CN102639558A - 表达系统 - Google Patents

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Abstract

本文提供与毒素的周质表达相关的组合物和方法，所述毒素包括白喉毒素或CRM197。

Description

表达系统
说明书
本发明涉及细菌毒素尤其是白喉毒素(包括白喉毒素的突变体形式，例如CRM197)的表达领域，并包括适合于表达和制备这样的毒素的大批培养物的方法。本发明还提供可在本发明的方法期间使用或产生的新的多核苷酸和多肽。
白喉毒素是由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)产生的蛋白外毒素。它作为包含信号序列(tox信号序列)的单一多肽产生，该信号序列在蛋白分泌时由细菌移除。
由于在残基190、192或193处的切割，白喉毒素易于被剪接而形成由二硫键连接的两个亚基，片段A和片段B (Moskaug 等 Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989)。片段A是催化活性部分并为依赖NAD的ADP核糖基转移酶，其特异性靶向蛋白合成因子EF-2，从而使EF-2失活并在细胞中关闭蛋白合成。
对细菌毒素(例如白喉毒素)的免疫性可在感染期间天然获得，或通过注射解毒形式的毒素(类毒素)人工获得(Germanier, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984)。传统上通过化学修饰天然毒素制备类毒素(Lingood 等 Brit.J. Exp. Path. 44; 177, 1963)，使其无毒同时保留抗原性，保护接种动物免受天然毒素的随后攻击。备选地，一些具有减少毒性的突变白喉毒素已被描述(US4709017, US4950740)。
CRM197是一种无毒形式的白喉毒素，但与白喉毒素免疫学上无法区分。通过不产毒的噬菌体β197tox- (通过亚硝基胍诱变产毒carynephage b而产生)感染白喉棒状杆菌产生CRM197 (Uchida 等 Nature New Biology (1971) 233; 8-11)。CRM197蛋白与白喉毒素具有相同的分子量，但与它的不同在于结构基因中的单碱基改变。这导致在位置52上的氨基酸从甘氨酸变成谷氨酰胺，其使得片段A不能与NAD结合，并因此无毒(Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology 1983年9月 第560-564页)。
白喉类毒素和具有减少毒性的突变体形式CRM197是许多提供抗白喉棒状杆菌免疫性的疫苗中的组分。一些联合疫苗是已知的，其可预防百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌，并任选预防乙肝病毒和/或乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b) (参见，例如WO 93/24148和WO 97/00697，WO 02/055105)。
白喉毒素和包括CRM197在内的突变体形式也作为对糖安全和有效的T细胞依赖载体用于疫苗中。CRM197目前用于乙型流感嗜血杆菌寡糖CRM197缀合物疫苗(HibTitre®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.)中。
用于制备白喉类毒素(DT)的方法在本领域是公知的。例如，DT可通过从白喉棒状杆菌的培养物中纯化毒素后化学解毒而产生，或者可通过纯化毒素的重组体或遗传学上解毒的类似物来制备(例如，如US4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827和US 5,917,017中所述的CRM197或其他突变体)。
由于低蛋白丰度，阻碍了产生显著量的用于疫苗中的白喉毒素(例如CRM197)。之前通过在大肠杆菌中表达CRM197时已发现该问题(Bishai 等 J Bacteriol. 169:5140-5151)，Bishai等描述含有白喉毒素(包含tox信号序列)的重组融合蛋白的表达，这导致降解蛋白的产生。
克隆含有tox信号序列的白喉片段并将这些序列在大肠杆菌中表达牵涉某些困难。表达的蛋白被分泌到周质间隙中，而该分泌与宿主细胞的降低的生存力(O’Keefe 等 Proc. Natl. Acad. Sci. 86:343-346)和重组蛋白增加的蛋白酶解(Bishai 等 J Bacteriol. 169: 5140-5151)相关。因为这些原因，已建议移除tox信号序列以便不再周质表达，这可增加白喉类毒素的表达(Bishai 等)。
因此，本申请提供一种用于通过周质表达制备细菌毒素的改进方法，其包括以下步骤：a) 培养包含其中特定信号序列与细菌毒素的序列连接的表达载体的细菌宿主细胞的培养物，和b) 诱导包含与细菌毒素连接的特定信号序列的多肽表达，使得周质表达细菌毒素。本申请还提供在本发明的方法中使用的多核苷酸。
在周质中产生细菌毒素比胞质产生可具有一种或多种优势。
(1) 在切割信号肽后，蛋白以其成熟形式产生，和/或
(2) 大肠杆菌的周质是氧化环境，其允许形成二硫键，这可帮助产生可溶性、正确折叠的蛋白，和/或；
(3) 大肠杆菌的周质与胞质相比含有更少的蛋白酶，这可帮助避免蛋白酶剪切表达的蛋白，和/或；
(4) 周质还含有较少的蛋白，这允许获得更纯的重组蛋白。
发明概述
在本发明的第一方面，提供一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中；
(a) 5’信号序列部分编码具有能够指导异源蛋白转运至细菌周质的氨基酸序列的异源多肽；和
(b) 3’毒素部分编码具有与编码至少15个氨基酸和/或至少一个B或T细胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中
(a) 5’信号序列部分编码具有能够指导异源蛋白转运至细菌周质的氨基酸序列的异源多肽，且其中5’信号序列部分不是来源于白喉棒状杆菌；和
(b) 3’毒素部分编码具有与编码至少15个氨基酸和/或至少一个B或T细胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。
在本发明的第三方面，提供一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中5’信号部分序列编码具有以下的氨基酸序列的信号肽：
(a) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26；
(b) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的变体，该变体与相应的序列的不同在于1、2或3个点突变、氨基酸插入或氨基酸缺失，该变体能够将表达的蛋白导向周质；或
(c) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的至少10个氨基酸的片段，其能够将表达的蛋白导向周质。
且3’毒素部分编码细菌毒素或者其片段或变体。
在本发明的第四方面，提供一种包含与诱导型启动子连接的本发明的多核苷酸的载体。
在本发明的第五方面，提供一种包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。
在本发明的第六方面，提供由本发明的多核苷酸编码的多肽。
在本发明的第七方面，提供一种用于制备细菌毒素的方法，其包括以下步骤：a) 培养本发明细菌宿主细胞的培养物，和b) 诱导多肽的表达使得周质表达细菌类毒素。
在本发明的第八方面，提供一种用于制备缀合物的方法，其包括以下步骤：a) 使用本发明的方法制备细菌毒素，和b) 将步骤a)的细菌毒素与抗原缀合。
在本发明的第九方面，提供一种用于制造疫苗的方法，其包括以下步骤：a) 使用本发明的方法制备细菌毒素或缀合物，和b) 将细菌毒素或其缀合物与药学上可接受的赋形剂混合。
附图说明
图1 – 产生CRM197-信号序列构建体的克隆方法概述。通过NdeI和SacI消化，将编码与CRM197的N端融合的信号序列的DNA部分从质粒A上切下。通过AatII和XhoI消化，将CRM197 SEQ ID NO: 31的C端序列从质粒B上切下。通过NdeI、SacI、AatII和XhoI消化并使用DNA连接酶连接，将这两条序列剪接到pET26b载体中。通过用AgeI和NdeI消化包含信号序列的质粒和pRIT16668载体并使用DNA连接酶将它们剪接在一起，将所产生的载体(pRIT16668)用于产生其他信号序列-CRM197构建体。
图2 – 产生含有无N端信号序列的CRM197序列的构建体(pRIT16669)的克隆方法概述。这是通过使用NdeI和AatII消化后连接，将编码CRM197的PCR片段插入到pRIT16668中而完成。
图3 – 产生包含FlgI信号序列的构建体的克隆方法概述。这是通过使用NdeI和AatII消化后连接，将编码CRM197的PCR片段和FlgI信号序列(SEQ ID NO: 23)插入到pRIT16669中而完成。这产生了质粒pRIT16681。
图4 –显示在30℃在三种不同菌株中用IPTG处理后诱导DsbA-CRM197 3小时的凝胶。使用Novex TG 10-20%凝胶。图A凝胶是蛋白质印记，使用抗-DTPa和抗-小鼠NBT-BCIP染色。图B凝胶使用考马斯蓝染色。泳道1包含分子量标志物，泳道2包含未被诱导的BLR(DE3)菌株，泳道3包含已被诱导的BLR(DE3)菌株，泳道4包含未被诱导的B834 (DE3)菌株，泳道5包含已被诱导的B384 (DE3)菌株和泳道6包含已被诱导的HMS174(DE3)菌株。
图5 –显示CRM-197在细菌细胞中和在培养基中表达的凝胶。图B凝胶显示蛋白质印迹，使用抗-DTPa和抗-小鼠NBT-BCIP染色。图A使用考马斯蓝染色。各泳道的内容物述于下表：
Figure 711873DEST_PATH_IMAGE001
表 1
图6 –显示在30℃在三种不同菌株中诱导DsbA-CRM197 3小时的凝胶。使用Novex TG 10-20%凝胶。图A是蛋白质印记，使用抗-DTPa和抗-小鼠NBT-BCIP染色。图B使用考马斯蓝染色。泳道1包含分子量标志物，泳道2包含未被诱导的BLR(DE3)菌株，泳道3包含已被诱导的BLR(DE3)菌株，泳道4包含来自已被诱导的BLR(DE3)菌株的可溶性部分，泳道5包含来自已被诱导的BLR(DE3)菌株的不溶性部分，泳道6包含未被诱导的B834(DE3)菌株，泳道7包含诱导的B834(DE3)可溶性部分和泳道8包含诱导的B834(DE3)不溶性部分。
图7 – 比较在诱导阶段加入或不加入1M磷酸钾缓冲液至100mM的浓度的条件下优化FlgI构建体的表达的凝胶。使用Novex TG 10-20%凝胶。泳道1包含分子量标志物，泳道2包含从诱导(在30℃诱导)起0分钟的细胞提取物，泳道3包含从诱导(在30℃诱导)起2小时的细胞提取物，泳道4包含从诱导(在30℃诱导)起4小时的细胞提取物，泳道5包含在30℃诱导过夜后的细胞提取物，泳道6包含在30℃诱导后4小时后的培养基，泳道7包含在30℃过夜诱导后的培养基，泳道8包含从诱导(在23℃诱导)起两小时的细胞提取物，泳道9包含从诱导(在23℃诱导)起4小时的细胞提取物，泳道10包含过夜诱导后的细胞提取物，泳道11包含从诱导(在23℃诱导)起4小时的培养基和泳道12包含过夜诱导(在23℃诱导)后的培养基。
图 8 – 发酵概况的绘图，其中在20L规模补料分批发酵期间监控过程参数。第1条线描述加入的基质量(克)，第2条线描述pH，第3条线描述搅拌速度(rpm)，第4条线描述pO2 (%)，第5条线描述温度(℃)和第6条线描述加入的碱量(g)。
图9 – 本发明的多肽和多核苷酸的序列表。
图10 –在诱导期间周质和细胞相关部分中CRM197的产生作为补料速度和pH的函数的绘图，在pH 6.8进行培养。左图显示周质CRM197产生。右图描述细胞相关的CRM197产生。
发明详述
定义
术语“多核苷酸”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为包括单链和双链区/形式的未修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
术语多肽指包含至少10个氨基酸的任何肽。
本文使用的术语“编码肽的多核苷酸”包括包含编码本发明的肽或多肽的序列的多核苷酸。该术语还包括包含编码肽或多肽的单一连续区或不连续区(例如，被整合的噬菌体整合的插入序列、整合的载体序列、整合的转座子序列中断或者由于RNA编辑或基因组DNA再组织而中断的多核苷酸)以及也可包含编码和/或非编码序列另外的区的多核苷酸。
多核苷酸“5’信号序列部分的变体”是编码与相应的野生型信号序列相比含有1、2、3、4或5个氨基酸置换、氨基酸添加或氨基酸缺失突变的信号序列的多核苷酸序列。
“氨基酸缺失”是从蛋白的氨基酸序列中移除一个氨基酸。
“氨基酸添加”是从蛋白的氨基酸序列中添加一个氨基酸。
“氨基酸置换”是在蛋白的序列中用一个氨基酸置换另一个氨基酸。
多核苷酸“3’毒素部分的变体”是编码与毒素多肽具有80%、85%、90%、95%、98%或100%同一性的多肽序列的多核苷酸序列。关于同一性的定义在下文给出。
一般来说，“变体”任选是通过保守氨基酸置换(由此一个残基被具有类似特性的另一残基置换)而不同于参照物的多肽。通常这样的置换在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；和碱性残基Lys和Arg之间；或芳香族残基Phe和Tyr之间。
“5’信号序列部分的片段”是编码信号肽的至少10、15或20个氨基酸的序列。
“3’毒素部分的片段”是编码毒素多肽的至少5、10、15、20、30、40、50、100或200个氨基酸的连续部分的序列，其任选具有免疫原性活性。具有“免疫原性活性”的肽或 “免疫原性的”肽能够(如有必要，当与载体偶联时)引起识别相应毒素的免疫应答。优选的片段是编码B细胞或T细胞表位的那些多核苷酸，和包含所述多核苷酸片段的重组多核苷酸。任选地，这些毒素的片段是免疫原性片段。
本领域已知的“同一性”是两条以上多肽序列，或者两条以上多核苷酸序列之间的关系，视情况而定，通过比较序列所确定。在本领域中，“同一性”还意指多肽或多核苷酸序列之间序列关联性的程度，视情况而定，由这样的序列串间的匹配所确定。“同一性”可通过已知的方法容易地计算，方法包括但不限于描述于以下的那些：(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., 主编, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., 主编, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, 第一部分, Griffin, A.M., 和 Griffin, H.G., 主编, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; 和 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 和 Devereux, J., 主编, M Stockton Press, New York, 1991; 和 Carillo, H., 和 Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)。设计确定同一性的方法来给出所测试的序列间最大的匹配。此外，确定同一性的方法汇编于公众可得的计算机程序中。测定两条序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux, J., 等, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTN (Altschul, S.F. 等, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)和FASTA (Pearson 和 Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)。BLAST家族的程序是从NCBI和其他来源公众可得的(BLAST Manual, Altschul, S., 等, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., 等, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)。公知的Smith Waterman算法亦可用于确定同一性。
用于多肽序列比较的参数包括下述：
算法：Needleman 和 Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比较矩阵：BLOSSUM62，来自Henikoff和Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)
空位罚分：8
空位长度罚分：2
可与这些参数一起使用的程序作为来自Genetics Computer Group, Madison WI的“gap (空位)”程序是公众可得的。上述参数是用于肽比较的默认参数(连同末端空位无罚分)。
用于多核苷酸比较的参数包括下述：
算法：Needleman 和 Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比较矩阵：匹配 = +10, 不匹配 = 0
空位罚分：50
空位长度罚分：3
作为来自Genetics Computer Group, Madison WI的“空位”程序可得。这些是用于核酸比较的默认参数。
术语“信号肽”或“信号多肽”指能够将表达的蛋白导向周质的肽。
术语“细菌毒素”包括毒素和类毒素两者。
术语“类毒素”描述例如通过引入点突变、缺失或插入而部分或完全灭活的毒素。
发明人预期在所有情况下本文的术语“包括”和“包含”可任选分别用术语“由…组成”替换。
术语异源蛋白指对于其中它被表达的细胞类型不是天然的蛋白。类似地，术语“异源多肽”指对于其中它被表达的细胞类型不是天然的多肽。
术语“不是来源于白喉棒状杆菌的多肽”指序列与天然(非重组)白喉棒状杆菌中发现的多肽不同的多肽。
本发明的多核苷酸
本发明的一个方面涉及编码周质表达的毒素的多核苷酸。
一般来说，在蛋白上存在信号序列促进蛋白到周质中的转运(原核宿主)或蛋白的分泌(真核宿主)。在原核宿主中，信号序列指导新生蛋白跨过内膜到周质间隙中；然后信号序列被切割。如果当它与目标多肽连接时，那么信号序列能够将表达的蛋白导向周质，在多肽在革兰氏阴性细菌中翻译期间，与不存在信号序列相比，在革兰氏阴性细菌的周质中发现更多的所述多肽。在一个实施方案中，当在革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)中表达时，至少50、60、70、80、90或100%的目标多肽被导向周质。
测试信号序列是否能够指导周质表达的测定可使用报道蛋白进行。例如，可在绿色荧光蛋白基因的上游剪接周质信号序列，该蛋白可在本发明的宿主细胞中表达。显微镜可用于判定绿色荧光蛋白在胞质和周质中的比较水平。
如果在实质量的多肽链的合成之前转运发生，那么蛋白或肽是共翻译转运的。SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26编码能够将表达的蛋白通过共翻译转运导向周质的肽，然而SEQ ID NO: 6和8编码能够将表达的蛋白通过翻译后转运导向周质的肽。
在一个实施方案中，提供一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸(例如，用于毒素在细菌细胞中的表达)，其中
(a) 5’信号序列部分编码具有能够指导异源(毒素)蛋白转运至细菌周质的氨基酸序列的异源(信号)多肽；和
(b) 3’毒素部分编码具有与编码至少15个(连续)氨基酸和/或至少一个B或T细胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段(其可为免疫原性的)有至少75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。
在另一个实施方案中，提供一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸(用于多肽在细菌细胞中的表达)，其中
(a) 5’信号序列部分编码具有能够指导异源蛋白转运至细菌周质的氨基酸序列的多肽，且其中5’信号序列部分不是来源于白喉棒状杆菌；和
(b) 3’毒素部分编码具有与编码至少15个氨基酸和/或至少一个B或T细胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，5’信号序列不是来自白喉棒状杆菌的tox信号序列。
鉴定B和T细胞表位在技术人员的能力内。通过2D结构预测可鉴定B细胞表位，例如使用PSIPRED程序(来自David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK) (图4)。基于由Jameson 和 Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988])所述的方法计算抗原性指数(antigenic index)。在该程序中使用的参数是抗原性指数和抗原性肽的最小长度。对于最少5个连续氨基酸，抗原性指数0.9在该程序中用作阈值。可例如通过由Sturniolo等(Nature Biotech. 17: 555-561 [1999])所述的tepitope方法鉴定T细胞表位。
为了清楚，词组“具有能够指导异源蛋白转运至细菌周质的氨基酸序列”和“具有能够指导转运异源蛋白至细菌周质的氨基酸序列”意思相同。
在另一实施方案中，该多核苷酸可编码具有能够指导异源蛋白共翻译转运至细菌周质的氨基酸序列的多肽。
任选地，3’毒素部分编码SEQ ID NO: 32。任选地，3’毒素部分编码DT。任选地，3’毒素部分包含SEQ ID NO: 31。
任选地，5’信号序列部分编码SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种，或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种，或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 2、4或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、10或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、10或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 18、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 18、22或24中的任一种。
在另一实施方案中，5’信号序列部分编码(变体包含)以下序列的1、2或3个点突变、插入或缺失：SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种，或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种，或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 2、4或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、10或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、10或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 18、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 18、22或24中的任一种。
在另一实施方案中，5’信号序列部分编码以下序列的至少10、12、15、18或20个氨基酸的片段：SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种，或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 2、4或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、10或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 2、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、10或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 4、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、12或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 10、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、14或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 12、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、16或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 14、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、18或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 16、22或24中的任一种，或SEQ ID NO: 18、20或24中的任一种，或SEQ ID NO: 18、22或24中的任一种，该片段能够指导蛋白转运至细菌周质。
在本发明的另一方面，提供包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多肽，其中5’信号部分序列编码具有以下的氨基酸序列的信号肽：
(a) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24；或SEQ ID NO: 24；SEQ ID NO: 2、4或24；或SEQ ID NO: 2、10或24；或SEQ ID NO: 2、12或24；或SEQ ID NO: 2、14或24；或SEQ ID NO: 4、10或24；或SEQ ID NO: 4、12或24；或SEQ ID NO: 4、16或24；或SEQ ID NO: 4、18或24；或SEQ ID NO: 4、20或24；或SEQ ID NO: 4、22或24；或SEQ ID NO: 10、12或24；或SEQ ID NO: 10、14或24；或SEQ ID NO: 10、16或24；或SEQ ID NO: 10、18或24；或SEQ ID NO: 10、22或24；或SEQ ID NO: 12、14或24；或SEQ ID NO: 12、16或24；或SEQ ID NO: 12、18或24；或SEQ ID NO: 12、20或24；或SEQ ID NO: 12、22或24；或SEQ ID NO: 14、16或24；或SEQ ID NO: 14、18或24；或SEQ ID NO: 14、20或24；或SEQ ID NO: 14、22或24；或SEQ ID NO: 16、18或24；或SEQ ID NO: 16、20或24；或SEQ ID NO: 16、22或24；或SEQ ID NO: 18、20或24；或SEQ ID NO: 18、22或24中的任一种。
(b) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24；或SEQ ID NO: 24；SEQ ID NO: 2、4或24；或SEQ ID NO: 2、10或24；或SEQ ID NO: 2、12或24；或SEQ ID NO: 2、14或24；或SEQ ID NO: 4、10或24；或SEQ ID NO: 4、12或24；或SEQ ID NO: 4、16或24；或SEQ ID NO: 4、18或24；或SEQ ID NO: 4、20或24；或SEQ ID NO: 4、22或24；或SEQ ID NO: 10、12或24；或SEQ ID NO: 10、14或24；或SEQ ID NO: 10、16或24；或SEQ ID NO: 10、18或24；或SEQ ID NO: 10、22或24；或SEQ ID NO: 12、14或24；或SEQ ID NO: 12、16或24；或SEQ ID NO: 12、18或24；或SEQ ID NO: 12、20或24；或SEQ ID NO: 12、22或24；或SEQ ID NO: 14、16或24；或SEQ ID NO: 14、18或24；或SEQ ID NO: 14、20或24；或SEQ ID NO: 14、22或24；或SEQ ID NO: 16、18或24；或SEQ ID NO: 16、20或24；或SEQ ID NO: 16、22或24；或SEQ ID NO: 18、20或24；或SEQ ID NO: 18、22或24中的任一种(的变体)，其与相应的序列的不同在于1、2或3个点突变、氨基酸插入或氨基酸缺失，能够将表达的蛋白导向周质；或
(c) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24；或SEQ ID NO: 24；SEQ ID NO: 2、4或24；或SEQ ID NO: 2、10或24；或SEQ ID NO: 2、12或24；或SEQ ID NO: 2、14或24；或SEQ ID NO: 4、10或24；或SEQ ID NO: 4、12或24；或SEQ ID NO: 4、16或24；或SEQ ID NO: 4、18或24；或SEQ ID NO: 4、20或24；或SEQ ID NO: 4、22或24；或SEQ ID NO: 10、12或24；或SEQ ID NO: 10、14或24；或SEQ ID NO: 10、16或24；或SEQ ID NO: 10、18或24；或SEQ ID NO: 10、22或24；或SEQ ID NO: 12、14或24；或SEQ ID NO: 12、16或24；或SEQ ID NO: 12、18或24；或SEQ ID NO: 12、20或24；或SEQ ID NO: 12、22或24；或SEQ ID NO: 14、16或24；或SEQ ID NO: 14、18或24；或SEQ ID NO: 14、20或24；或SEQ ID NO: 14、22或24；或SEQ ID NO: 16、18或24；或SEQ ID NO: 16、20或24；或SEQ ID NO: 16、22或24；或SEQ ID NO: 18、20或24；或SEQ ID NO: 18、22或24中的任一种的至少10个氨基酸的片段，该片段能够将表达的蛋白导向周质；
且3’毒素部分编码细菌毒素或者其片段或变体。
本发明另外提供包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中5’信号部分序列编码具有以下的氨基酸序列的信号肽：
(d) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26；
(e) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的变体，该变体与相应的序列的不同在于1、2或3个点突变、氨基酸插入或氨基酸缺失，该变体能够将表达的蛋白导向周质；或
(f) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的至少10个氨基酸的片段，该片段能够将表达的蛋白导向周质；
且3’毒素部分编码细菌毒素或者其片段或变体。
在一个实施方案中，本发明多核苷酸的5’信号序列部分编码SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的至少一种。在另一实施方案中，本发明多核苷酸的5’信号序列部分编码SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的至少一种。在一个实施方案中，本发明多核苷酸的5’信号序列部分编码以下序列中的至少一种：SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26；或SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24；或SEQ ID NO: 24，SEQ ID NO: 2、4或24；或SEQ ID NO: 2、10或24；或SEQ ID NO: 2、12或24；或SEQ ID NO: 2、14或24；或SEQ ID NO: 4、10或24；或SEQ ID NO: 4、12或24；或SEQ ID NO: 4、16或24；或SEQ ID NO: 4、18或24；或SEQ ID NO: 4、20或24；或SEQ ID NO: 4、22或24；或SEQ ID NO: 10、12或24；或SEQ ID NO: 10、14或24；或SEQ ID NO: 10、16或24；或SEQ ID NO: 10、18或24；或SEQ ID NO: 10、22或24；或SEQ ID NO: 12、14或24；或SEQ ID NO: 12、16或24；或SEQ ID NO: 12、18或24；或SEQ ID NO: 12、20或24；或SEQ ID NO: 12、22或24；或SEQ ID NO: 14、16或24；或SEQ ID NO: 14、18或24；或SEQ ID NO: 14、20或24；或SEQ ID NO: 14、22或24；或SEQ ID NO: 16、18或24；或SEQ ID NO: 16、20或24；或SEQ ID NO: 16、22或24；或SEQ ID NO: 18、20或24；或SEQ ID NO: 18、22或24中的任一种。由SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26编码的核苷酸序列可与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25的相应的多核苷酸序列相同。备选地，它可为由于遗传密码冗余(简并)而同样编码SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的多肽的任何序列。备选地，多核苷酸可包含编码SEQ ID NO: 33-45的部分。
本发明的多核苷酸还可包含编码SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的变体的5’信号序列部分，其能够将蛋白导向周质。
本发明还提供包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的片段的5’信号序列。本发明的片段由来自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的至少10、15或20个氨基酸的连续部分组成。在一个实施方案中，该片段导致至少50、60、70、90、90或100%的编码毒素的多肽被转运至周质。在另一实施方案中，该片段与包含来自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的相应氨基酸序列的多肽具有相同或实质上相同的周质转运性质。在另一实施方案中，该片段能够指导多肽共翻译转运至周质。
3’毒素部分编码任何细菌毒素。在一个实施方案中，被编码的细菌毒素是白喉、破伤风、百日咳或肺炎球菌溶血素毒素。
在一个实施方案中，3’毒素部分编码细菌类毒素，例如白喉类毒素或CRM197。任选地，3’毒素部分编码SEQ ID NO: 32中所述的氨基酸序列。在另一实施方案中，3’毒素部分包含SEQ ID NO: 31的核苷酸序列。在一个实施方案中，多肽编码SEQ ID NO: 33-45。
备选地，3’部分可编码上述毒素或类毒素的至少10、15、25、35、50、100、150个氨基酸的任何片段，或编码与上述毒素或类毒素具有80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同源性的变体。
任选地，5’信号序列部分直接为3’毒素部分的5’。备选地，它们被至少3、6、9、12、21、51、99、300或1000个另外的核苷酸分开。例如，这些核苷酸可编码一个或多个至少10、20、30、50、100、200或500个氨基酸的另外的肽序列。
此外，对于本发明的每个多核苷酸，提供与其互补的多核苷酸。优选这些互补多核苷酸和与其互补的各多核苷酸完全互补。
本发明还预期任何编码较大蛋白(例如前体或融合蛋白)的序列内的多核苷酸的表达。包括另外的氨基酸序列经常是有利的，另外的氨基酸序列含有分泌或前导序列、前序列(prosequence)、帮助纯化的序列(例如多组氨酸残基)或用于重组生产期间稳定性的另外序列。此外，还考虑了加入外源多肽或脂质尾或多核苷酸序列来增加最终分子的免疫原性潜能。
在一个实施方案中，5’信号序列部分不是白喉棒状杆菌的tox信号序列。
本发明的多肽
本发明还提供由本发明的多核苷酸编码的多肽。另外提供这些多肽的片段和变体。
本发明包括编码多肽的本发明的多核苷酸。
本发明还包括这些多肽的片段。该片段包含来自5’信号序列部分和3’毒素部分两者的区段。在另一实施方案中，这些片段包含信号肽的至少10、15或20个氨基酸。在一个实施方案中，这些片段包含来自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26或SEQ ID NO: 33-45的至少10、15或20个氨基酸。
在一个实施方案中，当在革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)中表达时，这些片段至少50%、60%、70%、80%、90%或100%被导向周质。
本发明还包括包含本发明的多肽或多肽片段的融合蛋白。
本发明的多肽或免疫原性片段可为较大蛋白(例如前体或融合蛋白)的一部分。包括另外的氨基酸序列经常是有利的，另外的氨基酸序列含有帮助纯化的序列(例如多组氨酸残基)或用于重组生产期间稳定性的另外序列。此外，还考虑了加入外源多肽或脂质尾或多核苷酸序列来增加最终分子的免疫原性潜能。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体、用本发明载体的基因工程宿主细胞和通过重组技术产生本发明的多肽。使用来源于本发明DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可用于产生这样的蛋白。
本发明的重组多肽可通过对本领域技术人员公知的方法从包含表达系统的基因工程宿主细胞中制备。因此，在另一方面，本发明涉及包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达系统，涉及具有这样的表达系统的基因工程宿主细胞，并涉及通过重组技术产生本发明的多肽。在本发明的另一方面，本发明涉及与诱导型启动子连接的本发明的多核苷酸，使得当诱导启动子时，表达由多核苷酸编码的多肽。本发明的另一方面包含所述载体，其中通过加入足够量的IPTG激活诱导型启动子。任选地，其浓度为0.1-10mM、0.1-5mM、0.1-2.5mM、0.2-10mM、0.2-5mM、0.2-2.5mM、0.4-10mM、1-10mM、1-5mM、2.5-10mM、2.5-5mM、5-10mM。
为了重组产生本发明的多肽，宿主细胞可被基因工程化以整合表达系统或其部分或者本发明的多核苷酸。将多核苷酸导入到宿主细胞中可通过许多标准实验室手册(例如Davis, 等, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) 和 Sambrook, 等, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))中所述的方法实现，例如，磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导的转染、转介、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、缀合、转导、划痕标记(scrape loading)、射击导入(ballistic introduction)和感染。
合适宿主的代表性实例包括革兰氏阴性细菌细胞，例如大肠杆菌、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、博德特氏菌属(Bordetella)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、蓝细菌属(Cyanobacteria)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、弗朗西斯氏菌属(Franciscella)、螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、变形菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏杆菌属(Shigella)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)的细胞。在本发明的另一方面，宿主细胞是大肠杆菌细胞。
许多不同种类的表达系统可用于产生本发明的多肽。在一个实施方案中，载体来源于细菌质粒。通常，适合在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或载体就这一点而言可用于表达。合适的DNA序列可通过多种公知和常规技术中的任一种插入到表达系统中，例如在Sambrook等, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (同上)中提及的那些技术。
发酵
在本发明的另一方面，提供一种用于制备细菌毒素的方法，其包括以下步骤：a)培养本发明细菌宿主细胞的培养物，和b)诱导多肽的表达使得周质表达细菌类毒素。
在本发明的另一实施方案中，提供一种用于周质表达重组多肽的方法，其通过
A. 培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物；和
B. 诱导多肽的表达使得周质表达蛋白；
其中一种或多种下述步骤在表达期间进行：
i. 步骤a)的pH低于步骤b)的pH；
ii. 步骤a)的温度高于步骤b)的温度；或
iii. 步骤a)的基质补料速度高于步骤b)的基质补料速度。
在一个实施方案中，进行步骤i、步骤ii、步骤iii、步骤i和步骤ii、步骤i和步骤iii、步骤ii和步骤iii，或步骤i、步骤ii和步骤iii。在另一实施方案中，表达本发明的多核苷酸。
当将诱导剂(例如IPTG)加入到宿主细胞的培养物中时，诱导多肽表达，引起增加速率的多肽表达。
在一个实施方案中，步骤a)的pH与步骤b)的pH相同，在第二个实施方案中，步骤a)的pH低于步骤b)的pH，即使得步骤b)的pH高于步骤a)的pH。
本领域的技术人员将认识到如何实现步骤a)和步骤b)之间的改变。步骤a)和步骤b)之间条件(例如，pH、温度或基质补料速度)方面的改变意指，步骤a)或步骤b)期间的一般平均条件如报道，并且如果没有其他干预，则可被估定，例如仅诱导前(例如5秒、15秒、30秒、1分钟、15分钟、30分钟或1小时) (步骤a)或仅诱导后(例如5秒、15秒、30秒、1分钟、15分钟、30分钟或1小时) (步骤b)。很明显发明人还设想，改变发酵条件的干预可在诱导稍前或稍后发生以实现相同的技术效果，但在这种情形下，步骤a)或步骤b)期间的一般或平均条件将同样如本文所揭露地改变。
在另一实施方案中，步骤a)的pH在5.0-7.0、5.0-6.0、6.0-7.0或6.5-7.0的范围内。
在一个实施方案中，在步骤b)中维持pH。在一个实施方案中，维持pH高于pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0或在6.5-10.0、6.5-9.5、6.5-9.0、6.5-8.5、6.5-7.5、6.5-7.0、7.0-10.0、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.0-7.5、7.5-10.0、7.5-9.5、7.5-9.0、7.5-8.5、7.5-8.0、8.0-10.0、8.0-9.5、8.0-9.0、8.0-8.5、8.5-10.0、8.5-9.5、8.0-9.0、8.0-8.5、8.5-10.0、8.5-9.5、8.5-9.0、9.0-10.0、9.0-9.5或9.5-10.0之间。在另一实施方案中，使用选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和组氨酸缓冲液的缓冲液维持pH。任选地，缓冲液的浓度是10-200mM、50-100mM、100-200mM、10-50mM或50-150mM。任选地，缓冲液是80-120mM、80-100mM或100mM的磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，步骤b)中的pH高出步骤a)中的pH至少、精确或大约2.0、1.5、1.0、0.5、0.3、0.2或0.1个pH单位。
在一个实施方案中，本发明的方法在发酵罐中进行。在一个实施方案中，增加pH使得步骤b)中的pH高于步骤a)的pH。任选地，该pH的增加通过加入碱(例如氢氧化钠或氨)而实现。
在另一实施方案中，通过在步骤b)期间加入碱(例如氢氧化钠或氨)维持步骤(b)的pH在6.5-10.0、6.5-9.5、6.5-9.0、6.5-8.5、6.5-7.5、6.5-7.0、7.0-10.0、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.0-7.5、7.5-10.0、7.5-9.5、7.5-9.0、7.5-8.5、7.5-8.0、8.0-10.0、8.0-9.5、8.0-9.0、8.0-8.5、8.5-10.0、8.5-9.5、8.0-9.0、8.0-8.5、8.5-10.0、8.5-9.5、8.5-9.0、9.0-10.0、9.0-9.5或9.5-10.0之间。
在一个实施方案中，本发明的方法包括步骤a)中的第一基质补料速度和步骤b)中的第二基质补料速度，其中第二基质补料速度低于第一基质补料速度。在另一实施方案中，第二基质补料速度维持在步骤a)期间维持的基质补料速度的5%-90%、20%-80%或20%-30%。
基质补料速度(或基质供应速度)是在补料分批和诱导阶段期间基质加入的速度(ml min-10)，即不包括任何起始非补料分批阶段期间的发酵。
在一个实施方案中，细菌毒素是肺炎球菌溶血素毒素、白喉毒素、破伤风毒素或百日咳毒素或者其点突变的变体。在一个实施方案中，毒素是白喉类毒素。在另一实施方案中，毒素是CRM197，任选其由SEQ ID NO: 32编码。在另一实施方案中，细菌毒素是肺炎球菌溶血素、白喉毒素、破伤风毒素或百日咳毒素的片段或点突变的变体。
本方法的细菌宿主细胞在关于载体和宿主细胞的部分中已定义。在一个实施方案中，细菌宿主细胞选自：大肠杆菌、不动杆菌属、放线杆菌属、博德特氏菌属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、蓝细菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、螺杆菌属、嗜血杆菌属、克雷伯氏菌属、军团菌属、莫拉氏菌属、奈瑟氏球菌属、巴斯德氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏杆菌属、密螺旋体属、弧菌属和耶尔森氏菌属。
在一个实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌的菌株。在另一实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌的K菌株或B菌株。在另一实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌的K12或B834菌株。
在一个实施方案中，步骤a)的温度高于步骤b)的温度。在一个实施方案中，本发明方法的步骤a)在20-40℃的温度下进行。任选地，本发明方法的步骤b)在20-28℃、21-27℃、22-26℃、23-24℃、21-24℃或22-23℃的温度下进行。
在另一实施方案中，在步骤b)中通过加入足够量的IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达。任选地，其为如下浓度：0.1-10mM、0.1-5mM、0.1-2.5mM、0.2-10mM、0.2-5mM、0.2-2.5mM、0.4-10mM、1-10mM、1-5mM、2.5-10mM、2.5-5mM、5-10mM。
在一个实施方案中，在诱导时细菌的光密度OD650为0-2.5或0.4-1.5。术语“在诱导时”指在过程中加入诱导剂(例如IPTG)的点，其将会在步骤b)的最开始发生。
发酵罐是任何适合工业生产细菌培养物的设备。然而，该术语不包括通常用于以较小规模培养细菌的培养瓶。任选地，发酵罐包含20-500、50-500、100-500、250-500、400-500、20-400、50-400、100-400、250-400、20-250、100-200、100-250、250-300、300-500、10-2000、500-2000、1000-2000、1500-2000或1000-1500或约150L的培养物。
任选地，搅拌发酵罐中的培养物。搅拌任选通过搅拌发酵罐中的培养物，但可通过任何其他合适方法，例如通过搅拌、振动混合器和/或鼓气泡。
在一个实施方案中，发酵罐中的溶氧水平(DO)为(维持)大于5%、10%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%或30%。在另一实施方案中，发酵罐中的DO为5%-50%、10%-40%、15%-25%或17%-22%。100% DO是，在28℃和0.5巴的压力下形成压缩气体泡经过培养基之后，用氧饱和培养基(不存在培养物)时氧存在的量。
发酵步骤可遭受大量泡沫产生。为了控制泡沫形成，任选向发酵罐中加入消泡剂。任选在发酵罐中使用泡沫探针或机械消沫器，其可与消泡剂一起使用。
在一个实施方案中，用于制备细菌毒素的方法涉及从细菌宿主细胞内的细菌毒素中移除信号肽来获得成熟细菌毒素。任选地，该移除通过宿主细胞机器进行。在一个实施方案中，通过大肠杆菌信号肽酶进行切割。任选地，移除的信号序列进一步通过信号肽肽酶切割。
在一个实施方案中，本发明方法包括从培养物中收获细胞浆(cell paste)的另外步骤c)。
在一个实施方案中，使用离心收获细胞。任选地，这在5,000-8,000g、5,500-7,500g、6,000-7,000g下进行。任选地，这在4℃-10℃、5℃-9℃、6℃-8℃或7℃-8℃下进行。
在另一实施方案中，本发明方法包括纯化细菌毒素(例如成熟细菌毒素)的另外步骤。在一个实施方案中，该步骤涉及细胞破碎和使用层析和过滤技术进一步纯化。
在一个实施方案中，使用渗透压休克、机械或酶法破碎细胞。任选地，机械法包括使用机械均质机、涡旋、声处理、使用弗氏压碎器或玻珠研磨。任选地，酶法包括使用溶菌酶、消解酶或溶葡萄球菌素消化。
在一个实施方案中，层析技术是亲和层析、凝胶过滤、高效液相层析(HPLC)或离子交换层析。任选地，亲和层析使用亲和标签纯化柱、抗体纯化柱、凝集素亲和柱、前列腺素纯化柱或链霉亲和素柱。任选地，HPLC使用离子交换柱、反相柱或大小排阻柱。任选地，离子交换柱是阴离子交换柱或阳离子交换柱。
缀合
本发明还提供一种用于制备缀合物的方法，其包括以下步骤：i) 使用本发明的方法制备细菌毒素，和b) 将步骤ii)的细菌毒素与抗原缀合。
在一个实施方案中，抗原是细菌糖。例如，细菌糖是来自选自肺炎链球菌(S. pneumoniae)、流感嗜血杆菌(H. influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitides)、B组链球菌、A组链球菌、沙门氏菌Vi、肠球菌和金黄色葡萄球菌(S. aureus)的细菌的荚膜糖。本文所定义的“糖”可为寡糖或多糖。
在本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可通过任何已知偶联技术制备。缀合方法可依赖于糖和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶
Figure 107083DEST_PATH_IMAGE002
四氟硼酸盐(CDAP)的活化来形成氰酸酯。活化的糖可因此与载体蛋白上的氨基直接或通过间隔区(接头)基团偶联。例如，间隔区可为胱胺或半胱胺以便提供硫醇化多糖，其可通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如，使用GMBS)或卤乙酰化的载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺[例如乙基碘乙酰亚胺HCl]或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯或SIAB，或SIA，或SBAP)反应后获得的硫醚键与载体偶联。优选地，氰酸酯(任选通过CDAP化学制备)与己二胺或ADH偶联，且使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学将氨基衍生的糖经由蛋白载体上的羧基与载体蛋白缀合。这样的缀合物描述于以下PCT公开申请中：WO 93/15760 Uniformed Services University 和 WO 95/08348 和 WO 96/29094。
其他合适技术使用碳二亚胺、酰肼、活化酯、降冰片烷(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多在WO 98/42721中描述。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的游离羟基与CDI (Bethell 等 J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn 等 J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18)反应后，与蛋白反应形成氨基甲酸酯键而形成。这可涉及异头端还原为伯羟基，任选伯羟基和CDI的伯羟基保护/脱保护反应来形成CDI氨基甲酸酯中间体，并将该CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基偶联。
缀合物还可通过如US 4365170 (Jennings) 和 US 4673574 (Anderson)中所述的直接还原胺化法制备。其他方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。
另一方法涉及将用己二酸二酰肼(ADH)衍生的溴化氰(或CDAP)活化糖与蛋白载体通过碳二亚胺缩合(例如，使用EDAC)而偶联(Chu C. 等 Infect. Immunity, 1983 245 256)。
在一个实施方案中，糖上的羟基(优选活化的羟基，例如活化以[例如与CDAP]形成氰酸酯的羟基)与蛋白上的氨基或羧基直接或间接(通过接头)连接。当存在接头时，糖上的羟基优选与接头上的氨基连接，例如通过使用CDAP缀合。接头(例如ADH)中的另一个氨基可与蛋白上的羧酸基团缀合，例如通过使用碳二亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，将肺炎球菌荚膜糖在接头与载体蛋白缀合前与接头缀合。备选地，接头可在与糖缀合前与载体缀合。
通常蛋白载体上的下述类型的化学基团可用于偶联/缀合：
A) 羧基(例如，经由天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中，该基团与糖上的氨基直接连接或用碳二亚胺化学(例如，用EDAC)与接头上的氨基连接。
B) 氨基(例如，经由赖氨酸)。在一个实施方案中，该基团与糖上的羧基直接连接或用碳二亚胺化学(例如，用EDAC)与接头上的羧基连接。在另一实施方案中，该基团与糖上用CDAP或CNBr活化的羟基直接连接或与接头上这样的基团、具有醛基的糖或接头、具有琥珀酰亚胺酯基的糖或接头连接。
C) 巯基(例如经由半胱氨酸)。在一个实施方案中，该基团用马来酰亚胺化学与溴或氯乙酰化的糖或接头连接。在一个实施方案中，该基团用双偶氮联苯胺活化/修饰。
D) 羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双偶氮联苯胺活化/修饰。
E) 咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双偶氮联苯胺活化/修饰。
F) 胍基(例如经由精氨酸)。
G) 吲哚基(例如经由色氨酸)。
在糖上，通常下述基团可用于偶联：OH、COOH或NH2。在本领域已知的不同处理(例如高碘酸盐、酸水解、过氧化氢等)后，可产生醛基。
直接偶联途径：
糖-OH + CNBr或CDAP -----> 氰酸酯 + NH2-蛋白 ----> 缀合物
糖-醛 + NH2-蛋白 ---->西佛碱(Schiff base) + NaCNBH3 ----> 缀合物
糖-COOH + NH2-蛋白 + EDAC ----> 缀合物
糖-NH2 + COOH-蛋白 + EDAC ----> 缀合物
经由间隔区 ( 接头 ) 的间接偶联途径：
糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH2----NH2 ----> 糖----NH2 + COOH-蛋白 + EDAC -----> 缀合物
糖-OH + CNBr或CDAP ----> 氰酸酯 + NH2-----SH -----> 糖----SH + SH-蛋白 (具有暴露半胱氨酸的天然蛋白或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得) -----> 糖-S-S-蛋白
糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH2----SH -------> 糖----SH + 马来酰亚胺-蛋白 (修饰氨基) ----> 缀合物
糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH2-----SH ---> 糖-SH + 卤乙酰化-蛋白 ----> 缀合物
糖-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> 糖------NH2 + EDAC + COOH-蛋白 ----> 缀合物
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 糖----SH + SH-蛋白 (具有暴露半胱氨酸的天然蛋白或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得) -----> 糖-S-S-蛋白
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> 糖----SH + 马来酰亚胺-蛋白 (修饰氨基) ----> 缀合物
糖-COOH + EDAC + NH2----SH ---> 糖-SH + 卤乙酰化-蛋白 ----> 缀合物
糖-醛 + NH2-----NH2 ----> 糖---NH2 + EDAC + COOH-蛋白 ----> 缀合物
注：任何合适碳二亚胺可代替上述EDAC使用。
总之，可通常用于和糖偶联的蛋白载体化学基团的类型是氨基(例如在赖氨酸残基上)、COOH基(例如在天冬氨酸和谷氨酸残基上)和SH基(如果可用) (例如在半胱氨酸残基上)。
本发明的疫苗或免疫原性组合物
本发明进一步提供一种用于制造疫苗或免疫原性组合物的方法，其包括以下步骤：
A. 使用本发明的方法制备细菌毒素或缀合物和；
B. 将细菌毒素或其缀合物与药学上可接受的赋形剂混合。
由该方法产生的疫苗或免疫原性组合物可另外包含来自另外细菌物种的抗原。在一个实施方案中，疫苗或免疫原性组合物可包含选自以下的抗原：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、大肠杆菌、粘膜炎莫拉氏菌(M.cattarhalis)、破伤风、白喉、百日咳、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、肠球菌或金黄色葡萄球菌。
在另一步骤中，本发明的多肽可与佐剂混合。选择与使用本发明方法制备的细菌毒素或缀合物混合的合适佐剂在本领域技术人员的知识内。合适佐剂包括铝盐(例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾)，但亦可为其他金属盐(例如钙、镁、铁或锌盐)，或可为酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生糖或聚磷腈的不溶性悬液。
通过经由全身或粘膜途径给予所述疫苗，包含本发明免疫原性组合物的疫苗制剂可用于保护或治疗易患感染的哺乳动物。这些给药可包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或经由粘膜给予至口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。鼻内给予用于治疗肺炎或中耳炎的疫苗是优选的(因为可更有效预防肺炎球菌的鼻咽运输，从而在其最早期减弱感染)。虽然本发明的疫苗可作为单剂量给予，但是其组分亦可同时或在不同时间一起共给予(例如，肺炎球菌糖缀合物可单独、给予疫苗的任何细菌蛋白组分同时或之后1-2周给予，用于最佳协调相对于彼此的免疫应答)。除了单一给药途径外，可使用两种不同的给药途径。例如，糖或糖缀合物可IM(或ID)给予且细菌蛋白可IN(或ID)给予。另外，本发明的疫苗对初免剂量可IM给予且对加强剂量IN给予。
疫苗中毒素的含量将通常在1-100μg的范围内，优选5-50μg，最通常在5-25μg的范围内。初始接种后，受试者可以充分的间隔接受一次或多次加强免疫。
疫苗制剂通常描述于Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (Powell M.F. 和 Newman M.J.主编) (1995) Plenum Press New York)。脂质体内的包封由Fullerton, US专利4,235,877描述。
实施例
实施例 1 设计 CRM197- 信号序列构建体
使用标准分子生物学技术产生包含编码与CRM197类毒素融合的N端信号序列的序列的质粒。使用13种不同的信号序列(表2)；这些序列选自GenEMBL数据库；
Figure 859138DEST_PATH_IMAGE003
表 2
第一构建体从3种质粒中产生(参见图1)。质粒A，由Geneart创建，包含的DsbA信号序列(SEQ ID NO: 25)在编码CRM197的N末端片段的序列(SEQ ID NO: 32的氨基酸1-206)的3’。通过使用NdeI和SacI限制酶消化两者质粒后连接，将该质粒克隆到pET26b骨架质粒(Novagen)中。质粒B，由Geneart创建，包含CRM197的C末端片段(SEQ ID NO: 32的氨基酸206-533)。使用AatII和XhoI限制酶进行限制性切割，将其克隆到pET26b骨架中，所产生的质粒命名为pRIT16668。该构建体包含从DsbA直到信号酶结合位点的信号序列，接着是信号酶结合序列后存在的来自DsbA的两个氨基酸，来自限制酶结合位点的另外两个氨基酸以及最后缺失前两个氨基酸的CRM197。这意指，当这些构建体表达时，在周质表达并通过信号酶移除信号序列后产生的蛋白包含缺失前两个氨基酸但具有来自DsbA和限制位点的另外四个氨基酸的CRM197。
pRIT16668质粒包含DsbA信号序列侧翼的NdeI和AgeI限制位点。
通过用NdeI和AgeI消化质粒pRIT16668来移除DsbA信号序列，产生包含12种其他信号序列的质粒。将编码12种其他信号序列中每一种的杂交寡核苷酸一次一种连接在这两个位点之间。
将所产生的质粒转化到Novablue化学感受态细胞(Novagen商品目录号70181-3，按制造商推荐使用)中。对于各质粒，通过测序确认正确插入片段的存在。然后将质粒单独地转化到B834(DE3)化学感受态细胞(Novagen商品目录号69041-3)、HMS174(DE3)化学感受态细胞或备选的BLR(DE3)化学感受态细胞(Novagen商品目录号69053-3，按制造商推荐使用)中用于表达。
实施例 2 设计 CRM197 构建体用于胞质表达 ( 缺失周质信号序列 )
在该实验中，产生与实施例1中产生的质粒相似但缺失周质信号序列的质粒。本设计过程在图2中概述。首先通过标准PCR技术使用命名为MDSCRM1 (SEQ ID NO: 27)和MDSCRM2 (SEQ ID NO: 28)的两条引物和作为模板的pRIT16668扩增CRM197序列(SEQ ID NO: 31) (使用的温度循环是(94℃ 2’- 55℃ 2’- 72℃ 2’30) X 25 - 72℃ 10’– 结束4℃)。
将该片段代替CRM197信号序列插入片段插入到质粒pRIT16668中。这使用通过用限制酶NdeI和XhoI消化PCR产物和pRIT16668的标准分子生物学技术实现。所产生的质粒包含成熟CRM197序列(SEQ ID NO: 31)但不包含信号序列，并命名为pRIT16669。
将所产生的质粒转化到Novablue化学感受态细胞(Novagen商品目录号70181-3，按制造商推荐使用)中。对于各质粒，通过测序确认正确插入片段的存在。然后将质粒转化到B834(DE3)化学感受态 细胞(Novagen商品目录号69041-3，按制造商推荐使用)中用于表达。
实施例 3 设计最佳信号序列 -CRM197 构建体
选择信号序列FlgI用于产生改进的构建体。随后的克隆过程在图3中概述。
使用标准PCR技术扩增包含与CRM197序列N末端部分融合的FlgI信号序列的DNA区。使用两条引物，引物命名为FlgI c-CRMopt3e (SEQ ID NO: 29)和MDSCRM906NC (SEQ ID NO: 30)引物，使用pRIT16669作为模板，使用循环(94℃ 2’(94℃ 1’– 60℃ 1’- 72℃ 2’30) X 3 (94℃ 1’– 58℃ 1’- 72℃ 2’30) X3 (94℃ 1’– 56℃ 1’- 72℃ 2’30) X 3 (94℃ 1’– 54℃ 1’- 72℃ 2’30) X 20 72℃ 10’结束4℃)。
使用通过用限制酶NdeI和AatII消化PCR产物和质粒pRIT16669的标准分子生物学技术将该片段插入到质粒pRIT16669中。所产生的质粒包含CRM197 (SEQ ID NO: 31)的完整成熟N末端和终止于信号酶结合位点的FlgI信号序列(SEQ ID NO: 23)，并命名为pRIT16681。
将所产生的质粒转化到Novablue化学感受态细胞(Novagen商品目录号70181-3，按制造商推荐使用)中。对于各质粒，通过测序确认正确插入片段的存在。然后将质粒转化到B834(DE3)化学感受态细胞(Novagen商品目录号69041-3)细胞中用于表达。
实施例 4 表达 DsbA 信号序列 -CRM197 构建体
在该实验中，培养并诱导用实施例1中产生的DsbA信号序列构建体转化的细胞表达。将B834(DE3)、HMS174(DE3)和BLR(DE3)重组菌株的预培养物(3ml)在卡那霉素(50μg/ml)存在下用1%葡萄糖补充的LBT培养基中搅拌下37℃培养过夜。在培养基的光密度OD620到达0.1后，将该预培养的第二天样品加入到具有50μg/ml卡那霉素的20ml LBT培养基中。将这些细胞在30℃搅拌下培养。在该质粒中，CRM197表达受lac操纵基因的控制，因此通过加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导编码的CRM197的表达。当光密度到达0.6时，进行IPTG (加入直至终浓度为1mM)的诱导，并将培养物在30℃另外培养3小时。
通过在SDS-PAGE凝胶(Novex Tris-甘氨酸 10-20%)上进行总细菌细胞产物的电泳并用考马斯亮蓝染色，评价CRM197表达的水平。使用用NBT-BCIP染色的小鼠抗-DTPa多克隆抗体，进行蛋白质印迹。
图4描述该实验的结果。考马斯凝胶显示在诱导和未诱导培养物之间的表达概况无差异。蛋白质印迹表明，在诱导和未诱导的培养物两者中都不存在CRM197。在这些条件下没有或有很少周质CRM197表达。
实施例 5 优化 pH 和温度条件以及构建体的表达分析
重复实施例4中的步骤；然而在该情况中，在诱导前向培养物中加入100mM的K2HPO4/KH2PO4缓冲液，使得将培养基缓冲为pH7.5。通过加入1mM IPTG诱导表达，并在23℃或30℃使得培养物过夜培养。使用如实施例4中所述的考马斯染色和蛋白质印迹技术，评价上清液和沉淀中表达的蛋白水平。
关于翻译后信号序列，对于OmpA信号序列，CRM197的表达水平非常高，然而蛋白被切割而形成约27kDa的蛋白。该截短形式是细胞相关的(在周质释放部分或培养基中未发现)。关于NspA信号序列，表达是阳性的但获得低水平的成熟CRM197。
关于共翻译序列，用FlgI和SipA信号序列，表达水平高，然而产生的CRM197不完全成熟。用NikA信号序列的表达导致表达成熟蛋白。全局表达水平低于用FlgI和SipA信号序列，但在总提取物中通过考马斯染色仍是可检测的。
实施例 6 CRM197 胞质表达构建体的表达分析
用实施例2中产生的质粒转化DE3细胞，如实施例4所述培养并诱导CRM197的表达。通过在SDS-PAGE凝胶上进行总细菌细胞产物的电泳，并使用如实施例4中所述的考马斯蓝染色和蛋白质印迹技术，评价CRM197表达水平。在标准PBS缓冲液中对细菌提取物进行一次注射技术(one shot technic)(Constant系统)。离心后，将获得的可溶性和不溶性部分上样到凝胶上。
该实验的结果示于图6中。基因在这些菌株中表达良好，不过相当部分的蛋白是不溶的并保留在沉淀中。此外，胞质表达导致在凝胶上出现明显较低的分子量蛋白。
实施例 7 优化的 FlgI 构建体的表达分析
用实施例3中产生的构建体转化BLR(DE3)大肠杆菌细胞，如实施例5的优化方案中所述，培养并诱导表达。另外，将一些样品细胞在不加入100mM K2HPO4/KH2PO4缓冲液的条件下培养。类似地，使用实施例4中所述的考马斯染色和蛋白质印迹技术，评价表达的蛋白水平。诱导时，温度维持在23℃或30℃，并在诱导时、诱导后2小时、诱导后4小时和过夜诱导后取样品。
该实验的结果示于图7中。蛋白质印迹表明，在23℃用缓冲液可更容易检测到CRM197的表达水平。所观察到的在诱导期间未缓冲的细胞中的蛋白表达水平较低。
实施例 8 –大肠杆菌 B2355 预培养
使用大肠杆菌菌株B2355的冷冻种子培养物制备预培养物。该菌株是用包含编码来自大肠杆菌的FlgI信号肽和CRM197成熟部分之间的融合蛋白的序列的pET26b衍生物(其为图3和实施例3中所述的质粒pRIT16681)转化的B834(DE3)菌株。种子培养能力确定为每ml大约1x1010菌落形成单位。
将种子培养物融化至室温，并将400µl用于接种包含400ml预培养基(改自Zabriskie 等 (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))) 的2升锥形烧瓶。
然后将接种烧瓶在37℃ (±1℃)和200rpm下孵育。当650nm的光密度(OD650nm)达到2.50时(约6小时的孵育)，终止预培养。培养一终止，就将预培养物用于接种发酵罐中的培养基(实施例9)。
实施例 9 – 20L 规模补料分批发酵
方法
使用20升发酵罐(Biolafitte)。将9升分批阶段培养基无菌转移至发酵罐中(改自Zabriskie 等 (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))。随着碱加入，将培养基的pH重调为6.8。3ml未稀释的辐射处理消泡剂(SAG 471)也加入到发酵罐中。然后在接种前设置温度(28℃)、排出压力(0.5巴)、通气速率(20升喷射气体/分钟)和初始搅拌速度(300rpm)。在这些条件中的溶氧水平是100%。在发酵期间，以恒定水平维持排出压力和通气速率。
通过加入18ml的预培养物(如实施例8中所述制备)实现接种。
在分批阶段(0-15小时)期间，温度维持在28℃。溶氧水平设置为20%。当溶氧(DO)低于20%时，通过增加搅拌来调节DO水平。葡萄糖耗尽导致DO升高和伴随的搅拌降低。
15小时发酵后，根据下述补料加入概况，加入另外的基质：
发酵时间 (h) 另外的基质补料速度 (ml/min) 补料累积重量(g)
0 0.000 0
1 0.000 0
2 0.000 0
3 0.000 0
4 0.000 0
5 0.000 0
6 0.000 0
7 0.000 0
8 0.000 0
9 0.000 0
10 0.000 0
11 0.000 0
12 0.000 0
13 0.000 0
14 0.000 0
15 0.000 0
16 0.600 21
17 1.150 81
18 1.150 161
19 1.150 241
20 1.150 321
21 1.150 400
22 1.150 480
23 1.150 560
24 1.150 639
25 1.150 719
26 1.150 799
27 1.150 878
28 1.150 958
29 1.150 1038
30 1.150 1117
31 1.150 1197
32 1.150 1277
33 1.150 1357
34 1.150 1436
35 1.150 1516
36 1.150 1596
37 1.150 1675
38 1.150 1755
39 1.150 1835
40 1.150 1914
41 1.150 1994
42 1.150 2074
43 1.150 2153
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45 1.150 2313
46 1.150 2393
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48 0.325 2466
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64 0.325 2827
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67 0.325 2894
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70 0.325 2962
71 0.325 2984
72 0.325 3007
表 3
在补料分批阶段(15-46小时)，通过加入碱维持pH在6.8，将温度调节在28℃，并通过控制搅拌速度将DO水平维持在20%。
46小时后，加入IPTG至终浓度为1mM，以诱导细菌。另外，46小时后通过加入碱使pH逐渐增加，并将温度降低至23℃ (这些变化是高水平周质表达所需的)。在整个诱导阶段(46-72小时)，维持pH和温度。通过控制搅拌速度，维持DO水平在20%。
在诱导阶段结束时(72小时)，通过离心(6,500xg，4℃持续1小时)收集细胞浆，并贮存在-20℃。
通过使用改自Chen 等 (Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004))的步骤的渗透压休克进行周质提取。通过Elisa测定周质和胞质部分中CRM197含量。
图8显示在20L规模分批补料发酵期间具有监测的过程参数的典型发酵概况。
在发酵结束时，通过Elisa测定周质CRM197生产力：
周质 胞质 分泌效率
3180 mg/L 394 mg/L 87%
表 4
该技术显示空前的表达水平和分泌效率。
实施例 10 –在诱导阶段使用的最佳补料速度和温度的测定
为了重组蛋白的最大化周质产生，在本实验中使用反应-表面方法学(J.ind. Microbiol. Biotechnol. 37:195-204 (2010))确定三个参数的最佳值。所研究的三个发酵参数是培养阶段的pH、诱导阶段的pH和诱导阶段的补料速度。根据Doehlert uniform shell design (Doehlert (Applied Statistics 19:231-239 (1970)))，选择这三个参数的值。使用表5中所述的值进行15组发酵。
使用菌株B2284进行发酵，该菌株是用包含编码来自大肠杆菌的FlgI信号肽和CRM197成熟部分之间的融合蛋白的序列的pET26b衍生物(其为图3和实施例3中所述的质粒pRIT16681)转化的BLR(DE3)细胞的菌株。
对于各发酵，将种子培养物融化至室温，并将400µl用于接种包含400ml预培养基(改自Zabriskie 等 (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)))的2升锥形烧瓶。
然后将接种烧瓶在37℃ (±1℃)和200rpm下孵育。当650nm的光密度(OD650nm)达到约2.5时(约6小时的孵育)，终止预培养。培养一终止，就将预培养物用于接种发酵罐中的培养基(改自Zabriskie 等 (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)))。
使用20升发酵罐(Biolafitte)。将9升分批阶段培养基无菌转移至发酵罐中。随着碱加入，将培养基的pH重调为目标值(表5)。将3ml未稀释的辐射处理消泡剂(SAG 471)也加入到发酵罐中。然后在接种前设置温度(28℃)、排出压力(0.5巴)、通气速率(20升喷射气体/分钟)和初始搅拌速度(300rpm)。在这些条件中的溶氧(DO)水平是100%。在发酵期间，以恒定水平维持排出压力和通气速率。
通过加入15-20ml的预培养物实现接种。
在分批阶段期间(0-15小时)，将温度维持在28℃。溶氧水平设置为20%，当DO下降低于20%时，通过增加搅拌调节溶氧水平。
在分批补料阶段(15-46小时)，通过加入碱，根据表5中所述的条件之一维持pH。将温度调节在28℃。将搅拌速度维持在恒定设定值(最大800rpm)，并且当DO增加高于20%时，通过自动加入浓缩的补料溶液(改自Zabriskie 等 (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)))维持DO水平在20%。
当培养物达到约90的OD650nm时，通过碱或酸加入，根据表5中所述的条件之一改变pH设定值，并将温度降低至23℃。一旦实现这些条件，加入IPTG至终浓度为1mM。在整个诱导阶段期间(24小时)，维持pH和温度。在整个诱导阶段期间，根据表5中所述的条件之一使用不变的基质补料速度。通过控制搅拌速度，维持DO水平在20%。
在诱导阶段结束时，通过离心(典型地，6,500xg，4℃持续1小时)收集细胞浆，并贮存在-20℃。
通过使用改自Chen 等 (Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004))的步骤的渗透压休克进行周质提取。通过Elisa测定周质和胞质部分中的CRM197含量(表6)。
表 5
Figure 619284DEST_PATH_IMAGE004
表 6
基于来自15组发酵的结果，使用NEMROD-W软件(LPRAI, Marseille, France)模拟周质和胞质部分中CRM197的产生。
如图10中所示，在诱导期间低补料速度下的周质CRM197产生是最大的(图10a)，而较高补料速度下细胞内的CRM197累积是最大的(图10b)。用于周质或细胞相关的CRM197的产生的补料速度优化方面的差异便于规定选择性改进周质CRM197产生的条件。在诱导时pH增加也是有效产生周质CRM197所需的(图10a)。
下文表7描述使用NEMROD-W软件所获得的培养期间的最佳pH、诱导期间的最佳pH和最佳补料速度。
表 8
参数 值
培养期间的pH 6.8
诱导期间的pH 7.5
诱导期间的补料速度 0.330 ml min-1
优化pH和补料速度条件导致CRM97到周质中的最佳分泌。
<110> 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
<120> 表达系统
<130> VB63702
<160> 45
<170> Windows版FastSEQ版本4.0
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<220>
<221> 其他(misc)_信号
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atgaaattta gtaaaaaata tatagcagct ggatcagctg ttatcgtatc cttgagtcta 60
tgtgcctatg ca 72
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<221>信号
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Met Lys Phe Ser Lys Lys Tyr Ile Ala Ala Gly Ser Ala Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Cys Ala Tyr Ala
20
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<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 其他_信号
<222> (0)...(0)
<400> 3
atgaaaatga ataaaaaggt actattgaca tcgacaatgg cagcttcgct attatcagtc 60
gcaagtgttc aagca 75
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<221>信号
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Met Lys Met Asn Lys Lys Val Leu Leu Thr Ser Thr Met Ala Ala Ser
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Leu Leu Ser Val Ala Ser Val Gln Ala
20 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 其他_信号
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atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60
gcc 63
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<221>信号
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Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
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Thr Val Ala Gln Ala
20
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<213> 人工序列
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<221> 其他_信号
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atgaaaaaag cacttgccac actgattgcc ctcgctctcc cggccgccgc actggcg 57
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<221>信号
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Ala Leu Ala
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<221>信号
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Met Arg Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Phe Met Leu Pro Ala
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Phe Ser
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<221> 其他_信号
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atgatgacta aaataaagtt attgatgctc attatatttt atttaatcat ttcggccagc 60
gcccatgct 69
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221>信号
<222> (0)...(0)
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Met Met Thr Lys Ile Lys Leu Leu Met Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ser Ala His Ala
20
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<221> 其他_信号
<222> (0)...(0)
<400> 13
atgatgaagc acatgcgtat atgggccgtt ctggcatcat ttttagtctt tttttatatt 60
ccgcagagct atgcc 75
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<212> PRT
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<220>
<221>信号
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Met Met Lys His Met Arg Ile Trp Ala Val Leu Ala Ser Phe Leu Val Phe
1 5 10 15
Phe Tyr Ile Pro Gln Ser Tyr Ala
20
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<220>
<221> 其他_信号
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atgaggtttt tattgggcgt gctgatgctg atgatctccg gctcagcgct ggcg 54
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<213> 人工序列
<220>
<221>信号
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<400> 16
Met Arg Phe Leu Leu Gly Val Leu Met Leu Met Ile Ser Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ala
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 其他_信号
<222> (0)...(0)
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gcgcttgca 69
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<212> PRT
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<221>信号
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Met Ser Lys Arg Thr Phe Ala Val Ile Leu Thr Leu Leu Cys Ser Phe
1 5 10 15
Cys Ile Gly Gln Ala Leu Ala
20
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<221> 其他_信号
<222> (0)...(0)
<400> 19
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catgct 66
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<211> 22
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<213> 人工序列
<220>
<221>信号
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Met Met Lys Gln Ala Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp
1 5 10 15
Ala Ser Val Leu His Ala
20
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<221> 其他_信号
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<400> 21
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catgcc 66
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<220>
<221>信号
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Ser Phe Ile Val His Ala
20
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<221> 其他_信号
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<221>信号
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<400> 24
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<211> 19
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<220>
<221>信号
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<400> 26
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
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<221> 引物_结合
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<212> DNA
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<220>
<221> 引物_结合
<222> (0)...(0)
<400> 29
ggagcgcata tgattaaatt tctctctgca ttaattcttc tactggtcac gacggcggct 60
caggctggtg cggatgatgt ggtggatagc 90
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物_结合
<222> (0)...(0)
<400> 30
cacgccgcat agttcgcacc cgca 24
<210> 31
<211> 1605
<212> DNA
<213> 白喉棒状杆菌
<400> 31
ggtgcggatg atgtggtgga tagcagcaaa tcttttgtga tggaaaactt tagcagctat 60
catggcacca aaccgggcta tgtggatagc attcagaaag gcatccagaa accgaaaagc 120
ggcacccagg gcaactatga tgatgattgg aaagaatttt atagcaccga taacaaatat 180
gatgcggcgg gttatagcgt ggataacgaa aatccgctgt ctggcaaagc gggcggtgtg 240
gtgaaagtga cctatccggg cctgaccaaa gtgctggccc tgaaagtgga taacgcggaa 300
accatcaaaa aagaactggg cctgagcctg accgaaccgc tgatggaaca ggtgggcacc 360
gaagaattta ttaaacgctt tggcgatggc gcgagccgtg tggttctgag cctgccgttt 420
gcggaaggca gcagcagcgt ggaatatatt aacaactggg aacaggcgaa agccctgagc 480
gtggaactgg aaattaactt tgaaacccgt ggcaaacgtg gccaggatgc gatgtatgaa 540
tacatggcgc aggcgtgcgc gggcaatcgt gtgcgtcgta gcgtgggcag cagcctgagc 600
tgcattaacc tggattggga cgtcattcgt gataaaacca aaaccaaaat cgaaagcctg 660
aaagaacatg gcccgatcaa aaacaaaatg agcgaaagcc cgaacaaaac cgtgagcgaa 720
gaaaaagcga aacagtatct ggaagaattt catcagaccg cgctggaaca tccggaactg 780
agcgaactga aaaccgtgac cggcaccaat ccggtgtttg cgggtgcgaa ctatgcggcg 840
tgggcggtga atgtggcgca ggtgattgat agcgaaaccg cggataacct ggaaaaaacc 900
accgcggccc tgagcattct gccgggcatt ggcagcgtga tgggcattgc ggatggcgcg 960
gtgcatcata acaccgaaga aattgtggcg cagagcattg ccctgagcag cctgatggtg 1020
gcgcaggcga ttccgctggt tggcgaactg gtggatattg gctttgcggc gtacaacttt 1080
gtggaaagca tcatcaacct gtttcaggtg gtgcataaca gctataaccg tccggcgtat 1140
tctccgggtc ataaaaccca gccgtttctg catgatggct atgcggtgag ctggaacacc 1200
gtggaagata gcattattcg taccggcttt cagggcgaaa gcggccatga tattaaaatt 1260
accgcggaaa acaccccgct gccgattgcg ggtgttctgc tgccgaccat tccgggcaaa 1320
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tgccgtgcga ttgatggcga tgtgaccttt tgccgtccga aaagcccggt gtatgtgggc 1440
aacggcgtgc acgcgaacct gcatgtggcg tttcatcgta gcagcagcga aaaaatccat 1500
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accaaagtga actctaaact gagcctgttc ttcgaaatca aaagc 1605
<210> 32
<211> 535
<212> PRT
<213> 白喉棒状杆菌
<400> 32
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
20 25 30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
35 40 45
Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65 70 75 80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
85 90 95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
100 105 110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
115 120 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
210 215 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
260 265 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
340 345 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr
385 390 395 400
Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His
405 410 415
Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
420 425 430
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
435 440 445
His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
465 470 475 480
Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser
485 490 495
Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu
500 505 510
Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser
515 520 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
<210> 33
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 33
Met Lys Phe Ser Lys Lys Tyr Ile Ala Ala Gly Ser Ala Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Cys Ala Tyr Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser
20 25 30
Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys
35 40 45
Pro Gly Tyr Val Asp Ser
50
<210> 34
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 34
Met Lys Met Asn Lys Lys Val Leu Leu Thr Ser Thr Met Ala Ala Ser
1 5 10 15
Leu Leu Ser Val Ala Ser Val Gln Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser
50 55
<210> 35
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 35
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser
20 25 30
Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr
35 40 45
Val Asp Ser
50
<210> 36
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 36
Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val
20 25 30
Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp
35 40 45
Ser
<210> 37
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 37
Met Arg Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Phe Met Leu Pro Ala
1 5 10 15
Phe Ser Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met
20 25 30
Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser
35 40 45
<210> 38
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 38
Met Met Thr Lys Ile Lys Leu Leu Met Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser
20 25 30
Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro
35 40 45
Gly Tyr Val Asp Ser
50
<210> 39
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 39
Met Met Lys His Met Arg Ile Trp Ala Val Leu Ala Ser Phe Leu Val
1 5 10 15
Phe Phe Tyr Ile Pro Gln Ser Tyr Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser
50 55
<210> 40
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 40
Met Arg Phe Leu Leu Gly Val Leu Met Leu Met Ile Ser Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met
20 25 30
Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser
35 40 45
<210> 41
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 41
Met Ser Lys Arg Thr Phe Ala Val Ile Leu Thr Leu Leu Cys Ser Phe
1 5 10 15
Cys Ile Gly Gln Ala Leu Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser
20 25 30
Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro
35 40 45
Gly Tyr Val Asp Ser
50
<210> 42
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 42
Met Met Lys Gln Ala Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp
1 5 10 15
Ala Ser Val Leu His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys
20 25 30
Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly
35 40 45
Tyr Val Asp Ser
50
<210> 43
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 43
Met Leu Ser Thr Leu Arg Arg Thr Leu Phe Ala Leu Leu Ala Cys Ala
1 5 10 15
Ser Phe Ile Val His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys
20 25 30
Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly
35 40 45
Tyr Val Asp Ser
50
<210> 44
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 44
Met Ile Lys Phe Leu Ser Ala Leu Ile Leu Leu Leu Val Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val
20 25 30
Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp
35 40 45
Ser
<210> 45
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 45
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val
20 25 30
Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp
35 40 45
Ser

Claims (75)

1. 一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中
(a) 5’信号序列部分编码具有能够指导异源蛋白转运至细菌周质的氨基酸序列的异源多肽；和
(b) 3’毒素部分编码具有与编码至少15个氨基酸和/或至少一个B或T细胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。
2. 一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中
(a) 5’信号序列部分编码具有能够指导异源蛋白转运至细菌周质的氨基酸序列的多肽，且其中5’信号序列部分不是来源于白喉棒状杆菌；和
(b) 3’毒素部分编码具有与编码至少15个氨基酸和/或至少一个B或T细胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。
3. 权利要求1或2的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码具有能够指导异源蛋白共翻译转运至细菌周质的氨基酸序列的多肽。
4. 权利要求1-3的多核苷酸，其中3’毒素部分编码SEQ ID NO: 32。
5. 权利要求1-4的多核苷酸，其中3’毒素部分包含SEQ ID NO: 31。
6. 权利要求1-5的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码
a. SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种；
b. SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的变体，所述变体包含1、2或3个点突变、插入或缺失；或
c. SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的至少10个氨基酸的片段。
7. 权利要求1-5的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码
a. SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的任一种；
b. SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26的变体，所述变体包含1、2或3个点突变、插入或缺失；或
c. SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26的至少10个氨基酸的片段。
8. 权利要求1-5的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码
a. SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24中的任一种；
b. SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24的变体，所述变体包含1、2或3个点突变、插入或缺失；或
c. SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24的至少10个氨基酸的片段。
9. 权利要求1-5的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码
a. SEQ ID NO: 24；
b. SEQ ID NO:24的变体，所述变体包含1、2或3个点突变、插入或缺失；或
c. SEQ ID NO:24的至少10个氨基酸的片段。
10. 一种包含5’信号序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中5’信号部分序列编码具有以下的氨基酸序列的信号肽：
(a) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26；
(b) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的变体，所述变体与相应的序列的不同在于1、2或3个点突变、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述变体能够将表达的蛋白导向周质；或
(c) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的至少10个氨基酸的片段，所述片段能够将表达的蛋白导向周质；
且3’毒素部分编码细菌毒素或者其片段或变体。
11. 权利要求10的多核苷酸，其中5’信号部分序列编码具有以下的氨基酸序列的信号肽：
(a) SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26；
(b) SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26的变体，所述变体与相应的序列的不同在于1、2或3个点突变、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述变体能够将表达的蛋白导向周质；或
(c) SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26的至少10个氨基酸的片段，所述片段能够指导表达的蛋白转运至周质。
12. 权利要求10或11的多核苷酸，其中5’信号部分序列编码具有以下的氨基酸序列的信号肽：
(a) SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24；
(b) SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24的变体，所述变体与相应的序列的不同在于1、2或3个点突变、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述变体能够将表达的蛋白导向周质；或
(c) SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24的至少10个氨基酸的片段，所述片段能够指导表达的蛋白转运至周质。
13. 权利要求10-12的多核苷酸，其中5’信号部分序列编码具有以下的氨基酸序列的信号肽：
(a) SEQ ID NO: 24；
(b) SEQ ID NO: 24的变体，所述变体与相应的序列的不同在于1、2或3个点突变、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述变体能够将表达的蛋白导向周质；或
(c) SEQ ID NO: 24的至少10个氨基酸的片段，所述片段能够指导表达的蛋白转运至周质。
14. 权利要求10的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的至少一种。
15. 权利要求10-11的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26中的至少一种。
16. 权利要求10-12的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24中的至少一种。
17. 权利要求10-13的多核苷酸，其中5’信号序列部分编码SEQ ID NO: 24。
18. 权利要求10或14的多核苷酸，其中5’信号序列部分包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中的至少一种。
19. 权利要求11或15的多核苷酸，其中5’信号序列部分包含SEQ ID NO: 1、3、9、11、13、15、17、19、21、23或25中的至少一种。
20. 权利要求12或16的多核苷酸，其中5’信号序列部分包含SEQ ID NO: 1、3、9、11、13、15、17、19、21或23中的至少一种。
21. 权利要求13或17的多核苷酸，其中5’信号序列部分包含SEQ ID NO: 23。
22. 权利要求10-21的多核苷酸，其中细菌毒素是白喉毒素或者其片段或变体。
23. 权利要求10-22的多核苷酸，其中细菌毒素是CRM197或者其片段或变体。
24. 权利要求10-23的多核苷酸，其中3’毒素部分编码与SEQ ID NO: 32有至少90%或至少95%序列同一性的多肽。
25. 权利要求10-24的多核苷酸，其中3’毒素部分编码具有SEQ ID NO: 32或其片段的氨基酸序列的多肽。
26. 权利要求10-25的多核苷酸，其中3’毒素部分包含SEQ ID NO: 31。
27. 权利要求1-26的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO: 33-45的多肽。
28. 权利要求10-21的多核苷酸，其中细菌毒素是破伤风毒素或者其片段或变体。
29. 权利要求1-28的多核苷酸，其中5’信号序列部分直接是3’毒素部分的5’。
30. 一种载体，其包含与诱导型启动子连接的权利要求1-29的多核苷酸。
31. 权利要求30的载体，其中所述诱导型启动子通过加入足够量的IPTG而激活。
32. 一种宿主细胞，其包含权利要求30或31的表达载体或者权利要求1-29中任一项的多核苷酸。
33. 权利要求32的宿主细胞，其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌。
34. 权利要求32或33的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：大肠杆菌、不动杆菌属、放线杆菌属、博德特氏菌属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、蓝细菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、螺杆菌属、嗜血杆菌属、克雷伯氏菌属、军团菌属、莫拉氏菌属、奈瑟氏球菌属、巴斯德氏菌属、变形菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏杆菌属、密螺旋体属、弧菌属和耶尔森氏菌属。
35. 权利要求32-34的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
36. 一种多肽，其由权利要求1-29的多核苷酸编码。
37. 一种用于制备细菌毒素的方法，其包括以下步骤：a) 培养权利要求32-35的细菌宿主细胞的培养物，和b) 诱导多肽表达使得周质表达细菌类毒素。
38. 一种用于周质表达重组多肽的方法，所述方法是通过：
A. 培养革兰氏阴性宿主细胞的培养物；和
B. 诱导多肽表达使得周质表达蛋白；
其中在表达期间进行一种或多种下述步骤：
i. 步骤a)的pH低于步骤b)的pH；
ii. 步骤a)的温度高于步骤b)的温度；或
iii. 步骤a)的基质补料速度高于步骤b)的基质补料速度。
39. 权利要求38的方法，其中进行步骤i、步骤ii、步骤iii、步骤i和步骤ii、步骤i和步骤iii、步骤ii和步骤iii，或步骤i、步骤ii和步骤iii。
40. 权利要求38-39的方法，其中表达权利要求1-15的多核苷酸。
41. 权利要求37-40的方法，其中步骤a)的pH和步骤b)的pH相同。
42. 权利要求37-40的方法，其中步骤a)的pH低于步骤b)的pH。
43. 权利要求37-42的方法，其中步骤a)中的pH在6.0-7.0或6.5-7.0的范围内。
44. 权利要求37-43的方法，其中步骤b)中的pH在6.5-10.0、7.0-8.0、6.5-9.0或7.0-8.5的范围内。
45. 权利要求44的方法，其中在步骤b)期间维持pH。
46. 权利要求44或45的方法，其中使用选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和组氨酸缓冲液的缓冲液维持pH。
47. 权利要求46的方法，其中缓冲液的浓度是10-200mM、50-100mM、10-50mM、100-200mM或50-150mM。
48. 权利要求37-47的方法，其中缓冲液是80-100mM的磷酸盐缓冲液。
49. 权利要求37-48的方法，其中所述方法在发酵罐中进行。
50. 权利要求42-49的方法，其中步骤b)中pH的增加是通过加入碱例如氢氧化钠或氨而实现。
51. 权利要求41-50的方法，其中通过在步骤b)期间加入氢氧化钠或氨维持pH在6.5-10.0、7.0-8.0、6.5-9.0或7.0-8.5之间。
52. 权利要求37-51的方法，其包括步骤a)中的第一基质补料速度和步骤b)中的第二基质补料速度，且其中第二基质补料速度低于第一基质补料速度。
53. 权利要求52的方法，其中第二基质补料速度维持在第一基质补料速度的5%-90%、20%-80%或20%-30%之间。
54. 权利要求37-53中任一项的方法，其中细菌毒素是白喉毒素或其点突变的变体。
55. 权利要求54的方法，其中细菌毒素是CRM197。
56. 权利要求37-53中任一项的方法，其中细菌毒素是破伤风毒素。
57. 权利要求37-56中任一项的方法，其中步骤a)的温度高于步骤b)的温度。
58. 权利要求37-57中任一项的方法，其中步骤a)在20-40℃的温度下进行。
59. 权利要求37-57中任一项的方法，其中步骤b)在20-28℃、21-27℃、21-24℃或22-23℃的温度下进行。
60. 权利要求37-59中任一项的方法，其中通过加入足够量的IPTG在步骤b)中诱导表达。
61. 权利要求60的方法，其中加入IPTG至终浓度为0.1-10mM。
62. 权利要求37-61中任一项的方法，其中所述宿主细胞在诱导时具有0-2.5或0.4-1.5的光密度(OD650)。
63. 权利要求49-62的方法，其中发酵罐包含10-2000升的培养物。
64. 权利要求49-63的方法，其中发酵罐包含100-200L或约150L的培养物。
65. 权利要求49-64的方法，其中溶氧水平超过5%。
66. 权利要求65的方法，其中溶氧水平是15-25%。
67. 权利要求37-66中任一项的方法，其中从在细菌宿主细胞内的细菌毒素中移除信号肽以获得成熟细菌毒素。
68. 权利要求37-67中任一项的方法，其包括从培养物中收获细胞浆的另外步骤c)。
69. 权利要求37-68中任一项的方法，其包括纯化细菌毒素例如成熟细菌毒素的另外步骤。
70. 一种用于制备缀合物的方法，其包括以下步骤：i) 使用权利要求37-64中任一项的方法制备细菌毒素，和ii) 将步骤a)的细菌毒素与抗原缀合。
71. 权利要求70的方法，其中抗原是细菌糖。
72. 权利要求71的方法，其中细菌糖是来自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌或金黄色葡萄球菌的荚膜糖。
73. 一种用于制造疫苗的方法，其包括以下步骤：
A. 使用权利要求37-72的方法制备细菌毒素或缀合物和；
B. 将细菌毒素或其缀合物与药学上可接受的赋形剂混合。
74. 权利要求73的方法，其中细菌毒素在步骤b)中与另外的抗原混合。
75. 权利要求73-74的方法，其中细菌毒素在步骤b)中与佐剂混合。
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