KR20140002221A - ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents

ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140002221A
KR20140002221A KR1020120070151A KR20120070151A KR20140002221A KR 20140002221 A KR20140002221 A KR 20140002221A KR 1020120070151 A KR1020120070151 A KR 1020120070151A KR 20120070151 A KR20120070151 A KR 20120070151A KR 20140002221 A KR20140002221 A KR 20140002221A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
yrhb
protein
recombinant protein
human
gene
Prior art date
Application number
KR1020120070151A
Other languages
English (en)
Inventor
이지원
박진승
한경연
안금영
송종암
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020120070151A priority Critical patent/KR20140002221A/ko
Publication of KR20140002221A publication Critical patent/KR20140002221A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 융합파트너로 YrhB를 이용한 재조합 단백질의 발현벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게, 본 발명은 기존에 대장균 내 역할이 규명되지 않았던 대장균 YrhB의 대장균 내 역할 및 생화학적 특성을 규명하고, 이를 융합파트너로 YrhB 유전자를 이용하는 재조합 단백질융합파트너(fusion partner) 및 외래단백질 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조한 후, 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 과정을 거침으로써 대장균 YrhB 유전자를 융합파트너로 사용하여 발현시켜 재조합 단백질의 수용성 및 접힘(folding)을 향상시키는 재조합 단백질의 제조방법 및 대장균 YrhB 유전자를 융합파트너로 포함한 발현벡터에 관한 것이다.

Description

ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법{Preperation method of recombinant protein by use of YrhB as a fusion expression partner}
본 발명은 YrhB를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 에 관한 것이다.
최근 유전공학 및 생명공학 기술의 발달로 면역 조절 및 효소 저해제 및 호르몬 같은 의약 및 연구용 단백질과 진단용 단백질이나 반응 첨가 효소와 같은 산업용 단백질의 재조합 발현을 통한 생산 공정 기술 개발 및 산업화가 추진되고 있다. 특히, 대장균은 빠른 성장 속도로 인한 고농도 배양이 가능하며, 모든 유전 정보가 밝혀져 있기 때문에 대량의 재조합 단백질을 생산하기 위한 균주로서 많이 사용되고 있다. 그러나, 대장균은 진핵세포에서 일어나는 여러 가지 단백질 활성형 3차 구조 형성과정을 수행할 수 없음으로 대장균 내에서 여러 유용한 외래 단백질을 발현할 경우 불용성 응집체를 형성하는 경향이 있다. 이를 극복하기 위하여 대장균의 단백질 발현속도를 낮추어 목적 단백질의 수용도를 높이기 위해 저온 발현을 실행하거나[비특허문헌 1], 다양한 프로모터를 사용하여 유도 조건을 최적화[비특허문헌 2], 분자 샤페론 또는 단백질 접힘 조절자와 목적 단백질의 동시발현[비특허문헌 3] 및 융합발현파트너와 목적 단백질을 융합하여 발현시키는 방법이 널리 활용되고 있다.
대장균 내 분자 샤페론은 스트레스가 주어진 환경에서 대장균 성장 시 단백질의 접힘을 도와 단백질의 변성 및 불용성 응집체 형성을 막음으로써 스트레스에서도 대장균의 생존을 돕는 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 기존에 열에 반응하여 발현이 증가되는 열 충격 단백질(heat shock protein)인 DnaK/DnaJ/GrpE, GroEL/GroES, IbpA/B, Hsp31, Hsp33, ClpB 등이 분자 샤페론으로 확인되었다[비특허문헌 4, 비특허문헌 5].
하지만 기존에 밝혀진 열 충격 단백질이 모든 발현된 단백질에 대해서 접힘을 돕는 기능을 하지 못하므로 지난 30년 동안 새로운 분자 샤페론을 발견하고 그 기능을 규명하기 위한 연구가 지속되어 왔다[비특허문헌 6 내지 8].
이와 더불어 대장균 내에서 외래 단백질의 수용성 높은 발현을 유도하는 여러 융합발현파트너가 지난 수년 동안 연구되고 보고되어왔다[비특허문헌 9 내지 11]. 수많은 융합발현파트너가 개발되고 이용되어 왔지만 가장 많이 연구된 대표적인 융합발현파트너로는 MBP(Maltose binding protein), GST(Glutathione-S-transferase), Trx(Thioredoxin) 등이 있다. 이러한 융합발현파트너는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법을 이용하여 융합 발현된 목적 단백질을 쉽게 정제할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 하지만 이러한 융합발현파트너들은 의료목적 또는 산업적으로 유용한 단백질들에 모두 범용적으로 작용하지 않는다는 단점이 있다. 또한, 목적 단백질을 수용성으로의 발현을 유도하더라도 고유한 기능을 수행하는 활성형으로의 발현을 유도하는 데는 실패하는 경우가 많다. 또한, 이러한 융합파트너들은 목적 단백질에 비해 상대적으로 크기가 커서 융합 부분의 크기에 따라 목적 단백질의 수율이 현저히 떨어진다는 단점과 의료목적 또는 산업적으로 유용한 단백질들에 모두 범용적으로 작용하지 않는다는 단점이 있다. 또한, 목적 단백질을 수용성으로의 발현을 유도하더라도 고유한 기능을 수행하는 활성형으로의 발현을 유도하는 데는 실패하는 경우가 많고, 적합한 용도로 이용되기 위하여 융합파트너의 제거 과정이 추가되어야 하는 공정상의 불합리성을 지닌다는 문제점이 있다.
지금까지 생명공학 기술에 의해 산업적으로 생산된 국내의 재조합 단백질은 발현 가능한 재조합 단백질들의 생산 공정개발에 치중되어 있어서 핵심 원천 기술인 발현시스템 개발은 외국에 비해 상대적으로 모방 또는 개량 수준의 부가기술로서 개발되고 있는 상태이며 상업적으로나 의약적으로 매우 중요한 단백질은 분비 단백질(secretory protein) 및 막 단백질(membrane protein)들로서 대장균 내에서 발현 시 불용성 응집체를 만드는 난발현성 단백질(difficult-to-express proteins)이여서 개발이 지연되고 있다. 이를 극복하기 위해서는 대장균 내에서 난발현 단백질의 발현시스템에 관한 원천 기반기술을 확보하는 것이 중요하다. 또한, 상기한 바와 같이 각각의 융합파트너는 각기 다른 분자생물학적 특성을 가짐으로써 융합된 재조합 단백질이 접힘을 돕는 기작도 다르기 때문에 모든 단백질에서 동일한 효과를 나타내지 못한다.
Hammarstrom et al., Protein Sci. 11:313-321, 2002 Qing et al., Nat Biotechnol. 22:877-882, 2004 de Marco and De Marco, J Biotechnol. 109:45-52, 2004 Baneyx, F. and Mujacic, M., Nat. Biotechnol 22:1399-408,2004 Sakahira, H., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99 : 16412-16418, 2002 Jakob, U. et al., Cell 96:341-352, 1999 Rinas, U. et al., J. Biotechnol. 2, 127:244-257, 2007 Tomoyasu, T. et al., Nat. Struct. Biol., 8: 427-32, 2001 Esposito and Chatterjee, Curr. Opin. Biotechnol.17:353-358, 2006 Kapust and Waugh, Protein Sci. 8:1668-1674, 1999 Sachdev and Chirgwin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:933-937, 1998
이에, 본 발명자들은, 범용적으로 재조합 단백질의 접힘을 효과적으로 돕는 융합파트너를 이용한 발현 시스템을 구축하기 위해 예의 노력한 결과, 기존에 알려지지 않았던 대장균의 YrhB 유전자 암호화하는 단백질의 기능 및 특성을 규명하고 이를 융합파트너로 이용하여 목적 단백질과 융합 발현시킬 경우, 재조합 단백질의 수용성도(solubility) 및 발현율이 현저히 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 지금까지 규명되지 않았던 대장균 유래의 YrhB 유전자가 암호화하는 단백질의 생화학적 특성을 규명하고, 이를 융합파트너로 이용하여 대장균에서 외래 단백질의 발현 시 그 수용성도를 높이고 접힘(folding)을 향상시킬 수 있는, 재조합 단백질 생산용 융합파트너로 활용하기 위한 발현벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 단백질 생산용 발현벡터로 형질도입된 형질전환체 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 융합파트너(fusion partner)로 YrhB 유전자 및 외래단백질 유전자를 포함한 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계
를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 융합파트너(fusion partner)로 YrhB 유전자 및 외래단백질 유전자를 포함하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질 생산용 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 단백질의 제조방법에 의해 제조된 재조합 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 YrhB의 유전자를 융합파트너로 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법은 기존의 융합파트너가 가지고 있는 수용성과 접힘에 관한 한계를 극복할 수 있고, 단백질 의약품 및 산업용 생산에 폭 넓게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 이용된 모든 재조합 단백질 생산에 이용된 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 대장균 YrhB가 고온에서 대장균의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 37 ℃와 48 ℃에서 YrhB 결손 대장균과 야생형 대장균의 생장 속도를 비교한 그래프이다[(A) 야생형 BL21과 yrhB- mutant의 37 ℃에서 성장 비교 결과, (B) 야생형 BL21과 yrhB- mutant 및 yrhB- mutant[pHCE19(II)-YrhB]의 48 ℃에서 성장 비교 결과 및 yrhB- mutant[pHCE19(II)-YrhB] 내 YrhB의 발현 정도를 나타낸 SDS-PAGE 결과 (S: 가용성 분획, IS: 비가용성 분획)].
도 3은 YrhB가 고온에서 기존에 알려진 열 충격 단백질과 달리 다량체가 아닌 단량체로 존재함을 보여주는 Native PAGE 결과이다[1: 열 충격(heat shock) 주기 전, 2-11: 1시간 간격으로 총 10시간, M1,2: 14 kDa alpha-lactalbumin, M3: albumin mixture monomer(66 kDa), dimer (132 kDa)].
도 4는 대장균 유래의 PurK 단백질이 고온에 존재할 때 YrhB가 PurK의 열에 의한 변성을 방지하는 효과가 있다는 것을 보여주는 결과이다.
도 5는 YrhB가 UDP(uridine phosphorylase) 단백질의 리폴딩 시 샤페론과 같이 폴딩을 돕는 것을 검증한 실험 결과(A)이며, 뿐만 아니라 고온에서 UDP의 열에 의한 변성을 방지하는 효과를 검증한 분석(assay) 결과(B)이다[1U은 1분 동안 37 ℃에서 1μmole의 uridine을 uracil로 전환하는데 필요한 UDP의 양을 뜻함].
도 6은 9개의 난발현 단백질들을 대장균에서 단독으로 발현한 경우와 YrhB 유전자와 융합 발현시킨 경우의 재조합 단백질의 발현량을 SDS-PAGE 결과를 통해 용해도를 비교한 결과이다[M: 분자 마커; S: 가용성 분획; IS: 비가용성 분획].
도 7 은 YrhB 융합 아르기닌 디이미네이즈의 활성을 확인한 결과이다[(A) 엔테로카이네이즈 인식 부위가 삽입된 YrhB 융합 아르기닌 디이미네이즈(H6-YrhB-EK-ADI)의 정제 (fraction 1) 및 정제한 H6-YrhB-EK-ADI에 엔테로카이네이즈를 첨가하여 YrhB를 절단한 후(fraction 2,3) SDS-PAGE로 확인한 결과, (B) 정제한 H6-YrhB-EK-ADI(fraction 1)와 정제한 H6-YrhB-EK-ADI에 엔테로카이네이즈를 첨가하여 YrhB가 절단된 아르기닌 디이미네이즈를 포함하는 용액을 이용한 아르기닌 디이미네이즈의 활성 검증].
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에 있어서, 용어 "외래단백질(heterologous protein)" 또는 "목적단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "재조합 단백질(recombinant protein)" 또는 "융합단백질(fusion protien)"은 원래의 외래단백질의 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동 가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 융합파트너(fusion partner)로 YrhB 유전자 및 외래단백질 유전자를 포함한 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계
를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 YrhB 유전자는 대장균 유래이며, 서열번호 1로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 외래 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 사용하는 것이 바람직하고, 인간 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인간 프리프로그렐린(human prepro-ghrelin, ppGRN), 인간 인터류킨 2(human interleukin-2, hIL-2), 인간 활성 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, AID), 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, ADI), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, hFTN-L), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 인간 차가운 자가면역 질환 Nacht 도메인(cold autoinflammatory syndrome1 (NALP3) Nacht domain, Nacht) 및 글루탐산 탈카르복시화 효소의 448 내지 558 아미노산(glutamate decarboxylase448 -585, GAD448 -585)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 숙주세포는 대장균(E.coli)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
대장균에서 외래단백질은 불용성 응집체로 발현되는 경우가 많다. 이에 본 발명에서는 단백질의 올바른 접힘을 유도하기 위해 YrhB을 융합파트너로 사용하여, 재조합 단백질의 수용성 발현을 향상시키고자 하였다. 단백질의 접힘을 저해하는 조건에서도 활성이 유지되며 발현량이 증가한 단백질은 단백질의 잘못된 접힘(misfolding)을 극복하기 위한 대장균의 생체 메커니즘에 관여한다는 가능성뿐 아니라 단백질 구조가 안정적이며 자체 접힘 능력이 뛰어나다는 것을 보여주므로 융합단백질로서 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 기존에 생물학적 기능이 규명되지 않은 YrhB의 생물학적 특성을 규명하고 대장균 내 타 단백질에 미치는 영향을 규명하였다.
YrhB는 지금까지 대장균 내 생물학적 기능이 규명되지 않은 단백질이다. 본 연구를 통해 YrhB는 자체적인 구조적 안정성을 가지므로 고온에서 수용성으로 존재하는 것을 확인하였다. 전체 크기가 10 kDa 으로 기존에 알려진 small heat shock 단백질들이 고온에서 자가 조립을 통해 다량체로 존재하여 타 단백질의 불용성 응집체 형성을 방지하는 반면 YrhB는 고온에서도 단량체로 존재하며, 특히 수용성으로 존재하는 것을 확인하였다. 앞서 많은 연구를 통해 스트레스 저항성 단백질 및 단백질 변성조건에서도 본연의 구조를 유지할 수 있는 구조적 안정한 단백질을 선별하여 효과적인 융합파트너로 사용하여 많은 외래단백질을 활성형으로 그리고 수용성 상태로 생산해낸 바 있다. 즉, 자체적인 구조 안정성을 보임으로 융합파트너로서 사용 가능함을 가정하였다.
먼저, 고온에 존재하는 대장균에서 YrhB가 대장균의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, yrhB 유전자 결손 돌연변이체를 제작하여 야생형 대장균과 고온에서 생장을 비교하였다. 그 결과, 48 ℃에서 생장 시 yrhB 결손 돌연변이체는 생장이 야생형에 비해 저해되는 것을 확인하였으며, 이는 발현벡터를 통해 YrhB 단백질을 yrhB 결손 돌연변이체 내에서 발현하면 생장 저해 현상이 해소되는 것을 확인하였다(도 2). 이는 YrhB 단백질이 고온에서 대장균의 생장에 필수적임을 보여준다.
기존에 알려진 small heat shock protein은 대장균이 고온에 노출 시 다량체로 자가조립되어 대장균 단백질의 열 변성을 방지하는 것으로 알려져 있다. 이와 비교하기 위하여 유전자 재조합 기법을 이용하여 제조한 YrhB 단백질을 고온에 노출시켜 자가 조립 여부를 확인한 결과, YrhB는 고온에 노출되어도 단량체로 존재하며 특히 수용성으로 존재하므로 고온에 대한 열 안정성을 가지는 것을 확인하였다(도 3).
대장균 내 다른 단백질의 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 대장균 유래 단백질인 PurK와 UDP를 발현, 제조하였다. 유전자 재조합 기법을 이용하여 각 유전자를 증폭한 후 발현 벡터에 삽입하여 대장균에서 발현한 후, 정제한 PurK를 YrhB와 혼합하여 고온에 방치했을 때 PurK가 단독으로 존재할 때보다 PurK의 열 변성이 저해되는 것을 확인하였다(도 4). 뿐만 아니라 UDP 단백질의 변성 후 리폴딩 효율을 비교한 결과 YrhB가 존재할 경우 잘 알려진 DnaK/J/E 시스템과 유사한 리폴딩 효율 향상 효과를 나타냄을 확인하였다.
특히, DnaK/J/E 시스템은 ATP를 요구하는 반면, YrhB는 ATP 없이 대장균 내 단백질의 리폴딩을 돕는 것을 확인하였다(도 5의(A)). YrhB가 PurK의 열 변성을 방지한 효과를 보였던 것과 마찬가지로 UDP의 열 변성 또한 YrhB에 의해 효과적으로 방지되는 것을 확인하였다(도 5의 (B)).
이는 YrhB가 자체적인 고온에 대한 안정성을 지녀 대장균이 고온에 노출된 경우에 대장균 내 타 단백질의 열 변성을 저해함으로써 활성형으로 존재하도록 도와줘 결과적으로 고온에서 생장이 가능하게 해줌을 보여주며, 타 재조합 단백질의 활성형 제조를 위한 리폴딩 시 리폴딩 효율을 돕는 물질로 사용될 수 있음을 보여준다.
한편, 본 발명은 융합파트너로 YrhB 유전자 및 외래단백질 유전자를 포함하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터를 제공한다.
구체적으로 본 발명은 융합파트너로 YrhB 유전자와 외래단백질 유전자가 연결되어 포함되는 재조합 단백질 생산용 발현벡터를 포함할 수 있다.
상기 YrhB 유전자는 대장균 유래이며, 서열번호 1로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 외래단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 사용하는 것이 바람직하고, 인간 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인간 프리프로그렐린(human prepro-ghrelin, ppGRN), 인간 인터류킨 2(human interleukin-2, hIL-2), 인간 활성 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, AID), 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, ADI), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, hFTN-L), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 인간 차가운 자가면역 질환 Nacht 도메인(cold autoinflammatory syndrome1 (NALP3) Nacht domain, Nacht) 및 글루탐산 탈카르복시화 효소의 448 내지 558 아미노산(glutamate decarboxylase448 -585, GAD448 -585)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
자체적으로 높은 구조적 안정성과 접힘 효율을 지니는 단백질은 재조합 단백질 발현 시 융합 파트너로 좋은 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 본 발명에서는 YrhB를 외래단백질의 대장균 내 활성형 발현을 위한 융합 파트너로 활용하기 위한 발현벡터를 제조하였다[도 1 참조].
본 발명에서는 외래단백질의 예로 의료, 연구용 단백질인 인간 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, 이하 EGF), 인간 프리프로그렐린(human prepro-ghrelin, 이하 ppGRN), 인간 인터류킨 2(human interleukin-2, 이하 hIL-2), 인간 활성 시티딘 디아미네이즈 (human activation induced cytidine deaminase, 이하 AID), 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, 이하 ADI), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, 이하 hFTN-L), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, 이하 G-CSF), 인간 차가운 자가면역 질환 Nacht 도메인(cold autoinflammatory syndrome1 (NALP3) Nacht domain, Nacht)와 산업용 단백질인 제1형 당뇨병의 진단 마커로 알려진 글루탐산 탈카르복시화 효소의 448 내지 558 아미노산(glutamate decarboxylase448-585, 이하 'GAD448 -585')를 선정하여 각각 YrhB의 카르복실 말단에 삽입한 발현벡터를 제조하였다. 이를 대장균에 형질전환시켜 이로부터 재조합 단백질을 생산하였다. 각각의 재조합 단백질의 발현량을 확인한 결과, 단독 발현한 외래단백질의 수용성 발현량 보다 YrhB 융합한 외래단백질에서 수용성 발현량이 매우 증가하는 것을 확인하였다(도 6).
본 발명은 기존에 생물학적 특성 및 기능이 규명되지 않았던 대장균 단백질 YrhB의 분리 및 정제를 통해 단백질의 특성을 규명하고 이를 재조합 단백질의 리폴딩을 돕는 물질 및 재조합 단백질의 융합 발현 시 수용성도를 향상시킬 수 있는 융합 파트너로 활용하는 기술을 제공한다.
뼈대벡터에 융합 파트너로서 YrhB 유전자와 외래 단백질 유전자가 연결되어 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, pT7, pEt, pGEX 등의 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 발현벡터는 pT7 뼈대 벡터에 상기 융합파트너의 유전자와 외래단백질의 유전자를 삽입할 부위를 일련의 순서로 포함함으로써 상기 융합파트너와 외래단백질을 재조합 단백질로 발현할 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 벡터의 융합파트너의 유전자에 작동 가능하도록 YrhB 유전자와 외래단백질 사이에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 융합파트너와 융합할 목적단백질이 산업용 단백질일 경우, 융합파트너가 목적단백질의 기능을 저하할 수도 있으며, 의학용 단백질일 경우는 항원항체 반응을 야기할 수 있으므로 융합파트너는 제거되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 벡터의 융합파트너 또는 외래단백질의 유전자에 작동 가능하도록 재조합 단백질의 분리 정제가 용이하도록 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, poly-His 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 발명의 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 pT7 뼈대 벡터에 상기 융합파트너의 유전자, 외래단백질의 유전자 및 분리정제용 태그를 삽입할 부위를 일련의 순서로 포함함으로써 상기 융합파트너, 외래단백질 및 분리정제용 태그를 포함하는 재조합 단백질로 발현할 수 있다.
본 발명의 실시태양에서, 상기 외래 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 외래단백질 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 외래단백질이 생산될 수 있도록 할 수 있다
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 발현벡터는 융합파트너로 YrhB 유전자 및 외래 단백질 유전자를 포함하는 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 YrhB 유전자 는 대장균 유래이며, 서열번호 1로 표시되는 것이 바람직하다. 상기 외래 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성을 갖는 단백질을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 단백질의 제조방법에 의해 제조된 재조합 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 YrhB 유전자를 융합파트너로 이용한 제조방법으로 제조된 재조합 단백질은 높은 비율의 가용성으로 발현되고, 천연형과 동일한 단백질 구조를 형성하므로, 불용성 응집체에 요구되었던 변성제나 환원제에 의한 리폴딩(refolding) 과정을 생략할 수 있다. 고부가가치의 의료용 또는 산업용 재조합 단백질을 목적 단백질로 이용하여 이를 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 단백질의 융합파트너 YrhB는 크기가 작아서 목적단백질의 수율이 이전의 융합파트너에 비해 훨씬 향상될 수 있다. 또한, 도 4, 5에서 나타낸 바와 같이, 재조합 단백질의 활성 회복을 위한 리폴딩 시 리폴딩 효율을 향상시켜지는 물질로 사용 가능하며, 도 6에서 나타난 바와 같이 의료목적 또는 산업적으로 유용한 단백질들에 모두 범용적으로 작용할 수 있고, 목적단백질의 수용성 발현을 유도할 뿐만 아니라 고유한 기능을 수행하는 활성형으로의 발현을 유도하는데 적합하다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: YrhB 의 대장균 내 생물학적 특성을 확인하기 위한 YrhB 유전자 결손 대장균 제작
YrhB가 대장균의 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여, TargeTron system(Sigma-Aldrich)를 이용하여 yrhB 유전자 결손 대장균 BL21 (이하, yrhB- mutant)을 제조하였다. TargeTron 시스템은 염색체상에 존재하는 서열 중 원하는 유전자를 그룹 II 인트론으로 대체함으로써 특정 유전자를 녹아웃(knockout)시키는데 사용되었다.
먼저, yrhB 유전자 서열(서열번호 1; NCBI Reference Sequence: NC_012971.1; 3445686-3445970 bp)을 sigma-aldrich.com/targetronaccess 에 적용하여 group II Intron이 삽입 가능한 위치를 선정하고 RNA의 인트론을 유전자 변이를 시키기 위하여 PCR을 진행하기 위한 프라이머를 주문 제작하였다(Genotech). 주문 제작한 프라이머를 하기와 같이 조합하여 PCR을 진행하였다.
2μL IBS primer[서열번호 2] (100 μM)
2μL EBS1d primer[서열번호 3] (100 μM)
2μL EBS2 primer[서열번호 4] (20 μM)
2μL EBS universal primer[서열번호 5] (20 μM)
12μL Water
합 20 μL
PCR: 94℃, 30초- (94℃,15초 - 55℃,30초 - 72℃, 30초)x 30회 - 72℃, 2분
서열번호 2: IBS
AAAAA AGCTT ATAAT TATCC TTAGA TCTCC CGGTC GTGCG CCCAG ATAGG GTG
서열번호 3: EBS1d
CAGAT TGTAC AAATG TGGTG ATAAC AGATA AGTCC CGGTC GTTAA CTTAC CTTTC TTTGT
서열번호 4: EBS2
TGAAC GCAAG TTTCT AATTT CGATT AGATC TCGAT AGAGG AAAGT GTCT
서열번호 5: EBS
CGAAA TTAGA AACTT GCGTT CAGTA AAC
그 결과, 550bp PCR 산물을 얻었으며, 이를 아래와 같이 제한 효소 처리를 하여 350 bp의 cohesive end를 가지는 DNA를 준비하였다 (60℃, 30분)
8μL PCR 산물 (200 ng)
2μL 10X제한효소 버퍼
1μL Hind III (20 U/ μL)
1μL BsrG I (10 U/ μL)
8μL Water
합 20 μL, 60℃, 30분
그 후, 그룹 II 인트론, 클로람페니콜(chloramphenicol), 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자를 포함하고 있는 pACD4K-C 벡터와 라이게이션(ligation)을 진행하였다.
2μL pACD4K-C Linear vector (40 ng)
6μL 상기 제한 효소 처리한 PCR 산물 (350 bp)
10μL Quick Link buffer A
2μL Quick Link buffer B
합 20 μL, 60℃, 30초
그런 다음, 아이스에 1분간 방치한 후, 1 μL의 Quick-Link Ligase를 넣어 25℃에서 30분간 라이게이션을 진행하였다. 라이게이션 한 벡터를 하나한(Hanahan)이 기술한 방법[Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985]에 의해 BL21에 형질전환하였다. 형질전환된 BL21은 클로람페니콜(100 mg/L)과 카나마이신(100 mg/L)이 포함된 LB 플레이트에 도말하여 선별하였다.
또한, yrhB- mutant내에 YrhB 단백질이 존재할 경우 생장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, pHCE19(II)에 yrhB 유전자를 삽입하여 형질전환하였다. yrhB 유전자(서열번호 1)를 암호화하는 뉴클레오티드를 획득하기 위해, yrhB 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다. 또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 6: GAA TTC ATG ATTACTT ATCACGACGC)에는 EcoRI 제한효소 인식서열을, 안티센스 프라이머(서열번호 7: GGA TCC TCA GGG CAA GCC GAA GGT)에는 정지코돈과 BamHI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하였다.
PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH 8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 대장균으로부터 분리한 염색체를 주형 DNA로 100 ng, 상기 서열번호 6,7로 표시되는 프라이머쌍을 각각 50 pmol을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행되었다. 반응 조건은 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 수행하였으며, 그 결과 증폭된 DNA절편의 5' 말단에 EcoRI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한 효소 부위를 포함하는 PCR 산물을 수득하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소 EcoRI과 BamHI으로 각각 처리하여 pHCE19(II)의 제한효소 EcoRI과 BamHI자리에 삽입하였고, 이를 pHCE19(II)-YrhB이라고 명명하였다. pHCE19(II)-YrhB로 형질전환된 yrhB- mutant(이하 yrhB-[pHCE19(II)-YrhB])는 암피실린(100 mg/L), 카나마이신(100 mg/mL), 클로람페니콜(100 mg/L)이 포함된 LB 플레이트에 도말하여 선별하였다.
실시예 2: YrhB 가 고온에 존재하는 대장균의 생장에 미치는 영향을 확인한 실험 결과
실시예 1에서 제조한 형질전환체 콜로니와 야생형 BL21 콜로니를 각 배지 5 ml에 접종하여 37 ℃에서 15시간 배양하였다.
구체적으로 야생형 BL21은 LB에, yrhB- mutant는 카나마이신(100 mg/L)와 클로람페니콜(100 mg/ L) 포함된 LB, 마지막으로 yrhB-[pHCE19(II)-YrhB]은 암피실린(100 mg/L), 카나마이신(100 mg/L), 클로람페니콜(100 mg/L)이 들어있는 LB배지에 접종하였다. 이를 각 50 ml 배지가 들어있는 삼각 플라스크에 1 ml씩 접종하여 37 ℃에서 배양 후 O.D60이 0.5에 이르렀을 때 37 ℃ 또는 48 ℃에 옮겨서 배양하였으며 30분 간격으로 5시간 동안 O.D600를 측정하였다.
그 결과, 37 ℃에서는 yrhB- mutant와 야생형이 동일한 성장 속도를 보인 반면[도 2의 (A)], 고온(48 ℃)에서는 yrhB- mutant의 성장 속도가 야생형에 비해 급격히 감소함을 확인하였다[도2의 (B)]. 하지만 yrhB- mutant에 pHCE19(II)-YrhB를 통해 YrhB 단백질을 발현함으로써 고온에 의한 성장 속도 저해가 극복되는 것을 확인하였다. 이는 대장균이 고온에 존재할 때 YrhB 단백질의 대장균의 생존 유지 및 성장 유지에 필수적임을 보여준다.
실시예 3: 온도에 따른 YrhB 의 4차원 구조 확인
YrhB 단백질을 분리 정제를 목적으로, yrhB 유전자(서열번호 1)를 암호화하는 뉴클레오티드를 획득하기 위해, yrhB 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다. 또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 8: GAA TTC ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT ATTACTT ATCACGACGC)에는 EcoRI 제한효소 인식서열과 히스티딘을 암호화하는 서열을, 안티센스 프라이머(서열번호 9: GGA TCC TCA GGG CAA GCC GAA GGT)에는 정지코돈과 BamHI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하였다. PCR과 라이게이션은 실시예 2에 명시된 바와 동일하게 진행하였고, 이를 pHCE19(II)-H6 YrhB이라고 명명하였다[정제하기 위해서 YrhB 의 아미노 말단에 Histidine이 6개 들어가도록 설계, 센스 프라이머 서열번호 8에 CAC CAT CAC CAT CAC CAT 가 히스티딘을 암호하는 유전자 서열임]. pHCE19(II)-H6YrhB로 형질전환된 BL21을 암피실린(100 mg/L) LB 배지(150 mL)에서 배양하여 O.D600이 3이 될 때까지 37 ℃에서 배양하였다. 융합 발현된 H6 YrhB는 Ni-NTA 아가로스 비드(QIAGEN) 500㎕을 사용하여 Ni2 + 이온 친화 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 분리 정제한 H6 YrhB (1 mg/ml) 를 48 ℃에 두고 1시간 간격으로 10시간 동안 시료(16 μL)를 채취하여 원심분리(13,000 rpm, 10 분)를 통해 상등액과 불용성 응집체를 분리하였으며, 이를 각각 Native PAGE loading dye(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 37.5% 글리세롤) (4 μL)와 혼합한 후, 폴리아크릴아마이드 겔로 100 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법을 염색한 후 탈색하였다.
그 결과, 시간에 관계 없이 YrhB는 수용액으로 존재하였으며, 단량체(10 kDa)로 존재하는 것을 확인하였다[도 3].
실시예 4: YrhB 의 대장균 유래 단백질의 열변성 저해 효과 검증
대장균 유래의 단백질 N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthase(이하, PurK)를 암호화하는 뉴클레오티드(서열번호 12, NCBI Reference Sequence: NC_012971.1; 520614-521681bp)를 획득하기 위해, purK 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다.
또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 10: CAT ATG AAA CAG G TT TGC GTC)에는 NdeI 제한효소 인식서열을, 안티센스 프라이머(서열번호 11: CTC GAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG ACT GAA CTT ACT CTG C)에는 정지코돈과 히스티딘, XhoI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하였다.
PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 대장균으로부터 분리한 염색체를 주형 DNA로 100 ng, 프라이머쌍을 각각 50 pmol을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행되었다. 반응 조건은 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 수행하였으며, 그 결과 증폭된 DNA절편의 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 XhoI 제한 효소 부위를 포함하는 PCR 산물을 수득하였다.
증폭된 PCR 산물을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 각각 처리하여 pT7-7(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI자리에 삽입하였고 이를 pT7-PurK H6이라고 명명하였다[정제하기 위해서 PurK 의 카르복실 말단에 Histidine이 6개 들어가도록 설계함]. pT7-PurK H6로 형질전환된 yrhB- mutant(이하 yrhB-[pT7-PurK H6])는 암피실린(100 mg/L), 카나마이신(100 mg/mL), 클로람페니콜(100 mg/L)이 포함된 LB 플레이트에 도말하여 선별하였다. 선별된 콜로니를 하룻밤 동안 암피실린(100 mg/L), 카나마이신(100 mg/mL)를 포함하는 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 동일 배지에 접종한 다음 37 ℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600이 0.5~0.6에 이르렀을 때 IPTG를 첨가(1 mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 동일한 조건으로 5~6시간 더 배양하였다. 융합 발현된 PurK H6 는 Ni-NTA 아가로스 비드(QIAGEN) 500㎕을 사용하여 Ni2 + 이온 친화 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
실시예 3에서 분리 정제한 H6 YrhB 와 PurK H6를 10 mM 포타슘 포스페이트(pH 7.4)에 아래와 같이 희석하였다.
1) 15 μM PurK H6, 2) 15 μM PurK H6 + 50 μM H6 YrhB, 3) 15 μM PurK H6 + 50 μM BSA (PIERCE, USA). 세가지 시료를 각각 20 μL씩 분주하여 55℃에서 5분 간격으로 30분간 방치 후 13,000rpm으로 원심 분리하여 수용액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리한 상등액과 불용성 응집체를 각각 5xSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)과 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량을 농도계(Densitometer, Bio-Rad, USA)로 확인하고, 하기 수학식 1에 따라 용해도(%)를 계산하였다.
[수학식 1]
Figure pat00001
그 결과, 도 4에서 보여지는 바와 같이, YrhB 가 같이 존재할 때 고온에서 PurK이 열 변성이 저해되는 것을 확인하였다.
실시예 5: YrhB 의 대장균 유래 단백질의 리폴딩 촉진 효과 검증
대장균 유래의 단백질(uridine phosphorylase, 이하 UDP)를 암호화하는 뉴클레오티드[서열번호 15, NCBI Reference Sequence: NC_012971.1; 3916345-3917109bp]를 획득하기 위해, udp 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다.
또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 13: CAT ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TCC AAG TCT GAT GTT TTT C)에는 히스티딘과 NdeI 제한효소 인식서열을, 안티센스 프라이머(서열번호 14: CTC GAG TTA TTT CAG CAG ACG ACG)에는 정지코돈과, XhoI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하였다. 실시예 4와 동일하게 PCR과 제한효소 처리를 하여 pT7-7(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI 자리에 삽입하였고 이를 pT7- H6 UDP라고 명명하였다[정제하기 위해서 UDP의 아미노 말단에 Histidine이 6개 들어가도록 설계함].
pT7-H6 UDP로 형질전환된 yrhB- mutant(이하, yrhB-[pT7-H6 UDP])는 Ampicilline(100 mg/L), kanamycine(100 mg/mL), chloramphenicol(100 mg/L)이 포함된 LB 플레이트에 도말하여 선별하였다. 실시예 4와 동일하게 콜로니 선별 및 단백질 발현, 분리 정제를 진행하였다.
정제한 H6 UDP를 10 mM 포타슘 포스페이트(pH 7.4)에 1 mM로 준비한 후 445 μL의 8M 구아니딘 HCl, 445 μL 의 100mM MOPS(pH 7.4), 10 μL의 1mM UDP를 혼합하여 37℃에서 6시간 동안 배양하여 변성시켰다. 변성된 UDP는 100 mM phosphate, 50 mM MOPS(pH 7.5) 의 리폴딩 버퍼에 다음과 같이 5가지 조합으로 최종 농도를 맞추어 시료를 준비 후 리폴딩을 시도하였으며, 시간별로 UDP의 활성을 측정하였다.
1) 10 μM UDP , 2) 10 μM UDP + 40 nM YrhB, 3) 10 μM UDP + 40 nM YrhB + 1 mM ATP, 4)10 μM UDP + v 2 mM MgCl2 , 40 nM DnaK, 8 nM DnaJ, 4 nM GrpE (Stressgen,USA) 5) 10 μM UDP + 1 mM ATP, 2 mM MgCl2 , 40 nM DnaK, 8 nM DnaJ, 4 nM GrpE (Stressgen,USA)
UDP 활성은 Leer, J.C. et al., Eur. J. Biochem., 75: 217-224,1997 의 논문을 참고하였다.
간단히 정리하면, 리폴딩을 시행한 용액 50 μL (0.4 μM UDP)를 950 μL 기질 용액(5 mM uridine, 10 mM phosphate, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.3)에 넣은 후 37 ℃에서 5분간 반응시켰다. 반응용액 300 μL 에 0.5 M NaOH 700 ㎕를 넣어 반응을 종료하고 이 용액을 290 nm에서 O.D를 측정하였다. O.D290=5.41은 UDP에 의해 1mM의 우라실(uracil)이 생성됨을 말하며, 1U은 37 ℃에서 1분간 1μmole 의 우리딘(uridine)을 우라실(uracil)로 전환시키는데 소요되는 UDP의 양을 뜻한다.
그 결과, YrhB가 존재할 때 UDP가 단독으로 존재할 때 보다 리폴딩 효율이 증가하며 ATP 없이도 리폴딩 효율이 증가되는 것을 확인하였다. 특히, 이는 기존에 분자샤페론 시스템으로 잘 알려진 DnaK/J/E 시스템과 유사한 효율의 리폴딩 향상 효과를 가져온 것을 확인하였다(도 5의 (A)).
실시예 4와 같이 UPD의 열변성에 대한 YrhB의 효과를 확인하기 위하여, 분리 정제한 UDP(1.7 μM)를 1) UDP 단독, 2) UDP + 1.7 μM YrhB 혼합 시료를 준비하여 10분 간격으로 두 시간 동안 60 ℃에 방치 후 동일한 방법으로 UDP 활성을 측정하였다.
그 결과, YrhB가 혼합되어 있을 때 UDP의 열변성에 의한 효소 활성 저해가 감소하는 것을 확인하였다(도 5의 (B)).
실시예 6: 아미노 말단에 YrhB 를 융합파트너로 포함하는 발현벡터의 제조
고온에서 구조 안정성이 뛰어나며 대장균 내 단백질의 열변성 저해 및 리폴딩 효과를 향상시켜 주는 YrhB를 융합파트너로 포함하는 발현벡터를 제조하였다.
정지 코돈을 제외한 YrhB의 유전자를 획득하기 위하여, PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다. 또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 16: CAT ATG ATT ACT TAT CAC GAC g)에는 NdeI 제한효소 인식서열을, 안티센스 프라이머(서열번호 17: CTC GAG GGG CAA GCC GAA GGT)에는 XhoI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하였다. 실시예 2와 같은 방법으로 PCR 과 제한효소 처리를 진행하였으며, 이를 pT7-7(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI 자리에 삽입하였고, 이를 pT7-YrhB 이라고 명명하였다.
실시예 7: 외래단백질을 융합단백질 형태로 제조하는 발현벡터
YrhB를 융합파트너로 이용하여 다양한 외래단백질의 수용성 발현의 증가를 확인하기 위해, 외래단백질의 단독 발현벡터, 융합파트너와의 융합 발현벡터 및 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합 발현벡터를 제작하였다.
1) 외래단백질 단독 발현벡터
인간 표피 성장 인자(epidermal growth factor, 이하 EGF; NCBI Nucleotide accession number M15672 /1-165bp)[서열번호 18], 인간 프리프로-그렐린(human prepro-ghrelin, 이하 ppGRN; NCBI Nucleotide accession number NM;016362: 109-393)[서열번호 19], 인간 인터루킨 2(human interleukin 2, 이하 hIL-2; nm;000586/116-517bp)[서열번호 20], 인간 활성유도 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, 이하 AID; NCBI Nucleotide accession number NM;020661: 77-673bp)[서열번호 21], 인간 글루타메이트 디카르복실레이즈(human glutamate decarboxylase, 이하 GAD448 -585)[서열번호 22], 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, 이하 ADI; NCBI Nucleotide accession number X54141)[서열번호 23], 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, 이하 hFTN-L; NM;000146:200-727bp)[서열번호 24], 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, 이하 G-CSF; NCBI Nucleotide accession number NM;172219: 131-655bp)[서열번호 25], 인간 NLR family, pyrin domain containing 3(이하, Nacht, NCBI Nucleotide accession number NM;183395.2: 1410-2354bp)[서열번호 26] 등 외래단백질의 5'-말단에 NdeI 제한효소 인식서열과 3'-말단에 HindIII(GAD의 경우 ClaI) 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작된 하기 표 1의 프라이머쌍을 각각 50 pmol씩 포함한 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH4)2SO4; 20 mM Tris-HCl(pH 8.8); 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100 ng을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 94℃/30초(변성), 52℃/30초(어닐링), 72℃/30초(신장)로 총 30회 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 증폭 산물을 NdeI/HindIII(GAD448 -585의 경우는 NdeI/ClaI) 제한 효소로 처리한 후, 대장균 발현벡터 pT7(Novagen, USA)의 NdeI/HindIII(GAD448 -585의 경우는 NdeI/ClaI) 자리에 삽입함으로써 외래단백질의 단독 발현벡터를 수득하였다.
유전자명 프라이머 염기서열
EGF 센스 CAT ATG AAC TCT GAC TCC GAATGC (서열번호 27)
안티센스 AAG CTT TTA ACG CAG TTC CCA CCA (서열번호 28)
ppGRN 센스 CAT ATG GGC TCC AGC TTC CTG (서열번호 29)
안티센스 AAG CTT TCA CTT GTC GGC T (서열번호 30)
hIL-2 센스 CAT ATG GCA CCT ACT TCA AGT (서열번호 31)
안티센스 AAG CTT TTA TCA AGT CAG TGT (서열번호 32)
AID 센스 CAT ATG GAC AGC CTC TTG ATG AAC (서열번호 33)
안티센스 AAG CTT TCA TAA CAA AAG TCC CA (서열번호 34)
GAD448 -585 센스 CAT ATG CGC CAC GTT GAT GT (서열번호 35)
안티센스 ATC GAT TTA TAA ATC TTG TCC (서열번호 36)
ADI 센스 CAT ATG TCT GTA TTT GAC AGT (서열번호 37)
안티센스 AAG CTT CTA TCA CTT AAC ATC (서열번호 38)
hFTN-L 센스 CAT ATG AGC TCC CAG ATT CGT (서열번호 39)
안티센스 AAG CTT TTA GTC GTG CTT GAG AGT (서열번호 40)
hG-CSF 센스 CAT ATG ACT CCA CTC GGA CCT G (서열번호 41)
안티센스 AAG CTT TCA TGG CTG TGC AAG (서열번호 42)
Nacht 센스 CAT ATG ACT GTG GTG TTC CAG (서열번호 43)
안티센스 AAG CTT TCA CAG CAG GTA GTA C (서열번호 44)
2) 외래단백질의 융합파트너와의 융합 발현벡터
하기 표 2의 프라이머쌍을 이용하여 실시예 7-1과 같이 PCR을 통해 9개의 외래 단백질에 대한 융합 발현용 벡터 제작을 위한 DNA를 증폭하였다.
상기 PCR 증폭 산물을 XhoI/HindIII(GAD448 -585의 경우는 XhoI/ClaI) 제한효소로 처리한 후, 실시예 1의 방법으로 제작한 발현벡터 pT7-YrhB의 XhoI/HindIII(GAD448-585의 경우는 XhoI/ClaI) 자리에 삽입함으로써 외래단백질의 융합파트너와의 융합 발현벡터를 수득하였다.
상기의 방법으로 만들어진 플라스미드를 각각 pT7-YrhB:EGF, pT7-YrhB:ppGRN, pT7-YrhB:hIL-2, pT7-YrhB:AID, pT7-YrhB:GAD448 -585, pT7-YrhB:ADI, pT7 YrhB:hFTN-L, pT7-YrhB:G-CSF 및 pT7-YrhB:Nacht라고 명명하였다.
유전자명 프라이머 염기서열
EGF 센스 CTC GAG AAC TCT GAC TCC GAATGC (서열번호 45)
안티센스 AAG CTT TTA ACG CAG TTC CCA CCA (서열번호 46)
ppGRN 센스 CTC GAG GGC TCC AGC TTC CTG (서열번호 47)
안티센스 AAG CTT TCA CTT GTC GGC T (서열번호 48)
hIL-2 센스 CTC GAG GCA CCT ACT TCA AGT (서열번호 49)
안티센스 AAG CTT TTA TCA AGT CAG TGT (서열번호 50)
AID 센스 CTC GAG GAC AGC CTC TTG ATG AAC (서열번호 51)
안티센스 AAG CTT TCA TAA CAA AAG TCC CA (서열번호 52)
GAD448 -585 센스 CTC GAG CGC CAC GTT GAT GT (서열번호 53)
안티센스 ATC GAT TTA TAA ATC TTG TCC (서열번호 54)
ADI 센스 CTC GAG TCT GTA TTT GAC AGT (서열번호 55)
안티센스 AAG CTT CTA TCA CTT AAC ATC (서열번호 56)
hFTN-L 센스 CTC GAG AGC TCC CAG ATT CGT (서열번호 57)
안티센스 AAG CTT TTA GTC GTG CTT GAG AGT (서열번호 58)
hG-CSF 센스 CTC GAG ACT CCA CTC GGA CCT G (서열번호 59)
안티센스 AAG CTT TCA TGG CTG TGC AAG (서열번호 60)
Nacht 센스 CTC GAG ACT GTG GTG TTC CAG (서열번호 61)
안티센스 AAG CTT TCA CAG CAG GTA GTA C (서열번호 62)
3) 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합 발현벡터 제작
YrhB와 융합 발현한 목적 단백질이 활성을 유지하는지 확인하기 위하여, 효소 활성 측정이 가능한 아르기닌 디이미나아제(ADI)를 목적 단백질로 하는 YrhB 융합 단백질 발현벡터를 제작하였다. 정제를 위하여 yrhB의 아미노 말단에 히스티틴을 포함하는 H6-YrhB의 유전자를 획득하기 위하여, PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 제작하였다. 또한, 상기 프라이머쌍의 센스 프라이머(서열번호 63: CAT ATG ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT ATTACTT ATCACGACGC)에는 NdeI 제한효소 인식서열을 포함하도록 제작하고 서열번호 17을 안티센스 프라이머로 하여 실시예 2와 같은 방법으로 PCR 과 제한효소 처리를 진행하였으며, 이를 pT7-7(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI 자리에 삽입하였고, 이를 pT7-H6-YrhB라고 명명하였다. 센스프라이머(서열번호 64: CTC GAG GAT GAC GAT GAC AAA TCT GTA TTT GAC AGT)와 안티센스 프라이머(서열번호 56) 이용하여 실시예 7-2)와 같이 PCR을 통해 융합 발현용 벡터 제작을 위한 엔테로카이네이즈 절단부위를 포함하는ADI DNA를 증폭하였으며, 이를pT7-H6-YrhB의 XhoI/HindIII 자리에 삽입함으로써 pT7-H6 YrhB-EK-ADI 발현벡터를 수득하였다.
실시예 8: 재조합 단백질의 수용성 발현
실시예 7의 방법으로 제조한 외래단백질의 단독 발현벡터, 융합파트너와의 융합 발현벡터를 대장균에 형질 전환하여 배양한 뒤, IPTG로 재조합 단백질의 발현을 유도함으로써 본 발명의 융합파트너에 의한 수용성 발현의 효과를 확인하였다.
1) 대장균 형질전환 및 재조합 단백질의 발현
하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 실시예 7의 벡터들(외래단백질 단독 발현벡터, 외래단백질의 융합파트너와의 융합 발현벡터, 단백질 절단효소 인식부위를 포함하는 융합 발현벡터)를 대장균에 형질전환하였다.
구체적으로 CaCl2로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 실시예 7의 벡터들을 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후, 암피실린(ampicillin)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 암피실린 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 100㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 LB 배지에 접종한 다음 37℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600이 0.5~0.6에 이르렀을 때 IPTG를 첨가(1 mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 동일한 조건으로 5~6시간 더 배양하였다.
2) SDS - PAGE 를 이용한 가용성으로 생산된 재조합 단백질 확인
실시예 8-1)의 방법으로 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심분리하여 균체 침전물을 회수한 후 7 ml의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson sonifier, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액과 불용성 응집체를 각각 5xSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)과 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 12% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량을 농도계(Densitometer, Bio-Rad, USA)로 확인하고, 상기 수학식 1에 따라 용해도(%)를 계산하였다.
그 결과, YrhB와 융합한 외래단백질의 발현이 대부분 불용성 응집체보다 수용성 발현에서 더 많은 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 단독 발현한 외래단백질의 수용성 발현량보다 YrhB와 융합한 외래단백질에서 용해도가 매우 증가하는 것을 확인하였다(도 6 참조).
실시예 9: YrhB 융합 단백질의 활성형 유지 여부 확인
1) YrhB 와 융합 발현한 아르기닌 디이미나아제(ADI)의 발현 및 정제
YrhB와 융합 발현한 목적 단백질이 활성을 유지하는지 확인하기 위하여, 효소 활성 측정이 가능한 ADI를 목적 단백질로 하는 YrhB 융합 단백질 발현 벡터를 실시예 7-3)과 같이 제작하였으며 이를 실시예 8-1)에 언급한 바와 같이 형진전환체를 제작하였다. 실시예 3, 4 와 같이 재조합 단백질을 발현, 정제하여 H6-YrhB-EK-ADI 재조합 단백질을 하였다.
2) YrhB 와 융합 발현한 아르기닌 디이미나아제(ADI)의 효소 활성 확인
이미 발표된 문헌[Noh EJ et al., Mol cells 13:137-143, 2002; Misawa S et al., Biotechnol 36:145-155, 1994]의 실험 방법을 사용하여 실시예 7의 3)을 통해서 확보한 YrhB가 융합발현된 아르기닌 디이미나아제(이하, H6 YrhB-EK-ADI) 그리고 YrhB를 엔테로카이네이즈로 절단한 후 아르기닌 디이미나아제의 효소활성을 측정하였다.
아르기닌 디이미나아제는 L-아르기닌을 가수분해하여 L-시트룰린과 암모니아를 생합성하는 효소이다. 각종 효모 및 세균에는 아르기닌의 아미노기 대사에 연결하여 ATP를 생산하는 경로가 존재하는데, 이 효소는 그 경로의 최초단계에서 작용한다. 활성의 측정은 L-아르기닌으로부터 반응에서 생성되는 L-시트룰린을 아치볼드비색법(산성에서 디아세틸모노옥심을 작용시켜 산화제를 가하면 요소와 그 유도체가 황색에서 적색으로 변하는 반응)으로 측정하였다. 미카엘리스상수 Km값 0.5×10-4M (아르기닌), 10-3M(카나바닌)이고, 최적 pH는 6.7~6.8이며 p-메르쿠리벤조산(PMB)에 의해 저해된다. OD 530nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 5분간 반응을 기록하였다.
그 결과, 상기 수용성 재조합 단백질 H6 YrhB EK ADI 그리고 YrhB를 엔테로카이네이즈로 절단한 후 아르기닌 디이미나아제의 효소 활성이 확인되었다. 이로서 YrhB 절단한 후 ADI가 수용성 상태로 존재할 뿐 아니라 활성을 유지함을 확인하였다[도 7 참조].
따라서, 본 발명은 융합 파트너를 이용하여 외래단백질을 생산할 때 먼저 대장균 내에서 수용성으로 생산하고, 융합 파트너를 절단한 후에 외래 단백질이 활성형으로 유지되는 것으로, 산업적 생산 측면에서 유용하다고 할 수 있다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Preperation method of recombinant protein by use of YrhB as a fusion expression partner <160> 64 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 285 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgattactt atcacgacgc attcgcgaaa gcgaaccatt accttgatga tgcagatctc 60 ccggtcgtca ttactctaca tggacgcttt agccagggct ggtatttctg tttcgaagca 120 cgagaatttc tcgaaactgg agatgaggcc gcgcgcttag ctggtaacgc accttttatt 180 attgataaag acagtggtga aattcattct ctgggaacgg caaagccgct ggaagaatat 240 ctacaggatt acgaaataaa aaaggctacc ttcggcttgc cctga 285 <210> 2 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS primer <400> 2 aaaaaagctt ataattatcc ttagatctcc cggtcgtgcg cccagatagg gtg 53 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS1d primer <400> 3 cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcccggtc gttaacttac ctttctttgt 60 60 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS2 primer <400> 4 tgaacgcaag tttctaattt cgattagatc tcgatagagg aaagtgtct 49 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBS universal primer <400> 5 cgaaattaga aacttgcgtt cagtaaac 28 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 6 gaattcatga ttacttatca cgacgc 26 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 7 ggatcctcag ggcaagccga aggt 24 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 8 gaattcatgc accatcacca tcaccatatt acttatcacg acgc 44 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 9 ggatcctcag ggcaagccga aggt 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 10 catatgaaac aggtttgcgt c 21 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 11 ctcgagttaa tggtgatggt gatggtgact gaacttactc tgc 43 <210> 12 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide coding PurK <400> 12 atgaaacagg tttgcgtcct cggtaacggg cagttaggcc gtatgctgcg tcaggcaggt 60 gaaccgttag gcattgctgt ctggccggtc gggctggacg ctgaaccggc ggcggtgcct 120 tttcaacaaa gcgtgattac cgctgagatc gaacgctggc cggaaaccgc attaacccgc 180 gagctggcgc gtcatccggc ctttgtgaac cgcgatgtgt tcccgattat tgccgaccgt 240 ctgactcaga agcagctttt cgataagctc cacctgccga ccgcaccgtg gcagttactt 300 gccgatcgca gcgagtggcc tgcggtgttt gagcgtttag gtgaactggc gattgttaag 360 cgtcgcactg gtggctatga cggtcgcggt caatggcgtt tacgtgccaa tgaaaccgaa 420 cagttaccgg cagagtgtta cggcgaatgt attgtcgagc agggcattaa cttctctggt 480 gaagtgtcgc tggttggcgc acgcggattt gatggcagca ccgtgtttta tccgctgacg 540 cataacctgc atcaggacgg tattttgcgc accagcgtcg cttttccgca ggccaatgcg 600 cagcagcaag cgcaagccga agagatgctg tcggcgatta tgcaggagct gggctatgtg 660 ggcgtgatgg cgatggagtg ttttgtcacc ccgcaaggtc tgctgatcaa cgaactggca 720 ccgcgtgtgc ataacagcgg tcactggaca caaaacggtg ccagcatcag ccagtttgag 780 ctgcatctgc gggcgattac cgatctgccg ttaccgcaac cggtagtgaa tagtccgtcg 840 gtgatgatca acctgattgg tagcgatgtg aattatgact ggctgaaact gccgctggtg 900 catctgcact ggtacgacaa agaagtccgt ccggggcgta aagtggggca tctgaatttg 960 accgacagcg acacatcgcg tctgaccgcg acgctggaag ccttgatccc gctgctgccg 1020 ccggagtatg ccagcggcgt gatgtgggcg cagagtaagt tcagttaa 1068 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 13 catatgcacc atcaccatca ccattccaag tctgatgttt ttc 43 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 14 ctcgagttat ttcagcagac gacg 24 <210> 15 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide coding UDP <400> 15 atgtccaagt ctgatgtttt tcatctcggc ctcactaaaa acgatttaca aggggctacg 60 cttgccatcg tccctggcga cccggatcgt gtggaaaaga tcgccgcgct gatggataag 120 ccggttaagc tggcatctca ccgcgaattc accacctggc gtgcagagct ggatggtaaa 180 cctgttatcg tctgctctac cggtatcggc ggcccgtcta cctctattgc tgttgaagag 240 ctggcacagc tgggcattcg caccttcctg cgtatcggca caacgggcgc tattcagccg 300 catattaatg tgggtgatgt cctggttacc acggcgtctg ttcgtctgga tggtgcgagc 360 ctgcacttcg caccgctgga attcccggct gtcgctgatt tcgaatgtac gactgcgctg 420 gttgaagctg cgaaatccat tggcgcgacg actcacgttg gcgtgacagc ttcttctgat 480 accttctacc ctggtcagga acgttacgat acttactctg gtcgcgtagt ccgtcacttt 540 aaaggttcta tggaagagtg gcaggcgatg ggcgtaatga actatgaaat ggaatctgca 600 accctgctga ccatgtgtgc aagtcagggc ctgcgtgccg gtatggtagc gggggttatc 660 gttaaccgca cccagcaaga gatcccgaat gctgagacga tgaaacaaac cgaaagccat 720 gcggtgaaaa tcgtggtgga agcggcgcgt cgtctgctga aataa 765 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 16 catatgatta cttatcacga cg 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 17 ctcgaggggc aagccgaagg t 21 <210> 18 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF <400> 18 atgaactccg actccgagtg tcctctgtcc cacgacggtt actgtctgca cgacggtgtt 60 tgtatgtaca tcgaggccct ggacaagtac gcctgtaact gtgttgttgg ttacatcggt 120 gagagatgtc agtacagaga cctgaagtgg tgggagctgc gttga 165 <210> 19 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppGRN <400> 19 ggctccagct tcctgagccc tgaacaccag agagtccagc agagaaagga gtcgaagaag 60 ccaccagcca agctgcagcc ccgagctcta gcaggctggc tccgcccgga agatggaggt 120 caagcagaag gggcagagga tgaactggaa gtccggttca acgccccctt tgatgttgga 180 atcaagctgt caggggttca gtaccagcag cacagccagg ccctggggaa gtttcttcag 240 gacatcctct gggaagaggc caaagaggcc ccagccgaca agtga 285 <210> 20 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL-2 <400> 20 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt gataa 405 <210> 21 <211> 603 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AID <400> 21 atggacagcc tcttgatgaa ccggaggaag tttctttacc aattcaaaaa tgtccgctgg 60 gctaagggtc ggcgtgagac ctacctgtgc tacgtagtga agaggcgtga cagtgctaca 120 tccttttcac tggactttgg ttatcttcgc aataagaacg gctgccacgt ggaattgctc 180 ttcctccgct acatctcgga ctgggaccta gaccctggcc gctgctaccg cgtcacctgg 240 ttcacctcct ggagcccctg ctacgactgt gcccgacatg tggccgactt tctgcgaggg 300 aaccccaacc tcagtctgag gatcttcacc gcgcgcctct acttctgtga ggaccgcaag 360 gctgagcccg aggggctgcg gcggctgcac cgcgccgggg tgcaaatagc catcatgacc 420 ttcaaagatt atttttactg ctggaatact tttgtagaaa accatgaaag aactttcaaa 480 gcctgggaag ggctgcatga aaattcagtt cgtctctcca gacagcttcg gcgcatcctt 540 ttgcccctgt atgaggttga tgacttacga gacgcatttc gtactttggg acttttgtta 600 tga 603 <210> 22 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAD448-585 <400> 22 cgccacgttg atgtttttaa actatggctg atgtggaggg caaaggggac taccgggttt 60 gaagcgcatg ttgataaatg tttggagttg gcagagtatt tatacaacat cataaaaaac 120 cgagaaggat atgagatggt gtttgatggg aagcctcagc acacaaatgt ctgcttctgg 180 tacattcctc caagcttgcg tactctggaa gacaatgaag agagaatgag tcgcctctcg 240 aaggtggctc cagtgattaa agccagaatg atggagtatg gaaccacaat ggtcagctac 300 caacccttgg gagacaaggt caatttcttc cgcatggtca tctcaaaccc agcggcaact 360 caccaagaca ttgacttcct gattgaagaa atagaacgcc ttggacaaga tttataa 417 <210> 23 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADI <400> 23 atgtctgtat ttgacagtaa atttaaagga attcacgttt attcagaaat tggtgaatta 60 gaatcagttc tagttcacga accaggacgc gaaattgact atattacacc agctagacta 120 gatgaattat tattctcagc tatcttagaa agccacgatg ctagaaaaga acacaaacaa 180 ttcgtagcag aattaaaagc aaacgacatc aatgttgttg aattaattga tttagttgct 240 gaaacatatg atttagcatc acaagaagct aaagacaaat taatcgaaga atttttagaa 300 gactcagaac cagttctatc agaagaacac aaagtagttg taagaaactt cttaaaagct 360 aaaaaaacat caagagaatt agtagaaatc atgatggcag ggatcacaaa atacgattta 420 ggtatcgaag cagatcacga attaatcgtt gacccaatgc caaacctata cttcacacgt 480 gacccatttg catcagtagg taatggtgta acaatccact acatgcgtta caaagttaga 540 caacgtgaaa cattattctc aagatttgta ttctcaaatc accctaaact aattaacact 600 ccatgatact acgacccttc actaaaatta tcaatcgaag gtggggacgt atttatctac 660 aacaatgaca cattagtagt tggtgtttct gaaagaactg acttacaaac agttacttta 720 ttagctaaaa acattgttgc taataaagaa tgtgaattca aacgtattgt tgcaattaac 780 gttccaaaat gaacaaactt aatgcactta gacacatgac taacaatgtt agacaaggac 840 aaattcctat actcaccaat cgctaatgac gtatttaaat tctgagatta tgacttagta 900 aacggtggag cagaaccaca accagttgaa aacggattac ctctagaagg attattacaa 960 tcaatcatta acaaaaaacc agttttaatt cctatcgcag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020 gaaatcgaaa gagaaacaca cttcgatggt acaaactact tagcaattag accaggtgtt 1080 gtaattggtt actcacgtaa cgaaaaaaca aacgctgctc tagaagctgc aggcattaaa 1140 gttcttccat tccacggtaa ccaattatca ttaggtatgg gtaacgctcg ttgtatgtca 1200 atgcctttat cacgtaaaga tgttaagtga tag 1233 <210> 24 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFTN-L <400> 24 atgagctccc agattcgtca gaattattcc accgacgtgg aggcagccgt caacagcctg 60 gtcaatttgt acctgcaggc ctcctacacc tacctctctc tgggcttcta tttcgaccgc 120 gatgatgtgg ctctggaagg cgtgagccac ttcttccgcg aattggccga ggagaagcgc 180 gagggctacg agcgtctcct gaagatgcaa aaccagcgtg gcggccgcgc tctcttccag 240 gacatcaaga agccagctga agatgagtgg ggtaaaaccc cagacgccat gaaagctgcc 300 atggccctgg agaaaaagct gaaccaggcc cttttggatc ttcatgccct gggttctgcc 360 cgcacggacc cccatctctg tgacttcctg gagactcact tcctagatga ggaagtgaag 420 cttatcaaga agatgggtga ccacctgacc aacctccaca ggctgggtgg cccggaggct 480 gggctgggcg agtatctctt cgaaaggctc actctcaagc acgactaa 528 <210> 25 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-CSF <400> 25 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag 120 ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc 180 ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc 240 ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt 300 cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag 360 atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc 420 gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc 480 ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga 525 <210> 26 <211> 951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nacht <400> 26 actgtggtgt tccagggggc ggcagggatt gggaaaacaa tcctggcccg gaagatgatg 60 ttggactggg cgtcggggac actctaccaa gacaggtttg actatctgtt ctatatccac 120 tgtcgggagg tgagccttgt gacacagagg agcctggggg acctgatcat gagctgctgc 180 cccgacccaa acccacccat ccacaagatc gtgagaaaac cctccagaat cctcttcctc 240 atggacggct tcgatgagct gcaaggtgcc tttgacgagc acataggacc gctctgcact 300 gactggcata aggccgagcg gggagacatt ctcctgagca gcctcatcag aaagaagctg 360 cttcccgagg cctctctgct catcaccacg agacctgtgg ccctggagaa actgcagcac 420 ttgctggacc atcctcggca tgtggagatc ctgggtttct ccgaggccaa aaggaaagag 480 tacttcttca agtacttctc tgatgaggcc caagccaggg cagccttcag tctgattcag 540 gagaacgagg tcctcttcac catgtgcttc atccccctgg tctgctggat cgtgtgcact 600 ggactgaaac agcagatgga gagtggcaag agccttgccc agacatccaa gaccaccacc 660 gcggtgtacg tcttcttcct ttccagtttg ctgcagcccc ggggagggag ccaggagcac 720 ggcctctgcg cccacctctg ggggctctgc tctttggctg cagatggaat ctggaaccag 780 aaaatcctgt ttgaggagtc cgacctcagg aatcatggac tgcagaaggc ggatgtgtct 840 gctttcctga ggatgaacct gttccaaaag gaagtggact gcgagaagtt ctacagcttc 900 atccacatga ctttccagga gttctttgcc gccatgtact acctgctgtg a 951 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 27 catatgaact ctgactccga atgc 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 28 aagcttttaa cgcagttccc acca 24 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 29 catatgggct ccagcttcct g 21 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 30 aagctttcac ttgtcggct 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 31 catatggcac ctacttcaag t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 32 aagcttttat caagtcagtg t 21 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 33 catatggaca gcctcttgat gaac 24 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 34 aagctttcat aacaaaagtc cca 23 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense pri <400> 35 catatgcgcc acgttgatgt 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 36 atcgatttat aaatcttgtc c 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 37 catatgtctg tatttgacag t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 38 aagcttctat cacttaacat c 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 39 catatgagct cccagattcg t 21 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 40 aagcttttag tcgtgcttga gagt 24 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 41 catatgactc cactcggacc tg 22 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 42 aagctttcat ggctgtgcaa g 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 43 catatgactg tggtgttcca g 21 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 44 aagctttcac agcaggtagt ac 22 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 45 ctcgagaact ctgactccga atgc 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 46 aagcttttaa cgcagttccc acca 24 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 47 ctcgagggct ccagcttcct g 21 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 48 aagctttcac ttgtcggct 19 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 49 ctcgaggcac ctacttcaag t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 50 aagcttttat caagtcagtg t 21 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 51 ctcgaggaca gcctcttgat gaac 24 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 52 aagctttcat aacaaaagtc cca 23 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 53 ctcgagcgcc acgttgatgt 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 54 atcgatttat aaatcttgtc c 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 55 ctcgagtctg tatttgacag t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 56 aagcttctat cacttaacat c 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 57 ctcgagagct cccagattcg t 21 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 58 aagcttttag tcgtgcttga gagt 24 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 59 ctcgagactc cactcggacc tg 22 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 60 aagctttcat ggctgtgcaa g 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 61 ctcgagactg tggtgttcca g 21 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 62 aagctttcac agcaggtagt ac 22 <210> 63 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 63 catatgatgc accatcacca tcaccatatt acttatcacg acgc 44 <210> 64 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 64 ctcgaggatg acgatgacaa atctgtattt gacagt 36

Claims (14)

1) 융합파트너(fusion partner)로 YrhB 유전자 및 외래단백질 유전자를 포함한 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계
를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 YrhB 유전자는 대장균 유래인 재조합 단백질의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 YrhB 유전자는 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 외래단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 재조합 단백질의 제조방법.
제 4 항에 있어서,
상기 외래단백질은 인간 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인간 프리프로그렐린(human prepro-ghrelin, ppGRN), 인간 인터류킨 2(human interleukin-2, hIL-2), 인간 활성 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, AID), 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, ADI), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, hFTN-L), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 인간 차가운 자가면역 질환 Nacht 도메인(cold autoinflammatory syndrome1 (NALP3) Nacht domain, Nacht) 및 글루탐산 탈카르복시화 효소의 448 내지 558 아미노산(glutamate decarboxylase448 -585, GAD448 -585)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 재조합 단백질의 제조방법.
융합파트너로 YrhB 유전자 및 외래단백질 유전자를 포함하는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 6 항에 있어서,
융합파트너로 YrhB 유전자와 외래단백질 유전자가 연결되어 포함되는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 YrhB 유전자는 대장균 유래인 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 YrhB 유전자는 서열번호 1로 표시되는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 외래단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 외래단백질은 인간 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인간 프리프로그렐린(human prepro-ghrelin, ppGRN), 인간 인터류킨 2(human interleukin-2, hIL-2), 인간 활성 시티딘 디아미네이즈(human activation induced cytidine deaminase, AID), 아르기닌 디이미나아제(Arginine deiminase, ADI), 인간 페리틴 가벼운 사슬(human ferritin light chain, hFTN-L), 인간 과립구 집락-자극인자(human granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 인간 차가운 자가면역 질환 Nacht 도메인(cold autoinflammatory syndrome1 (NALP3) Nacht domain, Nacht) 및 글루탐산 탈카르복시화 효소의 448 내지 558 아미노산(glutamate decarboxylase448-585, GAD448 -585)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 발현벡터는 도 1(B)의 개열지도로 표시되는 재조합 단백질 생산용 발현벡터.
제 6 항의 재조합 단백질 생산용 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체.
제 1 항의 방법에 의해 제조된 재조합 융합 단백질.
KR1020120070151A 2012-06-28 2012-06-28 ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 KR20140002221A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120070151A KR20140002221A (ko) 2012-06-28 2012-06-28 ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120070151A KR20140002221A (ko) 2012-06-28 2012-06-28 ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140002221A true KR20140002221A (ko) 2014-01-08

Family

ID=50139324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120070151A KR20140002221A (ko) 2012-06-28 2012-06-28 ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20140002221A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20160128362A (ko) 대장균에서 재조합 ｃｒｍ197의 향상된 생산
EP3210997A1 (en) Agents and methods for the expression and secretion of peptides and proteins
WO2021128766A1 (zh) 一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法
JP2004194588A (ja) 新規なニトリルヒドラターゼ
US10308925B2 (en) Methionine lyase, encoding gene and biosynthetic method thereof
CN113481226B (zh) 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用
EP3214176B1 (en) Expression system of psicose epimerase and production of psicose using same
KR20120040740A (ko) 만노오스 프로모터를 포함하는 벡터 및 만노오스 프로모터
KR20080039879A (ko) Pdi를 융합파트너로 이용한 수용성 및 활성형 재조합단백질의 제조방법
KR101373297B1 (ko) 대장균 포스포글리세르산 인산화효소 유전자를 융합 파트너로서 포함하는 발현벡터
CN111978407B (zh) 嗜热菌来源的赖氨酸脱羧酶的异源表达方法及其应用
JP4146095B2 (ja) 耐熱性グルコキナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法
JP3822006B2 (ja) シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法
KR20140002221A (ko) ＹｒｈＢ를 융합 파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법
KR101658081B1 (ko) CysQ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법
RU2593172C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА
RU2803949C1 (ru) Способ экспрессии белка crm197
JP2023139192A (ja) Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法
JP2003111590A (ja) 改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体、グルカンの製造法
CN113201552B (zh) 一种分子伴侣质粒系统及其应用
KR100890183B1 (ko) 말산탈수소효소를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의제조방법
US20240240210A9 (en) Recombinant microorganism and a method for itaconic acid production
EP4079845A1 (en) Method for enhancing water solubility of target protein by whep domain fusion
JP3632246B2 (ja) 大腸菌のフラビン還元酵素
KR20090025479A (ko) ＳｌｙＤ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application