JP2022551809A - Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 - Google Patents
Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022551809A JP2022551809A JP2022514680A JP2022514680A JP2022551809A JP 2022551809 A JP2022551809 A JP 2022551809A JP 2022514680 A JP2022514680 A JP 2022514680A JP 2022514680 A JP2022514680 A JP 2022514680A JP 2022551809 A JP2022551809 A JP 2022551809A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- crm197
- protein
- nucleic acid
- crm197 protein
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 title claims abstract description 146
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 38
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 238000011969 continuous reassessment method Methods 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 13
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 101150044687 crm gene Proteins 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 101150057627 trxB gene Proteins 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 101000679617 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) Pertussis toxin subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102220513293 Protein VAC14 homolog_G52E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000006919 modified lb Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
- C12R2001/16—Corynebacterium diphtheriae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、ＣＲＭ１９７タンパク質を大腸菌で発現し、周辺細胞質に分泌させるためのシグナル配列及びその用途に関し、より具体的には、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列、前記シグナル配列をコードする核酸、前記核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質遺伝子を含む核酸構造体又は発現ベクター、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入された組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養する段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法に関する。本発明によると、酸化還元電位を調節していない一般の大腸菌でも、親型菌から分離されたタンパク質と理化学的／免疫学的性質が同一であるＣＲＭ１９７タンパク質を発現させることができ、周辺細胞質への分泌増加のための培地のｐＨ変化がなくても周辺細胞質への分泌効率が高いＣＲＭ１９７タンパク質の製造が可能であるので、ＣＲＭ１９７タンパク質の生産において非常に有用である。【選択図】 図４
Description
本発明は、ＣＲＭ１９７タンパク質を大腸菌で発現し、周辺細胞質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）に分泌させるためのシグナル配列及びその用途に関し、より具体的には、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列、前記シグナル配列をコードする核酸、前記核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質遺伝子を含む核酸構造体又は発現ベクター、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入された組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養する段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法に関する。
ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ、ＤＴ）は、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）の病原性菌株から合成及び分泌されるタンパク質性外毒素である。ジフテリア毒素は、５３５個の残基からなる前酵素（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）として分泌され、トリプシン－類似プロテアーゼによって処理されることによって２個の断片（ＡとＢ）に分離される、ＡＤＰ－リボシル化酵素（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）である。断片Ａは、触媒的に活性である部位で、特異的にタンパク質合成因子ＥＦ－２をターゲットとするＮＡＤ－依存性ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼであって、これによってＥＦ－２を不活性化させ、細胞内でのタンパク質の合成を中断させる。
ジフテリア毒素の多様な無毒性形態と、部分毒性の免疫学的に交差反応する形態（ＣＲＭ又は交差反応する各物質）との分離を通じてＣＲＭ１９７が発見された（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４８，３８４５－３８５０，１９７３）。好ましくは、ＣＲＭは、ＤＴ全体又はその一部を含む任意の大きさ及び組成であり得る。
ＣＲＭ１９７は、一つのアミノ酸置換Ｇ５２Ｅが存在する、酵素学的に高度に非活性的で、且つ無毒性である形態のジフテリア毒素である。この突然変異は、ＮＡＤ－結合部位の前側に位置した活性－部位ループに固有の柔軟性を付与することによって、ＮＡＤに対するＣＲＭ１９７の結合性を低下させ、ＤＴの毒性をなくす（Ｍａｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（１４）：５２２９－３４２０１２）。ＣＲＭ１９７は、ＤＴと同様に、二硫化結合を２個保有している。二硫化結合の一つは、Ｃｙｓ１８６をＣｙｓ２０１と連結し、断片Ａを断片Ｂと連結する。２番目の二硫化結合は、断片Ｂ内でＣｙｓ４６１をＣｙｓ４７１と連結する。ＤＴ及びＣＲＭ１９７は、断片Ａに起因したヌクレアーゼ活性を有している（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，２９９５－８，１９９０）。
多数の抗原は、タンパク質に化学的に連結されていない限り、特に幼児において免疫原性が低いので、接合体又は接合ワクチンに製造される。このような接合ワクチンでは、タンパク質成分を「運搬タンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とも言う。ＣＲＭ１９７は、タンパク質－炭水化物接合及びハプテン－タンパク質接合で運搬タンパク質として頻繁に使用される。ＣＲＭ１９７は、運搬タンパク質として、ジフテリアトキソイドのみならず、他のトキソイドタンパク質を凌ぐ多くの長所を有している（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ Ｖａｃｃｉｎｅ，２８：４３３５，２０１０）。
ジフテリア毒素（ＤＴ）の製造方法は、当業界によく知られている。例えば、ＤＴは、コリネバクテリウムジフテリアの培養物からトキシンの精製後の化学的無毒化（ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって生産され得るか、組換え体又は遺伝的に無毒化されたトキシンの類似体の精製によって製造され得る。
タンパク質の存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）により、ワクチンに使用するためのＣＲＭ１９７などのジフテリア毒素の大量生産が不可能であった。このような問題点は、以前に大腸菌でＣＲＭ１９７を発現させることによって取り扱われており（Ｂｉｓｈａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５１４０－５１５１）、Ｂｉｓｈａｉ等は、分解されたタンパク質の生産をもたらすジフテリア毒素（ｔｏｘシグナル配列を含む）を含有する組換え融合タンパク質の発現を記述した。
周辺細胞質でのバクテリア毒素の生産は、細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）の生産に比べて、ｉ）たんぱく質が信号ペプチドの切断後に成熟型で生産されたり、ｉｉ）大腸菌の周辺細胞質が二硫化結合の形成を許容する酸化環境であるので、可溶性の、確実にフォルディングされたタンパク質の生産を促進することができ、ｉｉｉ）大腸菌の周辺細胞質が細胞質より少ないプロテアーゼを含有し、発現されたタンパク質のタンパク質分解性切断を避けるように促進することができ、ｉｖ）周辺細胞質がさらに少ないタンパク質を含有し、より純度の高い組換えタンパク質が収得されることを許容する。
一般に、タンパク質上のシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の存在は、周辺細胞質へのタンパク質の輸送（原核宿主）又は分泌（真核宿主）を促進する。原核宿主におけるシグナル配列は、新生タンパク質を内膜を横切って周辺細胞質に調整し、その後、シグナル配列は切断される。すなわち、商業的に重要なタンパク質をより効率的に大量生産できるシグナル配列の探索が重要であり、組換え微生物の開発が要求されている実情である。
そこで、本発明者等は、効率的で、且つ費用効果の良い方式でＣＲＭ１９７タンパク質を生産する方法を開発しようと鋭意努力した結果、特定のシグナル配列を選択し、大腸菌での翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を最適化するためにコドンコンテキスト（ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）と２次構造を複合し、塩基配列をデザインしており、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするＣＲＭ１９７塩基配列も大腸菌での発現を最適化しており、これらを用いる場合、大腸菌でＣＲＭ１９７が効率的に発現され、ｐＨ変化がなくてもＣＲＭ１９７の周辺細胞質への分泌が効率的に行われることを確認し、本発明を完成した。
本背景技術部分に記載した前記情報は、本発明の背景に対する理解を向上させるためのものに過ぎなく、よって、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
本発明の目的は、ＣＲＭ１９７タンパク質を大腸菌の周辺細胞質に分泌し、ＣＲＭ１９７タンパク質の大腸菌に対する毒性を最小化し、発現を極大化させるために、特定配列のＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列、前記シグナル配列をコードする核酸、及び前記核酸を用いたＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１３乃至配列番号２１のいずれか一つのアミノ酸配列で表される、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列を提供する。
また、本発明は、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸を提供する。
また、本発明は、前記核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む核酸構造体又は発現ベクター、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入されている組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養する段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法を提供する。
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
本発明の一実施例では、９個のシグナル配列をＣＲＭ１９７タンパク質と融合させることによって発現を試みた。各シグナル配列は、コドンコンテキストとｍＲＮＡの２次構造を考慮した上で、翻訳に最適化した塩基配列（配列番号４乃至配列番号１２）をデザインした。この構造物を発現プラスミドｐＨｅｘ１．３に挿入し、各構造物の最適な大腸菌の菌株を探すために５種の大腸菌の菌株でのＣＲＭ１９７の発現を調査した。また、選定された大腸菌で培養温度、インデューサーの種類及び濃度を設定した。結果的に、前記各構造物を多様な大腸菌の菌株に形質転換させた結果、酸化還元電位（ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）に関連する遺伝子（ｔｒｘＢ、ｇｏｒ）を操作していない菌株でもＣＲＭ１９７タンパク質を可溶型（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ）で発現させることができ、これを周辺細胞質に分泌させることができた。
したがって、本発明は、一観点において、配列番号１３乃至配列番号２１のいずれか一つのアミノ酸配列で表される、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列に関する。
本発明は、他の観点において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸に関する。
本発明において、前記核酸は、配列番号４乃至配列番号１２のいずれか一つの塩基配列で表されることを特徴とすることができ、好ましくは、配列番号６又は配列番号８の塩基配列で表されることを特徴とすることができるが、これに制限されるのではない。
本明細書において、「ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列」とは、ＣＲＭ１９７タンパク質の発現及び周辺細胞質への分泌のためのシグナル配列を意味する。
本発明の一実施例において、ＣＲＭ１９７タンパク質を周辺細胞質に分泌させるために大腸菌の外膜（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ）をターゲットとするタンパク質のシグナル配列及びＭ１３ファージ由来のシグナル配列を選択した（表３）。選択したシグナル配列の大腸菌での翻訳を最適化するために、コドンテキストと２次構造とを複合することによって塩基配列をデザインした（配列番号４乃至配列番号１２）。
本発明は、更に他の観点において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む核酸構造体に関する。
本発明は、更に他の観点において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターに関する。
本発明の一実施例において、ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）をコードするＤＮＡ塩基配列も、大腸菌での発現を最適化した（配列番号２）。デザインされた各シグナル配列のＤＮＡ断片及び最適化されたＣＲＭ１９７ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨｅｘ１．３に挿入した（図３）。
本発明において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子としては、ＣＲＭ１９７タンパク質を暗号化する遺伝子であれば制限なく利用可能である。好ましくは、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とすることができるが、これに制限されるのではない。
本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、特定の外来のＤＮＡ鎖を細胞外から細胞内に導入することを意味する。導入されたＤＮＡ鎖を含む宿主微生物は、「形質転換された微生物」という。ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外因子として、又は染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する「形質転換」は、標的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入したり、標的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に統合・完成させ、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドが暗号化するタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置する場合、及び染色体外に位置する場合のいずれであるのかと関係なく、これらの全てを含む。
本発明において、前記「核酸構造体」は、宿主細胞内に発現できる限り、宿主細胞の染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）内に挿入されて位置する場合、及び染色体外に位置する場合のいずれであるのかと関係なく、これらの全てを含む。
また、本明細書において、前記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」と同一の意味で使用され、標的タンパク質を暗号化するＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いずれの形態で導入されても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター、転写終決信号、リボソーム結合部位及び翻訳終決信号を含む。前記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
本明細書において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現できる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は、簡単には潜在的なゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製して機能できるか、又は、一部の場合にゲノム自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター」は、時々相互交換的に使用される。
本発明の目的上、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的に使用され得る典型的なプラスミドベクターは、（ａ）１宿主細胞当たり数十個乃至数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選ばれるようにする抗生剤耐性遺伝子、及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入できるようにする制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しない場合にも、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用すると、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。
併せて、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的な関係で配置されるとき、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されるとき、遺伝子の発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又は、リボソーム結合部位は、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。
一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
本発明において、前記発現ベクターは、Ｔｒｃプロモーターをさらに含むことを特徴とすることができる。
本発明において、前記発現ベクターは、ｐＨｅｘ１．３であることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
ＣＲＭ１９７は、ヌクレアーゼ活性が存在し、大腸菌に非常に有毒なものとして知られている。したがって、所望でない条件でのＣＲＭ１９７発現は、大腸菌の成長に悪影響を及ぼし得る。大腸菌発現プラスミドｐＨｅｘ１．３は、ＬａｃＩ遺伝子を有しており、ｔｒｃプロモーターのバックグラウンド発現を抑制することができ、このプラスミドに挿入された発現モジュールＴＰＢ１Ｔｖ１．３（図１）は、発現されるＣＲＭ１９７遺伝子の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）にλファージ由来のｔＲ２転写ターミネーター及びＴ７ファージ由来のＴｅ転写ターミネーターが挿入され、下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に大腸菌由来のｒｒｎＢ Ｔ１Ｔ２転写ターミネーターが挿入され、プラスミド由来のプロモーターから転写されるＣＲＭ１９７の発現を抑制できるようにデザインされた。
本発明は、更に他の観点において、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入されている組換え微生物に関する。
本発明において、前記組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
前記組換え微生物としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が通常的に使用され、原核及び真核細胞を含む全ての微生物として、バクテリア、酵母、カビなどが利用可能であり、本発明の実施例では大腸菌を使用したが、これに限定されなく、前記ＣＲＭ１９７タンパク質が十分に発現できるものであればいずれの種類の微生物であっても構わない。
もちろん、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現するのに全て同等に機能を発揮することはなく、同様に、全ての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮することはない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担なしで、本発明の範囲を逸脱しない状態で、他の多様なベクター、発現調節配列及び宿主から適宜選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択するにおいては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその内部で複製されなければならないためであり、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力、及び当該ベクターによってコーディングされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮しなければならない。
前記形質転換された組換え微生物は、通常的に知られている任意の形質転換方法によって製造することができる。
また、本発明において、前記遺伝子を宿主細胞の染色体上に挿入する方法としては、通常的に知られている遺伝子操作方法を使用することができ、一例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ－連関ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、フォックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター又は非ウイルス性ベクターを用いる方法を挙げることができる。
また、形質転換方法には、発現ベクターを用いた方法以外にも、前記核酸構造体を宿主細胞の染色体上に直接挿入する方法も利用され得る。
一般に、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｎ）、リポフェクション、弾道的送達、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、多価陽イオン又は脂質：核酸接合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、化学物質促進ＤＮＡ流入、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが利用され得る。
ソノポレーション、例えば、ソニトロン（Ｓｏｎｉｔｒｏｎ）２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いた方法も核酸の伝達に使用することができ、他の代表的な核酸伝達システムは、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）及びＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｅｔｅｍ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）の方法を含む。リポフェクション方法は、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号及び米国特許第４，８９７，３５５号に明示されている。また、リポフェクション試薬は商業的に市販されており、例えば、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭＴＭ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭが市販されている。ポリヌクレオチドの効果的なレセプター－認識リポフェクションに適当な陽イオン又は中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒの脂質を含み（ＷＯ９１／１７４２４及びＷＯ９１／１６０２４）、生体外導入を通じて細胞に、生体内導入を通じて標的組織に伝達することができる。免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の製造方法は、当該業界によく知られている（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２７０：４０４－４１０、１９９５；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２：２９１－２９７，１９９５；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：３８２３８９，１９９４；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：６４７－６５４，１９９４；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．，２：７１０－７２２，１９９５；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：４８１７－４８２０，１９９２；米国特許第４，１８６，１８３号；米国特許第４，２１７，３４４号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，２６１，９７５号；米国特許第４，４８５，０５４号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，７７４，０８５号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９４６，７８７号）。
本発明の一実施例において、製造されたプラスミドベクターを多様な大腸菌の菌株（表４）に形質転換させた結果、Ｌ３融合の場合は、全ての菌株でＣＲＭ１９７が発現され、Ｌ５融合の場合は、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２を除いた菌株でＣＲＭ１９７が発現された（図４）。Ｌ３、Ｌ５融合の全てが酸化還元電位に関連する遺伝子（ｔｒｘＢ、ｇｏｒ）を操作していない菌株でもＣＲＭ１９７タンパク質を可溶型で発現させることができ、前記タンパク質は、親型菌から分離されたタンパク質と理化学的／免疫学的性質が同一であった。また、Ｌ３融合の場合、２５℃のみならず、３０℃でもＣＲＭ１９７タンパク質を可溶型で発現させることができた（図７、図１２Ａ）。
既存の報告によると、培養時、ｐＨ６．５～６．８で培養しながら、誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）時にｐＨ７．５に変化（ｓｈｉｆｔ）させると、ＣＲＭ１９７の周辺細胞質への分泌が改善される。これと異なり、本発明で製造された菌株の場合、培地のｐＨ変化なしでＣＲＭ１９７の周辺細胞質への効率的な分泌を確認した（図１２）。ｐＨ変化のない高濃度培養でのＬ５融合の場合、ＣＲＭ１９７の生産性は３．７ｇ／Ｌで、周辺細胞質に分泌されるＣＲＭ１９７は２ｇ／Ｌ以上であった。
本発明は、更に他の観点において、（ａ）前記核酸構造体又は発現ベクターが導入されている組換え微生物を培養し、ＣＲＭ１９７タンパク質を生成する段階；及び（ｂ）前記生成されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収する段階；を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法に関する。
本発明において、前記（ｂ）段階は、周辺細胞質に分泌されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収することを特徴とすることができる。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１：ＣＲＭ１９７過剰発現プラスミドの製造
実施例１．１：プラスミドｐＨｅｘ１．３の製造
大腸菌発現プラスミドｐＨｅｘ１．３は、次のように製作した。ｐｔｒｃ９９ａ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ．６９，３０１－１５，１９８８）をＳｓｐＩとＤｒａＩに二重に切断（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した後、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）電気泳動を用いて約３．２ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）は、ＰＣＲを用いて増幅した。使用したテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）はプラスミドｐＣＲ２．１で、使用したプライマーはＫＦ２、ＫＲであった（表１）。
ＰＣＲ反応液の条件は、ｄＮＴＰ各２．５ｍＭ、プライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ～５００ｎｇ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）１．２５Ｕ、反応体積５０μｌとし、ＰＣＲ条件は、９８℃１０秒、６０℃５秒、７２℃分／ｋｂの３段階を３０回繰り返した。このようなＰＣＲ条件で生成された約０．８ｋｂのＤＮＡ断片をＢａｍ ＨｉとＨｉｎｄＩＩＩに二重に切断した後、クレノウ断片（ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いて平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）で充填した後、前過程で製造した３．２ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いてライゲーションした。この反応液をＥ．ｃｏｌｉ Ｃ２９８４Ｈに形質転換し、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）がＡｍｐからＫｍに置換されたｐＨｅｘ１．１を製造した。
プロモーター、ＲＢＳ、及び転写ターミネーターを含む発現モジュールＴＰＢ１Ｂｖ１．３（図１）は、Ｂｉｏｎｅｅｒで合成した（配列番号１）。発現モジュールＴＰＢ１Ｂｖ１．３をｐＨｅｘ１．３に搭載する過程は、次の通りである。発現モジュールＴＰＢ１Ｂｖ１．３を鋳型として、ＴＰＢ＿Ｆ、ＴＰＢ＿Ｒをプライマー（表１）として用いてＰＣＲ増幅して得たＤＮＡ断片（１２５５ｂｐ）と、ｐＨｅｘ１．１を鋳型として、ｐＨｅｘ＿Ｆ、ｐＨｅｘ＿Ｒをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片（４５６１ｂｐ）を表２のような条件でライゲーション独立クローニング（ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ）（ＬＩＣ；Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８，５４４０－３，２０１２）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てた後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ２９８４Ｈに形質転換することによってｐＨｅｘ１．３を製造した（図２）。
ＬＩＣ反応条件：ベクターは、制限酵素で切ったり、ＰＣＲを用いてリニア（ｌｉｎｅａｒ）形態のＤＮＡ断片に作る。インサート（Ｉｎｓｅｒｔ）は、ＰＣＲを用いて製造する。ベクターとインサートは、上記の表のように混ぜた後、常温で２分３０秒間反応した。
実施例１．２：ＣＲＭ１９７遺伝子の製造
大腸菌で発現が最適化されたＣＲＭ１９７の塩基配列（ＣＲＭ１９７ｅｃ）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔで合成した（配列番号２）。ＣＲＭ１９７ｅｃがコードするアミノ酸配列は、配列番号３の通りである。
実施例１．３：シグナル配列遺伝子の製造
ＣＲＭ１９７タンパク質を大腸菌の周辺細胞質に分泌させるために使用されたシグナル配列は、下記の表３に示した（配列番号１３乃至配列番号２１）。大腸菌での発現を最適化するために、コドンテキストと２次構造を考慮した上で、配列番号４乃至配列番号１２のＤＮＡを合成した（表３）。
実施例１．４：ＣＲＭ１９７過剰発現のためのプラスミドの製造
ＣＲＭ１９７を大腸菌で過剰発現し、周辺細胞質に分泌させるためのプラスミドは、図３のように製造した。ｐＨｅｘ１．３をＢｓａＩとＤｒａＩに二重に切断した後、アガロース電気泳動を用いて約５ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。シグナル配列Ｌ１～Ｌ９は、表１のプライマーと鋳型を用いてＰＣＲ増幅した。ＬＩＣ方法を用いて各シグナル配列にＣＲＭ１９７遺伝子を融合するためのＣＲＭ１９７ ＤＮＡ断片は、表１のプライマーと鋳型を用いてＰＣＲ増幅した。ＢｓａＩとＤｒａＩに切断されたｐＨｅｘ１．３と各シグナル配列断片、及びこれと互換されるＣＲＭ１９７断片は、上述したＬＩＣ条件を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てた後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ２９８４Ｈに形質転換し、各シグナル配列と融合されたＣＲＭ１９７を含有するプラスミドｐＨｅｘ－Ｌ１－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ２－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ４－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ６－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ７－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ８－ＣＲＭ、及びｐＨｅｘ－Ｌ９－ＣＲＭを製造した。
実施例２：大腸菌でのＣＲＭ１９７タンパク質の発現
実施例１で製造されたプラスミドのうち、発現量及び細胞の成長程度を考慮した上でｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ及びｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを選択した。下記の表４の大腸菌の菌株に形質転換し、ＣＲＭ１９７タンパク質の発現及び発現位置を調査した。
培養方法は、固体培地（ソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、寒天（ａｇａｒ）１５ｇ／Ｌ）で生成されたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を１００ｍＭのリン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ７．５）、ｋｍ ５０μｇ／ｍｌ、０．２％のラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）を含有するＬＢ液体培地で３０℃で１５時間にわたって振盪培養した後、総細胞にＳＤＳ ＰＡＧＥを行った後、クマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）及びウェスタンブロッティングを用いてＣＲＭ１９７の発現を分析した（図４）。Ｌ３融合の場合は、使用した全ての菌株でＣＲＭ１９７タンパク質が発現されたが、Ｌ５融合の場合は、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２に形質転換したとき、液体培地で成長することができなかった。これ以外の菌株では、ＣＲＭ１９７タンパク質の発現が観察された。
実施例２．１：Ｌ５によるＣＲＭ１９７発現
ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）を１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、ｋｍ ５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地（５０ｍＬ／５００ｍＬのバッフル付フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ））でＯＤ６００が０．４～０．６に到逹するまで培養した後、インデューサーとしてラクトース０．２％、０．４％、０．６％、又はＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ）０．０２ｍＭ、０．２ｍＭ、２ｍＭを添加することによって発現を誘導した。培養温度は２５℃又は３０℃であった。培養後、細胞を回収した後、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を行い、細胞を破砕した。破砕後、遠心分離することによって上澄み液（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と沈殿物（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）とを分離した。各サンプルのＳＤＳ＿ＰＡＧＥ後、クマシー染色及びウェスタンブロッティングを用いてＣＲＭ１９７タンパク質の発現を分析した（図５）。インデューサー（ラクトース、ＩＰＴＧ）を添加した後、２５℃で培養した場合、発現されたＣＲＭ１９７タンパク質のほとんどは可溶型で存在し、レファレンスＣＲＭ１９７の分子量と同一であると見なし、発現されたタンパク質は、Ｌ５シグナル配列が除去された成熟ＣＲＭ１９７であると判断される（図５Ａ）。その一方で、３０℃で培養した場合、ラクトースをインデューサーとして使用すると、ＣＲＭ１９７タンパク質の約５０％は不溶性画分で発見され、ＩＰＴＧをインデューサーとして添加すると、ＣＲＭ１９７タンパク質のほとんどは不溶性画分で発見された（図５Ｂ）。
ＣＲＭ１９７の発現位置を確認するために、浸透圧衝撃（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）を用いて周辺細胞質画分を回収した。過程は次の通りである。ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃で培養した後、遠心分離することによって細胞を回収した。原形質膜誘導緩衝溶液［３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０％のスクロース、１ｍＭ又は１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）］で、細胞の濃度がＯＤ６００１０になるように再懸濁した後、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって細胞を採取し、同一の量の４℃以下の冷たい３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加し、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって上澄み液を得た（周辺細胞質画分、Ｐ２）。原形質膜誘導緩衝溶液の処理後、上澄み液（Ｐ１）、周辺細胞質画分（Ｐ２）、及び細胞質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて展開した後、クマシー染色及びウェスタンブロッティングを用いてＣＲＭ１９７の発現及び発現位置を調査した（図５）。Ｌ５は、ＣＲＭ１９７を成功的に周辺細胞質に分泌できることを確認した（図６）。原形質膜誘導緩衝溶液として、ＥＤＴＡは、１ｍＭより１０ｍＭである場合に効果的であった。
実施例２．２：Ｌ３によるＣＲＭ１９７発現
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）を実施例２．１と同一の条件で発現させた。Ｌ３によって誘導されるＣＲＭ１９７の場合、Ｌ５と異なり、全ての条件で可溶型で存在し（図７）、周辺細胞質に分泌されることを確認した（図８）。
実施例３：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ又はｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を次のような方法で培養した。本培養時、流入（ｆｅｅｄｉｎｇ）はｐＨスタット（ｓｔａｔ）方法を用いて行い、流入溶液（Ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ブドウ糖６００ｇ／Ｌ、酵母エキス３０ｇ／Ｌ）及び塩基性溶液（Ａｌｋａｌｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：１４％～１５％のアンモニア）を用いてｐＨ７．３に維持した。培養に用いた溶液及び培地組成は、表５及び表６に示した。
修正されたＬＢ寒天培地［Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天：ソイトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ］で形成された単一コロニーを種培養培地に接種し、３０℃で１８時間にわたって培養した。この種培養を再び本培養培地（３Ｌ／５Ｌの発酵槽）に１％（ｖ／ｖ）の比率で接種し、３０℃で培養した。本培養培地は、種培養培地に追加的に滅菌された消泡剤を０．１％添加した。培養液の吸光度が３０～４０の値を有した後、温度を２５℃に下げた。次に、ＩＰＴＧ １０ｍＭを添加し、培養液の吸光度が１００～１２０になった後で培養を終了した。
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の５Ｌの発酵槽での培養様相は図９に示し、ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養様相は図１０に示した。５Ｌの発酵槽での発酵時、発現されるＣＲＭ１９７の発現様相は図１１の通りであって、発現収率は、Ｌ３融合の場合は１．１ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌで、Ｌ５融合の場合は３．０ｇ／Ｌ～３．７ｇ／Ｌであった。ＣＲＭ１９７の定量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／クマシー染色後、デンシトメーター（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）（ＧＳ－９００ＴＭ、Ｂｉｏ－ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｓ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてレファレンスＣＲＭ１９７との相対量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ）を比較して定量した。
実施例４：タンパク質の精製
実施例４．１：細胞培養液から周辺細胞質画分の製造
５Ｌの発酵槽で培養した細胞から周辺細胞質画分を回収する過程は次の通りである。細胞培養液を４℃、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離し、細胞を沈澱させた。細胞沈殿物は、吸光度１００を基準にして修正されたタンパク質の原形質膜誘導緩衝溶液（表７）に再懸濁し、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。
その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって細胞を採取し、同一の量の４℃以下の冷たい３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］を添加し、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって上澄み液を採取し、ＭＦを用いて不純物を除去した。上記の過程を通じたｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で回収された周辺細胞質画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は図１２（Ａ）に示し、ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で回収された周辺細胞質画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は図１２（Ｂ）に示した。周辺細胞質画分に存在するＣＲＭ１９７タンパク質の量は、Ｌ３菌株の場合は１．２ｇ／Ｌで、Ｌ５菌株の場合は２．３ｇ／Ｌであることが確認された（表８）。
実施例４．２：ＣＲＭ１９７タンパク質の精製
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ培養液の周辺細胞質画分を採取し、ＴＦＦシステムを用いて１０ｋＤａのカットオフ膜（ｃｕｔ－ｏｆｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ）で２倍濃縮し、１０倍体積の１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶媒（ｐＨ７．２）で限外ろ過を実施した。ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ（ＧＥヘルスケア）システムを用いて二つのカラム工程を経て精製を完了した。第一のカラム工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ｄｉｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｅｔｙｌ Ｓｅｐａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ、ＤＥＡＥ）であって、核酸及び不純物タンパク質を除去する目的で使用した。ＤＥＡＥレジン（Ｒｅｓｉｎ）は（－）電荷を帯びており、（＋）電荷のタンパク質が結合するようになる。限外ろ過を経た試料は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーを経て結合されていないタンパク質及び不純物が１次的に抜け出て除去され、続いた洗浄工程を経て、塩の濃度によってＣＲＭ１９７を除いた結合力の低い不純物タンパク質を除去した。その後、塩の濃度を増加させ、ＣＲＭ１９７のみを溶出した。ＤＥＡＥクロマトグラフィーを用いて精製する過程中の試料に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を進行し、その結果を図１３（Ａ）に示した。ＤＥＡＥクロマトグラフィーを経た試料は、ＨＡ （Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）クロマトグラフィーを用いて１次的に結合されていない不純物及びタンパク質をフロースルーモードで除去し、最終１００ｍＭのリン酸カリウム及び１００ｍＭのＮａＣｌ溶媒でＣＲＭ１９７を溶出させた。溶出されたＣＲＭ１９７のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１３（Ｂ）に示した。
実施例５：コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７との比較
最終精製したＣＲＭ１９７に対して品質及び特性を分析した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析した結果、純度は９９％以上であることを確認した（図１４）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を通じて、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と同一の位置にバンドが現れることを確認した（図１５）。
また、ＣＲＭ１９７を構成するアミノ酸５３５個の全体の配列を確認し、１００％一致することを確認した。また、分子量の測定結果、５８，４０９Ｄａの主なピークが確認され、理論的分子量値と一致した（図１６）。ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分析を通じて高次構造を確認し、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と高次構造に差がないことを確認した（図１７）。蛍光スペクトルの分析結果、最大放出波長は、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と同一に３３８ｎｍであった（図１８）。
前記結果を通じて、大腸菌ｐＨｅｘ－Ｌ３菌株を使用して生産したＣＲＭ１９７は、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と物理化学的及び免疫学的に同一のタンパク質であることを確認した。
本発明によると、酸化還元電位を調節していない一般の大腸菌でも、親型菌から分離されたタンパク質と理化学的／免疫学的な性質が同一であるＣＲＭ１９７タンパク質を発現させることができ、周辺細胞質への分泌増加のための培地のｐＨ変化がなくても、周辺細胞質への分泌効率の高いＣＲＭ１９７タンパク質の製造が可能であるので、ＣＲＭ１９７タンパク質の生産において非常に有用である。
以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
Claims (13)
- 配列番号１３～２１のいずれか一つのアミノ酸配列で表される、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列。
- 請求項１に記載のＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸。
- 前記核酸は、配列番号４～１２のいずれか一つの塩基配列で表されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
- 前記核酸は、配列番号６又は配列番号８の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
- 請求項２に記載の核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む核酸構造体。
- 前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項５に記載の核酸構造体。
- 請求項２に記載の核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む発現ベクター。
- 前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
- Ｔｒｃプロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
- 請求項５に記載の核酸構造体又は請求項７に記載の発現ベクターが導入されている組換え微生物。
- 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
- 次の段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法：
（ａ）請求項１０に記載の組換え微生物を培養し、ＣＲＭ１９７タンパク質を生成する段階；及び
（ｂ）前記生成されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収する段階。 - 前記（ｂ）段階は、周辺細胞質に分泌されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収することを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023120482A JP2023139192A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
| JP2023120481A JP2023139191A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2019-0108892 | 2019-09-03 | ||
| KR1020190108892A KR102099342B1 (ko) | 2019-09-03 | 2019-09-03 | Crm197 단백질 발현 방법 |
| PCT/KR2019/012899 WO2021045292A1 (ko) | 2019-09-03 | 2019-10-02 | Crm197 단백질 발현 방법 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023120482A Division JP2023139192A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
| JP2023120481A Division JP2023139191A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022551809A true JP2022551809A (ja) | 2022-12-14 |
Family
ID=70291826
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022514680A Pending JP2022551809A (ja) | 2019-09-03 | 2019-10-02 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
| JP2023120482A Pending JP2023139192A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
| JP2023120481A Pending JP2023139191A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023120482A Pending JP2023139192A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
| JP2023120481A Pending JP2023139191A (ja) | 2019-09-03 | 2023-07-25 | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220281928A1 (ja) |
| EP (1) | EP4026842A4 (ja) |
| JP (3) | JP2022551809A (ja) |
| KR (1) | KR102099342B1 (ja) |
| CN (1) | CN114929727A (ja) |
| BR (1) | BR112022003992A2 (ja) |
| CA (1) | CA3149784A1 (ja) |
| WO (1) | WO2021045292A1 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017508454A (ja) * | 2014-03-03 | 2017-03-30 | スカラブ ゲノミクス， エルエルシー | 大腸菌における組換えｃｒｍ１９７の産生強化 |
| WO2019143911A1 (en) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | Obi Pharma, Inc. | Crm197 protein expression |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4217344A (en) | 1976-06-23 | 1980-08-12 | L'oreal | Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres |
| US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
| US4186183A (en) | 1978-03-29 | 1980-01-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis |
| US4261975A (en) | 1979-09-19 | 1981-04-14 | Merck & Co., Inc. | Viral liposome particle |
| US4485054A (en) | 1982-10-04 | 1984-11-27 | Lipoderm Pharmaceuticals Limited | Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV) |
| US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
| US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4774085A (en) | 1985-07-09 | 1988-09-27 | 501 Board of Regents, Univ. of Texas | Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators |
| US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| AU7979491A (en) | 1990-05-03 | 1991-11-27 | Vical, Inc. | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes |
| KR100447530B1 (ko) * | 2001-08-14 | 2004-09-08 | 한국과학기술원 | ＯｍｐＦ를 이용하여 목적 단백질을 대장균 세포외로분비생산하는 방법 |
| KR100961528B1 (ko) * | 2007-10-17 | 2010-06-07 | 한국생명공학연구원 | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 |
| GB0917647D0 (en) * | 2009-10-08 | 2009-11-25 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Expression system |
| GB201106225D0 (en) * | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| GB201218660D0 (en) * | 2012-10-17 | 2012-11-28 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| WO2014102265A1 (en) * | 2012-12-27 | 2014-07-03 | Glycovaxyn Ag | Methods and compositions relating to crm197 |
| US20150184215A1 (en) * | 2013-12-27 | 2015-07-02 | Development Center For Biotechnology | Development of the soluble recombinant crm197 production by e. coli |
| KR101641578B1 (ko) * | 2014-01-08 | 2016-07-21 | 한국생명공학연구원 | 프로모터 변이체 및 이를 이용한 단백질 생산방법 |
| GB201610599D0 (en) * | 2016-06-17 | 2016-08-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic Composition |
| EP3444269A1 (en) * | 2017-08-17 | 2019-02-20 | National Research Council of Canada | Systems and methods for the production of diphtheria toxin polypeptides |
-
2019
- 2019-09-03 KR KR1020190108892A patent/KR102099342B1/ko active IP Right Grant
- 2019-10-02 WO PCT/KR2019/012899 patent/WO2021045292A1/ko unknown
- 2019-10-02 EP EP19944515.6A patent/EP4026842A4/en active Pending
- 2019-10-02 JP JP2022514680A patent/JP2022551809A/ja active Pending
- 2019-10-02 BR BR112022003992A patent/BR112022003992A2/pt unknown
- 2019-10-02 CN CN201980101045.9A patent/CN114929727A/zh active Pending
- 2019-10-02 US US17/638,822 patent/US20220281928A1/en active Pending
- 2019-10-02 CA CA3149784A patent/CA3149784A1/en active Pending
-
2023
- 2023-07-25 JP JP2023120482A patent/JP2023139192A/ja active Pending
- 2023-07-25 JP JP2023120481A patent/JP2023139191A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017508454A (ja) * | 2014-03-03 | 2017-03-30 | スカラブ ゲノミクス， エルエルシー | 大腸菌における組換えｃｒｍ１９７の産生強化 |
| WO2019143911A1 (en) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | Obi Pharma, Inc. | Crm197 protein expression |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114929727A (zh) | 2022-08-19 |
| BR112022003992A2 (pt) | 2022-06-21 |
| US20220281928A1 (en) | 2022-09-08 |
| WO2021045292A1 (ko) | 2021-03-11 |
| JP2023139192A (ja) | 2023-10-03 |
| CA3149784A1 (en) | 2021-03-11 |
| KR102099342B1 (ko) | 2020-04-10 |
| EP4026842A4 (en) | 2023-12-27 |
| JP2023139191A (ja) | 2023-10-03 |
| EP4026842A1 (en) | 2022-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6636661B2 (ja) | 大腸菌における組換えｃｒｍ１９７の産生強化 | |
| US7799552B2 (en) | Protein and nucleic acid expression systems | |
| JPH11513562A (ja) | 組換えプラスミドの生産方法 | |
| US11702456B2 (en) | Systems and methods for the production of diphtheria toxin polypeptides | |
| JP2023517162A (ja) | 枯草菌及びエンドヌクレアーゼを使用したヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の生成 | |
| WO2023045682A1 (zh) | 一种提高多肽可溶性表达产量的方法 | |
| JP5794985B2 (ja) | マンノースプロモーターを含むベクター及びマンノースプロモーター | |
| JP2021522785A (ja) | 抗体発現を最適化するための方法 | |
| US8354248B2 (en) | Promoter-encoding DNA fragment, recombinant vector, recombiant transformant, and uses thereof | |
| KR20140004219A (ko) | 대장균에서 이형 단백질 생산을 위한 새로운 발현 및 분비 벡터 시스템 | |
| KR102142255B1 (ko) | Crm197 단백질 발현 방법 | |
| JP2008509704A (ja) | プラスミドｄｎａ産生用大腸菌改良株 | |
| JP2022551809A (ja) | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 | |
| TW201111505A (en) | Fermentation process | |
| RU2803949C1 (ru) | Способ экспрессии белка crm197 | |
| JP7449000B2 (ja) | 可溶性の組換えタンパク質の生成 | |
| JP2021100434A (ja) | ストレプトマイセス属微生物用ベクター | |
| US11060123B2 (en) | Production of soluble recombinant protein without n-terminal methionine | |
| KR101175725B1 (ko) | 신규한 그람 양성균 박테리아 발현 시스템 | |
| KR20230102682A (ko) | 목적 단백질의 발현 방법 | |
| US20210348174A1 (en) | Production of Soluble Recombinant Proteins without N-Terminal Methionine in E-Coli | |
| US20200331973A1 (en) | Nucleic acid encoding crm197 and process for improved expression thereof | |
| KR20140002221A (ko) | ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| JPS633800A (ja) | 菌体外分泌による蛋白質の製造法 | |
| JPH0779781A (ja) | 蛋白排出遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220502 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230425 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20231121 |