CN104673736A - 一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-l-古龙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-L-古龙酸的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过基因工程改造，基于接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig，将CutA基因与糖酸转化中的关键酶基因融合表达，改造G.oxydans一步发酵生产2-KLG，最终提高2-KLG的产量至40.3g/L，较未表达CutA的一步工程菌提高了24.4％；并且外源蛋白耐热性使工程菌的耐热性有所提高。本发明通过表达外源蛋白CutA实现细胞内酶的交联，有利于多种酶连续催化反应，对维生素C一步发酵生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-L-古龙酸的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
维生素C(Vitamin C，VC)，又称抗坏血酸(Ascorbic acid)，是一种人体必需的维生素和抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等工业。目前国内维生素C工业化生产采用两步发酵法，该方法第二步发酵，即将山梨糖转化2-KLG，是由巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)组成的混菌发酵系统实现的。在该系统中，执行糖酸转化的微生物只有小菌(K.vulgare)，然而小菌单独生长困难，需要大菌(B.megaterium)伴生才能正常生长。混菌发酵控制为生产工艺增加了很大困难，且小菌产酸性状不稳定，经常因菌种退化造成倒罐，导致生产屡受重创。我国维生素C生产由3种细菌参与，势必在微生物代谢过程中造成底物和培养基的大量浪费，而两步发酵过程不但延长了生产周期还增加了能源和人力成本。因此，现有维生素C两步发酵工艺尚存在巨大的发展潜力。
氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是两步发酵法生产2-KLG中第一步发酵过程常用菌种，通过基因工程手段将维生素C两步发酵有关基因克隆到G.oxydans中构建得到一步发酵菌株，实现由山梨醇经单菌一步发酵生成2-KLG，解除了小菌对伴生菌依赖的问题，简化了维生素C生产工艺。
CutA是一种微生物调节蛋白，可形成三聚体结构，并且具有交联作用。本发明利用CutA蛋白三聚体交联作用，结合内蛋白(包括接头蛋白和配体蛋白)的自聚集作用，将CutA基因与糖酸转化中的关键酶基因融合表达，改造G.oxydans一步发酵生产2-KLG(Vc前体)，最终提高了2-KLG的产量。本发明通过表达外源蛋白CutA实现细胞内酶的交联，有利于多种酶连续催化反应，并且外源蛋白耐热性使工程菌的耐热性有所提高，对维生素C一步发酵生产具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的方法，是以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)为宿主，基于接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig，将CutA基因与糖酸转化中的山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因进行融合表达。
本发明的一种实施方式，是将编码耐热交联蛋白的基因cutA通过编码接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig的基因克隆于质粒pGUC-tufB-sdh-GGGGS-sndh上，构建表达质粒pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA，再转化氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)生产2-KLG。所述质粒pGUC-tufB-sdh-GGGGS-sndh的构建方法，参见文献Stepwise metabolic engineering of Gluconobacter oxydans WSH-003 for the directproduction of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol(Gao L,et al.Metab.Eng.2014Jul；24:30-7)中质粒pGUC-k0203-GS-k0095的构建方法。
本发明的一种实施方式，是将编码接头蛋白SH3、山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的基因进行融合，连接启动子tufB，将编码配体蛋白SH3lig的基因与cutA基因进行融合，也连接一个启动子tufB，将上述两融合基因片段以质粒pGUC为出发载体构建表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；将得到的表达载体转化G.oxydans得到重组菌。GGGGS、(GGGGS)2为连接肽，分别连接山梨糖脱氢酶、山梨酮脱氢酶，和SH3lig、CutA。
在本发明的一种实施方式中，所述cutA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌是G.oxydans WSH-003。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌一步工程菌的构建方法，是将编码接头蛋白SH3、山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的基因进行融合，连接启动子tufB，将编码配体蛋白SH3lig的基因与cutA基因进行融合，也连接启动子tufB，将上述两基因片段以质粒pGUC为出发载体构建表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；将得到的表达载体转化G.oxydans得到重组菌株。
具体地，所述构建方法包括：
(1)以编码连接肽GGGGS的基因连接编码山梨糖脱氢酶的基因sdh和编码山梨酮脱氢酶的基因sndh，得到序列如SEQ ID NO.5所示的sdh-GGGGS-sndh的序列；融合编码接头蛋白SH3的序列SEQ ID NO.2和sdh-GGGGS-sndh，得到SH3-sdh-GGGGS-sndh；以质粒pGUC为载体，酶切连接tufB启动子，得到带接头蛋白的脱氢酶融合表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh；
(2)以编码连接肽(GGGGS)2的基因连接编码配体蛋白SH3lig的基因与cutA基因，以质粒pGUC为载体，酶切连接tufB启动子，得到pGUC-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；
(3)将两个表达质粒pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh和
pGUC-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA，通过酶切连接，得到重组表达载体
pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA，电转至G.oxydans得到一步工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述cutA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，tufB启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述氧化葡萄糖酸杆菌一步工程菌发酵生产2-KLG的方法，是将活化后的工程菌，按15％(v/v)接种量转接至发酵培养基，30℃，200r/min，发酵168h。
活化用种子培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1.0，pH4.8～5.1，琼脂20(固体培养基)，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
所述发酵培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1.2，氯化钙0.2，初始pH5.1～5.4，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
本发明通过基因工程改造，基于接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig，将CutA基因与糖酸转化中的关键酶基因融合表达，改造G.oxydans一步发酵生产2-KLG(Vc前体)，最终提高了2-KLG的产量，2-KLG的产量可达40.3g/L，较未表达CutA的一步工程菌提高了24.4％；并且外源蛋白耐热性使工程菌的耐热性有所提高。本发明通过表达外源蛋白CutA实现细胞内酶的交联，有利于多种酶连续催化反应，对维生素C一步发酵生产具有重要意义。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。
附图说明
图1基于CutA表达的蛋白结构示意图。
图2一步菌株发酵曲线图，▲和△分别表示G.oxydans/
pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA和G.oxydans/
pGUC-tufB-sdh-GGGGS-sndh生产2-KLG的产量；●和○分别表示G.oxydans/
pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA和G.oxydans/
pGUC-tufB-sdh-GGGGS-sndh的菌体浓度(OD600)。
具体实施方式
山梨醇、2-KLG含量测定：液相色谱(LC)
Agilent 1100system,RioRad公司Aminex HPX-87H色谱柱；流动相：2.75μmol/L浓硫酸；柱温：35℃；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：示差折光检测器。
实施例1表达载体及一步工程菌的构建
大肠杆菌-氧化葡萄糖酸杆菌穿梭质粒载体pGUC的构建方法参见江南大学2014年博士学位论文：一步单菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸工程菌的构建与优化，高丽丽。
(1)以编码连接肽GGGGS的基因连接编码山梨糖脱氢酶的基因sdh和编码山梨酮脱氢酶的基因sndh，得到序列如SEQ ID NO.5所示的sdh-GGGGS-sndh的序列；融合编码接头蛋白SH3的序列(SEQ ID NO.2)和sdh-GGGGS-sndh，得到SH3-sdh-GGGGS-sndh；以质粒pGUC为载体，酶切连接tufB(SEQ ID NO.4)启动子，得到带接头蛋白的脱氢酶融合表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh；
(2)以编码连接肽(GGGGS)2的基因连接编码配体蛋白SH3lig(SEQ ID NO.3)的基因与cutA基因(SEQ ID NO.1)，以质粒pGUC为载体，酶切连接tufB启动子，得到pGUC-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；
(3)将两个表达质粒pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh和
pGUC-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA，通过酶切连接，得到重组表达载体
pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；
(4)将构建好的表达载体转化到E.coli JM109，涂布到含有氨苄青霉素的LB培养基上，挑取平板上的转化子进行PCR验证，再电转至G.oxydans WSH-003中，得到G.oxydans/pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA一步工程菌，基于CutA表达后的蛋白结构示意图及发酵结果见图1和图2。
实施例2发酵生产2-KLG
种子培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1，pH4.8～5.1，琼脂20(固体培养基)，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
发酵培养基(g/L)：山梨醇15，酵母膏1.2，氯化钙0.2，初始pH5.1～5.4，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
培养条件：从固体平板上刮取几环菌体接种于装有50mL液体培养基(加入终浓度75μg/mL氨苄青霉素)的500mL双刺摇瓶中，30℃旋转式摇床200r/min振荡培养至对数生长期(30h左右)，按15％(v/v)接种量转接至终浓度75μg/mL氨苄青霉素的新鲜培养基，再培养至对数生长期，按15％(v/v)接种量转接发酵培养基，30℃，200r/min，发酵168h。2-KLG产量为40.3g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种2-酮基-L-古龙酸产量提高的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌，其特征在于，基于接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig，将CutA基因与糖酸转化中的山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因进行融合表达。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述CutA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，编码所述接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，是将编码接头蛋白SH3、山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的基因进行融合，连接启动子tufB，将编码配体蛋白SH3lig的基因与cutA基因进行融合，也连接一个启动子tufB，将上述两融合基因片段以质粒pGUC为出发载体构建表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；将得到的表达载体转化G.oxydans得到重组菌。
5.一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，基于接头蛋白SH3及其配体蛋白SH3lig，将CutA基因与糖酸转化中的山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因进行融合表达。
6.一种构建权利要求1-4任一所述2-酮基-L-古龙酸产量提高的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌的方法，其特征在于，是将编码接头蛋白SH3、山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的基因进行融合，连接启动子tufB，将编码配体蛋白SH3lig的基因与cutA基因进行融合，也连接一个启动子tufB，将上述两融合基因片段以质粒pGUC为出发载体构建表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；将得到的表达载体转化G.oxydans得到重组菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)以编码连接肽GGGGS的基因连接编码山梨糖脱氢酶的基因sdh和编码山梨酮脱氢酶的基因sndh，得到序列如SEQ ID NO.5所示的sdh-GGGGS-sndh的序列；融合SEQ ID NO.2所示编码接头蛋白SH3的序列和sdh-GGGGS-sndh，得到SH3-sdh-GGGGS-sndh；以质粒pGUC为载体，酶切连接tufB启动子，得到带接头蛋白的脱氢酶融合表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh；
(2)以编码连接肽(GGGGS)2的基因连接编码配体蛋白SH3lig的基因与cutA基因，以质粒pGUC为载体，酶切连接tufB启动子，得到pGUC-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA；
(3)将两个表达质粒pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh和pGUC-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA，通过酶切连接，得到重组表达载体pGUC-tufB-SH3-sdh-GGGGS-sndh-tufB-SH3lig-(GGGGS)2-cutA，电转至G.oxydans得到一步工程菌。
8.一种应用权利要求1-4任一所述氧化葡萄糖酸杆菌重组菌发酵生产2-KLG的方法，其特征在于，是将活化后的重组菌菌，按15％(v/v)接种量转接至发酵培养基，30℃，200r/min，发酵168h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1.2，氯化钙0.2，初始pH 5.1～5.4，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
10.权利要求1-4任一所述氧化葡萄糖酸杆菌重组菌在维生素C生产中的应用。
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