火的温度为55度，时间为15秒；反应温度为68度，时间应大于相应高保真DNA聚合物扩增出完整连接产物的长度所需要的时间的1.5倍，循环数为30；末尾反应温度为68度，时间为5分钟；低温保存的温度为4度；

所述反应缓冲液含有20mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM KCl，0.1％Triton X-100，1mMNAD⁺，10mM dNTP，10mM DTT，5％PEG-8000，pH为7.6。

2.根据权利要求1所述的一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法，其特征在于，所述反应体系中还加入了甲基化DNA内切酶；所述甲基化DNA内切酶对甲基化的DNA进行切割。

3.根据权利要求1或2所述的一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法，其特征在于，所述目标DNA片段的加入摩尔浓度均相同；所述扩增引物的加入摩尔浓度均相同。

4.根据权利要求1或2所述的一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法，其特征在于，所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.5～50。

5.根据权利要求1或2所述的一步、无缝、非同源、多片段的基因拼接或基因改造方法，其特征在于，所述桥接引物的一段序列和桥接引物的剩余一段序列具有相同的Tm值，所述Tm值的取值范围为50～80℃。