KR20060080194A

KR20060080194A - 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템

Info

Publication number: KR20060080194A
Application number: KR1020067005158A
Authority: KR
Inventors: 타넬 텐슨; 실야 라트; 마야 아도야안; 안드레스 메닉; 우르베 투츠; 마트 우스타브
Original assignee: 핏 바이오테크 오와이제이 피엘씨
Priority date: 2003-09-15
Filing date: 2004-09-15
Publication date: 2006-07-07
Also published as: EA011823B1; SI1664305T1; PT1664305E; ES2529346T3; KR101215245B1; AP1993A; EP1664305A1; US7521182B2; FI116068B; PL1664305T3; AU2004272776A1; HK1217111A1; AP2006003577A0; FI20031319A; BRPI0414392A; DK1664305T3; EP2949753A1; MXPA06002559A; US20070036822A1; HK1084975A1

Abstract

본 발명은 항생제 내성 유전자가 없는 선별 시스템에 관한 것으로서, 이 선별 시스템은 벡터 상에서 선별 마커로서 araD 유전자의 사용에 기초하며, 상기 벡터는 araD 유전자가 결핍된 박테리아 균주에 삽입한다. 이.콜라이로부터의 araD 유전자는 L-리불로스-5-포스페이트-4-에피머라제를 코딩한다. 본 발명은 araD 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다. 비-항생제 선별 마커는 시스템을 치료제 생산에 적합하게 한다. araD 유전자는 숙주의 성장에 필수는 아니지만, 그러한 조작은 일부 선별 조건 하에 성장에 영향을 준다. araD 결실은 숙주에게는 독성이나 인간에게는 독성이 아닌 물질을 축적시킨다. araD 유전자는 비교적 작으므로, 복제를 위해 더 낮은 에너지를 필요로 하는 소형 플라스미드를 구성할 수 있으며, 성장 속도와 수율을 증가시킬 수 있다.

Description

비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템{SELECTION SYSTEM CONTAINING NON-ANTIBIOTIC RESISTANCE SELECTION MARKER}

본 발명은 araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편의 선별 마커로서의 사용에 기초한 신규한 선별 시스템, 및 araD 유전자 결핍 박테리아 균주의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편을 포함하는 신규한 벡터와 신규한 araD 유전자 결핍 박테리아 균주에 관한 것이다. 또, 본 발명은 관심 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다.

세포 배양물 내에서 증식하는 박테리아 및 기타 세포의 효과적인 유전자 조작을 위한 필수 요건은 특정 유전자형이 변경된 세포를 선별하는 능력이다. 재조합 DNA 방법에서 가장 일반적인 선별 방법은 클로닝 벡터 또는 플라스미드 내에 선별 마커를 포함하는 것이다. 선별 마커는 선별 마커를 포함하지 않는 숙주 세포로부터 선별 마커를 포함하는 숙주 세포를 분리할 수 있는 클로닝된 유전자 또는 DNA 서열일 수 있다. 적절한 선별 배지와 함께 선별 마커는 세포 내에 클로닝 벡터를 유지한다. 그렇지 않은 경우에는, 플라스미드의 복제가 박테리아 숙주에게 크게 부담되 어, 성장 배양물에서 플라스미드가 없는 박테리아가 플라스미드를 포함하는 세포보다 유리하게 성장한다.

대부분의 용도에서, 항생제 내성 유전자는 범용되는 선별 마커이다. 그러나, 환자에게 투여하기 위한 DNA 백신과 같은 산물을 고 수율로 생성하는 것을 목표로 하는 재조합 치료제 제조를 위해서, 항생제 내성 유전자의 사용은, 항생제 내성 병원체의 유포가 전세계적으로 심각한 문제라는 점을 비롯하여 여러 문제점을 유발한다[Levy, S. B., J. Antimicrob. Chemother. 49 (2002) 25-30]. 따라서, 항생제 내성 유전자는 약학 산업에서 광범위하게 사용할 수 없으며, 예를 들어 미국 식품의약국의 규제에 따라서 제3기로 진입하는 실험 DNA 백신에는 항생제 내성 유전자를 사용할 수 없다.

대안적으로, 항생제 무함유 선별 시스템이 제안된 바 있다. 그러한 항생제 무함유 선별 시스템은 박테리아 독소-항독소 시스템[Engelberg-Kulka, H. and Glaser, G., Annu Rev Microbiol 53 (1999) 43-70], 텔루륨과 같은 중금속에 대한 내성에 관여하는 유전자[Silver, S. and Phung, L. T., Annu Rev Microbiol 50 (1996) 753-789], 및 플라스미드가 숙주 영양요구성을 보완하는 유전자를 코딩하는 시스템[Wang, M. D., et al., J. Bacteriol. 169 (1987) 5610-5614]을 포함한다.

미국 특허 출원 2000/0014476 A1은 특히 비-항생제 선별 마커의 사용을 일반적으로 개시하는 데, 상기 선별 마커는 이화대사 유전자와 같은 유전자 산물이 일정 배양 조건 하에 세포의 대사에 필요한 유전자일 수 있으며, 이는 세포가 배양 배지(특정 탄소원 또는 질소원) 등에 존재하는 일부 물질을 동화할 수 있게 한다. 그러한 적절한 유전자의 구체적인 예는 제시되어 있지 않다. 이러한 방법을 반드시 상업적 제조에 적용할 수 있는 것은 아닌데, 그 이유는 성장 배지로부터 아미노산이나 탄소 공급원과 같은 필수 성분을 제거하면 수율이 감소하여 바람직하지 않기 때문이다. 또한, 필수 영양소를 제외시키는 성장 배지의 조작은, 시판되는 영양소 혼합물을 개별 영양소로 교체해야 하기 때문에 성장 배지의 단가를 상당히 증가시킬 수 있다.

상업적 치료 용도로서, 숙주의 성장에는 필요하지 않지만 그 조작이 선택된 환경에서의 성장에 영향을 미치는 유전자를 사용하는 것이 유리하다. 또한, 치료 용도 관점에서, 제거시 숙주 세포에는 독성이나 인간을 비롯한 포유류에 대해서는 독성이 아닌 화합물의 축적을 유도하는 유전자를 사용하는 것이 유리하다. 또한, 더 작은 유전자를 사용하는 것이 유리한데, 이는 복제를 위한 에너지 소비가 적은 소형 플라스미드를 구성하여 박테리아 배양물의 성장 속도 및 플라스미드 수율을 개선시킨다.

본 발명의 개요

본 발명의 목적은 재조합 치료 산물의 제조시 사용되고 이전에 개시된 바 있는 선별 시스템의 문제를 해소한 신규한 항생제 무함유 선별 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 환경 및 환자의 안전성 측면에서 재조합 치료제 산물의 제조시 안전하게 사용할 수 있는 신규한 항생제 무함유 선별 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 표준 성장 배지를 사용하여 재조합 치료 산물의 제조시 비용 효율적으로 사용할 수 있는 신규한 항생제 무함유 선별 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 성장 속도 증가 및 수율 향상을 제공하는 신규한 항생제 무함유 선별 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 환경 및 인체에 대해 비독성이고 숙주 내에서 장기간 유지될 수 있는 신규한 선별 마커 함유 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 환경에 무해한, 유전자 결핍을 포함하는 신규한 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 치료 산물의 제조를 위해 관심 유전자를 보유하는 세포를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

놀랍게도, araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편의 선별 마커로서의 사용과 특정 araD 유전자 결핍 박테리아 숙주의 사용이 본 발명의 목적에 부합한다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 araD 유전자, 이의 상보성 서열 또는 이의 촉매적 활성 단편을 선별 마커로서 보유하는 벡터가 삽입된 araD 유전자 결핍 박테리아 세포를 포함하는 신규한 선별 시스템을 제공한다. 본 발명의 일 구체예는 araD 유전자가 araD 유전자 또는 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제(EC 5.1.3.4.)인 선별 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 araD 유전자가 돌연변이된 선별 시스템에 관한 것이다.

본 발명은 araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열 또는 이의 촉매적 활성 단편을 선별 마커로서 포함하는 신규한 벡터를 추가로 제공한다.

본 발명은 araD 유전자가 결핍된 신규한 박테리아 균주를 추가로 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 선별 마커로서 araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열 또는 이의 촉매적 활성 단편, 및 2) 관심 유전자를 포함하는, 플라스미드로 형질전환된 세포를 선별하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 araD 결핍 숙주 세포에 상기 플라스미드를 삽입하는 단계 및 아라비노스를 함유하는 성장 배지 중에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

도 1은 이.콜라이 세포에 의한 아리비노스의 탄소 공급원으로서의 사용을 도시한다(Lin, 1987).

도 2는 S6wtd1EGFP의 맵을 도시한다. d1EGFP, E2 및 카나마이신 내성 마커 아미노글리코시드-3'-O-포스포트랜스퍼라제(kana)는 화살표로 표시되어 있다. 추가의 특징은 진한 선으로 표시되어 있다: 10E2BS - 친화도가 높은 10개의 BPV E2 결합 부위; CMV-tk - 인간 시토메갈로바이러스 직조기(immeadiately early) 프로모터 및 HSV Th 유전자 리더 서열; 인트론 - SD 및 SA 부위가 최적화된 토끼 베타-글로빈 유전자 인트론; tkpa - HSV Tk 유전자 폴리아데닐화 신호; RSV LTR - 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부; bgh pA - 소 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 신호; pUCori - pUC18 플라스미드로부터 유도된 박테리아 복제 기점.

도 3은 S6wtd1EGFPkana/araD1의 맵을 도시한다. d1EGFP, E2, 카나마이신 내성 마커 아미노글리코시드-3'-O-포스포트랜스퍼라제(kana) 및 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제(araD)에 대한 코딩 서열은 화살표로 표시되어 있다. 추가의 특징은 진한 선으로 표시되어 있다: 10E2BS - 친화도가 높은 10개의 BPV E2 결합 부위; CMV-tk - 인간 시토메갈로바이러스 직조기 프로모터 및 HSV Th 유전자 리더 서열; 인트론 - SD 및 SA 부위가 최적화된 토끼 베타-글로빈 유전자 인트론; tkpa - HSV Tk 유전자 폴리아데닐화 신호; RSV LTR - 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부; bgh pA - 소 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 신호; pUCori - pUC18 플라스미드로부터 유도된 박테리아 복제 기점.

도 4는 S6wtd1EGFPkana/araD2의 맵을 도시한다. d1EGFP, E2, 카나마이신 내성 마커 아미노글리코시드-3'-O-포스포트랜스퍼라제(kana) 및 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제(araD)에 대한 코딩 서열은 화살표로 표시되어 있다. 추가의 특징은 진한 선으로 표시되어 있다: 10E2BS - 친화도가 높은 10개의 BPV E2 결합 부위; CMV-tk - 인간 시토메갈로바이러스 직조기 프로모터 및 HSV Th 유전자 리더 서열; 인트론 - SD 및 SA 부위가 최적화된 토끼 베타-글로빈 유전자 인트론; tkpa - HSV Tk 유전자 폴리아데닐화 신호; RSV LTR - 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부; bgh pA - 소 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 신호; pUCori - pUC18 플라스미드로부터 유도된 박테리아 복제 기점.

도 5는 S6wtd1EGFP/araD1의 맵을 도시한다. d1EGFP, E2 및 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제(araD)에 대한 코딩 서열은 화살표로 표시되어 있다. 추가의 특징은 진한 선으로 표시되어 있다: 10E2BS - 친화도가 높은 10개의 BPV E2 결합 부위; CMV-tk - 인간 시토메갈로바이러스 직조기 프로모터 및 HSV Th 유전자 리더 서열; 인트론 - SD 및 SA 부위가 최적화된 토끼 베타-글로빈 유전자 인트론; tkpa - HSV Tk 유전자 폴리아데닐화 신호; RSV LTR - 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부; bgh pA - 소 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 신호; pUCori - pUC18 플라스미드로부터 유도된 박테리아 복제 기점.

도 6는 S6wtd1EGFP/araD2의 맵을 도시한다. d1EGFP, E2 및 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제(araD)에 대한 코딩 서열은 화살표로 표시되어 있다. 추가의 특징은 진한 선으로 표시되어 있다: 10E2BS - 친화도가 높은 10개의 BPV E2 결합 부위; CMV-tk - 인간 시토메갈로바이러스 직조기 프로모터 및 HSV Th 유전자 리더 서열; 인트론 - SD 및 SA 부위가 최적화된 토끼 베타-글로빈 유전자 인트론; tkpa - HSV Tk 유전자 폴리아데닐화 신호; RSV LTR - 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부; bgh pA - 소 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 신호; pUCori - pUC18 플라스미드로부터 유도된 박테리아 복제 기점.

도 7a 및 7b는 상이한 배지에서 성장한 이.콜라이 균주 AG1델타 araD로부터 추출한 S6wtd1EGFP/araD1 (7a) 및 S6wtd1EGFP/araD2 (7b)의 플라스미드 DNA의 전기영동 분석 결과를 도시한다.

도 8은 이.콜라이 균주 AG1델타araD로부터 추출한 S6wtd1EGFP/araD1 및 S6wtd1EGFP/araD2의 플라스미드 DNA의 제한 패턴 분석 결과를 도시한다.

도 9는 안정성 분석에 있어서 S6wtd1 EGFP/araD2의 전기영동 분석 결과를 도 시한다.

도 10a 및 10b는 안정성 분석에 있어서 S6wtd1EGFP/araD2의 제한 패턴 분석 결과를 도시한다.

도 11은 발효 과정에서 측정 및 공인된 AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2의 공급물-회분식 발효의 성장 파라미터를 도시한다. 약어는 다음과 같다: sPump = 공급 속도; p02 = 산소 농도; 온도 = 배양 온도; mys = 목적하는 성장 속도; OD = 600 nm에서의 흡광도.

도 12는 AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2의 세포용해 및 정제 방법을 도시한다.

도 13a 및 13b는 클론 13의 araD 유전자좌 서열을 도시한다.

도 14는 플라스미드 p3hCG의 맵을 도시한다.

도 15는 플라스미드 paraDMgB의 맵을 도시한다.

도 16은 플라스미드 p3araD1hCG의 맵을 도시한다.

도 17은 플라스미드 p3araD2hCG의 맵을 도시한다.

도 18은 araD가 파괴된 이.콜라이 균주의 L-아라비노스 감수성의 분석 결과를 도시한다.

도 19는 글루코스 및 아라비노스 농도가 상이한 M9 및 효모 추출 배지에서의 L-아라비노스 감수성의 분석 결과를 도시한다.

도 20은 플라스미드 p2 MG C#11의 맵을 도시한다.

도 21은 플라스미드 paraD MG C #145의 맵을 도시한다.

도 22a 및 도 22b는 sgbE 유전자를 포함하는 이.콜라이 게놈 단편을 도시한 다.

도 23a 및 23b는 ulaF 유전자를 포함하는 이.콜라이 게놈 단편을 도시한다.

본 발명은 생체내 투여할 재조합 치료 산물의 생산, 특히 DNA 백신의 생산에 사용할 수 있는, 항생제 무함유의 대체 선별 시스템을 얻고자 하는 노력에 기초한다. 놀랍게도, 원핵 및 진핵 유기체, 예컨대 인간을 비롯한 포유류의 오탄당 인산 회로에 관여하는 araD 유전자를 플라스미드용 영양요구성 숙주 세포에서 선별 마커로서 성공적으로 사용할 수 있다는 것을 발견하였다. 영양요구성을 이용하면 나중에 플라스미드 제제를 오염시키는 독성 물질의 사용이나 형성을 포함하지 않아 유리하다.

araD/araC 유전자를 기초로 효과적인 선별 시스템을 구성한 바 있다 [Ariza, R. R., et al., Carcinogenesis 14 (1993) 303-305]. 그러나, 이러한 선별 시스템이 돌연변이유발 메카니즘에 대한 연구에 사용된 적은 있지만 플라스미드 유지용 선별 마커로서 이전에 사용된 적은 없었다. Ariza 등은 araC 유전자가 종결 코돈을 포함하고 araD 유전자 불활성화된 균주를 사용하였다. 서프레서 tRNA를 코딩하는 supF 유전자 산물을 플라스미드에 도입하였다. 활성 서프레서 tRNA의 존재 하에, araC로부터 효소적 활성 산물을 생성하여 세포 성장 정지를 유발하였다(araD가 불활성이기 때문임). 이 시스템으로 supF tRNA에 의한 돌연변이 억제 연구가 가능하며; supF가 돌연변이로 불활성화되는 경우에는 세포가 아라비노스 상에서 증식할 수 있다. 따라서, 이러한 선별 시스템은 araD 유전자가 아니라 araC 유전자에 기초하는 것이다. araD는 플라스미드에 도입된 적도 없고, 상기 시스템이 플라스미드 제조 목적으로 고안되거나 특성화된 적도 없었다.

araD는 리불로스-5-포스페이트에서 크실룰로스-5-포스페이트로의 에피머화에 관여하는 효소를 코딩하고(도 1), 따라서 오탄당 인산 회로에서 아라비노스를 사용할 수 있다[Engelsberg, E., et al, J. Bacteriol. 84:(1962) 137-146]. araD가 불활성화되면, 리불로스-5-포스페이트는 박테리아 세포에서 축적되어 성장 정지를 유도한다.

araD의 염색체 카피를 숙주 세포 내에서 불활성화시키고 araD 유전자의 온전한 카피, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열 또는 이의 촉매적 활성 단편을 플라스미드에 삽입한 경우, L-아라비노스를 함유하는 배지 중 상기 플라스미드 함유 세포의 성장 이점은 2가지 효과의 결과로서 얻어진다. 첫째는, 플라스미드 함유 세포가 탄소원으로서 아라비노스를 사용할 수 있고, 둘째는 독성 리불로스-5-포스페이트가 축적되지 않는다. 이로 인하여 아리비노스가 보충된 리치(rich) 성장 배지를 사용할 수 있다. 리치 배지에서 이.콜라이 세포는 빠르게 성장하며 플라스미드 수율이 높다. 효모 추출물과 같은 저렴한 박테리아 성장 배지의 표준 성분을 아미노산 공급원으로서 사용할 수 있다. 이론적으로 플라스미드 제제를 오염시키는 미량의 리불로스-5-포스페이트는 문제가 아닌데, 그 이유는 상기 제제를 생체내 투여하는 경우 리불로스-5-포스페이트가 인간 세포에 의해 효과적으로 대사되고 독성이 아니기 때문이다.

araD 유전자의 돌연변이 형태의 사용은 특별한 장점을 제공한다. araD 유전자가 결핍된 박테리아 세포에 선별 마커로서 araD 유전자의 돌연변이 형태를 보유하는 벡터를 포함시킨 본 발명의 선별 시스템은 araD 유전자 산물인 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제를 최적 농도로 생성하여 박테리아의 억제되지 않은 신속한 성장을 가능하게 한다. 완전한 araD 유전자를 보유하나 araD 유전자좌의 임의 위치에서 결실 또는 돌연변이를 포함하는 벡터를 함유하는 선별 시스템을 사용하면 유사한 장점이 얻어진다.

본 발명의 선별 시스템은 1) 선별 마커로서 araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편을 보유하는 벡터와, 2) 벡터가 부가되는 특정 araD 유전자 결핍 박테리아 균주를 포함한다. 아라비노스의 존재 하에 특정 araD 유전자 결핍 숙주를 배양하면, araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편을 포함하는 벡터를 함유하는 세포만이 살아남는다.

본 발명의 선별 시스템에서, 치료용 산물 제조에 통용되는 임의의 발현 벡터를 사용하여, 당업계에 일반적으로 공지된 방법으로 araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편을 벡터에 삽입한다. 본 발명에서, araD 유전자는 서열 번호 1의 서열, 서열 번호 19의 서열 또는 이에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 임의의 적용가능한 araD 유전자도 포함한다. 본 발명에서, "araD 유전자의 촉매적 활성 단편"은 L-리불로스-5-포스페이트를 D-크실룰로스-5-포스페이트로 에피머화할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 임의의 유전자 단편이다. 본 발명의 특정 구체예에서, araD 유전자, 이의 상보성 서열 또는 이의 촉매적 활성 단편을 장기간 유지할 수 있는 벡터 내에 삽입하여, 목적하는 항원(들)을 안정하게 발현시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열 또는 이의 촉매적 활성 단편을 장기간 유지할 수 있는 벡터에 삽입하여, 목적하는 항원(들)을 안정하게 발현시킬 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 사용된 벡터는

(a) 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵 고착(nuclear-anchoring) 단백질을 코딩하는 DNA 서열[상기 핵 고착 단백질은 (i) 특정 DNA 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인, 및 (ii) 핵 성분에 결합하는 기능성 도메인, 또는 이의 기능적 등가물을 포함함]; 및

(b) 핵 고착 단백질에 대한 결합 부위를 형성하는 다량체화된 DNA 서열[상기 벡터는 파필로마 바이러스의 복제 기점이 결핍되어 있음]; 및

(c) araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편

을 포함하는 발현 벡터이다.

그러한 벡터는 참고 인용한 국제 특허 출원 W002/090558호에 상세히 개시되어 있다.

본 발명의 선별 방법에 사용된 벡터는

(a) 소 파필로마 바이러스 타입 1(BPV)의 E2 단백질, 및

(b) 클러스터로서 벡터에 통합된 BPV E2 단백질의 복수의 결합 부위[이 부위는 머리 대 꼬리 구조로서 존재할 수도 있고, 또는 이격된 위치에 의해 벡터 내에 함유될 수 있으며, 상기 벡터에는 파필로마 바이러스 복제 기점이 결핍되어 있음]; 및

(c) araD 유전자, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편

을 포함하는 발현 벡터인 것이 가장 바람직하다.

원칙적으로 본 발명의 선별 시스템에는 araD 유전자가 결핍되어 있고 치료 산물의 제조시 사용하기 적합한 임의의 공지된 숙주를 사용할 수 있다. 본 발명에서 용어 "결핍"은 임의의 공지된 방법으로 araD 유전자를 전체적으로 결실시키거나 불활성화시킨 숙주를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, araD 유전자를 일반적인 방법, 예컨대 하기 실시예에 개시된 방법으로 결실시킨 에스케리치아 콜라이 균주, 바람직하게는 시판되는 이.콜라이 균주 DH5α-T1, AG1 또는 JM109를 사용한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 다른 유전자의 제거를 위해 조합 결실시킨 이.콜라이 균주, 바람직하게는 이.콜라이 균주 DH5α-T1, AG1 또는 JM109를 사용한다. 대안적으로, L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 araD 유전자 및/또는 기타 유전자를 당업계에 공지된 방법으로 불활성화시킨 시판용 이.콜라이 균주, 바람직하게는 이.콜라이 균주 DH5α-T1, AG1 또는 JM109를 사용할 수 있다. 재조합 치료용 산물의 제조를 위해 관심 유전자를 보유하는 세포를 선별하는 방법에 있어서, 관심 유전자를 당업계에 공지된 방법으로 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 araD 유전자 및/또는 다른 유전자가 결핍된 숙주 세포로 삽입하고, 해당 숙주에게 적절한 배양 배지 및 조건 하에 아라비노스를 함유하는 성장 배지에서 세포를 배양한다.

이.콜라이 세포를 배양하기에 적절한 임의의 성장 배지를 사용할 수 있다. 양산을 위해서는, 성장 배지가 수율 측면에서 최적화되어야 하는 것은 당연하다. 적절한 성장 배지의 예는 시판되는 성장 배지, 예컨대 M9 및 LB (몇몇 제조업체, 예컨대 리투아니아 Fermentas사로부터 입수 가능)이다. 성장 배지에 첨가되는 아라비노스의 양은 중요하지 않지만, 아라비노스는 총 배양 기간 동안 충분한 양으로 존재해야 한다. 0.1% 정도의 소량이면 선별에 충분한 것으로 확인되었다. 통상적으로, 아라비노스는 약 0.1∼2.0%, 바람직하게는 약 0.2∼약 1.0%, 가장 바람직하게는 0.2∼약 0.5%의 양으로 배지에 첨가한다. 그러나, L-아라비노스의 효과는 0.01% 정도의 낮은 농도에서도 관찰되고, 성장 배지에 최대 5%로 L-아라비노스를 첨가할 수 있다. L-아라비노스를 선별제로서, 그리고 제한된 탄소원으로서 사용하는 특정 구체예에서, 성장 배지에 첨가해야 하는 L-아라비노스의 적량은 0.2%이다.

본 발명의 선별 시스템은 임의의 발현계에서 사용하기 적절하다. 특히, 본 발명의 선별 시스템은 항생제 내성 유전자의 사용과 관련된 문제를 피할 수 있기 때문에 생체내 사용하기 위한 DNA 백신과 같은 재조합 치료용 산물의 발현에 사용하기 적합하다. 유사하게, 본 발명의 선별 시스템은 재조합 단백질의 생성에 사용하기 적절하다.

아라비노스는 식품에 자연적으로 그리고 첨가제로서 포함되는 식용 당분이며 인간을 비롯한 포유류에 대한 독성이 없기 때문에 제조 방법으로부터 얻은 최종 산물에서 가능한 아라비노스 오염은 별것 아니다.

또한, araD 유전자는 예를 들어 앰피실린 및 테트라사이클린에 대해 통용되는 항생제 내성 유전자보다 크기가 작고, 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 유전자와 크기가 유사하다. 이로 인해서 거대한 플라스미드에서보다 복제 에너지 소비가 작은 소형 플라스미드를 구성할 수 있기 때문에, 추가의 장점을 얻을 수 있다. 따라서, 박테리아 배양물의 성장 속도와 플라스미드의 수율이 모두 증가한다.

본 발명은 본 발명의 예로서 제공된 하기의 비제한적인 실시예를 참조하면 더욱 잘 이해될 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 더욱 상세히 설명하기 위해 제시된 것이다. 그러나 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.

실시예 1

ara D 선별 플라스미드의 클로닝

araD 선별 구성체를 클로닝하기 위해서 플라스미드 S6wtd1EGFP (도 2)를 사용하였다. 이 플라스미드는 플라스미드 골격의 기능 성분으로서 pMB1 복제 기점과 카나마이신 내성 마커를 포함한다. 플라스미드 내의 카나마이신 내성은 이.콜라이 트랜스포존 Tn903으로부터 유도된 유전자에 의해 부여된다.

표준 절차에 따라서 이.콜라이 DH5α 염색체로부터 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 araD 유전자를 증폭시켰다. 프라이머쌍 s6araDL1 + s6araDR1 또는 s6araDL1 + s6araDR1을 이용하여 2개의 다른 방향으로 선별된 플라스미드에 상기 PCR 산물을 클로닝하여, 각각 araD1 및 araD2로 명명한 산물을 얻었다.

s6araDL1:

CGCCATGGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAGCACGAAGGAGTCAACATG (서열 번호 2);

s6araDR1:

CGCCATGGACTAGTAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCATTACTGCCCGTAATATGC (서열 번호 3);

s6araDL2:

CGCCATGGACTAGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAGCACGAAGGAGTCAACATG (서열 번호 4);

s6araDR2:

CGCCATGGAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCATTACTGCCCGTAATATGC (서열 번호 5).

상기 플라스미드는, (pBR322 내의 테트라사이클린 내성 유전자를 작동시키기 위해 사용된) 플라스미드 pBR322 유래의 P2 프로모터와 이.콜라이의 trp 오페론으로부터의 종결 서열이 PCR 과정에서 araD 코딩 서열의 상류 및 하류에 각각 부가되도록 고안하였다.

814 bp 및 815 bp의 PCR 산물을, HinclI로 선형화한 pUC18 벡터 (리투아니아 Fermentas사) 내로 클로닝하고, 하기와 같은 범용의 서열결정 프라이머를 사용하여 서열 결정함으로써 정확한 서열을 입증하였다.

M13F22:GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA (서열 번호 6) 및

M13R24:GAGCGGATAACAATTTCACACAGG (서열 번호 7) 및 araD 특이적 프라이머

araD F311: CCAACTCACCGGCTGCTCTATC (서열 번호 8),

araD F614: AATGCCGAAGATGCGGTGCATAAC (서열 번호 9),

araD R700: TAACTGCGGCGCTAACTGAC (서열 번호 10), 및

araD R421: GGTTGCTGGAATCGACTGAC (서열 번호 11).

증폭 서열 내의 돌연변이는 상이한 클론의 재조합으로 수복하였다.

S6wtd1EGFP로의 araD의 클로닝을 위해서, 제한 효소 PagI (위치 4761) (리투아니아 Fermentas사)로 부분 분해하여 벡터를 선형화하고, DNA 5'-말단을 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIAP; 리투아니아 Fermentas사)로 탈인산화하였다. araD1 및 araD2 단편은 NcoI (리투아니아 Fermentas사)을 이용하여 pUC18로부터 절취하여S6wtd1EGFP/PagI에 결찰시켰다.

양 결찰 혼합물을 이.콜라이 DH5α 컴피턴트 세포로 형질전환시키고 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지를 포함하는 접시 상에서 평판배양하고, 밤새 37℃에서 항온처리하였다. 먼저 콜로니 PCR로 콜로니를 분석한 다음, DNA를 분리하고 다른 제한 효소로 분해하였다.

클로닝 결과 도 3 및 도 4에 도시된 S6wtd1EGFPkana/araD1 및 S6wtd1EGFPkana/araD2를 얻었다.

카나마이신 내성 마커 유전자를 플라스미드로부터 제거하기 위해서, 제한 엔도뉴클레아제 BcuI (리투아니아 Fermentas사)로 S6wtd1EGFPkana/araD1 및 S6wtd1EGFPkana/araD2로 분해하고, 6473 bp 벡터 단편을 자가 결찰시켰다.

결찰 혼합물은 이.콜라이 AG1 ΔaraD 균주로 형질전환시키고(실시예 3 참조), 2% L-아라비노스가 보충된 M9 배지를 포함하는 접시에 평판배양하고 36 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 먼저, 콜로니 PCR로 콜로니를 분석한 다음, DNA를 분리하고 다른 제한 효소로 분해하였다. 클로닝 결과, 각각 도 5 및 6에 도시된 S6wtd1EGFP/araD1 및 S6wtd1EGFP/araD2를 얻었다.

S6wtd1EGFP/araD1 및 S6wtd1EGFP/araD2를 함유하는 박테리아 콜로니를 2개의 다른 배지, 즉 2.5% L-아라비노스가 보충된 LB 및 0.2% L-아라비노스가 보충된 M9에서 격렬히 진탕하면서 37℃에서 배양하였다. 세포를 수거하고, QlAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)를 사용하여 세포로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다(각각 도 7a 및 7b).

LB 및 M9 배지 내에 배양물로부터 얻은 플라스미드 DNA 샘플을, 제한 엔도뉴클레아제 PagI (리투아니아 Fermentas사)로 분해시키기 전 및 후에 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다(도 8). PagI 분해에서 얻은 단편의 예상 크기는 S6wtd1EGFP/araD1의 경우 3954 및 2519 bp이고 S6wtd1EGFP/araD2의 경우 4315 및 2157 bp였다. Eco91I로 분해한 람다 DNA(도 8c의 M15)와 EcoRl/HindIII (리투아니아 Fermentas사)로 분해한 람다 DNA (도 8c의 M3)를 분자량 마커로서 사용하였다. 분석한 모든 박테리아 클론은 제한 효소 분석에서 적당한 플라스미드를 포함하였으 나, LB 배지에서 플라스미드를 배양한 경우에는 DNA 수율이 매우 낮았다. 4개의 S6wtd1EGFP/araD2 클론(도 8b의 #13 및 #14)으로부터 분석된 박테리아 클론 중 2개는, 0.2% L-아라비노스가 보충된 M9 배지에서 배양할 때 성장율이 더 높았으며(도 7 및 8), 그 결과 1회 배양당 플라스미드 수율이 더 높았다.

성장율이 개선된 2개의 클론의 추가 분석을 실시하였다. 제한 분석으로 판정되는 바와 같이 2개의 플라스미드는 다른 플라스미드와 구조가 동일하였다. 플라스미드를 박테리아로부터 추출하고, araD 유전자좌를 서열결정하여 추가로 특성규명하였다. 클론 #13의 araD 유전자좌 서열(서열 번호 18; 서열 번호 19)은, araD 유전자 코딩 서열이 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제의 위치 8에서 글루타민 코돈 대신에 종지 코돈을 보유한다는 것을 보여준다. 이 돌연변이는, L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제(araD 코딩 서열)의 코돈 8에서 시티딘(5'-CAG-3')이 티미딘으로 치환되어 생긴 것으로, 종지 코돈(5'-TAG-3')을 형성한다. araD 유전자 내에 그러한 돌연변이를 보유하는 플라스미드는, 코딩 서열이 종지 코돈을 포함하더라도, L-아라비노스의 존재 하에 선별 배지에서 성장하는 능력을 효과적으로 제공하였다. 종지 코돈이 코딩 서열의 시작 부분에 있는 경우에도 에스케리치아 콜라이의 리보좀이 종지 코돈 UAG를 효과적으로 판독한다는 것이 입증되었다[Murgola, E. J., Annu. Rev. Genet. 19(1985) 57-80 참조]. 이론에 구애받지 않으면서, 본 발명자들은 박테리아의 억제되지 않은 신속한 성장의 지표인 플라스미드의 높은 수율을 위해서는 araD 유전자 산물인 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제가 최적 농도로 필요하다는 가설을 세웠다.

클론 #14 araD 유전자좌 서열의 분석 결과, araD 코딩 서열은 예상한 바와 같이 완벽하였다. 그러나, E2 단백질 결합 부위를 포괄하는 araD 프로모터 부근의 서열 재배열이 관찰되었다(도 13a 및 13b, 서열 번호 18 참조). 또한, 이들 데이타가 시사하는 바는, 프로모터 부근의 재배열이 프로모터 활성의 하향조절을 초래하여, araD 산물의 레벨을 낮춘다는 것이다.

실시예 2

돌연변이된 ara D 선별 플라스미드의 클로닝

돌연변이된 araD 선별 구성체를 클로닝하기 위해, 카나마이신 내성을 수반하는 플라스미드 p3hCG[트랜스포존 Tn5 유래된 카나마이신 내성 마커 (neo) 유전자](도 14)를 제한 엔도뉴클레아제 BcuⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, 말단은 Klenow 단편(리투아니아 Fermentas사)을 사용하여 채운 뒤, 크기가 4,647 bp인 단편을 아가로스 겔 전기영동 후에 겔로부터 정제하였다. pMB1 복제 기점, 및 araD 유전자 코딩 서열의 8번 위치에 정지 코돈을 생성하는 C → T 돌연변이가 있는 araD 서열은 제한 엔도뉴클레아제 BcuⅠ 및 Eco52Ⅰ를 사용하여 플라스미드 paraDMgB로부터 잘라내고(도 15), 말단은 Klenow 단편(리투아니아 Fermentas사)을 사용하여 채운 뒤, 송아지 소장 알칼리성 포스파타제(CIAP; 리투아니아 Fermentas사)로 DNA 5'-말단을 탈인산화시켰다. 크기가 1,532 bp인 단편은 아가로스 겔 전기영동 후에 겔로부터 정제하고, 상기 수득한 4,647 bp 단편과 결찰시켰다. 에스케리치아 콜라이 AG1 araD가 결핍된 균주는 이 결찰 혼합물로 형질변환시키고, 0.5% 효모 추출물, 2% L-아라비노스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖가 있는 선별성 M9 배지를 함유하는 아가 플레이트 에 플레이팅하였다. 콜로니를 플레이팅하고, 24시간 후에 이를 검사하고, 콜로니의 크기가 균일한지를 보았다. 플라스미드는 박테리아로부터 추출한 뒤, araD 유전자좌를 서열화하여 특징지었다.

상기 클로닝으로 각각 도 16 및 도 17에 도시되어 있는 플라스미드 p3araD1hCG 및 p3araD2hCG를 얻었다. 서열 분석에 따르면, 박테리아는 코돈 8에 C → T로의 돌연변이가 있는 재배열되지 않은 플라스미드를 포함하고 있었다(p3araD1hCG; 도 16; p3araD2hCG; 도 17).

이 실험을 야생형 서열로 반복하고 형질변환시키고, 24시간 후에 형질변환된 플레이트를 조사하는 경우, 그 결과는 상이하였다. 2가지 형태의 콜로니가 관찰되었다: 첫째는 크기가 큰 콜로니이고, 둘째는 성장이 지연된 작은 콜로니임. 이들 플라스미드의 서열 분석에서, araD 유전자 코딩 서열은 글루타민에 대한 코돈 대신 정지 코돈을 가지고 있거나(플라스미드 #3A, araD2), 또는 돌연변이가 리보솜 결합 부위 중의 샤인-달가르노 서열에서 발생한다(AGGAG는 AGTAG로 치환됨)(플라스미드 #2A, araD2)는 것이 드러났다. 그러나, 플라스미드 #7(araD1)은 모든 araD 유전자좌 영역에서 정확한 서열을 가지고, 박테리아는 매우 천천히 성장하며, 액체 배지에서 성장시킬 경우 플라스미드 수율이 10배 더 낮았다.

실시예 3

아라비노스 민감성 Δ ara D 에스케리치아 콜라이 균주의 구성

3개의 이. 콜라이 균주 DH5αT1, AG1 및 JM109를 사용하여, ΔaraD 돌연변이체를 구성하였다. 이. 콜라이 게놈 중의 araD 유전자는 Datsenko 및 Wanner에 의한 문헌 [PNAS 97 (2000) 6640-6645]에 기재된 방법을 사용하여 파괴하였다. 이 방법은 파지 λ Red 재조합 시스템을 이용한다. 요컨대, 이 시스템의 방법은 상동성이 확장된 프라이머를 사용하여 PCR로 생성한 선별성 항생제 내성 유전자로 염색체 서열을 치환하는 것이다. 이는 상기 측접 상동성 부위의 Red-매개성 재조합으로 수행한다.

파지 λ 재조합 시스템을 코딩하는 pKD46(Datsenko 및 Wanner에 의한 문헌, 상기함)을 형질변환시키기 위해, RF1 및 RF2 용액을 사용하여 이. 콜라이, 즉, 세포를 화학적으로 항체 반응 능력이 있게 만들었다:

RF1 100 ㎖

RbCl 1	1.2 g
MnCl₂·4H₂O	0.99 g
1 M KAc pH 7.5	3 ㎖
CaCl₂·2H₂O	0.15 g
글리세롤	15 g
pH 5.8	(CH₃COOH 첨가)

RF2 100 ㎖

0.5 M MOPS	2 ㎖
RbCl	0.12 g
CaCl₂·2H₂O	1.1 g
글리세롤	15 g
pH 6.8	(NaOH 첨가)

세포는 2 ㎖ LB 배지에서 OD₆₀₀이 0.2∼0.5가 되도록 성장시켰다. 배양물은 원심분리하고, 펠릿은 RF1 1 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 혼합물은 얼음 상에 10분간 둔 뒤 원심분리하였다. 펠릿은 RF2 100 ㎕ 중에 현탁시키고, 현탁액은 얼음 상에 30∼ 45분간 두었다. 약 50 ng의 pKD43을 첨가하고, 세포를 30분 더 얼음 상에 둔 뒤, 37℃에서 5분간 열 충격을 주었다. 얼음 상에서 10분간 배양한 뒤, SOB 배지 900 ㎕를 형질변환된 세포에 첨가하고, 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포는 앰피실린(100 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 배지에 플레이팅하였다. 형질변환 플레이트에서 콜로니를 골라내어, 2 ㎖의 동일한 배지에서 OD₆₀₀이 약 1이 되도록 성장시키고, 글리세롤 저장액을 제조하였다(배양물 2 ㎖ + 50% 글리세롤 0.6 ㎖). 이 저장액은 -80℃에서 저장하였다.

araD 유전자를 파괴하기 위해, 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 직선형 PCR 생성물을 만들었다. 플라스미드 pKD13(Datsenko 및 Wanner에 의한 문헌 [PNAS vol. 97, no 12, June 2000])을 PCR 주형으로 사용하였다. 사용한 프라이머는 ara(pr1) 및 ara(pr4)였다:

ara(pr1)

5'-CTCAAACGCCCAGGTATTAGAAGCCAACCTGGCGCTGCCAAAACACGTGTAGGCTGGAGCTGC TTC 3' (서열 번호 12)

ara (pr4)

5'-GGTTTGATCACAAAGACGCCGCGCTCGCGATCAACGGCGCATTCCGGGGATCCGTCGACC 3' (서열 번호 13)

이들 프라이머는 PCR에서 어닐링(annealing)하기 위한 pKD13 및 상동성 재조합을 위한 araD 유전자와 상보성이 있는 서열을 가진다.

PCR 반응 혼합물은 다음과 같았다: PFU 천연 완충액(5 ㎕), 10 mM dNTP(5 ㎕), 프라이머 ara(pr1) 10 μM(1 ㎕), 프라이머 ara(pr4) 10 M(1 ㎕), pKD13 100 ng(2 ㎕), DMSO(4 ㎕), PFU 2.5 U(1 ㎕) 및 최대 50 ㎕의 mQ수(mQ water).

PCR 절차는 다음과 같았다: 변성 45초, 96℃; 어닐링 45초, 50℃; 합성 2분 30초, 72℃, 25 사이클. 수득한 PCR 생성물은 1.4 kb였다.

5개의 반응을 동시에 수행하였다; DNA는 Ultrapure 정제 키트(MoBio Laboratories사)를 사용하여 2% 아가로스 겔로부터 정제하고, 물 60 ㎕로 용출시켰다. DNA는 에탄올 침전으로 농축시키고, 물 5 ㎕에 용해시켰다. 최종 농도는 0.6 ㎍/㎕였다. 전기천공 시, 분액 1.5 ㎕를 사용하였다.

PCR 생성물은 DH5αT1 pKD46, AG1 pKD46(Datsenko 및 Wanner에 의한 문헌, 상기함) 및 JM109 pKD46 이. 콜라이 세포로 전기천공시켰다. 우선, 재조합 시스템을 유도하기 위해 L-아라비노스 10 mM 및 앰피실린 100 ㎍/㎖를 함유하는 YENM 배지 200 ㎖를 밤새 배양한 DH5αT1 pKD46, AG1 pKD46 및 JM109 pKD46 이. 콜라이 세포의 배양물과 접종시켰다. 이 배양물은 30℃에서 OD₆₀₀이 0.8(DH5αT1 및 JM109) 및 0.6(AG1)이 되도록 성장시켰다. 박테리아는 4℃에서 10분간 4,000 g에서 원심분리하여 수거하고, 멸균수 20 ㎖로 2회 세척한 뒤, 10% 글리세롤을 함유하는 멸균수 20 ㎖로 1회 세척하였다. 세포는 10% 글리세롤을 함유하는 물 300 ㎕ 중에 현탁시켰다. 전기천공 시, 반응능 세포 40 ㎕를 사용하였다.

전기천공은 0.2 cm 큐벳 및 2.5 kV를 사용하는 BioRad 이. 콜라이 펄서를 이 용하여 수행하였다. 정제된 PCR 생성물(1.5 ㎕)을 반응능 세포에 첨가하고, 1분간 얼음 상에 두고, 전기천공을 실시한 직후에 가온한 SOB 배지 2 ㎖를 상기 세포에 첨가하고, 혼합물은 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이 세포는 카나마이신(25 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 배지에 플레이팅하였다. 100 pg의 대형 카나마이신 내성 플라스미드(GTU-MultiHIV C-clade)를 양성 대조군으로 사용하였으며, 음성 대조군에는 플라스미드를 첨가하지 않았다. 양성 대조군에 대한 형질전환 효율은 AG1에 대해서는 10⁶, JM109에 대해서는 10⁷이었다. 음성 대조군 플레이트에는 콜로니가 없었고, JM109 + PCR 생성물 플레이트에서는 215개의 콜로니를 얻었으며, AG1 + PCR 생성물 플레이트에서는 70개의 콜로니를, DH5αT1 + PCR 생성물 플레이트에서는 50개의 콜로니를 얻었다.

실시예 4

이. 콜라이 DH5αT1 Δ ara D, AG1 Δara D 및 JM109Δ ara D 균주의 테스트

삽입 부위 근처의 araD 유전자 상에 어닐링 부위를 함유하는 프라이머 araVlisF(5' CGGCACGAAGGAGTCAACAT 3'; 서열 번호 14) 및 araVlisR(5' TGATAGAGCAGCCGGTGAGT 3'; 서열 번호 15)을 사용하는 콜로니 PCR로, 수득한 콜로니를 실시예 2에 기재되어 있는 전기천공법으로 카나마이신 내성 유전자가 존재하는지에 대해 테스트하였다. PCR 생성물이 araD 유전자에 삽입되어 있다면, 272 bp의 PCR 생성물이 araD 및 1,545 bp 생성물 중에 삽입되지 않은 이. 콜라이 DH5αT1, AG1 및 JM109 균주로부터 예상되었다. DH5αT1ΔaraD의 콜로니 3개, AG1ΔaraD의 콜로니 9개, 및 15개의 JM109ΔaraD 중 14개의 콜로니가 확인되었고, 각각에서 1,545 bp 생성물을 얻었다. 따라서 상기 3개의 균주에는 카나마이신 내성 유전자가 삽입되어 있다고 결론지었다.

카나마이신 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위해, 프라이머 kanaSF(5' TCAGATCCTTGGCGGCAAGA 3'; 서열 번호 16) 및 araVR(5' TGTAATCGACGCCGGAAGGT 3'; 서열 번호 17)을 사용하여 다른 콜로니 PCR를 수행하였다. 카나마이신 내성 유전자가 araD 유전자에 삽입되어 있다면, 상기 프라이머는 435 bp 생성물을 생산한다. AG1ΔaraD 및 JM109ΔaraD 균주로부터 6개의 콜로니를, DH5αT1 ΔaraD 균주로부터는 3개의 콜로니를 테스트하였고, 이들 모두 정확한 생성물을 제공하였다.

AG1ΔaraD 및 JM109ΔaraD로부터 6개의 콜로니를, DH5αT1ΔaraD로부터는 3개의 콜로니를 카나마이신 25 ㎍/㎖를 함유하는 LB 배지에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 배양하여, 온도에 민감한 복제 기점을 가지는 pKD46 플라스미드를 제거하였다. 상기 세포는 LB 배지 및 앰피실린을 함유하는 LB 배지에 레플리카 플레이팅하여 앰피실린에 대한 감수성을 테스트하였다. 앰피실린을 함유하는 배지에서는 세포가 성장하지 않았기 때문에, 박테리아는 pKD46 플라스미드를 더 이상 포함하지 않는다고 결론지었다.

생성된 AG1ΔaraD 및 JM109ΔaraD 균주에 대해 아라비노스 감수성을 테스트하였다. AG1ΔaraD의 1 콜로니 및 JM109ΔaraD의 1 콜로니를 각각 2 ㎖ LB에 접종하였다. 배양물은 8시간 동안 성장시키고, 0.2% 글리세롤, 카나마이신 25 ㎍/㎖, 0.01% 티아민(JM109ΔaraD에 대해서는 0.05% 프롤린)을 함유하는 M9 배지로 1:100 으로 희석시키고, 상이한 농도의 L-아라비노스는 성장 배지에 첨가하였다. 배양물은 교반 배양기에서 밤새 37℃에서 성장시킨 뒤, OD₆₀₀을 측정하였다(표 1).

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 ΔaraD 균주의 성장을 억제하기 위해서는 0.1% 정도의 소량의 L-아라비노스면 충분하다.

또한 더 낮은 농도의 L-아라비노스를 사용하여 상기 AG1ΔaraD, DH5αT1ΔaraD 및 JM109ΔaraD에 대한 아라비노스 감수성을 테스트하였다. 결과는 도 18에 나타나 있다. 도 18에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 ΔaraD 균주의 성장을 억제하기 위해서는 0.0005% 정도의 소량의 L-아라비노스면 충분하다.

또한, 상이한 농도의 글루코스 및 아라비노스(0.2% 글루코스, 0.2% 아라비노스, 2% 아라비노스)가 있는 효모 추출액 배지 및 M9 배지에서 L-아라비노스 감수성을 테스트하였다. 배양물은 교반 배양기에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 그 뒤, 세포 밀도를 정량화하기 위해 OD₆₀₀을 측정하였다. 결과는 도 19에 나타나 있다.

상기한 아라비노스 농도(0.2% 및 2%) 모두 본 발명의 ΔaraD 균주의 성장을 억제하였다. 그러나 완전한(intact) araD 유전자를 가진 균주의 성장을 억제하지 않았다.

또한, ΔaraD 균주의 플라스미드 DNA 수율을 테스트하였다. 실시예 1에서 제조한 플라스미드 S6wtd1EGFParaD2를 AG1ΔaraD 및 JM109ΔaraD 균주로 형질전환시켰다. 반응능 세포는 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이 RF1 및 RF2 용액을 이용하여 제조하였다.

형질변환 플레이트에서 얻은 콜로니는 0.5% 효모 추출물 및 카나마이신 25 ㎍/㎖ + 0.01% 티아민 + L-아라비노스(2% 및 0.2%)를 함유하는 2 ㎖ M9 배지에 접종시켰다.

배양물은 37℃에서 17시간 동안 배양하였다. 그 뒤, 세포 밀도를 정량화하기 위해 OD₆₀₀을 측정하였고, 플라스미드 DNA는 Qiagen 미니프렙 키트로 추출하였다. 미니프렙 분리를 위해 계수 2.8(OD₆₀₀/㎖)을 사용하여, 유사한 결과를 얻었다. 결과는 표 2에 나타나 있다.

DNA 농도는 260 nm에서 OD로서 분광 광도계로 측정하였다. 현미경 분석을 위해, 1 액적의 박테리아 배양물을 글래스 슬라이드에 가하고, 커버 슬립으로 덮었다. 배양물은 유침용 대물렌즈로 100배 확대하여 시각적으로 검사하였다.

상기 결과에 따르면, 0.2% L-아라비노스는 2% 아라비노스와 동일한 수준에서 플라스미드 복제수를 얻기에 충분하다.

이 플라스미드에 대해서는 AG1ΔaraD가 더 나은 것처럼 보이는데, 이는 플라스미드 수율과 세포 밀도가 좀 더 높기 때문이다.

실시예 5

잠재적으로 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제를 코딩하는 유전자 내에 추가 돌연변이가 있는 에스케리치아 콜라이 균주의 생성

이. 콜라이 염색체는 상이한 오페론 중에 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제에 대한 2개의 추가 코딩 서열을 포함한다. L-아스코르베이트 분해 경로로부터의 ulaF 및 sgbE 유전자는 에피머라제 활성이 있는 유전자를 코딩한다(Wen Shan Yew, Jhon A. Gerlt, J. Bacteriol. 184 (2002) 302-306). 선별의 엄중도를 증가시키고, 에피머라제 활성이 있는 다른 유전자로 인한 이. 콜라이 균주의 가능한 순응 메커니즘을 방지하거나 녹아웃(knock out)시키기 위해, 이. 콜라이 게놈에서 UlaF 및 SgbE 유전자의 코딩 서열을 차단하였다. 상기 순응 메커니즘은 적절한 조건 하에 장기간에 걸친 플라스미드 생산 시에 발생할 수 있다.

이. 콜라이 균주 DH5αT1ΔaraD 및 AG1ΔaraD 중의 UlaF 및 SgbE 유전자는 실시예 3에 기재되어 있는 파지 λ Red 재조합 시스템을 사용하여 파괴하였다.

우선, 이. 콜라이 AG1ΔaraD 및 DH5αT1ΔaraD 균주에서 카나마이신 내성 유전자를 제거하였다. FLP 재조합효소 발현 플라스미드 pKD20(Datsenko 및 Wanner에 의한 문헌, 상기함)은 앰피실린 내성이고 온도에 민감하였다. 카나마이신 내성 돌연변이체는 pCP20(카나마이신 내성 유전자는 FRT-측접됨)과 형질변환시키고, 앰피실린 내성 돌연변이체는 30℃(48시간)에서 선별한 뒤, 동일한 콜로니는 42℃(24시간, 2회)에서 비선별적으로 정제하였다. 이어서, 이들 콜로니에 대해 카나마이신 내성 및 앰피실린 내성이 소실되었는지를 테스트하였다.

파지 λ Red 재조합 시스템에 의한 염색체 ulaF 유전자(서열 번호 20)의 불활성화는 프라이머 ulaFylem 및 ulaFalum을 사용하여 수행하였다:

ulaFylem

CAGCAGGTATTTGAAGCCAACATGGAGCTGCCGCGCTACGGGCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (서열 번호 21)

ulaFalum

AAACGGCTGCGGAATTAGACCAGTTATCTCCCGAGGAAGGAAATTAATTCCGGGGATCCGTCGACC (서열 번호 22)

다수의 콜로니가 상기 형질변환 플레이트 모두에서 관찰되었다. 카나마이신 내성 유전자의 존재 여부에 대해, 프라이머 ulaFvalisR 및 ulaFvalisF를 사용하는 콜로니 PCR로 전기천공법으로 수득한 15개의 콜로니를 시험하였다:

ulaFvalisR

AAACGGCTGCGGAATTAGACC (서열 번호 23)

ulaFvalisF

GCCGTACCTGATTGAGATGTGGAG (서열 번호 24)

상기 프라이머는 삽입 부위 부근의 UlaF 유전자 상에 어닐링 부위를 포함한다. PCR 생성물이 UlaF 유전자에 삽입되어 있다면, UlaF 및 1,527 bp 생성물에 삽입되지 않은 이. 콜라이 DH5αT1ΔaraD 및 AG1ΔaraD 균주로부터 864 bp의 PCR 생성물을 예측할 수 있었다. 카나마이신 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위해, 프라이머 ulaFvalisR(서열 번호 23) 및 kanaSF(서열 번호 16)를 사용하여 다른 콜로니 PCR을 수행하였다.

카나마이신 내성 유전자가 UlaF 유전자에 삽입되어 있다면, 상기 프라이머는 428 bp의 생성물을 생산한다. AG1ΔaraDΔulaF 및 DH5αT1ΔaraDΔulaF 균주로부터의 4개의 콜로니를 테스트하였고, 이들 모두는 정확한 생성물을 제공하였다. 각 균주로부터 하나의 콜로니를 더 사용하였다.

이. 콜라이 AG1ΔaraDΔulaF 및 DH5αT1ΔaraDΔulaF 균주에서 카나마이신 내성 유전자를 제거하는 것은 상기한 바와 같이 수행하였다. 파지 λ Red 재조합 시스템에 의한 염색체 sgbE 유전자(서열 번호 25)의 불활성화는 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 사용된 프라이머는 sgbEalum 및 sgbEylem였다:

sgbEalum

CGTTACAGCAAGGAACATATCAATTCGTAGTGCCGGGGCGATGAAGAATTCCGGGGATCCGTCGACC (서열 번호 26)

sgbEylem

GCAGGAGGCTGGATTTATATGTTAGAGCAACTGAAAGCCGACGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (서열 번호 27)

다수의 콜로니가 상기 형질변환 플레이트 모두에서 관찰되었다. 전기천공법으로 수득한 15개의 콜로니는 프라이머 sgbEvalisR 및 sgbEvalisF를 사용하여 콜로니 PCR로 카나마이신 내성 유전자의 존재 여부에 대해 시험하였다:

sgbEvalisR

CGGCGTTACAGCAAGGAACATATC (서열 번호 28)

sgbEvalisF

ATTGAAGCGCGTATGCAGGAGG (서열 번호 29)

PCR 생성물이 SgbE 유전자에 삽입되어 있다면, SgbE 및 1,413 bp 생성물에 삽입되지 않은 이. 콜라이 DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE 및 AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE 균주로부터 792 bp의 PCR 생성물을 예측할 수 있었다. 카나마이신 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위해, 프라이머 sgbEvalisR(서열 번호 28) 및 kanaSF(서열 번호 16)를 사용하여 다른 콜로니 PCR을 수행하였다.

상기 균주 둘 다로부터 얻은 15개의 콜로니를 테스트하였고, 4개의 콜로니가 정확한 생성물을 제공하였다.

생산된 이. 콜라이 DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE 및 AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE 균주에 대해 아라비노스 감수성을 테스트하고, 이를 이. 콜라이 DH5αT1ΔaraD 및 AG1ΔaraD 균주와 비교하였다. 각 균주의 한 콜로니를 0.5% 효모 추출물, 카나마이신 25 ㎍/㎖, 0.2% 글루코스만, 또는 각각 0.2% 또는 2% L-아라비노스를 함유하는 2 ㎖ M9 배지로 접종시켰다. 결과는 표 3에 나타나 있다.

표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 균주의 아라비노스 감수성에는 실질적인 상이함이 없었다. 유사하게, ΔaraD 및 ΔaraDΔulaFΔsgbE 균주의 플라스미드 DNA 수율은 실시예 3에 기재된 바와 같이 테스트하였으며(결과는 나타내지 않음), 이. 콜라이 AG1ΔaraD 및 AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE 또는 DH5αT1ΔaraD 및 DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE 균주 간의 상이함은 발견되지 않았다.

실시예 6

S6wtd1EGFP/ ara D2의 안정성

백신 접종 벡터의 중요한 특징은 박테리아 세포의 증식 중의 안정성이다. 박테리아에서 S6wtd1EGFP/araD2의 안정성을 테스트하기 위해, 플라스미드를 실시예 3에서 제조한 이. 콜라이 AG1ΔaraD 및 JM109ΔaraD 균주로 형질변환시켰고, 4세대에 걸친 플라스미드 DNA 분석에서 상기 벡터가 완전하게(intactness) 이어졌다.

플라스미드 S6wtd1EGFP/araD2는 반응능 이. 콜라이 AG1ΔaraD 및 JM109ΔaraD 세포와 혼합하고, 30분간 얼음 상에서 배양하였다. 그 뒤, 37℃에서 3분간의 열-충격을 세포 현탁액에 가한 뒤, 빠르게 얼음 냉각시켰다. LB 배지 1 ㎖를 샘플에 첨가하고, 혼합물은 강하게 교반하면서 37℃에서 45분간 배양하였다. 마지막으로, 세포 일부분을 0.5% 효모 추출액, 2% L-아라비노스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖를 함유하는 M9 배지 디시에 플레이팅하였다. 다음 날, 한 콜로니의 세포를 동일한 배지를 함유하는 새 디시로 옮겼다. 이 절차는 4 계대의 박테리아가 성장할 때까지 반복하였다. 박테리아 균주의 각 계대에서 얻은 2개의 콜로니를 사용하여, 0.5% 효모 추출액, 2% L-아라비노스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖를 함유하는 2 ㎖ M9 배지에 접종하고, 강하게 교반하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 세포는 수거하고, 플라스미드 DNA는 QIAprep Spin 미니프렙 키트(QIAGEN)를 사용하여 박테리아로부터 추출하였다. 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ(리투아니아 Fermentas사)로 침지시키기 전(도 9) 및 후(도 10)에, 아가로스 겔 전기영동법을 사용하여 플라스미드 DNA 샘플과 형질변환에 사용된 원래의 S6wtd1EGFP/araD2 DNA(도 9 및 도 10의 대조군)를 비교 분석하였다. EcoRI/HindⅢ(리투아니아 Fermentas사)로 침지시킨 람다 DNA를 분자량 마커(도 10에서는 M3)로 사용하였다.

샘플은 이. 콜라이 AG1ΔaraD에 대해서는 도 10A, JM109ΔaraD 균주에 대해서는 도 10B에 도시되어 있는 바와 같이 HindⅢ로 침지시켰고, 원래의 S6wtd1EGFP/araD2 플라스미드 DNA와 동일한 패턴이 관찰되었다. HindⅢ 침지에 의해 생성된 단편의 예상 크기는 3,274 bp, 1,688 bp 및 1,510 bp이다. 따라서, 백신 접종 벡터 S6wtd1EGFP/araD2는 이. 콜라이 AG1ΔaraD 및 JM109ΔaraD 균주에서 증식할 때 안정하다고 결론지을 수 있다.

실시예 7

항생제 선별 시스템과 본 발명의 L-아라비노스 선별 시스템의 비교

항생제 선별 시스템과 본 발명의 L-아라비노스 선별 시스템을 비교하기 위해, 다음의 성장 배지를 사용하였다.

플라스미드 p2 MG C #11을 가지고 있는 이. 콜라이 AG1에 대한 성장 배지:

배지 1: M9 배지 + 0.5% 효모 추출액, 0.2% 글루코스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖(선별성 배지);

배지 2: M9 배지 + 0.5% 효모 추출액 및 0.2% 글루코스(비선별성 배지);

배지 3: M9 배지 + 0.5% 효모 추출액, 0.2% L-아라비노스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖(선별성 배지); 및

배지 4: M9 배지 + 0.5% 효모 추출액 및 0.2% L-아라비노스(비선별성 배지).

paraD MG C #145를 가지고 있는 이. 콜라이 AG1ΔaraD에 대한 성장 배지:

배지 5: M9 배지 + 0.5% 효모 추출액, 0.2% L-아라비노스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖(선별성 배지); 및

배지 6: M9 배지 + 0.5% 효모 추출액, 0.2% 글루코스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖(비선별성 배지).

플라스미드 p2 MG C #11(도 20) 및 paraD MG C #145(도 21)는 이. 콜라이 AG1 및 코돈 8에 C → T로의 돌연변이가 있는 이. 콜라이 AG1ΔaraD로 형질변환시켰다. 이 형질변환된 박테리아 콜로니는 배양기에서 밤새 37℃에서 성장시켰다. 다음 날 아침, 이들 콜로니를 상기한 선별성 및 비선별성 액체 배지로 접종시켰다. 접종시킨 배양물은 안정기에 도달할 때까지 각각 배지 2 ㎖의 교반기 내에서 성장시키고, OD₆₀₀에서 배양물 밀도를 측정하였다. 플라스미드는 배양물에서 추출하고, 플라스미드 DNA 수율은 260 nm에서 플라스미드 DNA를 측정하여 결정하였다. 플라스미드 수율은 260 nm에서 광학 밀도 1에 대해 50 ㎍이 산출되는 것을 기준으로 계산하였다.

그 뒤, 상기 안정기의 배양물로부터의 분액 20 ㎕를 새 배지로 접종하고(희석도 100배), 상기 배양물은 안정기에 이를 때까지(8∼12시간) 성장시켰다. 배양물의 밀도는 OD₆₀₀에서 측정하고, 플라스미드를 추출하고, 수율을 측정한 뒤, 다시 분액을 액체 배지 2 ㎕로 접종시켰다. 이 절차는 7회 반복하였다(제조 1∼7). 실험 결과는 하기 표 5에 나타나 있다.

상기 데이터로부터, 선별성 조건 뿐 아니라 비선별성 조건 하에 배양물의 연속 희석/성장 단계에서, 카나마이신 내성 유전자를 가지고 있으며 카나마이신의 존재 하에 이. 콜라이에 내성을 부여하는 플라스미드가 소실된다고 결론지을 수 있다. 배양물 1 ㎖로부터의 플라스미드 수율은 7회의 희석으로 선별성 조건 하에서는 3배, 비선별성 조건 하에서는 10배 감소한다(표 5에서, 각각 제조 1/1 대 1/7 및 2/1 대 2/7). 카나마이신 내성이 있는 플라스미드를 가지고 있는 이. 콜라이에 대한 탄소 공급원이 글루코스가 아니라 L-아라비노스인 경우, 동일한 기본 결과가 얻어진다(표 5에서, 각각 제조 3/1 대 3/7 및 4/1 대 4/7). 그러나, 본 발명의 araD 선별 시스템을 플라스미드에서 사용하는 경우, 플라스미드 DNA 수율은 선별성 조건(표 5에서, 제조 5/1 대 5/7) 및 비선별성 조건(표 5에서, 제조 6/1 대 6/7) 하에서 높다. 상기 선별성 조건 및 비선별성 조건 하에서, 플라스미드 DNA 수율은 7세대에 걸쳐 약 20% 감소하였다. 이는 본 발명의 araD 선별 시스템을 가지고 있는 플라스미드가 선별성 조건 뿐 아니라 비선별성 조건 하에서 훨씬 더 안정하며 효율적으로 성장한다는 것을 명백하게 나타내는 것이다.

실시예 8

AG1Δ ara D S6wtd1EGFP/ ara D2의 주입회분식(fed-batch) 발효

araD 유전자게 선별 시스템은 또한 플라스미드 함유 박테리아를 생산하기 위한 주입회분식 발효로 테스트하였다. 단일 콜로니를 AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2 플레이트에서 골라내고, 0.5% 효모 추출액, 0.2% L-아라비노스 및 카나마이신 25 ㎍/㎖을 함유하는 250 ㎖ M9 배지로 접종하고, 강하게 교반하면서 밤새 37℃에서 배양하였다. 18시간 후, 접종물의 OD₆₀₀은 6.4였다. 접종물 160 ㎖는 발효기 출발 배지(Fermenter Starting Medium : KH₂PO₄ 8 g/ℓ; NaCl 10 g/ℓ; NH₄Cl 5g/ℓ; 효모 추출액 5g/ℓ; L-아라비노스 2 g/ℓ; MgSO₄ 2 g/ℓ, 카나마이신 25 ㎍/㎖ 및 티아민 0.1 g/ℓ; NH₄0H로 인한 pH 6.7) 5 L를 포함하는 발효기에 첨가하였다. 성장 5.5 시간 후, 0.15 h^-1의 소정의 성장 속도(탄소 공급원이 성장을 제한할 수 있는 속도임)로 발효기 공급 배지(L-아라비노스 300 g/ℓ; 효모 추출액 150 g/ℓ; 카나마이신 50 ㎎/ℓ; 티아민 0.2 g/ℓ)로 자동 공급(automatic feeding)을 시작하였다. 공급 속도는 식 F(t) = myS^*S_in/S_f[여기서, myS는 소정의 성장 속도이고, S_in은 시점에 첨가하는 탄소 공급원의 양이고, S_f는 공급 배지 중 탄소 공급원 농도임]에 따라 컴퓨터로 조절하였다. 성장시킨 후 OD₆₀₀을 측정하였고, 플라스미드 DNA에 대한 샘플을 얻었다. 발효 도중 얻은 데이터는 도 11에 나타나 있다. 발효는 공급 배지 1 L가 소모되었을 때 종결시켰다. 최종 OD₆₀₀은 45였다. 박테리아 덩어리는 원심분리로 수거하고, STE 완충액 2 L로 1회 세척하였다. 박테리아 생물량의 수율은 습윤 중량으로 410 g이었다. 플라스미드 DNA 함량에 대한 데이터는 표 6에 나타나 있다.

표 6의 데이터는 L-아라비노스 선별 시스템이 세포 밀도가 높을 때 잘 작동한다는 것을 나타낸다. 아마도 이는 L-아라비노스가 한정된 조건에서 박테리아 세포 중에 플라스미드 카피가 더 많이 존재하면 박테리아가 당을 더 빨리 사용할 수 있다는 장점 때문일 것이다.

실시예 9

AG1Δ ara D S6wtd1EGFP/ ara D2의 정제

AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2의 정제는 다음과 같이 수행하였다(도 12):

a) 공급물 제조

투명한 용해물은 Qiagen 플라스미드 정제 핸드북에 따라 제조하되, 단, RNase는 사용하지 않았다.

이. 콜라이 세포 페이스트 200 g을 재현탁 완충액 2,000 ㎖에 재현탁시킨 뒤, 등부피의 P2 및 P3를 사용하여 용해 및 중화시켰다. 세포 잔해는 4℃에서 30분간 6,000 g에서 원심분리하여 제거하였다. 투명한 용해물은 페이퍼 타월을 통해 붓고, 10% Triton X-114(Sigma) 1/10을 첨가하고, 용액은 1시간 동안 얼음 상에 두었다. (Triton X-114는 단백질 내 내독소의 수준을 효과적으로 감소시키는 것을 드러났으며, 이는 Liu 등의 문헌 [Clinical Biochemistry, 1997]을 참조한다). 1시간 뒤, 핵산을 0.6 부피의 냉각 이소프로필로 침전시켰다. 상청액은 버리고, 침전물은 -20℃에서 밤새 저장하였다.

b) 플라스미드 DNA 정제

플라스미드 DNA 정제는 변형이 거의 가해지지 않는 Amersham Pharmacia사의 3단계 수퍼코일드 플라스미드 정제 방법에 따라 수행하였다.

단계 1. 침전물은 TE(Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM; pH 8.0) 1,500 ㎖에 재용해시키고, 완충액 교환 및 RNA 제거를 위해 완충액 A[(NH₄)₂SO₄ 2 M, Tris Cl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5]로 미리 평형화시킨 Sepharose 6 FF(Amersham Pharmacia) 상에 로딩하였다.

단계 2. (완충액 A로 평형화시킨) PlasmidSelect(Amersham Pharmacia) 컬럼을 공부피로 만들고, 완충액 B2(NaCl 1.6 M, (NH₄)₂SO₄ 2 M, Tris Cl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5)로 세척 및 용출시킨 뒤, 수퍼코일드 플라스미드 DNA를 캡처하였다.

단계 3. 용출시킨 플라스미드는 증류된 탈이온수 5 부피로 희석시키고, 완충액 C1(NaCl 0.4 M, Tris Cl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5)로 평형화시킨 SOURCE 30Q(Amersham Pharmacia)에 로딩하였다. 세척 후, 정제된 플라스미드는 완충액 C2(NaCl 1 M, Tris Cl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5)로 용출시키고, 용출 피크를 모았다. 분획의 크기는 150 ㎖였고, 이는 내독소가 없는 (<10 EU/㎎) S6wtd1EGFP/araD2 플라스미드 100 ㎎을 함유하였다.

SEQUENCE LISTING <110> FIT Biotech Oyj Plc. <120> Novel selection system <130> 2031002 <160> 29 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 780 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 gtttcgtttg attggctgtg gttttataca gtcattactg cccgtaatat gccttcgcgc 60 catgcttacg cagatagtgt ttatccagca gcgtttgctg catatccggt aactgcggcg 120 ctaactgacg gcagaatatc cccatataag cgacctcttc cagcacgatg gcgttatgca 180 ccgcatcttc ggcatttttg ccccatgcaa acgggccgtg ggaatggacc agaacgccgg 240 gcatttgcgc tgcatcgata ccctgttttt caaaggtttc tacgatgacg ttaccggttt 300 cccactcata ttcgccgttg atttctgcgt cggtcatttt gcgggtgcag ggaatggtgc 360 cgtagaaata gtcggcgtgg gtggtgccgg ttgctggaat cgactgaccc gcctgcgccc 420 agatggtggc gtggcgcgag tgcgtatgca caatgccgcc aatggagggg aatgcctgat 480 agagcagccg gtgagttggc gtgtcggagg agggcttttt cgtaccttca accacttcac 540 cggtttcgat gctaaccacg accatatcgt cagcggtcat gacgctgtaa tcgacgccgg 600 aaggtttgat cacaaagacg ccgcgctcgc gatcaacggc gctgacgttg ccccatgtga 660 gcgtgaccag gttgtgtttt ggcagcgcca ggttggcttc taatacctgg cgtttgagat 720 cttctaacat gttgactcct tcgtgccgga tgcgctttgc ttatccggcc tacaaaatcg 780 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cgccatggtt ctcatgtttg acagcttatc atcgataagc tttaatgcgg tagtttagca 60 cgaaggagtc aacatg 76 <210> 3 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgccatggac tagtaaaaaa aagcccgctc attaggcggg ctgtcattac tgcccgtaat 60 atgc 64 <210> 4 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cgccatggac tagttctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt 60 tagcacgaag gagtcaacat g 81 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cgccatggaa aaaaaagccc gctcattagg cgggctgtca ttactgcccg taatatgc 58 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gccagggttt tcccagtcac ga 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gagcggataa caatttcaca cagg 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ccaactcacc ggctgctcta tc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aatgccgaag atgcggtgca taac 24 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 taactgcggc gctaactgac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ggttgctgga atcgactgac 20 <210> 12 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ctcaaacgcc caggtattag aagccaacct ggcgctgcca aaacacgtgt aggctggagc 60 tgcttc 66 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ggtttgatca caaagacgcc gcgctcgcga tcaacggcgc attccgggga tccgtcgacc 60 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 cggcacgaag gagtcaacat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tgatagagca gccggtgagt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 tcagatcctt ggcggcaaga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 tgtaatcgac gccggaaggt 20 <210> 18 <211> 1030 <212> DNA <213> Artificial <400> 18 ggatccgacc ggcaacggta cagatccgac cggcaacggt acagatccga ccggcaacgg 60 tcagatccga ccggcaacgg tacagatccg accggcaacg gtacagatcc gaccggcaac 120 ggtacagatc cgaccggcaa cggtacagat ccgaccggca acggtacaga tccgaccggc 180 aacggtacag atccgaccgg caacggtaca gatcccccta gcgaattgac tagttctcat 240 gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tagcacgaag gagtcaacat 300 gttagaagat ctcaaacgcc aggtattaga agccaacctg gcgctgccaa aacacaacct 360 ggtcacgctc acatggggca acgtcagcgc cgttgatcgc gagcgcggcg tctttgtgat 420 caaaccttcc ggcgtcgatt acagcgtcat gaccgctgac gatatggtcg tggttagcat 480 cgaaaccggt gaagtggttg aaggtacgaa aaagccctcc tccgacacgc caactcaccg 540 gctgctctat caggcattcc cctccattgg cggcattgtg catacgcact cgcgccacgc 600 caccatctgg gcgcaggcgg gtcagtcgat tccagcaacc ggcaccaccc acgccgacta 660 tttctacggc accattccct gcacccgcaa aatgaccgac gcagaaatca acggcgaata 720 tgagtgggaa accggtaacg tcatcgtaga aacctttgaa aaacagggta tcgatgcagc 780 gcaaatgccc ggcgttctgg tccattccca cggcccgttt gcatggggca aaaatgccga 840 agatgcggtg cataacgcca tcgtgctgga agaggtcgct tatatgggga tattctgccg 900 tcagttagcg ccgcagttac cggatatgca gcaaacgctg ctggataaac actatctgcg 960 taagcatggc gcgaaggcat attacgggca gtaatgacag cccgcctaat gagcgggctt 1020 ttttttccat 1030 <210> 19 <211> 696 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 19 atgttagaag atctcaaacg ccaggtatta gaagccaacc tggcgctgcc aaaacacaac 60 ctggtcacgc tcacatgggg caacgtcagc gccgttgatc gcgagcgcgg cgtctttgtg 120 atcaaacctt ccggcgtcga ttacagcgtc atgaccgctg acgatatggt cgtggttagc 180 atcgaaaccg gtgaagtggt tgaaggtacg aaaaagccct cctccgacac gccaactcac 240 cggctgctct atcaggcatt cccctccatt ggcggcattg tgcatacgca ctcgcgccac 300 gccaccatct gggcgcaggc gggtcagtcg attccagcaa ccggcaccac ccacgccgac 360 tatttctacg gcaccattcc ctgcacccgc aaaatgaccg acgcagaaat caacggcgaa 420 tatgagtggg aaaccggtaa cgtcatcgta gaaacctttg aaaaacaggg tatcgatgca 480 gcgcaaatgc ccggcgttct ggtccattcc cacggcccgt ttgcatgggg caaaaatgcc 540 gaagatgcgg tgcataacgc catcgtgctg gaagaggtcg cttatatggg gatattctgc 600 cgtcagttag cgccgcagtt accggatatg cagcaaacgc tgctggataa acactatctg 660 cgtaagcatg gcgcgaaggc atattacggg cagtaa 696 <210> 20 <211> 687 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 20 atgcaaaagc taaaacagca ggtatttgaa gccaacatgg agctgccgcg ctacgggctg 60 gtgaccttta cctggggcaa cgtcagcgct atcgaccgcg aacgcgggct ggtggtgatc 120 aagcccagcg gcgttgccta cgaaaccatg aaagcggccg atatggtggt ggttgatatg 180 agcggcaagg tggtggaagg ggagtatcgc ccatcttccg acactgcgac gcatctcgaa 240 ctctaccgtc gttacccgtc gcttggtggc attgtccata cccactccac tcatgccacc 300 gcatgggcgc aggcggggct ggcgatcccg gcgttaggca ccacgcacgc cgactacttc 360 tttggcgaca ttccgtgtac gcgcgggtta agcgaagaag aggtgcaggg cgagtatgaa 420 ctgaacaccg gcaaagtgat tatcgaaacg ctgggcaacg ccgagccgct gcatacgccg 480 ggaattgtgg tgtatcagca cgggccgttc gcctggggga aagatgctca cgatgcggtg 540 cataacgcgg tggtgatgga agaagtggcg aaaatggcgt ggattgcccg cggcattaac 600 ccacaactca atcacatcga cagcttcctg atgaataaac acttcatgcg taaacacggt 660 cctaacgctt attacgggca gaagtag 687 <210> 21 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <400> 21 cagcaggtat ttgaagccaa catggagctg ccgcgctacg ggctggtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <400> 22 aaacggctgc ggaattagac cagttatctc ccgaggaagg aaattaattc cggggatccg 60 tcgacc 66 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <400> 23 aaacggctgc ggaattagac c 21 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <400> 24 gccgtacctg attgagatgt ggag 24 <210> 25 <211> 696 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 25 atgttagagc aactgaaagc cgacgtgctg gcggcgaatc tggcgcttcc cgctcaccat 60 ctggtgacgt tcacctgggg caatgtcagc gcggtagacg aaacgcggca atggatggta 120 atcaaacctt ccggcgtcga gtacgacgtg atgaccgccg acgatatggt ggtggttgag 180 atagccagcg gtaaggtggt ggaaggcagc aaaaaaccct cttccgatac accaacgcat 240 ctggcgctct accgtcgcta tgccgaaatt ggcggtattg tgcataccca ctcgcgccac 300 gccaccatct ggtcacaggc cgggctggat ctccccgcct ggggcaccac ccacgccgat 360 tatttttacg gtgccatccc ctgcacgcga cagatgaccg cagaggagat taacggcgaa 420 tatgaatatc agaccggcga agtgatcatt gaaaccttcg aagaacgtgg caggagtccg 480 gcacaaatcc cggcggtgct ggtgcattct cacggcccgt tcgcatgggg taaaaacgcc 540 gccgatgccg tgcataacgc cgtagtactc gaagaatgcg cctatatggg tctattctcg 600 cgccagcttg cgccgcagct ccctgcgatg caaaacgaac tgctggataa gcactacctg 660 cgtaagcatg gggccaatgc ctattacggg cagtaa 696 <210> 26 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial <400> 26 cgttacagca aggaacatat caattcgtag tgccggggcg atgaagaatt ccggggatcc 60 gtcgacc 67 <210> 27 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <400> 27 gcaggaggct ggatttatat gttagagcaa ctgaaagccg acgtggtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <400> 28 cggcgttaca gcaaggaaca tatc 24 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <400> 29 attgaagcgc gtatgcagga gg 22

Claims

선별 마커로서 araD 유전자, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편을 보유하는 벡터가 부가된 araD 유전자 결핍 박테리아 세포를 포함하는 선별 시스템.
제1항에 있어서, araD 유전자는 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제 유전자(EC 5.1.3.4)인 선별 시스템.
제1항에 있어서, araD 유전자가 돌연변이된 것인 선별 시스템.
제3항에 있어서, 돌연변이가 araD 유전자의 8번 위치에 종지 코돈을 도입하는 것인 선별 시스템.
제1항에 있어서, 박테리아 세포는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포인 선별 시스템.
제5항에 있어서, 이.콜라이는 이.콜라이 균주 JM109인 선별 시스템.
제5항에 있어서, 이.콜라이는 이.콜라이 균주 DH5α인 선별 시스템.
선별 마커로서 araD 유전자, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편을 포함하는 벡터.
제8항에 있어서, 상기 벡터는

(a) 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵 고착(nuclear-anchoring) 단백질을 코딩하는 DNA 서열[상기 핵 고착 단백질은 (i) 특정 DNA 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인, 및 (ii) 핵 성분에 결합하는 기능성 도메인, 또는 이의 기능적 등가물을 포함함];

(b) 핵 고착 단백질에 대한 결합 부위를 형성하는 다량체화된 DNA 서열; 및

(c) araD 유전자, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편

을 포함하는 발현 벡터이고, 파필로마 바이러스의 복제 기점이 결핍되어 있는 것인 벡터.
제9항에 있어서, 상기 벡터는

(a) 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵 고착 단백질을 코딩하는 DNA 서열로서, 상기 핵 고착 단백질은 소 파필로마 바이러스 타입 1(BPV)의 E2 단백질인 서열;

(b) 클러스터로서 벡터에 통합된 BPV E2 단백질의 복수의 결합 부위인 핵 고착 단백질에 대한 결합 부위를 형성하는 다량체화된 DNA 서열[이 부위는 머리 대 꼬리 구조로서 존재할 수도 있고, 또는 이격 배치에 의해 벡터 내에 함유될 수 있음]; 및

(c) araD 유전자, araD 유전자의 돌연변이 형태, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편

을 포함하는 발현 벡터이고, 파필로마 바이러스 복제 기점이 결핍되어 있는 것인 벡터.
제10항에 있어서, 돌연변이된 DNA 서열에서의 결실을 더 포함하는 것인 벡터.
제10항에 있어서, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열에서의 돌연변이를 더 포함하는 것인 벡터.
araD 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 AG1.
araD 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 JM109.
araD 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 DH5α-T1.
araD 유전자 및 ulaF 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 DH5α-T1.
araD 유전자 및 sgbE 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 DH5α-T1.
araD 유전자, ulaF 유전자 및 sgbE 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 DH5α-T1.
araD 유전자 및 ulaF 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 AG1.
araD 유전자 및 sgbE 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 AG1.
araD 유전자, ulaF 유전자 및 sgbE 유전자가 결핍된 이.콜라이 균주 AG1.
선별 마커로서 araD 유전자, 이의 상보성 서열, 또는 이의 촉매적 활성 단편과 관심 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포를 선별하는 방법으로서, 상기 플라스미드를 araD 결핍 숙주 세포로 삽입하는 단계 및 아라비노스를 함유하는 성장 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제22항에 있어서, araD 유전자는 L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라제 (EC 5.1.3.4)인 방법.
제22항에 있어서, araD 유전자는 돌연변이된 것인 방법.