KR102059619B1 - 글루코스-자일로스 혼합당의 동시발효가 가능한 돌연변이 균주 - Google Patents

글루코스-자일로스 혼합당의 동시발효가 가능한 돌연변이 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루코스-자일로스 혼합당의 동시발효가 가능한 돌연변이 균주에 관한 것으로, 본 발명은 글루코스가 이용될 때 자일로스의 이용을 억제하는 분해대사물 억제 (catabolite repression)가 완화된 돌연변이 균주를 개발하였는데, 글루코스와 자일로스를 동시에 이용할 수 있고, 이를 통해 친환경적이고 높은 가격경쟁력을 가짐과 동시에, 높은 효율로 에탄올을 수득할 수 있다.

Description

글루코스-자일로스 혼합당의 동시발효가 가능한 돌연변이 균주 {Mutant strain for simultaneously fermentescible of glucose and xylose mixed sugars}
본 발명은 글루코스-자일로스 혼합당의 동시발효가 가능한 돌연변이 균주에 관한 것이다.
바이오매스(biomass)로부터 생산 가능한 바이오연료는 다른 신재생 에너지원과는 달리 생물체를 이용하는 특징이 있다. 바이오에너지는 식물을 주원료로 사용하므로 자원고갈의 문제가 없으며, 바이오연료 사용에 의해 배출된 이산화탄소는 다시 원료로 사용되어 식물의 생장에 이용되기 때문에 최종적으로 배출되는 이산화탄소의 양도 적다. 최근 유네스코의 분석에 따르면 전체 에너지 소비량의 30% 정도를 바이오연료의 잠재력으로 평가하고 있다. 이는 석유 고갈에 따른 에너지 부족에 대한 실질적 대안이 될 수 있으며, 화석연료의 과다 사용에 따른 지구 온난화 문제를 해결할 수 있음을 보여준다.
또한, 석유자원과 같이 특정 지역에 편중되어 있는 연료와 달리 바이오매스를 이용한 바이오연료는 대부분의 지역에서 활용 가능한 유기성 페기물인 축산 폐수, 음식물 쓰레기, 하수 슬러지 (sewage sludge) 등을 사용하여 만들 수 있으며, 잉여 농산물, 폐목재, 농·임산 부산물 등도 활용 가능함으로 많은 국가가 바이오연료 산업에 관심을 보이고 있다. 현재 상용화된 바이오 에너지 기술에는 축산 분뇨, 하수 슬러지, 음식물 쓰레기 등의 유기성 폐기물을 이용하여 메탄올을 생산하는 혐기성 소화 방법과 농·임산 부산물인 볏짚, 간벌재 등을 이용하여 우드칩, 펠렛 등의 고형 연료 및 바이오 오일을 만드는 열화학적 기술을 이용한 방법, 그리고 수송용 바이오 연료 전환 기술로써 옥수수와 사탕수수로부터 추출한 당을 효모로 발효하여 생산하는 바이오 에탄올과 식물성 기름을 이용하여 만드는 바이오디젤 (bio-diesel)이 있다.
현재 상용화된 바이오 에탄올(bio-ethanol)은 식량자원으로 사용되는 당질계 또는 전분질계 바이오매스를 이용하고 있으며, 식량자원을 원료로 사용한다는 문제점과 식량자원의 수요 증가에 따른 원료 수급의 문제가 발생할 우려가 있다. 국내 에너지 소비 중 수송용 연료가 차지하고 있는 비율은 현재 약 30%로 전부 수입 화석연료에 의존하고 있는 상황이며, 원유가격의 폭등과 기후변화 협약에 의한 탄소 저감의무 등이 부가되면서 국가 경제에 미치는 부담이 커지고 있다.
최근 개발되고 있는 신재생 에너지들 중, 목질계 바이오매스가 가지는 장점은 액체연료로의 전환이 가능하여 수송용 연료로 사용할 수 있다는 점이며, 향후 경제성이 점차 확보될 전망이다. 하지만, 당질계와 전분질계의 바이오매스처럼 당화 과정 후 발효와 증류를 통해 바이오 에탄올을 생산할 수 있는 것이 아니라, 목질계 바이오매스를 구성하고 있는 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌의 결합이 상당히 견고하게 이루어져 있기 때문에 당화 과정 이전에 전처리 과정이 필수적이다.
즉, 목질계 바이오매스로부터 바이오 에탄올을 생산하기 위해서는 물리, 화학적인 전처리 방법을 통해 견고한 결합을 끊고 당 성분을 추출해야 한다는 단점을 보완해야만 향후 경제성을 확보할 것으로 보인다. 또한, 목질계 바이오매스의 전처리 과정 중 발효 저해 물질인 푸란(furan), 푸푸랄(furfural), 페루릭산 (ferulic acid) 등이 생성되어 발효를 저해하는 것도 하나의 문제점이라고 할 수 있다.
대한민국공개특허 제10-2012-0095837호에는, 자일로스를 이용하여 에탄올을 생산할 수 있는 내열성 효모 또는 그 변이주 및 자일로스를 이용한 에탄올의 생산방법에 관하여 기재하고 있다. 대한민국공개특허 제10-2012-0099672호에는, 향상된 자일로스 이용 능력을 갖는 변형 미생물, 상기 미생물에 도입하기 위한 벡터, 및 상기 미생물을 이용한 화학물질의 생산방법에 관하여 기재하고 있다.
본 발명은 바이오매스 중 지구상에서 가장 많이 생산되고 풍부한 탄소원으로, 재생 가능한 친환경 에너지 원인, 목질계 바이오매스를 이용하여 석유자원과의 가격 경쟁력을 가짐과 동시에 원료 수급의 문제를 해결하고자, 분해대사물 억제 (catabolite repression)가 완화된 돌연변이 균주를 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 글루코스와 자일로스의 동시발효가 가능한 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)를 제공한다.
한편, 본 발명은 글루코스와 자일로스가 동시에 존재하는 배지에 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)의 배양방법에 있어, 상기 글루코스 또는 자일로스는, 바람직하게 배지에 각각 20~40g/L의 농도로 첨가된 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 글루코스와 자일로스가 동일한 양으로 배지에 첨가된 것이 좋다.
한편, 본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)를 이용한 에탄올의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 에탄올의 생산방법은, 바람직하게 기질로 목질계 바이오매스를 사용하는 것이 좋고, 상기 목질계 바이오매스는, 일 예로 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 글루코스가 이용될 때 자일로스의 이용을 억제하는 분해대사물 억제 (catabolite repression)가 완화된 돌연변이 균주를 개발하였는데, 글루코스와 자일로스를 동시에 이용할 수 있고, 이를 통해 친환경적이고 높은 가격경쟁력을 가짐과 동시에, 높은 효율로 에탄올을 수득할 수 있다.
도 1은 모균주 클루이베로마이세스 마르시아누스 17694-DH1와 본 발명의 돌연변이주 클루이베로마이세스 마르시아누스 SBK1의 동시발효를 나타낸 결과이다 (A, C, E: Parental strain (Kluyveromyces marxianus 17694-DH1); B, D, F: Kluyveromyces marxianus SBK1; A,B: 40g/L 글루코오스; C,D: 40g/L 글루코오스와 40g/L 자일로스; E, F: 40g/L 자일로스; □: 글루코오스, ○: 자일로스, ◆: 흡광도 (OD), ●: 자이리톨, ■: 에탄올).
도 2는 글루코스 농도에 따른 글루코스-자일로스 동시발효 결과를 나타낸 것이다 (□: 글루코오스, ○: 자일로스, ◆: 흡광도 (OD), ●: 자이리톨, ■: 에탄올).
비식용 바이오매스는 주로 셀룰로스, 헤미셀룰로스로 구성되며, 전처리와 효소 분해 공정을 통해 각각 글루코스와 자일로스로 가수분해된다. 이러한 비식용 바이오매스를 이용하여 효율적으로 에탄올 또는 부탄올 등의 다양한 바이오연료를 생산하기 위해서는 글루코스-자일로스 혼합당을 동시에 이용하는 것이 무엇보다 중요하다. 기존에는 글루코스를 다 이용할 때까지, 자일로스의 이용이 제한되어, 대사산물의 생산성을 저하시키는 문제가 있어 왔다. 따라서, 글루코스와 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 기술의 개발이 요구되는데, 그렇게 하기 위해서는, 글루코스가 이용될 때 자일로스의 이용을 억제하는 분해대사물 억제 (catabolite repression)가 완화 또는 제거된 돌연변이 균주가 요구된다.
이러한 필요에 의해, 본 발명에서는 자일로스를 효율적으로 이용할 수 있는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 17694-DH1 (강원대학교 대학원 생물공학과 학위논문 2017.2. Xylose로부터 Ethanol의 수율이 증가된 돌연변이 균주 Kluyveromyces marxianus 17694-DH1을 이용한 Ethanol 생산에 관한 연구)와 글루코스의 구조적 유사체인 2-데옥시글루코오스 (2-DOG)를 이용한, 유도적 돌연변이를 통해, 글루코스와 자일로스의 동시발효 능력이 우수한 돌연변이주, 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)를 개발하게 되었다.
클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 균주는 1888년 E. C. Hansen에 의해 처음 발견되었으며, 열내성 효모로써 자일로스(xylose)를 대사하여 자일리톨(xylitol)과 에탄올(ethanol)을 생산할 수 있는 특징을 가지고 있다. 또한, 클루이베로마이세스 마르시아누스는 일반적인 효모가 생육하기 힘든 45℃의 높은 온도에서도 짧은 세대수와 높은 성장속도를 갖는다.
한편, 본 발명은 글루코스와 자일로스가 동시에 존재하는 배지에 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)의 배양방법에 있어, 상기 글루코스 또는 자일로스는, 바람직하게 배지에 각각 20~40g/L의 농도로 첨가된 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 글루코스와 자일로스가 동일한 양으로 배지에 첨가된 것이 좋다.
한편, 본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)를 이용한 에탄올의 생산방법을 제공하는데, 바람직하게 기질로 목질계 바이오매스를 사용하는 것이 좋고, 상기 목질계 바이오매스는, 일 예로 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서는 본 발명의 균주가 글루코스와 자일로스 혼합당을 동시에 발효하여 효과적으로 에탄올을 생산하는 것을 확인하였고, 모균주에 비해 에탄올 생산량이 67%, 에탄올 수율이 19%, 및 에탄올 생산성이 67% 향상된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 글루코스에 의한 분해대사물 억제 정도는 글루코스의 농도에 비례하여 증가함을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 돌연변이주, 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)은 글루코스에 의한 분해대사물 억제 (catabolite repression)가 완화된 균주임을 확인한 것이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
< 실시예 1: 클루이베로마이세스 마르시아누스 ( Kluyveromyces marxianus ) SBK1의 에탄올 생산>
(1) 클루이베로마이세스 마르시아누스 ( Kluyveromyces marxianus ) SBK1 개발 및 배양
글루코스와 자일로스를 동시에 발효 가능한 균주를 개발하기 위하여, 모균주는 자일로스로부터 에탄올을 효율적으로 생산하도록 개량된 돌연변이 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 17694-DH1 (강원대학교 대학원 생물공학과 학위논문 2017.2. Xylose로부터 Ethanol의 수율이 증가된 돌연변이 균주 Kluyveromyces marxianus 17694-DH1을 이용한 Ethanol 생산에 관한 연구)을 이용하였다.
유도적 돌연변이 유발과정은, 8% 자일로스와 1.5% 2-DOG가 포함된 배지에서 약 70일 동안 진행하였다. 이후, 2% 자일로스와 0.1% 2-DOG가 포함된 고체배지에서 104개의 콜로니를 분리하였고, 글루코스-자일로스에 대한 동시발효능이 우수한 균주 1개를 최종적으로 선발하여, 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1라 명명하였고, 한국생명공학연구원으로부터 기탁번호 KCTC18674P를 부여받았다.
전배양은 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 17694-DH1와 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1를 글루코스와 자일로스가 각각 20g/L씩 포함된 YP(10g/L Yeast extract, 20g/L peptone) 배지에 투입하고 30℃, 200rpm 조건으로 수행하여, 하기 실험에 사용하였다.
(2) 글루코스 - 자일로스 혼합당 동시발효
본 발명의 돌연변이주 클루이베로마이세스 마르시아누스 SBK1의 글루코스-자일로스 혼합당 동시발효 능력을 확인하기 위해 모균주 클루이베로마이세스 마르시아누스 17694-DH1과 함께 동시발효를 진행하였다 (도 1). 도 1은 모균주 클루이베로마이세스 마르시아누스 17694-DH1와 본 발명의 돌연변이주 클루이베로마이세스 마르시아누스 SBK1의 동시발효를 나타낸 결과이다 (A, C, E: Parental strain (Kluyveromyces marxianus 17694-DH1); B, D, F: Kluyveromyces marxianus SBK1; A,B: 40g/L 글루코오스; C,D: 40g/L 글루코오스와 40g/L 자일로스; E, F: 40g/L 자일로스; □: 글루코오스, ○: 자일로스, ◆: 흡광도 (OD), ●: 자이리톨, ■: 에탄올).
모균주 (클루이베로마이세스 마르시아누스 17694-DH1)는 8시간 이내에 글루코스 40g/L를 모두 소비하였고, 그 이후 자일로스 소비가 일어났지만, 자일로스 10g/L를 소비한 후에는 속도가 점차 감소하여 멈추었다 (도 1의 C). 반면, 본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스 SBK1는, 글루코스 소비속도가 현저하게 감소하기 하였으나, 자일로스를 동시에 소비하는 패턴을 보였다. 이처럼, 120시간 이내에 자일로스 소비량이 약 10g/L에서 약 35g/L로 증가함에 따라, 에탄올 생산량도 약 15g/L에서 약 25g/L로 증가하였다 (도 1의 D).
한편, 하나의 탄소원(글루코스 또는 자일로스)이 포함된 배지에서의 성장을 비교하였을 때, 돌연변이주 (클루이베로마이세스 마르시아누스 SBK1)의 글루코스 소비속도가 눈에 띄게 느려진 것이 확인되었다 (도 1의 A, B). 모균주는 8시간 이내에 글루코스 40g/L를 모두 소비하였지만, 돌연변이주는 120시간 이내에 글루코스 40g/L를 모두 소비하였다. 그러나 모균주와 돌연변이주의 자일로스 소비속도는 변화가 없었다(도 1의 E, F). 이로써, 돌연변이주의 글루코스의 분해대사물 억제 (catabolite repression)와 관련된 기작이 완화되었음을 알 수 있었다.
한편, 하기 표 1은 도 1의 결과를 수치화한 것이다.
K. marxianus 17694-DH1 K. marxianus
SBK1		 Improvement (%)
Optical density (A600nm) 12.84 ±0.95 15.36 ±0.25 19
Glucose consumption (g/L) 38.29 ±0.08 38.03 ±0.02
Xylose consumption (g/L) 13.63 ±0.33 35.03 ±0.38 157
Xylose consumption rate (g/L·h) 0.11 ±0.00 0.29 ±0.00 163
Ethanol production (g/L) 15.2 ±0.11 25.47 ±0.97 67
Yield (g/g) 0.29 ±0.44 0.35 ±2.69 19
Productivity (g/L·h) 0.13 ±0.00 0.21 ±0.01 67
표 1에 의하면, 모균주에 비하여, 에탄올의 생산량은 약 10g/L로 67%, 에탄올 수율은 약 0.06g/g으로 19%, 에탄올 생산성은 약 0.08g/L·h로 67% 향상된 것을 확인할 수 있었다.
(3) 글루코스에 의한 분해대사물 억제 ( catabolite repression)
본 발명의 돌연변이주 (클루이베로마이세스 마르시아누스 SBK1)의 글루코스에 의한 분해대사물 억제 완화 정도를 확인하기 위하여, 글루코스의 농도를 다르게 첨가한 배지에서 글루코스-자일로스 동시발효를 수행하였다. (도 2). 도 2는 글루코스 농도에 따른 글루코스-자일로스 동시발효 결과를 나타낸 것이다 (□: 글루코오스, ○: 자일로스, ◆: 흡광도 (OD), ●: 자이리톨, ■: 에탄올). 글루코스의 농도는 20g/L에서 70g/L까지 증가시켰으며, 자일로스의 농도는 40g/L로 고정하였다.
실험 결과, 글루코스의 농도가 증가할수록 자일로스 소비속도가 점차 감소하는 패턴을 보였다.
한편, 하기 표 2는 도 2의 결과를 수치화한 것이다.
Glucose
concentration (g/L)		 Optical density
(A600 nm)		 Xylose
consumption
rate (g/L·		 Ethanol
Production
rate (g/L·		 Yield
(g/g)
20 11.03 ±0.04 0.28 ±0.01 0.19 ±0.00 0.34 ±0.01
30 11.82 ±0.25 0.25 ±0.01 0.24 ±0.00 0.37 ±0.00
40 14.11 ±0.27 0.22 ±0.00 0.28 ±0.00 0.40 ±0.00
50 10.57 ±0.75 0.17 ±0.01 0.22 ±0.04 0.36 ±0.00
60 11.17 ±0.21 0.14 ±0.01 0.22 ±0.00 0.39 ±0.00
70 11.40 ±0.14 0.12 ±0.01 0.21 ±0.01 0.39 ±0.00
표 2에 의하면, 글루코스 농도가 10g/L씩 증가함에 따라 자일로스 소비속도는 0.28g/L·h에서 0.12g/L·h로 대폭 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 이는 글루코스의 농도가 증가할수록 이에 따른 분해대사물 억제 정도가 증가하여 자일로스의 소비속도가 대폭 감소한 것으로 예상된다. 따라서, 클루이베로마이세스 마르시아누스 SBK1는 글루코스로부터 분해대사물 억제가 다소 완화되어 글루코스의 농도와 자일로스의 농도가 각각 40g/L로 같거나 이 보다 적을 때 동시 발효가 가능하지만, 글루코스의 농도가 50g/L 보다 증가할수록 자일로스의 소비속도가 크게 감소한다.
한국생명공학연구원 KCTC18674P 20180307

Claims (7)

  1. 글루코스와 자일로스의 동시발효가 가능한 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P).
  2. 글루코스와 자일로스가 동시에 존재하는 배지에 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)의 배양방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 글루코스 또는 자일로스는,
    배지에 각각 20~40g/L의 농도로 첨가된 것을 특징으로 하는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)의 배양방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 글루코스와 자일로스는,
    동일한 양으로 배지에 첨가된 것을 특징으로 하는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)의 배양방법.
  5. 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) SBK1 (기탁번호:KCTC18674P)을 이용하여 에탄올을 생산하되,
    상기 에탄올은 기질로 목질계 바이오매스를 사용하여 생산하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 생산방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 목질계 바이오매스는,
    셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 에탄올의 생산방법.
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