CN102787114A

CN102787114A - 一种高效定向无缝dna片段连接方法

Info

Publication number: CN102787114A
Application number: CN2012102840315A
Authority: CN
Inventors: 卢大儒; 周翔达; 宋晓; 孙海燕; 陈红岩
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Hei biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Priority date: 2012-08-11
Filing date: 2012-08-11
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2032-08-11
Also published as: CN102787114B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体为一种定向无缝DNA片段连接方法。本发明的连接引物两端要与待连接DNA片段2a和3a的待连接处两侧各有5-40个碱基的序列完全互补；由于引物的tm值随着碱基数量和GC含量的增加变高，而完成连接反应的TaqDNA连接酶活性的温度区间在65℃~50℃之间，所以连接引物1与单个待连接片段之间的互补碱基数量应使连接引物与单个待连接片段之间的tm值处于50℃~65℃之间；将片段先行磷酸化，或者将引物磷酸化，然后进行PCR扩增，以保证待连接片段的5’端带有磷酸基团。本发明的连接过程中不发生顺序错位，不产生串联寡聚体，不产生载体和片段的自连环化，操作自由度高，操作简单，周期短，价格低廉。

Description

一种高效定向无缝DNA片段连接方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效定向无缝DNA片段连接方法。

背景技术

DNA片段的连接和重组一直都是生命科学领域的重要实验手段，按照特定的目的把两个或几个DNA片段连接起来就可以构建重组分子。重组分子可有多种用途，如，连接了外源基因的重组表达载体可以运载外源基因到宿主细胞进行表达；又如，通过连接获得非天然的杂合基因，可以表达生产所需杂合蛋白。重组工程一直在追求更高的效率，更高的准确性和更大的连接长度。这一领域的进步对质粒构建、基因重组等生物操作都有着重要的意义；与之相关的每一次进步都会提供出更多更好的方法，从而推动生物研究的发展，化不可能为可能。

DNA分子的体外连接就是在一定条件下, 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的生物化学过程。传统的DNA连接和重组方法中，常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4 DNA连接酶；二者的作用机理类似，前者的反应需要NAD+参与催化，而T4连接酶的反应则需要ATP参与催化。最初的研究表明，大肠杆菌连接酶只能催化粘端的连接，现在发现在PEG或聚蔗糖存在的条件下，也能进行平端的连接。相比较而言，T4-DNA连接酶并不需要PEG等的存在就能进行平端的连接，所以现在实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。

在实际连接过程中，由于载体和片段末端的不同，也造成了策略上的多种变化和限制，主要分为粘端连接和平端连接两大类；各种连接策略如下：

（1）粘性末端的连接

单一限制性内切酶或两种限制性内切酶（为同尾酶，如BamHI和BglII）分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：3～1：10之间。同时，为了最大限度地抑制质粒DNA的自身环化，还可将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，防止其自身环化。而带5’端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli受体菌后该种缺口可在DNA复制过程种自动修复；而用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端。一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。该种粘性末端的连接载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）通常为为1：1。粘性末端共同面对的问题在于受限于酶切位点，操作自由度往往很低。

（2）平头末端的连接

平头末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。相对粘性末端，平末端连接更少受酶切位点的限制，自由度很高，几乎可以将任意DNA片段连接在一起，但是连接难度也大幅提高。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇（PEG 8000）以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。同互补粘性末端的连接一样，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

以上策略是目前绝大多数DNA连接和重组操作所采用的主流手段。

除此之外，还有一种利用同源重组原理进行DNA片段克隆和重组的方法。传统的DNA同源重组一般使用大肠杆菌λ噬菌体Red操纵子中的Redα, Redβ and Redγ来实现线性DNA片段和环状DNA之间的重组（linear plus circular homologous recombination， LCHR）。LCHR已经广泛的用于大型质粒和染色体的修饰，基因的删除和插入等等。大肠杆菌中的Rac 前噬菌体也包含一对跟Red功能相似的蛋白 RecE和 RecT ，最近的研究发现Red体系和RecET体系有着显著的区别，Red体系对于催化线性分子和环状分子之间的重组更为有效，而RecET体系能高效的催化两个线性DNA分子的同源重组（linear plus linear homologous recombination， LLHR）。它们的主要工作原理都是设计特殊的Oligo寡核苷酸引物将待插入或待连接的片段扩增，使之两端各带有一端50bp甚至更长的与接口两端序列完全互补的“同源臂”，在同源重组酶的作用下，相应的“同源臂”互相捕捉并使其所在的DNA分子之间发生同源重组，从而实现片段的定向无缝连接和重组。此方法用于连接的片段全部需要使用DNA聚合酶扩增；同时用于制造“同源臂”和扩增片段需要订购相应数量的长度很长的Oligo寡核苷酸引物。

基于T4 DNA连接酶的连接方法，在互补粘性末端和平末端的连接中难以避免载体的自连、片段的自连、连接顺序不可控、连接方向不可控以及几个分子串联形成寡聚物，其中互补粘性末端要受酶切位点的限制，平末端虽然操作自由度高，但是连接效率十分低下（仅为粘性末端连接效率的1%左右）；而非互补粘性末端的连接虽然能解决定向的问题，但对载体和片段的酶切位点提出了更多限制，对于各种情况的适应性差，操作自由度低；它们共同面对的困难就是一次性连接片段数量少，长度短。

基于同源重组的方法虽然也能够解决以上的问题，但是用于连接的片段全部需要使用DNA聚合酶扩增，即便使用高保证DNA聚合酶，扩增过程中造成的错配也是在所难免的，这会给研究增加难以预测的风险；同时用于制造“同源臂”和扩增片段需要订购相应数量的长度很长的Oligo寡核苷酸引物，往往大大提升这种方法的成本。

本项方法发明则旨在针对以上问题提供一种新型的DNA片段连接方法，能够以较为低廉的成本实现DNA片段的高效定向无缝连接和重组。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低廉，且能高效、定向、无缝的连接DNA片段的方法。

本发明提供的DNA片段的连接方法，为了将待连接DNA片段2a和3a连接起来，需要设计并化学合成一段Oligo寡核苷酸连接引物1，其设计原理如图1所示：该连接引物1两端要与待连接片段2a和3a的待连接处两侧各有5-40个碱基的序列完全互补；由于引物的tm值随着碱基数量和GC含量的增加变高，而完成连接反应的Taq DNA 连接酶5活性的温度区间在65℃~50℃之间，所以连接引物1与单个待连接片段之间的互补碱基数量应使连接引物1与单个待连接片段之间的tm值处于50℃~65℃之间，优选控制在55℃~60℃，最常用控制55℃；设计时需尽可能使连接引物1与每个待连接片段的温度基本一致，温度之差不应超过1.5℃，这样能够在相应温度下让多个连接处都取得最高的效率；由于Taq DNA 连接酶5只有在待连接片段3a的5’端有磷酸基团4的情况下，才能催化其与另一条待连接片段2a的3’端所带的羟基形成磷酸二酯键，一般酶切片段的5’端都带有磷酸基团，但是PCR扩增得到的片段则往往没有，所以需要将片段先行磷酸化，或者将引物磷酸化，然后进行PCR扩增，以保证待连接片段的5’端带有磷酸基团。

本发明的连接原理则如图2所示，在PCR扩增的高温阶段使得待连接片段2a和3a解链成为单链2b和3b后，在PCR扩增降温到低温阶段即连接引物1与单个待连接片段的tm值时，由于碱基配对原理，连接引物1会分别与待连接片段2b和3b特异性地结合，使得2b的3’端和3b的5’端紧密相邻；Taq DNA 连接酶5的连接条件要求两条链必须与同一条互补链配对结合，且必须是两条紧邻DNA链（5’端带有磷酸基团）才能被催化形成磷酸二酯键，在3b的5’端带有磷酸基团4的情况下，Taq DNA 连接酶5会将2b和3b连接成完整的单链；图3则是热循环中发生的链式连接反应的示意图，当一条连接引物在一次热循环中将两条待连接DNA片段的一侧连接成完整的单链后，在下一轮热循环中该连接引物则和完整单链脱离，继续去完成另外两条单链的连接；而在上一轮热循环中被连接上的完整单链，则在下一轮热循环中成为了新的连接模板与另一侧尚未连接上的两条单链结合，在Taq连接酶的帮助下将另一侧的单链也连接上；之后，在又一轮的热循环中，这两条完整的单链又各自成为新的连接模板将其他未连接上的单链连接在一起，以此类推，形成一个链式连接反应，实现连接产物的指数型增长。

各种不同的策略如图4、图5、图6、图7所示，其中图4显示的是平末端连接的策略：如果两个待连接片段7和8都为平末端片段，则直接按照图1所示的设计原理设计连接引物6即可；若两个待连接片段末端存在非互补粘末端，如图5所示，待连接片段10为粘端而待连接片段11为平端，则可先将待连接片段11补平为平末端12，再按照图1所示设计原理设计连接引物9即可，即便两待连接片段都是粘末端且非互补，也可以先补平，再设计连接引物；若待连接片段14和连接片段15带有互补粘性末端如，图6所示，虽然传统方法中的T4 DNA 连接酶也可以进行该情况下的定向连接，但是考虑到一次性多个片段连接时片段中可能存在平末端和互补粘末端同时存在的情况，而互补粘末端之间的tm值（17℃左右）一般远低于本方法发明中的连接反应温度（50℃~65℃），所以同样可以按照图1中所示设计原理设计连接引物13以辅助连接。一次性多片段连接的连接原理如图7所示，只需根据待连接片段的数量、方向和顺序，按照前述方法，依次设计对应的连接引物，则可以在保证连接顺序和方向全部正确的情况下实现多个片段的一次性连接。

本方法发明的关键点在于设计并合成一段两端与待连接片段各有5-30个碱基完全互补的单链Oligo寡核苷酸连接引物，在连接过程中该连接引物能将待连接片段拉在一起紧密相邻，而此类连接引物由于根据待连接片段的末端设计，只要待连接片段的末端并非完全相同，那么连接引物带有的末端识别特异性就能帮助其确保片段连接的顺序和方向都正确，连接反应则利用Taq DNA连接酶的连接特性完成。

采用本项方法发明的有益效果：连接过程中不发生顺序错位，不产生串联寡聚体，不产生载体和片段的自连环化，能够一次性连接多个片段（至少五个），连接长度长，尤其能在保证以上条件的情况下高效连接平末端片段，不受酶切位点限制，操作自由度高；用于连接的片段可以是酶切得来，不必一定使用DNA聚合酶扩增，减少了出现错配的风险；同时操作简单，得到目标产物的周期短，不需要专门的试剂盒，仅靠常规仪器和试剂就可以完成操作，价格低廉，任何实验室都可以使用。

附图说明

图1：本方法发明中连接引物设计原理示意图。

图2：本方法发明中连接引物工作原理示意图。

图3：本方法发明中链式反应示意图。

图4：本方法发明中平末端片段连接策略示意图。

图5：本方法发明中存在_---非互补粘末端连接策略示意图。

图6：本方法发明中互补粘性末端连接策略示意图。

图7：本方法发明中多个片段一次性连接策略示意图。

图8：本方法发明中实施例流程示意图。

具体实施方式

本发明方法的流程如图8所示。

步骤I，准备连接所需要的载体16、待连接的片段17、设计并合成连接引物18；载体16和片段17根据末端情况和目的分子的要求决定采用哪一种图2中所示的连接策略，即平末端直接连接，非互补粘性末端补平为平末端后连接，互补性粘性末端可补平也可直接连接，之后根据最终的末端序列设计连接引物18；注意一定要确保5’端带有磷酸基团；载体16和待连接片段17纯化后测量浓度，方便之后计算连接时的浓度配比；连接体系中根据加入片段的浓度计算连接引物的量。

步骤II，连接反应得到目的产物。连接体系一般控制在5-10μL，10μL最常用；载体16一般加入50-150ng；待连接片段17与载体16物质的量的比值，一般取其长度与载体长度比值的倒数，若待连接片段的长度大于载体长度，则摩尔浓度比值取1:1即可；连接引物18加入的量与其待连接开口的初始数量的比值从1:2到10:1均可，一般采用5:1；体系中需加入Taq DNA 连接酶的Buffer（连接缓冲液）和连接酶19，Taq DNA 连酶接Buffer（连接缓冲液）的终浓度为1X，Taq DNA 连接酶一般加入0.1μL，即40units；

之后将连接体系置于常规PCR仪20中，连接反应的热循环程序21如下：

① 94℃ -98℃（94℃最为常用） 10s-30s（10s最为常用）；

② 55℃-60℃（以设计的连接引物tm值为准，55℃最为常用） 2min；

③ 返回步骤①，循环5-30次（10次循环最为常用）；

④ 80℃ 30s（除去残留在连接产物上未脱落的连接引物）；

⑤ 60℃ 2min（将连接产物上还未连接的断口连接好）；

⑥ 4℃保温。

如果是构建环状质粒的连接反应，则之后可以向连接产物22中加入Plasmid Safe酶23，此种酶可将连接产物中未能成环的线性片段除去，可以一定程度上提升转化效率，此步骤酌情采用，略去不影响结果。

步骤III，转化和筛选目的产物。将连接产物22加入感受态细胞24中转化后，涂布在带有选择性抗性的LB固体培养基平板上25，37℃下过夜培养，最后筛选并鉴定出目的产物。产物正确率一般在90%以上。整个流程从拿到合成的连接引物后计算可在24小时内完成，其中连接的热循环反应只需30分钟左右。

实施例1：

本实施例针对将一段平末端片段与一段平末端载体相连。

步骤I，通过酶切准备连接所需要的载体16以及待连接的片段17

本实施例中载体16平端酶切位点的两端序列为（箭头表示酶切位点）：

5’-CGAATTCCTGCAGCCC ↓ GGGGGATCCACTAGTTCTAGA-3’ （SEQ.ID.NO.1）

待插入片段17两端的序列为：

5’-GCTCTAGAATGGCAGACAATTTTTCGCTC---ATATCCCTCTTGTAAGTCATCTACTTAAGGATCCCG-3’（中间省略）（SEQ.ID.NO.2）

设计并合成连接引物18，共两段，对应两个接口其序列为（序列中的空格只表示分开各自与两个片段互补的部分，实际引物是连贯的，中间没有断开）：

18-1：5’-CGAATTCCTGCAGCCC GCTCTAGAATGGCAGACAATTT-3’ （SEQ.ID.NO.3）

tm=55℃ tm=55℃

18-2：5’AGTCATCTACTTAAGGATCCCG GGGGGATCCACTAGTTCTAGA-3’

tm=55℃ tm=55℃ （SEQ.ID.NO.4）

步骤II，即为旨在得到目的产物的连接反应。本实施例中采用最常用的10μL；本实施例中载体16采用最常用的100ng；待连接片段17与载体16物质的量的比值本实施例中采用最常用的1:1；连接引物18加入的量与其待连接开口的初始数量的比值本实施例中采用最常用的5:1；体系中需加入Taq DNA 连接酶的Buffer（连接缓冲液）和连接酶19，Taq DNA 连酶接Buffer（连接缓冲液）的终浓度为1X，Taq DNA 连接酶一般加入0.1μL，即40units；

① 94℃ -98℃（本实施例中取最常用的94℃） 10s-30s（本实施例中取10s）；

② 55℃-60℃（本实施例中采用55℃） 2min；

③ 返回步骤①，循环5-30次（本实施例中采用最常用的10次循环）；

④ 80℃ 30s（除去残留在连接产物上未脱落的连接引物）；

⑤ 60℃ 2min（将连接产物上还未连接的断口连接好）；

⑥ 4℃保温。

之后向连接产物22中加入Plasmid Safe酶23，此种酶可将连接产物中未能成环的线性片段除去，可以一定程度上提升转化效率。

步骤III，即为转化、筛选并鉴定出目的产物。将连接产物22加入感受态细胞24，本实施例中采用E.coli感受态，采用氯化钙转化法转化。根据载体16中所带抗性基因，将转化后的感受态涂布在带有Amp、Xgal、IPTG的LB固体培养基平板25上，37℃下过夜培养，筛选出白色菌斑后进行鉴定26：将挑出的菌落放于培养基中摇晃培养，抽提质粒后选择载体R端引物和片段R端引物进行PCR扩增，DNA电泳判断是否有目的片段插入载体且方向正确；选择酶切位点将质粒酶切，DNA电泳观察切出的片段大小是否正确从而进一步确认连接是否成功。

产物正确率一般在90%以上。整个流程从拿到合成的连接引物后计算可在24小时内完成，其中连接的热循环反应只需30分钟左右。

实施例2：

本实施例针对将一段平末端片段与一段粘末端载体相连。

Xho1切

5’-GGATCTATTTCCGGTGAATTCC↓TCGAGACTAGTTCTAGAGCGGC-3’

（SEQ.ID.NO.5）

3’-CCTAGATAAAGGCCACTTAAGGAGCT↑CTGATCAAGATCTCGCCG-5’

（SEQ.ID.NO.6）

使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分将两个粘性末端补平，接口两端的序列变为：

5’-GGATCTATTTCCGGTGAATTCCTCGA-3’ （SEQ.ID.NO.7）

5’-TCGAGACTAGTTCTAGAGCGGC-3’ （SEQ.ID.NO.8）

3’-CCTAGATAAAGGCCACTTAAGGAGCT-5’ （SEQ.ID.NO.9）

3’-AGCTCTGATCAAGATCTCGCCG-5’ （SEQ.ID.NO.10）

待插入片段17两端的序列为：

5'-CGACATGGCGAGTGTAGTGCT---AGAAAGAGTACTTCATCTAGATCAGCC-3'（SEQ.ID.NO.11）

18-1：5’-GGATCTATTTCCGGTGAATTCC CGACATGGCGAGTGTAGTGCT-3’

tm=55℃ tm=55℃ （SEQ.ID.NO.12）

18-2：5’ AGAAAGAGTACTTCATCTAGATCAGCC TCGAGACTAGTTCTAGAGCGGC-3’

tm=55℃ tm=55℃ （SEQ.ID.NO.13）

步骤II，即为旨在得到目的产物的连接反应。本实施例中体系采用最常用的10μL、载体浓度采用最常用的100ng、待连接片段17与载体16物质的量的比值取1:1、连接引物18加入的量与其待连接开口的初始数量的比值采用最常用的5:1；体系中需加入Taq DNA 连接酶的Buffer（连接缓冲液）和连接酶19，Taq DNA 连酶接Buffer（连接缓冲液）的终浓度为1X，Taq DNA 连接酶加入0.1μL，即40units；

之后将连接体系置于常规PCR仪20中，本实施例中连接反应的热循环程序21如下：

① 94℃ 10s；

② 55℃ 2min；

③ 返回步骤①，循环10次；

④ 80℃ 30s（除去残留在连接产物上未脱落的连接引物）；

⑤ 60℃ 2min（将连接产物上还未连接的断口连接好）；

⑥ 4℃保温。

步骤III，即为转化、筛选并鉴定出目的产物。将连接产物22加入感受态细胞24，本实施例中采用E.coli感受态，采用氯化钙转化法转化。根据载体16中所带抗性基因，将转化后的感受态涂布在带有Amp的LB固体培养基平板25上，37℃下过夜培养，挑选长出的菌斑后进行鉴定26：具体操作同实施例I，主要是PCR鉴定是否连接上、方向是否正确，酶切鉴定片段大小即插入数量是否正确。

实施例3：

本实施例针对一次性连接5个片段成为环状质粒的情况。

5’-CGAATTCCTGCAGCCC ↓ GGGGGATCCACTAGTTCTAGA-3’ （SEQ.ID.NO.14）

待插入片段17共4条，两端的依次序列为（中间省略）：

17-1：5'-CCCAAGCTTATGGCGG---CAAAGTATAGGGGATCCCG-3' （SEQ.ID.NO.15）

17-2：5’-GCGCCTCCTAGTGAAAC---GTTACCCACTCCCCTCAC-3’ （SEQ.ID.NO.16）

17-3：5’-GCATTGAGGAGATGGATGG---ATTTATGGAGCAGCTACGT-3’

（SEQ.ID.NO.17）

17-4：5’-GCTCTAGAATGGCAGACAATTT---AGTCATCTACTTAAGGATCCCG-3’

（SEQ.ID.NO.18）

设计并合成连接引物18，共5段，对应两个接口其序列为（序列中的空格只表示分开各自与两个片段互补的部分，实际引物是连贯的，中间没有断开）：

18-1：5’-CGAATTCCTGCAGCCC CCCAAGCTTATGGCGG -3’ （SEQ.ID.NO.19）

tm=55℃ tm=55℃

18-2：5’-CAAAGTATAGGGGATCCCG GCGCCTCCTAGTGAAAC-3’ （SEQ.ID.NO.20）

tm=55℃ tm=55℃

18-3：5’-GTTACCCACTCCCCTCAC GCATTGAGGAGATGGATGG-3’ （SEQ.ID.NO.21）

tm=55℃ tm=55℃

18-4：5’-ATTTATGGAGCAGCTACGT GCTCTAGAATGGCAGACAATTT-3’

tm=55℃ tm=55℃ （SEQ.ID.NO.22）

18-5：5’-AGTCATCTACTTAAGGATCCCG GGGGGATCCACTAGTTCTAGA-3’

tm=55℃ tm=55℃ （SEQ.ID.NO.23）

① 94℃ 10s；

② 55℃ 2min；

③ 返回步骤①，循环10次；

④ 80℃ 30s（除去残留在连接产物上未脱落的连接引物）；

⑤ 60℃ 2min（将连接产物上还未连接的断口连接好）；

⑥ 4℃保温。

步骤III，即为转化、筛选并鉴定出目的产物。将连接产物22加入感受态细胞24，本实施例中采用E.coli感受态，采用氯化钙转化法转化。根据载体16中所带抗性基因，将转化后的感受态涂布在带有Amp、Xgal、IPTG的LB固体培养基平板25上，37℃下过夜培养，挑选白色菌斑后进行鉴定26：具体操作同实施例I，主要是PCR鉴定是否连接上、方向是否正确，酶切鉴定片段大小即插入数量是否正确，其中PCR鉴定需要选取每一个片段的R端引物分别于载体的R端引物进行PCR，检查插入顺序是否正确。

<110> 复旦大学

<120> 一种高效定向无缝DNA片段连接方法

<130> 001

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<170> PatentIn version 3.3

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cgaattcctg cagcccgggg gatccactag ttctaga 37

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gctctagaat ggcagacaat ttttcgctca tatccctctt gtaagtcatc tacttaa 57

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cgaattcctg cagcccgctc tagaatggca gacaattt 38

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agtcatctac ttaaggatcc cggggggatc cactagttct aga 43

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ggatctattt ccggtgaatt cctcgagact agttctagag cggc 44

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cctagataaa ggccacttaa ggagctctga tcaagatctc gccg 44

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ggatctattt ccggtgaatt cctcga 26

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tcgagactag ttctagagcg gc 22

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cctagataaa ggccacttaa ggagct 26

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cgacatggcg agtgtagtgc tagaaagagt acttcatcta gatcagcc 48

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ggatctattt ccggtgaatt cccgacatgg cgagtgtagt gct 43

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agaaagagta cttcatctag atcagcctcg agactagttc tagagcggc 49

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gctctagaat ggcagacaat ttagtcatct acttaaggat cccg 44

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213>

<400> 19

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<213>

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<212> DNA

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<212> DNA

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Claims

1.一种高效定向无缝DNA片段连接方法，其特征在于具体步骤为：

（1）设有待连接的两个DNA片段（2a和3a），设计并化学合成一段Oligo寡核苷酸连接引物（1），该连接引物（1）两端要与待连接的两个DNA片段（2a和3a）在待连接处两侧各有5-40个碱基的序列完全互补；由于引物的tm值随着碱基数量和GC含量的增加变高，而完成连接反应的Taq DNA 连接酶5活性的温度区间在65℃~50℃之间，所以连接引物（1）与单个待连接片段之间的互补碱基数量应使连接引物1与单个待连接片段之间的tm值处于50℃~65℃之间；

（2）将待连接DNA片段先行磷酸化，或者将连接引物磷酸化后进行PCR扩增，以保证待连接DNA片段的5’端带有磷酸基团。

2.根据权利要求1所述的高效定向无缝DNA片段连接方法，其特征在于：所述连接引物（1）与每个待连接DNA片段的温度差不超过1.5℃。

3.根据权利要求1或2所述的高效定向无缝DNA片段连接方法，其特征在于：

如果两待连接DNA片段末端存在非互补粘末端，设第一DNA片段为粘端，而第二DNA片段为平端，则先将第一DNA片段补平为平末端，再设计连接引物；如果两待连接DNA 片段都是粘末端且非互补，则将两待连接DNA 片段都先补平为平末端，再设计连接引物。

4.根据权利要求1或2所述的高效定向无缝DNA片段连接方法，其特征在于具体操作步骤为：

步骤I，准备连接所需要的载体、待连接的片段、设计并合成连接引物；载体和待连接片段根据末端情况和目的分子的要求决定采用连接策略：即平末端直接连接；非互补粘性末端补平为平末端后连接，互补性粘性末端可补平或直接连接，之后根据最终的末端序列设计连接引物；确保5’端带有磷酸基团；载体和待连接片段纯化后测量浓度，方便之后计算连接时的浓度配比；连接体系中根据加入片段的浓度计算连接引物的量；

步骤II，连接反应得到目的产物，连接体系控制在5-10μL；载体加入量为50-150ng；待连接片段与载体物质的量的比值，取其长度与载体长度比值的倒数，若待连接片段的长度大于载体长度，则摩尔浓度比值取1:1；连接引物加入的量与其待连接开口的初始数量的比值从1:2到10:1；体系中加入Taq DNA 连接酶的Buffer和连接酶，Taq DNA 连接酶Buffer的终浓度为1X，Taq DNA 连接酶加入量为0.1μL，即40units；

之后将连接体系置于PCR仪20中，连接反应的热循环程序如下：

① 94℃ -98℃，10s-30s；

② 55℃-60℃，2min；

③ 返回步骤①，循环5-30次；

④ 80℃ 30s；

⑤ 60℃ 2min；

⑥ 4℃保温；

步骤III，即为转化和筛选出目的产物，将连接产物加入感受态细胞中转化后，涂布在带有选择性抗性的LB固体培养基平板上，37℃下过夜培养，最后筛选并鉴定出目的产物。