CN1489899A

CN1489899A - 利用基因工程技术培育“双肌”克隆猪的方法

Info

Publication number: CN1489899A
Application number: CNA021462615A
Authority: CN
Inventors: 林福玉; 邓继先; 黄培堂
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2004-04-21

Abstract

本发明公开了一种利用基因剔除和体细胞核移植法培育克隆猪的方法。该方法通过同源重组破坏猪体细胞的肌肉生长抑制素基因，体外筛选中靶细胞后，通过核移植技术最终获得基因打靶的克隆猪。本发明涉及崭新的猪育种方法具有能使优良性状稳定遗传，最终获得纯合家系的优点。

Description

利用基因工程技术培育“双肌”克隆猪的方法

技术领域

本发明涉及一种猪育种的新方法，特别涉及一种利用转基因技术培育瘦肉率增加、快速增长、饲料转化率提高的“双肌”克隆猪的方法。

背景技术

猪肉是我国人民最喜爱的肉食，除一些少数民族和生活在牧区的汉族人口外，大多数人日常食用的主要肉类是猪肉。随着人民生活的日益提高，人们对瘦肉的需求增加。就畜牧业来讲，获得高瘦肉率、快速增长、饲料转化率提高的猪的新品种，成为多年来育种工作者孜孜以求的目标。我国是传统的养猪大国，是世界上养猪最多的国家。培育品质优良的猪的品种，必将对我国国民经济产生巨大而深远的影响。

1982年，Palmiter等将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，获得“超级小鼠”。利用转基因技术进行猪的育种成为包括我国在内的众多国家的研究课题。经过20年的努力，在我国，经显微注射方法生产了数百头原代转基因猪及其后代。尽管一部分转生长激素基因猪获得了良好的表型，但有的性状不能稳定遗传，有的由于转基因多拷贝随机整合破坏某些内源基因或转基因异位表达而导致产生各种畸变。更为重要的是，直至目前，尚未获得纯合的转基因家系，给猪的基因工程育种工作的前景蒙上了一层阴影。

肌肉生长抑制素基因[myostatin(GDF8；MSTN)]剔除型小鼠比野生型小鼠的肌肉明显肥大、增生，体重增加30％，脂肪蓄积受到抑制，成为“超级小鼠”[McPherron AC，Lawler AM，Lee SJ.Regulation of skeletal muscle mass inmice by a new TGF-beta superfamily member.Nature.1997，387：83-90；McPherron AC，Lee SJ.Suppression of body fat accumulation in myostatin-deficient mice.J Clin Invest.2002，109(5)：595-601.]。经过长期遗传选育的比利时蓝牛与其他品种相比，具有更为强壮的骨骼肌，可能是由于肌肉生长抑制素基因突变的结果[McPherron AC，Lee SJ.Double muscling in cattle due tomutations in the myostatin gene.Proc Natl Acad Sci USA.1997，94(23)：12457-12461.]。因此，肌肉生长抑制素是肌肉生长的一种负调控因子。

基因打靶技术是利用外源DNA与细胞基因组DNA同源序列发生同源重组对细胞基因组进行定点修饰的技术[Capecchi MR.Altering the genome byhomologous recombination.Science.1989，244(4910)：1288～1292.]。利用基因打靶技术可以实现外源基因的单拷贝定点整合，从而剔除细胞的内源基因。

利用体细胞核移植技术生产转基因动物[Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature.1997，385(6619)：810～813]，开辟了转基因动物生产的新领域。随着多种克隆动物的诞生，这一技术显示出众多优越性，并逐步替代显微注射法。从普通的猪体细胞[Polejaeva IA，Chen SH，Vaught TD，et al.Cloned pigs produced by nucleartransfer from adult somatic cells.Nature.2000，407(6800)：86-90.]到遗传修饰过的猪体细胞[Lai L，Kolber-Simonds D，Park KW，et al.Production of alpha-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning.Science.2002，295(5557)：1089-92；Dai Y，Vaught TD，Boone J，et al.Targeted disruption of thealphal，3-galactosyltransferase gene in cloned pigs.Nat Biotechnol.2002，20(3)：251-5.]通过核移植技术都能产生仔猪，为猪的基因工程育种工作增添了新的活力。

发明内容

为提供一种培育瘦肉率增加、快速增长、饲料转化率提高的新的猪品种的方法，本发明的发明人采取了以下技术方案。

本发明的发明人首先从构建的猪的基因组文库中克隆出猪肌肉生长抑制素的基因组序列，构建基因剔除打靶载体，其中包括猪肌肉生长抑制素的基因5’端序列、抗生素抗性基因pCMV-neo序列、猪肌肉生长抑制素的基因3’端序列和pSV40-tk基因序列。分离猪胚胎成纤维细胞，进行体外培养，然后用电穿孔法或者其他转染方法将线性化的基因打靶载体导入猪胚胎成纤维细胞中，用抗生素G418和Ganc进行筛选。挑取的克隆以猪肌肉生长抑制素的基因序列作探针进行Southern印迹试验，确证同源重组事件的发生。在完成体细胞打靶后，取出猪的卵母细胞，体外活化，然后去掉活化的卵母细胞的核，然后，将抗生素抗性基因已插入猪肌肉生长抑制素的基因组序列中的猪成纤维细胞的核移植到去核猪卵中。体外培养观察，选择成活的移核卵胚移植到代孕猪的输卵管。用Southern印迹方法对出生的小猪进行DNA检测；对出生的仔猪称重，测定出生仔猪的增重情况；测定肌肉的数量、直径；测定脂肪含量等。通过基因剔除猪进行交配，获得纯合家系。

本发明涉及利用基因打靶技术剔除猪体细胞中肌肉生长抑制素基因，然后通过中靶体细胞核移植法，培育一种瘦肉率增加、快速增长、饲料转化率提高的“双肌”克隆猪的方法。这种育种方法通过同源重组，实现了基因的定点整合，可以克服普通显微注射转基因的位点效应而导致的流产、生理障碍等。同时，可以使猪的性状稳定遗传，最终获得纯和家系，达到真正培育猪的良种的目的。

本发明将为牛、羊等其他家畜品种的基因育种工作提供有意义的理论和实践指导。

本发明所指的猪包括大白猪、杜洛克、汉普夏、皮特兰、二花脸、长白猪、约克夏、东北民猪、湖北白猪等品种及我国其他地方猪的品种。

附图说明

图1为基因打靶载体及基因鉴定引物的位置示意图

图2为显微操作核移植和胚胎的体外培养

具体实施方式

材料和方法

1、试剂与培养基：所有试剂购自Sigma-Aldrich公司；所用内切酶、分子生物学方面的试剂购于Promega公司；培养基购自Gibco公司。

2、基因克隆与鉴定：从猪基因组文库用常规方法筛选出猪肌肉生长抑制素基因全长序列，进行序列分析[Stratil A，Kopecny M.Genomic organization，sequence and polymorphism of the porcine myostatin(GDF8；MSTN)gene.AnimGenet，30(6)：468-70.]。

3、猪肌肉生长抑制素基因打靶载体的构建。利用合适的酶切位点用常规分子克隆方法构建用于打靶的载体。酶切确证成功后，将载体线性化，定量后备用。

4、从性成熟或性成熟前的母猪获取成熟的卵母细胞：对性成熟后的母猪，在怀孕21-40天时，肌肉注射0.2mg前列腺素F2(a)类似物，(+)-Cloprostenol，24小时后再注射0.2mg(+)-Cloprostenol和1500IU eCG，诱导流产。在注射eCG猴2小时后，注射500IU hCG诱导超排卵。对性成熟前母猪，在注射1500IU eCG后72小时，再注射500IU hCG。在注射hCG后45小时屠宰母猪，用无Ca、无Mg的Dulbecco磷酸缓冲盐水，补充有01％BSA。获得的卵母细胞置于38.5℃的5％CO₂培养箱培养。从屠宰场取到的卵巢获取卵母细胞：从屠宰场取到的卵巢，用0.9％盐水浸洗两次，放入DPBS(含100μl/ml青霉素和100μl/ml硫酸连霉素)溶液内，用25-30℃的冷藏箱运回实验室。卵巢收集到卵泡吸出的时间控制在2-5h。预先在39℃、CO₂培养箱平衡卵丘卵母细胞复合体(COC)成熟培养基备用。选择卵巢表面直径3-6mm的中等卵泡，用18G针头的10ml注射器吸出COC，放入COC成熟培养基，挑选出至少被两层卵丘细胞包裹的卵母细胞，洗三次，然后将50-60枚COC转移到4孔板里用石蜡油覆盖500μl COC成熟培养基内。在39℃、CO₂培养箱过夜培养。培养22h后，卵母细胞用无激素的NCSU23培养基洗三次，再加500μl不含激素的NCSU 23培养基在39℃、CO₂培养箱培养22h。

5、猪胚胎成纤维细胞制备：取受精后30-35天的猪胚胎，将胚胎组织剪成小块，用含0.25％胰酶和1mM EDTA的PBS在4℃培养3小时，分散细胞。然后用含10％FBS的DMEM培养基(GIBCO)洗一次。用10％FBS的DMEM高密度地培养胚胎成纤维细胞。每次传代一传二，传到2-6代用于转染。核供体细胞培养到长满，不补充培养基继续培养16天。培养3天时，用增殖细胞核抗原(PCNA)检测仍为阳性，10天后检测为阴性，继续培养6天，细胞进入G₀期。用Giemsa染色确定每一细胞的正常核型。

6、电击转染：按常规复苏胚胎成纤维细胞，培养3天。用0.25％胰酶消化细胞，用10％FCS的DMEM培养基洗一次，用Hepes缓冲盐水悬浮细胞，计数细胞，取2×10⁷细胞，1000RPM离心，去上清。用0.8ml含有0.5pmol/ml载体DNA的Hepes缓冲盐水悬浮细胞。转移细胞悬浮液到电击池。电击条件：260V、960μFD。电击后的细胞，用无选择剂的10％FCS DMEM培养基培养在使用胶原蛋白包被的培养瓶或培养皿。培养两天后，消化细胞，计数，悬浮在含20％FCS和100μg/ml G418的Hams营养混合物，以2×10⁴细胞/孔的浓度培养在胶原蛋白包被96孔板。(正常成纤维细胞在50-75的G418培养5-7天被杀死。)培养14天后，一传三复制。一块用于提取DNA；一块用于保存。保存方法：用0.25％胰酶消化，冻存在20μl冻存液内，细胞数大约为1000-2000。

7、中靶细胞的鉴定：选用打靶载体同源臂外侧的一段猪肌肉生长抑制素基因作为探针，用组织DNA提取试剂盒，提取细胞克隆的DNA，用EcoR V、Hind III、Sal I等几种不同的内切酶酶切电泳后，进行Southern印迹，鉴定发生同源重组的细胞，阳性的细胞克隆用作核移植的核供体。

8、COC的显微操作和核移植：将COC从NCSU-23培养基移到0.3mg/ml透明质酸酶溶液，用巴斯德管打掉卵丘细胞。成熟卵母细胞放入5μg/mlBisbenzimide(Hoechst 33258)溶液30min，然后转移到含4mg/ml BSA和7.5μg/ml Cytochalase B的TL-Hepes溶液中。用25-30μm的玻璃管吸掉第1极体和M II板以及周围的少量胞浆，完成去核。在紫外光下观察玻璃管内的核体，确定是否成功地去掉胞核。去核的的卵母细胞转移到含4mg/ml BSA和01mg/ml半胱氨酸的NCSU 23培养基，在39℃、CO₂培养箱培养2h。然后移到加有300μl TL-Hepes+4mg/ml BSA的显微注射池，放到显微镜的载物台上。预先制备好锋利斜面口径10μm的注射玻璃管。每次注射后，用含15％Polyvinylpyrrolidone(分子量40,000)NCSU23洗注射管。刺破成纤维细胞，轻轻吸入可见的胞浆，去掉胞浆。然后将胞核和残存细胞碎片，通过去核的同一裂口注射到去核卵母细胞胞浆中，尽可能少地将培养基注射到卵母细胞胞浆中。

9、移植核的活化：将显微注射的卵细胞移到含4mg/ml BSA和0.1mg/ml半胱氨酸NCSU-23培养基，在39℃、CO₂培养箱培养30min。用不同浓度的Thimerosal在不同时间活化卵母细胞，然后在DTT中培养。活化的卵母细胞及时地转移到NCSU-23培养基，在39℃、CO₂培养箱培养。

10、代孕猪的制备：给孕20-30天猪，注射0.2mg的cloprostenol，24小时后注射0.2mg的cloprostenol和1000IU eCG诱导流产。在注射eCG 72小时后，注射500IU hCG诱导发情。在注射hCG 24小时后，进行人工受精，产生辅助胚胎。冲洗准备用于移植的一侧输卵管，在激活后20或40小时，注射hCG 48或68小时转移克隆胚胎。

11、出生仔猪的Southern印迹方法鉴定：留取出生时小猪的胎血或取新生猪的耳朵组织，用组织DNA提取试剂盒，提取DNA。鉴定方法同材料和方法的第7步。

12、生理生化检查：对基因剔除的小猪，进行生理生化检查，判断其健康情况。

13、纯合家系的获得。通过基因剔除猪进行交配，获得纯合家系。

结果

1、基因打靶载体的构建：从猪基因文库中获取猪的肌肉生长抑制素基因的全部编码及5’端和3’端侧翼序列。按附图1构建基因打靶载体。在这一载体中的肌肉生长抑制素基因5’端序列长度为2kb、肌肉生长抑制素基因3’端序列6kb。抗性基因为pCMV调控的neor，位于肌肉生长抑制素基因的第三外显子编码区。在肌肉生长抑制素基因3’端后连接有tk基因。在转染前线性化载体。

2、细胞转染与鉴定：复苏胚胎成纤维细胞，培养3天后用于基因打靶。打靶后的细胞培养在10％FCS DMEM培养基中48h，然后，换成含G418和FIAUHams营养混合物培养基。培养14天后，一传三复制。

细胞克隆进行Southern blot试验，分别用EcoR V、Hind III、Sal I酶切细胞DNA，用附图1标示部位的序列作探针，其显影片段与理论推测一致的细胞为基因打靶阳性细胞，将其扩增，冻存备用。

3、核移植和胚胎的体外培养：将基因打靶阳性细胞培养至80％的覆盖率，调整大多数细胞到G0期后用于核移植其过程见图2。将核移植的卵细胞转移到含4mg/ml BSA和0.1mg/ml半胱氨酸NCSU 23培养基，在39℃、CO₂培养箱培养30min，再按材料和方法中叙述方法进行活化处理。活化的卵母细胞及时地转移到NCSU23培养基，在39℃、CO₂培养箱培养。培养24-48h，胚胎可发育到4-16细胞。代孕母猪为杜罗克猪，在核移植的前三天开始给代孕母猪注射eCG，72h后注射hCG，发情后，进行人工受精，20h后选择24-48h、发育良好的胚胎用于输卵管的植入。

4、新生小猪的鉴定：由于胚胎成纤维细胞来自大白猪(约克夏种)，毛色为白色，代孕猪毛色为红色。出生小猪从颜色可初步分出克隆猪和野生型小猪。抽取克隆小猪的血液或取耳朵组织，提取DNA，进行3种内切的Southern blot试验，用鉴定细胞(见附图1)相同的探针杂交。

5、生理生化检查及分析：对基因剔除的小猪，进行生理(仔猪出生重、断奶时体重、出栏重、不同月龄重等；测定肌肉的数量、直径等，脂肪含量)及生化检查，判断其健康情况，可分析野生型和基因打靶克隆猪的差别。

6、纯合家系的获得。通过基因剔除猪进行交配，分析其后代，最终获得纯合家系。

Claims

1.利用基因工程技术培育“双肌”猪的方法，其特征在于包括利用基因打靶技术重组猪肌肉生长抑制素基因和利用体细胞核移植技术生产移核卵胚等步骤。

2.权利要求1的培育“双肌”猪的方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)克隆猪肌肉生长抑制素基因；

(b)构建肌肉生长抑制素基因打靶载体；

(c)将打靶载体导入猪胚胎成纤维细胞中，并抗生素G418和Ganc进行筛选；

(d)将抗生素抗性基因已插入猪肌肉生长抑制素的基因组序列中的猪成纤维细胞的核移植到去核猪卵中；

(e)选择成活的移核卵胚移植到代孕猪的输卵管；

(f)出生仔猪的生物学鉴定。

3.权利要求1或2的培育“双肌”猪的方法，其特征在于所说的猪为大白猪、杜洛克、汉普夏、皮特兰、二花脸、长白猪、约克夏、东北民猪或湖北白猪。