CN102080075A - 一种无缝基因克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不含有人工碱基的无缝基因克隆方法，步骤有:i)根据目的基因和目标载体的序列，设计、合成嵌合体引物；ii)实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR,获得融合线性片段；iii)DpnI消化PCR产物,去除带甲基化的模板质粒DNA;iv)转化大肠杆菌菌株DH5α；v)挑取单克隆菌落测序鉴定；vi)酶切确认重组质粒的整合情况。该方法不需要特殊的限制性内切酶和连接酶以及碱性磷酸酶，而且可以将任意目的基因融入任意目标载体的任意位置。该方法原理简单，操作简便，位点精确可控，阳性率高，适用范围广。

Description

一种无缝基因克隆方法

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种不含有人工碱基的无缝基因克隆方法。

背景技术

基因克隆是进行基因鉴定及其生物学功能分析的基本方法，是现代分子生物学最重要的技术之一。目前，基因克隆的方法主要包括两大类，一类依赖酶切连接反应(ligase-dependent cloning，LDC)，一类不依赖于酶切链接反应(ligase-independent cloning，LIC)。LDC的应用最为广泛，其主要原理是利用能够识别特异DNA序列的限制性内切酶，将目的基因和目的载体酶切后再用连接酶将各个片段连接起来，从而形成重组DNA分子(LU，Q.2005.Seamless cloning and genefusion.Trends Biotechnol，vol.23，no.4，p.199-207.)。LDC的缺点也非常明显：(1)酶切与连接的步骤复杂烦琐，费时费力；(2)限制性内切酶位点的可用性(availability)是本方法的限速步骤，特别是克隆长基因片段的时候，往往由于基因内部冗余的酶切位点而使本方法难以奏效；(3)克隆效率难以控制，这很大程度上归因于不同限制性内切酶酶切反应和连接反应的效率差异较大；(4)不可避免引入人工碱基而影响基因表达与功能研究，这主要是由于限制性内切酶位点的残留。为了规避上述限制因素，多种LIC方法应运而生。将脱氧单磷酸尿苷dUMP掺入到合成的引物中，用此类引物经PCR扩增得到的产物可被UDG酶(uracil DNAglycosylase)选择性的降解从而产生粘性末端。然后将这些携带粘性末端的PCR产物与特定载体退火即可得到重组克隆，无需进行体外连接(ASLANIDIS，C.andDE JONG，P.J.1990.Ligation-independent cloning of PCR products(LIC-PCR).Nucleic Acids Res，vol.18，no.20，p.6069-6074；RASHT CHIAN，A.；BUCHMAN，G.W.；SCHUSTER，D.M.and BERNINGER，M.S.1992.Uracil DNAglycosylase-mediated cloning of polymerase chain reaction-amplified DNA：application to genomic and cDNA cloning.Anal Biochem，vol.206，no.1，p.91-97.)。但这种方法需要合成带有修饰的特殊引物，因此难以得到有效的推广和使用。利用重组酶可将目的基因与目标载体经体外同源重组的方式产生重组DNA，但是因为重组酶的价格昂贵，使其从经济角度来考虑不是优选方案(BUCHHOLZ，F.and BISHOP，M.2001.LoxP-directed cloning：use of Cre recombinase as a universalrestriction enzyme.Biotechniques，vol.31，no.4，p.906-908，910，912，914，916，918.)。PCR介导的基因克隆通常用到”超长引物”(megaprimer)进行扩增，但是其低下的扩增效率往往造成克隆的失败，反而导致在条件优化方面需要投入更多人力和物力(VAN DEN ENT，F.and LOWE，J.2006.RF cloning：arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J Biochem BiophysMethods，vol.67，no.1，p.67-74.；BRYKSIN，A.V.and MATSUMURA，I.2010.Overlap extension PCR cloning：a simple and reliable way to create recombinantplasmids.Biotechniques，vol.48，no.6，p.463-465.)。

由此可见，发展一种快速、简便、经济的高效基因克隆方法，既是现代分子生物学发展的需要，也必将积极推动后基因组时代的基因功能研究进程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种不依赖于酶切链接反应，快速、简便、经济、高效的无缝基因克隆方法。

本发明为解决上述技术问题而提供的技术方案是：

一种无缝基因克隆方法，包括如下步骤：

i)根据目的基因和目的载体的序列，设计、合成三条引物pF，pR，p1R；

其中pF为嵌合体引物，包括P1引物和P2引物两部分，P1引物序列与目的载体插入位置5’端的20-30个碱基的序列相同，P2引物序列与目的基因5’端的20-30个碱基的序列相同；

pR也为嵌合体引物，由P3引物和P4引物两部分构成，P3引物序列与目的载体插入位置3’端的20-30个碱基的序列相同，P4引物序列与目的基因3’端的20-30个碱基的序列相同；

p1R引物序列实际为P1引物的反向互补序列；

引物P2，P4和P1R的Tm值保持一致；

ii)实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR，获得融合线性片段；

反应体系由如下成分组成：1)pF，pR，P1R引物；2)含有目的基因的DNA模板；3)目的载体模板；4)dNTP；5)高保真DNA聚合酶KOD plus；6)与KOD plus配套使用的PCR缓冲液；7)硫酸镁MgSO₄；8)超纯水；

反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性15秒，退火温度为(Tm-5)℃，时间持续30秒，延伸温度为68℃，持续时间按照1000碱基/分钟设定；循环数为30；

iii)Dpn I消化PCR产物，去除带甲基化的模板质粒DNA；

iv)转化大肠杆菌菌株DH5α；

v)挑取单克隆菌落测序鉴定；

vi)酶切确认重组质粒的整合情况。

本发明方法的一个要点，是提供了一套嵌合体引物设计方案。本发明需要三条引物，分别命名为pF，pR，p1R。pF为嵌合体引物，包括P1引物和P2引物两部分(pF＝P1+P2)。P1引物的长度为20-30个碱基，其序列与目的载体插入位置5’端的20-30个碱基的序列相同；P2引物的长度为20-30个碱基，其序列与目的基因5’端的20-30个碱基的序列相同；pF引物的总长度为40-60个碱基。pR也为嵌合体引物，由P3引物和P4引物两部分构成(pR＝P3+P4)。P3引物的长度为20-30个碱基，其序列与目的载体插入位置3’端的20-30个碱基的序列相同；P4引物的长度为20-30个碱基，其序列与目的基因3’端的20-30个碱基的序列相同；pR引物的总长度为40-60个碱基。p1R引物的长度为20-30个碱基，其序列实际为P1引物的反向互补序列。引物P2，P4和P1R的Tm值保持一致，便于后续的PCR扩增。

本发明方法的另一个要点，是提供了一种一步二元式搭桥耦联长距离PCR方法。实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR的目标是通过一步单管式PCR反应将目的基因与目的载体融合为一条线性片段。在本反应中，一级产物是由pF与pR引物扩增得到的目的基因序列。因为pR引物的P3部分与目的载体插入位点的序列互补，因此一级产物启动了二级反应，即一级产物与目的载体在插入位点处退火延伸产生二级产物(此即搭桥反应)，也就是所需的融合线性片段。在此基础上，P1R引物与pF引物共同退火到二级产物的5’和3’端引发三级反应(此即长距离PCR)，保证PCR扩增以指数形式增长，从而大量获得融合线性片段。本反应可在一个PCR管中完成，且巧妙利用搭桥耦联长距离PCR，简化了实验步骤。

本发明方法提供了一种特殊的线性融合片段。该片段的5’和3’末端具有20-30碱基的同源序列。该段同源序列保证了在转化到大肠杆菌细胞内后发生同源重组，使线性片段转变为含有目的基因的环状质粒。

本发明方法所述的嵌合体引物是脱氧核糖核酸(DNA)，不带有任何其它的化学修饰，价格低廉，易得易运易保存。

本发明所述含有目的基因的DNA模板可以是质粒DNA或基因组DNA，经逆转录得到的cDNA。但如果是质粒DNA，则必须是从非甲基化缺陷的大肠杆菌菌株中纯化而来。在本发明的一个优选方案中，含有目的基因的DNA模板是猪肌肉组织基因组DNA；目的载体模板是从非甲基化缺陷的大肠杆菌菌株(dam+菌株，如DH5α，JM109等)纯化而来，载体本身带有甲基化修饰。

本发明方法所述的Dpn I消化PCR产物，去除带甲基化的模板质粒DNA，反应体系组成是PCR产物26μl，10×Buffer Tango^TM 3μl，Dpn I 1μl；反应条件是37℃水浴锅中温育2h。

为了具体阐明本发明的实施流程和效果，在附图说明和具体实施方式中，选择的目的基因是猪肌抑素基因的启动子序列，长度分别为3.8kb和2.3kb；选择的目的载体是荧光素酶报告基因载体pGL3-basic。此处需要特别指出的是，本发明方法的应用远不止于此，附图说明和具体实施方式不构成对本发明的限制。

本发明方法不需要特殊的限制性内切酶和连接酶以及碱性磷酸酶，不需要进行片段分离、纯化、回收、连接等繁杂操作，不引入人工碱基，而且可以将任意目的基因融入任意目的载体的任意位置。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、原理简单，操作简便；

2、不需要使用各类限制性内切酶和连接酶，避免了繁琐的酶切连接等步骤，大大节省物质成本和时间成本；

3、不会引入任何人工碱基，没有酶切位点的残留；

4、插入位点精确可控；

5、适用范围广，可以将任意目的基因融入任意目的载体的任意位置。

除非特别指出或是单独定义，本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。本文所提及的所有已公开的专利申请和参考文献均已通过完整引用的方式并入本申请中。

附图说明

图1为本发明的工作原理示意图。

首先确定要克隆的目的基因、目的载体和插入位点，然后设计、合成嵌合体引物，实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR，经限制性内切酶Dpn I消化去除携带甲基化的模板质粒，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过夜培养后挑取单克隆菌落测序验证和酶切鉴定。嵌合体引物设计和一步二元式搭桥耦联长距离PCR是本技术的核心所在，其主要用处包括两个方面：一是使目的基因与目的载体在预定位点融合成为线性片段，二是利用长距离PCR大量扩增获得此类融合线性片段，以保证得到高阳性率的重组质粒。

图2猪肌抑素基因结构示意图

猪肌抑素基因转录区(黑色长方形)上游3.8kb和2.3kb的片段(白色长方形)作为启动子候选序列，克隆到报告载体pGL3-basic(黑色线条)的萤火虫荧光素酶基因(灰色长方形)上游用于检测其转录活性。这两段候选序列均包含了真核生物转录起始的必需元件CAAT盒(黑色椭圆)与TATA盒(黑色三角形)。猪肌抑素基因的转录方向用黑色箭头表示。

图3一步二元式搭桥耦联长距离PCR扩增猪肌抑素启动子与报告载体pGL3-basic的线性融合片段

猪肌抑素启动子候选序列的长度分别为3.8kb和2.3kb，报告载体pGL3-basic的长度是4.8kb，设计的插入位点是萤火虫荧光素酶基因的上游，因此融合线性片段的理论长度分别是8.6kb和7.1kb。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物可见清晰的8.6kb和7.1kb条带，另外的3.8kb和2.3kb的条带则分别是候选序列自身的扩增产物。电泳结果与预先的设计完全吻合。

图4重组质粒的纯化和酶切鉴定结果

重组质粒经测序分析后，经提取纯化结合单酶切进一步确认其真实性。因为在猪肌抑素启动子候选序列中间有一个天然的Bgl II酶切位点，而pGL3-basic的单克隆位点处也有一个Bgl II酶切位点，因此用Bgl II单酶切重组质粒，则应该切出两条带。由图示的电泳结果可知，含有3.8kb候选序列的重组质粒经Bgl II酶切后，产生的两条片段的长度分别为2.7kb和5.9kb；含有2.3kb的重组质粒经Bgl II酶切后，产生的两条片段的长度分别为1.2kb和5.9kb。这与理论分析完全相符，表明通过运用本发明所提供的基因克隆技术，已将猪肌抑素启动子候选序列以无缝形式融合到报告载体pGL3-basic质粒上。

图5重组质粒pGL3-mstn-3.8kb序列

SEQ ID No：5，下划线部分表示插入的猪肌抑素启动子候选序列，限制性内切酶Bgl II位点用方框表示，斜体部分表示嵌合体引物的载体同源序列，下划线加黑部分表示目的基因引物序列。

图6重组质粒pGL3-mstn-2.3kb序列

SEQ ID No：6，下划线部分表示插入的猪肌抑素启动子候选序列，限制性内切酶Bgl II位点用方框表示，斜体部分表示嵌合体引物的载体同源序列，下划线加黑部分表示目的基因引物序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件和方法者，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版所建议的条件。

实施例1设计、合成用于克隆猪肌抑素启动子的嵌合体引物。

猪肌抑素基因5’端3.8kb和2.3b的片段作为其启动子候选序列，克隆到报告载体pGL3-basic的萤火虫荧光素酶基因的5’端，以利于候选通过检测荧光素酶的表达测试候选序列的转录活性。根据本发明的工作原理，针对两段候选序列分别设计嵌合体引物(为了方便区分，以其长度对引物命名)，序列如下：3.8kb-pF：5’gctcgagatctgcgatctaagtaagcttggCATCATTAAACTTCTGACAAGCC3’(SEQ ID No：1，大写字母所代表的是与猪肌抑素3.8kb启动子候选序列5’末端同源的引物，小写字母代表的是与pGL3-basic插入位点5’末端同源的引物)2.3kb-pF：5’gctcgagatctgcgatctaagtaagcttggGTGCCATGAGTATTGATTCTGGAG3’(SEQ ID No：2，大写字母所代表的是与猪肌抑素2.3kb启动子候选序列5’末端同源的引物，小写字母代表的是与pGL3-basic插入位点5’末端同源的引物)pR：5’catggtggctttaccaacagtaccggaatg CGCCAAGCAAAATTTTAATGCC 3’(SEQ ID No：3，大写字母所代表的是与猪肌抑素3.8kb启动子候选序列3’末端同源的引物，小写字母代表的是与pGL3-basic插入位点3’末端同源的引物)P1R：5’ccaagcttacttagatcgcagatctcgagc 3’(SEQ ID No：4，为pF引物小写字母部分的反向互补序列)

所有引物由上海英骏生物科技有限公司合成，以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(ph＝8.0)稀释为10μmol/L的溶液，-20℃保存备用。

实施例2一步二元式搭桥耦联长距离PCR扩增猪肌抑素启动子与报告载体pGL3-basic的线性融合片段。

i)试剂与材料来源

高保真DNA聚合酶KOD plus及其配套的缓冲液(10×buffer)，dNTP，硫酸镁MgSO₄均购自东洋纺生物科技有限公司，货号为KOD-201，-20℃冻存。猪基因组DNA按照常规的酚仿抽提法进行，-20℃冻存。目的载体pGL3-basic按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行，-20℃冻存。

ii)体系组成：扩增3.8kb和2.3kb的片段只有pF引物不同，其余成分相同。

成分	初始浓度	用量	终浓度
				PCR buffer	10×	5μl	1×
dNTP	2mmol/L	5μl	200μmol/L
				硫酸镁MgSO4	25mmol/L	2μl	1mmol/L
KOD plus	1unit/μl	1μl	0.02unit/μl
				3.8kb-pF	10μmol/L	4μl	800nmo/L
或2.3kb-pF	10μmol/L	4μl	800nmo/L
				pR	10μmol/L	1μl	200nmo/L

P1R	10μmol/L	3μl	600nmo/L
				猪基因组DNA	25ng/μl	1μl	0.5ng/μl
pGL3-basic	50ng/μl	1μl	1ng/μl
				双蒸水		28μl
总体积		50μl

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。

iii)反应条件

实施PCR反应的参数如下：

iv)产物检测

PCR反应结束后，取5μl产物用1％琼脂糖凝胶做电泳检测，EB染色，紫外成像系统拍照记录结果。

实施例3Dpn I消化PCR产物

限制性内切酶Dpn I特异识别并切割甲基化的GATC序列，购自立陶宛Fermentas公司，货号ER1702。反应体系的组成如下：

成分	初始浓度	用量	终浓度
				Buffer TangoTM	10×	3μl	1×
Dpn I	10units/μl	1μl	0。33unit/μl
				PCR产物		26μl
总体积		30μl

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。

放在37℃水浴锅中温育2h，结束后置于冰上，用于转化。

实施例4转化大肠杆菌DH5α

大肠杆菌DH5α的感受态细胞和氨苄青霉素LB平板(50μg/ml)的制备均按照分子克隆(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版)的条件实施。转化体系的组成如下：

经Dpn I消化的PCR产物    5μl

DH5α感受态细胞         50μl

总体积                  55μl

将以上成分混匀，冰浴30min；

42℃热激90s；

加入不含有氨苄抗生素的液体LB培养基500l，置于37℃摇床以200rpm/min的转速复苏45min；

在台式离心机上以8000rpm/min的转速离心，将菌体沉淀下来，然后去除450μl LB培养基；

将剩余的100μl样品涂布在。氨苄青霉素LB平板上，置于37℃温箱过夜培养16h。

实施例5挑取单克隆菌落测序鉴定

因携带有甲基化的模板质粒在Dpn I的作用下已经被切割，故只有发生了同源重组形成的重组环状质粒才能在氨苄青霉素LB平板上生长。挑取直径在2～4mm左右的单菌落，置于5ml含有氨苄抗生素(50μg/ml)的液体LB培养基中，在37℃摇床以200rpm/min的转速培养8h，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

实施例6酶切确认重组质粒的整合情况

在猪肌抑素启动子候选序列中间有一个天然的Bgl II酶切位点，而pGL3-basic的单克隆位点处也有一个Bgl II酶切位点，因此用Bgl II单酶切重组质粒，则应该切出两条带。实验以pRL-TK质粒作为阴性对照。为了方便叙述，所构建的重组质粒分别命名为pGL3-mstn-3.8kb和pGL3-mstn-2.3kb。酶切体系的组成如下：

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。

放在37℃水浴锅中温育2h，取全部产物用1％琼脂糖凝胶做电泳检测，EB染色，紫外成像系统拍照记录结果。

SEQUENCELISTING

 

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

 

<120> 一种无缝基因克隆方法

 

<130> 

 

<160> 6    

 

<170> PatentInversion3.3

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

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<210> 6

<211> 7094

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 6

ggtaccgagctcttacgcgtgctagcccgggctcgagatctgcgatctaagtaagcttgg    60

 

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acgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaaca  7080

 

tttctctatcgata                                                    7094

Claims (6)

1.一种无缝基因克隆方法，其特征在于，包括如下步骤:

 （1）根据目的基因和目的载体的序列，设计、合成三条引物pF，pR，p1R；其中pF为嵌合体引物，包括P1引物和P2引物两部分，P1引物序列与目的载体插入位置5’端的20-30个碱基的序列相同，P2引物序列与目的基因5’端的20-30个碱基的序列相同；

pR也为嵌合体引物，由P3引物和P4引物两部分构成，P3引物序列与目的载体插入位置3’端的20-30个碱基的序列相同， P4引物序列与目的基因3’端的20-30个碱基的序列相同；

p1R引物序列为P1引物的反向互补序列；

引物P2，P4和P1R的Tm值保持一致；

（2）实施一步二元式搭桥耦联长距离PCR，获得融合线性片段；

反应体系由如下成分组成:i)pF，pR，P1R引物；ii)含有目的基因的DNA模板；iii)目的载体模板；iv)dNTP；v)高保真DNA聚合酶KOD plus；vi)与KOD plus配套使用的PCR缓冲液；vii)硫酸镁MgSO₄；viii)超纯水；

反应条件为:95℃预变性2分钟；95℃变性15秒，退火温度为(Tm-5)℃，时间持续30秒，延伸温度为68℃，持续时间按照1000碱基/分钟设定；循环数为30；

（3）Dpn I消化PCR产物，去除带甲基化的模板质粒DNA；

（4）转化大肠杆菌菌株DH5α；

（5）挑取单克隆菌落测序鉴定；

（6）酶切确认重组质粒的整合情况。

2.如权利要求1所述的无缝基因克隆方法，其特征在于，所述的Dpn I消化PCR产物，去除带甲基化的模板质粒DNA，反应体系组成是PCR产物26μl，10×Buffer Tango^TM 3μl，Dpn I 1μl；反应条件是37℃水浴锅中温育2h。

3.如权利要求1或2所述的无缝基因克隆方法，其特征在于，所述含有目的基因的DNA模板是质粒DNA或基因组DNA，或经逆转录得到的cDNA。

4.如权利要求3所述的无缝基因克隆方法，其特征在于，所述目的载体模板是从非甲基化缺陷的大肠杆菌菌株纯化而来。

5.如权利要求1或2所述的无缝基因克隆方法，其特征在于，所述目的基因是猪肌抑素基因的启动子序列，长度分别为3.8kb和2.3kb；选择的目的载体是荧光素酶报告基因载体pGL3-basic。

6.如权利要求5所述的无缝基因克隆方法，其特征在于，所用引物序列为: 

3.8kb-pF:5’gctcgagatctgcgatctaagtaagcttggCATCATTAAACTTCTGACAAGCC3’

2.3kb-pF:5’gctcgagatctgcgatctaagtaagcttggGTGCCATGAGTATTGATTCTGGAG3’

pR:5’ catggtggctttaccaacagtaccggaatg CGCCAAGCAAAATTTTAATGCC 3’ 

P1R:5’ ccaagcttacttagatcgcagatctcgagc 3’。

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