CN102643868B - 一种生产丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产丁醇的方法。该方法先将发酵菌株Clostridium thermocellum ATCC 27405接入含有玉米棒芯的改良GS培养基中，分阶段控制发酵pH，培养一定时间后，再接入另一种发酵菌株Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，进行偶联发酵生产丁醇。利用该方法可以有效地利用经预处理的玉米棒芯通过厌氧发酵直接生产丁醇，大幅度降低来自纤维素酶的成本，并实现己糖、戊糖同步发酵。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产丁醇的方法，尤其是将木质纤维素降解菌与溶剂高产菌偶联，直接将木质纤维素降解并进一步发酵成为丁醇的方法。
背景技术
丁醇是优良的有机溶剂和重要的大宗基础化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆以及合成橡胶等工业。更因燃烧、储存及运输特性，它是比乙醇更优越的下一代清洁生物燃料。
丁醇的工业制法主要有丙烯羰基合成法、乙醛醇醛缩合法、发酵法三种，其中前两者均以石油为原料。近年来，在石化资源枯竭和环境恶化的双重压力下，能够转化生物质资源为新型燃料丁醇的生物发酵技术又重新受到人们的重视。
传统生物丁醇生产主要以玉米、糖蜜为原料，美国以玉米淀粉为原料发酵生产丁醇总溶剂浓度可达25～33g·L-1，居世界领先水平。玉米是重要的粮食、饲料和发酵工业原料，糖蜜作为制糖工业的下脚料，两者产量均有限，无法满足大规模发展生物丁醇产业的原料需求。在越来越重视粮食安全和能源安全的背景下，探索木质纤维素原料替代粮食原料生产燃料丁醇成为生物质能源发展战略的重要组成。我国木质纤维素原料丰富，每年总量可达20亿吨以上，但利用效率低，造成资源浪费。其中，玉米棒芯是农作物加工废料，富含纤维素和半纤维素，木质素含量低，且价格低廉，是用于发酵生产丁醇的理想原料之一。
传统木质纤维素发酵生产丁醇过程需要添加外源纤维素酶来降解木质纤维素，该纤维素酶主要通过好氧发酵生产，成本较高，已经成为木质纤维素利用的关键技术障碍。同时，木质纤维素发酵生产丁醇过程中己糖、戊糖同步发酵利用效率低也是制约木质纤维素利用的重要因素。将分别具有高效降解木质纤维素和发酵己糖、戊糖能力的两类微生物偶联，能够有效利用木质纤维素通过厌氧发酵直接生产丁醇。高温厌氧纤维小体(cellulosome)产生菌C.thermocellum是目前纤维素降解能力强的厌氧菌之一，其木质纤维素降解速率远大于自身糖代谢速率。C.beijerinckii因能同时利用木糖和葡萄糖，近年来，越来越多的研究选择其作为发酵木质纤维素水解液的溶剂菌。
Petitdemange(Petitdemange E，Fond O，Caillet F，1983，5：119-124)和Yu(YuEKC，Chan MKH，Saddler JN，1985，7：509-514)等学者在20世纪80年代曾尝试C.thermocellum和Clostridium acetobutylicum在37℃下混菌发酵木质纤维素的研究，但实验结果并不理想，发酵停留在产酸期，溶剂产量低，仅1.4g·L-1左右。其关键问题可能是Clostridium acetobutylicum对己糖和戊糖共发酵的能力较弱。最近，Nakayama等(Nakayama S，Kiyoshi K，Kadokura T，2011，77：6470-6475)研究在封闭试管中进行培养温度为30℃的混菌发酵。C.thermocellum以纤维二糖为碳源培养一定时间后收集菌体细胞制成无碳源细胞悬液，再与含有40g·L-1结晶纤维素的培养基1∶1混合，在60℃下培养24h后改变发酵温度为30℃，并接种C.saccharoperbutylacetonicum N1-4，发酵10d，生产丁醇7.9g·L-1，初步实现了结晶纤维素直接厌氧发酵产丁醇。但是，该研究丁醇生产强度仅为0.033g·L-1·h-1，也未涉及天然的木质纤维素原料的利用。
目前，国内外研究中还未见关于C.thermocellum先降解木质纤维素累积高浓度还原糖后再与溶剂菌偶联发酵生产丁醇的报道。因此在以代表性的木质纤维素——玉米棒芯为碳源的情况下，考虑到水解产物为己糖、戊糖混合物，以C.thermocellum和C.beijerinckii偶联发酵生产丁醇。以木质纤维素为原料直接厌氧发酵生产丁醇，将为木质纤维素的资源化和能源化提供有益的思路和方法。
发明内容
本发明的目的提供一种偶联厌氧发酵木质纤维素生产丁醇的方法。将木质纤维素降解菌与溶剂高产菌偶联，直接将木质纤维原料降解并进一步发酵成为丁醇，大幅度降低来自纤维素酶的成本，并实现己糖、戊糖同步发酵。
本发明提出的生产丁醇的方法，包括以下步骤：
1)将保存于冷冻甘油管的偶联发酵体系中的一种发酵菌株Clostridiumthermocellum ATCC 27405接入装有改良GS种子培养基的血清瓶，55～65℃静置培养18～24h，得到一级种子；
将偶联发酵体系中的另一种发酵菌株Clostridium beijerinckii NCIMB 8052由芽孢悬液接入装有TGY培养基的血清瓶，30～40℃静置培养18～24h，得到一级种子；
所说的改良GS种子培养基是由质量体积比分别为0.1％～0.2％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8～7.2；
所说的TGY培养基是由质量体积比分别为0.5％蛋白胨、0.3％酵母粉和0.1％葡萄糖组成，其pH值为7.0～7.5；
2)取2～12ml C.thermocellum一级种子接种于含400ml改良GS培养基的厌氧发酵罐中，发酵转速为100～150r·min-1，培养温度55～65℃，发酵培养初始采用3～5mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH 6.8～7.2，至发酵产H2和CO2混合气体积达到100～250mL时，采用3～5mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH在6.4～6.8；
所说的改良GS培养基是由质量体积比分别为5％～6.5％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8～7.2；
3)当C.thermocellum菌体生长55～100h，补加玉米棒芯16～28g；
4)发酵至105～145h，接种2～8ml C.beijerinckii的一级种子，改变发酵温度为30～40℃，并一直控制在此温度范围，生产得到丁醇。
本发明中，所说的发酵菌株C.thermocellum，分类命名：中文名为嗜热纤维梭菌，拉丁文学名为Clostridium thermocellum ATCC 27405。发酵菌株C.beijerinckii，分类命名：中文名为拜氏梭菌，拉丁文学名为Clostridium beijerinckiiNCIMB 8052。
本发明工艺可操作性强，通过C.thermocellum和C.beijerinckii偶联，能够有效地利用经预处理的玉米棒芯通过厌氧发酵直接生产丁醇，大幅度降低来自纤维素酶的成本，并实现己糖、戊糖同步发酵。适合于工业化应用，前景广阔。
附图说明
图1是C.thermocellum和C.beijerinckii偶联发酵玉米棒芯生产丁醇的特性曲线。其中：
图(a)是发酵产物浓度及pH随时间变化曲线，图中：-■-丁醇；-□-丁酸；-▲-乙醇；-△-乙酸；-●-丙酮；-○-乳酸；——pH；--◇--混合气；
图(b)是玉米棒芯及发酵液中各类还原糖含量随时间变化曲线，图中：-×-玉米棒芯残留；-+-酸水解上清液还原糖含量；-◆-酸水解上清液戊糖含量；-◇-酸水解上清液葡萄糖含量；-*-酸水解上清液其他己糖含量；
图2是C.thermocellum和C.beijerinckii偶联发酵玉米棒芯生产丁醇的特性曲线。其中：
图(a)是发酵产物浓度及pH随时间变化曲线，图中：-■-丁醇；-□-丁酸；-▲-乙醇；-△-乙酸；-●-丙酮；-○-乳酸；——pH；--◇--混合气；
图(b)是玉米棒芯及发酵液中各类还原糖含量随时间变化曲线，图中：-×-玉米棒芯残留；-+-酸水解上清液还原糖含量；-◆-酸水解上清液戊糖含量；-◇-酸水解上清液葡萄糖含量；-*-酸水解上清液其他己糖含量；
图3是C.thermocellum和C.beijerinckii偶联发酵玉米棒芯生产丁醇的特性曲线。其中：
图(a)是发酵产物浓度及pH随时间变化曲线，图中：-■-丁醇；-□-丁酸；-▲-乙醇；-△-乙酸；-●-丙酮；-○-乳酸；——pH；--◇--混合气；
图(b)是玉米棒芯及发酵液中各类还原糖含量随时间变化曲线，图中：-×-玉米棒芯残留；-+-酸水解上清液还原糖含量；-◆-酸水解上清液戊糖含量；-◇-酸水解上清液葡萄糖含量；-*-酸水解上清液其他己糖含量；
图4是C.thermocellum和C.beijerinckii偶联发酵玉米棒芯生产丁醇的特性曲线。其中：
图(a)是发酵产物浓度及pH随时间变化曲线，图中：-■-丁醇；-□-丁酸；-▲-乙醇；-△-乙酸；-●-丙酮；-○-乳酸；——pH；--◇--混合气；
图(b)是玉米棒芯及发酵液中各类还原糖含量随时间变化曲线，图中：-×-玉米棒芯残留；-+-酸水解上清液还原糖含量；-◆-酸水解上清液戊糖含量；-◇-酸水解上清液葡萄糖含量；-*-酸水解上清液其他己糖含量。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明此发明
实施例1
1)将保存于冷冻甘油管的1.5mL偶联发酵体系的一种发酵菌株Clostridiumthermocellum ATCC27405接入装有改良GS种子培养基的200mL血清瓶，60℃静置培养24h，得到一级种子；
将偶联发酵体系中的另一种发酵菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052由1mL芽孢悬液接入装有TGY培养基的100mL血清瓶，37℃静置培养24h，得到一级种子；
所说的改良GS种子培养基是由质量体积比分别为0.1％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
所说的TGY培养基是由质量体积比分别为0.5％蛋白胨、0.3％酵母粉和0.1％葡萄糖组成，其pH值为7.0；
2)取4ml C.thermocellum一级种子接种于含400ml改良GS培养基的厌氧发酵罐中，发酵转速为120r·min-1，培养温度60℃，发酵培养初始采用5mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH7.0，至发酵产H2和CO2混合气体积达到100mL时，采用5mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH在6.5；
所说的改良GS培养基是由质量体积比分别为5％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
3)当C.thermocellum菌体生长60h，补加玉米棒芯22g。
4)发酵至120h，接种4ml C.beijerinckii的一级种子，改变发酵温度为37℃，并一直控制在此温度，生产丁醇。
采用GC测定发酵产物(溶剂：丁醇、乙醇和丙酮；有机酸：丁酸、乙酸和乳酸)的含量，采用DNS法(Miller GL，1959，31：426-428)、盐酸-地衣酚法(Hashimoto S，Shogren MD，Pomeranz Y，1987，64(1)：30-34)、SBA-40D生物传感分析仪葡萄糖氧化酶法分别测定酸水解上清液中还原糖含量。由图1可见，偶联发酵末期总溶剂达16.0g·L-1，其中丁醇浓度高达8.75g·L-1。
实施例2
1)将保存于冷冻甘油管的1.5mL偶联发酵体系的一种发酵菌株Clostridiumthermocellum ATCC27405接入装有改良GS种子培养基的200mL血清瓶，60℃静置培养20h，得到一级种子；
将偶联发酵体系中的另一种发酵菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052由1mL芽孢悬液接入装有TGY培养基的100mL血清瓶，37℃静置培养20h，得到一级种子；
所说的改良GS种子培养基是由质量体积比分别为0.1％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
所说的TGY培养基是由质量体积比分别为0.5％蛋白胨、0.3％酵母粉和0.1％葡萄糖组成，其pH值为7.0；
2)取8ml C.thermocellum一级种子接种于含400ml改良GS培养基的厌氧发酵罐中，发酵转速为120r·min-1，培养温度60℃，发酵培养初始采用3mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH7.0，至发酵产H2和CO2混合气体积达到200mL时，采用3mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH在6.5；
所说的改良GS培养基是由质量体积比分别为5.5％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
3)当C.thermocellum菌体生长60h，补加玉米棒芯22g。当C.thermocellum菌体生长98h，补加玉米棒芯18g。
4)发酵至144h，接种2ml C.beijerinckii的一级种子，改变发酵温度为37℃，并一直控制在此温度，生产丁醇。
采用GC测定发酵产物(溶剂：丁醇、乙醇和丙酮；有机酸：丁酸、乙酸和乳酸)的含量，采用DNS法(Miller GL，1959，31：426-428)、盐酸-地衣酚法(Hashimoto S，Shogren MD，Pomeranz Y，1987，64(1)：30-34)、SBA-40D生物传感分析仪葡萄糖氧化酶法分别测定酸水解上清液中还原糖含量。由图2可见，偶联发酵末期总溶剂达15.0g·L-1，其中丁醇浓度高达8.00g·L-1。
实施例3
1)将保存于冷冻甘油管的1.5mL偶联发酵体系的一种发酵菌株Clostridiumthermocellum ATCC 27405接入装有改良GS种子培养基的200mL血清瓶，60℃静置培养24h，得到一级种子；
将偶联发酵体系中的另一种发酵菌株Clostridium beijerinckii NCIMB 8052由1mL芽孢悬液接入装有TGY培养基的100mL血清瓶，37℃静置培养24h，得到一级种子；
所说的改良GS种子培养基是由质量体积比分别为0.2％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
所说的TGY培养基是由质量体积比分别为0.5％蛋白胨、0.3％酵母粉和0.1％葡萄糖组成，其pH值为7.0；
2)取12ml C.thermocellum一级种子接种于含400ml改良GS培养基的厌氧发酵罐中，发酵转速为120r·min-1，培养温度60℃，发酵培养初始采用5mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH 7.0，至发酵产H2和CO2混合气体积达到120mL时，采用5mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH在6.5；
所说的改良GS培养基是由质量体积比分别为6.5％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
3)当C.thermocellum菌体生长60h，补加玉米棒芯16g。
4)发酵至132h，接种8ml C.beijerinckii的一级种子，改变发酵温度为37℃，并一直控制在此温度，生产丁醇。
采用GC测定发酵产物(溶剂：丁醇、乙醇和丙酮；有机酸：丁酸、乙酸和乳酸)的含量，采用DNS法(Miller GL，1959，31：426-428)、盐酸-地衣酚法(Hashimoto S，Shogren MD，Pomeranz Y，1987，64(1)：30-34)、SBA-40D生物传感分析仪葡萄糖氧化酶法分别测定酸水解上清液中还原糖含量。由图3可见，偶联发酵末期总溶剂达15.7g·L-1，其中丁醇浓度高达7.38g·L-1。
实施例4
1)将保存于冷冻甘油管的1.5mL偶联发酵体系的一种发酵菌株Clostridiumthermocellum ATCC 27405接入装有改良GS种子培养基的200mL血清瓶，60℃静置培养24h，得到一级种子；
将偶联发酵体系中的另一种发酵菌株Clostridiumbeijerinckii NCIMB 8052由1mL芽孢悬液接入装有TGY培养基的100mL血清瓶，37℃静置培养24h，得到一级种子；
所说的改良GS种子培养基是由质量体积比分别为0.2％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
所说的TGY培养基是由质量体积比分别为0.5％蛋白胨、0.3％酵母粉和0.1％葡萄糖组成，其pH值为7.0；
2)取2ml C.thermocellum一级种子接种于含400ml改良GS培养基的厌氧发酵罐中，发酵转速为120r·min-1，培养温度60℃，发酵培养初始采用3mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH 7.0，至发酵产H2和CO2混合气体积达到135mL时，采用3mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH在6.5；
所说的改良GS培养基是由质量体积比分别为5.0％玉米棒芯、0.6％酵母粉、0.21％NH4Cl、0.15％KH2PO4、0.29％K2HPO4、0.1％MgCl2、0.015％CaCl2、0.000125％FeSO4、0.1％L-半胱氨酸、0.0002％刃天青以及0.0004％维生素B1、0.002％维生素B6、0.0002％维生素B12、0.0004％生物素、0.0004％对氨基苯甲酸组成，其pH值为7.0；
3)当C.thermocellum菌体生长60h，补加玉米棒芯20g。
4)发酵至128h，接种8ml C.beijerinckii的一级种子，改变发酵温度为37℃，并一直控制在此温度，生产丁醇。
采用GC测定发酵产物(溶剂：丁醇、乙醇和丙酮；有机酸：丁酸、乙酸和乳酸)的含量，采用DNS法(Miller GL，1959，31：426-428)、盐酸-地衣酚法(Hashimoto S，Shogren MD，Pomeranz Y，1987，64(1)：30-34)、SBA-40D生物传感分析仪葡萄糖氧化酶法分别测定酸水解上清液中还原糖含量。由图4可见，偶联发酵末期总溶剂达15.2g·L-1，其中丁醇浓度高达7.40g·L-1。
Claims (1)
1.一种生产丁醇的方法，其特征是包括以下步骤：
1) 将保存于冷冻甘油管的偶联发酵体系中的一种发酵菌株Clostridium thermocellum ATCC 27405接入装有改良GS种子培养基的血清瓶，55～65 ℃静置培养18～24 h，得到一级种子；
将偶联发酵体系中的另一种发酵菌株Clostridium beijerinckii NCIMB 8052由芽孢悬液接入装有TGY培养基的血清瓶，30～40 ℃静置培养18～24 h，得到一级种子；
所述改良GS种子培养基是由质量体积比分别为0.1 %～0.2 %玉米棒芯、0.6 %酵母粉、0.21 % NH4Cl、0.15 %KH2PO4、0.29 % K2HPO4、0.1 %MgCl2、0.015 %CaCl2、0.000125 % FeSO4、0.1 % L-半胱氨酸、0.0002 %刃天青以及0.0004 %维生素B1、0.002 %维生素B6、0.0002 %维生素B12、0.0004 %生物素、0.0004 %对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8～7.2；
所述TGY培养基是由质量体积比分别为0.5 %蛋白胨、0.3 %酵母粉和0.1 %葡萄糖组成，其pH值为7.0～7.5；
2) 取2～12 ml步骤1) 得到的C. thermocellum ATCC 27405一级种子接种于含400 ml改良GS培养基的厌氧发酵罐中，发酵转速为100～150 r·min-1，培养温度55～65 ℃，发酵培养初始采用3～5 mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH 6.8～7.2，至发酵产H2和CO2混合气体积达到100～250 mL时，采用3～5 mol·L-1氢氧化钠控制发酵pH在6.4～6.8；
所述改良GS培养基是由质量体积比分别为5 %～6.5 %玉米棒芯、0.6 %酵母粉、0.21 % NH4Cl、0.15 %KH2PO4、0.29 % K2HPO4、0.1 %MgCl2、0.015 %CaCl2、0.000125 % FeSO4、0.1 % L-半胱氨酸、0.0002 %刃天青以及0.0004 %维生素B1、0.002 %维生素B6、0.0002 %维生素B12、0.0004 %生物素、0.0004 %对氨基苯甲酸组成，其pH值为6.8～7.2；
3) 当C. thermocellum ATCC 27405菌体生长55～100 h，补加玉米棒芯16～28 g；
4) 发酵至105～145 h，接种2～8 ml 步骤1) 得到的C. beijerinckii NCIMB 8052的一级种子，改变发酵温度为30～40 ℃，并一直控制在此温度范围，生产得到丁醇。
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| Continuous Hydrogen Production During Fermentation of alpha-Cellulose by the Thermophillic Bacterium Clostridium thermocellum;Magnusson, L et al;《Biotechnology and Bioengineering》;20091231;第102卷(第3期) * |
| Magnusson, L et al.Continuous Hydrogen Production During Fermentation of alpha-Cellulose by the Thermophillic Bacterium Clostridium thermocellum.《Biotechnology and Bioengineering》.2009,第102卷(第3期), |
| 林有胜 等.生物燃料丁醇的研究与前景.《现代化工》.2008,第28卷(第4期),84-95. |
| 生物燃料丁醇的研究与前景;林有胜 等;《现代化工》;20080430;第28卷(第4期);84-95 * |
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