CN106456769A

CN106456769A - 重组crm197在大肠杆菌中的增强产生

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Publication number: CN106456769A
Application number: CN201580011743.1A
Authority: CN
Inventors: C.R.布拉特纳; D.A.弗里施; R.E.诺维; T.M.亨克; E.A.斯蒂芬; F.R.布拉特纳; H.崔; G.波斯费; C.F.兰德里
Original assignee: This Franch Et Sav Genome LLC
Current assignee: This Franch Et Sav Genome LLC; Scarab Genomics LLC
Priority date: 2014-03-03
Filing date: 2015-03-02
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-03-02
Also published as: EP3113800A4; JP2019058195A; EP3113800A1; AU2015225439B2; CN106456769B; US20170073379A1; JP6636661B2; CA2940316C; CA2940316A1; KR20160128362A; KR102315246B1; WO2015134402A1; JP2017508454A; JP6473460B2; AU2021201686A1; AU2015225439A1; US10479820B2

Abstract

本发明提供包含编码重组CRM197蛋白的表达载体的简化基因组或天然K12菌株大肠杆菌细菌和其在CRM197产生中的用途。所述CRM197蛋白可与将所表达的CRM197蛋白引导至大肠杆菌宿主的周质的信号序列融合。

Description

重组CRM197在大肠杆菌中的增强产生

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年3月3日提交的美国临时申请No.61/947,234的权益，所述临时申请的内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明是针对重组CRM197在大肠杆菌中、优选地在简化基因组大肠杆菌K12菌株中的产生。

背景技术

白喉毒素(DTx)是以535个氨基酸的单一多肽链形式合成的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的双组分外毒素，其含有通过二硫桥连接在一起的A(活性)结构域和B(结合)结构域。所述毒素结合于细胞受体(HB-EGF受体)并通过内吞作用进入细胞，其中所述A结构域是通过蛋白水解裂解从所述B结构域释放的。所述A结构域然后通过由所述B结构域产生的孔离开内体并进入细胞质，它在所述细胞质中抑制蛋白质合成，最终导致细胞死亡。

CRM197是含有用谷氨酸置换甘氨酸(G52E)的单一氨基酸置换的Dtx的突变形式，所述氨基酸置换使得蛋白质无酶活性和无毒。已经发现CRM197是针对荚膜细菌的结合疫苗的理想载体。结合疫苗包含共价连接到免疫原性不佳和T细胞非依赖性荚膜多糖的CRM197，因此产生具高度免疫原性的结合抗原并导致针对所述抗原的长期免疫性。

含有CRM197作为载体蛋白的疫苗已经成功地用于使数百万儿童免疫并包括(针对脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的血清群A-C-W135-Y的四价结合疫苗)、和(针对脑膜炎奈瑟菌的血清型C)、和(针对B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)Hib)，和多价肺炎球菌结合物Prevnar^TM。

相比于破伤风和白喉毒素，CRM197不需要化学解毒并且因此可以被纯化至均质并直接用于结合。CRM197目前由白喉棒状杆菌C7(其中它由β噬菌体的多个溶素原表达)的发酵或在荧光假单胞菌(Pseudomonas flurorescens)中由质粒系统制造。CRM197(它是在白喉棒状杆菌发酵期间释放到培养基中)的产率较低，范围从数十mg/L至约200mg/L，并且需要2级生物安全设施，从而导致每毫克CRM197的零售价格为约$500美元。疫苗单剂量通常含有约10至60μg的CRM197并且每年使用超过1.5亿剂。目前对于结合CRM197疫苗的需求已经超过了供应并且已导致在发展中国家开展疫苗接种计划的延迟，这将数百万儿童的健康置于危险之中。

此外，基于CRM197与在一些癌症中高度表达的肝素结合表皮生长因子(pro-HB-EGF)的可溶形式结合的能力，最近已报道了CRM197在治疗癌症如卵巢癌中的可能治疗用途。这种治疗潜力的研究和开发将更多菌株用于目前生产方法中。

造成CRM197的高价格和供应短缺的一个最大因素是历史上在生产主力大肠杆菌中不能产生大量的CRM197。虽然CRM197的不溶形式可以在大肠杆菌中发酵至相对中等产率，但不溶性产物中仅一部分可以转化成可溶形式(Stefan等，2011)。在大肠杆菌中产生大量的可溶性CRM197已经变得更具挑战性。可靠且廉价地生产大量的CRM197以用于治疗用途的方法将构成本领域中的显著进步。

发明内容

本发明涉及在大肠杆菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法。在若干实施方案中，所述方法包括在适合所述重组CRM197蛋白表达的条件下温育包含表达载体的简化基因组大肠杆菌，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的编码CRM197蛋白的核酸序列。相比于在野生型大肠杆菌菌株如BL21中的产生，在根据本发明的简化基因组大肠杆菌宿主细胞中实现CRM197产率的显著增加。编码CRM197蛋白的核酸序列优选进行密码子优化以在大肠杆菌宿主细胞中表达。在一个优选的实施方案中，天然亲本大肠杆菌菌株是K12菌株。在另一个实施方案中，所述方法包括在适合所述重组CRM197蛋白表达的条件下温育包含表达载体的天然K12菌株大肠杆菌，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的编码CRM197蛋白的核酸序列。

在一个方面，将编码CRM197蛋白的核酸序列与编码引导所述CRM197蛋白转移至大肠杆菌宿主细胞(优选地简化基因组大肠杆菌宿主细胞)的周质的信号序列的核酸序列融合，由此达到约1克/升至约10克/升的可溶性CRM197的产率。根据本发明的这个方面，所述大肠杆菌宿主(优选地简化基因组大肠杆菌宿主)包含包括如下核酸序列的表达载体，所述核酸序列包含编码具有能够引导CRM197运输至大肠杆菌周质的氨基酸序列的多肽的5′信号序列部分和编码缺乏其天然信号序列的CRM197蛋白的3′CRM197部分。优选地，CRM197的表达是可诱导的并且所述方法包括如下步骤：(a)使大肠杆菌(优选地简化基因组大肠杆菌)生长和(b)诱导CRM197的表达。优选地，所述方法是在发酵罐中进行的。

在相关方面，用包含可操作地连接至蛋白质编码序列的可诱导启动子(例如lac衍生启动子)的表达载体转化(例如简化基因组)大肠杆菌宿主细胞并且通过添加合适量的诱导剂(例如异丙基B-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG))来诱导CRM197的表达。优选地，在摇瓶条件下，在约0.1至约1.5(更优选地约0.2至约0.9.甚至更优选地约0.3至约0.6)的600nm(在所述波长下1OD单位对应于约0.8×10⁹个细胞/毫升)下的光密度(OD)下发生诱导。在发酵条件下，优选地在约100至400、更优选地约150至300、最优选地200至275(例如230和250)的OD600下发生诱导。在其他相关方面，培养物在生长和/或诱导期间的pH是约6.5至约7.5，生长和/或诱导温度是约20℃至约30℃(优选地约25℃)并且生长培养基不含血清、酵母提取物和动物源副产品。在特别优选的实施方案中，使(例如简化基因组)大肠杆菌生长包括在37℃下进行相对短的初始温育(例如1至3小时)，接着在诱导之前和之后在20℃至30℃下(优选地在约25℃下)生长，或者包括在诱导之前和之后在20℃至30℃下(优选地在约25℃下)连续生长。

在相关实施方案中，所得可溶性CRM197的产率是至少约0.5g/L、至少约.7g/L、至少约1.0g/L、至少约1.3g/L、至少约1.5g/L、至少约1.7g/L、至少约2.0g/L、至少约2.3g/L、至少约2.5g/L、至少约2.7g/L、至少约3.0g/L、至少约3.5g/L、至少约3.7g/L、至少约4.0g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6.0g/L、至少约7.0g/L、至少约8.0g/L、至少约9.0g/L或至少约10.0g/L。在其他实施方案中，所得可溶性CRM197的产率是约1.0g/L至约10.0g/L、约1.0g/L至约9.0g/L、约1.0g/L至约8.0g/L、约1.0g/L至约7.0g/L、约1.0g/L至约6.0g/L、约1.0g/L至约5.0g/L、约1.0g/L至约4.0g/L、约1.0g/L至约3.0g/L或约1.0g/L至约2.0g/L。在其他实施方案中，所得可溶性CRM197的产率是约2.0g/L至约10.0g/L、约2.0g/L至约9.0g/L、约2.0g/L至约8.0g/L、约2.0g/L至约7.0g/L、约2.0g/L至约6.0g/L、约2.0g/L至约5.0g/L、约2.0g/L至约4.0g/L、约2.0g/L至约4.0g/L或约2.0g/L至约3.0g/L。在其他实施方案中，所得可溶性CRM197的产率是约3.0g/L至约10.0g/L、约3.0g/L至约9.0g/L、约3.0g/L至约8.0g/L、约3.0g/L至约7.0g/L、约3.0g/L至约6.0g/L、约3.0g/L至约5.0g/L、或约3.0g/L至约4.0g/L。

在一个相关方面，所述5′信号序列部分编码信号识别颗粒(SRP)依赖性信号序列如DsbA、TolB和TorT分泌信号，Sec依赖性信号序列如OmpF、OmpT、OmpA、PhoA、MalE、LamB、LivK和PelB分泌信号，或双精氨酸转运(TAT)信号序列如TorA和Sufl分泌信号。在一些实施方案中，所述5′信号序列部分编码Sec依赖性信号序列，优选地OmpA或OmpF分泌信号。在一个特别优选的实施方案中，所述5′信号序列部分编码ompF分泌信号。

在其他优选的实施方案中，所述5′信号序列部分编码选自MglB、MalE、OppA、RbsB、Agp、FkpA、YtfQ、HdeA、HdeB、OmpC和GlnH分泌信号的信号序列。在一个特别优选的实施方案中，所述5′信号序列部分编码YtfQ分泌信号。

在另一个相关方面，所述大肠杆菌宿主细胞另外包含一个或多个核酸，所述核酸包含可操作地连接至表达控制序列的编码用于辅助CRM197在周质中的转运和/或折叠的一种或多种蛋白的序列。所述包含编码用于辅助CRM197在周质中的转运和/或折叠的一种或多种蛋白的序列的核酸可能是包含编码CRM197的核苷酸序列的相同表达载体的一部分或者可能位于不同的表达载体上。用于辅助CRM197的转运和/或折叠的蛋白质包括(但不限于)伴侣蛋白，例如Skp、DnaK、DnaJ、CaflM和CaflA；二硫键形成蛋白，例如DsbA、DsbB、DsbC和DsbD；肽基-脯氨酰基顺反异构酶，例如PpiA、PpiD、FkpA和SurA；可溶性配体蛋白，例如MBP、GST和硫氧还蛋白；分泌途径蛋白，例如YebF、MalE、HlyA、Hirudin、OmpF和Spy；蛋白酶抑制剂，例如YccA；和减轻输出饱和的蛋白质，例如PspA。

在另一个实施方案中，编码CRM197蛋白的核苷酸序列不与信号序列融合，由此达到约2克/升至约25克/升的不溶性CRM197的产率。根据本发明的这个方面，所述(例如简化基因组)大肠杆菌宿主包含包括编码缺乏其天然信号序列的CRM197蛋白的核酸序列的表达载体，由此所述CRM197蛋白在所述大肠杆菌宿主的细胞质中表达。

在若干方面，本发明涉及在(例如简化基因组)大肠杆菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法，所述方法包括：将编码与引导CRM197蛋白转移至周质的信号序列融合的CRM197蛋白的核苷酸序列连接到表达载体中；用所述表达载体转化所述大肠杆菌宿主细胞；和在适合重组CRM197蛋白表达的培养基中培养转化的大肠杆菌宿主细胞；其中可溶性CRM197的产率是约1至10g/L，优选地约2至10g/L，并且还包括从培养物收集大肠杆菌细胞并通过机械方法在不存在去垢剂的情况下裂解所收集的细胞。任选地，所述方法还包括获得所得裂解物的可溶性部分(例如通过离心以分离可溶性和不溶性部分)并对所述可溶性部分(包含由大肠杆菌宿主产生的可溶性CRM197)进行一个或多个纯化步骤。在一个实施方案中，对可溶性CRM197进行疏水相互作用色谱法和/或阴离子交换色谱法。在优选的实施方案中，所述大肠杆菌宿主细胞是简化基因组大肠杆菌宿主细胞。

在其他方面，本发明涉及包含表达载体的(例如简化基因组)大肠杆菌宿主细胞，所述表达载体包含包括如下核酸序列的核酸序列，所述核酸序列包含编码具有能够引导CRM197运输至大肠杆菌周质的氨基酸序列的多肽的5′信号序列部分和可操作地连接至表达控制序列的编码缺乏其天然信号序列的CRM197蛋白的3′CRM197部分。在优选的实施方案中，所述大肠杆菌宿主细胞是简化基因组大肠杆菌宿主细胞，其至少缺乏从简化基因组大肠杆菌菌株MDS42缺失的基因或至少缺乏从简化基因组大肠杆菌菌株MDS69缺失的基因。

在下文中更详细地描述本发明的这些和其他实施方案。

附图说明

图1描绘了导致在旨在研究CRM197的不溶性形式的实验中使用的CRM197序列中的发夹结构的释放的DNA序列变化。优化序列(B)产生更高的最小能量(对于优化序列为-1.68，相比于原始序列的-4.27)并松弛二级结构，从而相对于原始序列增强了起始位点(ATG)和核糖体结合位点(RBS)的识别。

图2描绘了CRM197在简化基因组大肠杆菌菌株MDS42recA(具有recA缺失的MDS42菌株)中的胞质表达。使摇瓶培养物在基本培养基中生长至光密度(OD)为0.5并且然后用所指示的0或250μM IPTG诱导。电泳是利用4-12％梯度丙烯酰胺Bis-Tris凝胶，接着使用GelCode染色试剂进行蛋白质染色。每个泳道加载0.04OD的材料。M＝标记泳道；T＝总细胞蛋白；S＝可溶性部分；I＝不溶性部分。大量的胞质CRM197存在于不溶性部分(箭头)中，从而验证了构建体和菌株在不溶性CRM197产生中的稳健性。

图3描绘了关于CRM197在简化基因组菌株MDS42recA中的周质递送所研究的信号序列。上图(A)是与密码子优化的CRM197序列的5′端融合的异源信号序列的图示。左下图(B)示出代表三个大肠杆菌分泌途径的信号序列。右下图(C)示出与CRM197共表达以测试其辅助CRM197在周质中的转运和/或折叠的能力的蛋白。

图4描绘了使用OmpA和OmpF信号序列在MDS42recA中的CRM197表达的蛋白质凝胶分析。在25℃下使用Aaa1-5YccA(OmpA+CRM197+/-YccA)或Aaa1-5YccA(OmpF+CRM197+/-YccA)作为伴侣蛋白进行早期(图A和C；在0.01的OD₆₀₀下添加诱导剂)和晚期(图B和D；在约0.4的OD₆₀₀下添加诱导剂)诱导。箭头指示CRM197在每个诱导剂系列中的最高水平。注意到在CRM197正下方迁移的内源大肠杆菌蛋白。凝胶方法如关于图2所述。借助于周质化缓冲液(Periplasting Buffer)(Epicentre，Madison，WI)制备周质样品。通过在1.5ml Eppendorf管中在7,500x g下离心10分钟来收集2OD样品。除去上清液并将细胞沉淀轻轻地重新悬浮在50μl周质化缓冲液(200mM Tris-HCl[pH 7.5]、20％蔗糖、1mM EDTA和30U/μl Ready-Lyse溶菌酶)中。在室温下5分钟后，将50μl的冰冷水快速加入到重新悬浮的沉淀中。将混合物在冰上温育5分钟，然后通过在4,000x g下离心15分钟而从原生质球分馏周质部分。制备代表周质部分的上清液用于SDS-PAGE分析。加载相当于0.12OD单位的量。

图5比较了使用葡萄糖或甘油作为碳源对MDS42recA宿主细胞中的CRM197表达的影响。图A描绘了总细胞蛋白(每个泳道加载0.04OD)。图A描绘了分离的周质蛋白(每个泳道加载0.12OD)。注意到在补充有葡萄糖的培养基中产生较高水平的CRM197。标记为“仅42”的泳道是利用不具有表达载体(即不表达CRM197)的MDS42recA的对照泳道。

图6描绘了在八个携带编码与ompA信号序列融合的CRM197的表达载体的简化基因组大肠杆菌菌株中的CRM197表达的蛋白质凝胶分析，所述菌株包括四个构建在MDS42平台上的菌株和四个构建在MDS69平台上的菌株。所测试的MDS42菌株是：(i)MDS42，(ii)MDS42recA，(iii)MDS42metab(包含rph和ilvG移码突变的校正以及iclR和arpA基因的缺失的MDS42菌株)和(iv)MDS42 Blon metab(MDS42metab还包含Lon蛋白酶(b0439)启动子区域的修饰以模拟B菌株大肠杆菌的lon启动子区域的序列，其中IS插入将原始大肠杆菌lon启动子的-35区域与-10区域隔开)。所测试的MDS69菌株是：(i)MDS69metab(包含rph和ilvG移码突变的校正以及iclR和arpA基因的缺失的MDS69菌株)，(ii)MDS69 Blon metab(MDS69metab还包含上述Lon蛋白酶启动子修饰)，(iii)MDS69 lpp metab(MDS69 metab还包含lpp基因(MG1655的核苷酸1755260-1755687)的缺失)和(iv)MDS69 Blon、lpp metab。图A和图C描绘了在所示IPTG浓度下诱导后分离的总细胞蛋白。图B和图D指示平行进行的周质分离。凝胶方法如图2中所述。

图7描绘了MDS42和MDS69蛋白酶菌株中的CRM197表达的蛋白质凝胶分析。图A和图C描绘在所示IPTG浓度下诱导后分离的总细胞蛋白。图B和图D描绘平行进行的周质分离。凝胶方法如图2中所述。

图8描绘了携带编码与OmpA信号序列融合的CRM197的表达载体的简化基因组大肠杆菌菌株MDS42metab在10升规模的限定基本培养基中进行补料分批发酵后的发酵样品的蛋白质凝胶和Westem印迹分析。图A：在所示发酵OD下收集总细胞蛋白(TCP)和周质(Peri)制剂。在OD＝200下添加IPTG。图B：将利用抗白喉毒素抗体的Westem印迹分析用于明确鉴定CRM197。注意到在诱导之前CRM197不表达。SFC＝摇瓶对照。对于TCP和Peri样品，每个泳道分别加载0.04和0.12OD。凝胶方法如图2中所述。

图9描绘了(i)使用常规去垢剂基缓冲液分离的总细胞蛋白(TCP)的蛋白质凝胶(图A，和图B的左侧三个泳道)和(ii)OmpA-CRM197在MDS42recA菌株中表达后，周质蛋白制剂的蛋白质凝胶(图B的右侧三个泳道)。图A：将总细胞蛋白样品(左侧)在高速(21k g)下离心10分钟并且然后再次分析(右侧)。在可溶性部分中不存在CRM197。图B：总细胞蛋白(TCP)和周质部分的高速离心显示，CRM197不溶于暴露于去垢剂的细胞质部分中(左侧)并且可溶于不暴露于去垢剂的周质部分(右侧)中。凝胶方法如图2中所述。箭头指示TCP中的CRM197不出现在可溶性部分中。

图10描绘了去垢剂和机械裂解和CRM197溶解性的蛋白质凝胶。对携带编码与CRM197融合的ompA的表达载体的MDS42recA细胞进行如关于图8所述的补料分批发酵。使用(A)去垢剂((Novagen)，破坏细胞膜的非离子型去垢剂的专有混合物)或(B)在增溶剂存在下的机械(超声处理)裂解使细胞裂解。注意到在不存在去垢剂的情况下裂解导致高水平的可溶性CRM197。GSH：GSSG＝谷胱甘肽的还原/氧化比率；M＝标记；Sol＝可溶性部分；TCP＝总细胞蛋白。诱导剂(IPTG)＝35μM。

图11是描绘携带编码OmpA-CRM197的表达载体的MDS69metab宿主细胞的发酵的图。发现CRM197在补料分批发酵中增加直至30小时时间点，其中达到1.95g/L的最大产率。

图12描绘了来自图11的发酵的蛋白质凝胶，其显示在发酵样品中存在大量的可溶性CRM197。在具有葡萄糖作为碳源的基本培养基中对菌株MDS69metab进行补料分批发酵。通过超声处理将添加诱导剂(22小时)之前或者在28或29小时收集的样品均质化并且分离不同的细胞部分。发现CRM197只在可溶性(Sol)部分中。TCP＝总细胞蛋白部分；Insol＝不溶性部分。

图13描绘了CRM197的两次柱纯化的结果。图A：对图12中所示的50OD的28小时发酵样品进行微流化仪(MF)均质化。分离可溶性和不溶性(IS)部分并且将可溶性物质(25OD当量)加载在苯基琼脂糖柱上。标记为“可溶性”的三个泳道分别是0.1、0.07和0.04OD的预加载可溶性样品。用10mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)洗脱含CRM197的物质。收集五个连续的2.5ml样品(从左到右)并且将圆圈指示的部分汇集。注意到少量的未加工CRM197(箭头)从主要洗脱样品纯化并在仅使用蒸馏水洗脱后存在。图B：将来自图A的汇集样品加载在DEAE琼脂糖柱上并使用不同盐浓度(0.1M NaCl，接着是1M NaCl，最后是1.5M NaCl)洗脱。在1M NaCl下洗脱最高纯度的CRM197。示出抗白喉毒素抗体(1：1000稀释)Western印迹分析以及平行操作的蛋白质染色凝胶。F，流过；W，柱洗涤；MF＝微流体化后的总匀浆液；IS＝微流体化匀浆液离心后的不溶性部分；S＝微流体化匀浆液离心后的可溶性部分。

图14是在MDS42recA相比于野生型B菌株BLR(DE3)中的CRM197表达的蛋白质凝胶分析。用编码将蛋白质引导至周质的ompA-CRM197融合体的表达载体转化细胞并在25℃下在摇瓶中生长19小时。通过添加所示浓度的IPTG在OD＝0.3(晚期阶段)下诱导CRM197的表达。分离并分析周质蛋白。注意到在CRM197正下方迁移的内源大肠杆菌蛋白。

图15是在MDS69metab和MDS69metab低突变率宿主中从pSX2-OmpA CRM197和pSX2-OmpF CRM197表达产生的周质部分的蛋白质凝胶分析。在相同宿主中并使用相同诱导条件，OmpF-CRM197克隆相比于ompA-CRM197克隆(泳道8-9)在MDS69meta低突变宿主(泳道5-6)中产生更多可溶性周质CRM197。泳道11-15代表在细胞收集后的培养基上清液样品并且证实在这些诱导和生长条件下向培养基中释放很少CRM197至不释放CRM197。

图16A-16C描绘了CRM197DNA和氨基酸序列。图16A描绘了被优化以用引导成熟CRM197蛋白向周质空间的表达和加工的信号序列表达的CRM197 ORF的DNA序列。图16B描绘了被优化以在细胞质中表达的CRM197 ORF的DNA序列。图16C描绘了在信号序列加工(图16A)或N端甲硫氨酸除去(图16B)后产生的成熟CRM197蛋白的氨基酸序列。

图17描绘了关于CRM197在简化基因组菌株MDS69metab中的周质递送所研究的信号序列，根据其在大肠杆菌K和/或B菌株中的相对丰度分类。

图18描绘了在简化基因组大肠杆菌菌株MDS69metab中在OD约0.3下添加的25μM诱导剂(IPTG)下利用以下信号序列的μg/OD(上图)和μg/ml周质CRM197(Caliper分析)：OmpF、MalE、HdeA、OppA、HdeB和GlnH(诱导A)以及OmpF、MglB、Agp、OmpC、RbsB、FkpA和YtfQ(诱导B)。

图19描绘了在简化基因组大肠杆菌菌株MDS69metab中在OD约0.3下添加的35μM诱导剂(IPTG)下利用以下信号序列的μg/OD(上图)和μg/ml周质CRM197(Caliper分析)：OmpF、MalE、HdeA、OppA、HdeB和GlnH(诱导A)以及OmpF、MglB、Agp、OmpC、RbsB、FkpA和YtfQ(诱导B)。

图20描绘了在简化基因组大肠杆菌菌株MDS69metab中在OD约0.3下添加的50μM诱导剂(IPTG)下利用以下信号序列的μg/OD(上图)和μg/ml周质CRM197(Caliper分析)：OmpF、MalE、HdeA、OppA、HdeB和GlnH(诱导A)以及OmpF、MglB、Agp、OmpC、RbsB、FkpA和YtfQ(诱导B)。

图21比较了在简化基因组大肠杆菌菌株MDS69metab中在OD约0.3下添加的0、25、35和50μM诱导剂下利用OmpF信号序列和在OD约0.3下添加的0、25、35、50、75、100、150和250μM诱导剂下利用YtfQ信号序列获得的μg/OD(上图)和μg/ml周质CRM197(Caliper分析)。结果是两组实验的平均值。

图22是比较了在OD＝0.3(晚期阶段)下添加的50μM(OmpF)或50、75、100、150、250μM(YtfQ)的诱导剂浓度下利用OmpF或YtfQ信号序列在MDS69metab的周质(P)和培养基(M)中的CRM197产率的蛋白质凝胶分析。在指定OD下收集样品用于分析。

图23比较了在所示诱导剂浓度下利用OmpF或YtfQ信号序列在MDS metab细胞中和利用ompF信号序列在BL21(DE3)细胞中的CRM197的周质表达。在OD约2(极晚期诱导)下添加诱导剂并且通过Caliper分析样品。示出在每种浓度的诱导剂下的(可溶性)周质CRM197的g/L(外推至OD600＝250)。

具体实施方式

虽然本发明能够以多种形式实施，但下文对于若干实施方案的描述是在理解下作出的：本公开应视为本发明的例示，而不旨在将本发明限制为所说明的具体实施方案。提供标题仅仅是为了方便，而不应理解为以任何方式限制本发明。在任何标题下说明的实施方案可与在任何其他标题下说明的实施方案组合。

除非另外明确指出，否则在本申请中指定的各种范围中的数值的使用以近似值形式陈述，如同在所述范围内的最小值和最大值都带有前缀词语“约”。以这种方式，可以使用高于和低于所述范围的轻微变化来达到与所述范围内的值基本上相同的结果。如本文所用，术语“约”和“大约”当提及数值时应具有所讨论相关领域的技术人员所理解的平常和普通的含义。此外，范围的公开内容旨在作为包括所述最小值与最大值之间的每个数值的连续范围以及可以由这些数值形成的任何范围。这包括可以形成的包括或不包括有限的上和/或下边界的范围。这还包括可通过将给定所公开数字除以另一个所公开数字而得到的比率。因此，本领域技术人员应理解，许多这样的比率、范围和比率范围可以从本文呈现的数据和数字明确得出并且都代表本发明的各种实施方案。

如本文所用的“简化基因组”细菌是指具有约1％至约75％的其基因组(例如蛋白质编码基因)缺失、例如约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％或约60％的基因组缺失的细菌。在一个实施方案中，在本发明的实践中使用的简化基因组细菌具有优选地通过遗传工程改造以相比于天然亲本菌株的基因组小至少两个百分比(2％)和至多二十个百分比(20％)(包括其间任何数字)的基因组。优选地，所述基因组相比于天然亲本菌株的基因组小至少五个百分比(5％)和至多三十个百分比(30％)。更优选地，所述基因组相比于天然亲本菌株的基因组小八个百分比(8％)至十四个百分比(14％)至二十个百分比(20％)(包括其间任何数字)或更多。可选地，所述基因组可被工程改造以相比于天然亲本菌株的基因组小不到20％、不到30％、不到40％或不到50％。术语“天然亲本菌株”是指在如由科学界通常理解为代表菌株系基础的自然或天然环境中存在并且可对其基因组作出一系列缺失以产生具有较小基因组的细菌菌株的细菌菌株。天然亲本菌株也是指相对于工程改造的菌株进行比较并且其中工程改造的菌株小于所述天然亲本菌株的完全补体的菌株。通过将“在所有缺失后缺失的碱基对总数”除以“在所有缺失之前基因组中的碱基对总数”并且然后乘以100来计算在一系列缺失后已变得更小的基因组的百分比。类似地，通过将具有较小基因组的菌株中的核苷酸总数(不考虑其产生过程)除以天然亲本菌株中的核苷酸总数并且然后乘以100来计算所述基因组小于天然亲本菌株的百分比。

在一个实施方案中，“简化基因组”细菌是指上述量的基因组的除去不会不可接受地影响生物体在基本培养基上生长的能力的细菌。在本上下文中两个或更多个基因的除去是否“不可接受地影响”生物体在基本培养基上生长的能力取决于具体应用。例如，增殖率的30％降低对于一种应用可能是可接受的，但对于另一种应用并非如此。此外，从基因组缺失DNA序列的不利作用可通过诸如改变培养条件等措施来降低。这些措施可能会将原本不可接受的不利作用变成可接受的不利作用。在一个实施方案中，增殖率与亲本菌株大致相同。然而，相比于亲本菌株低约5％、10％、15％、20％、30％、40％至约50％的范围的增殖率在本发明的范围内。更具体地，本发明细菌的倍增时间可在约十五分钟至约三小时的范围内。合适的简化基因组细菌以及从细菌如大肠杆菌缺失DNA的方法的非限制性实例公开于美国专利No.6,989,265、7,303,906、8,119,365、8,039,243和8,178,339中，所述专利各自特此以引用的方式并入本文中。

本文使用的术语“b编号”是指如Blattner等，《科学(Science)》，277：1453-1474(1997)中所述赋予K-12MG1655菌株的每个基因的唯一ID。

本文使用的术语“CRM197”是指交叉反应物质197(CRM197)，它是在CRM197中具有单一G→A转变从而导致甘氨酸(在野生型毒素中的位置52处)被谷氨酸置换的白喉毒素变体。这种错义突变造成ADP-核糖基转移酶活性的损失。参见例如Giannini等，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，12(10)：4063-4069(1984)。

在若干实施方案中，提供在简化基因组大肠杆菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法。已经发现，例如相比于野生型大肠杆菌宿主菌株，使用简化基因组大肠杆菌宿主菌株，可以不溶性或可溶性形式产生令人惊讶地高产率的重组CRM197。在一个方面，所述方法导致不溶性CRM197在宿主细胞的细胞质中的产生增加。在其他方面，所述方法导致可溶性CRM197在宿主细胞的周质中的产生增加。在优选的实施方案中，用于产生简化基因组大肠杆菌宿主细胞的天然亲本大肠杆菌菌株是K-12菌株，例如K-12菌株MG1655。

在一些实施方案中，根据本文所述的方法，使用天然K-12菌株如K-12MG1655来产生重组CRM197。

根据本发明使用的CRM197的核苷酸序列可使用重组DNA技术来制备。例如，CRM197可以化学合成或者可以通过定点诱变基于由科尼噬菌体β携带的白喉毒素的野生型结构基因的已知核苷酸序列来制备(Greenfield等，《美国国家科学院院刊(Proc Nat Acad Sci)》，80：6953-6957(1993))。优选地，CRM197的核苷酸序列被优化以在大肠杆菌中表达。

异源核酸的多种序列特征可以被优化，包括(但不限于)翻译起始区域的修饰、mRNA结构元件的改变，和不同密码子偏性的使用。用于优化核酸序列以改善在大肠杆菌宿主细胞中的表达的方法是本领域中已知的并且描述于例如美国专利No.7,561,972中，所述专利的内容以引用的方式并入本文中。优选地，CRM197的核苷酸序列优化以在大肠杆菌中表达至少包括密码子优化。在大肠杆菌中很少使用的异源核酸序列中的密码子的存在可以延迟所编码蛋白的翻译并导致在大肠杆菌宿主细胞中的表达降低。因此，在一个方面，使用在大肠杆菌中一般使用的密码子来优化CRM197在大肠杆菌中的表达。CRM197优化以在大肠杆菌中表达此外优选地包括干扰二级结构的最小化。干扰二级结构可通过阻碍转录和翻译而导致异源蛋白在大肠杆菌中的表达降低。例如，在起始位点的mRNA二级结构与翻译效率反向相关。当连接至编码信号序列的上游区域时被优化以在大肠杆菌的周质中表达的示例性CRM197核苷酸序列以SEQ ID NO：1提供(图16A)。当连接至上游ATG起始密码子时被优化以在大肠杆菌的细胞质中表达的示例性CRM197核苷酸序列以SEQ ID NO：3提供(图16B)。应理解，本发明的方法不限于以SEQ ID NO：1阐述的CRM197核苷酸序列。用于优化异源核苷酸序列以在大肠杆菌中表达的其他策略是本领域中已知的并且可以在除了上述策略之外使用或作为上述策略的替代。

从遗传工程改造的细菌宿主细胞如包含表达系统的大肠杆菌制备重组异源蛋白的方法是本领域技术人员所熟知的。重组CRM197可以通过这些方法中的任何方法在(例如简化基因组)大肠杆菌宿主细胞中表达。在一个方面，本发明方法涉及包含表达系统的简化基因组大肠杆菌宿主细胞，所述表达系统包含可操作地连接至可诱导启动子的编码CRM197的核苷酸序列以使得当启动子被诱导时在宿主细胞中表达CRM197。在一个优选方面，通过添加合适量的IPTG来诱导启动子。可以通过若干标准分子生物学技术中的任何技术将多聚核苷酸引入简化基因组大肠杆菌宿主细胞中，例如Davis等，《分子生物学中的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》，(1986)和Sambrook等，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中描述的那些，包括(但不限于)磷酸钙转染、显微注射、电穿孔、结合、感染等。类似地，可使用适合维持、增殖或表达多聚核苷酸和/或在宿主中表达多肽的任何系统或载体来实施本发明。例如，可通过标准技术将适当的DNA序列插入载体如质粒中。

本发明的一个方面涉及CRM197在(例如简化基因组)大肠杆菌宿主细胞中的周质表达。蛋白质在周质中的表达已用于工业用途并且已经在Hanahan，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，166：557-580(1983)；Hockney，《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》，12：456-632(1994)；和Hannig等，《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》，16：54-60(1998)中评述，所述文献各自以引用的方式并入本文中。因此，在若干实施方案中，提供如下方法，其包括在适合重组CRM197蛋白表达的条件下使包含表达载体的(例如简化基因组)大肠杆菌生长，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的编码与信号序列融合的CRM197蛋白的核酸序列，其中所述信号序列引导CRM197蛋白转移至大肠杆菌宿主的周质。根据这些方法，产生令人惊讶地高产率的完整可溶性CRM197并且可以回收基本上所有的可溶性CRM197。

在蛋白质上存在信号序列促进新近翻译的蛋白质跨越大肠杆菌的内膜运输到周质空间中。信号序列然后裂解；因此用引导CRM197转移至大肠杆菌的周质的信号序列代替天然白喉棒状杆菌信号序列最终产生具有相同氨基酸序列的成熟蛋白。

下文列出能够引导异源蛋白至大肠杆菌周质的信号序列的代表性实例。应理解，可用于本发明方法中的信号序列不限于下文列出的那些。优选地，所述信号序列导致当在大肠杆菌中表达时至少70％、80％、90％或100％的多肽引导至周质。

根据本发明使用的其他信号序列包括(但不限于)CpdB(3′-核苷酸酶/2′，3′-环状核苷酸2′-磷酸二酯酶)、YdeN(假定硫酸酯酶)、OsmY(由高渗应激诱导)、ArtI(亚基精氨酸ABC转运蛋白)、GltL(谷氨酸ABC转运蛋白)和CybC(细胞色素b562)。

在优选的实施方案中，所述信号序列选自ytfQ、OmpA和OmpF信号序列。在一个特别优选的实施方案中，所述信号序列是OmpF信号序列。在另一个特别优选的实施方案中，所述信号序列是YtfQ信号序列。

任何简化基因组大肠杆菌菌株可用作根据本文所述方法的宿主细胞。在一个方面，所述简化基因组大肠杆菌具有已经遗传工程改造以相比于其天然亲本菌株的基因组小至少两个百分比(2％)和至多四十个百分比(40％)(包括其间任何数字)、例如5％至30％或5％至20％的基因组。通过将“在所有缺失后缺失的碱基对总数”除以“在所有缺失前在亲本菌株的基因组中的碱基对总数”并且然后乘以100来计算在一系列缺失后基因组已经变得较小的百分比。在另一个方面，所述简化基因组细菌具有4.41Mb至3.71Mb、4.41Mb至3.25Mb或者4.41Mb至2.78Mb的基因组。根据本文所述的方法使用的简化基因组大肠杆菌菌株可利用国际专利公开No.WO 2003/070880中所述的方法通过亲本大肠杆菌菌株的累积基因组缺失来产生。

所述亲本大肠杆菌菌株可为任何大肠杆菌菌株，但优选地是K-12菌株(例如MG1655(ATCC No.47076)或W3110(ATCC No.27325))或B菌株。特别优选的亲本大肠杆菌菌株是K-12菌株MG1655(注释版本m56，NCBI登录号U000961)，其拥有具有4,639,674个碱基对的基因组。

在一个方面，所述亲本大肠杆菌菌株是缺乏在以引用的方式并入本文中的美国专利No.8,178,339的表2-20中列出的一个或多个基因的K-12菌株。在一个优选的实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株至少缺乏以下基因(基于Blattner等，《科学(Science)》，277：1453-74和GenBank登录号400096中阐述的名称，由“b”编号识别)：b0245-b0301、b0303-b0310、b1336-b1411、b4426-b4427、b2441-b2450、b2622-b2654、b2657-b2660、b4462、b1994-b2008、b4435、b3322-b3338、b2349-b2363、b1539-b1579、b4269-b4320、b2968-b2972、b2975-b2977、b2979-b2987、b4466-b4468、b1137-b1172、b0537-b0565、b0016-b0022、b4412-b4413、b0577-b0582、b4415、b2389-b2390、b2392-b2395、b0358-b0368、b0370-b0380、b2856-b2863、b3042-b3048、b0656、b1325-b1333、b2030-b2062、b2190-b2192、b3215-b3219、b3504-b3505、b1070-b1083、b1878-b1894、b1917-b1950、b4324-b4342、b4345-b4358、b4486、b0497-b0502、b0700-b0706、b1456-b1462、b3481-b3484、b3592-b3596、b0981-b0988、b1021-b1029、b2080-b2096、b4438、b3440-b3445、b4451、b3556-b3558和b4455，它们是从大肠杆菌K-12MG1655缺失以产生简化基因组(或多个缺失)菌株MDS39的基因。在另一个优选的实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株还缺乏以下基因：b1786，它是从MDS39缺失以产生简化基因组菌株MDS40的基因。在另一个优选的实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株还缺乏以下基因：b0150-b01530，它们是从MDS40缺失以产生MDS41的基因。在另一个优选的实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株还缺乏以下基因：b2945(endA)，它是从MDS41缺失以产生简化基因组菌株MDS42的基因。在另一个实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株还缺乏以下基因中的任一种：b0315-b0331、b0333-b0341和b0346-b0354，它们是从MDS42缺失以产生简化基因组菌株MDS43的基因。在另一个实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株还缺乏以下基因中的任一种：b2481-b2492、b2219-b2230、b4500、b3707-b3723、b0644-b0650、b4079-4090、b4487、b4092-b4106、b0730-b0732、b3572-b3587、b1653、b2735-b2740、b2405-b2407、b3896-b3900、b1202、b4263-b4268、b0611、b2364-b2366、b0839、b0488-b0500、b0502，它们是从MDS43缺失以产生MDS60的基因。在另一个优选的实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株还缺乏以下基因中的任一种：b0566-b0575、b2209、b0160-b0161、b1431-b1444、b3643、b1037-b1043、b0383、b0226-b0234、b2115-b2132，它们是从MDS60缺失以产生MDS69的基因。在某些实施方案中，用于本文所述方法中的所述简化基因组大肠杆菌K-12菌株是MDS41、MDS42、MDS60或MDS69。

用于本发明中的大肠杆菌宿主细胞优选地包含功能recA基因(b2699)，但缺乏功能recA基因(b2699)的大肠杆菌还可以用作用于产生CRM197的宿主细胞。例如，简化基因组大肠杆菌菌株如例如菌株MDS40、MDS41、MDS42或MDS69可以通过从修饰的大肠杆菌K-12菌株完全或部分缺失基因以使b2699失活来修饰。在一个实施方案中，与OmpA信号序列融合的CRM197在缺乏功能recA基因的简化基因组大肠杆菌宿主中表达。

在另一个方面，所述简化基因组大肠杆菌包含选自由编码Pol II、Pol IV和Pol V的基因组成的群组的一个或多个非功能基因，如WIPO公开No.2013/059595中所述，所述公开的内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌具有非功能PolB(由b0060编码，大肠杆菌K12 MG1655基因组上的坐标63429-65780)和DinB(由b0231编码，MG1655基因组上的坐标250898-251953)基因。在另一个实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌具有非功能PolB、DinB和UmuDC(由b1183-b1184编码，MG1655基因组上的坐标1229990-1231667)基因。优选地，通过完全或部分缺失而使得所述基因失活。例如，可使得polB、dinB和umuDC基因在简化基因组大肠杆菌菌株如菌株MDS40、MDS41、MDS42或MDS69中呈非功能性。

在另一个方面，所述简化基因组大肠杆菌(例如菌株MDS40、MDS41、MDS42或MDS69)已经遗传修饰以(a)增强乳清酸磷酸核糖基转移酶活性，(b)产生活性乙酰羟酸合酶II和(c)降低iclR和arpA基因产物的表达。

大肠杆菌乳清酸磷酸核糖基转移酶(一种催化嘧啶核苷酸合成的酶)是由pyrE基因(b编号b3642)编码的。所述pyrE基因存在于具有上游rph基因(b3643)的操纵子中。由于rph基因的编码区域中的-1移码突变，所述pyrE基因在大肠杆菌K-12菌株如MG1655和W3310中在亚最佳水平下表达。可以通过完全除去rph编码序列的缺失来增强乳清酸磷酸核糖基转移酶活性以使rph-pyrE操纵子的启动子更接近于pyrE的翻译起始位点。可选地，可以使用美国专利No.8,293,505(其内容以引用的方式并入)中所述的任何方法来增强乳清酸磷酸核糖基转移酶活性。

大肠杆菌乙酰羟酸合酶II通常由被ilvG基因编码的大的亚基和被ilvM基因(b3769)编码的小的亚基组成。大肠杆菌K-12菌株MG1655的ilvG序列已破坏并且实际上是如GenBank登录号AAC77488.1中所示的假基因(b编号b4488)。所述ilvG假基因由两个独立的编码序列ilvG_1(b3767)和ilvG_2(b3768)构成。K-12菌株如MG1655中的ilvG假基因序列包含相对于在其他大肠杆菌菌株(例如B菌株、O菌株等)中存在的完整ilvG基因在位置983和984处的核苷酸GT的缺失。这些核苷酸的缺失导致移码突变并且在K-12 ilvG假基因序列的位置982-984处的核苷酸TGA充当提前终止密码子，从而产生对应于ilvG_1的ilvG的截短形式。因此，ilvG的正常基因产物不表达并且乙酰羟酸合酶II不存在于大肠杆菌K-12菌株中。简化基因组大肠杆菌可以通过在ilvG基因中引入补充天然-2移码突变的突变而被修饰以产生活性乙酰羟酸合酶II。可选地，简化基因组大肠杆菌可以通过美国专利No.7,300,776(其整个内容以引用的方式并入本文中)的任何方法被修饰以产生活性乙酰羟酸合酶II。

大肠杆菌K菌株的iclR和arpA基因分别是编码调节乙醛酸支路酶和乙酰基-CoA合成酶的表达的调节蛋白的相邻基因。所述iclR(异柠檬酸裂解酶调节剂)基因(b编号b4018)在NCBI Entrez GeneID No.948524下描述。所述arpA(锚蛋白样调节蛋白)基因(b编号b4017)在NCBI Entrez GeneID No.944933下描述。发现所述arpA基因在B菌株如BL21DE3和REL606的基因组序列中相对于K-12菌株序列部分缺失。例如通过在美国专利No.6,989,265的第8栏第45行至第14栏第41行描述的“无疤痕”缺失方法，通过所有或部分的iclR和arpA基因序列缺失，可以使iclR和arpA基因在简化基因组大肠杆菌中失活(即，使其呈非功能性)。

在其他实施方案中，简化基因组大肠杆菌包含relA基因，其含有在美国专利No.8,367,380(其内容以引用的方式并入本文)中所述的任何突变。例如，简化基因组大肠杆菌菌株如菌株MDS40、MDS41、MDS42或MDS69可被修饰以并入这些突变中的任何突变。

根据本发明使用的简化基因组大肠杆菌可包含上述修饰的任何组合。在一些优选的实施方案中，使用简化基因组大肠杆菌作为CRM197的周质产生的宿主，所述简化基因组大肠杆菌至少包含MDS42的缺失或至少包含MDS69的缺失并且遗传修饰以(a)增强乳清酸磷酸核糖基转移酶活性，(b)产生活性乙酰羟酸合酶II和(c)降低iclR和arpA基因产物的表达。所述简化基因组大肠杆菌优选地包含功能性recA基因。

各种蛋白编码基因可缺失以形成简化基因组细菌。在大肠杆菌和其他细菌中，可缺失的DNA序列类型包括一般将不利地影响生物体或者所述生物体的基因产物的稳定性的那些。产生不稳定性的这些元件包括(但不限于)转座元件、插入序列和可在基因组不稳定性中起作用的其他“自私DNA”元件。例如，插入序列(IS)元件和其相关转座通常存在于细菌基因组中，并且因此是缺失靶标。IS序列是大肠杆菌中常见的，并且它们可全部缺失。为了本文件中清楚起见，我们一般使用术语IS元件和转座元件来指代DNA元件，无论是完整的或是有缺陷的，其可以从基因组中的一个点移动到另一个点。科学和技术中的IS元件的有害作用的一个实例是，它们可以在增殖期间从宿主大肠杆菌的基因组跳到质粒中以进行测序。可以通过从所有IS元件的宿主细胞缺失来防止这种人为结果。对于特定的应用，与基因组不稳定性相关的其他特定基因如活性和非活性原噬菌体也可能缺失。在特别优选的实施方案中，根据本发明的简化基因组大肠杆菌宿主已经从其缺失所有插入序列(即不包含插入序列)。在一个相关方面，简化基因组大肠杆菌宿主缺乏所有IS1、IS2、IS3、IS5、IS150和IS186插入序列。

本发明的简化基因组细菌也可被工程改造以缺乏例如(但不限于)细菌的生长和代谢不必要的某些基因、假基因、原噬菌体、不需要的内源限制-修饰基因、致病基因、毒素基因、菌毛基因、周质蛋白基因、侵袭素蛋白基因、脂多糖基因、III类分泌系统、噬菌体毒力因子、噬菌体受体、致病岛、RHS元件、未知功能序列和细菌的相同天然亲本物种的两种菌株之间未共同存在的序列。并非细胞存活所需的其他DNA序列也可以缺失或省略。

在一个特别优选的实施方案中，提供简化基因组大肠杆菌，其具有相比于天然亲本大肠杆菌K菌株的基因组小五个百分比(5％)至三十个百分比(30％)的基因组并缺乏所有的插入序列(IS)元件。大肠杆菌MG1655的基因组图谱上的IS元件的位置示于美国专利No.8,178,339的图1和表2中，所述专利的内容以引用的方式并入本文中。通常存在于大肠杆菌中并且可除去的插入序列元件包括(但不限于)IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS30、IS150、IS186、IS600、IS911和IS10。优选地，所述天然亲本大肠杆菌菌株是大肠杆菌K-12菌株MG1655。

在另一个特别优选的实施方案中，所述简化基因组大肠杆菌包含一个或多个周质蛋白基因的缺失，包括(但不限于)单独或呈任何组合的下列基因：b0018、b0150、b0152-b0153、b0161、b0227、b0250、b0291-b0293、b0297、b0316、b0329、b0365、b0371、b0376、b0383-b0384、b0494、b0497-b0498、b0545、b0553、b0559、b0562、b0565、b0567、b0569、b0572-b0574、b0611、b0700、b0704、b0839、b0983-b0986、b1023-b1024、b1072、b1079-b1080、b1083、b1038-b1039、b1041-b1043、b1329、b1357、b1369、b1377、b1383、b1386、b1435-b1436、b1440、b1562、b1878、b1889、b1920、b1995、b2000、b2062、b2123、b2126、b2131-b2132、b2190、b2209、b2487、b2637、b2647、b2945、b3043、b3046-b3048、b3215-b3216、b3219、b3325、b3329、b3338、b3482、b3579、b3584、b3586、b3593、b3596、b4080、b4088、b4105、b4280、b4290-b4292、b4309-b4311、b4314、b4316-b4320、b4412、b4415、b4455和b4487。

在本发明的另一个方面，根据本文所述的方法，使用天然K-12菌株如K-12MG1655来产生重组CRM197。

所述重组蛋白可与伴侣蛋白/二硫键形成酶共表达，其可提供所述重组蛋白的适当折叠，包括(但不限于)Skp、DnaK、DnaJ、CaflM、CaflA、DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、PpiA、PpiD、FkpA、SurA、MBP、GST、YebF、MalE、HlyA、Hirudin、OmpF、Spy、YccA和PspA。可用于重组蛋白的周质表达的这些蛋白的核酸序列包括(但不限于)美国专利No.5,747,662；5,578,464和6,022,952中所述的那些，所述专利各自以引用的方式并入本文中。

用编码CRM197的表达载体转化的大肠杆菌宿主细胞(简化基因组或天然K12菌株)可以任何发酵形式培养。例如，本文中可使用摇瓶培养、分批、补料分批、半连续和连续发酵模式。如本文所用，“发酵”包括其中使用字面发酵的实施方案和其中使用其他非发酵培养模式的实施方案。此外，可使用任何规模的发酵，包括1升规模和较大的发酵体积。在一个实施方案中，发酵体积是或至少是1升。在其他实施方案中，发酵体积是或至少是5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1,000升、5,000升、10,000升、50,000升或更大。

在多个实施方案中，发酵培养基可选自丰富培养基、基本培养基和矿物盐培养基。在优选的实施方案中，选择基本培养基或矿物盐培养基。所述培养基优选不含或基本上不含血清和动物源产品。矿物盐培养基通常由矿物盐和碳源(例如葡萄糖、蔗糖或甘油)组成。用于制造矿物盐培养基的矿物盐包括选自以下的那些：例如，磷酸钾、硫酸铵或氯化铵、硫酸镁或氯化镁，和微量矿物质如氯化钙、硼酸盐，以及铁、铜、锰和锌的硫酸盐。在矿物盐培养基中不包括有机氮源，例如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。相反，使用无机氮源并且这可选自例如铵盐、氨水和气态氨。优选的矿物盐培养基将含有葡萄糖作为碳源。相比于矿物盐培养基，基本培养基还可含有矿物盐和碳源，但可以补充有例如低水平的氨基酸、维生素、蛋白胨或其他成分，但这些以非常小的水平加入。

在实施方案中，达到目标培养细胞密度，此时加入诱导剂、优选地IPTG，以起始蛋白质产生。应理解，诱导时的细胞密度、诱导剂浓度、pH和温度可以改变以确定最佳表达条件。

在优选的实施方案中，培养物的pH是约6.5至7.5。

转化的简化基因组大肠杆菌的生长、培养和/或发酵是在允许存活的温度范围内进行的，但优选为约20℃至约30℃，更优选为约25℃。在另一个优选的实施方案中，培养包括在37℃下进行相对短的初始温育(例如1至3小时)并且接着在诱导之前和之后在约20℃至约30℃、优选地约25℃下生长。在其他实施方案中，培养包括在诱导之前和之后在约25℃下生长。

在实施方案中，在摇瓶条件下，在20-30℃、优选地25℃的温育条件下在约0.1至约1.5、更优选地约0.2至约0.9、甚至更优选地约0.3至约0.6的600nm光密度(OD)下加入诱导剂。在600nm下，1OD单位对应于约0.8×10⁹个细胞/毫升。在其他实施方案中，在发酵条件下，在约100至400、更优选地约150至300、最优选地230至250的OD600下加入诱导剂。

本发明方法提供适当加工的CRM197相比于常规表达系统例如在野生型大肠杆菌B菌株中的水平增加。在某些实施方案中，所述方法提供可溶性CRM197的增加。在本上下文中，术语“可溶性”是指蛋白质当在生理条件下在缓冲液中旋转10-30分钟时在约5,000至20,000x重力离心下不沉淀。相反，“不溶性”是指蛋白质当在生理条件下在缓冲液中旋转10-30分钟时可以通过在5,000至20,000x重力下离心而沉淀。

本发明的方法可以包括回收从(例如简化基因组)大肠杆菌宿主细胞产生的重组CRM197。当以可溶性蛋白形式在周质中产生时，优选通过在不存在去垢剂和增溶剂的情况下机械裂解大肠杆菌宿主细胞来实现可溶性形式的重组CRM197的回收。机械破坏通常涉及超声处理(Neppiras和Hughes，《生物技术和生物工程(Biotechnology andBioengineering)》，6：247-270(1964))、微流体化(Sauer等，《生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)》，33：1330-1342(1989))或珠粒研磨(Limon-Lason等，《生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)》，21(5)：745-774(1979))。还可使用本领域中已知的其他机械方法。

可通过本领域中已知的标准技术来纯化重组CRM197，包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法、免疫纯化方法等。在一个优选的实施方案中，重组CRM197的纯化包括疏水相互作用色谱法和/或阴离子交换色谱法。

可以通过本领域技术人员已知的方法如毛细管凝胶电泳和Western印迹分析来确定CRM197的产率。活性测定法还可以提供关于蛋白质产率的信息。蛋白质产率的有用措施包括每培养物体积的重组蛋白量(例如蛋白质克数/培养物升数)、活性蛋白的百分比或分数(例如测定法中使用的活性蛋白量/蛋白质量)、总细胞蛋白的百分比或分数、蛋白质/细胞的量和干生物质的百分比或比例。

用于评估CRM197的活性测定法是本领域中已知的并描述于文献中并且可包括免疫学测定法，例如Western印迹分析和ELISA，以及受体结合测定法，例如白喉毒素受体(proHB-EGF)结合。在一个实施方案中，通过提取上清液中的活性重组CRM197蛋白相比于所测定总量的％(即基于通过测定法测定为具活性的CRM197量相对于测定法中使用的CRM197总量)来表示活性。在另一个实施方案中，通过提取上清液中的活性重组CRM197蛋白相比于标准物例如天然蛋白的％(即基于上清液提取物样品中的活性CRM197蛋白量相对于标准样品中的活性蛋白量，其中在测定法中使用相同量的来自每个样品的蛋白)来表示活性。在实施方案中，约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、或约99％至100％的重组CRM197蛋白被测定为具活性。

证实CRM197身份的方法也是本领域中已知的，例如可以使用MALDI-TOF质谱法、N端测序分析或肽定位通过肽质量指纹识别来分析蛋白质。

以下是本发明的优选实施方案。

在简化基因组大肠杆菌K12菌株宿主中产生重组CRM197的方法包括：在适合所述重组CRM197蛋白表达的条件下，温育包含表达载体的简化基因组大肠杆菌K12菌株，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的与编码OmpF或YtfQ信号序列的核苷酸序列融合的编码CRM197蛋白的核苷酸序列，所述OmpF或YtfQ信号序列引导CRM197蛋白转移至所述简化基因组大肠杆菌宿主的周质，由此获得产率为至少1克、优选地至少2克/升的可溶性CRM197，并且其中所述温育条件包括在不含动物血清或其他动物副产品的基本培养基中培养大肠杆菌宿主细胞。

在简化基因组大肠杆菌K12菌株宿主中产生重组CRM197的方法包括：在适合所述重组CRM197蛋白表达的条件下，温育包含表达载体的简化基因组大肠杆菌K12菌株，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的与编码OmpF或YtfQ信号序列的核苷酸序列融合的编码CRM197蛋白的核苷酸序列，所述OmpF或YtfQ信号序列引导CRM197蛋白转移至所述简化基因组大肠杆菌宿主的周质，由此获得产率为至少1克、优选地至少2克/升的可溶性CRM197，其中所述简化基因组大肠杆菌K12菌株已经至少从其缺失以下DNA区段：所述大肠杆菌K-12菌株MG1655的b0245-b0301、b0303-b0310、b1336-b1411、b4426-b4427、b2441-b2450、b2622-b2654、b2657-b2660、b4462、b1994-b2008、b4435、b3322-b3338、b2349-b2363、b1539-b1579、b4269-b4320、b2968-b2972、b2975-b2977、b2979-b2987、b4466-4468、b1137-b1172、b0537-b0565、b0016-b0022、b4412-b4413、b0577-b0582、b4415、b2389-b2390、b2392-b2395、b0358-b0368、b0370-b0380、b2856-b2863、b3042-b3048、b0656、b1325-b1333、b2030-b2062、b2190-b2192、b3215-b3219、b3504-b3505、b1070-b1083、b1878-b1894、b1917-b1950、b4324-b4342、b4345-b4358、b4486、b0497-b0502、b0700-b0706、b1456-b1462、b3481-b3484、b3592-b3596、b0981-b0988、b1021-b1029、b2080-b2096、b4438、b3440-b3445、b4451、b3556-b3558、b4455、b1786、b0150-b0153和b2945，并且任选地具有以下另外的修饰：(i)b4017、b4018和b3643的缺失和(ii)在b4488的位置982处插入AT二核苷酸，并且其中所述温育条件包括在不含动物血清或其他动物副产品的基本培养基中培养大肠杆菌宿主细胞。

在简化基因组大肠杆菌K12菌株宿主中产生重组CRM197的方法包括：在适合所述重组CRM197蛋白表达的条件下，温育包含表达载体的简化基因组大肠杆菌K12菌株，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的与编码OmpF或YtfQ信号序列的核苷酸序列融合的编码CRM197蛋白的核苷酸序列，所述OmpF或YtfQ信号序列引导CRM197蛋白转移至所述简化基因组大肠杆菌宿主的周质，由此获得产率为至少1克、优选地至少2克/升的可溶性CRM197，其中所述简化基因组大肠杆菌K12菌株已经至少从其缺失以下DNA区段：大肠杆菌K-12菌株MG1655的b0245-b0301、b0303-b0310、b1336-b1411、b4426-b4427、b2441-b2450、b2622-b2654、b2657-b2660、b4462、b1994-b2008、b4435、b3322-b3338、b2349-b2363、b1539-b1579、b4269-b4320、b2968-b2972、b2975-b2977、b2979-b2987、b4466-4468、b1137-b1172、b0537-b0565、b0016-b0022、b4412-b4413、b0577-b0582、b4415、b2389-b2390、b2392-b2395、b0358-b0368、b0370-b0380、b2856-b2863、b3042-b3048、b0656、b1325-b1333、b2030-b2062、b2190-b2192、b3215-b3219、b3504-b3505、b1070-b1083、b1878-b1894、b1917-b1950、b4324-b4342、b4345-b4358、b4486、b0497-b0502、b0700-b0706、b1456-b1462、b3481-b3484、b3592-b3596、b0981-b0988、b1021-b1029、b2080-b2096、b4438、b3440-b3445、b4451、b3556-b3558、b4455、b 1786、b0150-b0153、b2945、b0315-b0331、b0333-b0341、b0346-b0354、b2481-b2492、b2219-b2230、b4500、b3707-b3723、b0644-b0650、b4079-4090、b4487、b4092-b4106、b0730-b0732、b3572-b3587、b1653、b2735-b2740、b2405-b2407、b3896-b3900、b1202、b4263-b4268、b0611、b2364-b2366、b0839、b0488-b0500和b0502，并且任选地具有以下另外的修饰：(i)b4017、b4018和b3643的缺失和(ii)在b4488的位置982处插入AT二核苷酸，并且其中所述温育条件包括在不含动物血清或其他动物副产品的基本培养基中培养大肠杆菌宿主细胞。

实施例1

不溶性CRM197在简化基因组大肠杆菌宿主中的胞质表达

CRM197目前由白喉棒状杆菌C7(其中它由β噬菌体的多个溶素原表达)的发酵或在荧光假单胞菌中由重组质粒系统制造。白喉棒状杆菌中的CRM197产率较低(至多约200mg/L)并且需要2级生物安全(BSL2)设施。在荧光假单胞菌中的产生导致较高产率(约2g/L)；然而，两种宿主都保持众多移动元件、隐蔽原噬菌体和具有致病功能的基因残余物。在细菌发酵中，插入序列(IS)元件的移动性可导致使相关基因失活的插入。最终结果可能是发酵失败或截短产物的不希望的表达，这两者都存在经济问题和潜在危险性。此外，CRM197回归到其毒性亲本可具有灾难性后果。CRM197的逆转可能促进在组织培养细胞中检测到的毒性活性(Qiao等，2008)。因此，具有降低的突变率的表达系统可提供最高的可靠性和生产率以及最低的逆转风险水平。

造成CRM197的高价格和供应短缺的一个最大因素是历史上在生产主力大肠杆菌中不能产生大量的CRM197。CRM197当在细菌的细胞质中表达时是不溶性的并且当在标准商业大肠杆菌菌株中制造时在使用之前需要重新折叠。因为在常规菌株中产生相对少量的CRM197，所以在摇瓶培养中测试简化基因组大肠杆菌菌株MDS42作为不溶性CRM197的生产宿主。

通过国际专利公开No.WO 2003/070880(其以引用的方式并入本文)中所述的方法来产生简化基因组菌株MDS42。简言之，通过从亲本菌株大肠杆菌MG1655对核酸序列进行一系列的39个连续缺失(基因组的约14.1％)来产生一系列的简化基因组菌株(MDS01-MDS39)。在IS数据库中与含有K-12序列和所有序列的基因组扫描芯片(NimbleGenSystems，Madison，WI)的杂交揭示出，MDS39(被设计以缺乏所有IS元件的第一菌株)出乎意料地含有其他拷贝的IS元件，其已经在其产生过程中转运到新的位置。这些IS元件被缺失以产生MDS40。从MDS40缺失fhuACDB(tonA基因座)以产生MDS41。进行每个累积缺失以产生MDS01-MDS41的位置和功能可见于美国专利No.8,178,339的表2，所述专利的整个内容以引用的方式并入本文中。然后从MDS41缺失endA基因以产生MDS42。在MDS42中进行27个另外的核酸缺失以产生MDS69。MDS42和基于MDS42的所有菌株(MDS43、MDS44……MDS69等)不含插入序列。

对于不溶性CRM197的产生，使用包含DNA序列变化的修饰CRM197序列，所述DNA序列变化导致CRM197序列中的发夹结构的释放。优化的CRM197序列除去二级结构，其抑制翻译起始并增强起始位点(ATG)和核糖体结合位点(RBS)的识别。参见图1。

除去天然CRM197信号序列并且优化的CRM197序列(cyto-CRM197，SEQ ID NO：3)通过PCR扩增并亚克隆到表达载体pSX2中，其含有卡那霉素抗性盒并使用乳糖可诱导启动子来驱动克隆序列的表达。将含有CRM197(缺乏其天然信号序列)的质粒pSX2转化到简化基因组大肠杆菌菌株MDS42中并在摇瓶培养中研究。简言之，使3ml培养物在补充有0.2％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的Korz基本培养基(Korz DJ等，《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》，39(1)：59-65(1995))中生长至饱和并用于接种20ml培养物至初始OD₆₀₀＝0.075。然后使用摇瓶测定产生最佳水平的不溶性胞质CRM197的生长温度和诱导剂(IPTG)浓度(在补充有质粒可选择的抗生素卡那霉素的基本培养基中)。最佳IPTG浓度测定为250μM。图2是蛋白质凝胶的实例，其分析了总细胞蛋白(T)以及在添加IPTG之前从三个生长至OD₆₀₀为0.5(晚期诱导)的独立培养物高速离心总细胞蛋白后的可溶性部分(S)和不溶性部分(I)。令人惊讶的是，在不溶性部分中存在大量的cyto-CRM197(参见图2，箭头)。当相对于蛋白质标准物定量时，在OD₆₀₀为200的适度发酵中，摇瓶结果预测10至12g/L的cyto-CRM197。简化基因组大肠杆菌宿主细胞中的不溶性CRM197产生是常规大肠杆菌菌株中的10倍。

实施例2

可溶性CRM197在简化基因组大肠杆菌宿主中的周质表达

接着，通过引导CRM197至周质空间的表达来测试可溶性CRM197在简化基因组大肠杆菌菌株中的产生。CRM197已被证明在大肠杆菌中极难以可溶性形式产生。高度表达的蛋白质向周质空间的输出通过提供用于正确蛋白质折叠的最佳非还原性环境和二硫桥形成来辅助稳定性。为此，研究了六个信号序列与多种共表达的伴侣蛋白来鉴定赋予CRM197的最高水平周质递送的信号序列和伴侣蛋白。图3示出所研究的信号序列和共表达的伴侣蛋白。所研究的信号序列包括来自三个大肠杆菌分泌途径中的每个的代表性信号序列。

从DNA 2.0(Menlo Park，CA)定购对于大肠杆菌(SEQ ID NO：1)进行密码子优化的CRM197开放阅读框(ORF)。CRM197 ORF前面是编码PelB信号序列的序列。pelB和CRM197 ORF侧接有被设计以促进克隆到pSX2表达载体中的序列。在下表1提供5′侧接序列-PelB信号序列-CRM197 ORF(包括终止密码子)-3′侧接序列的核苷酸序列，其中所述侧接序列加下划线，编码PelB信号序列的核苷酸序列加粗，并且CRM197 ORF是纯文本。

表1：pelB(加粗)-CRM197核苷酸序列(纯文本)+侧接序列(下划线)：

CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTTGAAGGAGATATACAT GGTGCGGATGATGTTGTGGACAGCTCTAAGTCTTTTGTGATGGAAAACTTTAGCTCGTACCACGGTACGAAGCCAGGTTATGTCGACAGCATTCAAAAAGGTATCCAGAAACCGAAGTCCGGCACGCAGGGTAACTACGACGACGATTGGAAAGAGTTCTACAGCACCGACAACAAGTATGACGCAGCGGGTTACAGCGTTGACAATGAGAATCCGTTGAGCGGCAAAGCGGGTGGTGTTGTCAAAGTGACGTATCCGGGTCTGACCAAGGTCCTGGCGTTGAAAGTTGATAACGCGGAAACCATTAAGAAAGAGCTGGGTCTGAGCCTGACCGAGCCGTTGATGGAGCAAGTTGGTACCGAAGAGTTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCGAGCCGCGTTGTCCTGTCCCTGCCTTTCGCGGAGGGCAGCTCCAGCGTTGAGTATATCAATAACTGGGAGCAAGCAAAAGCGCTGTCCGTCGAACTGGAAATCAATTTTGAAACGCGCGGTAAACGTGGTCAAGATGCAATGTACGAGTATATGGCCCAGGCCTGCGCTGGTAATCGTGTTCGTCGCAGCGTTGGTAGCAGCTTGTCTTGTATCAACCTGGATTGGGATGTGATCCGTGATAAGACCAAGACTAAGATCGAGAGCCTGAAAGAACATGGCCCGATTAAGAACAAGATGTCGGAGAGCCCGAATAAGACCGTGAGCGAAGAAAAGGCCAAGCAGTATCTGGAAGAGTTCCACCAAACGGCTCTGGAGCATCCGGAGCTGAGCGAGCTGAAAACGGTTACGGGCACCAACCCGGTGTTCGCAGGTGCGAATTACGCGGCGTGGGCAGTGAATGTGGCGCAGGTCATCGACTCCGAAACGGCGGACAATTTGGAGAAAACCACCGCAGCGCTGAGCATTCTGCCGGGCATCGGCAGCGTTATGGGCATTGCAGATGGTGCTGTGCACCATAACACTGAAGAAATCGTAGCGCAAAGCATTGCCCTGTCTAGCTTGATGGTGGCGCAGGCTATTCCGCTGGTCGGCGAACTGGTTGATATCGGCTTTGCTGCCTACAACTTCGTTGAAAGCATCATTAACCTGTTTCAGGTGGTCCACAACAGCTATAATCGCCCAGCGTACAGCCCGGGTCACAAGACCCAACCGTTCCTGCACGATGGCTATGCGGTGTCTTGGAACACGGTCGAAGATAGCATCATTCGTACCGGTTTCCAGGGCGAGAGCGGCCATGACATCAAGATTACTGCAGAAAATACCCCGCTGCCGATCGCAGGTGTCCTGCTGCCTACGATTCCGGGTAAGCTGGACGTTAACAAAAGCAAAACCCACATTTCTGTGAACGGTCGTAAGATTCGCATGCGTTGTCGTGCGATTGACGGCGACGTCACCTTCTGCCGTCCGAAGAGCCCGGTCTACGTTGGTAATGGTGTGCACGCGAACCTGCACGTGGCGTTTCACCGCAGCAGCTCGGAGAAAATCCATAGCAATGAGATTTCTAGCGACAGCATTGGCGTTCTGGGTTACCAAAAGACGGTTGACCATACCAAAGTCAATTCCAAACTGAGCCTGTTCTTTGAGATCAAAAGCTAACTCGAGCCC CAAGGGCGACACCCCCT

编码PelB-CRM197 ORF的核苷酸序列是从具有正义引物(GGAGATATACATATGAAATACTTGCTGCCAACC)和反义引物(CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA)的DNA 2.0克隆进行PCR扩增的以产生克隆到pSX2载体中所需的侧接区域。

使用2或3步骤PCR方法将可选的信号序列与CRM1970RF融合。在第一步骤中，使用覆盖信号序列的C端编码区域和CRM197的N端编码区域的正义引物以及覆盖CRM197的C端编码区域的反义引物。在第二步骤中，使用完成信号序列的ORF的引物与覆盖CRM197的C端编码区域的相同引物。在OmpA-CRM197构建体的情况下，使用第三步骤，其包括覆盖信号序列的N端区域的较短引物和覆盖CRM197的C端编码区域的相同引物。下文描述用于将大肠杆菌ompA和OmpF信号序列与CRM197ORF融合的引物。

使用下列引物将大肠杆菌ompA编码信号序列与CRM197ORF融合。对于步骤1，正义引物＝5′-GCTACCGTAGCGCAGGCCGGTGCGGATGATGTTGTGGA-3′并且反义引物＝5′-CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA-3′。对于步骤2，正义引物＝5′-GGAGATATACATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCAC TGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC-3′并且反义引物＝5′-CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA-3′。对于步骤3，正义引物＝5′-GGAGATATACATATGAAAAAGACAGCTATCG-3′并且反义引物＝5′-CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA-3′。

使用下列引物将ompF编码信号序列与CRM197ORF融合。对于步骤1，正义引物＝5′-GTTAGTAGCAGGTACTGCAAACGCTGGTGCGGATGATGTTGTGGA-3′并且反义引物＝5′-CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA-3′。对于步骤2，正义引物＝5′-GGAGATATACATATGATGAAGCGCAATATTCTGGCAGTGATCGTCCCTGCTCTGTTAGTAGCAGGTACTGCAAACGCT-3′并且反义引物＝5′-CTTTGTTAGCAGCCGATTAGCTTTTGATCTCAAAGAACA-3′。

将完成的信号序列-CRM197PCR产物克隆到pSX2表达载体中。所述信号序列-CRM197PCR产物的末端具有15bp的序列，其与pSX2载体的序列重叠。用限制酶Kpn I和Sac I将所述pSX2载体线性化以促进克隆反应。将克隆反应转化到具有另一个IS609缺失的MDS42、MDS42recA或MDS42recA中，以产生重组pSX2表达载体。通过序列分析验证信号序列-CRM197区域和侧接载体序列。

将在图3(B)示出的含有信号序列与CRM197序列(缺乏其天然信号序列)的组合的质粒pSX2转化到简化基因组大肠杆菌菌株MDS42或MDS42recA(具有recA基因(recA1819等位基因)缺失的MDS42菌株)中并在摇瓶培养中研究。除了信号序列和伴侣蛋白之外，所研究的培养变量包括温度、诱导剂(IPTG)浓度和添加诱导剂的时间点(早期[OD_600nm为0.01]或晚期[OD_600nm为约0.4])。确定下列条件对于CRM197的周质分泌是最佳的并且在后续实验中使用这些条件：(i)生长温度是约25℃，其前面是短暂37℃温育(例如2小时)，(ii)晚期诱导(在约0.4的OD₆₀₀下加入IPTG)和(iii)诱导剂(IPTG)浓度是15至35μM(cyto-CRM197的最佳表达所需的约1/10)。

简言之，使3ml培养物在补充有0.2％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的Korz基本培养基中生长至饱和并用于接种20ml培养物至初始OD₆₀₀＝0.075。将20ml培养物(在125ml具有隔板的Erlenmeyer烧瓶中)放置在37℃振荡温育箱(250rpm)中持续2小时。然后将培养物转移到25℃振荡温育箱并监测直至OD₆₀₀为0.3-0.4。此时，添加所示浓度的IPTG。将诱导培养物在25℃振荡温育箱中温育过夜。总诱导时间是18-22小时。在诱导后，测定培养物的OD₆₀₀。将代表2OD单位的培养物的等分试样加工以产生周质样品。借助于周质化缓冲液(Epicentre，Madison，WI)来制备周质样品。通过在1.5ml Eppendorf管中在7500xg下离心10分钟来收集2OD样品。除去上清液并且将细胞沉淀轻轻地重新悬浮在50μl周质化缓冲液(200mM Tris-HCl[pH 7.5]、20％蔗糖、1mM EDTA和30U/μl Ready-Lyse溶菌酶)中。在室温下5分钟后，将50μl的冰冷水快速加入到重新悬浮的沉淀中。将混合物在冰上温育5分钟，然后通过在4000xg下离心15分钟而从原生质球分馏周质部分。制备代表周质部分的上清液以用于SDS-PAGE分析。每个泳道加载相当于0.12OD单位的量。

图4中示出导致CRM197向周质中的最高分泌的最成功的信号序列和诱导特征。发现周质信号OmpA和OmpF促进CRM197向周质中的最大移动。三种共表达的伴侣蛋白都不会不同地影响周质递送(举例来说，在图4中在存在和不存在YccA的情况下比较表达)。因为OmpA和OmpF似乎导致大致相似量的周质CRM197，所以在后续实验中使用OmpA-CRM197。

因为包括ompA和ompF的sec依赖性途径的组分的表达可能经受分解代谢物阻遏，所以在摇瓶培养中在上述条件下在简化基因组大肠杆菌菌株MDS42中比较用于制备ompA-CRM197的作为碳源的甘油与葡萄糖的影响。如图5所示，补充有甘油的基本培养基相比于葡萄糖导致CRM197表达水平显著较低。因此在所有后续实验中使用葡萄糖作为碳源。

接着，比较若干不同简化基因组大肠杆菌宿主细胞中的周质CRM197的产生。因此，基于上文对于含有(i)优化细胞代谢的缺失或(ii)除去或降低可能不利地影响CRM197表达的蛋白酶(例如Blon)水平的缺失的MDS42所述的最佳条件，对于MDS42或MDS69菌株背景内的一系列缺失研究其在摇瓶培养中对周质(可溶性)CRM197产生的影响。测试基于MDS42的下列简化基因组大肠杆菌菌株：MDS42recA、MDS42metab和MDS42Blon/metab。MDS42metab是通过如下产生的：(i)缺失iclR(b编号b4018，在NCBI Entrez GeneID No.948524下描述)和arpA基因(b编号b4017，在NCBI Entrez GeneID No.944933下描述)，(ii)缺失rph基因(b3643)(从而增加下游pyrE基因的转录水平)，和(iii)通过在位置982插入AT二核苷酸来校正ilvG移码突变(导致活性乙酰羟酸合酶II的表达)。MDS42Blon/metab含有对于MDS42metab所述的修饰以及lon蛋白酶(b0439)启动子区域的修饰以模拟B菌株大肠杆菌的lon启动子区域的序列，其中IS插入将原始大肠杆菌lon启动子的-35区域与-10区域隔开。测试基于MDS69的下列简化基因组大肠杆菌菌株：MDS69metab(如上文对于MDS42metab所述修饰的MDS69菌株)、MDS69Blon/metab(MDS69metab进一步变异以包括Blon蛋白酶修饰)、MDS69lpp/metab(MDS69metab进一步修饰以缺失脂蛋白1pp(b1677))和MDS69Blon/lpp/metab(MDS69metab进一步修饰以包括Blon蛋白酶修饰和脂蛋白lpp基因缺失)。

图6比较了这些菌株中的OmpA-CRM197表达。在所研究的八种菌株中，在含有旨在增强代谢活性(代谢菌株)的缺失的那些菌株(在MDS42或MDS69背景上)中，显而易见最高水平的CRM197表达。然而，所测试的所有菌株都含有令人惊讶地大量的周质CRM197(图6的图B和图D)，其在总细胞蛋白制剂中的蛋白质凝胶上也是显而易见的(图6的图A和图C)。重要的是，这些结果表明，蛋白酶缺失Blon不影响代谢菌株中的CRM197水平。此外，高丰度脂蛋白Lpp(通过其不存在视为“释放”sec依赖性周质运输系统)的除去也被发现不影响周质CRM197水平。在诱导后分离来自这些实验的培养基并研究CRM197释放。在来自所研究的任何菌株的培养基中未鉴定出CRM197。表2是产生最高周质CRM197表达水平的MDS菌株的产率结果的总结。这些结果是通过比较来自所示四种菌株的CRM197的染色强度与在相同凝胶上操作的蛋白质标准物而获得的。将摇瓶值外推以预测在达到100或200OD₆₀₀的发酵中的CRM197量。表2中所示的四种菌株通常在补料分批发酵中达到300的OD，表明这些菌株能够相比于常规菌株中的目前可能产率而产生远远更多的CRM197。

表2

CRM197对蛋白水解裂解高度敏感，其使得高质量CRM197的产生具挑战性(Bishai等，《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》，169：5140-51(1987)；《载体蛋白的重组产生(Recombinant Production of Carrier Proteins)》，GEN News，2012年12月1日)。在另外一组实验中，在一系列蛋白酶缺失菌株中研究周质CRM197的产生以确定来自简化基因组大肠杆菌菌株的蛋白酶基因的靶向除去是否会导致周质中的CRM197增加。因此，分别组合缺失以下蛋白酶编码基因：degP(b0161)、prc(b1830)、htpX(b1829)以及lon启动子区域的部分。单独地或组合地缺失蛋白酶基因不影响CRM197表达水平。参见图7，说明被修饰以缺失蛋白酶基因的指定组合的简化基因组大肠杆菌菌株MDS42对CRM197的周质表达无影响。这种数据表明，当在基于MDS42或MDS69的简化基因组大肠杆菌菌株中产生时，假定由于这些菌株中的低水平的蛋白酶活性，不发生CRM197的蛋白水解裂解。

实施例3

补料分批发酵中的CRM197产生

接着，研究CRM197在简化基因组大肠杆菌菌株中的商业规模放大。因此，在10升规模的限定基本培养基中对MDS42代谢菌株中的OmpA-CRM197进行补料分批发酵。发酵条件包括在37℃下的分批阶段，其被接种至0.18OD并使其生长直至分批培养基中的1％葡萄糖已消耗(约7.5小时)。通过当分批培养基不含葡萄糖时出现的DO峰值来触发补料分批阶段。以指数进料速率开始进料以产生通过重量分析控制的0.3Mu(1/h)的生长速率(约12.5小时)。诱导点被确定为可用的磷酸盐接近耗尽的点。在诱导点之前约2小时的点，将温度改变为25℃并且进料速率降低至产生0.2Mu(1/hr)的生长速率的速率。一旦加入诱导剂(100μM)，就将进料改变为恒定速率以使得每小时加入80g葡萄糖持续约7小时。发酵OD₆₀₀接近300并产生非常高水平的周质靶向CRM197，如图8所示。在最佳条件下的第二次发酵导致周质CRM197水平为约2g/L，表明在测试发酵中的高一致性水平。

上述结果表明，在摇瓶和10L补料分批发酵中，在简化基因组大肠杆菌产生宿主如MDS42和MDS69中获得令人惊讶的产率的可溶性CRM197。

在初步发酵分析期间观测到的一个问题是总细胞蛋白分离中的可溶性形式的CRM197减少。因为周质分离方法不适用于大规模，所以开发出可溶性CRM197分离的一般方法。进行初始实验来确定在常规总细胞蛋白(TCP)分离后观测到的不溶性CRM197是否可以可溶性形式分离。因此，如上所述在10升规模下在限定基本培养基中对MDS42recA菌株中的OmpA-CRM197进行补料分批发酵(包括在37℃下温育，接着在加入诱导剂之前在25℃下短期温育)。利用市售的基于非离子型去垢剂的缓冲液对含有大量周质CRM197的细胞进行标准去垢剂消化以分离总细胞蛋白(TCP)。将总细胞蛋白样品在高速(21k g)下离心10分钟并且分离可溶性部分。分析TCP和可溶性部分的样品。如图9的图A所示，通过去垢剂均质化使可溶性周质形式的CRM197完全不溶。相反，当对周质制剂(如上所述)进行高速离心时，周质CRM197按照预期保持为可溶性形式。参见图9的图B。

在尝试回收不溶性CRM197部分时，将基于去垢剂的细菌细胞裂解与细胞裂解的机械方法进行比较，其相比于去垢剂裂解将更有利于用于产生CRM197的生产级平台，并且在商业大规模方法中将消除分离周质的需要。此外，在已知增强如下表3所述的蛋白质增溶的化学剂的存在下进行裂解：

表3：裂解方法和增溶剂的列表。

在50mM TrisHCl缓冲液(pH 8)中进行超声处理和微流体化并且在Lysonase^TM(溶菌酶和benzonase的商业混合物)(Novagen，Darmstadt，Germany)存在下进行所有裂解方法。然后在独立制剂中测试表3中列出的每种试剂。图10是通过去垢剂或机械裂解进行的一系列分离的实例。使用去垢剂裂解不可获得可溶性CRM197并且使用包括增溶剂的去垢剂裂解显而易见可溶性CRM197的仅少量增加。当与单独的去垢剂相比时，甘油和蔗糖适度地增强可溶性部分中存在的可溶性CRM197的量(图10的图A)。然而，机械裂解急剧增加了可溶性部分中的CRM197水平。实际上，在来自经受机械裂解(无论是使用超声处理(图10的图B)还是微流体化)的所有样品的可溶性部分中，显而易见CRM197水平的急剧增加。此外，在机械裂解后获得的可溶性CRM197量不会因增溶剂而显著不同(将“无试剂”与表3中的其他试剂进行比较)。从机械裂解方法产生的结果的汇编表明，MDS42中的CRM197(使用如下培养条件，其包括短期37℃温育，接着在25℃下生长和利用25-35μM IPTG进行晚期阶段诱导)包含7.2-8.3％的总细胞蛋白和6.3％至7.7％的可溶性蛋白。这些结果是令人感兴趣的，因为机械裂解是在大规模商业发酵中使用的标准细胞破坏方法并暗示产生大量可溶性CRM197的能力。

基于上述数据，适用于产生可溶性CRM197的商业方案包括在25℃下使携带编码与周质信号序列(例如由ompA或ompF编码)融合的CRM197编码序列的表达载体的简化基因组大肠杆菌宿主发酵，其中通过低速离心收集细胞，在合适的缓冲液(例如50mM Tris-HCl缓冲液，pH约8)中通过机械方式(例如超声处理或微流体化)裂解。在离心以除去碎片后，然后从上清液分离可溶性CRM197。在25℃和25-35mM IPTG下温育的摇瓶培养中，分离出可溶性形式的95％至100％的CRM197。

下表4示出使用携带含有ompA-CRM197融合体的表达载体的简化基因组大肠杆菌菌株MDS69metab(如上所述)进行的发酵结果的总结。这些发酵是在补料分批条件下使用限定基本培养基和在对数生长中晚期加入诱导剂IPTG而发生的。发酵规模是10升。通过改变诱导剂浓度，周质CRM197的量从0.5增加至约2g/L。

图11示出使用100μM诱导剂浓度进行发酵的细节。来自这种发酵的凝胶比较了具有可溶性(Sol)和不溶性(Insol)部分的总细胞蛋白(TCP)分离体，明确指出可溶性CRM197在发酵期间的稳固表达(参见图12)。

在简化基因组大肠杆菌宿主菌株的补料分批发酵中产生可溶性CRM197的最佳条件如下。关于温度，在分批阶段中通过在37℃下温育来起始生长，接着温度改变为20至25℃，然后加入诱导剂(在这种情况下是IPTG)是最佳的。最佳pH范围是6.5至7.5(例如6.5、7.0或7.5)。最佳诱导剂浓度是100至250μM IPTG(在生长的晚期对数阶段加入)。关于培养基条件，基本培养基条件确定为足够的并且具有降低成本和限定不含动物源产品的条件的优点。重要的是，常规大肠杆菌菌株不会在基本培养基中稳固生长。使用这些最佳条件，估计在使用简化基因组大肠杆菌宿主菌株(例如MDS42或MDS69)的10L规模发酵中能够可靠地产生目标产率为至少4g/L的可溶性CRM197。

实施例4

CRM197的下游加工

在简化基因组大肠杆菌中产生CRM197和机械裂解后，可以将CRM197纯化。为了确定在发酵条件下从MDS69metab产生的CRM197是否适合纯化，使用疏水相互作用色谱法(苯基琼脂糖)和阴离子交换色谱法(DEAE-纤维素)的组合进行小规模纯化。在10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)溶液中使用微流化仪(MF)对图11中所示的50OD单位的28小时发酵样品进行均质化。将所得匀浆在21,000g下离心10分钟并且分离可溶性和不溶性(IS)部分。使用Western印迹分析和针对白喉毒素(DPX)的多克隆抗体，发现CRM197在可溶性部分中高度富集(图13的图A在三种浓度(0.1、0.07和0.04OD)下比较了微流化仪(MF)和重新悬浮的不溶性(IS)部分与柱前可溶性部分)。将可溶性部分(25OD等量)过滤(0.45μm)，达到13％(重量/体积)硫酸铵并加载到先前在10mM氯化钠、10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中平衡的苯基琼脂糖柱(Phenyl sepharose HP HiTrap，General Electric)上。使用0.6M硫酸铵、6mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)洗涤柱并且在低盐条件(10mM氯化钠、10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5))下洗脱CRM197。然后通过抗DPX Western印迹分析和蛋白质染色来分析五个2.5mL洗脱部分(图13的图A，泳道标记为10mM NaCl)。通过用蒸馏水进行最终洗涤而从主要洗脱样品纯化少量的未加工CRM197(图13的图A，箭头)。然后将图13的图A中用圆圈圈出的部分汇集，用蒸馏水1∶2稀释并加载到已经在10mM氯化钠、10mM磷酸钠(pH 7.5)中平衡的含有1ml快流速DEAE琼脂糖(Pharmacia)的柱上。在加载样品并收集流过物之后，用3体积的50mM氯化钠、0.5mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)洗涤柱。使用递增的氯化钠浓度来洗脱CRM197：100mM NaCl(2次3ml)、1MNaCl(3ml)和1.5M NaCl(3ml)。SDS-PAGE分析揭示出使用1M NaCl洗脱最高纯度的可溶性CRM197，但显著量仍保持结合于柱。

这些结果表明，在简化基因组大肠杆菌宿主菌株中产生的CRM197是高度可溶的并且可以使用现有纯化方法分离至高纯度。

实施例5

在简化基因组大肠杆菌宿主中相比于野生型菌株的CRM197产生

在类似条件下比较简化基因组大肠杆菌菌株中的CRM197的周质产生与野生型大肠杆菌菌株中的CRM197产生。因此，用携带OmpA-CRM197融合体的pSX2载体转化CRM197大肠杆菌BLR(DE3)菌株并且评估周质产生并与简化基因组大肠杆菌菌株MDS42recA中的CRM197的周质产生进行比较。发酵条件如上所述。在37℃下的短暂生长起始阶段后，使细胞在25℃下在补充有0.2％葡萄糖(和31μg/ml异亮氨酸，对于BLR(DE3)培养物)的Korz培养基中生长19小时。在OD＝0.3下利用15或25mM IPTG诱导CRM197的表达。

如图14所示，相比于野生型B菌株，在简化基因组大肠杆菌宿主中观测到至少约5倍的周质CRM197产生增加。

其他实验揭示出，相比于OmpA-CRM197融合体，OmpF-CRM197融合体实际上导致在简化基因组大肠杆菌宿主中更高量的可溶性周质CRM197。用编码OmpF-CRM197融合体的表达载体转化简化基因组大肠杆菌宿主菌株MDS69metab和MDS69低突变(MDS69菌株还包含polB(b0060)、dinB(b0231)和umuDC(b1183-b1184)的缺失)并且在相同条件下将CRM197的周质表达与携带编码OmpA-CRM197融合体的表达载体的MDS69低突变宿主中进行比较。在37℃下短暂生长起始阶段后，使细胞在25℃下在补充有0.2％葡萄糖的Korz培养基中生长23小时。在OD＝0.3至0.34下利用25或35mM IPTG诱导CRM197的表达。分离周质蛋白并且分析每个菌株中的可溶性CRM197的表达。如图15所示，相比于OmpA-CRM197构建体，利用OmpF-CRM197构建体获得更高产率的CRM197。

实施例6

在简化基因组大肠杆菌菌株中利用多种信号序列测试CRM197产生

基于如由周质部分的2D凝胶分析所确定的信号序列在大肠杆菌B和K菌株的周质中的丰度来选择信号序列(Han，Mee-Jung等，《生物科学和生物工程杂志(Journal ofBioscience and Bioengineering)》，117(4)：437-442(2014))。表5列出所选择的信号序列和其在B和K菌株的周质中的相对丰度：

表5

将表5和图17所示的含有信号序列和CRM197序列(缺乏其天然信号序列)的组合的质粒pSX2(MglB、MalE、OppA、RbsB、Agp、FkpA、YtfQ、HdeA、HdeB或GlnH；也测试了OmpF和OmpC)转化到简化基因组大肠杆菌菌株MDS69metab(图18-21中的T69 Meta)中并在摇瓶培养中研究。如上所述，MDS69metab包含在MDS69背景上的下列修饰：(i)缺失iclR(b编号b4018，在NCBI Entrez GeneID No.948524下描述)和arpA基因(b编号b4017，在NCBIEntrez GeneID No.944933下描述)，(ii)缺失rph基因(b3643)，和(iii)通过在位置982处插入AT二核苷酸来校正ilvG移码突变。简言之，将来自MOPS基本培养基-卡那霉素(MMM/Kan)-葡萄糖划线板的转化细菌的菌落形成单位重新悬浮在补充有0.2％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的3ml Korz基本培养基中并在37℃下温育过夜以产生起始培养物。将起始培养物用于接种125ml Erlenmeyer烧瓶中的20mlKorz/0.2％葡萄糖/Kan至OD600＝0.05并在37℃下生长1.5小时，然后改变为25℃并生长直至OD₆₀₀为约0.3。此时，加入25μM、35μM或50μM浓度的诱导剂(IPTG)(晚期诱导)。然后使晚期诱导物在25℃下生长20小时并且收集2OD的培养物。使用BugBuster+Lysonase制备总细胞蛋白并且使用Epicentre周质化方法制备周质和原生质球部分。

图18-20描绘了使用所示信号序列(诱导A-OmpF、Ma1E、HdeA、OppA、HdeB、GlnH；诱导B-OmpF、Mg1B、Agp、OmpC、RbsB、FkpA、YtfQ)分别在25μM、35μM或50μM诱导剂浓度下的(可溶性)CRM197的周质产率。在25μM诱导剂浓度下利用所有信号序列获得良好产率(图18)。有趣的是，在35μM诱导剂浓度下，利用YtfQ信号序列的CRM197产率相对于在这种诱导剂浓度下利用其他所测试信号序列获得的CRM197产率显著增加(图19)。在50μM诱导剂浓度下，这种作用变得甚至更显著，其中CRM17产率保持较高，而在这种诱导剂浓度下利用其他所测试信号序列的CRM197产率显著降低(图20)。因此，CRM197和YtfQ信号序列的组合相比于CRM197与其他所测试信号序列的组合确定具有显著更宽的诱导范围。

为了进一步评估利用YtfQ信号序列的CRM197的诱导范围，根据上述方法在MDS69metab(0、25、35、50、75、100、150和250uM)中测试各8IPTG(诱导剂)水平的两种培养物。作为对照，也测试了利用CRM197和OmpF信号序列的MDS69metab的各4IPTG水平的2种培养物(0、25、35、50μM)。对2OD样品收集总细胞蛋白(TCP)并在Caliper上进行周质分析。

对于每种诱导剂水平所测试的两种培养物的平均结果示于图21。在至多100μM的所有诱导剂水平下，CRM197与YtfQ信号序列组合(YtfQ-CRM197)的产率保持较高。然而，与OmpF组合的CRM197产率仅在25和35μM诱导剂浓度下较高。图22是比较了在50μM IPTG(OmpF)下和在50、75、100、150和250μM IPTG(YtfQ)下OmpF和YtfQ信号序列对周质(P)和培养基(M)中的CRM197产率的影响的蛋白质凝胶。对于YtfQ信号序列，在50、75和100μM诱导剂浓度下显而易见令人惊讶地大量的周质CRM197，而对于OmpF序列，在50μM诱导剂浓度下存在远远更小量的周质CRM197。

“简言之，将来自MOPS基本培养基-卡那霉素(MMM/Kan)-葡萄糖划线板的转化细菌的菌落形成单位重新悬浮在补充有0.2％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的3ml Korz基本培养基中并在37℃下温育过夜以产生起始培养物。将起始培养物用于接种125ml Erlenmeyer烧瓶中的20mlKorz/0.2％葡萄糖/Kan至OD600＝0.05并在37℃下生长1.5小时，然后改变为25℃直至OD₆₀₀为约0.3。此时，加入25μM、35μM或50μM浓度的诱导剂(IPTG)(晚期诱导)。然后使晚期诱导物在25℃下生长20小时并且收集2OD的培养物。使用BugBuster+Lysonase制备总细胞蛋白并且使用Epicentre周质化方法制备周质和原生质球部分。”

接着，在MDS69metab中与OmpF或YtfQ信号序列组合和在大肠杆菌B菌株(BL21DE3)中与OmpF组合，评估极晚期诱导(OD₆₀₀约2)对CRM197产率的影响。简言之，用转化MDS69metab或BL21DE3的菌落形成单位接种补充有0.2％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的3mlKorz基本培养基，在37℃下温育过夜并用于接种125ml Erlenmeyer烧瓶中补充有0.2％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的15ml Korz基本培养基，使其在25℃下生长过夜以产生25℃起始培养物。将所述起始培养物用于接种500mlErlenmeyer烧瓶中的90ml Korz/0.2％葡萄糖/卡那霉素至OD₆₀₀＝0.1，接着在25℃下生长直至OD₆₀₀＞2(饱和或接近饱和)，然后在125mlErlenmeyer烧瓶中分成4×20的等分试样以在多种IPTG浓度下诱导(极晚期诱导)。使诱导物在25℃下生长20小时，并且收集2OD的培养物用于分析。使用BugBuster+Lysonase制备总细胞蛋白(TCP)。使用Epicentre周质化方法制备周质和原生质球部分。如图23中所示，对于CRM197和OmpF信号序列的组合，直至100μM IPTG仍在MDS69metab中观测到良好周质表达，假定由于不溶性，其在200mM诱导剂浓度下降低。对于CRM197和YtfQ信号序列的组合，直至400μM IPTG(所测试的最高浓度)，仍在MDS69 metab中观测到良好周质表达，其中未观测到不溶性CRM197。对于CRM197和OmpF的组合，在所测试的所有诱导剂浓度(25-200μM)下，在BL21(DE3)菌株中观测到弱表达。在原生质球中未观测到CRM197。

总结-所呈现的数据证实，在简化基因组大肠杆菌宿主中产生可溶性CRM197提供了通过常规方法所获得产率10倍的产率。预期在简化基因组大肠杆菌宿主中的产生提高了效率并降低了制造成本。此外，在简化基因组大肠杆菌宿主中的产生相比于在具有非简化基因组的常规细菌中的产生也将更清洁和更安全。这些改进将对药物蛋白产品的生产具有广泛影响，并最终扩宽需要疫苗的高危人群对它们的利用。此外，与广泛多种信号序列组合，观测到CRM197的高产率。对于YtfQ信号序列与CRM197的组合所观测到的宽泛诱导范围是令人惊讶的，因为在B菌株大肠杆菌中，相比于K菌株大肠杆菌中，存在更大量的YtfQ，并且所示例的简化基因组菌株是基于K菌株。在简化基因组大肠杆菌中CRM197与YtfQ的组合的宽泛诱导范围是显著的优点，因为在蛋白质产生期间，诱导剂浓度可以改变，并且因此在这些宿主中使用YtfQ信号序列与CRM197的组合导致CRM197产率的进一步增加。

Claims

1.一种在简化基因组大肠杆菌宿主中产生重组CRM197的方法，其包括在适合所述重组CRM197蛋白的表达的条件下温育包含表达载体的简化基因组大肠杆菌，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的与引导所述CRM197蛋白转移至周质的信号序列融合的编码CRM197蛋白的核苷酸序列，由此获得产率为至少1克/升的可溶性CRM197，并且其中天然亲本大肠杆菌菌株是K12菌株，优选地是K12MG1655。

2.如权利要求1所述的方法，由此获得产率为至少2克/升、至少3克/升、至少4克/升或至少5克/升的可溶性CRM197。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述信号序列选自由OmpA、OmpF、MglB、MalE、OppA、RbsB、Agp、FkpA、YtfQ、HdeA、HdeB、OmpC和GlnH信号序列组成的群组。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述信号序列是OmpF或YtfQ。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述信号序列是YtfQ。

6.如权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌具有已进行遗传工程改造以相比于大肠杆菌菌株MG1655小约2％至约40％、优选地小约5％至约30％的基因组。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌已经至少从其缺失以下DNA区段：所述大肠杆菌K-12菌株MG1655的b0245-b0301、b0303-b0310、b1336-b1411、b4426-b4427、b2441-b2450、b2622-b2654、b2657-b2660、b4462、b1994-b2008、b4435、b3322-b3338、b2349-b2363、b1539-b1579、b4269-b4320、b2968-b2972、b2975-b2977、b2979-b2987、b4466-4468、b1137-b1172、b0537-b0565、b0016-b0022、b4412-b4413、b0577-b0582、b4415、b2389-b2390、b2392-b2395、b0358-b0368、b0370-b0380、b2856-b2863、b3042-b3048、b0656、b1325-b1333、b2030-b2062、b2190-b2192、b3215-b3219、b3504-b3505、b1070-b1083、b1878-b1894、b1917-b1950、b4324-b4342、b4345-b4358、b4486、b0497-b0502、b0700-b0706、b1456-b1462、b3481-b3484、b3592-b3596、b0981-b0988、b1021-b1029、b2080-b2096、b4438、b3440-b3445、b4451、b3556-b3558、b4455、b1786、b0150-b0153和b2945。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌已另外至少从其缺失以下DNA区段：所述大肠杆菌K-12菌株MG1655的b0315-b0331、b0333-b0341、b0346-b0354、b2481-b2492、b2219-b2230、b4500、b3707-b3723、b0644-b0650、b4079-4090、b4487、b4092-b4106、b0730-b0732、b3572-b3587、b1653、b2735-b2740、b2405-b2407、b3896-b3900、b1202、b4263-b4268、b0611、b2364-b2366、b0839、b0488-b0500和b0502。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌是菌株MDS42。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌是菌株MDS69。

11.如权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌包含功能性recA(b2699)基因。

12.如权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌包含在所述relA基因的编码序列的位置547或548处具有至少一个点突变的relA基因，其中所述突变选自以下中的一个或多个：位置547的G→A突变、位置547的G→T突变、位置548的C→G突变或位置548的C→T突变。

13.如权利要求1至12中的任一项所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌缺乏功能性polB(b0060)、dinB(b0231)和任选地umuDC(b1183-b1184)基因。

14.如权利要求1至13中的任一项所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌包含以下修饰：(i)缺失rph基因以增强乳清酸磷酸核糖基转移酶活性，(ii)在ilvG基因中引入补充天然-2移码突变的突变以产生活性乙酰羟酸合酶II和(iii)缺失iclR和arpA基因。

15.如权利要求1至14中的任一项所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌不包含插入序列。

16.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述CRM197核苷酸序列被优化以在所述大肠杆菌宿主细胞中表达。

17.如任何前述权利要求所述的方法，其包括

(a)使所述简化基因组大肠杆菌生长，和

(b)诱导CRM197的表达。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述方法是在发酵罐中进行的。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中步骤(a)包括在37℃下使所述简化基因组大肠杆菌生长至多19小时，接着在步骤(b)之前和之后在约20-30℃、优选地约25℃下生长。

20.如权利要求17至19中的任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)是在不包含血清、酵母提取物或其他动物副产品的生长培养基中进行的。

21.如权利要求18至21中的任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，pH范围为6.5至7.5。

22.如权利要求17至21中的任一项所述的方法，其中使用磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或组氨酸缓冲液来维持所述pH。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液。

24.如权利要求17至23中的任一项所述的方法，其中在步骤(b)中通过添加合适量的IPTG来诱导表达。

25.如权利要求18至24中的任一项所述的方法，其中在100至400、优选地200至275、更优选地230至250的OD₆₀₀下诱导表达。

26.如权利要求18至25中的任一项所述的方法，其中所述发酵罐含有0.5-50,000升的培养物。

27.如权利要求17至26中的任一项所述的方法，其包括另一个步骤(c)在不存在去垢剂的情况下机械破坏所培养的简化基因组大肠杆菌细胞并离心所得细胞裂解物以获得可溶性部分。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述机械破坏包括超声处理或微流体化。

29.如权利要求27或28所述的方法，其中通过一个或多个纯化步骤从所述可溶性部分纯化CRM197。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述一个或多个纯化步骤包括疏水相互作用色谱法和/或阴离子交换色谱法。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述纯化步骤包括疏水相互作用色谱法，接着是阴离子交换色谱法。

32.如权利要求1所述的方法，其中所述编码CRM197蛋白的核苷酸序列不与编码信号序列的核苷酸序列融合，由此获得产率为约2克/升至约20克/升的不溶性CRM197。

33.如权利要求32所述的方法，其中对所述不溶性CRM197进行一个或多个增溶步骤。

34.如权利要求1所述的方法，其中所述编码CRM197蛋白的核苷酸序列与ompF或ytfQ信号序列融合并且其中所述简化基因组大肠杆菌宿主包含以下修饰：(i)以下DNA区段的缺失：所述大肠杆菌K-12菌株MG1655的b0245-b0301、b0303-b0310、b1336-b1411、b4426-b4427、b2441-b2450、b2622-b2654、b2657-b2660、b4462、b1994-b2008、b4435、b3322-b3338、b2349-b2363、b1539-b1579、b4269-b4320、b2968-b2972、b2975-b2977、b2979-b2987、b4466-4468、b1137-b1172、b0537-b0565、b0016-b0022、b4412-b4413、b0577-b0582、b4415、b2389-b2390、b2392-b2395、b0358-b0368、b0370-b0380、b2856-b2863、b3042-b3048、b0656、b1325-b1333、b2030-b2062、b2190-b2192、b3215-b3219、b3504-b3505、b1070-b1083、b1878-b1894、b1917-b1950、b4324-b4342、b4345-b4358、b4486、b0497-b0502、b0700-b0706、b1456-b1462、b3481-b3484、b3592-b3596、b0981-b0988、b1021-b1029、b2080-b2096、b4438、b3440-b3445、b4451、b3556-b3558、b4455、b1786、b0150-b0153和b2945，(ii)缺失rph基因以增强乳清酸磷酸核糖基转移酶活性，(iii)在ilvG基因中引入补充天然-2移码突变的突变以产生活性乙酰羟酸合酶II和(iv)缺失iclR和arpA基因；

由此获得产率为至少1克/升、优选地至少2克/升的可溶性CRM197。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述简化基因组大肠杆菌宿主已另外至少从其缺失以下DNA区段：所述大肠杆菌K-12菌株MG1655的b0315-b0331、b0333-b0341、b0346-b0354、b2481-b2492、b2219-b2230、b4500、b3707-b3723、b0644-b0650、b4079-4090、b4487、b4092-b4106、b0730-b0732、b3572-b3587、b1653、b2735-b2740、b2405-b2407、b3896-b3900、b1202、b4263-b4268、b0611、b2364-b2366、b0839、b0488-b0500和b0502。

36.一种包含表达载体的简化基因组大肠杆菌宿主，所述表达载体包含如下核酸序列，所述核酸序列包含编码具有能够引导CRM197运输至大肠杆菌周质的氨基酸序列的多肽的5′信号序列部分和编码缺乏其天然信号序列的CRM197蛋白的3′CRM197部分。