CN101331236A

CN101331236A - 用于提高扩增的核酸修复

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Publication number: CN101331236A
Application number: CNA2006800475663A
Authority: CN
Inventors: T·C·埃文斯; B·斯拉塔科; 陈立新; R·瓦伊斯维拉; 管楚狄; R·库切拉
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2005-10-20
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2026-04-11
Also published as: WO2007046854A1; EP1948821A1; JP2009512438A; JP5033806B2; EP1948821B1; CN101331236B

Abstract

提供了修复多核苷酸的方法及组合物，以便其能够在，例如扩增反应中，以提高的保真度和/或产率被复制。这涉及包含连接酶和选自NAD⁺或ATP的辅助因子的反应混合物的使用，以及在没有内切核酸酶VI存在的情况下将所述多核苷酸与所述反应混合物温育。所述反应混合物可能进一步包含AP内切核酸酶和聚合酶。如果使用，这些酶可根据它们抗高温的能力进行选择。例如，所述反应混合物可在多核苷酸合成反应前使用，在这种情况下，非嗜热的酶可被使用。由于修复被迅速完成并且延长的温育通常不是有害的，因此对于在所述酶混合物中温育几秒、几分钟或几小时而言，所述修复反应对时间不敏感。

Description

用于提高扩增的核酸修复

背景技术

[0001]多核苷酸的复制，更具体地扩增，通常用在分子生物学中以研究，例如，基因的性质。当多核苷酸以某些方式被损坏时，复制便产生问题。

[0002]例如，美国专利5,035,996描述了一种在扩增反应中使用修饰的核苷酸、dUTP控制聚合酶链反应扩增反应的污染的方法。该方法使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)消除那些含有尿嘧啶的PCR产物以防止污染后续的PCR反应。美国专利公开2004-0067559 A1也依靠扩增前引物DNA中修饰的碱基，并使用，例如dUTP以掺入扩增子中。随后，可通过加入例如UDG和内切核酸酶(Endo)IV，使扩增子形成片段。

[0003]一种被称作热启动核酸扩增的扩增方法已经被用于降低聚合酶链反应(PCR)过程中的错误引发(mis-priming)。在一类热启动扩增中，依靠在PCR反应中存在带有加帽的3’末端(blocked 3’terminus)的PCR引物阻止聚合酶引起的延伸(参见例如，美国公开号2003-0119150)。所述引物通过在＞37℃时有活性的热稳定3′-5′外切核酸酶去帽。因此，所述聚合酶仅当外切核酸酶在＞37℃使3′末端去帽时才延伸PCR引物。可选地，Taq聚合酶被加帽，并随后在扩增温度下被激活。

[0004]Barnes，W.M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2216-2220(1994)描述了在扩增中使用Vent

聚合酶和Taq聚合酶作为对仅应用Taq聚合酶的改良。Ghadessy等报道了突变的Taq聚合酶，该聚合酶不会被破损的或脱碱基的位点终止(Ghadessy等，Nature Biotechnol.22(6)：755-9(2004))。

[0005]报道称，如果DNA大量破损，则常规扩增技术受到影响(Di Bernardo等，Nucl.Acids Res.30：e16(2002))。由暴露于含有DNA核酸酶的环境和微生物引起的DNA降解和/或片段化是鉴证学、诊断测试和常规扩增中常见的问题，并且影响扩增产物的保真度和产率。此外，分析从储存、冷冻或成化石的灭绝的或极其稀有的生物体中所获得DNA的研究人员也要面对DNA降解的问题。

[0006]Fromenty，B.等，Nucl.Acids Res.28(11)：e50(2000)和国际公开号WO/0151656报道了，用外切核酸酶(Exo)III处理提高长PCR的产率。然而，Fromenty也报道了，使用Exo III时DNA＜500bp的扩增子的产率降低。与使用ExoIII相关的一个问题是它降解模板及引物。

[0007]Di Benardo等在Nucl.Acids Res.30(4)：e16(2002)中描述了T4DNA连接酶(T4连接酶)及大肠杆菌聚合酶用作预处理，以在双链DNA的交联区域间扩增单链DNA的较短区域。

[0008]扩增受损DNA的另一个方法在美国公开号2003-0077581中描述。降解的核酸和与其有同源序列的未降解核酸杂交。随后降解核酸的区域被核苷酸前体填充。接着用聚合和/或连接酶共价链接片段化的链。

[0009]改善受损DNA扩增的制剂可从Sigma，St.Louis，MO和Qbiogene，现在的MP Biomedicals，Irvine，CA购得。尽管这些制剂的组成没有说明，可以设想这些制剂中含有Exo III。

[0010]其他人报道了大肠杆菌DNA聚合酶I(E.coli DNA PolI)与T4连接酶的组合使用以进行预扩增修复(Pusch等，Nucl.Acids Res.26：857(1998))。然而，根据Pusch等，所述预扩增产物必须在扩增开始前纯化。

发明概述

[0011]在本发明的一个实施方式中，提供了一种通过修复受损多核苷酸增强复制或扩增产物的保真度和产率中至少一项的方法，其中该方法可以包括：在不存在内切核酸酶VI(Endo VI)的反应混合物中温育多核苷酸，所述反应混合物包含连接酶和NAD⁺或ATP中至少一种作为辅助因子。所述多核苷酸可从任何天然或合成来源获得，包括从保藏的生物材料、法医学证据、生物起源的古老物质以及组织活检切片材料获得。多核苷酸破损的例子可包括脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点、化学修饰的核苷酸、切口、缺口和DNA-DNA、DNA-蛋白质交联，DNA-RNA交联或RNA-RNA交联中至少一种。

[0012]在本方法的一个实施例中，所述连接酶是热稳定连接酶。Taq DNA连接酶是使用NAD⁺作为辅助因子的热稳定连接酶的一个例子。大肠杆菌DNA连接酶是其辅助因子为NAD⁺的连接酶的另一个例子。所述含有连接酶的反应混合物中其它组分可以包括T7Endo I或其突变体、聚合酶及AP内切核酸酶中的一种或多种。用在所述反应混合物中的聚合酶的例子包括Taq聚合酶、大肠杆菌聚合酶、或古细菌(archaeal)聚合酶或其突变体。古细菌聚合酶或由此衍生的嵌合的聚合酶的例子包括Pfu、、Deep、9°North、KOD和Phusion^TM聚合酶以及PWO中的一种或多种。用在所述反应混合物中其它聚合酶的例子包括Y聚合酶家族的成员，如大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、人聚合酶κ、人聚合酶η、Sso Dpo4、Sac Dbh、Sce聚合酶ζ和人聚合酶ι。

[0013]用在所述反应混合物中的内切核酸酶的例子包括至少下列一种：来自噬菌体T4、大肠杆菌、人类和嗜热菌属(Thermus)种中任意的至少一种内切核酸酶。所述反应混合物可进一步包含一种或多种选自下面的酶：T4嘧啶二聚体糖基化酶、[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)、UvrA、UvrB、UvrC、UvrD、Cho、Endo V、Endo III、Endo VIII、UDG、λβ蛋白、RecA和Aag。

[0014]在本发明的一个实施方式中，通过选自以下的方式，在复制多核苷酸后实现产率的提高，这些方式包括：PCR扩增、解旋酶依赖性扩增、转录调控的扩增、链置换扩增、滚环扩增和全基因组扩增。当所述多核苷酸为RNA，所述扩增可以是反转录扩增(RT-amplification)。当所述多核苷酸为DNA，所述反应混合物可包括在10-1000μL的反应体积内，加入到1-1000ng DNA中的1-100单位的大肠杆菌Endo IV、0.05-0.25单位的大肠杆菌聚合酶I以及5-500单位的Taq连接酶。

[0015]当浓度约50％以下的起始多核苷酸制备物提供缺少该反应混合物可获得的至少相似量的复制产物时，确定为产率改善或提高。优选地，所述改善应该是可重复的，表示约75％或更多的复制样品将证明改善。而且，任选地，所述方法的一个附加特征是它能够在单一的温育温度下获得改善的结果。

[0016]在本发明的一个实施方式中提供了一种方法，其中多核苷酸的扩增能够在聚合酶链反应中产生大小范围在50个核苷酸到100,000个核苷酸内的扩增子。

[0017]在本发明的一个实施方式中，提供了包含一种或多种酶以及它们的使用说明的试剂盒，其中至少一种酶是连接酶，所述一种或多种酶被配制为可添加进多核苷酸制备物中，以增强(如上文所述)多核苷酸的复制。

[0018]在本发明的一个实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包括有效量的连接酶、聚合酶和AP内切核酸酶——不包括Endo VI，提供与没有该组合物的复制多核苷酸相比，复制多核苷酸产率和保真度至少一种的增强。在所述组合物的一个例子中，某种酶的浓度如下：在10-1000μL体积中，1-100个单位的AP内切核酸酶、0.05-5个单位的聚合酶、和5-500个单位的连接酶用在预扩增混合物中。

[0019]所述组合物中特定酶的例子包括AP内切核酸酶，更具体地，II型AP内切核酸酶，更具体地，大肠杆菌Endo IV。所述聚合酶的例子是大肠杆菌聚合酶I。此外，所述组合物可进一步包含至少一种下列的酶：T4嘧啶二聚体糖基化酶、[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)、UvrA、UvrB、UvrC、UvrD、Cho、Endo V、Endo III、Endo VIII、UDG、RecA、λβ蛋白和Aag。

[0020]在本发明的一个实施方式中，提供了一种提高复制或扩增的多核苷酸产率的方法，包括：(a)获得至少第一对和第二对引物，其中第二对引物在与多核苷酸杂交时嵌入第一组引物中；(b)使多核苷酸经受上述组合物；(c)用第一组引物扩增该多核苷酸；(d)用第二组引物扩增(c)的产物；以及(e)获得扩增多核苷酸的提高的产率。

[0021]在本发明其它的实施方式中，提供了一种克隆多核苷酸片段的方法，包括：利用诸如上述组合物修复多核苷酸片段中的序列错误。这种组合物具有使多核苷酸片段的末端平齐(blunt-ending)的有利特性，消除了将片段克隆进载体中的步骤。

[0022]在本发明其它的实施方式中，提供了一种测定多核苷酸序列的方法，包括测序前将所述多核苷酸与上述组合物接触。测序结果的质量在灵敏度和准确度方面通常有改善。

[0023]在本发明其它的实施方式中，提供了一种复制或扩增片段化DNA的方法，包括：(a)将片段化的DNA与上述组合物接触；(b)任选地，加入重组的感受态蛋白；和(c)扩增或复制该片段化DNA。重组的感受态蛋白的例子是来自如λ噬菌体的RecA和β蛋白。

附图简述

[0024]图1A-1D显示用特定酶预先温育后，从热破损λDNA中得到提高的扩增子产率。

[0025]图1A显示由热引起的不同程度破损的DNA模板以及这种破损对5kbλDNA片段的扩增的影响，其中5ng、2ng和1ng的热处理的λDNA在99℃热处理0秒、30秒、60秒、90秒、120秒或180秒预先破损后被扩增。所述受损DNA在扩增前未经过酶处理。扩增的量经电泳后确定，并且发现其因120秒热处理而大大降低。凝胶上第一泳道包含1μg的对数2梯度大小标准物(2-log ladder sizestandard)(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0026]图1B示出使用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV和大肠杆菌聚合酶I从热破损的λDNA中扩增5kbλDNA片段得到提高的扩增子产率。DNA被如图1A所述热破损，但是受损DNA在扩增前经过酶处理。扩增结果在使用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV和大肠杆菌聚合酶I进行10分钟预处理反应后显示。扩增子的产率全部增加，但是特别值得注意的是120秒和180秒热破损DNA。凝胶上第一泳道和最后泳道含有1μg的2-log梯度大小标准物(NEB#N3200，NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0027]图1C显示了使用Taq连接酶、Tth Endo IV和大肠杆菌聚合酶I从热破损λDNA中得到的提高的扩增子产率。扩增按照图1B所示进行，但是扩增前的酶处理包含耐热嗜热菌(Thermus thermophilus)(Tth)Endo IV代替大肠杆菌内切核酸酶IV。扩增结果在使用水生嗜热菌(Thermus aquaticus)(Taq)连接酶、Tth Endo IV和大肠杆菌聚合酶I进行10分钟预处理反应后显示。扩增子的产率全部增加，但是特别值得注意的是120秒和180秒热破损DNA。只有第一泳道包含分子量标记梯度。

[0028]图1D显示了使用大肠杆菌连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV和大肠杆菌DNA聚合酶I从热破损λDNA中得到的提高的扩增子产率。扩增按照图1B所示进行但是扩增前的酶处理包含大肠杆菌连接酶代替Taq连接酶。经过99℃加热180秒的λDNA被用作模板。所用模板DNA的量在每一泳道的上方显示。对每个由酶预处理的模板数量，5kb扩增子的产率提高。

[0029]图2A和2B显示模板DNA经pH5的柠檬酸盐缓冲液处理对扩增子产率的影响。

[0030]图2A显示了5kb的λDNA片段扩增的结果，其中λDNA在pH5的柠檬酸盐缓冲液中在70℃加热0、20、40、80、120和160分钟。50ng、10ng和5ng每种柠檬酸盐处理的样品被扩增，并且所得产物在凝胶上观察以确定扩增的程度。所述DNA在扩增前没有用所选酶进行处理。右侧最后泳道包含1μg的2-log梯度。

[0031]图2B显示了λDNA的5kb扩增子产率的增加，无论所述酶混合物中使用何种聚合酶。120分钟柠檬酸盐破损的λDNA在扩增前用多种酶处理。

[0032]第1泳道：1μg的2-log梯度(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0033]第2泳道：无预处理。

[0034]第3泳道：用Taq连接酶、Taq DNA聚合酶及大肠杆菌内切核酸酶IV预处理。

[0035]第4泳道：用Taq连接酶、大肠杆菌聚合酶I及大肠杆菌内切核酸酶IV预处理。

[0036]第5泳道：用Taq连接酶、Taq∶

DNA聚合酶混合物及大肠杆菌内切核酸酶IV预处理。

[0037]图3显示了磷虾(krill)基因组的200bp片段的扩增结果，所述磷虾基因组是从乙醇储存的磷虾样品中提取的，并且用包含多种聚合酶中的一种、连接酶和提高扩增产率的AP内切核酸酶的酶混合物预处理。

[0038]第1泳道：没有用酶对磷虾DNA进行预处理。

[0039]第2泳道：用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及Taq聚合酶预处理磷虾DNA。

[0040]第3泳道：用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及聚合酶预处理磷虾DNA。

[0041]第4泳道：用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及50∶1 Taq∶

聚合酶预处理磷虾DNA。

[0042]图4显示了从热破损DNA得到10kb扩增子产率的增加。180秒热破损DNA用酶混合物预处理并随后扩增。

[0043]第1泳道：1μg的2-log梯度大小标准物(NEB#N3200，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0044]第2泳道：用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及大肠杆菌聚合酶I预处理。

[0045]第3泳道：用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV预处理。

[0046]第4泳道：用Taq连接酶预处理。

[0047]第5泳道：对照——未处理的DNA。

[0048]图5显示了连接酶预处理提高了从环境DNA(土壤样品提取物)获得的扩增子的产率。

[0049]第1泳道：2-log梯度大小标准物(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0050]第1泳道：无酶预处理。

[0051]第2泳道：用T4连接酶预处理。

[0052]第3泳道：无酶预处理。

[0053]第4泳道：用Taq连接酶预处理。

[0054]图6A-1到6A-9以及6B-1到6B-2：用大肠杆菌DNA连接酶(A)和T4DNA连接酶(B)在NCBI进行Blast P搜索。

[0055]图7：Tth Endo IV的DNA序列(SEQ ID NO：11)。

[0056]图8A、8B和8C显示了紫外光对使用λDNA的扩增子产率的影响。

[0057]图8A：λDNA经历长达50秒的紫外辐射，并且显示出产生2kb扩增子的产率轻微降低。

[0058]图8B：λDNA经历长达50秒的紫外辐射，并且显示出5kb扩增子产率的降低。

[0059]图8C：加入到λDNA中的多种反应混合物对紫外辐射后的5kb扩增子的产量的影响被示出。

[0060]第2-7泳道是不存在反应混合物的对照。

[0061]第8-13泳道显示了加入连接酶、聚合酶及AP内切核酸酶以及10单位T4pdg的增加的有益效果。

[0062]第14-19泳道显示了加入连接酶、聚合酶及AP内切核酸酶以及80单位T4pdg的增加的有益效果。

[0063]第1和20泳道：2-log梯度大小标准物(NEB#N3200，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0064]图9A和9B显示了加入连接酶到T7Endo I扩展了Endo I：DNA比例的可用范围，其中产物未被降解。如每一泳道所示，Taq连接酶和T7Endo I以不同的量被加入到超螺旋的DNA中。

[0065]图9A是对照，其中没有Taq连接酶被加入但是增加量的T7 Endo I被使用。所述超螺旋DNA用12.5-25单位的T7 Endo I被大量切成各种尺寸的片段。

[0066]图9B显示100单位Taq连接酶的加入在T7 Endo I的存在下如何保护DNA不受非特异性酶切，以至于甚至用200单位T7 Endo I时，仍有对应于线性DNA的，未在不存在连接酶的情况下出现的清晰条带。

[0067]图10A和10B显示了修复酶处理对氧化破损DNA或未破损模板的扩增子产率的影响。

[0068]图10A显示了加入修复酶到未破损模板，pWB407，对扩增子产率没有影响。

[0069]图10B显示了加入Fpg到破损模板——质粒pWB407，对产率产生不一致的效果，所述破损模板在甲基蓝存在下预先温育。在Fpg存在或不存在的情况下加入Taq连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶及大肠杆菌内切核酸酶IV一致地增加了扩增子的产率。

[0070]图11显示了用修复酶处理后，从破损的DNA得到增加的PCR反应保真度。PCR之前对未破损模板pWB407进行修复酶处理对保真度没有明显影响。单独用Fpg或也用Taq连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶I及大肠杆菌内切核酸酶处理破损的模板——用甲基蓝温育的质粒pWB407，增加了PCR的保真度。如下文所述，保真度的量度是克隆含lacZ的扩增子后，白色菌落的数量与蓝色菌落的数量之比。白色菌落的百分比越高，错误率越高。

[0071]图12显示了处理受损DNA或以增加保真度或产率中至少一项的流程图。

[0072]图13A和13B显示了用多种酶修复混合物在室温下温育15分钟或在4℃温育过夜的，30秒紫外破损的DNA的5kb片段扩增子的产率如何被提高。

[0073]图13A：室温温育：

[0074]第1泳道：2-log梯度DNA分子量标准物。

[0075]第2和3道：未用多种酶修复混合物在室温下温育15分钟的两个反应。

[0076]第4和5道：用修复混合物在室温下温育15分钟的反应具有预期的5kb扩增子。

[0077]图13B：4℃温育：

[0078]第1泳道：2-log梯度DNA分子量标准物。

[0079]第2和3泳道：未用多种酶修复混合物在4℃温育过夜的两个反应。

[0080]第4和5道：用修复混合物在4℃温育过夜的反应具有预期的5kb扩增子。

[0081]图14显示用修复酶混合物在室温下处理15分钟和用古细菌聚合酶进行PCR扩增后，从含尿嘧啶的质粒中得到的扩增子产率的提高。第1和2泳道显示使用vent DNA聚合酶的pNEB0.92U的PCR扩增产物。在920bp有一个勉强可见的条带。第3和4泳道显示了从用修复酶混合物处理的pNEB0.92U得到的PCR扩增产物。

[0082]图15显示了琼脂糖凝胶，其上可辨识出一条对应于620碱基对的扩增DNA的条带。所述620bp的扩增子是从48个核苷酸或更少的20个重叠单链寡核苷酸获得的。

[0083]第1泳道：2-log DNA分子量标准物(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0084]第2泳道：在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg和20单位Endo IV温育的20个寡核苷酸。

[0085]第3泳道：在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg、20单位Endo IV和λβ蛋白温育的20个寡核苷酸。

[0086]第4泳道：在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg、20单位Endo IV和大肠杆菌RecA温育的20个寡核苷酸。

[0087]第5泳道：在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg、20单位Endo IV、λβ蛋白和RecA温育的20个寡核苷酸。

[0088]第6泳道：对照，在装配步骤中，未加入修复酶的20个寡核苷酸。

[0089]图16显示了DNA修复处理对未被辐射(-)和被辐射DNA(+)的影响，其通过由当含有选择性标记的DNA被用来转化细胞时获得菌落的数量来确定。

[0090]图17显示了使用不同的嵌套引物对在2组扩增反应后对从古穴熊(ancient cave bear)DNA获得提高的扩增子产率。基因图谱显示了引物对F1-R1、F1-R2和F1-R4的位置。在凝胶上方，提供了一组数字(88、79、10、11、1868和1314)，其代表每个样品中估计的线粒体DNA量。3A和3B泳道包含最多的DNA。+/-表示使用F1-R1进行第一次扩增前是否使用了修复混合物。在3B泳道中，观察到对应于已修复洞穴熊DNA的明显的条带，其在不存在修复的泳道中没有出现。

[0090a]图18显示了质粒pNEB0.92U的DNA序列(SEQ ID NO：42)。

实施方式详述

[0091]本发明的实施方式提供了复制，或更特别地扩增多核苷酸方法的改进。提高复制或扩增的多核苷酸产率和保真度中至少一项与在复制或扩增无反应混合物存在下所需的50％多核苷酸后获得的可检测到的多核苷酸产率相关，所述反应混合物含有如本实施方式中示例的选定的修复酶。“保真度”涉及这样的复制，在其中错误率小于不存在包含本实施方式中所示例选定的修复酶的反应混合物的其它情况。

[0092]本发明的方法使用包含酶的反应混合物。如果怀疑存在多种类型的破损，那么可以如实施例中使用的特殊混合物所示，构建酶的组合。如果多核苷酸的破损是已知的，那么优选的酶混合物可如实施例中所示被选择。如果破损的性质未被识别，可以使用通用酶混合物。总之，在一步中一起加入酶不排除依次加入酶。

[0093]在多核苷酸复制导致聚合酶依赖性扩增时，长度小于约500个碱基(短至100个碱基对)的短扩增子或大于500个碱基或长至约50kb的长扩增子可被扩增(用PCR、RT-PCR和qPCR扩增)。其它类型的扩增可产生具有宽的尺寸范围的扩增子。例如，尺寸小至100个碱基或大至全基因组(人类为三十亿个碱基)的多核苷酸。这些扩增方法的例子包括：全基因组扩增、滚环扩增(RCA)和解旋酶依赖性扩增(HDA)。其它类型的多核苷酸合成包括引物延伸反应，如测序反应。所述方法的实施方式在分子生物学研究和解决应用生物学问题上具有广泛用途，其包括例如分析片段化和破损的DNA，诸如下列情况中发现的DNA：物证分析；生物考古学——其中分析来自远古来源的DNA是期望的；生物分类学——其中分析来自环境样品，如生命工程条码(Barcode of Life Project)所要求的DNA是期望的；及包括组织活检确定疾病的易感性或状态的诊断分析。其它用途包括：高保真度测序、基因装配、片段分析及克隆的一步法复制和连接。

破损的来源及程度

[0094]大多数分离的多核苷酸或体外复制的多核苷酸都受到某种程度的破损。多核苷酸的破损可能源自单个核苷酸的化学修饰或多核苷酸骨架的破裂。多核苷酸经受来自各种来源的破损，如包括甲醛和乙醇的化学试剂、环境因素、极端温度、氧化、干燥和紫外光。各种类型的破损包括：(a)由例如热、多核苷酸在乙醇中的储藏及暴露于环境中诸如水或极端pH值的因素引起的脱嘌呤或脱嘧啶破损；(b)由例如脱氨基作用、烷基化和氧化引起的单个核苷酸的修饰；(c)由例如热、多核苷酸在乙醇中的储藏及暴露于环境中诸如水或极端pH值的因素引起的切口和缺口；(d)由例如甲醛、光或环境因素引起的交联；(e)由例如由聚合酶造成的核苷酸错误插入引起的DNA错配；及(f)DNA的片段化。

[0095]在保藏的组织、干燥的标本或暴露于环境的多核苷酸中破损更严重。破损可以作为样品或其来源或其制备物老化的结果而发生。而且，破损可在多核苷酸合成方法应用的过程中发生，如在涉及高温步骤的PCR扩增过程中发生。因此，大多数核苷酸有一定程度的破损。当较长的扩增子被分析时，这种破损有较大的影响，因为扩增中遇到破损的可能性增大。

[0096]多核苷酸可以以各种方式受到破坏。不同的多核苷酸制备物经历不同类型的破损，取决于例如，该多核苷酸制备物在体外的储存和操作，含有多核苷酸的原核细胞、古细菌或真核细胞如何储存及从中提取多核苷酸的细胞的性质。合成的多核苷酸可在化学合成中受到破坏。

[0097]术语“多核苷酸”特别是指双链DNA、双链RNA、杂交DNA/RNA双螺旋、单链DNA和单链RNA。

[0098]“修复酶”特别是指参与多核苷酸修复过程的嗜冷、嗜温或嗜热的酶。例如，修复酶可引发在某个键的多核苷酸断裂，从而促进该多核苷酸破损区域的移除或单一核苷酸的移除。具有合成功能的酶，如连接酶和聚合酶，也是修复酶。在本发明的实施方式中，在反应混合物中提供了一种或多种选定的修复酶。破损的DNA经受所述反应混合物，以增强DNA的复制和/或扩增。“增强”是指与不存在修复混合物所观察到的比例相比，获得了复制或扩增产物与初始材料的改善的比例。

[0099]DNA修复酶在科技文献中被描述，例如，参见Wood，R.D.等的Mutat.Res.577(1-2)：275-83(2005)和Elsen，J.A.和Hanawalt，P.C.的Mutat.Res.435(3)：171-213(1999)。下面表1中提供了人类修复酶的列表。尽管没有在表1中描述，但是所列酶的同源体和其它功能上相关的酶包含在修复酶的描述中。上述任何酶可以是天然存在的、重组的或合成的。所述任何酶可以是天然的或体外产生的有多种活性的嵌合蛋白。搜索数据库以鉴别共享保守序列基序和有相似酶活性的相关酶的方法是本领域普通技术人员所知的。例如，NCBI的网站(www.ncbi.com)提供了保守结构域数据库。例如，如果在该数据库中搜索Endo IV的同源体，可调出74个序列匹配。(连接酶也见图6A-1到6A-9和6B-1到6B-2)。

[0100]用在酶混合物中修复受损DNA的“多核苷酸切割酶”特别是指一类修复酶并包括AP内切核酸酶、糖基化酶和负责碱基切除修复的裂合酶。

[0101]受损碱基可由DNA糖基化酶去除，DNA糖基化酶水解脱氧核糖部分与碱基间的N-糖基键。例如，大肠杆菌糖基化酶，UDG内切核酸酶，修复脱氨基的胞嘧啶，而来自大肠杆菌的两种3-mAde糖基化酶(TagI和TagII)修复烷基化剂引起的破损。

[0102]由糖基化酶引起的受损碱基去除得到的产物是必须被正确置换的脱嘌呤或脱嘧啶位点(AP位点)。这可由在与AP位点相邻的糖磷酸盐骨架上形成切口的内切核酸酶完成。该脱碱基的糖被移除并且一个新核苷酸由聚合酶/连接酶活性插入。这些修复酶在原核和真核细胞中发现。在这里具有应用价值的一些酶在一个分子中具有糖基化酶和AP内切核酸酶的活性。脱碱基位点可由AP内切核酸酶和/或AP裂合酶识别并酶切。第II类AP内切核酸酶在AP位点切割，留下可在多核苷酸聚合时使用的3′OH。此外，AP内切核酸酶可以移除连接在3′OH上抑制多核苷酸聚合的部分。例如，3′磷酸盐可被大肠杆菌内切核酸酶IV转化为3′OH。AP内切核酸酶可与糖基化酶联合工作。

[0103]糖基化酶底物的例子包括尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤(3-mAde)、甲酰胺基嘧啶(formamidopyrimidine)、7，8-二氢-8-氧代鸟嘌呤和羟甲基尿嘧啶。DNA中尿嘧啶的存在可因为由硫酸氢盐、亚硝酸或自发脱氨基引起的胞嘧啶错误插入或脱氨基而发生。次黄嘌呤一般是因为由亚硝酸或自发脱氨基引起的鸟嘌呤脱氨基而发生。在该上下文中，3-mAde是烷基化剂的产物。甲酰胺基嘧啶(FAPY)(7-mGua)是DNA甲基化试剂的一种常见产物。7，8-二氢-8-氧代鸟嘌呤是鸟嘌呤的一种诱变氧化产物。伽玛辐射产生4，6-二氨基-5-FAPY。羟甲基尿嘧啶由胸腺嘧啶的离子化辐射或氧化破损产生。

[0104]这些不同类型的破损可用上述及表1中描述的类型的糖基化酶修复。

[0105]另一种修复酶是裂合酶。这种酶可以切断多核苷酸中的磷酸二酯键。

[0106]AP内切核酸酶的例子属于4种类型。

(I)切割3′端→3′-OH+5′-P-并且具有相关的糖基化酶活性。

(II)切割5′端→3′-OH+5′-P

(III)切割3′端→3′-P+5′-OH

(IV)切割5′端→3′-P+5′-OH

[0107]已经分离得到若干显示出具有AP内切核酸酶或裂合酶及糖基化酶活性的酶，它们以协同的方式或顺序的方式协调作用。

[0108]目前发现的适合用于提高复制或扩增反应中产率或保真度至少一项的多核苷酸切割酶的例子包括由任何特定生物体或病毒但不限于它们衍生的以下类型的酶：1)AP内切核酸酶，如大肠杆菌Endo IV、Tth Endo IV和人类AP内切核酸酶；2)糖基化酶，如UDG、大肠杆菌AlkA和人类Aag；3)糖基化酶/裂合酶，如大肠杆菌Endo III、大肠杆菌Endo VIII、大肠杆菌Fpg、人类OGG1和T4嘧啶二聚体糖基化酶(T4pdg)；及4)裂合酶，如大肠杆菌Endo V。

[0109]Endo IV(也被称作Exo III)被公知能够在正常反应条件下在数小时内降解多核苷酸中感兴趣的破损区域外多核苷酸的很大一部分，因此未被包含在当前的酶混合物中，处理受损的多核苷酸。

[0110]出于当前目的的“聚合酶”是指具有聚合酶活性的酶，即使它可能具有其它活性。相同的一种或多种聚合酶可被自始至终用在修复和复制反应中，而不同的聚合酶可被用于该方法的不同阶段。

[0111]聚合酶的例子包括热稳定的细菌聚合酶，如Taq DNA和耐热嗜热菌(Thermus thermophilus)聚合酶，及古细菌聚合酶，如、Deep

和Pfu；对热不太稳定的酶，如Bst聚合酶、Thermomicrobium roseum聚合酶和嗜温聚合酶，如噬菌体聚合酶(如phi29聚合酶、T7聚合酶和T4聚合酶)、大肠杆菌聚合酶I和大肠杆菌聚合酶II、Y家族聚合酶，如大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、人类聚合酶κ、人类聚合酶η、SsO Dpo 4、Sac Dbh、Sce聚合酶ζ、人类聚合酶ι(MacDonald等，Nucleic Acids Res.34：1102-1111(2006)；Vaisman等，DNA Repair5：210(2006)；Ohmori等，Mol.Cell.8：7-8(2001)；Goodman Ann.Rev.Biochem.71：17-50(2002))，或它们的突变体、衍生物或修饰物。衍生物的例子包括Phusion^TM酶(Finnzymes，Espoo，芬兰)和将双链结合蛋白与来自一个或数个来源的聚合酶序列结合起来的其它聚合酶。

[0112]用在此处描述的酶混合物中的“连接酶”是指将多核苷酸单链的5′端连接到多核苷酸另一条单链的3′端的酶。这样的连接酶基本上可在所有真核、原核和古细菌细胞中找到，并且也能够在一些细菌噬菌体和病毒中找到。适当的连接酶的例子包括9°N连接酶、大肠杆菌连接酶、T4连接酶和Taq连接酶。其它连接酶包括LIGA(NP-416906.1)、Tth DNA LGS(AAA27486.1)、LIG3(NM-013975)和LIG4(NM-002312)。

[0113]在这里可能有利用价值的其它连接酶或类似连接酶的蛋白通过Blast搜索用T4连接酶或大肠杆菌连接酶搜索数据库而被显示出来(见图6A-1到6A-9和图6B-1及6B-2)，其中任何与这些已知连接酶共有至少6个连续氨基酸的酶可被包含在依据本发明实施方式的修复混合物中。

[0114]与已公开的连接酶与Exo III在不存在任何辅助因子的情况下的使用(美国公开号2005-0026147)相反，这里已经发现在包含连接酶的酶混合物中需要NAD⁺或ATP。更具体地，Taq连接酶和大肠杆菌连接酶需要NAD⁺，而T4连接酶和9°N连接酶需要ATP。

[0115]某些连接酶、聚合酶和内切核酸酶可从New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA获得，其中2005-2006产品目录的第107-117页被引入作为参考(连接酶在第102-108页)，并且在美国临时申请号60/717,296和国际公开号WO2005/052124中描述。此外，在预扩增混合物中，热稳定的修复酶可与不耐热的修复酶互换使用。热稳定的酶在高于40℃或更特别地，65℃或以上的温度中保持活性。

[0116]本发明的实施方式提高了由复制多核苷酸序列、扩增或其它合成反应得到的产物的产率或保真度。例如，当受损多核苷酸在预温育混合物和/或扩增过程中被用酶制备物(一种或多种)处理时，上述目的可以达到。

[0117]可以从上述预温育中获益的扩增方案包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)(美国专利号5,455,166和5,470,723)；解旋酶依赖性扩增(HAD)(美国公开号2004-0058378-A1)；转录调控的扩增(TMA)(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878(1990))；滚环扩增(RCA)，其产生多拷贝的序列，用于从体内滚环DNA复制修改的体外DNA扩增中(见，例如，Fire和Xu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4641-4645(1995)；Liu等，J.Am.Chem.Soc.118：1587-1594(1996)；Lizardi等，Nature Genetics 19：225-232(1998))；以及全基因组扩增法(Hawkins等，Current Opinions in Biotechnology 13：65-67(2002))。

[0118]“通用的”酶混合物现在被发现可用于在反应混合物中在复制或扩增前或复制或扩增过程中一般地修复破损的多核苷酸。按照本实施方式，在给定的情况下也有特定的有利的组合。

[0119]所述通用酶混合物包含连接酶和诸如NAD⁺或ATP的辅助因子。所述混合物优选地额外包括上述在诸如Thermopol(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)、AccuTaq LA DNA聚合酶缓冲液(Takara Bio Inc.，Shiga，日本)或任何其它常规Taq缓冲液的合适缓冲液中的聚合酶和AP内切核酸酶。在各种示例性的实施方式中，所述通用酶混合物包含大肠杆菌聚合酶I或Taq聚合酶，和AP内切核酸酶诸如嗜温Endo IV，如大肠杆菌内切核酸酶IV，或嗜热Endo IV，如TthEndo IV，以及连接酶，其选自大肠杆菌连接酶、Taq连接酶或古细菌连接酶诸如9°N连接酶。在一个特定的实施方式中，所述酶混合物包含1-100单位的Endo IV、0.05-0.25单位的大肠杆菌聚合酶I和5-500单位的Taq DNA连接酶，其适合在扩增前或扩增期间中在10-1000μL的反应体积中修复1-1000ng的DNA。应该理解，不同于上述通用混合物中特别说明的，内切核酸酶和聚合酶的浓度范围可随所用酶及反应温度而不同。然而，运用实施例中描述的分析可容易地确定所述浓度范围。例如，λDNA的标准制备物可按照实施例1进行热处理。所述DNA随后可以经受一些列含有连接酶和辅助因子的酶混合物的处理。额外的酶被滴定加入以便确定该酶在混合物中优选的浓度。用这种方法，可以最优化DNA修复。在每个样品扩增后，扩增的DNA的量可以通过凝胶电泳确定，揭示测试酶的优选浓度范围。

[0120]所述通用酶混合物可在多核苷酸扩增或其它合成前或期间使用。

[0121]如实施例所示，取决于破损的类型，期望用依赖DNA破损性质的额外的修复酶补充所述通用酶混合物。单个修复酶或修复酶混合物的用途可用实施例和附图中所述的分析方法确定，以确定其修复某一特定多核苷酸的适用性。

多核苷酸一般和特殊破损的修复

(a)一般破损

[0122]确定多核苷酸中破损的性质是很耗费时间的。如果怀疑多核苷酸有某种形式的破损，例如该多核苷酸扩增较差，优选的是不必要去分辨出破损或多个破损。在这些情况下，一种如上所述的通用酶混合物可被用于确定是否获得了改善的扩增。如果使用该通用混合物获得的改善足够，那么不需要进一步的行动。如果改善不足，额外的酶可被加入到这里所述的混合物中，直到获得优选的结果。所述整个分析可在诸如96孔盘的单一反应容器中完成。盘中的每个微孔对不同的酶混合物是可用的，其包括所述通用酶混合物加上被选择以解决下列每类破损的酶。

图12(流程图)和实施例中描述的分析提供了选择用于修复DNA的一般破损或未知破损的酶的方案。

(b)特殊破损

(i)AP位点

[0123]碱基的缺失是最常见形式的自发DNA破损。聚合酶和基于聚合酶的技术被这些脱碱基位点的存在不利影响。引物延伸反应的效率通过修复多核苷酸中发现的任何脱碱基位点而被提高。在一个实施方式中，这通过在脱碱基位点切割磷酸盐骨架的Endo IV活性实现。这在被切割的脱碱基位点的5′端的DNA片段上留下了可延伸的3′OH。它也在被切割的脱碱基位点的3′端的DNA片段上留下了脱氧核糖-5′-磷酸盐(dR5P)。聚合酶可以从游离的3′OH段延伸，用正确的核苷酸替代被切割的脱碱基位点。dR5P可被特异性靶向到dR5Ps的酶诸如哺乳动物聚合酶β或哺乳动物聚合酶β的8Kd N-末端部分去除(Deterding，J Biol Chem275：10463-71(2000))，被在某些聚合酶诸如大肠杆菌DNA聚合酶I中存在的flap内切核酸酶活性去除，或被独立的flap内切核酸酶诸如FENI去除。dR5P的去除也可通过flap内切核酸酶活性在该基团下游切割而发生。dR5P的去除和3′OH相邻的5′磷酸盐生成后，连接酶可以封闭这个切口以完成修复(见实施例1-3)。

(ii)修饰的核苷酸

(a)胸腺嘧啶二聚体

[0124]光照可以通过诱导嘧啶二聚体的形成来破损DNA。嘧啶二聚体阻断由诸如Taq DNA聚合酶的DNA聚合酶催化的DNA延伸反应，并因此阻止DNA扩增(Wellinger等，Nucleic Acids Res.24(8)：1578-79(1996))。因此，理想的是在扩增前或扩增中修复嘧啶二聚体。这可通过向通用酶混合物中加入嘧啶二聚体糖基化酶/裂合酶(Vande Berg等，J.Biol.Chem.273(32)：20276-20284(1998))而完成。DNA骨架在嘧啶二聚体的5′端被酶切，并留下可被DNA聚合酶延伸的3′羟基部分。在某些实施方式中，在3′羟基上的延伸和随后的形成以及接下来切割在DNA延伸期间产生的含破损的flap导致切口的产生，该切口被能够封闭该切口的酶封闭。flap的切割可由延伸性聚合酶，例如大肠杆菌聚合酶I，或由flap内切核酸酶的作用来完成(Xu，Y等，J.Biol.Chem.275(27)：20949-20955(2000)；Liu，Y等，Annu.Rev.Biochem.73：589-615(2004))。

(b)氧化破损，烷基化和脱氨基作用

[0125]由于不希望的核苷酸插入受损碱基的对面，错误可被引入DNA扩增反应的产物(Gilbert等，Am.J.Hum.Gen.72：48-61(2003)；Hofreiter等，Nucl.AcidsRes.29：4793-9(2001))。这些错误在扩增、克隆和测序需相同样品多次后可被发现。由于碱基破损导致的错误也可通过在用酶如UDG处理样品前和后比较序列数据来鉴定，其中UDG去除常见类型的突变DNA破损中的一种(Hofreiter等，Nucl.AcidsRes.29：4793-9(2001))。然而，用UDG处理在DNA中产生脱碱基位点，抑制通过引物延伸的DNA扩增。这可能会在UDG处理后引起DNA样品难以扩增。然后，该AP位点可被含有连接酶，并且优选地也包括AP内切核酸酶，和聚合酶的反应混合物修复。尿嘧啶的去除使得扩增反应中通常在该位点停止的聚合酶能够继续扩增DNA。例如，

聚合酶活性在含有尿嘧啶的DNA模板上被抑制。去除尿嘧啶的能力允许聚合酶具有提高的效率。

[0126]相反，这里显示了在含有连接酶和聚合酶的混合物中包含UDG能够被成功地用来提高多核苷酸复制或扩增的产物的产率和保真度。实施例12-14提供了多种包含UDG的有益的酶混合物的描述。

[0127]作为氧化破损产物的修饰的核苷酸也能够通过Fpg或hOGG从多核苷酸中去除留下阻断的多核苷酸，其中该阻断的多核苷酸可被诸如Endo IV的AP内切核酸酶修复。

[0128]复制或扩增前，酶预处理修复多核苷酸氧化破损的效率由实施例9显示，其中复制的多核苷酸产物的提高的保真度用含有连接酶、聚合酶、Endo IV和Fpg的酶混合物显示。

[0129]其它修饰的核苷酸如烷基化碱基或脱氨基碱基——其中胞嘧啶被转化为尿嘧啶、鸟嘌呤转化为黄嘌呤或腺嘌呤转化为次黄嘌呤，导致错误编码。这些修饰的核苷酸的去除是希望的。这些修饰的碱基可由上面讨论的UDG或由Alka或实施例10中描述的Aag去除。

(iii)交联

[0130]其它的核苷酸剪切修复(NER)蛋白(Minko等，Biochemistry44：3000-3009(2005)；Costa等，Biochimie 85(11)：1083-1099(2003)；Sanar，Ann.Rev.Biochem.65：43-81(1996))可用于修复由甲醛和体积大的加合物(bulky adduct)产生的破损，以及导致产生形成DNA-蛋白质交联的化学修饰的碱基的破损。大肠杆菌UvrA、UvrB，突变体UvrB、UvrC、UvrD或Cho中至少一种(Moolenar等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：1467-72(2002))可用于在受损位点周围的5′端和任选的3′端进行剪切。关于这些酶的性质及纯化方案的细节可从Zou，Y等，Biochemistry43：4196-4205(2004)中获得。修复过程可利用DNA聚合酶、DNA连接酶和任选地flap内切核酸酶完成。

[0131]如果NER酶(一种或多种)切割DNA但在该DNA中留下抑制引物延伸的加帽3′末端，则在5′剪切位点产生3′羟基可能是有用的。一个例子是如果NER酶(一种或多种)剪切DNA并留下3′磷酸盐。那么这将不能被已知的DNA聚合酶延伸，除非该3′磷酸盐被例如大肠杆菌内切核酸酶IV去除。

[0132]如果所述一种或多种NER酶切割DNA破损的5′和3′端，那么当新释放的寡核苷酸与该DNA分离时，破损被去除。聚合酶可以简单地填充DNA的剪切区域，留下切口，该切口可由连接酶随后封闭以完成修复。在某些情况下，聚合酶可以填充DNA并随后继续置换剩下的DNA链。在这些情况下，带有flapase活性的酶允许形成连接酶可封闭的切口。在一种或多种NER酶仅切割破损的5′端的情况下，聚合酶优选地置换原始的DNA链直到其通过破损部位，在该部位flapase切割DNA flap产生可连接的切口。所述flapase可在到达DNA破损部位前和后具有活性。优选地，聚合酶和flapase活性一直作用直到最终置换并去除DNA破损，留下可连接的切口，因此修复DNA模板。实施例7提供了有关上述方法的效力的例子。

(iv)切口、缺口和错配的多核苷酸

[0133]DNA骨架中的切口、缺口能够导致截短的引物延伸产物以及由单链区域的不期望的杂交形成嵌合物。异源双链DNA在多模板PCR和均一模板PCR中可能是个问题(Lowell，J.L.& Klein，D.A.Biotechniques 28：676-681(2000)；Thompson，J.R.等，Nucl.Acids Res.30(9)：2083-2088(2002)；Smith，J.& Modrich，P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6847-6850(1997))。例如，嵌合物可以在错配位点形成。

[0134]连接酶和聚合酶任选地与包含在通用酶混合物中辨识并切割异源双链位点的酶(T7 Endo I和其突变体)结合的效果导致DNA中切口、缺口、异源双链和嵌合物的修复，因此提高了多核苷酸复制和扩增反应的产率及保真度。实施例8显示了如上文所示使用T7Endo I和连接酶的有利效果。T7内切核酸酶或突变体与DNA比例的有用范围可通过在异源双链切割反应中包含DNA连接酶活性以将非特异切割的不良作用减到最小来扩展。该方法不需要DNA的量化并且避免了Lowell等在Biotechniques 28：676-681(2000)；和Smith等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6847-6850(1997)中要求的PCR反应后的额外步骤。

[0135]对某些多核苷酸，破损的性质可能已知。作为例子，酶混合物可根据修复特殊破损的上述(b)部分进行选择。当破损未知或来源混合时，可以使用这里描述的包含在实施例中的通用混合物。

DNA微阵列

[0136]DNA微阵列是用于分析DNA样品强有力的方法(Lipshutz等，CurrOpinion in Structral Biology 4：376-380(1994)；Kozal等，Nat Med 2(7)：753-9(1996))。从受损DNA的微阵列分析中得到的信息的数量和质量将得益于该受损DNA的首次修复。

实施例和附图的讨论

[0137]扩增后产物产率的提高被一般性显示和针对特殊来源的破损而显示：图1A-1D和4(热破损)，2A-2B(柠檬酸盐)，8A-8C(紫外辐射)，12、3、5和17(DNA、环境DNA、储存的磷虾DNA和洞穴熊DNA的一般破损)和9A-9B(经受不希望的异源双链形成)以及在不同温度下不同温育时间的影响(图13和14)。保真度的提高显示在图10A-10B和11中。图6A-1到6A-9，6B-1到6B-2提供了与Taq连接酶和T4连接酶序列同源的序列的细节。图7描述了Tth Endo IV的DNA序列，且图18-1到18-2描述了质粒pNEB0.920的序列。图15显示了多重片段化DNA可被修复，形成适合扩增产生扩增子的模板。克隆和转化用修复混合物的好处在图15和16中显示。

[0138]实施例1和图1A-1D显示了当模板DNA被破损超过了某一破损阈值时(如，约90秒热处理)，从PCR扩增中得到的扩增子的产率被显著地负面影响(见图1A)。这种破损对扩增的影响可以被逆转，并且扩增子产率可通过将DNA与酶混合物在扩增前温育而提高(见图1B、1C和1D)。此外，如果假定的“未破损”的DNA扩增子产率可通过加入所述的酶混合物而提高，那么实际上，该DNA被认为是已经破损的。

[0139]实施例1显示了酶混合物对DNA扩增的影响不依赖于单一类型的AP内切核酸酶或连接酶，而是相反地，来自多个可选来源的内切核酸酶或连接酶可以被使用。例如，热稳定的Tth Endo IV被发现与大肠杆菌内切核酸酶IV一样有效，并且大肠杆菌连接酶与热稳定的Taq连接酶一样有效。

[0140]实施例2和图2A-2B显示了另一种类型的DNA破损——脱嘌呤对扩增产率的负效应，其中脱嘌呤是由低pH值的存在引起的。而且，该实施例显示了酶混合物对DNA扩增的影响不依赖于单一类型的聚合酶，而是相反，多种可选来源的聚合酶可以被使用。例如，大肠杆菌聚合酶I可以被Taq DNA聚合酶或Taq和

DNA聚合酶的混合物替代，以产生提高的产率。

[0141]实施例3和图3显示了扩增产率的提高可在短(200bp)片段中观察到。实际上，扩增产率的提高应该能在从短至100个碱基到长至100kb的宽范围的DNA模板大小中观察到，并且应该相信甚至大于100kb的DNA扩增产率可以达到。

[0142]图3也显示了即使当DNA以粗物质形式储存(例如，在生物体的细胞内自身储存)被破损时，通过扩增前加入酶混合物，扩增产率明显提高。尽管所述酶混合物在扩增前加入到模板DNA中，但是当模板DNA用热稳定等效物的酶混合物在扩增或预扩增步骤中温育时，可见相似的产率效果。

[0143]实施例4和图4显示了单独的连接酶可提高扩增子产率，但是加入AP内切核酸酶进一步提高了产率。当连接酶、AP内切核酸酶和DNA聚合酶在扩增前被使用时，在本实施例中观察到最佳结果。而且，该实施例显示修复不依赖于DNA的大小。例如，对5kb和10kb扩增子可获得相似的结果。

[0144]实施例5和图5显示了使用连接酶从扩增中可达到提高的产率，所述连接酶可能是依赖NAD⁺或依赖ATP的酶，也显示了这种效果可在不限于单一来源的连接酶的情况下达到。图5显示了即使在预温育混合物中没有额外的酶使用时，Taq连接酶和T4连接酶在提高扩增产率上都有效。如果所述连接酶被加入到扩增混合物(如果是热稳定的)中，这种效果也被认为会产生。图5也显示了在扩增从在自然界中暴露于多种破损性试剂的土壤样品中直接获得的环境DNA时，该方法的优点。

[0145]图6A-1到6A-9，6B-1和6B-2和7是通用酶混合物中使用的酶或编码酶的序列的描述，通用酶混合物被这样命名是因为它可以在没有关于破损本身的特殊知识的情况下，广泛地应用于受损多核苷酸。尽管所述实施例是指DNA，多核苷酸的扩增或复制被更一般地设想。总之，即使在所有情况下没有被明确表述，扩增被发现有所改善的情况一般地也适用于增强多核苷酸的复制。

[0146]这里引用的所有参考文献，以及2005年10月20日提交的美国申请序列号11/255,290和2004年10月21日提交的美国临时申请序列号60/620,896，2005年1月24日提交的60/646,728和2005年4月21日提交的60/673,925，被引入作为参考。

实施例

实施例1：提高由热处理破坏的DNA的扩增子产率

[0147]开发出一种最优化所选试剂的使用以在扩增前修复DNA的试验。

各种程度热破损的产生

[0148]由热处理引起不同数量的DNA破损。这可用以下方式达到：100μLλDNA(NEB#N3011，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)以0.5mg/ml被等份加入到不同的试管中，在PE2700热循环仪中分别进行99℃热处理30秒、60秒、90秒、120秒和180秒。一份样品被用作没有预处理的扩增模板。

[0149]余下的受损DNA用酶混合物如下预处理：受损DNA模板在室温下在下列混合物中温育10分钟：

[0150]DNA(5ng、2ng和1ng)；

[0151]100μM dNTPs(NEB#M0447，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)；

[0152]1mM NAD⁺(Sigma#N-7004，Sigma，St Louis，MO)；

[0153]80单位Taq连接酶(NEB#M0208，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或40-100单位大肠杆菌连接酶(NEB#M0205S)；

[0154]0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I(E.coli polI，NEB#M0209，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)；

[0155]10单位大肠杆菌Endo IV(NEB#M0304，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或10单位Tth Endo IV；

[0156]1×Thermopol缓冲液(NEB#B9004，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)到96μL的终体积。

[0157]反应结束时，样品被转移到冰上并随后扩增。

DNA扩增反应

[0158]λDNA的扩增用以下引物按照Wang等Nucl.Acids Res.32：1197-1207(2004)的方法进行：CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG(L72-5R)(SEQ ID NO：1)和CCTGCTCTGCCGCTTCACGC(L30350F)(SEQ ID NO：2)

[0159]4μl扩增混合物被加入到96μl上述修复混合物中。所述扩增混合物在1×Thermopol缓冲液中含有100μM dNTPs，5单位Taq DNA聚合酶，0.1单位

(exo+)DNA聚合酶，5×10^-11M引物L72-5R和5×10^-11M引物L30350F。

[0160]为了修正任何酶储存缓冲液的效应，当一种修复酶被从反应中省略时，适当量的其储存缓冲液被加入到反应中。在所有情况下，扩增反应用以下参数在热循环仪中进行：95℃下20秒一个循环，接着是94℃下5秒、然后72℃下5分钟25个循环。被扩增的扩增子的大小为5kb。

[0161]DNA(5kb)扩增的结果通过1％琼脂糖凝胶电泳确定。6×加样染料(分子克隆：实验室手册，第三版，Sambrook和Russell编辑，冷泉港出版社，冷泉港，NY，2001，第5.4-5.17页(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd ed.，eds.Sambrook and Russell，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，2001，pp.5.4-5.17)被加入到100μl扩增反应物中。20μl该溶液与作为大小标准的1μg的2-log梯度(NEB#N3200，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)一起被点样到琼脂糖凝胶上。

[0162]每种样品的扩增DNA的量通过凝胶电泳进行比较，并且结果显示于图1A-D中。当样品在热处理后但扩增前用酶混合物处理时，获得明显提高的扩增产率(图1B、1C和1D)。

实施例2：用酶混合物预处理后，具有低pH诱导的脱碱基位点的DNA提高的扩增子产率

由脱碱基位点造成的各种程度损伤的产生

[0163]为了分析受损DNA修复的程度，首先用酸性pH引起不同数量的DNA损伤。这通过以下方式达到：

[0164]DNA用Ide，H.等在Biochemistry 32(32)：8276-83(1993)中描述的方法脱嘌呤。λDNA(NEB#N3011，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)用乙醇沉淀。该DNA以0.5mg/ml的浓度重悬浮在脱嘌呤缓冲液(100mM NaCl，10mM柠檬酸盐，pH5)中，并在70℃温育0、20、40、80、120和160分钟。随后该样品用乙醇沉淀并重悬浮在0.01M Tris，0.001M EDTA，pH8.0的溶液中。用缓冲液对照校准后，DNA浓度通过测量含DNA溶液的A₂₆₀而确定。

DNA用酶混合物预处理

[0165]受损DNA在室温下在下述混合物中温育10分钟：

[0166]DNA(120分钟低pH处理后的2.5ng的受损DNA)；

100μM dNTPs；

1mM NAD⁺；

80单位Taq连接酶；

0.1单位Taq DNA聚合酶或0.1单位大肠杆菌聚合酶I(NEB#M0209，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或0.1单位Taq∶0.002单位

聚合酶(NEB#M0254，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1×Thermopol缓冲液到终体积96μl。

[0167]上述混合物在室温下温育10分钟并随后在扩增前转移到冰上。

DNA扩增反应

[0168]扩增如实施例1所述进行，以产生5kb扩增子。通过用酶混合物处理含脱碱基位点的λDNA，相比阴性对照扩增子产率增加(图2A)。使用不同酶混合物进行一系列预处理的结果显示于图2B。所述酶混合物随聚合酶而变化(大肠杆菌聚合酶I或Taq∶)。

实施例3：从在防腐剂中储存后的完整生物体中提取的DNA提高的扩增子产率

[0169]如Bucklin，A和Allen，L.D.，Mol.Phylogenet.Evol.30(3)：879-882(2004)中所述，从北方磷虾(Meganyctiphanes norvegica)(krill)分离基因组DNA。所述磷虾储存在乙醇中约5年。

[0170]由酶混合物对磷虾DNA的预处理按如下进行：

50ng北方磷虾基因组DNA；

100μM dNTPs；

1mM NAD⁺；

40单位Taq连接酶；

0.5单位Taq DNA聚合酶，0.2单位(exo+)DNA聚合酶，或含有0.05单位Taq DNA聚合酶和0.001单位

(exo+)的Taq∶(exo+)混合物；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1×Thermopol缓冲液到终体积96μl。

[0171]在进行扩增步骤前，该反应在室温下温育15分钟。

DNA扩增反应

[0172]如Bucklin，A和Allen，L.D.，Mol.Phylogenet.Evol.30(3)：879-882(2004)所述，对应于52F和233R的扩增引物产生200bp的扩增子。

52F：TTTTTAGCAATACACTACACAGCAA(SEQ ID NO：3)

233R：ATTACGCCAATCGATCACG(SEQ ID NO：4)

[0173]引物以0.5μM的终浓度加入，并且每种dNTP的终浓度为200μM。1μl50∶1的Taq∶

混合物(5单位Taq DNA聚合酶和0.1单位

(exo+)DNA聚合酶被加入到反应中)随后被加入到每个反应中到终体积100μL。

[0174]对于对照反应(第1泳道)，没有加入Endo IV、Taq连接酶和预处理聚合酶。体积被相应调整。在修复酶被省略的反应中，适当体积的酶储存缓冲液被加入对照，以获得缓冲液效应。

[0175]循环条件如下：94℃下30秒，52℃下30秒和72℃下1分40秒40个循环。25μL(反应物的四分之一)被制备，点样到1％琼脂糖凝胶上，电泳，并如上文所述观察。

[0176]用上述酶混合物预温育样品后，观察到磷虾基因组DNA提高的扩增子产率(图3)。

实施例4：来自热破损DNA的大(10kb)扩增子提高的产率

[0177]如实施例1所述制备热破损DNA。λDNA在99℃加热180秒。

[0178]用酶混合物对受损DNA的预处理如下进行：

λDNA(1μg的180秒热处理的DNA)；

100μM dNTPs；

1mM NAD⁺；

80单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌聚合酶I；

100单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1×Thermopol缓冲液到体积96μL。

[0179]所述混合物在扩增前温育10分钟。

[0180]DNA扩增按实施例1所述进行，除了下面特别说明的。引物被加入到上述96μl预温育混合物中。引物L71-10R(序列GCACAGAAGCTATTATGCGTCCCCAGG)(SEQ ID NO：5)代替了实施例1中的L72-5R。iCycler的热循环仪程序(Bio-Rad，Hercules，CA)是：95℃下20秒1个循环，95℃下5秒、72℃下10分钟25个循环，和随后的72℃下10分钟1个循环。扩增子大小为10kb。

[0181]DNA如实施例1所述进行观察，除了以下例外。20μl的6×加样缓冲液被加入到100μl扩增反应物中。10μl的该溶液用水和1×加样缓冲液稀释到100μl。20μl的该溶液被点样到每条泳道中。该凝胶为0.8％的琼脂糖凝胶。结果显示于图4中。

实施例5：来自环境DNA(从土壤样品中提取)的DNA的改善的扩增产率

[0182]使用从MoBio Laboratories，Inc.，Carlsbad，CA购买的超净土壤DNA试剂盒(UltraClean Soil DNAKit)(目录号12800-50)从土壤中分离环境DNA。

用连接酶预处理DNA

[0183]含有从土壤中分离的0.6μg环境DNA和下述(a)和(b)中两种连接酶中的一种的100μl终体积形成反应混合物。该反应混合物随后在室温下温育15分钟。

[0184](a)1×Taq连接酶缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)和80单位Taq连接酶。

[0185](b)1×T4连接酶缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)和800单位T4连接酶(NEB#M0202，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

[0186]1μl反应混合物用在下述扩增反应中。

DNA扩增反应

[0187]用下述引物进行DNA扩增反应：GGGGGXAGAGTTTGATCMTGGCTCA(SEQ ID NO：6)和GGGGGXTACGGYTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO：7)(M＝C或A；Y＝C或T；X＝8-氧代-鸟嘌呤)。这些引物靶向具有1.6kb扩增子大小的16S rRNA。

[0188]所述50μl反应物含有10pmol的每种引物，1μl修复的环境DNA，200μM dNTPs，1×Thermopol缓冲液和1.25单位Taq DNA聚合酶。用以下循环参数进行扩增：94℃下5分钟1个循环，94℃下30秒、55℃下1分钟、72℃下1分40秒32个循环，随后72℃下5分钟1个循环。

[0189]按照实施例1所述进行凝胶电泳。结果显示于图5。

实施例6：紫外光破损的DNA的提高的扩增子产率

[0190]为了确定分析DNA修复有效性的条件，50μgλDNA(NEB#N3011，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH7.5)中稀释到50μg/ml的浓度，并用36J/m²的紫外光辐射0、10、20、30、40和50秒。

[0191]受损DNA的预处理用酶混合物按照如下进行：

[0192]所述受损DNA在室温下在下述混合物中温育15分钟：

DNA(50ng损伤0、10、20、30、40或50秒的λDNA)；

200μM dNTPs；

1mM NAD⁺；

400单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌Endo IV；

80单位或10单位T4 PDG(也称作T4 Endo V)(Trevigen，Gaithersburg，MD)；

1×Thermopol缓冲液

用水调整体积到50μl。

[0193]15分钟温育后，这50μl反应混合物被加入到50μl扩增溶液中。所述扩增溶液含有40pmol每种引物(如实施例1所述的L72-5R和L30350F或L72-2R(其DNA序列为CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG)(SEQ ID NO：8))，1×Thermopol缓冲液，1mM NAD⁺，200μM dNTPs，2.5单位Taq DNA聚合酶(NEB#M0267，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)和水到终体积50μL。将50μL修复反应物与50μl扩增溶液混合得到终体积100μl。

[0194]这100μl溶液被放入热循环仪中。

对于L72-5R和L30350F引物组合：94℃下5分钟1个循环；94℃下30秒，58℃下60秒，和72℃下4分钟30个循环；72℃下5分钟1个循环。

对于L72-2R和L30350F引物组合：94℃下5分钟1个循环；94℃下30秒，58℃下60秒，和72℃下2分钟30个循环；72℃下5分钟1个循环。

[0195]扩增产物的存在与否用溴化乙锭在1.8％的琼脂糖凝胶上观察。任意条带的大小与含有2-log梯度(NEB#N3200S，NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)大小标准的泳道比较。结果显示于图8。

实施例7：使用核苷酸剪切修复蛋白UvrA、UvrB和UvrC得到DNA的提高的扩增子产率

[0196]用含有涉及核苷酸剪切修复的蛋白质的酶混合物预温育样品后，确定磷虾基因组DNA的提高的扩增子产率。

[0197]储存DNA用酶混合物的预处理如下进行：

[0198]储存DNA在下列混合物中在4-37℃温育1-180分钟：

DNA：50ng北方磷虾基因组DNA；

100μM dNTPs；

1mMATP；

400单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌聚合酶I；

10nM大肠杆菌UvrA，250nM大肠杆菌UvrB(或突变体UvrB^*)，有或无50nM大肠杆菌UvrC；

1×Thermopol缓冲液到终体积96μl。

^*对于UvrB突变体，参见Zou，Y.等，Biochemistry 43：4196-4205(2004)。

[0199]DNA扩增反应按照实施例3所述进行。

实施例8：通过异源双链的酶切手段去除至少一条链上的错误核苷酸后，提高的DNA序列准确性

实验条件

[0200]A.向T7 Endo I中加入Taq连接酶被显示在DNA制备物中允许使用提高浓度的T7 Endo I，而没有随机降解DNA。

[0201]该试验依赖于用增加量的T7 Endo I处理含有十字形结构的超螺旋DNA。

[0202]0、1.6、3.1、6.2、12.5、25、50、100、200或400单位的T7 Endo I(NEB#M0302，England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)被加入到含有1μg的pUC(AT)(Guan，C.等，Biochemistry43：4313-4322(2004))和1×NEBuffer2(NEB#B7002S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的50μl反应物中。质粒pAT25tetA可被用来代替pUC(AT)(Parkinson，M.J.& Lilley，D.M.J.Mol.Biol.270：169-178(1997)和Bowater，R.P.，et.al.Biochemistry 33：9266-9275(1994))。另一组反应同时建立并使用与上述相同的组分，并添加1mM NAD⁺(Sigma目录号N-7004，Sigma，St.Louis，MO)和100单位Taq连接酶(使用浓度为100u/μl的NEB#M0208的原液，NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。所有的反应均在37℃温育60分钟。

[0203]结果通过将所述反应物在0.9％的TBE琼脂糖凝胶上跑胶，用溴化乙锭染色并用紫外光观察来分析(见图9A和9B)。在没有T7Endo I存在的情况下，pUC(AT)质粒在凝胶上产生2条带，对应于超螺旋形式(下方条带)和松弛环状形式(上方条带)。

[0204]T7Endo I将超螺旋的pUC(AT)解成松弛环状形式和跑在超螺旋和松弛环状形式中间的线状形式。在某种T7 Endo I∶DNA的比例下，产生弥散，表示T7Endo I通过非特异性酶活性降解了DNA。Taq连接酶的存在显著地增加了可用的T7 Endo I与DNA的比例。该比例通过用国际公开号WO 2005/052124中描述的突变的T7 Endo I替代T7 Endo I而进一步提高。

[0205]B.应用方法A，以从PCR反应物中去除异源双链。

[0206]从土壤中分离DNA以及所述纯化DNA的扩增按照实施例5进行，并任选地添加5单位T7 Endo I或其突变体。当加入T7 Endo I或其突变体时，增加额外的扩增循环(37℃下15分钟1个循环)。最后一步是允许T7内切核酸酶剪切形成的任意异源双链。

[0207]按照实施例1所述进行凝胶电泳。异源双链DNA按照Lowell，J.L.和Klein，D.A.Biotechniques 28：676-681(2000)的描述在凝胶上观察。在T7 Endo I或其突变体存在的情况下没有异源双链DNA的存在显示了T7 Endo I或其突变体与连接酶的效力。

[0208]单位定义随此处引用的每一种酶的产品描述在NEB目录，NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA中描述。例如，T7 Endo I或其突变体的单位定义是：在50μl的反应体积中，在37℃下1小时中，将超过90％的1μg超螺旋质粒转化为超过90％的线性DNA需要酶的量。

[0209]在连接酶存在时，T7 Endo I∶DNA的比例可以增大，而不增加DNA非特异性切割。

实施例9：氧化破损后DNA扩增反应提高的序列准确性

产生具有氧化破损的DNA

[0210]进行氧化破损的DNA是pWB407(Kermekchiev，M.B.等，Nucl.AcidsRes.31：6139-47(2003))。该破损是使用甲基蓝(MB)和可见光的组合如前所述产生的(Sattler等，Arch.Biochem.Biophys.376(1)：26-3(2000))。质粒DNA(200μg/ml，在蒸馏水中)被点样在拉伸的封口膜(parafilm stretches)上(每滴50μl)。MB被加到液滴中至终浓度为0到50(0、3、6、12.5、25和50)μg/ml(终体积100μl)的范围。带有这些拉伸封口膜的盘被置于冰上并用1×100W的灯照射8分钟。该MB-光-处理的DNA被沉淀、干燥并随后重悬浮在50μl的TE缓冲液(pH8.0)中。通过260nm的吸光度确定最终的DNA浓度。

DNA扩增条件

[0211]含有lacZ基因的pWB407的部分用引物316-138，TGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGC(SEQ ID NO：9)，和316-137，CGAAAGCTTTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGA(SEQ ID NO：10)扩增。引物316-138和316-137分别基于前述引物Kfd-29和H3Bla34(Kermekchiev，M.B.等，Nucl.Acids Res.31：6139-47(2003))。该100μl PCR反应物含有10或50ng的模板DNA，如果合适指出，和40皮摩尔每种引物。所用循环条件随用于扩增的热稳定聚合酶而变化。

[0212]当使用Taq DNA聚合酶(NEB目录号M0267S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)时，循环条件有初始的94℃下5分钟1个循环的变性步骤，随后94℃下30秒、58℃下60秒和72℃下3分30秒进行30个循环，以及最终72℃下5分钟。

[0213]当使用Phusion^TMDNA聚合酶(NEB目录号F-530S，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)时，循环条件有初始的98℃下30秒1个循环的变性步骤，随后98℃下10秒、62℃下30秒和72℃下1分30秒进行30个循环，以及最终72℃下5分钟。

[0214]该反应的结果通过在1.6％琼脂糖凝胶上加样25μL反应物，准备，电泳并且如上述观察进行分析。所用标记物是2-log DNA梯度(NEB目录号M3200S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。

扩增准确度的确定

[0215]从pWB407模板进行DNA扩增的准确度按照Barnes等，Gene112：29-35(1992)和Kermekchiev等，Nucl.Acids Res.31：6139-47(2003)所述确定。含有lacZ基因的扩增子从经受不同量的氧化破损的质粒pWB407产生。所述氧化破损按上文所述使用甲基蓝进行。PCR反应按上文所述使用50ng模板进行。循环后，10单位的限制性内切核酸酶，DpnI，被加入到每份100μLPCR反应物中并在37℃温育2小时。该步骤消除了初始的模板质粒。接着，所得的扩增产物用酚/氯仿萃取并用异丙醇沉淀(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd ed.，eds.Sambrook and Russell，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，2001，pp.6.25，A8.12-A8.24)。沉淀产物在水中重悬浮并用制造商(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)推荐的条件使用限制性内切核酸酶StyI和HindIII切割。该DNA消化反应通过加热到65℃20分钟使HindIII和StyI酶失活而停止。该限制性消化产物用microcon YM-100柱(Millipore，Billerica，MA)纯化以去除短的DNA片段。

[0216]总体积50μl的修复反应混合物含有10或50ng的pWB407扩增子+/-甲基蓝温育。所述修复反应物含有20mM Tris-HCl(25℃下pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，1mM NAD⁺，200μM dNTPs(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)和各种修复酶混合物。

[0217]以50μL的总体积分别使用或以多种组合使用的修复酶混合物是：

0.4单位Fpg，NEB目录号M0240S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)；

200单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1mMNAD⁺；

100μM dNTPs；

1×Thermopol缓冲液。

[0218]所述反应在25℃温育15分钟。温育后，50μL的PCR混合物(20mMTris-HCl(25℃时pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％TritonX-100，1mM NAD⁺，200μM dNTPs (dATP、dTTP、dCTP和dGTP)以及2.5单位Taq DNA聚合酶(NEB目录号M0267S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或1单位Phusion^TM DNA聚合酶被加入到50μL修复反应物中，并且该新溶液经受PCR的热循环条件。从这些反应中得到的扩增子按照上面对其它扩增子所述进行纯化和限制性酶消化。

[0219]该扩增子被克隆进pWB407质粒中。质粒pWB407通过用限制性内切核酸酶StyI和HindIII消化，随后与1单位/μg南极磷酸酶(antarctic phosphatase)的DNA(NEB目录号M0289S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)在37℃温育30分钟而制备。去磷酸化的pWB407载体骨架通过琼脂糖凝胶电泳纯化。用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)(Qiagen，Valencia，CA)进行凝胶提取。

[0220]在30μL反应体系中用大约0.1μg载体DNA和大约0.5μg扩增子将消化的扩增子连接到制备的pWB407质粒中。按照制造商推荐的条件(New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)用T4连接酶进行连接。连接产物被电转化进大肠杆菌菌株WB441中(Barnes，W.Gene 112：29-35(1992))。所用的选择指示平板(selectiveindicator plate)是含有50μg/ml氨苄青霉素和80μg/ml Xgal的LB平板。铺平板前，细菌在营养丰富的培养基中37℃培养1小时，以允许氨苄青霉素抗性的表达。缺少连接酶处理的对照转化产生零菌落。在37℃下一天后，和25℃下一或两天后，对蓝色菌落记分。结果显示于图10A-10B和11中。

实施例10：提高脱氨基破损后DNA扩增反应的序列准确度

产生脱氨基DNA

[0221]进行脱氨基的DNA是pWB407(Kermekchiev等，Nucl.Acids Res.31：6139-6147(2003))。该破损按照Yan，W.等在J.Virol.77(4)：2640-50(2003)中的描述用亚硝酸的随机诱变引发。亚硝酸可以将DNA的鸟嘌呤脱氨基为黄嘌呤，胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，以及将腺嘌呤脱氨基为次黄嘌呤。

[0222]质粒DNA(2mg)用pH4.6的1M醋酸盐缓冲液中的0.7M NaNO₂处理。该反应通过加入4倍体积冰冷的1M Tris-HCl(pH7.9)在不同的时间点终止。该质粒DNA用乙醇沉淀，干燥并随后重悬浮在100μL的TE缓冲液中。

预处理反应物以修复脱氨基的碱基

[0223]以50μL的总体积分别使用或以多种组合使用的修复酶混合物是：

[0224](a)

1单位人Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

2单位Endo III(NEB目录号M0268S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

2单位Endo V(NEB目录号M0305S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

2单位UDG(NEB目录号M0280S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

200单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1mM NAD⁺；

100μM dNTPs；

1×Thermopol缓冲液。

[0225](b)

2单位UDG(NEB目录号M0280S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

200单位Taq DNA连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1mM NAD⁺；

100μM dNTPs；

1×Thermopol缓冲液。

[0226](c)

200单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1mM NAD⁺；

100μM dNTPs；

1×Thermopol缓冲液。

[0227](d)

1单位人Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

200单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1mM NAD⁺；

100μM dNTPs；

1×Thermopol缓冲液。

[0228](e)

1单位人Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

2单位UDG(NEB目录号M0280S)，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

200单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1mM NAD⁺；

100μM dNTPs；

1×Thermopol缓冲液。

[0229](f)

1单位人Aag，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；

200单位Taq连接酶；

0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I；

10单位大肠杆菌内切核酸酶IV；

1mM NAD⁺；

100μM dNTPs；

1×Thermopol缓冲液。

[0230]扩增反应条件和扩增准确度的测定按照实施例9所述进行。

实施例11：单位定义

嗜热连接酶的单位

[0231]一个单位定义为在50μl总反应体积中，1μg BstE II消化的λDNA在45℃下15分钟内产生50％连接所需的酶量。Taq连接酶可从New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA获得。

嗜温连接酶的单位

[0232]一个单位定义为在20μl总反应体积中，HindIII酶切的λDNA(0.12μM的5′DNA末端浓度，300μg/ml)在16℃下30分钟内产生50％连接所需的酶量。大肠杆菌连接酶可从New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA获得。

AP内切核酸酶的单位

[0233]一个单位定义为在10μl总反应体积中，在37℃下1小时内切割1pmol含有单一AP位点的34-聚体寡核苷酸双链体所需的酶量。

嗜温聚合酶的单位

[0234]一个单位定义为在50μl总反应体积中，在37℃下30分钟内，用33μM包含[³H]-dTTP的dNTPs和70μg/ml变性的鲱鱼精DNA将10nmol的dNTP插入不溶于酸的物质所需的酶量。

嗜热聚合酶的单位

[0235]一个单位定义为在50μl总反应体积中，在75℃下30分钟内，用200μM包含[3H]-dTTP的dNTPs和200μg/ml被激活的小牛胸腺DNA将10nmol的dNTP插入不溶于酸的物质所需的酶量。嗜热的聚合酶——Taq聚合酶和古细菌聚合酶可从New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA获得。

[0236]嗜热的UDG、Fpg、Endo III和Endo VIII的单位定义与所列嗜温等同物(NEB目录，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的单位定义相同。

实施例12：DNA测序反应使用前修复DNA以提高测序反应的灵敏度

[0237]测序反应的灵敏度意欲表示测序前具有正确序列的模板DNA量产生降低的背景噪音和提高的信号。这使得更长和/或更完整的序列读取成为可能。序列读取的提高的保真度是额外的益处。诸如以下描述的修复混合物的有益用途可在一般的测序方法中观察到。例如，测序方法包括454测序法、单分子测序法、Sanger测序法和Maxam-Gilbert测序法。

[0238]两份DNA样品在DNA修复前和修复后进行DNA测序。所述的两份DNA样品用紫外处理40秒(见实施例6)并且λDNA在25μg/ml甲基蓝的存在下暴露于光线中。

[0239]在DNA测序反应使用之前，待测序的DNA在允许所述修复酶具有活性的条件下与一种或多种修复酶混合物接触。例如，0.5μg用于测序的模板DNA与NEB Thermopol缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)(1×浓度的Thermopol缓冲液含有20mM Tris-HCl，pH8.8，25℃；10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100)混合至1×浓度，并在室温下与DNA修复混合物(200单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、1单位T4pdg、5单位Endo IV、2.5单位Endo VIII、0.1单位Fpg和任选地0.5单位大肠杆菌UDG)温育15分钟。被修复的DNA被立即用于测序或在DNA测序前用商业试剂盒(例如，Qiagen，Inc.，Valencia，CA试剂盒)纯化和浓缩。所述测序反应可以用传统的Sanger测序反应或用美国公开号2005/0100932、美国专利号6,897,023或Margulies等在Nature 437(7057)：376-80(2005)中描述的方法进行。

[0240]作为用修复混合物预温育的结果，测序反应的灵敏度和结果的保真度被提高。

实施例13：修复受损DNA的多酶修复混合物在单一温度下有效

[0241]λDNA用紫外线辐射处理30秒(见实施例6)。L72-5R(SEQ ID NO：1)和L30350F(SEQ ID NO：2)引物被选择以在有预修复或无预修复的情况下从紫外处理的λDNA中扩增5kb的扩增子。所述DNA修复混合物含有200单位/μL TaqDNA连接酶、0.1单位/μL大肠杆菌聚合酶I、1单位/μL T4pdg、15单位/μL EndoIV、0.5单位/μL大肠杆菌UDG、2.5单位/μL Endo VIII和储存在25℃下pH7.5的20mM Tris-HCl中的0.1单位/μL Fpg、100mM NaCl和50％甘油。50ng 30秒紫外处理的λDNA被加入到热循环仪试管中，每个试管含有1×Thermopol缓冲液、100μM dNTPs和0.5mM NAD⁺。1μL修复酶混合物被加入到8只试管中的4只，并且用水将所有试管补充到终体积47μL。两只含有修复酶的试管和两只缺少所述酶的试管在室温下温育15分钟。剩余溶液在4℃温育过夜。所示温育时间过后，引物(1μM)、dNTPs(100μM)和2.5单位Taq DNA聚合酶被加入到每个热循环试管中，并且所述溶液被置于MyCycler热循环仪中，进行以下程序(Bio-Rad，Hercules，CA)：95℃下2分钟，1个循环；95℃下10秒，60℃下30秒和72℃下5分钟，25个循环；72℃下5min，1个循环；以及4℃下保持。25μL每种反应物在1％的琼脂糖凝胶上分析。

[0242]与其它的发现(美国公开号2006/0014154)——需要使用多个不同温度以达到修复——相反，紫外损伤的DNA与上述修复酶混合物在室温下温育15分钟或4℃温育过夜产生正确大小的复制产物(图13A和13B)。

实施例14：含有多个尿嘧啶的质粒DNA的修复和使用Vent

DNA聚合酶扩增

[0243]质粒pNEB0.92U被从大肠杆菌CJ236(NEB# E4141S，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)纯化。该序列在图18中显示。因为大肠杆菌CJ236缺少尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)和尿嘧啶N-糖基化酶，所以该质粒在其整个序列中含有随机分布的尿嘧啶。古细菌聚合酶Vent

DNA聚合酶被含有尿嘧啶的模板抑制。从pNEB0.92U DNA扩增920个碱基的扩增子在有预先修复和没有预先修复的情况下用引物S1224S(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)(SEQ ID NO：12)和S1233S(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)(SEQ IDNO：13)检查。所述DNA修复混合物含有200单位/μL Taq DNA连接酶、0.1单位/μL大肠杆菌聚合酶I、1单位/μL T4 pdg、15单位/μL Endo IV、0.5单位/μL大肠杆菌UDG、2.5单位/μL Endo VIII和储存在25℃下pH7.5的20mM Tris-HCl中的0.1单位u/μL Fpg、100mM NaCl和50％甘油。1μL所述修复酶混合物被加入到4只热循环试管中的2只，每只试管中含有0.5ng pNEB0.92U、1×Thermopol缓冲液、100μM dNTPs和0.5mM NAD⁺。所有试管用水补充到终体积45μL。该反应溶液在室温下温育15分钟，这之后引物(终浓度：0.4μM)、dNTPs(终浓度：100μM)和1单位Vent

DNA聚合酶被加入到每个试管中。该溶液被置于MyCycler热循环仪中，运行以下程序：95℃下2分钟，一个循环；95℃下10秒，65℃下30秒和72℃下1分钟，25个循环；72℃下5分钟，一个循环；随后4℃下保持。25μL每种反应物通过电泳在1％琼脂糖凝胶上检验。

[0244]在没有去除尿嘧啶的情况下，用Vent

DNA聚合酶从pNEB0.92U的扩增产生勉强可检测到的希望大小的产物。用修复混合物对pNEB0.92U的处理显著提高了使用VentDNA聚合酶从该质粒中产生的扩增子的量(图14)。

实施例15：从DNA片段得到的提高的扩增子产率

[0245]该反应中的模板是一组20个重叠的合成单链寡核苷酸，平均大小约为45个核苷酸。所述寡核苷酸序列显示在下面：

NEB寡核苷酸编号316-219(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

GGCGGCCTCGAGGCGAAACGCCGCAACTGCTTTCCGGGCGATACC(SEQ ID NO：14)

NEB寡核苷酸编号316-220(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

CGGCACGCCATCAATCTGCACCAGAATGCGGGTATCGCCCGGAAA(SEQID NO：15)

NEB寡核苷酸编号316-221(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

ATTGATGGCGTGCCGCAGAAAATTACCCTGCGCGAACTGTATGAA(SEQID NO：16)

NEB寡核苷酸编号316-222(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

CATGTTTTCATAGCGTTCATCTTCAAACAGTTCATACAGTTCGCG(SEQID NO：17)

NEB寡核苷酸编号316-223(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

CGCTATGAAAACATGGTGTATGTGCGCAAAAAACCGAAACGCGAA(SEQ ID NO：18)

NEB寡核苷酸编号316-224(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

GGTTTCCAGGTCAATGCTATACACTTTAATTTCGCGTTTCGGTTT(SEQ IDNO：19)

NEB寡核苷酸编号316-227(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

ATTGACCTGGAAACCGGCAAAGTGGTGCTGACCGATATTGAAGAT(SEQID NO：20)

NEB寡核苷酸编号316-228(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

CAGATGATCGGTCGCCGGCGCTTTAATCACATCTTCAATATCGGT(SEQID NO：21)

NEB寡核苷酸编号316-229(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

GCGACCGATCATCTGATTCGCTTTGAACTGGAAGATGGCCGCAGC(SEQID NO：22)

NEB寡核苷酸编号316-230(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

CAGCACCGGATGATCCACGGTGGTTTCAAAGCTGCGGCCATCTTC(SEQID NO：23)

NEB寡核苷酸编号316-233(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

GATCATCCGGTGCTGGTGTATGAAAACGGCCGCTTTATTGAAAAA(SEQID NO：24)

NEB寡核苷酸编号316-234(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

TTTATCGCCTTCTTTCACTTCAAACGCGCGTTTTTCAATAAAGCG(SEQID NO：25)

NEB寡核苷酸编号316-237(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

AAAGAAGGCGATAAAGTGCTGGTGAGCGAACTGGAACTGGTGGAA(SEQ ID NO：26)

NEB寡核苷酸编号316-238(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

TTTCGGGTTATCCTGGCTGCTGCTGCTCTGTTCCACCAGTTCCAG(SEQID NO：27)

NEB寡核苷酸编号316-239(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

CAGGATAACCCGAAAAACGAAAACCTGGGCAGCCCGGAACATGAT(SEQ ID NO：28)

NEB寡核苷酸编号316-240(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

ATATTTAATGTTTTTAATTTCCAGCAGCTGATCATGTTCCGGGCT(SEQ IDNO：29)

NEB寡核苷酸编号316-247(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

AAAAACATTAAATATGTGCGCGCGAACGATGATTTTGTGTTTAGCCTG(SEQ ID NO：30)

NEB寡核苷酸编号316-248(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

TTAATAATCACGTTATGATATTTTTTCGCGTTCAGGCTAAACACAAA(SEQID NO：31)

NEB寡核苷酸编号316-265(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

TAACGTGATTATTAACGAAAACATTGTGACCCATGCGTGCGATG(SEQ IDNO：32)

NEB寡核苷酸编号316-266(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)：

GCCGCCCTGCAGACCGGTCAGATCTTCATCGCCATCGCACGCATGGG(SEQ ID NO：33)

[0246]装配反应包括两部分：装配步骤和扩增步骤。对于装配步骤，标准反应物为50μL并包含70nM每种寡核苷酸、100μM dNTP、0.5mM NAD⁺、25℃下pH7.5的10mM Tris-HCl、2mM MgCl₂和50mM NaCl。没有酶被加入到对照反应中。第一组实验反应物还含有400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg和20单位Endo IV。第二组反应物含有第一组反应物中使用的酶和以1∶1的β蛋白∶核苷酸摩尔比例加入的λβ蛋白(Kmiec等，J.Biol.Chem.256：12636-12639(1981)；Rybalchenko，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：17056-17060(2004))。第三组反应物含有400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg、20单位Endo IV、0.3mM ATP，以及3∶1的核苷酸与RecA摩尔比。所述RecA来自大肠杆菌(NEB目录号M0249L，New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)。第四组反应物含有400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg、20单位Endo IV、0.3mMATP、3∶1的核苷酸与RecA摩尔比，以及1∶1的β蛋白∶核苷酸摩尔比。每组反应物中的甘油含量被控制。所述反应混合物在室温下温育30分钟。

[0247]室温温育后，5μL装配反应物使用200μM dNTPs、500nM寡核苷酸316-219和316-266、6mM MgSO₄、1单位Vent

DNA聚合酶，以及1×Thermopol缓冲液扩增，终体积100μL。所述反应物被混合并置于MyCycler(Bio-Rad，Hercules，CA)中并且使用以下热循环仪递降程序：94℃下2分钟(1个循环)；94℃下30秒，72℃-62℃下(每个循环降低1℃)30秒，72℃下45秒(10个循环)；94℃下30秒，62℃下30秒，72℃下45秒(20个循环)；72℃下5分钟(1个循环)，以及4℃下保持。每组反应以一式两份进行。11μL的10×样品缓冲液被加入到每份样品中，并且将25μL加样到1％琼脂糖凝胶上进行电泳。

[0248]结果显示于图15。当装配反应物不含加入的修复蛋白时，在扩增步骤后没有检测到扩增产物。然而，当修复蛋白被加入到装配反应物时，从扩增步骤中得到正确的620bp扩增子。包含λβ蛋白和/或大肠杆菌RecA进一步提高了扩增子的产率。可以得出结论，在DNA模板包含片段的系统中，包含DNA修复蛋白导致产生扩增子的能力。而且，当那些DNA修复蛋白中的一些已知参与DNA重组中时，该效果被增强。

实施例16：以受损的质粒DNA提高大肠杆菌的转化效率

[0249]质粒pUC19(GenBank登录号L09137)被加样到1％琼脂糖凝胶上并在溴化乙锭的存在下电泳，直到该质粒移动到凝胶中。凝胶中的DNA被用254nm的紫外光处理60秒。在紫外暴露过程中，含有pUC19质粒的凝胶块被切割。所述质粒用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen gel extraction kit)(Qiagen，Valencia，CA)从凝胶块中提取。25μL终体积的30ng被紫外辐射的DNA或未被辐射的DNA，用在1×Termopol缓冲液(NEB#B9004S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的缓冲液中的50单位大肠杆菌DNA连接酶(NEB#M0205S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、5单位T4pdg和20单位Endo IV处理，所述缓冲液添加NAD⁺(Sigma产品号N-7004，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和dNTPs(NEB#N0447S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)分别达到0.5mM和100μM。所述反应物在使用该DNA转化大肠杆菌DH-5α(NEB#C2991H，NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)前在室温下温育15分钟。作为对照，紫外辐射和未辐射的DNA在没有添加酶存在的情况下按上述处理。DH-5α细胞用被修复酶处理或未经处理的紫外辐射和未辐射的质粒DNA转化。转化通过在质粒DNA存在的情况下热休克大肠杆菌进行。50μL大肠杆菌和质粒在42℃温育30秒之前，在冰上温育30分钟。随后，该转化反应物在将所述细胞铺到含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上之前被置于冰上2分钟。铺有不同稀释率的每种转化物的LB琼脂平板被置于37℃培养箱内过夜，以确定所述质粒的转化效率。

[0250]当与用修复酶混合物处理的未损伤pUC19质粒比较时，经受紫外辐射且未被修复的质粒pUC19具有显著降低的转化效率(见图16)。

实施例17：同时进行DNA修复和平齐，用于PCR、克隆或固定化所需的随后连接

[0251]DNA文库通常由环境、组织或细胞培养物制备(Brady，S.F.等，Appliedand Environmental Microbiology，70(11)：6865-6870(2004)；分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)，第1卷，Ausubel，F.等(编者)，John Wiley& Sons，Inc.，Hoboken，NJ；第5章：“重组DNA文库的构建(Construction ofRecombinant DNA Libraries)”(2004)；Courtois，S.等，Applied and EnvironmentalMicrobiology，69(1)：49-55(2003)；美国专利号6,444,426)。这些文库常规地通过用超声降解、酶处理或喷雾作用剪切希望来源的DNA，制备DNA末端并连接该混合物到寡核苷酸或质粒DNA来产生(Weinmann，A.S.等，Molecular and CellularBiology 21(20)：6820-6832(2001))。与寡核苷酸的连接允许随后的PCR或固定在含有与所连接寡核苷酸互补的DNA序列的阵列上。与质粒的连接允许在异源宿主中的增殖。文库的一种最新用途是染色质免疫沉淀(Guenther，M.G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(24)：8603-8608(2005)；Ren，B.等，Genes Dev.16：245-256(2002)；和Odom，D.T.等，Science 303：1378-1381(2004))。作为制备用于平末端连接的DNA末端的一部分，研究人员通常使用连接酶，如T4DNA连接酶。然而，这里提供了一种酶混合物，它不仅能够修复DNA可能在纯化、制备和储存过程中获得的损伤，也能够产生平末端。该酶混合物包括连接酶和校读聚合酶以及使得酶具有活性所需要的任何辅助因子。优选地，所述混合物包括连接酶、校读聚合酶、脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶、UDG、FPG和T4pdg。

[0252]作为一个例子，染色质免疫沉淀(Chromatin IP(ChIP))如上文所述使用E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F5或E2F6的抗体在HeLa细胞的DNA上进行。(Weinmann，A.S.Molecular and Cellular Biology 21(20)：6820-6832(2001))。ChIP富集的DNA的克隆如上文所述(Weinmann，A.S.Molecular and Cellular Biology21(20)：6820-6832(2001)；http://mcardle.oncology.wisc.edu/farnham)。单独使用T4DNA聚合酶以平齐DNA被至少含有连接酶和校读聚合酶的组合的酶混合物取代。例如，DNA与用0.5mM NAD⁺和100μM dNTPs补充的1×Thermopol缓冲液中的400单位Taq DNA连接酶、0.1单位大肠杆菌聚合酶I、20单位大肠杆菌内切核酸酶IV、5单位T4PDG在室温下温育15分钟。在连接步骤之前，末端被平齐且被修复的DNA可以在75℃温育20分钟以使大肠杆菌聚合酶I失活。

[0253]校读聚合酶与至少一种连接酶的混合能够使DNA末端平齐，以随后连接到引物或质粒。

实施例18：片段化DNA的提高的扩增子产率。从片段化DNA产生较大DNA片段用于下游处理，如扩增、DNA测序、微阵列分析和杂交分析

[0254]0.1-1000ng片段化的DNA与重组/DNA退火熟练蛋白(annealingproficient protein)，如在标准反应缓冲液的大肠杆菌RecA(NEB#M0249S，NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA；West，S.C.Ann.Rev.Biochem.61，603-640(1992))和/或λβ蛋白(Rybalchenko，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(49)：17056-17060(2004)；Kmeic，E.和Holloman，W.K.，J.Biol.Chem.256(24)：12636-12639(1981))和任何所需辅助因子一起温育，终体积为5-1000μL。标准反应缓冲液的一个例子是25℃下pH7.5的10mM Tris-HCl、2mM MgCl₂和50mM NaCl。当使用RecA时，1mM ATP包含在标准反应中。与RecA和/或λβ蛋白温育同时或在RecA和/或λβ蛋白温育后温育之后，所述DNA也与修复混合物接触，该修复混合物包含至少DNA连接酶活性、DNA聚合酶活性和任何所需的辅助因子，即ATP、NAD⁺和dNTPs。所述修复混合物包含400单位Taq DNA连接酶和0.1单位大肠杆菌聚合酶I，以及另外，加入5单位T4pdg、20单位Endo IV、0.5单位大肠杆菌UDG、2.5u/μLEndo VIII和/或0.1单位Fpg。用修复蛋白温育前，DNA片段可被热变性并且该温度降至低于39℃。例如，反应缓冲液中的DNA可被加热到98℃5分钟，随后冷却到低于39℃。标准反应体积为5到1000μL并且在4-37℃的温育时间为1到60分钟。典型地，RecA或β蛋白以0.5∶1到5∶1的核苷酸与蛋白摩尔比例使用。

[0255]对上述方法的修改包括用热稳定的等效物替代RecA和/或β蛋白。这些蛋白的一些例子是ttRecA(Kato R和Kuramitsu S.，Eur J Biochem.259(3)：592-601(1999))，Taq RecA、Tma RecA和Apy RecA(Wetmur，J.G.等，J.Biol Chem.269(41)：25928-35(1994))。热稳定蛋白的使用意味着热稳定RecA或类β蛋白在变性步骤期间可与DNA混合。该蛋白活性所需的任何辅助因子均被包含在内。此外，上述修复酶在变性前或变性后被加入。注意对于热稳定的重组蛋白(RecA或类β蛋白)，在低于39℃的温度下加入非热稳定修复酶之前，所述蛋白可在45-75℃下加入反应混合物1-60分钟，以允许获得最优的活性。

[0256]接着，所述被修复的DNA可被用于随后的过程，如PCR。例如，作为一个测试系统，人类基因组DNA用声波处理来形成片段，并进行尺寸分级以使得平均片段大小集中在约200bp。500ng尺寸分级的材料按上述处理。5-100ng这种修复材料的滴定被用于PCR反应，所述PCR反应使用从未损伤人类基因组DNA中可靠地产生1、2和4kb扩增子的引物。引物对的例子是：

DNMT-R：

GGGGCACCTTCTCCAACTCATACT(SEQ ID NO：34)，

DNMT-1Fb：

Cctcatttggggaggggttatct(SEQ ID NO：35)，

DNMT-2Fc：

Cctgaaacaaggttgtggcatagc(SEQ ID NO：36)，和

DNMT-4Fb：

Gagtgagttgaaagtgctccataca(SEQ ID NO：37)。

相同模板滴定用片段化的DNA进行。当比较未修复和已修复的DNA时，已修复的模板允许以比模板DNA的量低至少两倍的量在琼脂糖凝胶上产生可见的扩增子，用紫外光和溴化乙锭观察。

[0257]RecA和/或类β蛋白活性连同至少连接酶和聚合酶活性的使用导致在比未修复DNA低的模板量下检测到PCR扩增子。

实施例19：DNA损伤修复后，储存的古洞穴熊组织样品的DNA扩增

[0258]与现今的材料相反，从古老的骨骼中提取的DNA显示出不同类型的破损。最常见的破损类型是由导致提取的DNA的平均分子长度缩短的单链断裂，以及诸如辐射和活性氧物质的非酶侵蚀引起的片段形成。(见：Hoss等，NucleicAcids Res.24(7)：1304-7(1996))。修复古老DNA(aDNA)的破损对改善提取DNA的效用是重要的。

[0259]古DNA按照

在Proc Natl Acad Sci USA 86(6)：1939-43(1989)中的描述提取。330bp洞穴熊DNA(～44,000年前)的扩增在有预先修复和无预先修复的情况下使用引物CB F1(CTATTTAAACTATTCCCTGGTACATAC)(SEQ IDNO：38)和CB R1(GGAGCGAGAGGTACACGT)(SEQ ID NO：39)进行。所述DNA修复混合物包含200单位/μL Taq DNA连接酶、0.1u/μL大肠杆菌聚合酶I、1单位/μL T4pdg、15单位/μL Endo IV、0.5单位/μL大肠杆菌UDG、2.5单位/μL EndoVIII和0.1单位/μL Fpg，并且储存在25℃下pH7.5的20mM Tris-HCl、100mM NaCl和50％甘油中。向4只热循环试管中的2只加入1μL修复酶混合物，每只装有2μlaDNA、1×Phusion^TM聚合酶缓冲液、100μM dNTPs和0.5mM NAD⁺的。所有的试管用水补充至终体积45μL。该反应溶液在室温下温育15分钟，这之后向每只试管中加入引物(到0.4μM)、dNTPs(到100μM)和1单位Phusion^TMDNA聚合酶。所述溶液被置于MyCycler热循环仪中(Bio-Rad，Hercules，CA)，运行以下程序：98℃下30秒，一个循环；98℃下10秒，58℃下20秒和72℃下20秒，30个循环；72℃下5分钟，一个循环；随后4℃下保持。被修复的PCR扩增的DNA和对照PCR扩增的DNA(未修复)使用嵌套引物被立即用于第二轮PCR扩增。用嵌套引物进行的扩增反应使用1×Taq Master Mix(目录号M0270S，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)，2μL先前的扩增物和终浓度为0.2μM的引物CB F1(CTATTTAAACTATTCCCTGGTACATAC)(SEQ ID NO：40)和CB F3(GCCCCATGCATATAAGCATG)(SEQ IDNO：41)。总反应体积为50μL。所述反应按照上文所述通过将5μl的每种反应物加样到1％琼脂糖凝胶上，准备，电泳和观察来分析。

[0260]洞穴熊骨骼样品中线粒体DNA的量用TaqMan

测试(AppliedBiosystems，Foster City，CA)用引物5′-AAAATGCCCTTTGGATCTTAAA-3′(SEQ IDNO：43)和5′-ACTGCTGTATCCCGTGGG-3′(SEQ ID NO：44)估计。

[0261]扩增的DNA被立即用于DNA测序方法中或进行DNA纯化和浓缩。纯化后，该DNA进行DNA测序(见实施例12)。

[0262]在嵌套PCR中使用Phusion DNA聚合酶和Taq聚合酶从洞穴熊DNA的扩增，在一份样品(CB3A)中产生具有期望扩增子大小的可检测到的产物。用修复混合物的处理从样品CB3B中产生另一种扩增子。对从处理和未处理的洞穴熊DNAs(CB3B样品)得到的扩增子进行的序列分析，将揭示用修复混合物处理是否明显帮助去除与DNA修饰关联的PCR扩增错误，如在Hoss等，Nucleic AcidsRes.24(7)：1304-7(1996)中所述的。

[0263]用修复酶混合物对洞穴熊DNA模板的处理允许Phusion^TMDNA聚合酶更有效地产生希望的扩增子并去除PCR扩增错误(图17)。

序列表

<110>新英格兰生物实验室公司

T.C.埃文斯

B.斯拉塔科

陈立新

R.瓦伊斯维拉

管楚狄

R.库切拉

<120>新英格兰生物实验室公司

<130>NEB-256-PCN-2

<150>PCT/US2006/013513

<151>2006-04-21

<150>PCT/US2005/038281

<151>2005-10-20

<160>44

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

cgaacgtcgc gcagagaaac agg 23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

cctgctctgc cgcttcacgc 20

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

tttttagcaa tacactacac agcaa 25

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

attacgccaa tcgatcacg 19

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

gcacagaagc tattatgcgt ccccagg 27

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>8-氧代-鸟嘌呤

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>m＝c或a

<400>6

ggggggagag tttgatcmtg gctca 25

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>8-氧代-鸟嘌呤

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>y＝c或t

<400>7

ggggggtacg gytaccttgt tacgactt 28

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

ccatgattca gtgtgcccgt ctgg 24

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>9

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagc 29

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>10

cgaaagcttt caaggatctt accgctgttg aga 33

<210>11

<211>813

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>耐热嗜热菌(Thermus thermophilus)内切核酸酶IV

<400>11

atgccgcgct acgggttcca cctttccatc gccgggaaaa agggcgtggc cggggcggtg 60

gaggaggcca ccgccctcgg cctcaccgct ttccagatct tcgccaaaag cccgcggagc 120

tggcgcccaa gggccctctc cccggccgag gtggaggcct tccgcgcctt aagggaggcc 180

tccgggggcc tccccgccgt gatccacgcc tcctacctgg tcaacctggg ggcggagggg 240

gagctttggg agaagagcgt ggcgagcctg gcggacgacc tggagaaggc cgccctcctc 300

ggggtggagt acgtggtcgt ccaccccggc tcgggccgcc ccgagcgggt caaggaaggg 360

gccctcaagg ccctgcgcct cgccggcgtc cgctcccgcc ccgtcctcct cgtggagaac 420

accgccgggg gcggggagaa ggtgggggcg cggtttgagg agctcgcctg gctcgtggcg 480

gacacccccc tccaggtctg cctggacacc tgccacgcct acgccgccgg gtacgacgtg 540

gccgaggacc ccttgggggt cctggacgcc ctggaccggg ccgtgggcct ggagcgggtg 600

cccgtggtcc acctcaacga ctccgtgggc ggcctcggaa gccgcgtgga ccaccacgcc 660

cacctcctcc agggaaagat cggggagggg ctcaagcgcg tcttcttgga cccgaggctc 720

aaggaccggg tcttcatcct ggaaaccccc aggggaccgg aggaggacgc ctggaacctc 780

cgggtcctca gggcctggct cgaggaggcc taa 813

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

agcggataac aatttcacac agga 24

<210>14

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>14

ggcggcctcg aggcgaaacg ccgcaactgc tttccgggcg atacc 45

<210>15

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>15

cggcacgcca tcaatctgca ccagaatgcg ggtatcgccc ggaaa 45

<210>16

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>16

attgatggcg tgccgcagaa aattaccctg cgcgaactgt atgaa 45

<210>17

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>17

catgttttca tagcgttcat cttcaaacag ttcatacagt tcgcg 45

<210>18

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>18

cgctatgaaa acatggtgta tgtgcgcaaa aaaccgaaac gcgaa 45

<210>19

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>19

ggtttccagg tcaatgctat acactttaat ttcgcgtttc ggttt 45

<210>20

<211>46

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>20

attgacctgg aaaccggcaa agtggtgctg accgatatta gaagat 46

<210>21

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>21

cagatgatcg gtcgccggcg ctttaatcac atcttcaata tcggt 45

<210>22

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>22

gcgaccgatc atctgattcg ctttgaactg gaagatggcc gcagc 45

<210>23

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>23

cagcaccgga tgatccacgg tggtttcaaa gctgcggcca tcttc 45

<210>24

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的

<400>24

gatcatccgg tgctggtgta tgaaaacggc cgctttattg aaaaa 45

<210>25

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>25

tttatcgcct tctttcactt caaacgcgcg tttttcaata aagcg 45

<210>26

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>26

aaagaaggcg ataaagtgct ggtgagcgaa ctggaactgg tggaa 45

<210>27

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>27

tttcgggtta tcctggctgc tgctgctctg ttccaccagt tccag 45

<210>28

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>28

caggataacc cgaaaaacga aaacctgggc agcccggaac atgat 45

<210>29

<211>45

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>29

atatttaatg tttttaattt ccagcagctg atcatgttcc gggct 45

<210>30

<211>48

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>30

aaaaacatta aatatgtgcg cgcgaacgat gattttgtgt ttagcctg 48

<210>31

<211>47

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>31

ttaataatca cgttatgata ttttttcgcg ttcaggctaa acacaaa 47

<210>32

<211>44

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>32

taacgtgatt attaacgaaa acattgtgac ccatgcgtgc gatg 44

<210>33

<211>47

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>33

gccgccctgc agaccggtca gatcttcatc gccatcgcac gcatggg 47

<210>34

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>34

ggggcacctt ctccaactca tact 24

<210>35

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

cctcatttgg ggaggggtta tct 23

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

cctgaaacaa ggttgtggca tagc 24

<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>37

gagtgagttg aaagtgctcc ataca 25

<210>38

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>38

ctatttaaac tattccctgg tacatac 27

<210>39

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<223>引物

<400>39

ggagcgagag gtacacgt 18

<210>40

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>40

ctatttaaac tattccctgg tacatac 27

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>41

gccccatgca tataagcatg 20

<210>42

<211>3474

<212>DNA

<213>未知的

<220>

<223>质粒pNEB0.92U

<400>42

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt cctgcagggt ttaaacgctg aggagacata tggccgccga 2280

gtctcagtta aaacgtgtga tcgaaacgct gcgccgtctg ggtattgaag aggtgctgaa 2340

actggaacgt cgtgatcctc agtatcgcgc tgtttgcaat gtggtcaagc gtcatggcga 2400

aactgtgggc agccgtttag ctatgttaaa cgccctgatt tcatatcgcc tgaccggtaa 2460

gggtgaggag cattgggaat atttcggcaa atatttcagt cagttagaag tgattgatct 2520

gtgccgtgat ttcttaaaat atattgagac cagcccgttc ctgaaaatcg gtgtcgaggc 2580

gcgcaagaaa cgcgcgttaa aggcctgcga ctacgtccct aacttggaag acttgggcct 2640

gaccctgcgt caattaagcc acatcgttgg tgcacgccgt gagcagaaga cgttggtctt 2700

cacaatcaag atcctgaact atgcatatat gtgcagccgc ggtgttatcg cgtgttgccg 2760

ttcgatattc caattcctgt ggattaccgt gttgcacgct tgacctggtg cgccggtctg 2820

atcgatttcc cgccggagga ggccttgcgc cgctacgagg ctgtgcagaa aatctgggat 2880

gccgtggcgc gcgaaactgg tattcctcca ttgcacttgg acaccctgtt atggttggcc 2940

ggtcgcgcgg tgctgtatgg tgaaaacctg catggtgtgc cgaaagaggt catcgctctg 3000

ttccaatggc gcggcggctg ccgtccgcct agcgagtaaa ccccctcagc ttaattaagg 3060

cgcgcctgag ctcgaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 3120

gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 3180

aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc 3240

tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 3300

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 3360

ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 3420

tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcga 3474

<210>43

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>43

aaaatgccct ttggatctta aa 22

<210>44

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>44

actgctgtat cccgtggg 18

Claims

1.通过修复受损多核苷酸来提高复制或扩增产物的保真度和产率中的至少一项的方法，其包括：

在没有内切核酸酶(Endo)VI存在的情况下，将所述多核苷酸在含有连接酶和作为辅助因子的NAD⁺或ATP至少一种的反应混合物中温育；以及

提高所述复制或扩增产物的保真度和产率中的至少一项。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸从选自下列的来源获得：天然来源、保藏的生物材料、法医学证据、生物起源的古老材料、组织活检切片和化学合成。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述破损选自脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点、诱变的核苷酸、修饰的核苷酸、切口、缺口、DNA-DNA或DNA-蛋白质交联、DNA-RNA交联和RNA-RNA交联。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接酶是热稳定的连接酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接酶选自Taq连接酶和大肠杆菌(E.coli)连接酶，并且辅助因子是NAD⁺。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含T7 Endo I或其突变体。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含聚合酶和至少一种AP内切核酸酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种AP内切核酸酶包括从大肠杆菌、人类或嗜热菌属(Thermus)的种获得的内切核酸酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种AP内切核酸酶是大肠杆菌内切核酸酶IV。

10.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述聚合酶选自Taq聚合酶、大肠杆菌聚合酶和古细菌聚合酶或其突变体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述古细菌聚合酶选自Pfu、

Deep

9°North、KOD或Pwo聚合酶。

12.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述聚合酶是Y聚合酶家族的成员。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚合酶选自大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、人聚合酶κ、人聚合酶η、Sso Dpo4、Sac Dbh、Sce聚合酶ζ和人聚合酶ι。

14.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含T4嘧啶二聚体糖基化酶。

15.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)。

16.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含UvrA、UvrB、UvrC、UvrD和Cho中的至少一种。

17.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含EndoVIII、Endo V或Endo III中的至少一种。

18.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含UDG和Aag。

19.根据权利要求1所述的方法，其中扩增通过选自：PCR扩增、解旋酶依赖性扩增、链置换扩增、滚环扩增和全基因组扩增的方法进行。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA，所述扩增是RT-扩增。

21.根据权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA，所述反应混合物包含加入到在10-1000μL中1-1000ngDNA的1-100单位大肠杆菌内切核酸酶IV、0.05-0.25单位大肠杆菌聚合酶I和5-500单位Taq连接酶。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸的扩增能够在聚合酶链反应中产生大小范围是50个核苷酸到100,000个核苷酸的扩增子。

23.根据权利要求1所述的方法，其中在所述反应混合物中温育所述多核苷酸在单一温度下完成，以便提高产率或保真度中的至少一项。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述单一温度为室温，所述温育时间小于1小时。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述单一温度为4℃，所述温育时间约为8-12小时。

26.试剂盒，包含：一种或多种酶，其中至少一种所述的酶是连接酶，所述一种或多种酶被配制为添加到多核苷酸制备物中以增强所述多核苷酸的复制；以及其使用说明。

27.一种组合物，其包含：

用于与多核苷酸在单一温度下温育的有效量的连接酶、聚合酶和不包括Endo VI的AP内切核酸酶，以便与不存在所述组合物的情况下复制的多核苷酸相比，提供复制多核苷酸的产率和保真度中至少一项的提高。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中在10-500μL的体积中，所述AP内切核酸酶以1-100单位的浓度存在，所述聚合酶以0.05-5单位存在，并且所述连接酶以5-500单位存在，以在预扩增混合物中使用。

29.根据权利要求27所述的组合物，适于1-1000ng DNA增强的复制。

30.根据权利要求27所述的组合物，其中所述AP内切核酸酶是II型AP内切核酸酶。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述AP内切核酸酶是大肠杆菌内切核酸酶IV。

32.根据权利要求27所述的组合物，其中所述聚合酶是大肠杆菌聚合酶I。

33.根据权利要求27所述的组合物，进一步包含T4嘧啶二聚体糖基化酶。

34.根据权利要求33所述的组合物，进一步包含Fpg。

35.根据权利要求27所述的组合物，进一步包含UvrA、UvrB、UvrC、UvrD和Cho中至少一种。

36.根据权利要求27所述的组合物，进一步包含Endo VIII、Endo V或EndoIII中至少一种。

37.根据权利要求27所述的组合物，UDG和Aag中至少一种。

38.克隆或测序多核苷酸片段的方法，其包括：

利用根据权利要求27所述的组合物修复所述多核苷酸片段中的序列错误；和

克隆或测序所述多核苷酸片段。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述组合物能够补平所述多核苷酸片段的末端，以便克隆进载体中。

40.提高复制或扩增的多核苷酸产率的方法，其包括：

(a)至少获得第一对和第二对引物，其中所述第二对引物在与所述多核苷酸杂交时是嵌套在所述第一对引物中的；

(b)使所述多核苷酸经受根据权利要求27所述的组合物；

(c)用所述第一对引物扩增所述多核苷酸；

(d)用所述第二对引物扩增步骤(c)的产物；和

(e)获得扩增的多核苷酸的提高的产率。

41.根据权利要求38或40所述的方法，其中所述组合物包括：连接酶、聚合酶、pdg、内切核酸酶IV、内切核酸酶VIII、Fpg和任选地UDG。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述连接酶是Taq DNA连接酶，所述聚合酶是大肠杆菌聚合酶I，所述PDG是T4pdg，并且所述Endo IV、Endo VIII、Fpg和任选地UDG从大肠杆菌中获得。

43.多核苷酸测序的方法，其包括：

(a)将所述多核苷酸与权利要求27所述的组合物接触；和

(b)对所述多核苷酸测序。

44.复制或扩增片段化的DNA的方法，其包括：

(a)将所述片段化的NDA与权利要求27所述的组合物接触；

(b)任选地加入重组的感受态蛋白；和

(c)扩增或复制所述片段化的DNA。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述重组感受态蛋白是RecA或β蛋白。