CN111979259A - 用于基因高效率表达的氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于基因高效率表达的氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体，属于基因工程领域。本发明筛选了氧化葡萄糖酸杆菌内源质粒可能的复制蛋白，并利用该类内源复制蛋白构建一系列的穿梭载体，将其转入氧化葡萄糖酸杆菌内进行验证，发现其转化效率和广宿主质粒pBBR‑MCS相比有较大的提高；并将穿梭载体用于蛋白的表达，使氧化葡萄糖酸杆菌的L‑山梨糖产量比广宿主载体的表达量提高7.8％，并使底物转化时间缩短了27.2％。本发明大大提高了对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的效率，实现对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的不同需求。

Description

用于基因高效率表达的氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体

技术领域

本发明涉及用于基因高效率表达的氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体，属于基因工程领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌是是一种严格需氧的革兰氏阴性菌，属于葡萄糖菌属，醋酸杆菌科，该类细菌主要栖息于高糖环境，如水果，花卉和蜂蜜中。葡萄糖酸杆菌具有以下几个特征使其在工业上应用广泛:(1)能快速且不完全氧化糖、醇类底物生成相应的醛、酮和酸；(2)膜结合脱氢酶催化活性位点一般位于周质空间，进行催化反应时底物不需要跨膜运输，而相应的产物则直接分泌到培养基中；(3)催化反应具有高度的区域选择性和立体选择性。氧化葡萄糖酸杆菌的特征决定了其在工业生产中的重要的应用，例如生产维生素C(vitamin C)，L-酒石酸(L-tartaric acid)，二羟基丙酮(DHA)，米格列醇(miglitol)和5-酮基-果糖(5-ketofructose)等。

质粒是一种独立于染色体之外的可以自主复制或双链环状DNA分子，它一般含有独特的复制子结构，其决定了该质粒在细胞内的稳定性和拷贝数等性质。质粒在遗传工程领域是作为基因的克隆或者表达载体，其可以帮助外源基因转化进入宿主细胞，从而对宿主细胞进行改造。40多年前，当重组DNA技术在发展起来时，质粒载体已经成为分子生物学领域的关键工具。Cohen等人在1973年首次在体外构建了具有生物学功能的细菌质粒，此后，质粒成为在宿主细胞内传递和操纵外源DNA的载体，开创了代谢工程的新纪元，人们利用不断开发的质粒载体改造微生物代谢途径合成新产品，如2-KLG和柚皮素等。随后，随着DNA高通量化学合成的发展，研究人员提出了系统生物学和合成生物学概念，一系列不同的质粒载体在合成生物学和代谢工程中有重要的作用，如维生素C生物合成。

目前，应用于氧化葡萄糖酸杆菌中的表达载体主要是pBBRI-MCS系列质粒或其衍生质粒，该系列质粒在属于广宿主质粒，在氧化葡萄糖酸杆菌内的稳定性及转化效率都比较差。由于氧化葡萄糖酸杆菌内可以高效转化的质粒较少以及氧化葡萄糖酸杆菌内共表达多个质粒载体缺少，这严重限制了它在工业生产中的应用潜力。本发明基于的高通量测序技术，通过对几株不同氧化葡萄糖酸杆菌基因组测序，得到氧化葡萄糖酸杆菌内野生质粒的序列，通过生物信息学分析，预测其可能的复制起始位点，并利用不同的复制起始位点构建了一系列不同性质的穿梭载体，利用这一系列不同的穿梭载体，将大大提高我们对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的效率，充分发挥其在工业生产的潜力。

发明内容

本发明的第一个目的是提供氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体，所述穿梭载体上具有如SEQ ID NO.1～15所示的基因。

在一种实施方式中，所述穿梭载体以pMD19-T Simple Vector载体为穿梭载体骨架。

本发明的第二个目的是提供含有所述穿梭载体的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌JM109为宿主，向宿主细胞中转化所述氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是重组氧化葡萄糖酸杆菌。

在一种实施方式中，所述重组氧化葡萄糖酸杆菌以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004、氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003、氧化葡萄糖酸杆菌1.049、氧化葡萄糖酸杆菌621H或氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC 1.110为宿主。

在一种实施方式中，所述穿梭载体具有如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.25任一所示的抗生素抗性基因。

本发明的第三个目的是提供所述穿梭载体的构建方法，是将SEQ ID NO.1～15任一所示的基因连接至T载体上。

在一种实施方式中，采用Gibson组装将T载体片段与SEQ ID NO.1～15任一所示的基因连接。

本发明的第四个目的是提供所述穿梭载体在表达蛋白中的应用。

在一种实施方式中，所述蛋白为荧光蛋白；所述荧光蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.16-SEQ ID NO.20任一所示。

本发明的第五个目的是提供SEQ ID NO.27～41任一所示的质粒复制蛋白在提高目的基因表达量方面的应用。

在一种实施方式中，所述目的基因是内源基因或外源基因。

在一种实施方式中，所述目的基因是参与微生物代谢的基因。

在一种实施方式中，所述基因为编码山梨醇脱氢酶的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.26所示。

本发明的第六个目的是提供一种利用所述重组菌发酵生产山梨糖的方法，是将重组菌活化后接种至发酵培养基，在30℃，220rpm条件下进行发酵培养。

在一种实施方式中，所述方法将重组菌在种子培养基中活化后获得种子液，再将种子液接种至发酵培养基，在28～30℃，200～220rpm条件下发酵培养。

在一种实施方式中，所述发酵培养基每升含有D-山梨醇140-160g，酵母膏0.4-0.6g，液体玉米浆1.5-2.5g，轻质碳酸钙0.5-1g。

在一种实施方式中，所述种子培养基每L含有：D-山梨醇140-160g，酵母膏6-8g，碳酸钙2-4g。

在一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：D-山梨醇140-160g，酵母膏0.4-0.6g，液体玉米浆1.5-2.5g，轻质碳酸钙0.5-1g，消泡剂0.2g。

在一种实施方式中，所述种子液是由甘油管直接接种三角瓶培养48h后得到一级种子，一级种子OD₆₀₀约2-3；按照接种量1％进行转接，培养24h后得到发酵种子液，OD₆₀₀约2-3；将发酵种子液按接种量为10％转接到发酵罐，35℃发酵。

本发明还要求保护所述氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体在食品、生物领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明筛选了氧化葡萄糖酸杆菌内源质粒可能的复制蛋白，并利用该类内源复制蛋白构建一系列的穿梭载体，将其转入氧化葡萄糖酸杆菌内进行验证，发现其转化效率和广宿主质粒pBBR-MCS相比有较大的提高；并将穿梭载体用于蛋白的表达，其中，G.oxydansp15-P_tuf-sldAB1的L-山梨糖产量(148.9g/L)分别比G.oxydans pBBR-P_tuf-sldAB1(138.1g·L^-1)和野生菌(131.9g·L^-1)提高7.8％和12.9％。而在底物转化时间上，G.oxydans p15-P_tuf-sldAB1(16h)分别比G.oxydans pBBR-P_tuf-sldAB1(22h)和野生菌(25h)缩短了27.2％和36％。本发明大大提高了对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的效率，实现对氧化葡萄糖酸杆菌遗传改造的不同需求。

附图说明

图1：氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体构建流程图。

图2：氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003表达荧光蛋白；A：野生型氧化葡萄糖酸杆菌明视野；B：野生型氧化葡萄糖酸杆菌荧光视野；C：含有穿梭载体的氧化葡萄糖酸杆菌明视野；D：含有穿梭载体的氧化葡萄糖酸杆菌荧光视野。

图3：不同穿梭载体在氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003内荧光蛋白表达强度；A：p1-mcherry；B：p2-mcherry；C：p3-mcherry；D：p4-mcherry；E：p5-mcherry；F：p6-mcherry；G：p7-mcherry；H：p8-mcherry；I：p9-mcherry；J：p10-mcherry；K：p11-mcherry；L：p12-mcherry；M：p13-mcherry；N：p14-mcherry；O：p15-mcherry；P：野生型对照对照。

图4：不同穿梭载体在氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003内的稳定性；A：p1-mcherry；B：p2-mcherry；C：p3-mcherry；D：p4-mcherry；E：p5-mcherry；F：p6-mcherry；G：p7-mcherry；H：p8-mcherry；I：p9-mcherry；J：p10-mcherry；K：p11-mcherry；L：p12-mcherry；M：p13-mcherry；N：p14-mcherry；O：p15-mcherry。

图5：不同抗性的穿梭载体在氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003内表达不同的荧光蛋白；A为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌EGFP荧光视野；B为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌YFP荧光视野；C为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌EBFP荧光视野；D为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌mCherry荧光视野；F为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌Cyan荧光视野；G为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌白光视野。

图6：穿梭载体在其他氧化葡萄糖酸杆菌内表达荧光蛋白；A：含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌621H明视野；B：含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌621H荧光视野；C：含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.110明视野；D：含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.110荧光视野；F：含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.049明视野；G：含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.049荧光视野。

图7：氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体转化效率比较；A：广宿主载体pBBR-MCS2转化的菌落数；B：构建的穿梭载体p3-Kana转化的菌落数。

图8：重组菌过过表达sldAB1山梨醇脱氢酶发酵生产L-山梨糖；-□-/-■-G.oxydans p15-P_tuf-sldAB1，-○-/-●-G.oxydans pBBR-P_tuf-sldAB1，-△-/-▲-wildG.oxydans。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基(g/L)：酵母抽提物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0，相应的固体培养基加入2％琼脂条，121℃灭菌15min。

山梨醇培养基(g/L)：山梨醇50，酵母抽提物10，121℃灭菌15min。

(二)荧光强度测定方法：将表达载体转入到氧化葡萄糖酸杆菌内，待菌体长出单菌落以后，挑取单菌落接种到48孔板培养48h,随后，测定菌体荧光强度和OD₆₀₀。利用多功能酶标仪Cytation 3imaging Reader system(BioTek,美国伯腾仪器有限公司)，mCherry测定条件为激发光587nm、发射光610nm，野生型G.oxydans做对照。最终以所测得荧光强度与细胞OD₆₀₀的比值定义为穿梭载体荧光蛋白的表达强度。

(三)质粒稳定性检测：将含有质粒(p1-Kana-p15-Kana)的G.oxydans WSH-003在不含有Kana的山梨醇培养基连续传，每一次接种量为1％，在30℃，220rpm摇床内培养36h后再连续传代，一共传代5次，取菌液做梯度稀释，将其先涂到无抗的山梨醇平板内，生长48h，待长出单菌落，将其单菌落转接到含有kana抗生素的山梨醇平板上，30℃培养36h，观察菌株生长情况，记录菌株生长个数，计算质粒稳定性(％)＝平板上的菌落数(A)/平板上的一共接种个数(B)×100％。

(四)氧化葡萄糖酸杆菌荧光测定：将氧化葡萄糖酸杆菌在在平板活化后，将其接种到含有6种抗生素的山梨醇培养基内，培养48h后，通过激光共聚焦显微镜(德国徕卡SPD8)拍照，检测荧光蛋白的表达情况。

实施例1氧化葡萄糖酸杆菌穿梭质粒的构建

根据氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003，葡萄糖酸杆菌WSH-004，葡萄糖酸杆菌1.049，和氧化葡萄糖酸杆菌621H基因组测序的结果，通过对氧化葡萄糖酸杆菌内源质粒基因分析，获得如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示的15个编码复制蛋白的基因序列。

设计用于扩增复制蛋白序列的引物对(如表1所示)。以氧化葡萄糖酸杆菌总基因组DNA为模板，以该引物对进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，1min-3min进行(根据不同复制蛋白大小决定)；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化。具体步骤为：

以商品化的质粒pMD19-T simple为模板，以T-F/T-R为引物，扩增得到T载体片段；以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004基因组为模板，以p1-F/p1-R为引物，扩增编码复制蛋白的DNA片段(SEQ ID NO.1)，将PCR产物进行产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p1-Kana；

参照以上相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004基因组为模板，以p2-F/p2-R为引物，扩增SEQ ID NO.2所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p2-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004基因组为模板，以p3-F/p3-R为引物，扩增SEQ ID NO.3所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p3-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004基因组为模板，以p4-F/p4-R为引物，扩增SEQ ID NO.4所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p4-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004基因组为模板，以p5-F/p5-R为引物，扩增SEQ ID NO.5所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p5-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组为模板，以p6-F/p6-R为引物，扩增SEQ ID NO.6所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p6-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组为模板，以p7-F/p7-R为引物，扩增SEQ ID NO.7所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p7-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌1.049基因组为模板，以p8-F/p8-R为引物，扩增SEQ ID NO.8所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p8-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌1.049基因组为模板，以p9-F/p9-R为引物，扩增SEQ ID NO.9所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p9-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌1.049基因组为模板，以p10-F/p10-R为引物，扩增SEQ ID NO.10所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p10-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌621H基因组为模板，以p11-F/p11-R为引物，扩增SEQ ID NO.11所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p11-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌621H基因组为模板，以p12-F/p12-R为引物，扩增SEQ ID NO.12所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p12-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌621H基因组为模板，以p13-F/p13-R为引物，扩增SEQ ID NO.13所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p13-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌621H基因组为模板，以p14-F/p14-R为引物，扩增SEQ ID NO.14所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p14-Kana；

参照相同的方法，扩增T载体片段，以氧化葡萄糖酸杆菌621H基因组为模板，以p15-F/p15-R为引物，扩增SEQ ID NO.15所示的编码复制蛋白的DNA片段，将PCR产物纯化，通过Gibson组装的方法将T载体片段和编码复制蛋白的DNA连接，构建为穿梭载体p15-Kana5，

共构建15个其载体穿梭载体(分别命名为p1-Kana,p2-Kana…,p15-Kana)，质粒结构示意图如图1所示，并转化大肠杆菌JM109。构建的穿梭载体如表2所示，将得到的载体送公司测序，其蛋白序列和SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.15均一致。

表1构建穿梭载所需引物

表2构建的15个穿梭载体信息

实施例2利用穿梭载体构建荧光蛋白表达载体

设计用于扩增荧光序列的引物对(如表2所示)，以实施例1构建的穿梭载体为模板，以表3引物对进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，1min；延伸72℃，5min。具体步骤为：

以实施例1构建的p1-Kana为模板，以T-F/p1-R为引物，扩增得到p1-Kana载体片段；将p1-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p1-mcherry；

以实施例1构建的p2-Kana为模板，以T-F/p2-R为扩增引物，扩增得到p2-Kana载体片段；将p2-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p2-mcherry；

以实施例1构建的p3-Kana为模板，以T-F/p3-R为扩增引物，扩增得到p3-Kana载体片段；将p3-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p3-mcherry；

以实施例1构建的p4-Kana为模板，以T-F/p4-R为扩增引物，扩增得到p4-Kana载体片段；将p4-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p4-mcherry；

以实施例1构建的p5-Kana为模板，以T-F/p5-R为扩增引物，扩增得到p5-Kana载体片段；将p5-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p5-mcherry；

以实施例1构建的p6-Kana为模板，以T-F/p6-R为扩增引物，扩增得到p6-Kana载体片段；将p6-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p6-mcherry；

以实施例1构建的p7-Kana为模板，以T-F/p7-R为扩增引物，扩增得到p7-Kana载体片段；将p7-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p7-mcherry；

以实施例1构建的p8-Kana为模板，以T-F/p8-R为扩增引物，扩增得到p8-Kana载体片段；将p8-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p8-mcherry；

以实施例1构建的p9-Kana为模板，以T-F/p9-R为扩增引物，扩增得到p9-Kana载体片段；将p9-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p9-mcherry；

以实施例1构建的p10-Kana为模板，以T-F/p10-R为扩增引物，扩增得到p10-Kana载体片段；将p10-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p10-mcherry；

以实施例1构建的p11-Kana为模板，以T-F/p11-R为扩增引物，扩增得到p11-Kana载体片段；将p11-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p11-mcherry；

以实施例1构建的p12-Kana为模板，以T-F/p12-R为扩增引物，扩增得到p12-Kana载体片段；将p12-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p12-mcherry；

以实施例1构建的p13-Kana为模板，以T-F/p13-R为扩增引物，扩增得到p13Kana载体片段；将p13-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p13-mcherry；

以实施例1构建的p14-Kana为模板，以T-F/p14-R为扩增引物，扩增得到p14-Kana载体片段；将p14-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p14-mcherry；

以实施例1构建的p15-Kana为模板，以T-F/p15-R为扩增引物，扩增得到p15-Kana载体片段；将p15-Kana载体片段和SEQ ID NO.16所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p15-mcherry；

以实施例1构建的p5-Kana为模板，以T-F/p5-R为扩增引物，扩增得到p5-Kana载体片段；将p5-Kana载体片段和SEQ ID NO.20所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p5-k-EGFP；

以实施例1构建的p3-Kana为模板，以T-F/p3-R为扩增引物，扩增得到p3-Kana载体片段；将p3-Kana载体片段和SEQ ID NO.18所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p3-k-EBFP；

以实施例1构建的p14-Kana为模板，以T-F/p14-R为扩增引物，扩增得到p14-Kana载体片段；将p14-Kana载体片段和SEQ ID NO.17所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p14-k-YFP；

以实施例1构建的p13-Kana为模板，以T-F/p13-R为扩增引物，扩增得到p13-Kana载体片段；将p13-Kana载体片段和SEQ ID NO.19所示的荧光蛋白片段通过Gibson组装的方法构建为荧光蛋白表达载体p13-k-Cyan；

将上述方法构建得到的含荧光蛋白基因的穿梭载体，分别转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，对构建的重组表达载体进行测序验证。共获得重组表达载体p1-mcherry、p2-mcherry、p3-mcherry、p4-mcherry、p5-mcherry、p6-mcherry、p7-mcherry、p8-mcherry、p9-mcherry、p10-mcherry、p11-mcherry、p12-mcherry、p13-mcherry、p14-mcherry、p15-mcherry、p5-k-EGFP、p3-k-EBFP、p14-k-YFP和p13-k-Cyan。

表3构建荧光蛋白表达载体

表4不同穿梭载体表达荧光蛋白信息

实施例3构建不同抗生素抗性的穿梭载体

分别合成如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.25所示的抗生素抗性基因序列。设计用于扩增荧光序列的引物对(如表5所示)，以表5所示引物扩增含有荧光蛋白的表达载体。选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，1min；延伸72℃，5min。

以实施例2构建的p5-k-EGFP为模板，以T-Res-F/T-Res-R为扩增引物，扩增得到有荧光蛋白的T载体片段；合成SEQ ID NO.22所示的编码抗生素抗性的DNA片段，通过Gibson组装的方法将有荧光蛋白的T载体片段和抗生素抗性的DNA片段连接，构建为荧光蛋白表达载体p5-EGFP；

以实施例2构建的p3-k-EBFP为模板，以T-Res-F/T-Res-R为扩增引物，扩增得到有荧光蛋白的T载体片段；合成SEQ ID NO.23所示的编码抗生素抗性的DNA片段，通过Gibson组装的方法将有荧光蛋白的T载体片段和抗生素抗性的DNA片段连接，构建为荧光蛋白表达载体p3-EBFP；

以实施例2构建的p14-k-YFP为模板，以T-Res-F/T-Res-R为扩增引物，扩增得到有荧光蛋白的T载体片段；合成SEQ ID NO.24所示的编码抗生素抗性的DNA片段，通过Gibson组装的方法将有荧光蛋白的T载体片段和抗生素抗性的DNA片段连接，构建为荧光蛋白表达载体p14-YFP；

以实施例2构建的p13-k-Cyan为模板，以T-Res-F/T-Res-R为扩增引物，扩增得到有荧光蛋白的T载体片段；合成SEQ ID NO.25所示的编码抗生素抗性的DNA片段，通过Gibson组装的方法将有荧光蛋白的T载体片段和抗生素抗性的DNA片段连接，构建为荧光蛋白表达载体p13-Cyan；

将荧光表达载体p5-EGFP、p3-EBFP、p14-YFP、p13-Cyan分别转化至大肠杆菌JM109，将得到的不同抗生素抗性的载体送金唯智测序验证。共获得不同抗生素抗性的荧光蛋白的穿梭载体p5-EGFP、p3-EBFP、p14-YFP和p13-Cyan。

表5构建不同抗生素抗性表达载体

表6不同抗生素抗性穿梭载体表达荧光蛋白信息

实施例4含穿梭载体的重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建

将实施例2和实施例3构建好的穿梭质粒表达载体分别转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，验证正确的转化子后，再接种到含有相应抗生素的LB培养基内(卡纳抗生素,链霉素,四环素和庆大霉素的浓度为50mg/L，氨苄青霉素的浓度为100mg/L)，其中含卡那霉素(kana)的LB培养基中kana浓度为50mg/L，含链霉素(spe)的LB培养基中spe浓度为50mg/L，含四环素(tet)的LB培养基中tet浓度为50mg/L，含庆大霉素(gm)的LB培养基中gm浓度为50mg/L，含氨苄青霉素(amp)的LB培养基中amp浓度为100mg/L，培养8-10h，然后提取穿梭载体质粒，其质粒提取步骤参考生工生物工程(上海)股份有限公司SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒(B518191)说明书，提取好的质粒放入-20℃冰箱备用。

从4℃保存的斜面上挑菌落划线接种到新鲜平板上，30℃培养36-48h，至可辨别单菌落。挑取一个单菌落接入装有5mL山梨醇液体培养基的小瓶中，30℃、220rpm，培养24-36h，至OD₆₀₀>0.6，取5mL培养的菌液接入装有50mL山梨醇液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、220rpm培养7-8h至OD₆₀₀到0.6-1.0，将装有菌液的离心管冰浴15min。4℃下3000rpm离心15min，去上清。加25mL预冷却至4℃的10％甘油(含有0.1M的氯化钙)溶液重悬菌体(可反复吹打)，使菌体充分分散。于4℃4500rpm离心10min，去上清。用10％甘油溶液洗涤一次。加1mL预冷的10％甘油溶液，摇匀，置于冰浴中，分装到灭菌的EP管中，得到氧化葡萄糖酸杆菌感受态细胞。

在冰上冷却待转化的质粒或片段和0.1cm电转化杯，以及100μL的氧化葡萄糖酸杆菌感受态细胞。将10μL质粒或片段加入感受态细胞中，用移液器进行轻柔混合(避免引入气泡)，混合后冰浴5-10min。将该混合物加入预冷的电转杯中(放入之前应将电转杯外壁水珠擦拭干净)。按照Bio-Rad电转仪的说明进行电转化，1800V电场强度，200Ω电阻和25μF电容，电激结束后，立即加入1mL预冷的液体种子培养基，将混合液转入14mL摇菌管中，充分混匀，30℃摇床培养5-6h。取200μL培养液涂布补加了相应抗生素的种子培养基固体平板30℃倒置培养，36-48h可出现转化子。获得的转化子分别命名为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p1-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p2-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p3-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p4-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p5-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p6-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p6-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p8-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p9-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p10-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p11-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p12-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p13-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p14-mcherry)，氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003(p15-mcherry)。

将不同的转化子在山梨醇培养基中，于30℃下培养48h，对荧光强度进行检测，结果如图3所示，不同的的穿梭载体表达的荧光强度不同，其中p14-mcherry和p15-mcherry荧光强度较高，表明其质粒拷贝数较高；同时p5-mcherry和p6-mcherry荧光强度较低，表名其质粒拷贝数较低。

将不同的转化子接种至不含抗生素的山梨醇培养基传代培养5次，测定传代5次后重组大肠杆菌细胞的质粒稳定性，结果如图4所示，p2-卡纳抗生素抗性基因，p5-卡纳抗生素抗性基因和p6-卡纳抗生素抗性基因的质量稳定性较差，在连续5吃传代后质粒保留率低于15％，

实施例5多种不同抗生素抗性的穿梭载体在氧化葡萄糖酸杆菌内共表达

为了将多个抗生素抗性质粒依次转入到氧化葡萄糖酸杆菌内，我们首先按照实施例4的方法将穿梭质粒p15-mcherr转化到氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003，筛选得到G.oxydansp15-mcherry，以G.oxydans p15-mcherry为出发菌株，将实施例2和实施例3构建的p3-EBFP穿梭质粒转化到氧化葡萄糖酸杆菌将穿梭质粒，筛选得到G.oxydans(p15-mcherry,p5-EGFP)，再按照相同的方法将穿梭载体p3-EBFP、p14-YFP、p13-Cyan依次转化至G.oxydans(p15-mcherry,p5-EGFP)中，最后得到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans(p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan)，将氧化葡萄糖酸杆菌在在平板活化后，将其接种到含有6种抗生素的山梨醇培养基内，培养48h后，通过激光共聚焦显微镜(德国徕卡SPD8)拍照，检测荧光蛋白的表达情况。结果显示如图5所示，A为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌EGFP荧光视野；B为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌YFP荧光视野；C为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌EBFP荧光视野；D为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌mCherry荧光视野；F为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌Cyan荧光视野；G为含有穿梭载体p15-mcherry,p5-EGFP,p3-EBFP,p14-YFP,p13-Cyan的氧化葡萄糖酸杆菌白光视野。

实施例6穿梭载体在其他氧化葡萄糖酸杆菌内的普适性

为了验证实施例2和实施例3构建的穿梭载体在不同株的氧化葡萄糖酸杆菌内具有普适性，将穿梭质粒p12-mcherry按照实施例4的方法分别转化到氧化葡萄糖酸杆菌1.049、氧化葡萄糖酸杆菌621H、氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC 1.110的感受态细胞中，氧化葡萄糖酸杆菌1.049、氧化葡萄糖酸杆菌621H、氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC 1.110分别公开于公开号为CN109628367A的专利申请文件中；通过在相应的抗生素平板上面筛选，最终，我们得到重组氧化葡萄糖酸杆菌，将氧化葡萄糖酸杆菌在在平板活化后，将其接种到含有相应抗生素的山梨醇培养基内，培养48h后，通过激光共聚焦显微镜(德国徕卡SPD8)拍照，检测荧光蛋白的表达情况。结果显示如图6所示，A为含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌621H明视野；B为含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌621H荧光视野；C为含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.110明视野；D为含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.110荧光视野；F为含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.049明视野；G为含有穿梭载体p12-mcherry的氧化葡萄糖酸杆菌1.049荧光视野。

实施例7穿梭载体在转化效率验证

为了验证实施例2和实施例3构建的穿梭载体和广宿主质粒(pBBR-MCS2)转化效率的比较，按照实施例4内提到的方法将得到穿梭质粒，然后将穿梭质粒P3-Kana和pBBR-MCS2按照实施例4的方法转化到不同的氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003的感受态细胞中，通过在相应的抗生素平板上面筛选，最终，我们得到重组氧化葡萄糖酸杆菌，验证其转化效率。结果显示如图7所示，构建的穿梭载体P3-Kana转化的菌落数是广宿主载体pBBR-MCS2转化的菌落数的3～4倍。

实施例8穿梭载体过表达sldBA1山梨醇脱氢酶发酵验证

设计用于过表达山梨醇脱氢酶的引物对，以实施例1构建的穿梭载体p15-kana为模板，以表7引物对进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，3min；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化，将得到的p15-kana穿梭载体片段(扩增引物为T-F/p15-R)和SEQ ID NO.26所示的山梨醇脱氢酶sldBA1的DNA片段(扩增引物为p15-sldBA-F/p15-sldBA-R)，模板为氧化葡萄糖酸杆菌的基因组)，通过Gibson组装的方法构建为山梨醇脱氢酶表达载体p15-sldAB1；将PCR产物进行产物纯化，将得到的pBBR2穿梭载体片段(扩增引物为pBBR2-F/pBBR2-R)和SEQ ID NO.26所示的山梨醇脱氢酶sldBA1的DNA片段(扩增引物为pBBR2-sldBA1-F/pBBR2-sldBA1-R)，模板为氧化葡萄糖酸杆菌的基因组)，通过Gibson组装的方法构建为山梨醇脱氢酶表达载体pBBR-sldAB。

表7构建不同抗生素抗性表达载体

将构建好的山梨醇表达载体p15-sldAB1和pBBR-sldAB按照实例4的氧化葡萄糖酸杆菌的转化方法转化到氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003内，成功构建好氧化葡萄糖酸杆菌重组菌株G.oxydans p15-P_tuf-sldAB1和G.oxydans pBBR-P_tuf-sldAB1，将这两株重组氧化葡萄糖酸杆菌和野生菌氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003在5L发酵罐发酵验证。种子液由甘油管直接接种三角瓶培养48h后得到一级种子，一级种子OD₆₀₀约2-3；按照接种量1％进行转接，培养24h后得到发酵种子液，OD₆₀₀约2-3；将发酵种子液按接种量为10％转接到发酵罐，35℃发酵，通过液相检测发酵液内山梨醇山梨糖的含量。

三种菌株的发酵表明，重组菌相对于野生菌在L-山梨糖的产量和底物D-山梨醇的转化效率上都得到了提高。结果如图8所示，其中，G.oxydans p15-P_tuf-sldAB1的L-山梨糖产量(148.9g/L)分别比G.oxydans pBBR-P_tuf-sldAB1(138.1g·L_-1)和野生菌(131.9g/L)提高7.8％和12.9％。而在底物转化时间上，G.oxydans p15-P_tuf-sldAB1(16h)分别比G.oxydans pBBR-P_tuf-sldAB1(22h)和野生菌(25h)缩短了27.2％和36％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 用于基因高效率表达的氧化葡萄糖酸杆菌穿梭载体

<160> 41

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgagcctggt ctttggtcag cagtactacc ggaacacaag tttatggggc ctatatgttt 60

ggcacgaaag ccagctccgc gatcgcaacc gcgtcggatc caagcacgcc gctgagccag 120

ttcgtctcgg ccaagacgct ggcagcgaac aatatgaccg gatggacggt cgcgcagtac 180

cagcagacgg tcgccagccg catgggaaat ggtgcgtcag aggcggttac gagctaatgt 240

ccgcgcgcca aaatgaacac aataaccccc ggaatataaa gaaaaaattg cgatccgggg 300

aactttacag gttgttgcgg agcctgaacg ggggcacgat gcccggatgt ctggagacgt 360

ccctgtgggc ggcgccagcg agtcgatcca gaggaccacc gatgacgtag cgcccacata 420

ccaaaaaccc cgcctcctcc gatttggcga tcggaagagc cagggctccg gcaaaaaaca 480

gtagctagat gacaaattcg taaattcatc tagcgtcagc tctctttgaa acgcaagtgc 540

taaattgcga acgggagtgt tttgtctggt gtccggccgt gaggtggtcc cctcaaccca 600

accgatccgg accaatcaat ggaacagtct gcccatacgc agaggacgcg cgctgcctgc 660

acacgacggg gccagcgccg aatcagtgag gccatggtgg ccgcacgcga ggaactgacg 720

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ggcgttctgc cggtcagccg tggtgccgcg ctgacgctca tcatcatggt ggaaaagacc 840

gctacggacg catggaccgc tctgaacacg ccgttcatct atgctcacaa cacgacactg 900

atgtcctgga cggggctttc gcgcagctcg ctgcagcggc acatccggga actggccgaa 960

gcgcggctcc tggtgccgca ggacggtcgc aacgggcagc gcgggcgacg ctggcagggg 1020

aacgaggaga cccaggtggg gttcaatctg tccaccctgc gctatcgctg gccggatttt 1080

ctcgcgctca gtgccgagca gcgccggatc cgcgagcgca tctcattcct gcgtgattcc 1140

atagccgatc tcaatgacag cgttcgggct ggggccgagc agttcggatt gcacgacgtg 1200

atcgcacagg cggccacgat catgcgtgcg cggctgcgga gcgttcagac gggcactctg 1260

gaagctctgt accgggagat ggccgccttg tccgcgatcg tcggggagca tgccgcaggc 1320

tccatttcgg agcccgaaag cacgtctgtg gaaaaccctg ccttttcaat gcagtatcca 1380

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caatcttcta aaaaagtaga tcccgtagcc gccacaggcg gcgatcgcat tgaaaaaatg 1500

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cggggtttca aggggacagc ggttttctat ctcgagattt gcagcggtct gcgggagttg 1620

tattccagcg aacggccgag cgcggaagag ctgatcgaag cggcggaata tctgtcgggg 1680

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gcggccgtgg ccgtcatcgt catggcctcg cggctggagc gtggcgcgcc catccgtttc 1800

agggatgcct atttccggtc gctgatcgag cgcggtgcac gcaacacgct cttccttgat 1860

cgcagcctct atgccttgcg ggacagccgc tcgcgtgaaa tcgggatgct ggccgaggcc 1920

ggctacatgc cgtctccggc agcgccgaca tccggcaaaa agggaatctg gatctgatag 1980

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<210> 2

<211> 2122

<212> DNA

<213> 人工序列

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agccgtgccc gtttaatact catataccta cagtcggaag ctataaggac gaactccaga 960

gatattgaac tcggaaaaag tcttcgtgct tggatgggaa gaatgaatat tcccatcggc 1020

ggcaagaacc tccagattgt ccgtgaccaa atggagcgga tatctagatc tcgtttatct 1080

tttgaagtga agaggggcgg aactgtaggt ctgactaacc aaaatatcat ggattccgcc 1140

gttttcatgg atccctctgt agagggcaac agcgagacgt acatgcacat ggcccgctta 1200

tcggagggtt tttttgatgg tcttcgtcgt catccggtgc cgctcgatga ggcagcaatc 1260

agggctttga gtaataacag catggctctc gatatctact cctggcttgc ataccggtta 1320

cattccctta gtaggcccac ttctataact tggcatgggc tgaaggcaca attcggccta 1380

aatttcgggc aactaaagaa ctttaaggcc cgcttcttgc ccaacttgca gcttgcacta 1440

gcggtctatc ctgccgcaaa ggtccttgaa caggacgacg gcaaaggaat tatactctac 1500

ccaggtcagc cgcccgttgg aaaaaaagcg acaagcttga ggctataggg atcgttttgc 1560

gccgtgcact tttgaagcca ccgccggctg ttttgtttcc cgtcgatgtg cacttttgaa 1620

gcttatcttt ctgccattca tgaaaacgtc tcatgacgtc ctcgtacgta ggtcgggaca 1680

agctagccgt gcacttttga agccccgcga ctggaacagc tgtaagtgtg cacttttgaa 1740

gccgagcttg tccgacgacg tctttaattc gacttactct gtccgatgag tagggttagt 1800

agatgacgga caaagtcttc cgtgttcgga aaatcctgag ctcgctctaa aaattgagcc 1860

ttagtttcgg gacgaagttt gatgtttagc tgtgctgtcc gcccgctctt tctcagggaa 1920

cggccgtcaa tctgtacctt atctgacctg cctgtgaagc ccgcctgtgc agcgtccgcg 1980

atcgctgcag aggtcgtact ctt 2003

<210> 5

<211> 2220

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaggtggcga gcgcgatcat cagcgattac gcgtccgccg tgagtcgctc gacaggggct 60

ccggccaccg gaacgcaggt ctatggcgcc tatatgttcg gcaccaaggc cggcgcggcc 120

attgcaaccg aatcaaatgc gagtacgcca ctcagccagt atgtctccgc caggacgctc 180

gcggccaaca atatgagtgg ctggacggta ggccagtacc agcagacggt ggccagccgc 240

atgggcagcg gggcttcgga ggccgtcaca agttgaaaac agcgcgccaa aatggacaca 300

ctaaacgccc gtttttactc aattttttcg ctgtcagcgc gctttcgagg ttgttacagc 360

gcccgaacgg aggcacgatg cccggatgtc tggagacgtc cctgtgggcg gcgccagcga 420

gtcgatccag aggaccccca atgacgtagc gcccacatac caaaaacccc gcctcctccg 480

atttggcgat cggaagagcc agggctccag gcaaaacagt tgttagatga tgaaaatcct 540

taacttcatc tagcgtcagc tccttttgaa acgcaagcat taaattgcga acgggagtct 600

tttgtctggt gtccggccgt gaggtggccc tttcatccca gacagaccgg accgatcaat 660

ggagcattct gcacagacgc agagggcgca ggccccgtgc acgcggcgcg gccgacgccg 720

gatcagtgag gccatgctgg ccgcacgcga cgaactgacc acccccgtcc cggctgaacc 780

cggcaaacgg gatatgctga acatgctgaa atccctgcgg ggtgtcctgc ctgtcagccg 840

gggagcagcc tcgacgctga tcatcatggt ggagaagacc tctccggacg cctggacggc 900

gcttgagacg cccttcatct acgcgcacaa caccacgctc atgtcctgga caggactgtc 960

gcgcagcacg ctgcaacgac acatccggga gctggcggaa gcgcggcttc tggtgccgca 1020

ggacggacgc aacggacagc gcggccgacg atggcaggcg gaggagggcc agacgcaggt 1080

tggcttcaat ctggcgtccc tgcgttaccg atggccagat cttctggagt taagcgcaga 1140

acaacggcga ctgcgtaagc gtgtgtcctt tttgcgtgac agcattgcca gcctgaacga 1200

cacggtccgt gcccaggcag agcacctcgg gcttcagcag atcatggagc aggcagtggg 1260

gatcatgcgc agccgtctga ggacggtcca gctcggtact ctggaggggc tgtaccggga 1320

gatgctggcc ctttctgcgg ctctggccgg gcagtgcgcc gagcctgaat ccggcccgga 1380

taacgcgcct gtggaaaacg ctgttttttc aacgtcgtat ccagcagaaa tgaggcccat 1440

gggtcctcaa aacggggccc actatacaga tactaaaaac attcaatctt ctaaaaaagt 1500

agaccacgta gccgccgatg gcggcattcg cattgaacac atgcggtgtg aagggccgag 1560

ttccgaaacc aaccgttcga gcgtttatga ccggacagcg ttgcgcgggt tcaagggcac 1620

ggcgacgttc tatctggaaa tctgcagcag cctgcgggat ctttgttcca ccggtcgacc 1680

gagtgccgag cagctgatcg aggccgccga gtatctgtca gggcaggtgg gtgtaacctg 1740

tcatgcctgg tcgcaggcct gtgtcgtcct tggccggttg caggcagccg tcgccgtgat 1800

cgtcatggcg tccaggctgg agcggggcgc tgtcatccgg ttccgggatg cctatttccg 1860

ctccctgatc gaacgcgggg cacgaaacac cctgttcctc gatcgcagcc tgtacgcact 1920

gcgggatcat cgcacccggg aagtggggat gctggccgaa gccggtgtgt ccctggccgc 1980

cgtaggcgtg caaaccgcaa aaacccgcgc ggcgtggatc tgacatggtt cctgttgaaa 2040

agcccactct tctgcgcgtt ctggatcgtc tcggggcact ggccaccctg cttctgccgc 2100

tgtttctggt gcattggcgc ggtatcgccg agggctgtct ggatgggctg gccgtcggat 2160

ttctgcttcg gagcgtcctg acccgcgagt ggcactggtg tcatcagggc ttcgtgtggc 2220

<210> 6

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagggctagt tttagtgggc ctgtaatatc acgtttgaag tcacgcatac gcgcatattc 60

tggtccaaac tgccctttga aagcatacca cgagatagat actggttctt tgagaatatg 120

tagcctgtaa gctaaccaat atatgtatct atcgcttttg attttccgga tatttgacga 180

attgctactt cccgaagtgg caaagggtgg tcaatcaagc tttcgtaaaa actttcgtct 240

aaacgaacaa cttctctcca aaacgaaggt tgattttcat cttcctgaat tggaaagatt 300

gcgtcccgta caaatgctcc gttactaacc atttttgctc cattgtggac gcgaaaaaat 360

gttagtctgc actgactgat tctttttgct tggtctctta cggaattata agttttccca 420

ccaacagtaa ttcccattac tttaagccaa gcattcatcg aagagccaag ctcgacttca 480

cgggattgtg tctttactgc ttgagtttgt aaatagagga gaatcatacg agccattgag 540

ccgtatggaa tacccacggg agttttgtcg tcgtttaagc cgctttcaat aagaagtttg 600

attcctccgc cttcacgttc ccatacggtc tcttcagtct ttttatgagg cagagcagcc 660

atcgcaaagc ccgaatgagt gatgccaatt tgtaaagctt catcacttaa tacttcatga 720

gcagcatcga cacatacacg gcttagctgc ccatcgagag acgcctgtcg ccgagcttca 780

tggagtccat ggcgttcaag aagattgtgt atttcaccca tgaacctgac tttccatggc 840

cgacgatcgg gtgtcaattt ggactttgct cgcggcgatt tttccacaga actcccttgg 900

actccactcg ccgtggtttg gactctgctc gcgcgctcta ggaagattat tagatatatt 960

tattagatat gcgcgaccag agtccaaggg ataaccacca ttgtagcgag caaagcccaa 1020

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gctgtctgca atgagcgagg aaagtccaag agggtgcgag aagagtccaa acaactgaat 1140

ggcacaataa gctggccgtt aggcggtgca aaaatttctc atcgt 1185

<210> 7

<211> 2514

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accacgcata cggcaataag aacagttgca gcgccggatg gattgaaggc cgtcgctgag 60

tatcacttca aagcgtaccg caccacagtg gcagccgcct gttcgactgt tcgttacgct 120

tgtcatgatc tcttcctcct aagcataaat agtccacgtt ttcggcatcg gttgtcgtct 180

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taagcagggc tgtcgcggct gttgtaagtt gacctgtggt ccgaccgata tgatcggcga 300

ggaggccata ggcaatcggc gccagtcgcc cgcgccgatc accccggtat agaacacggc 360

aaaggcccgg cccgtatctc caccaggtgc caactcaggc acagttccgt acaggaggga 420

ggatgtcccg ttcagaacaa tcccgagtag gggaagaagc accagtgtcc ccgacagtgg 480

cgtaaacagc gtggcgatga tcagcagtga tgtcgtcgtt tccgtcgcca cgacgcttct 540

ggcaataccc agatgatcgc ccagccaccc gcatgttgct ttccccaacg cccctccagc 600

aaagaggagc gccagggcaa ttccgactgt cgccgacgat ccaccacggc cgtgaatgag 660

aaaaggcagg aatagcagat agcccatccg tgtagcggta tcgaaagccc ctatcgccaa 720

cagccatgca aaaccggtgt gcctgctgga agacctctga tgcgggaaca tcgctgcggc 780

aggcgtaatt ttccgcggtg tgagcttaat cagcacaagg cacagggtca gtcccagcag 840

ggcaaggctg cccgtaaccg ggcgccaggt gaagacgggc agcaaaagtg cgatgagagc 900

tggcagggtc gccttgccca gatcgccgga gaaattataa agactgagtg ggcgtcgtgc 960

cgcatcgcca tagcactcgg taatcaggtg tgaggcacgc ggatgctgaa tactcgaccc 1020

gatgccagcg aggacaagac cacagcacag tccgacaaac cctattggaa ccgccatgac 1080

cgcgagacca cctgccgcaa tcaatgtgga caaaacgagc gcgttgcgcg gcgacatgcc 1140

attcagaagg cgatccgcag ggcctgaaga ccacccatcg tgccgaaata gagagcacgc 1200

acgatcgcaa gcccggcata ggacaggccg aactgggctt gccagactgg aaagaaggcg 1260

tacagcccgt ctgtaaagcc atcgtgcagc gcgtgggcaa gacacgcagc aatcagtcct 1320

cgccgctgtt cctgggcaca cgtgaactgc tgggatgcgg gttcagtgat ggtgctcatc 1380

tgcatgttgc acacggtcct ttcgcagaac atcttagaca tgtgattttt cagggaatag 1440

aaggaatatt ctcaccatac atgtcagttt tcctcacggg tctcatgcgc catctaccgc 1500

ctctcaatgc tctgcgtgtt ttcgaagttg cggcccgtac gggtagctat tccgaggctg 1560

catctgaact cggcctgacc catggtgcgg tcagccgtca gattgccctg ctggaaagct 1620

ggctggggca gcggcttttt caccgatccg gtcggcgcat ggtcgcaaca ccggtggcgc 1680

gtatttttgc gtccgaggtc agcggcgcct tcgagcggat gacaacggct gtcgaagcat 1740

gcggacgacc tgatgcgaga cggatcctgc ggatcaatgc accggtcagc tttgccatgc 1800

gctggctgct cccaaggctg gaccttttcc atagcgtcta tccggcggtg gaagtcgtgg 1860

tgacgaccgt ctcaacggtg cacgaggaac tccgcggtgg cttcgacgtg gctatccgtc 1920

gtggcgtggc aggtgctggt gcatggtcac atcaccgtgc cactcatgtt ctggacgata 1980

ttgatacagt gatcatgagc ccttcgttgt tcgctcagcg gccaatcctt gctcccgccg 2040

atcttgaggg acacaggctt ctggcgagcg aaacacgacc gggagactgg atcgattggc 2100

tggaagcggc ggaacttcct catctcatag gccgtccgcg gaccctgttc gaccattttt 2160

tcatcacccg gcaagctgtg atggacggcc tgggcatcgg gatcggcgcc ttgccaatgc 2220

tcgatatcga tattgcgatg ggacatcttg taacaccact cccacagatc cgggtgcacc 2280

ggaccggcta tgtcgcattg ctccccgaag ggaccgacaa gaccgcgccc tcagtacgtt 2340

tcgttgagtg gcttgcaagg gaaggaatgg ctggacgtaa acgggcctcc tgatcgaggc 2400

tcaaaatttc gcgagcatac ccgacaagtt cccgtccctg cagcgtcaat gcgagcgacc 2460

cgccgcgatc atgttccata agccgatagt cggtctgtta cttcctcgat cagc 2514

<210> 8

<211> 2374

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacaagggat atggacgtca gctgacagaa tttggccgta ccacgatccg caagccagcg 60

ggctttgcca gcatcccaga aacacccaac ctgacagccg ccatgatgcg ccgtgggtgg 120

tccacagggc taatcgagaa aattctcgga cagaactggc tgcgcctgta tcgcgacaca 180

tggacaccag aggtctgacg cggctcatgc caaccgctcc cccttaacga cgcgccgcaa 240

ggttcttggc ggtctggcaa acactgcccg catggcgaca tgcacgggcg cggatggcga 300

tctggaattg tcggtagccg gctttcacgg accattccag aaagcgtttc aggccatcgt 360

gatcaacagt ttcgaacgcg ccatgccggg cgtccgcgtg acataccgcc ccatcatcaa 420

ttctgcacag cttcttgcag cgctacggct ggaacgggaa gcaccgcaga ttgatgtcgc 480

cattgcggat gtgtcggtcg ctattcttgc caaacaggaa ggactgactt ccattttacg 540

ggaagaagag attctgagcc tgcgcgatat tccagactgg ggacgcttcg atgccatgaa 600

tggcgtcgca ttctcacggg ataatctgtc gctcatttat gacagccgtg ttctgacgcg 660

ccctccggaa agctggcgtg aacttggacg tcccgatttg acggaccaga tctccatgcc 720

tgtcgaggat acgcgtggcg ttgtactcct tccccttctg acgcgcatgg ccggagggga 780

ctacaggcaa aacatcgagc cgggactgac cctcatgcga cagtttgccc cctatgtcgc 840

aacctggaac gcacagcccg acatttacac cctgacgctg gcccagacga ttgccttggg 900

ggttggatgg aacggccgcg gtcagatgct cgcgcgggac aatccgaata cgctgcgtgc 960

tgtcgttccg tctgaaggca gcgtcgcaca gatcaatacg ctcaacctga cggcccctcc 1020

acaacgcgcc agactggcgc aggccttcat tgaacatgcc ctttccccgg acgtgcagac 1080

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tggctgaaac aaactcaaca ccagcctatc tctccgtcag cggcttcacg agacaattcc 1320

cgggtgcaga aaggcgttcc gtcgatgacg tcagctttac gctgaaacgc gggcagatgt 1380

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gtgggacgga gcaacttcat cgaggctgtg tgggtcgata gcaaacgtat ccatgcggaa 2040

ggcatcggca cacttttcat tggcttttcc gaaggctgga aagaccgcag aaccctcttg 2100

atccgccccc atcgcatcag attgggcaac agtctcgaaa catgctgcca gggtgtggtc 2160

gaaaacgttg ttttacgggt gagcgccgaa cttatctggt ccgtgtcggg tatgtaacac 2220

tcaccgttga acagcaggaa gatcagggcc agccagccca gacgggagac attgttgacc 2280

tgcactggca ggccagcgac atgtcagtcc ttcaagagcc tctctccgat gccctcactt 2340

caggccatcc gagttcatga gggtgtctgt ccga 2374

<210> 9

<211> 1010

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atacagctct atctgccgtt gtccgtgaag ctgaaggaag ggtagcgcca ggacattcgt 60

attcagcttg gtcgttaaca ggtttgcccc atcgcgacat tcctttgggt accgactggc 120

gtatccgcgg tgattttgct gatctagtca ttcgtccggg aattcgcatt gaagaagaag 180

gcgaggagca gctcggcgtt cccttcggga ctatagcaag actactgctt atcgactggc 240

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tcgcgaaccg aatgggctta ggccgcggag gcccaacaaa taaccggctt agggaacaat 360

tagagcgcct tgtgaactgc actatcacct tccgttttgg taaagatgat gcgggcgtta 420

tagtcaatga acggattgta gaagcgtata agtattcggg aaaggtagat cctagatcaa 480

aaagcaagac gagatggatt gagcgtattg ttctgtctga agcctacttt aatgagctca 540

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caattgatgc gtacctttgg ttggccttca ggcttcatgt tttgcaatct gataccttcg 660

tcagttggcc atcactttgg aaaagttttg gtcatcaata caagttgttg agaacattca 720

aacgggagtt tctagagccc ttctcaatcg ctcatgctgc ttatcctaat tcacgcgtcg 780

atatttctga acgaggcatc accctaaaac cttctcctcc accggtacca ttgaaagcct 840

aacctcttca gagctaggaa aattacttca ccgatgacct taggagagaa cttttttcga 900

gatatcggaa aaggggcaag cccttggggg aactgataca tagacaggag cagctatacg 960

cttagcttgt cgtgaaaccc ttgctgcgca gtttccgaca tagaagtcat 1010

<210> 10

<211> 1177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttctgagga cgaatcggac gcaaagggtg gcgattgcac cgcaccgagg atgtcggaat 60

cgctcccaaa agggtggtga ttgcaccgtg ataaaccggg agacacgctg tccaaagggt 120

ggtgattgca ccgcccatta tacccgaatt tttgagttaa gcctctgacc caattacttt 180

tgaaaagaca acggtctgtc gcgggacagg gggcgatgcg atcagcctca gacccgttcg 240

aacctgttct agcttcgcat ccggataaac agccgaaacc tgtcgcaagg ctatcaggaa 300

tgccttcttg aaattcttgt cgtccgtata ttcctgccca aactgtagcc gaaggttgga 360

ccaggtgagc cgttcgccag atccccgcac gcgatgaagc cgatgggcaa gccacgtata 420

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gagatttttg gtccacgcat cgaattcgtc taccggtcgg gcgttcagat tgcgcgaccc 600

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ggatgggccg ttttggctga tgttcagccg tttcatgaat tcgctgatgg tccggccgac 720

cgcgacagtg cgcgatttgg tccggatggc ttcggtactg atatggaaga gggccaggcg 780

cggctttgtc ccataaggaa cgaagagctt ttcccaatga ccgtcgttgt acatttcgcc 840

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<210> 11

<211> 1649

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcgtcagttg gaaaagcaga gcattaagcc ggcgaataaa gctgctccag gagcgagttg 60

ggtgtcgacc gacaaagccc tcacgatcga tctggaggca aaaaagcggg ccacaaatct 120

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aacggggggc ggggagggcg ataatacgag ccctcgctcg gtcacagcga cttttgcaga 300

acgataagcg gcgagggcaa gccccaaagg ttccttgaac tcagccttaa atgatttgag 360

agttttaaat tcggtgccga actgcttcca cagcgagccc cagcctacgg gggtatcccc 420

ttgcagggca tgtaatcgga aagctaacca cagatacgca tcaatagctc gtggcgagtt 480

ctgtatgtca cgaatggccg cgcggtcgat aagaatggga tgccttcgca gctcccgata 540

gaaggcctcc gacaacacga ctgtttcaat catgcgagta tttcttttcg ttctagggtc 600

tacctcccca acgtaacgaa acgactcaac gagacgttca ttgacgacaa cgccttcgcg 660

gtcgtttcca aatttaaagt caacggtgca ggtcgccagc ctttcaattt gctcgaccag 720

ttttttgcta ataggacctc cgcgactaag ccccatcctt ttgagtaaag aggcaggaga 780

ttttgctagc gagatttccc gtgaccccgt ttcaagagcc tcggactgcc agtcgatcaa 840

gagcaatcta gcgattgtcc cgcacggaac tgacagtttt tcagttgaat cgtcatctcg 900

cagtcgaaca cctggccgga ctagcaactg agcaaagtcc gtttttatta gccagtcttc 960

acctggtttt cgttctcggt ggggaagtcc ggcaagacac catgcgctat aactatagcc 1020

tattgaactt ccaccctcga tttcgcgaac caaagatgac gcggcagcat cgacaatctt 1080

acgtccagat ctgcctgcaa cgacgtcaag tatcgggtca gtcagagctg acgcttcgct 1140

atctttttct agcgaatggt tctgagcgat tttgatagcg tcttgagggc catgtgcttc 1200

caccagctcg tgaattgatc tgaacagatc gtgctgcgac ttagcgttag agtgcataat 1260

gcgatttcca gcagatcctc aataagctca gaaacacaca tcatcagggc cttgtcgatg 1320

tgttcgttgc tttccctcct ggatgtgttc ggtgcctacc tgctacacat agcgcggttg 1380

tgttttttgc cgacgtaaca ataaaaaaat tatattgtta ttatattgtt tcgtcggcag 1440

agaacacgtt gataaccccg taacccactg aaaaaacgtc tcgttttttt tcctcaaatt 1500

agcaccgtag gcagaaaaca cttcaccgat cttggctttt aacgtgcacc ttctgaagaa 1560

aaccgtgccg gtaggcaacg aacacaggga aaaccctgcc gcctatggaa agcattaaac 1620

acaacttttg gcgttttttc atggtcggg 1649

<210> 12

<211> 1843

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agaaatccga ccgccaggcc atccagacag ccctcggcga tgccgcgcca atgtaccaga 60

aacagcggca gaagcagggt cgcgaatgcg ccgagacgat ccagaacgcg cagaagagtg 120

gacttttcaa cacgcaccgt gtcagatcca cgccgaccgg gtttttgcgg tttgcacgcc 180

cacggcggcc agcgagacac cggcctcggc cagcatcccc acttcccggg tgcgatgatc 240

ccgcagtgca tacaggctgc gatcaaggaa cagcgtgttt cgtgccccgc gttcgatcag 300

ggagcggaaa taagcgtccc ggaaccggat gaccgcgccc cgctccagcc gtgacgccat 360

aacgatcacg gcgacagccg cctgcaatct cccaagcacg acacaggcct gcgaccaggc 420

atgacaggtt acacccacct gccctgacag atactcggcg gcctcgatca gctgctcggc 480

actcggccga ccggtggaac agaaatcccg caggttgctg cagatttcga gatagaacgt 540

cgccgtgccc ttgaacccgc gcaacgctgt ccggtcatac acgctcgaac ggttggttcc 600

ggaactcggc ccttcacacc gcatgggttc aatgcgaatg ccgccatcgg cggctacgtg 660

atctactttt ttagaagttt gaatgttttt agtatctgta tagtgggccc cgttttgagg 720

acccatgggc ctcatttctg ctggatacga cgttgaaaaa actgcgtttt ccacaggcgc 780

gttatccggg ccggattcag gctcggcgca ctgcccggcc agagccacag aaagggccag 840

catctcccgg tacagccctt ccagagtagc gagctgcacc gtcctcagac ggctgcgcat 900

gatccccact gcttgctcaa ggataggctc cagtccgaga gtttctgcct gtgcgcggac 960

cgtgtcgttc aggctggcaa tgttgtcacg caaaaaggag acgcgctggc gcagtcgccg 1020

ctgttccgcg ctcaacgcca gcagatccgg ccagcggtag cgcagggacg ccagattgaa 1080

gccaacctgc gtttggccct cttccgtctg ccaccgtcgg ccgcgctgcc cgttgcgtcc 1140

gtcctggggc accagaagcc gcgcgtccgc cagctcccgg atgtgccgct gcagcgtgct 1200

gcgcgacagt cctgtccagg acatgagcgt ggtgttgtgc gcgtagatga agggcgtctc 1260

aagcgccgtc caggcgtccg gagaggtctt ctccaccatg atgatcagcg tcgaggctgc 1320

tccccggctg acgggcagga caccgcggag ggatttcagc atgttcagca tatcccgttt 1380

gccgggttca gccgggacgg gggtggtcag ttcgtcgcgt gcggccagca tggcctcact 1440

gatccggcgt cggccgcgcc gcgtgcacgg ggcctgcgcc ctctgcgtct gtgcagaatg 1500

ctccattgat cggtccggtc tgggggtgaa gggaccacct cacggccgga caccagacaa 1560

aacgctcccg ttcgcaattt agtgcttgcg tttcgaaaag agctgacgct agatgaattt 1620

aacgaattac tcacctagca actgttttgc cggagccctg gctcttccga tcgccaaatc 1680

ggaggaggcg gggtttttgg tttgtgggcg ctacgtcatc gggggtcctc tggatcgact 1740

cgctggcgcc gcccacaggg acgtctccag acatccgggc atcgtgcctc cgttcgggcg 1800

ctgcaacaac ctcgaaagcg tccgctcaga aaaataattg agt 1843

<210> 13

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cacatcgcca tgggaagcct catgctacgc cgaaacgctc atccgtgaat ttccaaaagg 60

gctctaagag ccgatcggaa ttggtaagat atcatggcta tcccgtgcac tttggcgggg 120

aagatgtgca ctttagcgtt ggaagcgtgc acttttccgg agagtgatag cctaaaaacg 180

ggactcttcc gcgttgtccc gtgcacttta acgggacaaa ctaatatata actaatatct 240

tctactaagc ttcttcccgc taaagtgcac atccgtgcca aggcatttcc gtttcccggt 300

aaagttcacg gagacagatt agctagcttt agccatactc gccatgtcgg agagtatggc 360

atggctaaag ttcatcgaat tatagagcag atagggcgcc aaggcgcgct tcagctcgat 420

atagatcgac gcgtgatcga catcgcgagt gggtatatgt cgagcgaaga gcttggcatt 480

ggctttttgt attctggctg ggcccaagct gcattgccgc atagaagact taaatcgagc 540

gcagcatggc aagtaaaaag cgatcacgta acgctgctcg ttgagccggg gcgaagaccc 600

ggcaaagatg cagagccaga gtacgtagga gttccctatg gaagtaaagc tcgcttgatt 660

atgctttatc tccagaccga agcactgaag acaaacagca gagaaatcga gatagggaag 720

agccttcgat catggttgaa ccgcatgggt attcccatcg gaggaaaggc tgtcgcagac 780

gttcgtgatc aagccgagcg gattgcgcgt tgtcgtctga gctttcatat aaaaactgcc 840

gatagcacag gatttctaaa tcaaaatatc atcgactcag ggatgatcac tgagtatgac 900

gacgcgacag gaaaaccaac gtcattcctt gacgcagtga aattgtccga aaatttcttt 960

cagcaattaa aacgccaccc ggttccaata gaagaggccg ctattaggca tctaaatggt 1020

cattctcaag ctttagatat ttattgctgg ctagcgtatc gcttacacgt cttaaaaaag 1080

cctacaccca tcacctgggc ggctttaaaa ttacaatttg gcccaggcgt tgcccgtatg 1140

gaccatttcc gcacaggctt tttagataat ttgggactgg cattagcggt ttatcctgcg 1200

gcgaaagttg acgtcgaccg cacaggcgca accctgtttc cctctccacc gccagttaag 1260

ccgaaaacgc tctcgtagaa gcgggattac cgtcggtata ccgttgacct accttcgcaa 1320

ggcagctaaa aggaggcgta ctgttcgtct gtaagtgaaa tgcaaggtat accgaaggtc 1380

ttccgttccc atacagtata 1400

<210> 14

<211> 1603

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttagcccgg aaatgtcatt tgccatgcat atgaccgcca gaaagcatgg gatgagttta 60

caggacgcga tggccgacgc gtttaacgac tggctacgca agatgggaga aagtcctgta 120

ggcaagtagg taggtgtatc taaggtcatg tttgcatgca cgcatgtaca cttgccatca 180

tgtgctggaa tcagcgtatt gggctgcgtt cgtgccgttt tttgcaaaag ccaataaagg 240

ctccggcagg gcttttaagc tcgggtttcc ccatgtcgtg ccaccatgaa acccattcgt 300

catggagagc ataaatgtca tatcctggcg caacggtttt agcgtcatgc atggtttcgg 360

gatcaatgta gggagcatcc ctaacaggga caataacgtc ggcctttgtt ttaaggctca 420

agcggttgcg aaatagaatg atgtcgtcgg ccattgtgat ggcatagtca ggaaaatgag 480

catggctggt gtcatgcgca caaactttct taaccaagga tcgaaagacg cgaagcggac 540

tatttgagcc acattttttt tgcagcagct ctaatccgat cttccattca tctttcatac 600

cgcagtgttt gcgggctagc tcgtacatgc gtcgttcgaa tggtttacga agtcggaaat 660

agtctcggtg aagtgttagg acgttcttac tgatgactga acgatagacc caatctgaca 720

gagtgatttc gagatcaagc attcggccat caaacgtctt acgggtgatt ctagcttctt 780

cgatcaaacc gaaaattcgc gtctcttcaa tgccgcctgt ttgaatgttg gttcgcacgg 840

ttgttccgcg caagcgcgtc aacgcgtcgg ccagtagtct atagcctgct ccgctggttt 900

gacgattggt agcgaccagc atgtcataag cttgaaggcg gagtgtccgg cctggttgtt 960

cgccgtgatt cattttcgca acgagctgag agatgcagta gattaggata tccttgtcat 1020

gaatcgttgc tagccctttg ccagacggga tgatctctat gatattccca ttgtgttcat 1080

agcgtcgcat ccgagtgtca ggcttggtcg agagcgaaaa aacaggatgc tccattgacg 1140

ccatatcatc tttgggaatg gcatcgagca cgtcacagat gaatagatcc tgattgggat 1200

ggcggactgg caggaggggc gtgcgatcct caccttccat agccagagaa ggcgcaatgt 1260

cgaacaagga aggagaagat tctatcgtca tttcaattac agatagctac tatcgtcact 1320

tcacatacgc aagccaatta tcgtcatatt agattcagtt tgagcttatc gtcatttcaa 1380

ttgcgcatgc ttgctatcgt catagcggat tcagtttatc gtcatagtgg attcagttta 1440

tcgtcatagt ggattcacaa gacgacagaa tctttcaata acacctttat tattcaaggt 1500

gttattccgt ctctgaaaaa ccgtaacact gtttaaacac ctattaaaca ctctaatctg 1560

tggataactt ttcattccct aaaattttca gccaaattga gcc 1603

<210> 15

<211> 1183

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caaaccttcg ttgccacctg tccagcctgc tcctgtcctc gcaccaggtg caaccggaat 60

tgccccgttc gtcgcttcct gagccatttt gtccgtcccc ggttccgctg gccttgcagg 120

ctccgggcga gcgcggagcg ggagcggcgt agcccgccga aggcgccgga gcggtgtgac 180

ggtcaatcga cccactgcat cgctgaagcg cctcaccaat agttcgaaaa cgaaattata 240

tgccgatttg atgagcctct gatccgcccc cgagggtcca ccggcacggc ttcgctaccg 300

ctcacgcagg gcgttcgctg cgccgctccc gtgggcttcg gggacggccc aaagatcata 360

gagagggact gcgaaaaaaa atattgttta tcaaaacctt atgggggggg ggtagcccac 420

cagctatggg ctacccctag cccaccagct atgggctagg tttggatgaa tttcgtccaa 480

atttggattg aattaatcta cattttttgc cattaaatgg atgaaattta tccaattttg 540

gacagataat tgtctgattt gacctagggg taggccatga agtcgaagca agttggatta 600

acaaccgcac ccaacggaac ttgggtgcaa gtcgaacgag ccgctatgga acgctggtca 660

aaattagctg tatccaaccc tagggccgcc gccgtgatga tgcttatgac ctcccaaatg 720

ggccgcaata atgctctcgt cgcatcccaa gccacgttag ctaaaatggc aggttgcggc 780

ttgaatactc tcaaaagagc tttgtctgtt ttacgagaag gcaactggat tgaagttcga 840

cagataggcc ccactggcac agcctgtgct tacgtcgtta atgatcgcgt agcgtggtct 900

ggaaaccgcg acggcatccg ttacagcctg ttttctgctt ctgtgctgct cgcagacaat 960

gaacaacccg ataaggatga aattggctta cagccgtctc tacaccccgt tccagaccta 1020

tatccgggag agaagcagct accaaccggt cccggcctac caccaccgtc tcaaccttcc 1080

ttcgacggca tggaaccgga cttacctgcc accgaaaaat agctcggcca atgtccaagc 1140

gcacgtcgtc cgaagggcga cgtataagcg cgcactcacc gaa 1183

<210> 16

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

<210> 17

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atggtctcca aaggtgaaga gttgttcacg ggtgtcgttc caattttggt tgagttggat 60

ggtgatgtta acggtcacaa gttttcggtt tccggtgagg gtgagggtga tgctacgtat 120

ggtaagttga ctttgaaatt tatctgcact actggtaagt tgcctgttcc ttggccaact 180

ttggttacga cttttggtta tggtttgcag tgttttgcta ggtatccaga tcatatgaag 240

caacatgatt tttttaagtc cgctatgcct gagggttatg ttcaggaaag gactattttt 300

tttaaggatg atggtaacta caagactaga gctgaagtaa aatttgaagg tgacactcta 360

gttaatagga tcgaattgaa aggtattgat ttcaaggaag atggtaatat tctgggtcat 420

aaactggaat ataactataa tagccacaac gtatacatca tggctgataa acaaaaaaat 480

ggtattaaag ttaattttaa aattagacat aatattgaag atggttctgt tcaattggct 540

gatcattatc aacaaaatac tccaattggt gatggtccag ttttgttgcc agataatcat 600

tatttgtctt atcaatctgc tttgtctaaa gatccaaatg aaaaaagaga tcatatggtt 660

ttgttggaat ttgttactgc tgctggtatt actttgggta tggatgaatt gtataaatag 720

<210> 18

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg aggggcgagg gcgagggcga tgccaccaac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgagcca cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaccta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcgtcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaacttcaa cagccacaac atctatatca tggccgtcaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacgtggagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacagccac 600

tacctgagca cccagtccgt gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tccgcaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 19

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atggccctgt ccaacaagtt catcggcgac gacatgaaga tgacctacca catggacggc 60

tgcgtgaacg gccactactt caccgtgaag ggcgagggca gcggcaagcc ctacgagggc 120

acccagacct ccaccttcaa ggtgaccatg gccaacggcg gccccctggc cttctccttc 180

gacatcctgt ccaccgtgtt catgtacggc aaccgctgct tcaccgccta ccccaccagc 240

atgcccgact acttcaagca ggccttcccc gacggcatgt cctacgagag aaccttcacc 300

tacgaggacg gcggcgtggc caccgccagc tgggagatca gcctgaaggg caactgcttc 360

gagcacaagt ccaccttcca cggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt gatggccaag 420

aagaccaccg gctgggaccc ctccttcgag aagatgaccg tgtgcgacgg catcttgaag 480

ggcgacgtga ccgccttcct gatgctgcag ggcggcggca actacagatg ccagttccac 540

acctcctaca agaccaagaa gcccgtgacc atgcccccca accacgtggt ggagcaccgc 600

atcgccagaa ccgacctgga caagggcggc aacagcgtgc agctgaccga gcacgccgtg 660

gcccacatca cctccgtggt gcccttctaa 690

<210> 20

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgggtaagg gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaagcttc ctgttccttg gccaacactt 180

gtcactactc ttacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240

cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggaaaggac catcttcttc 300

aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga cacccttgtc 360

aacaggatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420

ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

<210> 21

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120

gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180

caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720

ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780

gacgagttct tctga 795

<210> 22

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840

tcactgatta agcattggta a 861

<210> 23

<211> 533

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atgttacgca gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaggt 60

ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg 120

cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat 180

cagccggact ccgattacct cgggaacttg ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct 240

gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag 300

cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat ctcgcagtct ccggagagca ccggaggcag 360

ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat 420

gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg 480

ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat atcgacccaa gtaccgcacc taa 533

<210> 24

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc 60

gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc 120

ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa 180

acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc 240

gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt 300

tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt 360

atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa 420

catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag 480

gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct 540

ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc 600

aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat 660

cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc 720

tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta 780

gtcggcaaat aa 792

<210> 25

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtgaaaccca acatacccct gatcgtaatt ctgagcactg tcgcgctcga cgctgtcggc 60

atcggcctga ttatgccggt gctgccgggc ctcctgcgcg atctggttca ctcgaacgac 120

gtcaccgccc actatggcat tctgctggcg ctgtatgcgt tggtgcaatt tgcctgcgca 180

cctgtgctgg gcgcgctgtc ggatcgtttc gggcggcggc caatcttgct cgtctcgctg 240

gccggcgcca ctgtcgacta cgccatcatg gcgacagcgc ctttcctttg ggttctctat 300

atcgggcgga tcgtggccgg catcaccggg gcgactgggg cggtagccgg cgcttatatt 360

gccgatatca ctgatggcga tgagcgcgcg cggcacttcg gcttcatgag cgcctgtttc 420

gggttcggga tggtcgcggg acctgtgctc ggtgggctga tgggcggttt ctccccccac 480

gctccgttct tcgccgcggc agccttgaac ggcctcaatt tcctgacggg ctgtttcctt 540

ttgccggagt cgcacaaagg cgaacgccgg ccgttacgcc gggaggctct caacccgctc 600

gcttcgttcc ggtgggcccg gggcatgacc gtcgtcgccg ccctgatggc ggtcttcttc 660

atcatgcaac ttgtcggaca ggtgccggcc gcgctttggg tcattttcgg cgaggatcgc 720

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<210> 26

<211> 2603

<212> DNA

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aaagtcagag ctacttcgca ggaccgtcgc cctatgcccc gcaggctcct ggcgtaaacg 600

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cgcgatactc tccgctttcg gaaattacgc ctgagaacgc aagcaagctc aaggtcgctt 780

tcgtctacca cacggggagt tatccgcgtc cgggacaggt gaacaaatgg gccgccgaaa 840

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ccattcccta taccgctgcc tgtaagggtg tgacgtattt cacgtcctcc gtggtgccgg 1020

aaggccagcc ctgccacaat cgccttatcg aaggcacgct ggatatgcgt ctgattgcgg 1080

tggacgcgga gacaggggat ttctgcccta atttcggtca tggtggtcag gtcaacctga 1140

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accgtcgtac cggcaagcca attctgccgg ttgaagaacg ccccgctccg tcccctggtg 1740

ttattccggg tgacccgcgt tctccgacgc agccatggtc cgtcgggatg ccggcccttc 1800

gcgtgccgga tctgaaagag acagacatgt ggggtatgtc ccccatcgat cagctcttct 1860

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<210> 27

<211> 452

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 27

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Asp Val Ile Ala Gln Ala Ala Thr Ile Met Arg Ala Arg Leu Arg Ser

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Met Arg Pro Met Gly Pro Gln Ser Gly Ala His Tyr Thr Asp Thr Lys

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Ser Gly Gln Val Gly Val Ser Cys His Ala Trp Ser Gln Ala Cys Val

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<210> 28

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<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 28

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<211> 319

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 29

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1 5 10 15

Met Gly Ile Glu Lys Asp Pro Ser Ser Lys Thr Phe Arg Ser Ala Pro

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Ser Asp Gln Glu Gln Gly Asp Phe Phe Val Pro Gly Leu Tyr Asp Leu

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Ser Lys Lys Asp Lys Arg Ala Asn Asp Val Met Ile His His Leu Pro

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<210> 30

<211> 309

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 30

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Leu Gln Leu Asp Ile Asp Arg Gln Val Val Glu Ala Ala Ala Ala Tyr

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Gly Ala Ala Gly Glu Pro Val Pro Val Gly Val Pro Tyr Gly Ser Arg

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<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 31

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<210> 32

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<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 32

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<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 33

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195 200 205

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245 250 255

Ser Thr Val His Glu Glu Leu Arg Gly Gly Phe Asp Val Ala Ile Arg

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Arg Gly Val Ala Gly Ala Gly Ala Trp Ser His His Arg Ala Thr His

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290 295 300

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Ala Ser Glu Thr Arg Pro Gly Asp Trp Ile Asp Trp Leu Glu Ala Ala

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420 425

<210> 34

<211> 331

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 34

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Gly Phe His Gly Pro Phe Gln Lys Ala Phe Gln Ala Ile Val Ile Asn

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Pro Leu Leu Thr Arg Met Ala Gly Gly Asp Tyr Arg Gln Asn Ile Glu

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Asn Ala Gln Pro Asp Ile Tyr Thr Leu Thr Leu Ala Gln Thr Ile Ala

195 200 205

Leu Gly Val Gly Trp Asn Gly Arg Gly Gln Met Leu Ala Arg Asp Asn

210 215 220

Pro Asn Thr Leu Arg Ala Val Val Pro Ser Glu Gly Ser Val Ala Gln

225 230 235 240

Ile Asn Thr Leu Asn Leu Thr Ala Pro Pro Gln Arg Ala Arg Leu Ala

245 250 255

Gln Ala Phe Ile Glu His Ala Leu Ser Pro Asp Val Gln Thr Ala Phe

260 265 270

Ala Asn Val Ala Phe Tyr Gly Pro Val Asn Arg Gln Val Val Leu Ser

275 280 285

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Glu Met His Leu Asp Trp Gly Phe Val Ser Gln His Tyr Asn Ser Trp

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Ile Arg Arg Ile Gln Arg Glu Val Ile Ser Gly

325 330

<210> 35

<211> 176

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 35

Met Gly Leu Gly Arg Gly Gly Pro Thr Asn Asn Arg Leu Arg Glu Gln

1 5 10 15

Leu Glu Arg Leu Val Asn Cys Thr Ile Thr Phe Arg Phe Gly Lys Asp

20 25 30

Asp Ala Gly Val Ile Val Asn Glu Arg Ile Val Glu Ala Tyr Lys Tyr

35 40 45

Ser Gly Lys Val Asp Pro Arg Ser Lys Ser Lys Thr Arg Trp Ile Glu

50 55 60

Arg Ile Val Leu Ser Glu Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Lys Lys His Pro

65 70 75 80

Val Arg Ile Asp Arg Glu Ala Ile Lys Asp Ile Gln Thr Ser Pro Gln

85 90 95

Ala Ile Asp Ala Tyr Leu Trp Leu Ala Phe Arg Leu His Val Leu Gln

100 105 110

Ser Asp Thr Phe Val Ser Trp Pro Ser Leu Trp Lys Ser Phe Gly His

115 120 125

Gln Tyr Lys Leu Leu Arg Thr Phe Lys Arg Glu Phe Leu Glu Pro Phe

130 135 140

Ser Ile Ala His Ala Ala Tyr Pro Asn Ser Arg Val Asp Ile Ser Glu

145 150 155 160

Arg Gly Ile Thr Leu Lys Pro Ser Pro Pro Pro Val Pro Leu Lys Ala

165 170 175

<210> 36

<211> 225

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 36

Met Tyr Asn Asp Gly His Trp Glu Lys Leu Phe Val Pro Tyr Gly Thr

1 5 10 15

Lys Pro Arg Leu Ala Leu Phe His Ile Ser Thr Glu Ala Ile Arg Thr

20 25 30

Lys Ser Arg Thr Val Ala Val Gly Arg Thr Ile Ser Glu Phe Met Lys

35 40 45

Arg Leu Asn Ile Ser Gln Asn Gly Pro Ser Arg Glu Ala Phe Arg Ala

50 55 60

Gln Met Asn Ala Leu Cys Ala Cys Glu Met Lys Leu Gly Tyr Gly Ser

65 70 75 80

Arg Asn Leu Asn Ala Arg Pro Val Asp Glu Phe Asp Ala Trp Thr Lys

85 90 95

Asn Leu Ala Lys Asp Ser Thr Ile Glu Leu Ser Glu Lys Phe Trp His

100 105 110

Glu Leu Lys Glu Asn Ala Val Pro Leu Asp Pro Arg Ala Leu Glu Gly

115 120 125

Leu Gln His Ser Ala Leu Ala Leu Asp Ile Tyr Thr Trp Leu Ala His

130 135 140

Arg Leu His Arg Val Arg Gly Ser Gly Glu Arg Leu Thr Trp Ser Asn

145 150 155 160

Leu Arg Leu Gln Phe Gly Gln Glu Tyr Thr Asp Asp Lys Asn Phe Lys

165 170 175

Lys Ala Phe Leu Ile Ala Leu Arg Gln Val Ser Ala Val Tyr Pro Asp

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Pro Val Pro Arg Gln Thr Val Val Phe Ser Lys Val Ile Gly Ser Glu

210 215 220

Ala

225

<210> 37

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<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 37

Met His Ser Asn Ala Lys Ser Gln His Asp Leu Phe Arg Ser Ile His

1 5 10 15

Glu Leu Val Glu Ala His Gly Pro Gln Asp Ala Ile Lys Ile Ala Gln

20 25 30

Asn His Ser Leu Glu Lys Asp Ser Glu Ala Ser Ala Leu Thr Asp Pro

35 40 45

Ile Leu Asp Val Val Ala Gly Arg Ser Gly Arg Lys Ile Val Asp Ala

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Leu Val Arg Glu Ile Glu Gly Gly Ser Ser Ile Gly

65 70 75 80

Tyr Ser Tyr Ser Ala Trp Cys Leu Ala Gly Leu Pro His Arg Glu Arg

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Lys Pro Gly Glu Asp Trp Leu Ile Lys Thr Asp Phe Ala Gln Leu Leu

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Pro Ala Ser Leu Leu Lys Arg Met Gly Leu Ser Arg Gly Gly Pro Ile

165 170 175

Ser Lys Lys Leu Val Glu Gln Ile Glu Arg Leu Ala Thr Cys Thr Val

180 185 190

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305 310 315 320

Ala Lys Val Ala Val Thr Glu Arg Gly Leu Val Leu Ser Pro Ser Pro

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Pro Pro Val Ser Ser

340

<210> 38

<211> 454

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 38

Met Glu His Ser Ala Gln Thr Gln Arg Ala Gln Ala Pro Cys Thr Arg

1 5 10 15

Arg Gly Arg Arg Arg Ile Ser Glu Ala Met Leu Ala Ala Arg Asp Glu

20 25 30

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Met Leu Lys Ser Leu Arg Gly Val Leu Pro Val Ser Arg Gly Ala Ala

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Leu Ser Val Ala Leu Ala Gly Gln Cys Ala Glu Pro Glu Ser Gly Pro

225 230 235 240

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245 250 255

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<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 39

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1 5 10 15

Leu Gln Leu Asp Ile Asp Arg Arg Val Ile Asp Ile Ala Ser Gly Tyr

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Met Ser Ser Glu Glu Leu Gly Ile Gly Phe Leu Tyr Ser Gly Trp Ala

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Asp Ser Thr Gly Phe Leu Asn Gln Asn Ile Ile Asp Ser Gly Met Ile

165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

Pro Thr Pro Ile Thr Trp Ala Ala Leu Lys Leu Gln Phe Gly Pro Gly

245 250 255

Val Ala Arg Met Asp His Phe Arg Thr Gly Phe Leu Asp Asn Leu Gly

260 265 270

Leu Ala Leu Ala Val Tyr Pro Ala Ala Lys Val Asp Val Asp Arg Thr

275 280 285

Gly Ala Thr Leu Phe Pro Ser Pro Pro Pro Val Lys Pro Lys Thr Leu

290 295 300

Ser

305

<210> 40

<211> 366

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 40

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<210> 41

<211> 181

<212> PRT

<213> Gluconobater oxydans

<400> 41

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Leu Pro Pro Pro Ser Gln Pro Ser Phe Asp Gly Met Glu Pro Asp Leu

165 170 175

Pro Ala Thr Glu Lys

180

Claims (10)

1.穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体上含有如SEQ ID NO.1～15所示的基因。

2.根据权利要求1所述的穿梭载体，其特征在于，以pMD19-T Simple Vector载体为穿梭载体骨架。

3.根据权利要求1或2所述的穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体上具有如SEQ IDNO.21～SEQ ID NO.25任一所示的抗生素抗性基因。

4.重组微生物细胞，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述的穿梭载体。

5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，宿主细胞是氧化葡萄糖酸杆菌，包括但不限于：氧化葡萄糖酸杆菌WSH-004、氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003、氧化葡萄糖酸杆菌1.049、氧化葡萄糖酸杆菌621H或氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC 1.110。

6.权利要求1～3任一所述的穿梭载体在表达蛋白中的应用。

7.权利要求1～3任一所述的穿梭载体在提高目的基因表达量方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因为内源基因或外源基因。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因为山梨醇脱氢酶基因。

10.含有权利要求1～3任一所述穿梭载体的氧化葡萄糖酸杆菌在食品、生物领域发酵生产产品中的应用。

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