PL206097B1 - Wektor ekspresyjny, jego zastosowanie, sposób wytwarzania tego wektora, komórka gospodarza, kompozycja farmaceutyczna, szczepionka DNA, genowy czynnik terapeutyczny oraz sposób wytwarzania szczepionki DNA - Google Patents

Description

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Wektor ekspresyjny, jego zastosowanie, sposób wytwarzania tego wektora, (54) komórka gospodarza, kompozycja farmaceutyczna, szczepionka DNA, genowy czynnik terapeutyczny oraz sposób wytwarzania szczepionki DNA (73) Uprawniony z patentu:

FIT BIOTECH OYJ PLC, Tampere, FI (30) Pierwszeństwo:

03.05.2001, FI, 20010922 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

21.02.2005 BUP 04/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.06.2010 WUP 06/10 (72) Twórca(y) wynalazku:

KAI KROHN, Salmentaka, FI

VESNA BLAZEVIC, Tampere, FI

MARJA TAHTINEN, Tampere, FI MART USTAV, Tartu, EE URVE TOOTS, Tartu, EE ANDRES MANNIK, Tartu, EE ANNAMARI RANKI, Helsinki, FI REIN SIKUT, Tartu, EE KADRI JANIKSON, Tartu, EE ENE USTAV, Tartu, EE (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Kossowska Janina PATPOL spółka z ograniczoną odpowiedzialnością

PL 206 097 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny, jego zastosowanie, sposób wytwarzania tego wektora, komórka gospodarza, kompozycja farmaceutyczna, szczepionka DNA, genowy czynnik terapeutyczny oraz sposób wytwarzania szczepionki DNA.

Transfer genów autologicznych lub heterologicznych do organizmów zwierząt lub ludzi przy pomocy odpowiednich wektorów staje się techniką o wielkim potencjale dla leczenia chorób o tle genetycznym lub dla zapobiegania lub leczenia chorób zakaźnych. Opracowano i przebadano na zwierzętach i ludziach kilka typów wektorów wirusowych i niewirusowych do dostarczania genu/genów, w których w wyniku mutacji wystąpił defekt i są niefunkcjonalne. Przykłady takich wektorów obejmują wektory adenowirusowe, wektory oparte na wirusach opryszczki, wektory retrowirusowe, wektory lentiwirusowe oraz wektory oparte na wirusach związanych z adenowirusami.

Szczepienie okazało się być wysoce skutecznym i ekonomicznym sposobem zapobiegania chorobom powodowanym przez czynniki zakaźne. Od wprowadzenia wirusa krowianki jako atenuowanej szczepionki przeciwko wirusowi ospy właściwej opracowano i wprowadzono do rutynowego stosowania szczepionki przeciwko wielu ludzkim patogenom. Dziś ospa została całkowicie pokonana przez szczepienia, wkrótce oczekuje się tego samego w przypadku wirusa polio. Kilku chorobom wieku dziecięcego, takim jak krztusiec, błonica i tężec można skutecznie zapobiegać przez szczepienia.

Ogólnie najskuteczniejszymi szczepionkami wirusowymi są żywe niezjadliwe mutanty wirusów wywołujących chorobę. Kluczem do sukcesu tego podejścia jest fakt, że żywy wirus atakuje te same narządy, ten sam typ i podobną liczbę komórek i przez to, mnożąc się u biorcy wywołuje długotrwałą odpowiedź odpornościową nie powodując choroby, lub powodując jedynie łagodną chorobę. W efekcie żywa atenuowana szczepionka wytwarza zakażenie podkliniczne, naturalny sposób immunizacji. W rezultacie zaindukowana zostanie pełna odpowiedź odpornościowa, obejmująca odpowiedzi humoralne, komórkowe i wrodzone, dostarczając długotrwałej, a niekiedy trwającej całe życie ochrony immunologicznej przeciwko patogenowi.

Mimo, że szczepionki atenuowane są najsilniejsze, mogą one wywoływać szkodliwe skutki uboczne. Atenuowana szczepionka wirusowa może więc ulec rewersji do szczepu zjadliwego lub, w wypadkach gdy atenuowany wirus jest niepatogenny u dorosł ych, wciąż powodować chorobę u dzieci lub osób osł abionych. Jest tak w przypadku wirusów powodują cych zakażenia przewlekłe takich, jak ludzki wirus braku odporności (HIV) typu 1 i 2. Szczepionki złożone z wirusowych lub bakteryjnych białek lub peptydów immunogennych niosą mniejsze ryzyko wywołania niepożądanych skutków ubocznych, lecz mogą być słabsze od żywych szczepionek. Dzieje się tak zwłaszcza w przypadku szczepionek przeciwko mikroorganizmom powodującym zakażenia przewlekłe, takim jak niektóre wirusy i bakterie wenątrzkomórkowe.

Siła i rodzaj odpowiedzi odpornościowej zależy jednak także od tego, jak białka wirusowe są przetwarzane i prezentowane układowi odpornościowemu przez komórki prezentujące antygen (APC) takie, jak makrofagi i komórki dendrytyczne. Białka i antygeny peptydowe są pobierane przez APC w procesie endocytozy, przetwarzane na małe peptydy immunogenne przez szlak endosomalny i prezentowane limfocytom T (komórkom T) przez antygeny głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy II (u człowieka zwane HLA - ludzkimi antygenami leukocytowymi klasy II). W przeciwieństwie do nich, białka syntetyzowane od nowa w APC lub możliwych komórkach docelowych odpowiedzi odpornościowej są przetwarzane w szlaku cytoplazmatycznym i prezentowane limfocytom T przez antygeny MHC klasy I (u człowieka HLA klasy I). Ogólnie, prezentacja peptydów immunogennych przez szlak klasy II prowadzi do aktywacji limfocytów T pomocniczych/indukujących, co z kolei prowadzi do aktywacji komórek B i odpowiedzi przeciwciał. W przeciwieństwie, prezentacja przez MHC klasy I faworyzuje indukcję cytotoksycznych limfocytów T (CTL), które są zdolne do rozpoznawania i niszczenia komórek zakażonych wirusami.

Na początku lat 90-tych wprowadzono sposób naśladowania przetwarzania antygenu i jego prezentacji normalnie uzyskiwanych przez żywe atenuowane szczepionki [Ulmer, J. B. i wsp. Science 259 (1993) 1745-1749]. Wykazano, że iniekcja eukariotycznych wektorów ekspresyjnych w postaci kolistego DNA do mięśni indukowała pobieranie tego DNA przez komórki mięśniowe (i prawdopodobnie też inne) i była w stanie wywołać odpowiedź odpornościową, zwłaszcza komórkową odpowiedź odpornościową w postaci CTL, przeciwko białku kodowanemu przez wstawiony gen. Począwszy od tej obserwacji, immunizacja DNA stała się standardowym sposobem indukowania odpowiedzi odpornościowej

PL 206 097 B1 przeciwko obcym białkom u zwierząt doświadczalnych, a badania nad kilkoma szczepionkami DNA u ludzi są w toku.

Ogólnie, wektory DNA stosowane w tych badaniach nad szczepionkami zawierają miejsce klonowania będącego przedmiotem zainteresowania genu, silny promotor wirusowy taki, jak wczesny natychmiastowy promotor wirusa CMV dla kierowania ekspresją będącego przedmiotem zainteresowania genu, region poliadenylacji oraz gen oporności na antybiotyk i bakteryjne miejsce startu replikacji dla namnażania wektora DNA (plazmidu) w komórkach bakteryjnych.

Z opisanymi powyż ej wektorami możliwe jest uzyskanie wykrywalnego poziomu ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania po podaniu wektora zwierzętom doświadczalnym lub ludziom albo przez bezpośrednie wstrzyknięcie do mięśni lub skóry techniką bombardowania cząstkami albo przez podanie wektora w roztworze bezpośrednio do śluzówek. Ekspresja uzyskana za pomocą tych wektorów jest jednak krótkotrwała: wektory wykazują tendencję do stopniowego zanikania ze stransfekowanych komórek i nie są przekazywane komórkom potomnym w dzielącej się populacji komórek. Krótkotrwała ekspresja będącego przedmiotem zainteresowania genu i ograniczona liczba docelowych komórek są przypuszczalnie zasadniczymi powodami, dla których obserwuje się jedynie czasowe odpowiedzi odpornościowe u pacjentów immunizowanych opisanymi powyżej wektorami DNA. Tak, przykładowo, Boyer i wsp. zaobserwowali jedynie czasowe odpowiedzi odpornościowe przeciwko białkom Env i Rev HIV1 u pacjentów - ludzi, których immunizowano kilkakrotnie wektorem podobnym do opisanych powyżej [Boyer, J. D., J Infect Dis 181 (2000) 476-483].

Rośnie zainteresowanie opracowaniem nowych produktów przydatnych w terapii genowej i szczepieniu DNA. Przykł adowo, jako przydatnych kandydatów zaproponowano wektory oparte na wirusach brodawczaka niosące kasetę ekspresyjną dla będącego przedmiotem zainteresowania genu.

Zidentyfikowano dotychczas ponad 70 podtypów ludzkich wirusów brodawczaka (HPV) oraz wiele różnych wirusów brodawczaka zwierząt [zur Hausen, H. i de Villiers E., Annu Rev Microbiol 48 (1994) 427-447; Bernard, H., i wsp., Curr Top Microbiol Immunol 186 (1994) 33-54]. Wszystkie wirusy brodawczaków wykazują podobną organizację genomu, a położenie wszystkich translacyjnych otwartych ramek odczytu (ORF) jest silnie zachowywane.

Wirusy brodawczaka zakażają komórki nabłonka płaskiego skóry lub śluzówek w różnych miejscach w ciele i indukują powstawanie łagodnych nowotworów, które w niektórych przypadkach mogą przejść w stan złośliwy. Genomy wirusa brodawczaka są replikowane i utrzymywane w zainfekowanych komórkach w postaci wielokopijnych plazmidów jądrowych. Replikacja, utrzymywanie episomów, ekspresja genów późnych i składanie wirusów są ściśle sprzężone z różnicowaniem się tkanki nabłonkowej: replikacja episomalnego DNA wirusa brodawczaka zachodzi podczas wstępnej replikacji namnażającej oraz drugiej, tj. ukrytej i trzeciej, tj. wegetatywnej, replikacji w różnicującym się nabłonku. [Howley, P. M.; Papillomavirinae: the viruses and their replication. w: Virology, Fields, B. C, Knipe, D. M., Howley, P. M., red., Lippincott Raven Publishers, Philadelphia, USA, 1996, 2. wyd, s. 2045-2076].

Wykazano, że dwa czynniki wirusowe kodowane przez otwarte ramki odczytu E1 i E2 są niezbędne i wystarczające do inicjacji replikacji DNA z miejsca startu wirusa brodawczaka w komórkach [Ustav, M. i Steniund, A., EMBO J 10 (1991) 449-57; Ustav, M., i wsp., EMBO J 10 (1991) 4321-4329; Ustav, E., i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 90 (1993) 898-902].

Zdefiniowano funkcjonalne miejsca startu replikacji DNA dla BPV1 [Ustav, M., i wsp., EMBO J 10 (1991) 4321-4329], HPV1a [Gopalakrishnan, V. i Khan, S., powyżej], HPV11 [Russell, J., Botchan, M., J Virol 69 (1995) 651-660], HPV18 [Sverdrup, F. i Khan, S., J Virol 69 (1995) 1319-1323: Sverdrup, F. i Khan, S., J Virol 68 (1994) 505-509] i wielu innych. Charakterystyczne jest, ż e wszystkie te fragmenty startu replikacji wykazują wysoką zawartość par A/T i zawierają kilka nakładających się na siebie pojedynczych miejsc rozpoznawanych przez białko E1, które razem tworzą miejsce wiązania E1 [Ustav, M., i wsp., EMBO J 10 (1991) 4321-4329; Holt, S., i wsp., J Virol 68 (1994) 1094-1102; Holt, S. i Wilson, V., J Virol 69 (1995) 6525-3652; Sedman, T., i wsp. J Virol 71 (1997) 2887-2996]. Dodatkowo, te funkcjonalne fragmenty startu replikacji zawierają miejsce wiązania E2, które jest niezbędne do zainicjowania replikacji DNA in vivo w większości przypadków (Ustav, E., i wsp., powyżej). Białko E2 ułatwia pierwszy etap rozpoznawania miejsca startu przez E1. Po wstępnym związaniu monomerycznego E1 z miejscem startu inicjowana jest multimeryzacja E1. Prowadzi to do utworzenia kompleksu z aktywnością topienia ori.

Zasugerowano, że E2 nie ma wpływu na dalsze etapy inicjacji replikacji DNA [Lusky, M., i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 91 (1994) 8895-8899].

ORF E2 BPV koduje trzy białka, które powstają w wyniku selektywnego wykorzystania promotora i alternatywnego składania RNA [Lambert, P., i wsp., Annu Rev Genet 22 (1988) 235-258]. Wszystkie

PL 206 097 B1 te białka mogą tworzyć homo- i heterodimery między sobą i wiążą się specyficznie z przerwaną sekwencją palindromową o długości 12 bp 5'-ACCNNNNNNGGT-3' [Androphy, E., i wsp., Nature 325 (1987) 70-739].

W genomie BPV1 znajduje się 17 miejsc wią zania E2, w genomach HPV jest ich do 4 i odgrywają one kluczową rolę w inicjacji replikacji DNA wirusowego (Ustav, E., i wsp., powyżej) oraz w regulacji ekspresji genów wirusowych (Howley, P. M., Papillomavirinae: the viruses and their replication, w: Virology, Fields, B. C., Knipe, D. M., Howley, P. M., red., Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1996. 2. wyd., s. 2045-2076). Analizy strukturalne i mutacyjne ujawniły trzy odrębne domeny funkcjonalne w białku E2 pełnej wielkości. Część N-końcowa (aminokwasu 1 do 210) jest domeną aktywacyjną dla transkrypcji i replikacji. Po niej następuje nieustrukturalizowany region zawiasowy (aminokwasy 211 do 324) oraz C-końcowa domena wiązania DNA i dimeryzacji (aminokwasy 325 do 410) [Dostatni, N., i wsp., EMBO J 7 (1988) 3807-3816; Haugen, T., i wsp. EMBO J 7 (1988) 4245-4253; McBride, A., i wsp., EMBO J 7 (1988) 533-539; McBride, A., i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 86 (1989) 510-514]. Na podstawie danych krystalografii rentgenowskiej domena wiązania DNA i dimeryzacji E2 ma strukturę podwójnie symetrycznej ośmiopasmowej przeciwrównoległej beczułki beta utworzonej przez dwie identyczne podjednostki „połówek beczułki” [Hegde, R., i wsp., Nature 359 (1992) 505-512; Hegde, R., J Nuci Med 36 (6 Suppl) (1995) 25S-27S]. Elementy funkcjonalne domeny trans-aktywują cej E2 wykazują bardzo wysoką integralność strukturalną, co potwierdza analiza mutacji [Abroi, A., i wsp., J Virol 70 (1996) 6169-6179; Brokaw, J., i wsp., J Virol 71 (1996) 23-29; Grossel, M., i wsp., J Virol 70 (1996) 7264-7269; Ferguson, M. i Botchan, M., J Virol 70 (1996) 4193-4199] oraz krystalografia rentgenowska [Harris, S., i Botchan, M. R., Science 284 (1999) 1673-1677 i Antson, A. i wsp., Nature 403 (2000) 805-809]. Ponadto, krystalografia rentgenowska wykazuje, że N-końcowa domena białka E2 tworzy strukturę dimeryczną, gdzie Arg37 odgrywa istotną rolę w powstawaniu dimeru (Antson, A., i wsp., powyż ej).

Jak opisano to poprzednio, białko E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1 w trans i jego liczne miejsca wiązania w cis są niezbędne i wystarczające dla przyłączania się episomalnych elementów genetycznych do chromatyny. Sugeruje się, że zjawisko to dostarcza mechanizmu rozdziału genomu wirusa podczas zakażenia wirusowego w dzielących się komórkach [Ilives, I., i wsp., J Virol. 73 (1999) 4404-4412].

Żaden z wektorów brodawczakowych lub innych ujawnionych do tej pory wektorów nie spełnia kryteriów i wymagań stawianych przed optymalną szczepionką, które są takie same dla szczepionek DNA i szczepionek konwencjonalnych. (Należy zauważyć, że wymagania te są korzystne, lecz nie są niezbędne dla zastosowania w charakterze szczepionki.) Po pierwsze, optymalna szczepionka musi wytwarzać odporność ochronną z minimalnymi skutkami niekorzystnymi. Szczepionka powinna zatem być pozbawiona składników, które są toksyczne i/lub wywołują objawy choroby u biorcy. Po drugie, optymalna szczepionka musi indukować swoistą wobec patogenu odpowiedź odpornościową, tzn. musi wywołać silną i mierzalną odpowiedź odpornościową przeciwko pożądanemu patogenowi, nie powodując odpowiedzi odpornościowej przeciwko innym składnikom szczepionki. Te dwa wymagania oznaczają, że wektor użyty jako szczepionka DNA powinien optymalnie wyrażać jedynie pożądany gen(y) i optymalnie nie powinien replikować się w gospodarzu ani nie zawierać sekwencji homologicznych z sekwencjami gospodarza, gdyż sekwencje nukleotydowe homologiczne pomiędzy wektorem a genomem gospodarza mogą powodować integrację wektora do genomu gospodarza. Po trzecie, optymalna szczepionka musi indukować odpowiedni rodzaj odpowiedzi odpornościowej: tzn. musi wywoływać zarówno odpowiedzi komórkowe, jak i humoralne by mogła działać zarówno przeciwko patogenowi wewnątrzkomórkowemu, jak i zewnątrzkomórkowemu. Ostatecznie, optymalna szczepionka musi być stabilna, tzn. musi zachowywać swą moc przez dostatecznie długi czas w organizmie by wywołać odpowiedź odpornościową i w preparacie szczepionki by mogła być używana w różnych wymagających okolicznościach podczas przechowywania i przygotowywania. Dodatkowo, szczepionka powinna mieć rozsądną cenę. Ponadto, droga i sposób szczepienia są istotnymi czynnikami do rozważenia przy optymalizacji immunizacji DNA.

Przy opracowywaniu szczepionki DNA duży problem stanowi niekiedy stabilność ekspresji żądanego genu. Funkcja utrzymywania lub trwałość wektora w komórce biorcy była więc w centrum uwagi w dotychczasowym stanie techniki, często jednak kosztem bezpieczeństwa. Przykładowo Ohe, Y., i wsp. [Hum Gene Ther 6 (3) (1995) 325-333] ujawniają wektor oparty na wirusie brodawczaka zdolny do stabilnej ekspresji na wysokim poziomie, proponowany do użycia w terapii genowej. Transformujące wczesne geny E5, E6 i E7 zostały z tego wektora usunięte, lecz zawiera on wciąż sekwencje

PL 206 097 B1 nukleotydowe kodujące inne geny wirusa brodawczaka takie, jak geny E1 i E2, które są zaangażowane w replikację wirusa. Wektor ten wytwarza zatem kilka innych białek wirusa brodawczaka, które mogą wywołać niepożądane odpowiedzi odpornościowe i które wiążą się z ryzykiem integracji wektora do gospodarza. Wektor ten jest także zdolny do replikacji, ponieważ zawiera gen E1. Ponadto ma duży rozmiar i przez to jest podatny na modyfikację w bakteriach podczas preparatyki.

Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/EE96/00004 (WO 97/24451) ujawnia wektory zdolne do długotrwałego utrzymywania się w komórce gospodarza i sposoby użycia takich wektorów dla uzyskania długoterminowego wytwarzania będącego przedmiotem zainteresowania produktu genu w komórce gospodarza - ssaka, która wyraż a E1 i E2. Wektory te zawierają minimalne miejsce startu replikacji (MO) wirusa brodawczaka, element utrzymywania minichromosomu (MME) wirusa brodawczaka i gen kodujący wspomniany produkt genu, przy czym MO i MME składają się z sekwencji DNA różnej od naturalnej sekwencji wirusa brodawczaka, a w niektórych wykonaniach także gen E1. Dodatkowo w niektórych przykładach ujawnione są wektory zawierające MME składający się zasadniczo z dziesię ciu miejsc wią zania E2. Wektory te wymagają dla ekspresji obecnoś ci biał ka E1 u gospodarza albo w wektorze. Nadaje to wektorom funkcje replikacyjną. Wektory te wyrażają także białko E1 obok genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz białka E2 i zawierają sekwencje takie, jak sekwencje β-globiny królika, które są częściowo homologiczne z sekwencjami ludzkimi powodując poważne ryzyko integracji do genomu ludzkiego, co obniża potencjał tych wektorów jako szczepionek DNA. Dodatkowo, wektory te są niestabilne ze względu na ich rozmiar (ok. 15 kb): na etapie preparatyki w komórkach bakteryjnych bakteryjna maszyneria replikacyjna wykazuje tendencje do modyfikacji wektora przez jego losowe cięcie, co prowadzi do niedostatecznie satysfakcjonujących produktów ekspresji, w tym produktów całkowicie pozbawionych będącego przedmiotem zainteresowania genu.

Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/EE96/00004 (WO 97/24451) ujawnia ponadto, że E1 i E2 są jedynymi białkami wirusowymi niezbędnymi do długotrwałej episomalnej replikacji tych wektorów. Dodatkowo, funkcja utrzymywania genomu BPV1 jest związana z obecnością minimalnego miejsca startu replikacji (MO), dla którego stwierdzono, że jest niezbędne, lecz niewystarczające dla długiego trwania lub stabilnego utrzymywania wektorów w komórkach. Dodatkowo, stwierdzono, że elementy cis, tzn. elementy utrzymywania minichromosomów BPV1 są wymagane do stabilnej replikacji BPV1. W szczególności, stwierdzono, że multimeryczne miejsca wiązania E2 (E2BS) są konieczne do stabilnego utrzymywania wektorów.

Istnieje wyraźne zapotrzebowanie na ulepszone nowe wektory, które byłyby użyteczne jako szczepionki DNA.

Zatem celem wynalazku jest dostarczenie nowych wektorów, które są zdolne do długotrwałego utrzymywania się w dużej i zwiększającej się liczbie różnych komórek ciała gospodarza i tym samym zdolne są do dostarczenia stabilnej ekspresji żądanego antygenu(-ów).

Dalszym celem wynalazku jest dostarczenie nowych wektorów, które są użyteczne w terapii genowej i jako genowe czynniki terapeutyczne i do wytwarzania leków wielkocząsteczkowych.

Wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego, który obejmuje (a) sekwencję DNA kodującą jądrowe białko kotwiczące funkcjonalnie połączoną z heterologicznym promotorem, które to jądrowe białko kotwiczące obejmuje:

(i) domenę wiążącą DNA, która wiąże specyficzną sekwencję DNA, i (ii) domenę funkcjonalną białka E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1, która wiąże się ze składnikiem jądra i (b) multimeryczną sekwencję DNA wiążącą jądrowe białko kotwiczące przy czym wektor pozbawiony jest miejsca startu replikacji mogącego działać w komórce ssaka.

Korzystnie jądrowe białko kotwiczące jest białkiem kotwiczącym w chromatynie, a domena funkcjonalna wiąże chromatynę mitotyczną.

Bardziej korzystnie jądrowe białko kotwiczące zawiera region zawiasu lub łącznika.

Korzystnie domena wiążąca DNA jest domeną wiążącą DNA białka E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1.

Korzystnie multimeryczną wiążącą sekwencją DNA obejmuje multimeryczne miejsca wiązania E2.

Korzystnie jądrowe białko kotwiczące jest naturalnym białkiem pochodzenia wirusowego.

Korzystnie jądrowe białko jest białkiem rekombinowanym, białkiem fuzyjnym lub białkiem uzyskanym przez techniki modelowania molekularnego.

Korzystnie wektor według wynalazku obejmuje dalej jedną lub więcej kaset ekspresyjnych sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania i wówczas korzystnie sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest sekwencją z genu otrzymanego od zakaźnego patogenu, korzystnie

PL 206 097 B1 wirusa, który korzystnie jest wybrany z grupy składającej się z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), wirusa opryszczki (HSV), wirusa zapalenia wątroby typu C, wirusa grypy i enterowirusa.

W przypadku gdy wektor zawiera kasety ekspresyjne sekwencja DNA bę d ąca przedmiotem zainteresowania korzystnie może być sekwencją z genu otrzymanego od bakterii, która korzystnie jest wybrana z grupy składającej się z Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis i Mycoplasma pneumonia, a najkorzystniej bakterią jest Salmonella.

Korzystną sekwencją DNA będącą przedmiotem zainteresowania jest też sekwencja z genu otrzymanego od patogenu grzybowego, którym korzystnie jest Candida albigens.

Korzystnie sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest pochodzenia HIV, która bardziej korzystnie koduje niestrukturalne białko regulatorowe HIV, korzystnie Nef, Tat, lub Rev, ale najkorzystniej Nef.

Korzystnie też sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje strukturalne białko HIV i korzystnie nia jest genem kodującym gp120/gp160 HIV.

W przypadku gdy wektor zawiera kasety ekspresyjne korzystnie pierwsza kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą Nef, Tat lub Rev i druga kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą Nef, Tat lub Rev.

Korzystnie też pierwsza kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą Nef, Tat lub Rev, a druga kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą strukturalne białko HIV.

Korzystnie sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko związane z rakiem.

Korzystnie również sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko związane z dojrzałością odpornościową, regulacją odpowiedzi odpornościowych lub regulacją odpowiedzi autoimmunologicznych, którym jest białko APECED.

Korzystnie sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest genem Aire.

Korzystnie sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania w wektorze zawierającym kasetę ekspresyjną koduje białko, które wykazuje defekt w jakiejkolwiek dziedzicznej chorobie jednogenowej.

Korzystnie również sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje lek wielkocząsteczkowy.

Korzystnie sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje cytokinę, bardziej korzystnie interleukinę wybraną z grupy obejmującej IL1, IL2, IL4, IL6 i IL12.

Korzystnie również sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje interferon.

Korzystnie sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje aktywną biologicznie cząsteczkę RNA, korzystnie wybraną z grupy składającej się z cząsteczek inhibitorowych antysensownych i rybozymów, a najkorzystniej cząsteczki inhibitorowe antysensowne lub rybozymy hamują funkcję onkogenu.

Wynalazek dotyczy również wektora według wynalazku do zastosowania jako lek.

W zakres wynalazku wchodzi również wektor wedł ug wynalazku do zastosowania jako lek do leczenia dziedzicznych lub nabytych defektów genetycznych.

Ponadto wynalazek obejmuje wektor według wynalazku do zastosowania jako terapeutyczna szczepionka DNA przeciwko czynnikowi zakaźnemu.

Wynalazek dotyczy również wektora według wynalazku do wytwarzania terapeutycznego wielkocząsteczkowego środka in vivo.

Wynalazek dotyczy także wektora według wynalazku do zastosowania do wytwarzania białka kodowanego przez sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania w komórce lub w organizmie.

W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie wektora wedł ug wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do dostarczania białka pacjentowi, przy czym wektor ten (i) obejmuje ponadto drugą sekwencję DNA kodującą białko, które ma być dostarczane pacjentowi, która to druga sekwencja DNA jest funkcjonalnie połączona z drugim promotorem, oraz (ii) nie koduje białka E1 wirusa brodawczaka bydła, a pacjent ten nie wyraża białka E1 wirusa brodawczaka bydła.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowanie wektora według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku u pacjenta, przy czym wektor ten (i) obejmuje ponadto drugą sekwencję DNA kodującą to białko, która jest funkcjonalnie połączona z drugim promotorem, i (ii) nie koduje białka E1 wirusa brodawczaka bydła, a pacjent nie wyraża białka E1 wirusa brodawczaka bydła.

PL 206 097 B1

Wynalazek obejmuje również zastosowanie wektora według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby zakaźnej u pacjenta wymagającego tego leczenia, przy czym sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko obejmujące immunogenny epitop czynnika zakaźnego.

W zakres wynalazku wchodzi równie ż zastosowanie wektora wedł ug wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dziedzicznych lub nabytych defektów genetycznych u pacjenta wymagającego tego leczenia, przy czym sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko, które ma wspomniany dziedziczny lub nabyty defekt genetyczny.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania wektora według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do ekspresji sekwencji DNA u pacjenta.

Wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie wektora według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia HIV.

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania wektora według wynalazku w dużej liczbie kopii, który obejmuje:

a) hodowanie komórki gospodarza zawierającej ten wektor, i

b) odzyskanie wektora

Korzystnie sposób obejmuje ponadto przed etapem (a) etap transformowania komórki gospodarza wektorem.

Bardziej korzystnie komórka gospodarza jest komórką prokariotyczną, a najkorzystniej komórką Escherichia coli.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi komórka gospodarza, która zawiera wektor według wynalazku.

Korzystnie komórka gospodarza jest komórką bakteryjną, lub komórką ssaka.

Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej wektor według wynalazku i odpowiedni noś nik farmaceutyczny.

Wynalazek dotyczy również szczepionki, która zawiera wektor według wynalazku.

Korzystnie szczepionka jest szczepionką zapobiegawczą.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi genowy czynnik terapeutyczny, który zawiera wektor według wynalazku.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania szczepionki DNA według wynalazku obejmującego połączenie wektora z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym.

W niniejszym wynalazku ujawniono nowe wektory, które spełniają wymagania stawiane przed wektorami nośnikowymi dla genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania lub dla optymalnego wektora szczepionki DNA i które korzystnie pozbawione są niedogodności i efektów ubocznych wektorów znanych w dotychczasowym stanie techniki.

Niniejszy wynalazek opiera się na zaskakującym stwierdzeniu, że wektor (plazmid) niosący (i) kasetę ekspresyjną sekwencji DNA kodującej jądrowe białko kotwiczące oraz (ii) wiele kopii sekwencji wiążących z wysokim powinowactwem to jądrowe białko kotwiczące, rozprzestrzenia się w proliferują cych komórkach.

W wyniku tego liczba komórek niosą cych wektor wzrasta nawet bez replikacji wektora. Gdy wektor dodatkowo niesie gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania, liczba komórek wyrażających gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania podobnie wzrasta bez replikacji wektora. Wektor według wynalazku pozbawiony jest więc miejsca startu replikacji wirusa brodawczaka. W korzystnym wykonaniu wektor według wynalazku pozbawiony jest miejsca startu replikacji działającego w komórkach ssaka.

Zgodnie z tym, w niniejszym wynalazku ujawniono zastosowanie nowych wektorów użytecznych jako wektory nośnikowe dla genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania, w szczepieniach DNA i terapii genowej oraz jako genowe czynniki terapeutyczne. W konkretnym wykonaniu, wektory te są zdolne do rozprzestrzeniania się i, jeżeli jest to pożądane, do wyrażania genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania w rosnącej liczbie komórek przez dłuższy czas. Wektor według niniejszego wynalazku korzystnie wyraża jedynie jądrowe białko kotwiczące i, jeśli jest to konieczne, gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania. Wektory te są pozbawione jakichkolwiek zbędnych, transformujących nowotworowo lub potencjalnie toksycznych sekwencji, unikając tym samym poważnej wady wektorów ujawnionych wcześniej lub proponowanych do wykorzystania w roli szczepionek DNA, tzn. reakcji nadwrażliwości przeciwko innym składnikom wirusowym. W niektórych

PL 206 097 B1 wykonaniach wynalazku uzyskuje się to przez niski poziom wyrażanego jądrowego białka kotwiczącego w komórkach. Jednocześnie wektory według niniejszego wynalazku indukują zarówno odpowiedzi odpornościowe humoralne, jak i komórkowe, przy czym gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania włączone są do wektora.

Wektory według niniejszego wynalazku są korzystne do wykorzystania zarówno in vitro (np. na etapie wytwarzania) jak i in vivo (np. w szczepieniu).

OPIS RYSUNKÓW

Figura 1 przedstawia schematyczną mapę plazmidu super6.

Figura 2 przedstawia schematyczną mapę plazmidu VI.

Figura 3 przedstawia schematyczną mapę plazmidu II.

Figura 4 przedstawia ekspresję białek Nef i E2 z wektorów super6, super6wt, VI, VIwt, i II w komórkach Jurkat.

Figura 5 przedstawia schematyczną mapę plazmidu product1.

Figura 6A przedstawia schematyczną mapę plazmidów NNV-1 i NNV-2, zaś Figura 6B przedstawia schematyczną mapę plazmidu NNV-2wt.

Figura 7 przedstawia ekspresję białka Nef z plazmidów NNV1, NNV-2, NNV-1wt, NNV-2-wt, super6, i super6wt w komórkach Jurkat.

Figura 8 przedstawia ekspresję białek Nef i E2 z plazmidów NNV-2-wt, NNV-2-wtFS, i produkt I w komórkach Jurkat.

Figura 9 przedstawia ekspresję białek Nef i E2 z plazmidów NNV-2-wt, NNV-2-wtFS, i produkt I w komórkach P815.

Figura 10 przedstawia ekspresję białek Nef i E2 z plazmidów NNV-2-wt, NNV-2-wtFS, i produkt I w komórkach CHO.

Figura 11 przedstawia ekspresję białka Nef z plazmidów NNV2-wt, NNV-2-wtFS, i produkt I w komórkach RD.

Figura 12 przedstawia ekspresję cząsteczek RNA NNV-2wt w komórkach CHO, Jurkat i P815.

Figura 13 przedstawia stabilność NNV-2wt w komórkach bakterii.

Figura 14 przedstawia analizę typu Southern stabilności NNV-2wt jako niereplikującego się elementu episomalnego w liniach komórkowych CHO i Jurkat.

Figura 15 przedstawia, że wektory NNV2wt, NNV2wtFS i product1 są niezdolne do replikacji zależnej od czynnika replikacyjnego HPV-11.

Figura 16 przedstawia schematyczną mapę plazmidu 2wtd1EGFP.

Figura 17 przedstawia schematyczną mapę plazmidu gf10bse2.

Figura 18 przedstawia schematyczną mapę plazmidu 2wtd1EGFPFS.

Figura 19 przedstawia schematyczną mapę plazmidu NNVd1EGFP.

Figura 20 przedstawia krzywe wzrostu komórek Jurkat transfekowanych plazmidami 2wtd1EGFP, 2wtd1EGFPFS, NNVd1EGFP lub samym DNA nośnikowym.

Figura 21 przedstawia krzywe wzrostu komórek Jurkat transfekowanych plazmidami 2wtd1EGFP, 2wtd1EGFPFS, gf10bse2 lub samym DNA nośnikowym.

Figura 22 przedstawia zmianę w procencie komórek dodatnich pod względem d1EGFP w populacji komórek Jurkat transfekowanych wektorami 2wtdlEGFP, 2wtd1EGFPFS lub NNVd1EGFP.

Figura 23 przedstawia zmianę w procencie komórek dodatnich pod względem d1EGFP w populacji komórek Jurkat transfekowanych wektorami 2wtd1EGFP, 2wtd1EGFPFS lub gf10bse2.

Figura 24 przedstawia zmianę w liczbie komórek wyrażających d1EGFP w populacji komórek Jurkat transfekowanych wektorami 2wtd1EGFP, 2wtd1EGFPFS lub NNVd1EGFP.

Figura 25 przedstawia zmianę w liczbie komórek wyrażających d1EGFP w populacji komórek Jurkat transfekowanych wektorami 2wtd1EGFP, 2wtd1EGFPFS lub gf10bse2.

Figura 26. Odpowiedzi limfocytów T przeciwko zrekombinowanemu białku Nef (5 mikrogramów/studzienkę), mierzone przez proliferację komórek T u pięciu pacjentów immunizowanych 1 mikrogramem GTU-Nef.

Figura 27. Odpowiedzi komórek T przeciwko zrekombinowanemu białku Nef (5 mikrogramów/studzienkę), mierzone przez proliferację komórek T u pięciu pacjentów immunizowanych 20 mikrogramami GTU-Nef.

Figura 28. Odpowiedzi komórek T przeciwko zrekombinowanemu białku Nef (5 mikrogramów/studzienkę), mierzone przez proliferację komórek T u pacjenta #1 immunizowanego 1 mikrogramem

PL 206 097 B1

GTU-Nef. Wyniki przedstawiono w postaci wskaźnika stymulacji w oznaczeniu proliferacji komórek T (NEF SI) oraz w postaci wydzielania IFN-Gamma do nadsączu.

Figura 29. (A) plazmid pEBOLPP; (B) plazmid s6E2d1EGFP;

(C) plazmid FRE2d1EGFP

Figura 30. Plazmid FREBNAd1EGFP

Figura 31. Wektory nie przeszkadzały proliferacji komórek.

Figura 32. Wektory są utrzymywane w komórkach z różną kinetyką.

Figura 33. Zmiana w liczbie komórek wyrażających d1EGFP w czasie w całkowicie stransfekowanej populacji komórek.

Figura 34. Zmiana w liczbie komórek wyrażających d1EGFP w czasie w całkowicie stransfekowanej populacji komórek. (A) ludzka zarodkowa linia komórkowa 293; (B) mysia linia komórkowa 3T6

Figura 35. Odpowiedź przeciwciał na Nef i E2.

Figura 36. Odpowiedź przeciwciał na Rev i Tat.

Figura 37. Odpowiedź na Gag i CTL.

Figura 38. (A) GTU-1; (B) GTU-2Nef; (C) GTU-3Nef; (D) super6wtd1EGFP; (E) FREBNAd1EGFP; (F) E2BSEBNAd1EGFP; (G) NNV-Rev.

Figura 39. (A) pNRT; (B) pTRN; (C) pRTN; (D) pTNR; (E) pRNT; (F) p2TRN; (G) p2RNT; (H) p3RNT; (I) pTRN-iE2-GMCSF; (J) pTRN-iMG-GMCSF.

Figura 40. (A) pMV1NTR; (B) pMV2NTR; (C) pMV1N11TR; (D) pMV2N11TR

Figura 41. (A) pCTL; (B) pdgag; (C) psynp17/24; (D) poptp17/24; (E) p2mCTL; (F) p2optp17/24; (G) p3mCTL; (H) p3optp17/24

Rysunek 42. (A) pTRN-CTL; (B) pRNT-CTL; (C) pTRN-dgag; (D) pTRN-CTL-dgag; (E) pRNT-CTL-dgag; (F) pTRN-dgag-CTL; (G) pRNT-dgag-CTL; (H) pTRN-optp17/24-CTL; (I) pTRN-CTL-optp17/24; (J) pRNT-CTL-optp17/24; (K) p2TRN-optp17/24-CTL; (L) p2RNT-optp17/24-CTL; (M) p2TRN-CTL-optp17/24; (N) p2RNT-CTL-optp17/24; (O) p2TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF; (P) p2RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF; (Q) p3TRN-CTL-optp17/24; (R) p3RNT-CTL-optp17/24; (S) p3TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF; (T) p3RNT-CTLoptp17/24-iE2-mGMCSF; (U) FREBNARNT-CTL-optp17/24; (V) super6wt-RNTCTL-optp17/24; (W) E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24; (X) pCMV-RNT-CTL-optp 17/24

Figura 43. Analiza ekspresji antygenów multireg.

Figura 44. Analiza ekspresji antygenów multireg złożonych z immunodominujących części białek.

Figura 45. Analiza lokalizacji wewnątrzkomórkowej antygenów multireg przez immunofluorescencję.

Figura 46. Analiza ekspresji białek strukturalnych kodowanych przez gag i multi-epitopu CTL.

Figura 47. Lokalizacja białka p17/24 w błonach komórek RD.

Figura 48. Analiza ekspresji multigenów zawierających dgag i CTL w komórkach Cos-7

Rysunek 49. Analiza typu Western antygenów multiHIV wyrażanych w komórkach Jurkat.

Figura 50. Analiza ekspresji antygenów TRN-CTL-optp17/24 i RNT-CTL-optp17/24 oraz białka E2 z wektora GTU-1, GTU-2 i GTU-3.

Figura 51. Utrzymywanie się ekspresji antygenów multiHIV z różnych wektorów.

Figura 52. Lokalizacja wewnątrzkomórkowa antygenów multiHIV w komórkach RD.

WEKTORY WEDŁUG WYNALAZKU

Jądrowe białka kotwiczące zawarte w wektorze ekspresyjnym według wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, białka kotwiczące w chromatynie takie, jak białko E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1 (BPV1 E2; SEKW. NR ID.:50). Sekwencjami DNA wiążącymi jądrowe białko kotwiczące mogą być, ale nie wyłącznie, multimeryczne miejsca wiązania E2. Na podstawie dotychczasowego stanu techniki nie można było spodziewać się, że funkcja segregacji/rozdziału, przykładowo, wirusów brodawczaka może być wyrażana oddzielnie, i że dodanie takiej funkcji segregacji/rozdziału do wektorów szczepionek zapewni rozdział wektora w populacji namnażających się komórek. Ponadto, na podstawie dotychczasowego stanu techniki nie można było oczekiwać, że możliwe jest skonstruowanie funkcjonalnych wektorów działających niezależnie od miejsca startu replikacji.

Termin „jądrowe białko kotwiczące” w użytym w niniejszym wynalazku znaczeniu odnosi się do białka, które wiąże specyficzną sekwencję DNA i jest zdolne do dostarczenia wektorowi funkcji kompartmentalizacji jądrowej, tzn. do białka, które jest zdolne do zakotwiczania lub przyłączenia wektora do specyficznego kompartmentu jądrowego. W niektórych wykonaniach wynalazku jądrowym białkiem kotwiczącym jest białko naturalne. Przykładami takich kompartmentów jądrowych są chromatyna

PL 206 097 B1 mitotyczna lub chromosomy mitotyczne, matriks jądrowa, domeny jądrowe, jak ND10 lub POD itp. Przykładami jądrowych białek kotwiczących są białko E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1 (BPV1), EBNA1 (antygen jądrowy 1 wirusa Epsteina-Barra; SEKW. NR ID.:52) oraz białka grupy białek o wysokiej mobilnoś ci (HMG) itp.

W niektórych wykonaniach wynalazku ją drowe biał ko kotwiczą ce wedł ug wynalazku jest biał kiem zrekombinowanym, innych wykonaniach jest białkiem fuzyjnym lub białkiem uzyskanym przez techniki modelowania molekularnego. Białko fuzyjne lub białko uzyskane przez techniki modelowania molekularnego jest charakteryzowane przez zdolność do wiązania składnika jądrowego oraz zdolność do specyficznego względem sekwencji wiązania DNA. W korzystnym wykonaniu wynalazku takie białko fuzyjne jest kodowane przez wektor według wynalazku, który zawiera także specyficzną sekwencję DNA, z którą białko fuzyjne się wiąże. Składniki jądrowe obejmują, ale nie wyłącznie, chromatynę, matriks jądrową, domenę ND10 i POD. W celu zmniejszenia ryzyka interferencji ekspresją genów endogennych dla komórki gospodarza, domena wiążąca DNA i odpowiednia sekwencja DNA korzystnie są nieendogenne dla komórki/organizmu gospodarza. Takie domeny obejmują, ale nie wyłącznie, domenę wiążącą DNA białka E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1 (BPV) (SEKW. NR ID.:50), antygen jądrowy 1 wirusa Epsteina-Barra (EBNA1; SEKW. NR ID.:52), oraz białka z grupy białek o wysokiej mobilności (HMG) (HMG box).

Wektor według wynalazku może ponadto obejmować „sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania”, która koduje białko (w tym peptyd lub polipeptyd), który jest np. immunogenem lub czynnikiem terapeutycznym. W niektórych wykonaniach wynalazku sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje aktywną biologicznie cząsteczkę RNA taką, jak cząsteczka RNA antysensownego lub rybozym.

Wektory ekspresyjne według wynalazku niosące sekwencję DNA kodującą jądrowe białko kotwiczące oraz multimeryczne miejsca wiązania tego jądrowego białka kotwiczącego rozprzestrzeniają się w populacji namnażających się komórek. Oznacza to, że duża liczba kopii wektorów lub plazmidów jest dostarczana do komórek docelowych, a wykorzystanie funkcji segregacji/rozdziału jądrowego białka kotwiczącego i jego multimerycznych miejsc wiązania zapewnia rozmieszczenie wektora w komórkach potomnych podczas podział u komórki.

Wektor według wynalazku pozbawiony jest miejsca startu replikacji działającego w komórkach ssaka. Pominięcie miejsca startu replikacji wirusa brodawczaka lub miejsca startu replikacji ssaka stanowi ulepszenie w stosunku do wektorów dotychczasowego stanu techniki z kilku powodów. (1) Pominięcie miejsca startu replikacji zmniejsza rozmiar wektora według wynalazku w porównaniu z wektorami znanymi w dotychczasowym stanie techniki. Takie zmniejszenie rozmiaru zwię ksza stabilność wektora i ułatwia jego pobieranie przez komórkę gospodarza. (2) Pominięcie miejsca startu replikacji zmniejsza ryzyko rekombinacji z genomem komórki gospodarza, zmniejszając tym samym ryzyko niepożądanych skutków ubocznych. (3) Pominięcie miejsca startu replikacji pozwala na kontrolowanie dawkowania przez proste dostosowanie ilości podanego wektora. W przeciwieństwie, przy działającym miejscu startu replikacji przy wyznaczaniu wymaganej dawki należy uwzględnić replikację wektora. (4) Jeżeli wektor nie jest podawany do organizmu gospodarza w sposób ciągły, brak miejsca startu replikacji pozwala na oczyszczenie się organizmu gospodarza z wektora, zapewniając w ten sposób większą kontrolę nad poziomem sekwencji DNA wyrażanych w organizmie gospodarza. Ponadto, zdolność organizmu do oczyszczenia się z wektora będzie korzystna, jeżeli obecność wektora będzie wymagana jedynie podczas trwania leczenia, lecz niepożądana u osobnika zdrowego.

Genem kodującym jądrowe białko kotwiczące użytecznym w wektorach według niniejszego wynalazku może być dowolna odpowiednia sekwencja DNA kodująca naturalne lub sztuczne białko takie, jak białko zrekombinowane, białko fuzyjne lub białko uzyskane przez techniki modelowania molekularnego mające wymagane właściwości. Gen kodujący naturalne jądrowe białko kotwiczące, zawierające domenę wiążącą DNA zdolną do wiązania specyficznej sekwencji DNA oraz domenę funkcjonalną zdolną do wiązania się ze składnikiem jądrowym może zatem być genem kodującym białko wirusowe takie, jak białko E2 wirusa brodawczaka bydła lub EBNA1 wirusa Epsteina-Barra. Alternatywnie, gen kodujący jądrowe białko kotwiczące, zawierające domenę wiążącą DNA zdolną do wiązania specyficznej sekwencji DNA oraz domenę funkcjonalną zdolną do wiązania się ze składnikiem jądrowym, może też składać się z sekwencji DNA kodujących domenę białka komórkowego wykazującego zdolność przyłączania się do odpowiedniej struktury jądrowej takiej, jak chromosomy mitotyczne, matriks jądrowa lub domeny jądrowe, jak ND10 lub POD.

PL 206 097 B1

Alternatywnie można zastosować sekwencję DNA kodującą nienaturalne lub sztuczne białko takie, jak białko zrekombinowane lub białko fuzyjne lub białko uzyskane przez modelowanie molekularne, które zawiera domenę wiążącą DNA zdolną do wiązania ze specyficzną sekwencją DNA z, np. wirusa brodawczaka taką, jak domena wiążąca DNA białka E2 BPV1, lecz w którym N-koniec jądrowego białka kotwiczącego, np. białka E2, został zastąpiony domenami dowolnego odpowiedniego białka o podobnych możliwościach, przykładowo, N-końcową domeną sekwencji antygenu jądrowego 1 wirusa Epsteina-Barra. Podobnie można zastosować sekwencje DNA kodujące białko zrekombinowane lub fuzyjne, które zawiera domenę wiążącą DNA zdolną do wiązania ze składnikiem jądrowym, np. N-końcową domenę funkcjonalną białka wirusa brodawczaka, takiego jak białko E2 BPV1, lecz w którym C-końcowa domena wiązania DNA i dimeryzacji jądrowego białka kotwiczącego, np. białka E2, została zastąpiona domeną dowolnego białka o odpowiedniej sile wiązania DNA, np. domeną wiązania DNA białka E2 BPV1 lub EBNA-1.

W korzystnym wykonaniu wynalazku jądrowe białko kotwiczące jest białkiem kotwiczącym w chromatynie, zawierającym domenę wiążącą DNA, która wiąże się ze specyficzną sekwencją DNA oraz domenę funkcjonalną zdolną do wiązania chromatyny mitotycznej. Korzystnym przykładem takiego białka kotwiczącego w chromatynie i jego multimerowych miejsc wiązania użytecznych w niniejszym wynalazku są białko E2 wirusa brodawczaka bydła 1 i multimerowe miejsca wiązania białka E2. W przypadku E2 mechanizm funkcji rozprzestrzeniania wiąże się z podwójną funkcją biał ka E2: zdolnością białka E2 do łączenia się z chromosomami mitotycznymi przez N-końcową domenę białka i specyficzna wobec sekwencji zdolność wią zania C-koń cowej domeny biał ka E2, co zapewnia przyłączanie wektorów zawierających multimeryczne miejsca wiązania E2 do chromosomów mitotycznych. Zatem wektory mają funkcję segregacji/rozdziału.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku kaseta ekspresyjna genu koduj ą cego bia łko kotwiczące w chromatynie zawiera gen dowolnego odpowiedniego białka pochodzenia komórkowego, wirusowego lub zrekombinowanego o właściwościach analogicznych do E2 BPV1, tzn. zdolności do łączenia się z chromatyną mitotyczną przez jedną domenę i do kooperacyjnego wiązania przez inną domenę z DNA multimerycznego miejsca wiązania specyficznego względem tej domeny wiążącej DNA.

W konkretnym wykonaniu sekwencje uzyskane z BPV1 są wykorzystane w wektorze wedł ug niniejszego wynalazku; są znacznie skrócone i obejmują tylko dwa elementy z BPV1. Po pierwsze, zawierają sekwencję kodującą białko E2 transkrybowaną z heterologicznego promotora eukariotycznego i poli-adenylowaną w heterologicznym miejscu poliadenylacji. Po drugie, zawierają wiele miejsc wiązania białka E2 włączonych w wektor w postaci grupy, w której miejsca te mogą być połączone w strukturze typu „głowa do ogona” albo włączone do wektora w ustalonych odstępach. Oba te elementy są niezbędne i, co zaskakujące, wystarczające dla funkcjonowania wektora w rozprzestrzenianiu się w namnażających się komórkach. Podobnie, gdy w wektorach według niniejszego wynalazku używa się sekwencji DNA opartych na innych odpowiednich źródłach, stosuje się te same zasady.

Według niniejszego wynalazku kaseta ekspresyjna genu jądrowego białka kotwiczącego zawierającego domenę wiążącą DNA zdolną do wiązania specyficznej sekwencji DNA oraz domenę funkcjonalną zdolną do wiązania składnika jądrowego, jak E2 BPV1, obejmuje heterologiczny promotor eukariotyczny, sekwencję kodująca jądrowe białko kotwiczące, taką jak sekwencja kodująca białko kotwiczące w chromatynie, przykładowo sekwencję kodującą białko E2 BPV1, oraz miejsce poli A. Mogą tu być zastosowane różne heterologiczne promotory eukariotyczne, które kontrolują ekspresję jądrowego białka kotwiczącego. Sekwencje nukleotydowe takich heterologicznych, eukariotycznych promotorów są dobrze znane w dziedzinie i łatwo dostępne. Takie heterologiczne promotory eukariotyczne mają różną siłę i specyficzność tkankową. W korzystnym wykonaniu, jądrowe białko kotwiczące jest wyrażane na niskim poziomie.

Multimeryczne wiążące sekwencje DNA, tzn. sekwencje DNA zawierające multimeryczne miejsca wiązania, według definicji niniejszego wynalazku, są regionem, z którym wiąże się domena wiązania DNA i dimeryzacji. Multimeryczne wiążące sekwencje DNA wektorów według niniejszego wynalazku mogą zawierać dowolne miejsca wiązania w DNA pod warunkiem, że spełniają powyższe wymagania.

W korzystnym wykonaniu multimeryczne wiążące sekwencje DNA wektora wedł ug niniejszego wynalazku mogą zawierać dowolne spośród znanych 17 miejsc wiązania E2 o różnym powinowactwie w postaci heksameru lub wyższego oligomeru, w postaci oktameru lub wyższego oligomeru, w postaci dekameru lub wyższego oligomeru. Można też stosować oligomery zawierające różne miejsca wiązania E2. Szczególnie korzystnymi miejscami wiązania E2 użytecznymi w wektorach według niniejszego wynalazku są miejsca BPV1 o wysokim powinowactwie 9 i 10, przy czym najkorzystniejsze jest miejsce

PL 206 097 B1 o powinowactwie 9. Gdy rozważ any jest wyższy oligomer, jego wielkość ograniczona jest jedynie uwarunkowaniami konstrukcji i może on zawierać od 6 do 30 identycznych miejsc wiązania. Korzystne wektory według wynalazku zawierają 10 miejsc wiązania 9 E2 BPV1 w układzie tandemowym. Gdy multimeryczne wiążące sekwencje DNA składają się z różnych miejsc wiązania E2, ich wielkość i skł ad ograniczone są wyłącznie sposobem praktyki konstrukcyjnej. Mog ą zatem zawierać dwa lub więcej różnych miejsc wiązania E2 przyłączonych do serii 6 do 30, najkorzystniej 10, miejsc wiązania E2. Genom wirusa brodawczaka bydła typu 1 (SEKW. NR ID.:49) zawiera 17 miejsc wiązania białka E2, które różnią się powinowactwem do E2. Miejsca wiązania E2 opisane są w pracy Li i wsp. [Genes Dev 3 (4) (1989) 510-526].Alternatywnie, multimeryczne wiążące sekwencje DNA mogą składać się z dowolnych multimetrycznych specyficznych sekwencji zdolnych do zaindukowania kooperacyjnego wiązania białka z plazmidem takich, jak miejsca wiązania EBNA1 lub odpowiedniego białka HMG. Powtórzenia 21x30 bp miejsc wiązania EBNA-1 zlokalizowane są w regionie rozciągającym się od pozycji nukleotydowej 7421 do pozycji nukleotydowej 8042 genomu wirusa Epsteina-Barra (SEKW. NR ID.:51). Te miejsca wiązania EBNA-1 są opisane w następujących pracach: Rawlins i wsp., Cell 42(3) (1985) 859-868; Reisman i wsp., Mol Cell Biol 5(8) (1985) 1822-1832; i Lupton i Levine, Mol Cell Biol 5(10) (1985) 2533-2542, wszystkich trzech niniejszym włączonych tu w całości przez odniesienie.

Pozycja multimerycznej wiążącej sekwencji DNA względem kasety ekspresyjnej domeny wiązania DNA i dimeryzacji nie jest krytyczna i może być dowolną pozycją w plazmidzie. Multimeryczne wiążące sekwencje DNA mogą zatem być położone albo poniżej albo powyżej względem kasety ekspresyjnej będącego przedmiotem zainteresowania genu, przy czym korzystna jest pozycja blisko promotora genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Wektory według wynalazku zawierają także, gdy jest to odpowiednie, odpowiedni promotor dla transkrypcji genu lub genów lub sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania, sekwencje poliadenylacji i introny. Korzystnie wektory mogą również zawierać miejsce startu replikacji plazmidu bakteryjnego i jeden lub więcej genów markerów selekcyjnych dla ułatwienia przygotowania wektora w gospodarzu bakteryjnym oraz odpowiedni promotor dla ekspresji genu selekcji antybiotykowej.

Marker selekcyjny może być dowolnym odpowiednim markerem dopuszczalnym w szczepionkach DNA, takim jak kanamycyna lub neomycyna i inne. Wektory według niniejszego wynalazku obejmują jedynie sekwencje DNA, przykładowo sekwencje DNA BPV1, które są niezbędne i wystarczające dla długotrwałego utrzymywania. Wszystkie nadmiarowe sekwencje, które mogą wywołać szkodliwe reakcje takie, jak sekwencje onkogenne, zostały usunięte. W korzystnych wektorach według wynalazku sekwencja kodująca E2 jest zatem zmodyfikowana przez analizę mutacyjną tak, by wyrażała jedynie białko E2, zaś nakładające się sekwencje E3, E4 i E5 zostały zinaktywowane przez wprowadzenie mutacji, które inaktywują translację otwartych ramek odczytu dla E3, E4 i E5. Wektor według wynalazku nie zawiera miejsca startu replikacji wirusa brodawczaka. Korzystnie wektor według wynalazku nie zawiera miejsca startu replikacji działającego w komórce ssaczej lub w organizmie ssaka.

Ponadto wektory według niniejszego wynalazku nie są specyficzne względem gospodarza, ponieważ ekspresja jądrowego białka kotwiczącego, takiego jak białko E2 jest kontrolowana przez promotory nienatywne lub heterologiczne. Wybrane promotory mogą być funkcjonalne w szerokim zakresie komórek ssaków lub mogą być specyficzne wobec komórki lub tkanki. Przykładami promotorów dla jądrowego białka kotwiczącego, takiego jak białko E2, użytecznymi w wektorach według niniejszego wynalazku są promotory kinazy tymidynowej, wczesny natychmiastowy promotor ludzkiego wirusa cytomegalii, LTR wirusa mięsaka Rousa i im podobne. Dla ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania korzystnymi promotorami są silne promotory zapewniające wysoki poziom ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, przykładem takiego promotora jest wczesny natychmiastowy promotor ludzkiego wirusa cytomegalii.

WEKTORY WEDŁUG WYNALAZKU JAKO NOŚNIKI DLA EKSPRESJI SEKWENCJI DNA BĘDĄCEJ PRZEDMIOTEM ZAINTERESOWANIA

Gen, geny, sekwencja lub sekwencje DNA wyrażane za pośrednictwem wektora według wynalazku mogą być dowolną będącą przedmiotem zainteresowania sekwencją DNA, której ekspresja jest pożądana. Wektory mogą zatem zawierać gen, geny, sekwencję lub sekwencje DNA z zakaźnych mikroorganizmów patogennych, takich jak wirusy, przeciwko którym nie mogą być przygotowane lub użyte żywe atenuowane szczepionki lub szczepionki zinaktywowane. Do takich będących przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA należą geny lub sekwencje DNA z wirusów, takich jak ludzki wirus braku odporności (HIV), wirus opryszczki prostej (HSV), wirus zakaźnego zapalenia wątroby C,

PL 206 097 B1 wirus grypy, enterowirusy itp.; bakterie wewnątrzkomórkowe, takie jak Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumonia itp.; zewnątrzkomórkowe bakterie, takie jak Salmonella lub grzyby takie, jak Candida albicans.

W korzystnym wykonaniu wynalazku wektory zawierają gen kodują cy wczesne biał ka regulatorowe HIV, tzn. niestrukturalne białka regulatorowe Nef, Tat lub Rev, korzystnie Nef. W innym korzystnym wykonaniu wektory według niniejszego wynalazku zawierają dwa lub więcej genów kodujących dowolną kombinację wczesnych białek regulatorowych i/lub białek strukturalnych HIV. Ilustrującymi przykładami takich kombinacji są kombinacja genu kodującego białko Nef i sekwencji DNA kodującej białko Tat, możliwie wraz z sekwencją DNA kodującą glikoproteinę otoczki zewnętrznej HIV, gp120/gp160 lub kombinacja dowolnych immunogennych epitopów białek patogenów włączonych do sztucznego zrekombinowanego białka.

Alternatywnie, wektory według wynalazku mogą zawierać geny lub sekwencje DNA dziedzicznych lub nabytych defektów genetycznych takie, jak sekwencje antygenów różnicowania się czerniaka, jak sekwencja kodująca Tyrozynazy A lub sekwencja kodująca beta-kateninę.

W korzystnym wykonaniu wynalazku wektory zawierają gen kodują cy białka zwią zane z nowotworami lub innymi chorobami mutacyjnymi, korzystnie z chorobami związanymi z dojrzewaniem układu odpornościowego i regulacją odpowiedzi odpornościowej przeciwko antygenom własnym i obcym, takie jak gen APECED.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku wektory zawierają dowolną sekwencję DNA kodującą białko, które wykazuje defekt w jakiejkolwiek dziedzicznej chorobie jednogenowej.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku wektory zawierają dowolną sekwencję DNA kodującą lek wielkoocząsteczkowy dostarczany i wytwarzany in vivo.

Sposób według wynalazku przygotowywania wektorów według wynalazku obejmuje następujące etapy: (A) hodowanie komórki gospodarza zawierającej wektor według wynalazku i (B) odzyskanie wektora. W niektórych konkretnych wykonaniach etap (A) poprzedzony jest etapem transformacji komórki gospodarza wektorem według wynalazku.

Wektory według wynalazku są korzystnie powielane w odpowiednich bakteryjnych komórkach gospodarza, takich jak Escherichia coli. Wektory według wynalazku są stabilne i replikują się w wysokiej liczbie kopii w komórkach bakteryjnych. Jeżeli wektor według wynalazku ma być powielany w bakteryjnej komórce gospodarza to zawiera on bakteryjne miejsce startu replikacji. Sekwencje nukleotydowe bakteryjnych miejsc startu replikacji są dobrze znane specjalistom i mogą być łatwo uzyskane.

Po transfekcji do gospodarza - ssaka w wysokiej liczbie kopii, wektor rozprzestrzenia się wraz z podziałami komórek i liczba komórek niosą cych wektor wzrasta bez replikacji wektora, a każ da komórka jest zdolna do wyrażania będącego przedmiotem zainteresowania białka.

Wektory według wynalazku dają w rezultacie wysoką ekspresję żądanego białka. Przykładowo, jak wykazano to w Przykładach 4, 7-10: można było wykazać wysoką ekspresję białka Nef HIV, zielonego białka fluoryzującego (EGFP) oraz białka AIRE w wielu różnych liniach komórkowych, zaś dane wskazują, że nie tylko liczba dodatnich komórek, ale też ilość kodowanego przez gen będący przedmiotem zainteresowania białka rośnie w czasie.

Wektory według wynalazku indukują także zarówno odpowiedź humoralną, jak i komórkową, co wykazano w Przykładach 9 i 10. Wyniki wskazują, że wektory według niniejszego wynalazku mogą być skutecznie użyte jako szczepionki DNA.

Szczepionki według niniejszego wynalazku zawierają wektor według niniejszego wynalazku lub mieszaninę takich wektorów w odpowiednim nośniku farmaceutycznym. Szczepionka może przykładowo zawierać mieszaninę wektorów zawierających geny trzech różnych białek regulatorowych HIV i/lub białek strukturalnych HIV.

Szczepionki według wynalazku są wytwarzane przy zastosowaniu standardowych sposobów wytwarzania szczepionek w celu wytworzenia szczepionek do podawania dowolną konwencjonalną drogą podawania, tzn. domięśniowo, doskórnie itp.

Szczepionki według wynalazku mogą zawierać sekwencje stymulujące ISS w celu zaktywowania odpowiedzi odpornościowej organizmu.

Szczepionki według wynalazku mogą być stosowane w konwencjonalny sposób zapobiegawczy do ochrony osobnika przed zakażeniem. Alternatywnie, szczepionki według wynalazku mogą być użyte jako szczepionki terapeutyczne, zwłaszcza w przypadkach zakażeń wirusowych, wraz z leczeniem konwencjonalnym.

PL 206 097 B1

Jak wspomniano powyżej, wektory według niniejszego wynalazku niosące mechanizm rozprzestrzeniania się w komórce gospodarza znajdują liczne zastosowania jako szczepionki, w terapii genowej, w transferze genów i jako immunogeny terapeutyczne. Wektory według wynalazku mogą być stosowane do dostarczania prawidłowego genu do gospodarza niosącego defekt genu, prowadząc tym samym do leczenia lub terapii choroby genetycznej. Ponadto wektory te mogą dostarczać geny białek immunogennych obcego pochodzenia, takich jak pochodzące z mikroorganizmów, lub autologicznych antygenów nowotworowych, do zastosowania w opracowywaniu szczepionek przeciwko mikroorganizmom lub nowotworom. Wreszcie, wektory według wynalazku mogą być zastosowane do specyficznego dostarczenia genu leku wielkocząsteczkowego do jądra, umożliwiając tym samym rozwój nowych zasad terapeutycznych w leczeniu chorób, w których ekspresja leku w miejscu działania jądrze komórkowym - jest istotna. Lekami tymi mogą być wielkocząsteczki chemiczne takie, jak dowolne białka lub polipeptydy o działaniu terapeutycznym lub leczniczym, które oddziałują z jakimkolwiek mechanizmem jądrowym, takim jak replikacja lub transkrypcja lub transport substancji do i z ją dra.

Konkretnie, wektory według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane do wyrażania konkretnych cytokin, takich jak interleukiny (IL1, IL2, IL4, IL6, IL12 i inne) lub interferon, w celu modulowania swoistych odpowiedzi odpornościowych organizmu (immunoterapia) przeciwko obcym antygenom lub wzmacniania aktywności układu odpornościowego przeciwko zmutowanym antygenom własnym. Rozpatrywane wektory są też użyteczne w uzupełnianiu niedoborów w funkcjonowaniu mózgu, spowodowanych utratą specyficznych dopaminergicznych neuronów prowadzącą do nieodwracalnej neurodegeneracji będącej przyczyną choroby Parkinsona, przez wyrażanie genów związanych z syntezą dopaminy takich, jak hydroksylaza tyrozyny, a także innych genów, których niedobór miałby podobny efekt. Wektory takie są także użyteczne dla ekspresji białek i peptydów regulujących aktywność mózgu takich, jak receptory dopaminy, receptory CCK-A i CCK-B, a także czynniki neurotroficzne takie, jak GDNF, BDNF i inne białka regulujące aktywność mózgu. Ponadto, wektory są użyteczne do długotrwałego wyrażania czynnika IX w hepatocytach oraz alfa 1-antytrypsyny w komórkach mięśniowych w celu uzupełnienia odpowiednich niedoborów w organizmie.

DOCELOWE CHOROBY I ZABURZENIA

W niektórych wykonaniach wektor wedł ug wynalazku jest stosowany jako szczepionka. W niektórych wykonaniach wektor według wynalazku zawiera będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA kodującą białko lub peptyd. Po podaniu takiego wektora pacjentowi, białko lub peptyd kodowany przez będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA jest wyrażany i stymuluje odpowiedź immunologiczną swoistą wobec białka lub peptydu kodowanego przez będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA.

W konkretnych wykonaniach wektor według wynalazku jest stosowany do leczenia i/lub zapobiegania chorobie zakaźnej i/lub schorzeniu spowodowanemu przez czynnik zakaźny. Do takich chorób i schorzeń należą, ale nie wyłącznie, choroby zakaźne wywoływane przez bakterie, wirusy, grzyby, pierwotniaki, robaki pasożytnicze i im podobne. W konkretniejszym wykonaniu wynalazku chorobą zakaźną jest zespół nabytego braku odporności (AIDS).

Korzystnie, gdy konieczne jest leczenie lub zapobieganie chorobom wirusowym, wykorzystywane są sekwencje DNA kodujące cząsteczki obejmujące epitopy znanych wirusów. Przykładowo, takie sekwencje DNA kodujące epitopy antygenowe mogą być przygotowane z wirusów, do których należą, między innymi, wirusy zakaźnego zapalenia wątroby typu A, zakaźnego zapalenia wątroby typu B, zakaźnego zapalenia wątroby typu C, grypy, ospy wietrznej, adenowirus, wirus opryszczki zwykłej typu I (HSV-I), wirus opryszczki zwykłej typu II (HSV-II), księgosuszu, wirus nieżytu nosa, echowirus, rotawirus, wirus syncytjum oddechowego, wirus brodawczaka, papowawirus, wirus cytomegalii, echinowirus, arbowirus, huntawirus, wirus coxsackie, wirus zapalenia ślinianki przyusznej (świnki), wirus odry, wirus różyczki, wirus polio, wirus ludzkiego zespołu braku odporności typu I (HIV-I) oraz wirus ludzkiego zespołu braku odporności typu II (HIV-II).

Korzystnie, gdy konieczne jest leczenie lub zapobieganie zakażeniom bakteryjnym, wykorzystywane są sekwencje DNA kodujące cząsteczki obejmujące epitopy znanych bakterii. Przykładowo, takie sekwencje DNA kodujące epitopy antygenowe mogą być przygotowane z bakterii, do których należą, ale nie wyłącznie, Mycobacteria, Rickettsia, Mycoplasma, Neisseria i Legionella.

Korzystnie, gdy konieczne jest leczenie lub zapobieganie zakażeniom pierwotniakami, wykorzystywane są sekwencje DNA kodujące cząsteczki obejmujące epitopy znanych pierwotniaków.

PL 206 097 B1

Przykładowo, takie sekwencje DNA kodujące epitopy antygenowe mogą być przygotowane z pierwotniaków, do których należą, między innymi, Leishmania, Kokzidioa, i Trypanosoma.

Korzystnie, gdy konieczne jest leczenie lub zapobieganie zakażeniom pasożytami, wykorzystywane są sekwencje DNA kodujące cząsteczki obejmujące epitopy znanych pasożytów. Przykładowo, takie sekwencje DNA kodujące epitopy antygenowe mogą być przygotowane z pasożytów, do których należą, między innymi, Chlamydia i Rickettsia.

W innych konkretnych wykonaniach, wektor według wynalazku jest stosowany do leczenia i/lub zapobiegania chorobie nowotworowej u pacjenta. W tych wykonaniach sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko lub peptyd, które są specyficzne dla, lub związane z chorobą nowotworową. W charakterze niewyczerpującego przykładu, chorobą nowotworową może być włókniakomięsak, śluzakomiesak, tłuszczakomięsak, chrzęstniakomiesak, kostniakomięsak, struniak, mięsakonaczyniak krwionośny, śródbłoniakomięsak, mięsakonaczyniak chłonny, śródbłoniakomięsakonaczyniak chłonny, maziówczak, międzybłoniak, mięsak Ewinga, mięśniakomięsak gładki, mięśniakomięsak prążkowany, rak okrężnicy, rak trzustki, rak piersi, rak jajnika, rak gruczołu krokowego, rak płaskokomórkowy, rak podstawnokomórkowy, gruczolakorak, rak gruczołu potowego, rak gruczołu łojowego, rak brodawczakowaty, gruczolakoraki brodawczakowate, gruczolakorak torbielowaty, rak rdzeniasty, rak oskrzelopochodny, gruczolakorak nerki, wątrobiak, rak przewodu żółciowego, nabłoniak kosmówkowy złośliwy, nasieniak, rak zarodkowy, guz Wilmsa, rak szyjki macicy, guz jądra, rak płuca, drobnokomórkowy rak płuca, rak pęcherza, rak nabłonkowy, glejak, gwiaździak, rdzeniak (cewiak nerwowy), czaszkogardlak, wyściółczak, szyszynczak, guz mózgu złożony z angioblastów, nerwiak nerwu słuchowego, skąpodrzewiak, oponiak, czerniak, nerwiak niedojrzały, glejak siatkówki; białaczki, np. białaczka limfocytowa ostra i białaczka szpikowa ostra (mieloblastyczna, promielocytowa, mielomonocytowa, monocytowa i choroba di Gugliemo); białaczka przewlekła (białaczka mielocytowa (granulocytowa) przewlekła i białaczka limfatyczna przewlekła); i czerwienica prawdziwa, chłoniak (ziarnica złośliwa i chłoniak nieziarniczy), szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstróma i choroba ciężkich łańcuchów (Franklina)itp.

W niektórych innych wykonaniach wynalazku będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA koduje białko, które nie funkcjonuje lub źle funkcjonuje na skutek choroby dziedzicznej lub nabytej mutacji w genie kodującym to białko. Do takich chorób genetycznych należą, między innymi, choroby metaboliczne, np. miażdżyca naczyń (dotknięty gen: APOE); choroba nowotworowa, np. rodzinna gruczolakowata polipowatość okrężnicy (dotknięty gen: APC); choroby autoimmunologiczne, np. zespół niedoczynności przytarczyc i kory nadnerczy (dotknięty gen: APECED); schorzenia mięśni, np. dystrofia mięśniowa Duchenne'a (dotknięty gen: DMD); choroby układu nerwowego, np choroba Alzheimera (dotknięte geny: PS1 i PS2).

W jeszcze innych wykonaniach wektory według wynalazku są stosowane do leczenia i/lub zapobiegania chorobom i zaburzeniom wywołanym przez patologicznie wysoką aktywnością białka. W tych wykonaniach będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA koduje antagonistę nadaktywnego białka. Do takich antagonistów należą, ale nie wyłącznie, cząsteczki antysensownego RNA, rybozymy, przeciwciała i białka dominujące negatywne. W konkretnych wykonaniach wynalazku będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA koduje inhibitor onkogenu.

W niektórych wykonaniach będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA koduje cząsteczkę działającą antagonistycznie na wzrost nowotworowy. W konkretnych wykonaniach wynalazku będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA koduje supresor nowotworów taki, jak, ale nie wyłącznie, p53. W innych konkretnych wykonaniach wynalazku będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA koduje aktywator apoptozy taki, jak, ale nie wyłącznie, kaspaza.

REKOMBINACJA DNA

W różnych wykonaniach wynalazku wektory według wynalazku zawierają jedną lub więcej kaset ekspresyjnych obejmujących będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA. Będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA może kodować białko i/lub aktywną biologicznie cząsteczkę RNA. W obu przypadkach sekwencja DNA jest wstawiona do wektora według wynalazku dla ekspresji w zrekombinowanych komórkach, lub komórkach gospodarza w przypadku terapii genowej.

Termin kaseta ekspresyjna, w użytym tu znaczeniu, odnosi się do będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA funkcjonalnie połączonej z jednym lub większą liczbą regionów regulatorowych lub sekwencji promotora/wzmacniacza, co pozwala na wyrażanie białka według wynalazku w odpowiedniej komórce gospodarza. Termin „funkcjonalnie połączona” oznacza związek, w którym

PL 206 097 B1 regiony regulatorowe i wyrażana sekwencja DNA są połączone i umieszczone tak, by umożliwić transkrypcję, a w przypadku białek i translację.

Regiony regulatorowe niezbędne do transkrypcji będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA mogą być dostarczone przez wektor według wynalazku. W zgodnym układzie gospodarz-konstrukt komórkowe czynniki transkrypcyjne takie, jak polimeraza RNA, zwiążą się z regionami regulatorowymi wektora powodując transkrypcję będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA w organizmie gospodarza. Dokładna natura regionów regulatorowych wymaganych dla ekspresji genu może być różna w różnych komórkach gospodarza. Ogólnie, wymagany jest promotor zdolny do wiązania polimerazy RNA i kierowania transkrypcją połączonej funkcjonalnie sekwencji DNA. Takie regiony regulatorowe mogą zawierać te sekwencje niekodujące końca 5', które związane są z inicjacją transkrypcji i translacji takie, jak element TATA, sekwencja czapeczkowania, sekwencja CAAT i tym podobne, regionr niekodujący po stronie 3' sekwencji kodującej może zawierać sekwencje regulatorowe terminacji transkrypcji takie, jak terminatory i miejsca poliadenylacji.

Do wyrażania będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA można zastosować zarówno regiony regulatorowe konstytutywne, jak i indukowalne. Zastosowanie promotorów indukowalnych może być korzystne gdy warunki optymalnego wzrostu komórek gospodarza i warunki dla wysokiego poziomu ekspresji będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA są różne. Przykłady przydatnych regionów regulatorowych dostarczono poniżej.

W celu połączenia sekwencji DNA o funkcjach regulatorowych, takich jak promotory z bę d ą cą przedmiotem zainteresowania sekwencją DNA lub wstawienia będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA do miejsca klonowania w wektorze, można zligować z końcami cDNA linkery lub adaptory dostarczające odpowiednich zgodnych miejsc restrykcyjnych przy zastosowaniu dobrze znanych w technice sposobów [Wu i wsp., Methods in Enzymol 152 (1987) 343349]. Po cię ciu enzymami restrykcyjnymi może nastąpić modyfikacja w celu stworzenia tępych końców przez obcięcie lub wypełnienie końców jednoniciowych przed ligacją. Alternatywnie, żądane miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny może być wprowadzone do fragmentu DNA przez amplifikację DNA przy zastosowaniu PCR ze starterami zawierającymi żądane miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny.

Wektor obejmujący będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z regionem regulatorowym (sekwencje wzmacniacza/promotora) można bezpośrednio wprowadzić do odpowiednich komórek gospodarza dla wyrażenia będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA bez dalszego klonowania.

Dla wyrażania będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA w komórkach gospodarza - ssaka, można zastosować różne regiony regulatorowe, przykładowo, wczesny i późny promotor SV40, wczesny natychmiastowy promotor wirusa cytomegalii (CMV), oraz promotor długich końcowych powtórzeń wirusa mięsaka Rousa (RSV-LTR). Do indukowalnych promotorów, które mogą być użyteczne w komórkach ssaków należą, między innymi, związany z genem metalotioneiny II, wrażliwe na glukokortykoid długie końcowe powtórzenia mysiego wirusa nowotworu sutka (MTV-LTR), genu β-interferonu oraz genu hsp70 [Williams i wsp., Cancer Res. 49 (1989) 2735-42; Taylor i wsp., Mol. Cell Biol., 10 (1990) 165-75]. Korzystne może być wykorzystanie promotorów szoku cieplnego lub promotorów stresu dla kierowania ekspresją będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA w zrekombinowanych komórkach gospodarza.

Dodatkowo, wektor ekspresyjny może zawierać dający się selekcjonować lub wyszukiwać gen markerowy dla wstępnej izolacji, identyfikacji lub śledzenia komórek gospodarza, które zawierają wektor. Dla komórek ssaków można użyć szeregu systemów selekcji, w tym, między innymi, genów kinazy tymidynowej wirusa opryszczki zwykłej [Wigler i wsp., Cell 11 (1977) 223], fosforybozylotransferazy hipoksantynowoguaninowej [Szybalski i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962) 2026], i fosforybozylotransferazy adeninowej [Lowy i wsp., Cell 22 (1980) 817] w komórkach odpowiednio tk^-, hgprt^- lub aprt^-. Jako podstawa selekcji może też być wykorzystana oporność na antymetabolit dla reduktazy dihydrofolanu (dhfr), nadającej oporność na metotreksat [Wigler i wsp., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 3567; O'Hare i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 1527]; gpt, nadającego oporność na kwas mykofenolowy [Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 2072]; fosfotransferazy neomycynowej, nadającej oporność na aminoglikozyd G-418 [Colberre-Garapin i wsp., J. Mol. Biol. 150 (1981) 1]; i fosfotransferazy higromycynowej, nadającej oporność na higromycynę [Santerre i wsp., 1984, Gene 30 (1984) 147]. Inne markery selekcyjne takie, jak, między innymi, histydynol i Zeocin® także mogą być wykorzystane.

PL 206 097 B1

SYSTEMY EKSPRESJI I KOMÓRKI GOSPODARZA

Do zastosowania ze sposobami według wynalazku komórka gospodarza i/lub organizm gospodarza korzystnie nie wyraża białka E1 wirusa brodawczaka bydła. Ponadto, korzystnie wektor według wynalazku nie koduje białka E1 wirusa brodawczaka bydła.

Do korzystnych ssaczych komórek gospodarza należą, między innymi, pochodzące od ludzi, małp i gryzoni (patrz, przykładowo, Kriegler M. w ”Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual”, New York, Freeman & Co. 1990), takie, jak małpie komórki stransformowane SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ludzka zarodkowa linia komórek nerki (293, 293-EBNA, lub komórki 293 subklonowane dla wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham i wsp., J. Gen. Virol., 36 (1977) 59; komórki nerki noworodka chomika (BHK, ATCC CCL 10); komórki jajnika chomika-DHFR [CHO, Urlaub i Chasin. Proc. Natl. Acad. Sci. 77 (1980) 4216]; komórki Sertolego myszy [Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251]; fibroblasty mysie (NIH-3T3), komórki nerki małpy (CVI ATCC CCL 70); komórki nerki koczkodana zielonosiwego (VERO-76, ATCC CRL-1587); komórki ludzkiego raka szyjki macicy (HELA, ATCC CCL2); komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludzkie komórki płuca (W138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065); i mysie komórki raka sutka (MMT 060562, ATCC CCL51).

Wektory według wynalazku mogą być syntetyzowane i składane ze znanych sekwencji DNA przy użyciu dobrze znanych w technice metod. Regiony regulatorowe i elementy wzmacniaczy mogą pochodzić z różnych źródeł, zarówno naturalnych, jak i syntetycznych. Niektóre spośród komórek gospodarza można uzyskać w handlu.

Wektory według wynalazku zawierające będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA mogą być wprowadzane do komórek gospodarza za pomocą szeregu różnych metod znanych w technice, w tym, ale nie wyłącznie, dla komórek prokariotycznych, za pomocą transformacji bakterii (Hanahan, 1985, w: DNA Cloning, A Practical Approach, 1: 109-136), a dla komórek eukariotycznych, transfekcji za pośrednictwem fosforanu wapnia [Wigler i wsp., Cell 11 (1977) 223-232], transfekcji za pośrednictwem liposomów [Schaefer-Ridder i wsp., Science 215 (1982) 166168], elektroporacji [Wolff i wsp., Proc Natl Acad Sci 84 (1987) 3344], i mikroinjekcji [Cappechi, Cell 22 (1980) 479-4889].

W konkretnych wykonaniach linie komórkowe wyrażające sekwencję DNA według wynalazku mogą być skonstruowane przy zastosowaniu wektora zawierającego marker selekcyjny. Przykładowo, nie wyczerpując możliwości, po wprowadzeniu wektora zmodyfikowane komórki mogą być pozostawione przez 1-2 dni we wzbogaconym podłożu, a następnie przeniesione na podłoże selekcyjne. Marker selekcyjny w wektorze nadaje oporność na selekcję i optymalnie pozwala na wzrost w hodowli jedynie komórkom zawierającym wektor z markerem selekcyjny.

STRATEGIE SZCZEPIONEK

W niektórych wykonaniach wektor wedł ug wynalazku obejmują cy kasetę ekspresyjną bę d ą cej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA jest podawany pacjentowi w celu zaindukowania odpowiedzi odpornościowej. Konkretnie, będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA koduje białko (przykładowo, peptyd lub polipeptyd), które po wyrażeniu indukuje swoistą odpowiedź odpornościową. Przykłady takich białek omówiono w części powyżej.

Dla dostarczenia wektora według wynalazku do zastosowania jako szczepionki można wybrać sposób spośród znanych w technice i/lub opisanych w części poniżej.

STRATEGIE TERAPII GENOWEJ

W niektórych wykonaniach wektor wedł ug wynalazku obejmuj ą cy kasetę ekspresyjną obejmują cą będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA jest podawany w celu leczenia lub zapobiegania różnym chorobom. Będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA może kodować białko i/lub aktywną biologicznie cząsteczkę RNA. Określenie „terapia genowa” odnosi się do terapii prowadzonej przez podawanie pacjentowi podlegającej ekspresji lub ekspresjonowalnej sekwencji DNA. W wykonaniu tego wynalazku sekwencje DNA wytwarzają kodowane przez nie biał ka lub czą steczki RNA, które wywierają działanie lecznicze.

Dowolny z dostępnych w technice sposobów terapii genowej może być stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Przykładowe sposoby opisano poniżej.

Ogólny przegląd sposobów terapii genowej opisano w Goldspiel i wsp., Clinical Pharmacy 12 (1993) 488-505; Wu i Wu, Biotherapy 3 (1991) 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993) 573-596; Mulligan, Science 260 (1993) 926-932; Morgan i Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993) 191-217; May, TIBTECH 1, I (5) (1993) 155-215. Sposoby powszechnie znane w dziedzinie

PL 206 097 B1 technologii rekombinacji DNA, które mogą tu być zastosowane, są opisane w Ausubel i wsp. (red.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); i Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

Następujące zwierzęce regiony regulatorowe wykazujące specyficzność tkankową, które stosowano w zwierzętach transgenicznych mogą być wykorzystane do ekspresji będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji DNA w konkretnym typie tkanki: region kontrolny genu elastazy I, który jest aktywny w komórkach groniastych trzustki [Swift i wsp., Cell 38 (1984) 639-646; Ornitz i wsp., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 (1986) 399-409; MacDonald, Hepatology 7 (1987) 425-515]; region kontrolny genu insuliny, który jest aktywny w komórkach beta trzustki [Hanahan, Nature 315 (1985) 115-122], region kontrolny genu immunoglobuliny, który jest aktywny w komórkach limfoidalnych [Grosschedl i wsp., Cell 38 (1984) 647-658; Adames i wsp., Nature 318 (1985) 533-538; Alexander i wsp., Mol. Cell. Biol. 7 (1987) 1436-1444], obszar kontrolny mysiego wirusa raka sutka, który jest aktywny w komórkach jąder, sutka, limfoidalnych i tucznych[Leder i wsp., Cell 45 (1986) 485-495], region kontrolny genu albuminy, który jest aktywny w wątrobie [Pinkert i wsp., Genes and Devel. 1 (1987) 268-276], region kontrolny genu alfa-fetoproteiny, który jest aktywny w wątrobie [Krumlauf i wsp., Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 1639-1648; Hammer i wsp., Science 235 (1987) 53-58; region kontrolny genu alfa 1-antytrypsyny, który jest aktywny w wątrobie [Kelsey i wsp., Genes and Devel. 1 (1987) 161-171], regionar kontrolny genu beta-globiny, który jest aktywny w komórkach szpikowych [Mogram i wsp., Nature 315 (1985) 338-340; Kollias i wsp., Cell 46 (1986) 89-94]; region kontrolny genu biał ka zasadowego mieliny, który jest aktywny w oligodendrocytach w mózgu [Readhead i wsp., Cell 48 (1987) 703-712]; region kontrolny genu lekkiego łańcucha 2 miozyny, który jest aktywny w mięśniu szkieletowym [Sani, Nature 314 (1985) 283-286], region kontrolny genu hormonu uwalniającego gonadotropinę, który jest aktywny w podwzgórzu [Mason i wsp., Science 234 (1986) 1372-1378].

Sposoby dostarczania dla strategii terapii genowej są dobrze znane w technice i/lub opisane w części poniż ej.

INHIBITORY ANTYSENSOWNE I RYBOZYMY

W niektórych wykonaniach wektor wedł ug wynalazku zawiera bę d ą c ą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA kodującą cząsteczkę antysensownego RNA lub rybozymu. Sposoby wytwarzania i stosowania takich cząsteczek są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.

Cząsteczki RNA antysensownego działają bezpośrednio, blokując translację mRNA przez hybrydyzację z docelowym mRNA i zapobieganie translacji białka. Strategie antysensowne obejmują projektowanie oligonukleotydów, które są komplementarne do docelowego mRNA. Oligonukleotydy antysensowne będą wiązać się do komplementarnego mRNA genu docelowego i zapobiegać translacji. Pełna komplementarność, mimo że jest korzystna, nie jest wymagana.

Sekwencja „komplementarna” do części RNA, w użytym tu znaczeniu, oznacza sekwencję wykazującą wystarczającą komplementarność by móc hybrydyzować przynajmniej z nie będącą poli-A częścią RNA tworząc stabilny dupleks; w przypadku dwuniciowych antysensownych kwasów nukleinowych można w ten sposób zbadać pojedynczą nić dupleksu DNA lub oznaczyć tworzenie układów trójniciowych. Zdolność hybrydyzacji zależeć będzie zarówno od stopnia komplementarności, jak i od długości antysensownego kwasu nukleinowego. Ogólnie, im dłuższa jest cząsteczka hybrydyzującego kwasu nukleinowego, tym więcej może zawierać niedopasowanych zasad z cząsteczką RNA wciąż tworząc stabilny dupleks (lub, w niektórych przypadkach strukturę trójniciową). Specjalista w dziedzinie oceni dopuszczalny stopień niedopasowania przy zastosowaniu standardowych procedur wyznaczania temperatury topnienia hybrydyzującego kompleksu.

Antysensowne kwasy nukleinowe powinny mieć długość co najmniej sześciu nukleotydów, a korzystnie są oligonukleotydami o długości od 6 do około 50 nukleotydów. W konkretnych aspektach oligonukleotyd ma długość co najmniej 10 nukleotydów, co najmniej 17 nukleotydów, co najmniej 25 nukleotydów lub co najmniej 50 nukleotydów. W innych wykonaniach wynalazku antysensowne kwasy nukleinowe mają długość co najmniej 100, co najmniej 250, co najmniej 500 i co najmniej 1000 nukleotydów.

Niezależnie do wyboru sekwencji docelowej, korzystne jest najpierw przeprowadzenie badań in vitro dla wyznaczenia zdolności oligonukleotydu antysensownego do hamowania ekspresji genu. Korzystnym jest, by badania te wykorzystywały kontrole rozróżniające między hamowaniem genu przez antysens a niespecyficznymi efektami biologicznymi oligonukleotydów. Korzystnym jest także by badania te porównywały poziomy docelowego RNA lub białka z poziomem wewnętrznej kontroli RNA lub białka. Dodatkowo przewiduje się, że wyniki uzyskane z zastosowaniem antysensownej sekwencji

PL 206 097 B1

DNA porównywane są z wynikami uzyskanymi z zastosowaniem kontrolnej sekwencji DNA. Korzystne jest, by kontrolna sekwencja DNA była mniej więcej tej samej długości co badany oligonukleotyd, i by sekwencja DNA oligonukleotydu różniła się od sekwencji antysensownej nie bardziej, niż jest to konieczne dla zapobiegania specyficznej hybrydyzacji z sekwencją docelową.

Podczas gdy można stosować antysensowne sekwencje DNA komplementarne do regionu kodującego genu docelowego, najkorzystniejsze są sekwencje komplementarne do transkrybowanego regionu nie podlegającego translacji.

Dla ekspresji biologicznie aktywnego RNA, np. RNA antysensownego z wektora według wynalazku, sekwencja DNA kodująca biologicznie aktywną cząsteczkę RNA jest funkcjonalnie połączona z silnym promotorem pol III lub pol II. Zastosowanie takiego konstruktu do transfekcji komórek docelowych u pacjenta spowoduje transkrypcję odpowiednich ilości jednoniciowych RNA, które utworzą komplementarne pary zasad z endogennymi transkryptami genu docelowego i tym samym zapobiegną translacji mRNA genu docelowego. Przykładowo, wektor może być wprowadzony, np. tak, że jest pobierany przez komórkę i kieruje transkrypcją antysensownego RNA. Takie wektory mogą być skonstruowane przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA in vitro standardowych w tej dziedzinie. Ekspresja sekwencji kodującej antysensowny RNA może odbywać się z dowolnego znanego w technice promotora, który działa w ssaczych, korzystnie ludzkich, komórkach. Promotory takie mogą być indukowalne lub konstytutywne. Do promotorów takich należą, między innymi: region wczesnego promotora SV40 [Bernoist i Chambon, Nature 290 (1981) 304-310], promotor zawarty w 3' długim końcowym powtórzeniu wirusa mięsaka Rousa [Yamamoto, i wsp, Cell 22 (1980) 787-797], promotor kinazy tymidynowej opryszczki [Wagner, i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (1981) 1441-1445], sekwencja regulatorowa genu metalotioneiny [Brinster, i wsp., 1982, Nature 296 (1982) 39-42], itp.

W niektórych wykonaniach wynalazku wektor wedł ug wynalazku zawiera sekwencję DNA kodującą rybozym. Cząsteczki rybozymów zaprojektowane do katalitycznego cięcia docelowych transkryptów mRNA mogą także być wykorzystane do zapobiegania translacji mRNA genu docelowego i tym samym zapobiegania ekspresji produktu genu docelowego [patrz, np., Publikacja Międzynarodowa PCT W090/11364, opublikowana 4 października, 1990; Sarver, i wsp., Science 247 (1990) 1222 -1225].

Rybozymy są enzymatycznymi cząsteczkami RNA zdolnymi do katalizowania specyficznego cięcia RNA. [omówienie przeglądowe, patrz Rossi, Current Biology 4 (1994) 469471]. Mechanizm działania rybozymu obejmuje specyficzną wobec sekwencji hybrydyzację cząsteczki rybozymu z komplementarnym docelowym mRNA, po której następuje cięcie endonukleolityczne. W skład cząsteczek rybozymu musi wchodzić jedna lub więcej sekwencji komplementarnych do mRNA genu docelowego oraz dobrze znana katalityczna sekwencja odpowiadająca za cięcie mRNA. Sekwencja ta, patrz np. Patent USA nr 5,093,246, który niniejszym jest włączony tu w całości przez odniesienie.

Podczas gdy do niszczenia mRNA docelowego genu można wykorzystać rybozymy przecinające mRNA w specyficznych wobec sekwencji miejscach rozpoznawania, korzystniejsze jest wykorzystanie rybozymów o strukturze głowy młotka (ang. hammerhead). Rybozymy o strukturze głowy młotka przecinają mRNA w miejscach wyznaczonych przez otaczające regiony tworzące komplementarne pary zasad z docelowym mRNA. Jedynym wymaganiem jest, by w docelowym mRNA znajdowała się następująca sekwencja dwóch zasad: 5'-UG-3'. Konstrukcja i wytwarzanie rybozymów o strukturze głowy młotka są dobrze znane w technice i opisane pełniej w Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, (patrz zwłaszcza Rysunek 4, strona 833) i w Haseloff & Gerlach, Nature, 334 (1988) 585-591, która niniejszym jest tu włączona w całości przez odniesienie.

Korzystnie rybozym jest skonstruowany tak, by miejsce rozpoznawania cięcia znajdowało się w pobliż u 5' końca mRNA genu docelowego, tzn. by zwiększyć wydajność i zminimalizować wewnątrzkomórkowe nagromadzanie się niefunkcjonalnych transkryptów mRNA.

Do rybozymów według niniejszego wynalazku należą także RNA endorybonukleazy (odtąd zwane „rybozymami typu Cecha”) takie, jak występująca naturalnie w Tetrahymena thermophila (znana jako IVS, lub RNA L-19 IVS) i opisana przez Thomasa Cecha i współpracowników [Zaug, i wsp., Science, 224 (1984) 574-578; Zaug i Cech, Science, 231 (1986) 470-475; Zaug, i wsp., Nature, 324 (1986) 429-433; opublikowane Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe nr WO 88/04300 przez University Patents Inc.; Been & Cech, Cell, 47 (1986) 207-216]. Rybozymy typu Cecha posiadają miejsce aktywne długości ośmiu par zasad, które hybrydyzuje z docelową sekwencją RNA, po czym

PL 206 097 B1 następuje cięcie docelowego RNA. Wynalazek obejmuje te rybozymy typu Cecha, których sekwencje docelowe o długości ośmiu par zasad są obecne w genie docelowym.

Ekspresja rybozymu może zachodzić pod kontrolą silnego konstytutywnego promotora pol III lub pol II tak, że stransfekowane komórki będą wytwarzać dostateczną ilość rybozymu by zniszczyć mRNA endogennego genu docelowego i zahamować translację. Ponieważ rybozymy, w przeciwieństwie do cząsteczek antysensownych, mają własności katalityczne, dla skutecznego działania wymagane jest mniejsze stężenie wewnątrzkomórkowe.

W przypadkach, gdy cząsteczki antysensowne i/lub rybozymu opisane tutaj są wykorzystywane do zahamowania ekspresji zmutowanego genu, możliwe jest, że technika ta może tak skutecznie zmniejszyć lub zahamować translację mRNA wytwarzanego przez prawidłowe allele genu docelowego, że może dojść do sytuacji, gdzie stężenie prawidłowego produktu genu docelowego będzie niższe, niż jest to wymagane dla prawidłowego fenotypu. W takich przypadkach, dla zapewnienia utrzymania zasadniczo normalnych poziomów aktywności genu docelowego, mogą zatem być wprowadzone do komórek sposobami terapii genowej takimi, jak opisane poniżej w części 5.4.4 cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące i wyrażające polipeptydy genu docelowego wykazujące normalną aktywność genu docelowego i nie zawierające sekwencji podatnych na działanie jakiegokolwiek antysensu, rybozymu lub układu trójniciowego stosowanego w leczeniu. Alternatywnie, w przypadkach, gdy gen docelowy koduje białko zewnątrzkomórkowe może być korzystne ko-podawanie prawidłowego białka genu docelowego w celu utrzymania wymaganego poziomu aktywności genu docelowego.

Sposoby podawania cząsteczek rybozymów i antysensownych RNA są dobrze znane w technice i /lub opisane w części poniżej.

FORMULACJE FARMACEUTYCZNE I DROGI PODAWANIA

W korzystnym aspekcie kompozycja farmaceutyczna wedł ug wynalazku obejmuje znacznie oczyszczony wektor według wynalazku (np. zasadniczo wolny od substancji ograniczających jego skuteczność lub wytwarzających niepożądane skutki uboczne). Pacjent, któremu podaje się kompozycję farmaceutyczną w sposobach według wynalazku jest korzystnie zwierzęciem, w tym, między innymi, należy do zwierząt, takich jak krowy, świnie, konie, kury, koty, psy itp., i jest korzystnie ssakiem, a najkorzystniej człowiekiem.

W niektórych wykonaniach wektor wedł ug wynalazku jest bezpoś rednio podawany in vivo, gdzie będąca przedmiotem zainteresowania sekwencja DNA ulega ekspresji wytwarzając kodowany produkt. Można to osiągnąć za pomocą dowolnego z licznych znanych w tej dziedzinie sposobów. Wektory według wynalazku mogą być podawane przez bezpośrednie wstrzyknięcie nagiego DNA; wykorzystanie bombardowania mikrocząstkami (np. urządzeniem „strzelba genowa”; Biolistic, Dupont); opłaszczanie lipidami lub receptorami powierzchni komórki lub czynnikami transfekcyjnymi; otaczanie w mikroczą stkach lub mikrokapsuł kach; podawanie w połączeniu z peptydem, o którym wiadomo, ż e wnika do jądra; podawanie w połączeniu z ligandem poddawanym endocytozie zależnej od receptora [patrz, np. Wu i Wu, J. Biol. Chem. 262 (1987) 4429-4432] (co może być wykorzystane do kierowania do komórek specyficznie wyrażających te receptory); itp. W konkretnym wykonaniu związek lub kompozycja mogą być podane w pęcherzyku, zwłaszcza w liposomie [patrz Langer, Science 249 (1990) 1527-1533; Treat i wsp., 1989, w: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, LopezBerestein i Fidler (red.), Liss, New York, ss. 353-365; Lopez-Berestein, tamże, ss. 317-327].

W niektórych wykonaniach wektor jest opłaszczony lipidami lub receptorami powierzchni komórki lub czynnikami transfekcyjnymi, lub połączony z peptydem podobnym do domeny homeobox, o którym wiadomo, ż e wnika do jądra [patrz np., Joliot i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 1864-1868], itp.

W niektórych innych wykonaniach, mog ą być tworzone kompleksy kwasu nukleinowego z ligandem, w których ligand obejmuje fuzjogenny peptyd wirusowy rozbijający endosomy, co pozwala na uniknięcie przez kwas nukleinowy degradacji w lizosomach.

W jeszcze innych wykonaniach kompleksy kwasu nukleinowego z ligandem mogą być kierowane in vivo do specyficznego pobierania przez komórki i ekspresji przez łączenie się ze specyficznym receptorem (patrz np., Publikacje PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188, i WO 93/20221).

Drogi podawania produktów według wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, drogę śródskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną, podskórną, donosową, nadtwardówkową i doustną. Drogi podawania obejmują ponadto podanie dowolną dogodną drogą, np przez wlew lub wstrzyknięcie dawki, przez wchłanianie poprzez wyściółki nabłonkowe lub śluzówkowo-skórne (np. śluzówkę jamy ustnej,

PL 206 097 B1 śluzówkę odbytu i jelit itp.). W konkretnym wykonaniu korzystne może być podawanie wektora według wynalazku przez wstrzyknięcie, za pomocą cewnika, za pomocą czopka lub za pomocą implantu, który to implant wykonany jest z materiału porowatego, nieporowatego lub żelatynowego, w tym błony takiej, jak błona typu sialastic lub włókna. Należy zwrócić uwagę na to, by nie użyć materiałów, do których wektor mógłby się absorbować. Podawanie może być ogólnoustrojowe lub miejscowe.

W niektórych wykonaniach wektor wedł ug wynalazku jest podawany razem z innymi biologicznie aktywnymi czynnikami takimi, jak czynniki chemioterapeutyczne lub czynniki wzmacniające układ odpornościowy.

W jeszcze innym wykonaniu drogi podawania obejmują dostarczanie przez ukł ad kontrolowanego uwalniania. W jednym z wykonań można zastosować pompę [patrz Langer, powyżej; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 (1989) 201; Buchwald i wsp., Surgery 88 (1980) 507; Saudek i wsp., N. Engl. J. Med. 321 (1989) 574]. W innym wykonaniu wykorzystane mogą być materiały polimeryczne [patrz Medical Applications of Controlled Release, 1974, Langer i Wise (red.), CRC Pres., Boca Raton, Florida; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984, Smoleń i Ball (red.), Wiley, New York; Ranger i Peppas, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 (1983) 61; patrz też Levy i wsp., Science 228 (1985) 190; During i wsp., Ann. Neurol. 25 (1989) 351; Howard i wsp., J. Neurosurg. 71 (1989) 105].

Inne układy kontrolowanego uwalniania omówione są w pracy przeglądowej Langera, Science 249 (1990)1527-1533.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku obejmują skuteczną terapeutycznie ilość wektora według wynalazku oraz odpowiedni nośnik farmaceutyczny. W konkretnym wykonaniu termin „odpowiedni nośnik farmaceutyczny” oznacza dopuszczony przez urząd regulujący rządu federalnego lub stanowego, wymieniony w Farmakopei USA lub innej powszechnie uznawanej farmakopei do stosowania u zwierząt, a konkretniej u ludzi. Termin „podłoże” oznacza rozcieńczalnik, adiuwant zaróbkę lub podłoże, z którym podawany jest środek terapeutyczny. Takimi odpowiednimi nośnikami farmaceutycznymi mogą być jałowe ciecze takie, jak woda i oleje, w tym oleje pochodzenia kopalnego, zwierzęcego, roślinnego lub syntetycznego, takie jak olej z orzeszków ziemnych, olej sojowy, olej mineralny, olej sezamowy i im podobne. Woda jest korzystnym nośnikiem gdy kompozycja farmaceutyczna jest podawana dożylnie. Roztwory soli i wodne roztwory glukozy i glicerolu mogą również być zastosowane jako ciekłe nośniki, zwłaszcza dla roztworów do iniekcji. Do odpowiednich zarobek farmaceutycznych należą skrobia, glukoza, laktoza, sacharoza, żelatyna, słód, ryż, mąka, kreda, żel krzemionkowy, stearynian sodowy, monostearynian glicerolu, talk, chlorek sodu, odtłuszczone mleko w proszku, glicerol, propylen, glikol, woda, etanol i tym podobne. Kompozycja, gdy jest to konieczne, może także zawierać niewielkie ilości czynników zwilżających lub emulgujących, lub czynników buforujących pH. Kompozycje te mogą przybrać postać roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, preparatów o przedłużonym czasie uwalniania i tym podobnych. Kompozycja może być formułowana w postaci czopka z tradycyjnymi czynnikami wiążącymi i nośnikami, takimi, jak trój glicerydy. Preparaty doustne mogą obejmować standardowe nośniki, takie jak farmaceutycznej jakości mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza, węglan magnezu itp. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych są opisane w ”Remington's Pharmaceutical Sciences” E. W. Martina. Kompozycje takie będą zawierać skuteczną terapeutycznie ilość kwasu nukleinowego lub białka, korzystnie w postaci oczyszczonej, wraz z odpowiednią ilością nośnika tak, by dostarczyć preparat w postaci odpowiedniej do podania pacjentowi. Formulacja powinna odpowiadać drodze podawania.

W konkretnym wykonaniu środek farmaceutyczny jest wytworzany zgodnie z rutynowymi procedurami jako kompozycja farmaceutyczna przystosowana do podawania drogą dożylną ludziom. Typowo, kompozycje do podawania dożylnego są roztworami w jałowym izotonicznym buforze wodnym. Gdy jest to konieczne, środek farmaceutyczny może także obejmować czynnik ułatwiający rozpuszczanie i miejscowy środek znieczulający taki, jak lignokaina dla zmniejszenia bólu w miejscu wstrzyknięcia. Ogólnie, składniki są dostarczane osobno albo zmieszane razem w postaci jednostkowej dawki, przykładowo jako suchy liofilizowany proszek lub odwodniony koncentrat w hermetycznie zamkniętym pojemniku takim, jak ampułka lub torebka wskazującym ilość aktywnego czynnika. Gdy środek farmaceutyczny ma być podawany przez wlew, może być wydawany razem z butelką do kroplówki zawierającą jałową wodę lub roztwór soli o jakości farmaceutycznej. Gdy środek farmaceutyczny podawany jest w zastrzykach, możne być z nim dostarczona ampułka jałowej wody lub roztworu soli tak, by składniki można było zmieszać przed podaniem.

PL 206 097 B1

Do podawania dopoliczkowego kompozycje mogą przyjmować postać tabletek lub pastylek do ssania formułowanych w konwencjonalny sposób.

Do podawania przez inhalację składniki do zastosowania według niniejszego wynalazku są dogodnie dostarczane w postaci rozpylonego aerozolu podawanego ze zbiorników pod ciśnieniem albo nebulizerów, z zastosowaniem odpowiedniego gazu pędnego, np. dichlorodifluorometanu, trichorofluorometanu, dichlorotetrafluoroetanu, dwutlenku węgla lub innego odpowiedniego gazu. W przypadku aerozolu pod ciśnieniem dawka może być wyznaczona przez dostarczenie zaworu odmierzającego ilość. Kapsułki i wkłady np. żelatyny do zastosowania w inhalatorze lub insuflatorze mogą być formułowane z zawartością sproszkowanej mieszanki związku i odpowiedniej podstawy takiej, jak laktoza lub skrobia.

Ilość wektora według wynalazku, która będzie skuteczna w leczeniu lub zapobieganiu wskazanej chorobie może być wyznaczona standardowymi technikami klinicznymi. Dodatkowo, oznaczenia in vitro mogą być ewentualnie wykorzystane do wspomożenia wyznaczenia optymalnego zakresu dawki. Konkretna dawka do zastosowania w preparacie będzie także zależeć od drogi podawania i stadium wskazanej choroby i powinna być wyznaczana zgodnie z oceną lekarza i okolicznoś ciami każdego pacjenta. Skuteczne dawki można ekstrapolować z krzywych odpowiedzi na dawkę uzyskanych w badawczych układach modelowych in vitro lub zwierzęcych.

Niniejszy wynalazek może być lepiej zrozumiany poprzez odwołanie do następujących niewyczerpujących przykładów, które dostarczono jako obrazujące wynalazek. Następujące przykłady przedstawiono w celu pełniejszego zilustrowania korzystnych wykonań wynalazku. Nie powinny jednak w żaden sposób być pojmowane jako ograniczające szeroki zakres wynalazku.

PRZYKŁADY

P r z y k ł a d 1

Klonowanie i analiza właściwości ekspresja wektorów super6 i super6wt

Plazmidy wektorowe super6 (Figura 1) oraz super6wt uzyskano z wektorów szczepionek genowych, opartych na poprzedniej generacji, odpowiednio VI oraz VIwt (Figura 2). Wektory VI oraz VIwt są głównie syntetycznymi plazmidami bakteryjnymi zawierającymi gen markerowy oporności na kanamycynę pochodzący z transpozonu Tn903 [Oka, A., i wsp., J Mol Biol 147 (1981) 217-226] oraz zmodyfikowaną formę replikonu pMB1 [Yanisch-Perron, C, i wsp., Gene 33 (1985) 103-119] niezbędnego do powielania się w komórkach Escherichia coli. Wektory VI oraz VIwt zawierają także wczesny natychmiastowy promotor wirusa cytomegalii połączony z sekwencją liderową HSV1 TK i sekwencjami genu króliczej β-globiny, pochodzącymi z plazmidu pCG [Tanaka, M., i wsp., 60 (1990) Cell 375-386]. Ostatnie elementy wymagane są do ekspresji z sekwencji kodującej nef pochodzącej z izolatu HAN2 ze szczepu HIV-1 [Sauermann, U., i wsp., AIDS Research. Hum. Retrov. 6 (1990) 813-823]. Wektory ekspresyjne dla Nef zawierają dziesięć zgrupowanych miejsc wiązania E2 o wysokim powinowactwie (pochodzących z plazmidu pUC1910BS, niepublikowane) tuż powyżej promotora CMV.

Wektor rodzicielski VI zawiera zmodyfikowaną sekwencję kodującą E2: region zawiasowy E2 (aminokwasy 192-311) zastąpiony jest czterema powtórzeniami glicyna-alanina z białka EBNA1 wirusa Epsteina-Barra [Baer, R.J., i wsp., Nature 310 (1984) 207-211]. Białko kodowane przez tę sekwencję nazwano E2d192-311+4G. Wektor rodzicielski VIwt zawiera kasetę ekspresyjną dla dzikiego typu białka E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1 z mutacjami punktowymi wprowadzonymi w celu usunięcia zdolności kodowania otwartej ramki odczytu (ORF) E3 i E4 przez dwa kodony stop w obu tych ORFach. W tych wektorach sekwencje kodujące E2 wklonowane są pomiędzy prowirusowy 5'LTR wirusa mięsaka Rousa [Long, E.O., i wsp., Hum. Immunol. 31 (1991) 229-235] oraz region poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu [Chesnut, J.D. i wsp., J Immunol Methods 193 (1996) 17-27].

Plazmidy wektorowe super6 i super6wt skonstruowano przez delecję z odpowiednich wektorów rodzicielskich VI i VIwt wszystkich sekwencji beta-globinowych poniżej genu nef z wyjątkiem drugiego intronu króliczego genu beta-globiny. Sekwencje beta-globinowe (zwłaszcza fragment egzonu) wykazują pewną homologię do sekwencji obecnych w ludzkim genie beta-globiny, podczas gdy intron nie wykazuje żadnej istotnej homologii do ludzkich sekwencji genomowych. Intron został zamplifikowany za pomocą PCR z plazmidu pCG [Tanaka, M. i wsp., Cell 60 (1990) 375-386] przy zastosowaniu oligonukleotydów zawierających pewne niezgodności w celu modyfikacji sekwencji donorowych i akceptorowych miejsc składania intronu dla pełnego dopasowania do motywów zgodności. Następnie region poliadenylacji genu kinazy tymidynowej typu 1 wirusa opryszczki zwykłej z pHook [Chesnut, J.D., i wsp., J Immunol Methods 193 (1996) 17-27] wklonowano tuż przy 3'-końcu intronu, ponieważ w plazmidach rodzicielskich zastosowano sygnał poliadenylacji króliczej B-globiny.

PL 206 097 B1

Właściwości ekspresji białek Nef i E2 wyrażonych przez plazmidy wektorowe super6 oraz super6wt analizowano i porównywano z właściwościami ekspresji białek Nef i E2 wyrażonych przez VI i VIwt za pomocą techniki Western [Towbin i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 76 (1979) 4350-4354] z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko Nef oraz E2. Najpierw, komórki Jurkat (linia ludzkich limfoblastów limfocytów T) transfekowano za pomocą elektroporacji [Ustav i wsp. EMBO J2 (1991) 449457] 1 μg super6, super6wt lub równomolarnymi ilościami plazmidów VI i VIwt. Jako kontrolę zastosowano równomolarną ilość wektora II (Figura 3) zawierającego identyczną kasetę Nef, lecz nie sekwencję kodującą E2. Jako kontrolę negatywną zastosowano nośnik DNA. W skrócie, plazmid oraz nośnik DNA mieszano z zawiesiną komórek w 0,4 cm kuwecie elektroporacyjnej (BioRad Laboratories, Hercules, USA), po czym stosowano impuls elektryczny (200 V; 1mF) przy zastosowaniu urządzenia Gene Pulser IITM z przystawką do zwiększania pojemności (BioRad Laboratories, Hercules, USA).

Po czterdziestu dziewięciu godzinach od transfekcji komórki poddawano lizie przez traktowanie buforem próbki zawierającego 50 mM Tris-HCl pH 6,8; 2% SDS, 0,1% błękit bromofenolu, 100 mM ditiotreitol oraz 10% (obj./obj.) glicerolu. Lizaty poddano rozdziałowi w 10% lub 12,5% żelu SDS poliakrylamidowym, a następnie przenoszono na 0,45 μm filtr nitrocelulozowy PVDF (Millipore). Filtr najpierw blokowano przez noc roztworem blokującym zawierającym 5% mleko w proszku (odtłuszczone), 0,1% Tween 20 w 50 mM Tris-HCl o pH 7,5; 150 mM NaCl po czym inkubowano przez 1 godzinę z rozcieńczoną surowicą odpornościową zawierającą monoklonalne anty-Nef (1:100) lub surowicą zawierającą anty-E2 (1:1000) w roztworze blokującym. Po każdym etapie inkubacji niezwiązane białka usuwano poprzez trzykrotne płukanie pasków w TBS - 0,1% Tween-20. Wiązanie pierwszorzędowych przeciwciał wykrywano przez inkubowanie pasków z peroksydazą chrzanową sprzężoną z antymysimi IgG (Labas, Estonia), po czym obrazowano przy zastosowaniu układu detekcji chemoluminescencyjnej (Amersham Pharmacia Biotech, United Kingdom).

Wyniki przedstawiono na Figurze 4. Wyrażenie białka Nef przedstawiono na panelu A, zaś wyrażenie białka E2 na panelu B. Strzałki wskazują prawidłowy rozmiar cząsteczkowy białek Nef i E2. Poziom wyrażenia E2d192-311+4GA jest bardzo niski i z tego powodu nie może być widoczny na transferze kapilarnym przedstawionym na Figurze 4.

Ilości Nef wyrażanego z plazmidów super6, super6wt, VI oraz VIwt (ścieżki 1-4 na Figurze 4A) są całkiem podobne (Figurze 4, panel A, ścieżka 1 do 4). Dużo mniej białka wytwarzanego jest z plazmidu II (ścieżka 5). Poziomy wyrażania białka Nef są wyższe z wektorów zawierających wtE2 (por. ścieżka 1 w porównaniu do ścieżki 2 oraz ścieżka 3 w porównaniu do ścieżki 4). Jest to zgodne z poziomami wyrażania białek E2 i E2d192-311+4GA z tych plazmidów (Figura 4, panel B).

P r z y k ł a d 2

Klonowanie i analiza właściwości ekspresyjnych plazmidów w serii product1 oraz NNV

W celu zwiększenia liczby kopii wektorów super6 i super6wt w Escherichia coli poczynione zostały dalsze modyfikacje w tych wektorach. Gen oporności na kanamycynę z Tn903, replikon pMB1 oraz miejsca wiązania E2 zostały usunięte za pomocą trawienia Hindlll/Nhel, a następnie zastąpione fragmentem Hindlll/Nhel z wektora retrowirusowego pBabe Neo [Morgenstern, J.P. i Land, H., Nucleic Acids Research 18 (1990) 3587-3596]. Fragment ten zawiera zmodyfikowany replikon pMB1 oraz gen oporności na kanamycynę z Tn5, umożliwiające zrelaksowaną wysoko kopijną replikację plazmidów w bakteriach. Nowe plazmidy nazwano odpowiednio jako productl (Figura 5) oraz product1wt. Nieudana próba powtórnego wstawienia dziesięciu miejsc wiązania E2 na tępy koniec Nhel powyżej promotora CMV product1 dała w rezultacie odpowiednio wektor New Vector NNV jedynie z dwoma miejscami wiązania wstawionymi do plazmidu.

Dodatkowych dziesięć miejsc wiązania E2 wstawiono z plazmidu pUC1910BS do New Vector zaraz poniżej kasety ekspresyjnej E2. Te nowe wektory nazwano NNV-1 i NNV-2 (Rysunek 6A). W celu zamiany E2d192-311+4GA na wtE2 (z wydeletowanym ORFem E3 i E4), fragment Bsp120I zawierający sekwencję kodującą E2d192-311+4GA został zastąpiony przez analogiczny fragment Bsp120I z super6wt zawierający wtE2. Otrzymane plazmidy nazwano odpowiednio NNV-1wt oraz NNV-2wt (Rysunek 6B). Numery 1 lub 2 w wektorach z serii NNV oznaczają orientację regionu 10 miejsc wiązania E2 w stosunku do kasety ekspresyjnej E2.

Właściwości ekspresyjne białka Nef z plazmidów NNV, tj. NNV-1, NNV-2, NNVwt oraz NNV-2wt, po transfekcji komórek Jurkat za pomocą elektroporacji w stężeniu 1 ig plazmidu analizowano i porównywano z właściwościami ekspresyjnych białek Nef z super6 i super6wt, za pomocą transferu typu Western zasadniczo w sposób opisany w Przykładzie 1. Ilości super6 i super6wt stosowane do transfekcji wynosiły odpowiednio 0,95 i 1 ig. Wyniki przedstawiono na Rysunku 7.

PL 206 097 B1

Wektory NNV-1 i NNV-2 posiadają potencjał ekspresyjny podobny do plazmidu super6 jak pokazało porównanie ścieżki 1 i 2 na rysunku 8 ze ścieżką 5. To samo dotyczy wektorów NNV-1wt, NNV-2wt i super6wt (porównanie ścieżek 3 i 4 ze ścieżką 6 na Figurze 7). Zgodnie z wcześniejszymi wynikami plazmidy wyrażające wtE2 wytwarzają więcej białka Nef niż wektory E2d192-311+4GA (porównanie ścieżki 1 ze ścieżką 3 i ścieżki 2 ze ścieżką 4 na rysunku 7). Zgodnie z tym oraz jako, że ekspresja Nef z NNV-2wt była nieco wyższa niż z NNV-1wt, do dalszych badań wybrano wektor NNV-2wt.

P r z y k ł a d 3

Analiza właściwości ekspresyjnych NNV-2wt

W celu analizy wł a ściwoś ci ekspresyjnych NNV-2wt, transfekowano za pomocą elektroporacji cztery różne linie komórkowe, tj. linie Jurkat (ludzkie limfoblasty limfocytów T), P815 (mysie nowotworowe komórki tuczne), CHO (komórki jajnika chomika chińskiego) oraz RD (ludzkie embrionalne komórki mięśniakomięsaka prążkowanego) i analizowano pod kątem wyrażania Nef i E2. W celu ujawnienia aktywacji transkrypcji i ustalenia właściwości, których pośredniczy białko E2 i zoligomeryzowane miejsca wiązania E2, jako kontrolę zastosowano product1wt, który nie posiada miejsc wiązania E2 (Rysunek 5). Dodatkowym plazmidem kontrolnym był plazmid NNV-2wtFS, który różni się od NNV-2wt tym, że posiada przesunięcie w ramce odczytu w sekwencji kodującej E2, a co za tym idzie nie wyraża funkcjonalnego białka E2.

Każdą linię komórkową transfekowano wektorowym DNA w różnej ilości za pomocą elektroporacji w sposób zasadniczo opisany w Przykładzie 1. Jako punkty czasowe obrano w przybliżeniu drugi i piąty dzień po transfekcji. Wyniki analiz przedstawione są na rysunkach 8 do 10.

Komórki Jurkat transfekowano 0,5 μg lub 2 μg NNV-2wt (ścieżki 1, 2, 8 i 9 na Figurze 8) oraz równorzędnymi ilościami plazmidów NNV-2wtFS (ścieżki 3, 4, 10 i 11 na Figurze 8) i product1wt (ścieżki 5, 6, 12 i 13 na Figurze 8) lub tylko nośnikiem (ścieżki 7 i 14 na Figurze 8). Jako punkty czasowe obrano 44 godzinę (ścieżki 1-7) oraz 114 godzinę (ścieżki 8-14) po transfekcji. Wyrażenie białek Nef E2 analizowano za pomocą transferu typu Western w sposób zasadniczo opisany w Przykładzie 1.

Komórki P815 transfekowano 0,5 μg lub 2 μg NNV-2wt (ścieżki 1,2, 8 i 9 na Rysunku 9) oraz równorzędną ilością plazmidów NNV-2wtFS (ścieżki 3, 4, 10 i 11 na Figurze 9) i product1wt (ścieżki 5, 6, 12 i 13 na Figurze 9) lub tylko nośnikiem (ścieżki 7 i 14 na Figurze 9). Jako punkty czasowe obrano 45 godzinę (ścieżki 1-7) oraz 119 godzinę (ścieżki 8-14) po transfekcji. Wyrażenie białek Nef analizowano za pomocą transferu typu Western w sposób zasadniczo opisany w Przykładzie 1. Transfer z przeciwciałami anty-E2 w 119 godzinie po transfekcji nie został przedstawiony, ponieważ nie wykryto żadnego specjalnego sygnału. Ogólnie, poziom wyrażania białka Nef korelował z poziomem ekspresji białka E2 u tych komórek, co potwierdza, że działanie białka E2 polega na aktywowaniu transkrypcji i udziale w utrzymaniu plazmidu przez dłuższy czas w proliferujących komórkach.

Komórki CHO transfekowano 0,5 μg lub 2 μg NNV-2wt (ścieżki 1,2, 8 i 9 na Figurze 10) oraz równorzędnymi ilościami plazmidów NNV-2wtFS (ścieżki 3, 4, 10 i 11 na Figurze 10) i product1wt (ścieżki 5, 6, 12 i 13 na Figurze 10) lub tylko nośnikiem (ścieżki 7 i 14 na Figurze 10). Jako punkty czasowe obrano 48 godzinę (ścieżki 1-7) oraz 114 godzinę (ścieżki 8-14) po transfekcji. Ekspresję białek Nef i E2 analizowano za pomocą transferu typu Western w sposób zasadniczo opisany w Przykładzie 1.

Komórki RD transfekowano 0,5 μg lub 2 μg NNV-2wt (ścieżki 1, 2, 8 i 9 na Figurze 11) oraz równorzędnymi ilościami plazmidów NNV-2wtFS (ścieżki 3, 4, 10 i 11 na Figurze 11) i product1wt (ścieżki 5, 6, 12 i 13 na Figurze 11) lub tylko nośnikiem (ścieżki 7 i 14 na Figurze 11). Jako punkty czasowe obrano 39 godzinę (ścieżki 1-7) oraz 110 godzinę (ścieżki 8-14) po transfekcji. Wyrażenie białka Nef analizowano za pomocą transferu typu Western w sposób zasadniczo opisany w Przykładzie 1.

We wszystkich czterech liniach komórkowych poziom wyrażania białka Nef, w przypadku wcześniejszych punktów czasowych (ścieżki 1-7 na Figurach 8-11) oraz późniejszych punktach czasowych (ścieżki 8-14 na Figurach 8-11) z plazmidu NNV-2wt był wyższy niż z wektorów kontrolnych. Przewaga NNV-2wt była bardziej oczywista w przypadku późniejszych punktów czasowych, co jest widoczne z porównania ścieżki 8 ze ścieżkami 10 i 12 na Figurze 8, a także z porównania ścieżki 9 ze ścieżkami 11 i 13 na Figurach 8, 9 i 10.

Wzór ekspresji RNA pochodzącego z tych plazmidów również analizowano przy zastosowaniu analizy Northern [Alwine, J.C, i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 74 (1977) 5350-5354] dla wektora NNV-2wt. W tym celu komórki Jurkat i CHO transfekowano 2 μg NNV-2wt. Do transfekcji komórek P815 zastosowano 10 μg NNV-2wt. Transfekcje przeprowadzono w sposób zasadniczo opisany

PL 206 097 B1 w Przykł adzie 1. W czterdzieś ci osiem godzin po transfekcji ekstrahowano cał kowity RNA przy zastosowaniu zestawu RNAeasy kit (Qiagen) i analizowano próbki zawierające 21 μg (P815), 15 μg (CHO) lub 10 μg (Jurkat) RNA za pomocą elektroforezy w warunkach denaturujących (1,3% żel agarozowy zawierający 20 mM MOPS pH 7,0; 2 mM NaOAc; 1 mM EDTA pH 8,0; 2,2 M formaldehyd). Bufor do rozdziału zawierał te same składniki z wyjątkiem formaldehydu. Próbki umieszczono w buforze zawierającym formamid i formaldehyd. Po elektroforezie rozdzielone RNA przenoszono na filtr HybondN+ (Amersham Pharmacia Biotech, United Kingdom) i przeprowadzano hybrydyzację z radioaktywnie wyznakowaną sekwencją kodującą nef, sekwencją kodującą E2 lub całymi sondami wektorowymi. RNA z komórek transfekowanych nośnikiem zastosowano jako kontrolę. Wyniki analizy transferu typu Northern przedstawione są na Figurze 12.

Wyniki wskazują, że z wektora nie są wyrażane żadne inne rodzaje RNA poza komplementarnymi cząsteczkami mRNA dla E2 i nef, ponieważ nie wykryto żadnych dodatkowych sygnałów w przypadku sondy całego wektora w porównaniu ze specyficznymi hybrydyzacjami nef i E2 (porównaj ścieżki 1-12 ze ścieżkami 13-18 na Figurze 12).

P r z y k ł a d 4

Analiza przyłączania NNV-2wt do chromosomów mitotycznych

Przyłączanie NNV-2wt do chromosomów mitotycznych w komórkach CHO analizowano za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) [Tucker J.D., i wsp., J.E.Celis (ed.), Cell Biology: A Laboratory Handbook, tom 2, str. 450-458. Academic Press, Inc. New York, NY. 1994].

Trzydzieści sześć godzin po transfekcji komórek CHO za pomocą elektroporacji 1 μg NNV-2wt lub równomolarnymi ilościami plazmidów kontrolnych NNV-2wtFS i product1wt (przeprowadzone zasadniczo w sposób opisany w Przykładzie 1), hodowle traktowano kolchicyną (Gibco) w celu zatrzymania komórek w metafazie mitozy. W skrócie, komórki były wystawiane na działanie kolchicyny dodanej do pożywki w końcowym stężeniu 0,1 μg/ml przez 1-4 godzin w celu zablokowania cyklu komórkowego w mitozie. Zablokowane komórki zbierano za pomocą traktowania trypsyną i zawieszano w 0,075 M roztworze KCl, inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut i utrwalano w zimnym metanol-lodowy kwas octowy (3:1, obj./obj.). Rozdzielone w metafazie chromosomy oraz interfazowe jądra przygotowywano do analizy hybrydyzacji in situ przez nakroplenie zawiesiny komórkowej na mokre szkiełka podstawowe. Przygotowywano kilka szkiełek podstawowych z jednej hodowli.

Sondy do hybrydyzacji przygotowywano za pomocą metody przesuwającego się nacięcia (nick-translation), stosując jako znacznik biotynę-16-dUTP i plazmid Product1wt jako matrycę. Typowa mieszanina reakcyjna do reakcji nick-translation zawiera bufor do reakcji nick-translation, niewyznakowane dNTP, biotynę-16-dUTP i polimerazę DNA E. coli.

Preparaty chromosomowe denaturowano w 70°C w 70% formamidzie (pH 7,0-7,3) przez 5 minut, następnie natychmiast odwadniano przez kolejne przemywania (płukania 70%, 80% i 96% zimnym etanolem każde przez 3 minuty) i suszono na powietrzu. Mieszanina hybrydyzacyjna (18 μl na szkiełko) składała się z 50% formamidu w 2XSSC (1xSSC to 0,15 M NaCl plus 0,015 M cytrynian sodu), 10% siarczan dekstranu, 150 ng DNA bio-tynylowanej plazmidowej sondy i 10 μg nośnikowego DNA spermy śledzia. Po 5 minutach denaturacji w 70°C, DNA sondy nakładano na każde szkiełko podstawowe, uszczelniano pod szkiełkiem nakrywkowym i hybrydyzowano przez noc w 37°C w wilgotnej komorze. Szkiełka przemywano trzema zmianami 2xSSC, nd 2xSSC zawierający 0,1% IGEPAL CA-630 (Sigma Chemical Co.) w 45°C. Przed detekcją immunofluorescencyjną, szkiełka preinkubowano przez 5 minut w buforze PNM [PN bufor (25,2 g Na2HPO4 • 7H2O, 0,83 g Na2HPO4 • 7H2O i 0,6 ml IGEPAL CA-630 w 1 litrze H2O) z 5% chudym mlekiem w proszku i 0,02% azydkiem sodu].

Następnie, sondę wykrywano ekstrawidyną skoniugowaną z izotiocjanianem fluoresceiny(FITC). Sygnał wzmacniano biotynylowanym przeciwciałem przeciwko awidynie i powtórnym traktowaniem ekstrawidyną-FITC. Pomiędzy każdym z etapów, szkiełka przemywano buforem PN zawierającym 0,05% IGEPAL CA-630 w temperaturze pokojowej przez 2x5 minut. Chromosomy barwiono kontrastowo jodkiem propidyny i zawieszano w roztworze zapobiegającym wygaszaniu sygnału z p-fenylenodwuaminą.

Szkiełka analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym VANOX-S wyposażonym w odpowiedni zestaw filtrów.

PL 206 097 B1

Wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1. Przyłączanie NNV-2wt do chromosomów

Hodowla	Metafazy z sygnałem episomalnym na chromosomach	Przeanalizowane metafazy	%
0,5 pg NNV-2wt	11	158	7
0,5 pg NNV-2wtFS	0	100	0
0,48 pg product1wt	0	100	0
nośnik	0	100	0

Dane jasno wskazują, że białko E2 i jego miejsca wiązania wymagane są do przyłączania do chromosomów ponieważ jedynie NN-2wt, ale nie dwa pozostałe wektory, miał taką zdolność.

P r z y k ł a d 5

Stabilność NNV-2wt podczas powielania się w komórkach bakteryjnych

Badano stabilność NNV-2wt podczas powielania się w komórkach bakteryjnych. Plazmid NNV-2wt mieszano z kompetentnymi komórkami Escherichia coli szczepu DH5alfa [przygotowanego jak zostało to opisane w Inoue, H., i wsp., Gene 96 (1990) 23-28] i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Następnie, zawiesinę komórek poddawano szokowi cieplnemu przez 3 minuty w 37°C, po czym następowało szybkie chłodzenie w lodzie. Do próbki dodawano jeden mililitr pożywki LB i mieszaninę inkubowano przez 45 minut w 37°C z silnym wytrząsaniem. Ostatecznie, porcję komórek umieszczano na szalkach zawierających pożywkę LB z 50 μg/ml kanamycyny. Następnego dnia, komórki z pojedynczej kolonii przenoszono na nowe szalki zawierające taką samą pożywkę. Procedurę tę powtarzano aż do wzrostu czwartego pokolenia bakterii, a plazmidowe DNA z kolonii z każdego pokolenia analizowano.

Jedną kolonię z każdego pokolenia używano do zaszczepienia 2 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, po czym następowała inkubacja przez noc w 37°C z silnym wytrząsaniem. Komórki zbierano i izolowano z nich plazmidowe DNA za pomocą klasycznej lizy przez gotowanie [Sambrook, S., i wsp., Molecular Cloning A Laboratory Manual. Drugie wyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]. Próbki trawiono endonukleazą restrykcyjną Xbal (Fermentas, Litwa) i analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w porównaniu z oryginalnym DNA stosowanym do transformacji. Wyniki przedstawiono na Figurze 13.

Jak widać na Rysunku 13, wektor jest stabilny podczas pasażowania w komórkach Escherichia coli: nie zaobserwowano żadnych kolonii z rearanżacjami w porównaniu z DNA zastosowanym do transformacji (ścieżka 9).

P r z y k ł a d 6

Stabilność NNV-2wt w komórkach eukariotycznych

Analizowano także stabilność plazmidu NNV-2wt jako episomalnego elementu niereplikującego w komórkach eukariotycznych. W tym celu transfekowano komórki CHO oraz Jurkat 2 μg NNV-2wt. Izolowano całkowite DNA z komórek 24, 72 oraz 96 godzin po transfekcji. W skrócie, komórki lizowano w 20 mM Tris-HCl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,2% SDS; w obecności 200 μg/ml proteinazy K (Fermentas, Litwa). Następnie, próbki ekstrahowano kolejno fenolem i chloroformem i strącano etanolem. Kwasy nukleinowe zawieszano w 10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0; 20 pg /ml RNAazy A (Fermentas, Litwa) i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Ostatecznie DNA strącano ponownie octanem amonu i etanolem, przemywano 70% etanolem i zawieszano w 10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0. Próbki trawiono różnymi restrykcyjnymi endonukleazami: Eco81I (Fermentas, Litwa), która posiada dwa miejsca rozpoznawane na plazmidzie, Hindlll (Fermentas, Litwa), która nie trawi DNA NNV-2wt oraz DpnI (New England Biolabs, USA), która tnie jedynie DNA syntetyzowane w komórkach Escherichia coli. Strawione DNA rozdzielano podczas elektroforezy agarozowej w TAE i analizowano za pomocą transferu typu Southern [Southern, E.M. J.Mol.Biol. 98 (1975) 503-517] ze specyficzną względem wektora sondą wyznakowaną radioaktywnie. Wyniki te zilustrowano na rysunku 14. Z porównania wielkości fragmentów pochodzących z trawienia Eco81I (ścieżki 1, 2 i 7 na rysunku 14) z odpowiednią ścieżką wzorca oczywiste jest, że nie wykryto rearanżacji wektora w tym oznaczeniu. Nie obserwowano żadnych sygnałów w pozycji odmiennej od ścieżek wzorca w przypadku trawień Hind III (ścieżki 3, 4 i 8 na rysunku 14) lub Hindlll/Dnpl (ścieżki 5, 6 i 9 na Figurze 14), co wskazuje, że nie obserwowano zjawiska integracji i/lub replikacji.

PL 206 097 B1

P r z y k ł a d 7

Analiza replikacji NNV-2wt w obecności czynników replikacyjnych ludzkiego wirusa brodawczaka

Uprzednio wykazano, że białka wirusa brodawczaka zdolne są inicjować replikację heterologicznych plazmidów zawierających ori pochodzących z wielu innych ludzkich oraz zwierzęcych papillomawirusów [Chiang, C.M., i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992) 5799-5803]. Chociaż NNV-2wt nie zawiera nietkniętego wirusowego miejsca inicjacji replikacji, sprawdzono w jaki sposób następuje inicjacja replikacji w obecności białek E1 i E2 ludzkiego wirusa brodawczaka typu 1. Komórki CHO transfekowano jednym mikrogramem plazmidu NNV-2wt, NNV-2wtFS lub product1 pojedynczo lub z 4,5 μg HPV-11 E1 z wektora ekspresyjnego pMT/E1 HPV11 lub z taką samą ilością pMT/E1 HPV11 oraz 4,5 μg białka HPV-11 E2 z wektora ekspresyjnego pMT/E2 HPV11, jak przedstawiono w górnej części rysunku 15. Transfekcji dokonano zasadniczo w sposób opisany w Przykładzie 1. Wektory ekspresyjne dla E1 i E2 zostały opisane uprzednio (Chiang, CM, i wsp., powyżej). Równomolarną ilość plazmidu HPV11ORI zawierającego miejsce inicjacji replikacji HPV-11 transfekowano z tymi samymi wektorami ekspresyjnymi, co stanowiło kontrolę pozytywną.

Izolowano niskocząsteczkowe DNA za pomocą zmodyfikowanej lizy Hirta [Ustav, i wsp., EMBO J 2 (1991) 449-457] 67 godzin po transfekcji. W skrócie, komórki przepłukane PBS poddawano lizie w lodzie przez 5 minut przez dodawanie alkalicznych roztworów do lizy I (50 mM glukoza; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0) i II (0,2 M NaOH; 1% SDS) w stosunku 1:2 na szalkach. Lizaty neutralizowano za pomocą 0,5 obj. roztworu III (mieszanina octanu potasu i kwasu octowego, 3 M w przypadku potasu i 5 M w przypadku octanu). Po odwirowaniu nadsącz strącano izopropanolem, zawieszano i inkubowano w 55°C w 20 mM Tris-HCl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,2% SDS; w obecności 200 μg/ml proteinazy K (Fermentas, Litwa). Następnie próbki ekstrahowano kolejno fenolem i chloroformem, po czym strącano etanolem. Kwasy nukleinowe zawieszano w 10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0; 20 μg /ml RNAzy A (Fermentas, Litwa) i inkubowano przez 30 minut w 65°C. Próbki trawiono linearyzującymi enonukleazami Ndel (Fermentas, Litwa) w przypadku wektorów lub Hindlll (Fermentas, Litwa) w przypadku HPV11ORI i DpnI (New England Biolabs, USA) (rozbija niezreplikowane DNA), a następnie przeprowadzano transfer i hybrydyzację typu Southern zasadniczo w sposób opisany wcześniej stosując radioaktywną sondę specyficzną wektorowo. Jako pozytywną kontrolę hybrydyzacji stosowano odpowiednie markery linearyzowanych wektorów i HPV110RI (ścieżki oznaczone jako M na rysunku 15). Jak wynika z wyników zestawionych na rysunku 15, w przypadku żadnego plazmidu nie wykryto sygnału replikacyjnego.

P r z y k ł a d 8

Analiza E2 oraz zależnej od jego miejsc wiązania funkcji segregacji wektorów w dzielących się komórkach

Jak opisano uprzednio, zarówno białko E2 bydlęcego wirusa brodawczaka typu 1 w konformacji trans jak i jego wielorakie miejsca wiązania w konformacji cis są istotne i wystarczające do chromatynowego wiązania episomalnych elementów genetycznych. Sugeruje się, że zjawisko to dostarcza mechanizmu rozdziału genomu wirusa podczas infekcji wirusowej w komórkach dzielących się [Ilves, I., i wsp., J. Virol. 73 (1999) 4404-4412]. Ponieważ oba elementy funkcjonalne zawarte są także w naszym układzie wektorowym, celem tego badania było sprawdzanie znaczenia białka E2 oraz oligomerycznych miejsc wiązania dla utrzymania transkrypcyjnie aktywnego elementu wektorowego w populacji dzielących się komórek.

Do tego celu sekwencja kodująca Nef wektorów NNV-2wt i super6wt została zastąpiona sekwencją kodującą niestabilnej postaci białka zielonej fluoresceiny (d1EGFP) otrzymanej z wektora pd1EGFP-N1 (Clontech Laboratories). Ponieważ czas półtrwania tego białka wynosi jedynie 1 godzinę, nie jest ono gromadzone w komórkach i wyrażenie d1EGFP wykrywane metodą cytometri przepływowej skorelowane jest z obecnością aktywnego transkrypcyjnie wektora w tych komórkach.

Z NNV-2wt usunięto sekwencja kodującą nef i zamiast niej wstawiono fragment Smal-Notl z Pd1EGFP-N1. Nowy wektor nazwano 2wtd1EGFP (Rysunek 16). Podobną zamianę przeprowadzono odpowiednio w przypadku super6wt w celu utworzenia gf10base2 (Rysunek 17). Do miejsca EcoRI w super6wt zaraz powyżej E2BS wprowadzono sekwencję rozpoznawaną przez ednonukleazę restrykcyjną Spel. Wektor gf10bse2 jest pochodną tego plazmidu i powstał przez zamianę fragmentu NdeI-Bst1107I zawierającego sekwencję kodującą nef z fragmentem z 2wtd1EGFP zawierającym sekwencję kodującą d1EGFP, wycięte tymi samymi enzymami.

PL 206 097 B1

Skonstruowano także plazmidy stanowiące negatywną kontrolę, które nie zawierały funkcjonalnej sekwencji kodującej E2 lub jego miejsc wiązania: Wprowadzono przesunięcie ramki odczytu do sekwencji kodującej E2 w kontekście 2wtd1EGFP przez zamianę Bsp120l-Bsp120l zawierającego sekwencję kodującą E2 podobnym fragmentem z plazmidu NNV-2wtFS. Uzyskany wektor nazwano 2wtd1EGFPFS (Figura 18). W celu uzyskania plazmidu kontrolnego NNVd1EGFP (Figura 19) całą kasetę ekspresyjną E2 (jak również replikon bakteryjny) z 2wtd1EGFP usunięto za pomocą trawienia Bst1107 i Nhel. Replikon został zrekonstruowany z plazmidu product1 jako fragment Hindlll (wypełnione)-Nhel.

Komórki Jurkat transfekowano za pomocą elektroporacji stosując 1 μg wektora 2wtd1EGFP lub równomolarne ilości plazmidów 2wtd1EGFPFS, NNVd1EGFP, gf10bse2 lub jedynie nośnikowego DNA w sposób opisany w Przykładzie 1. W różnych punktach czasowych po transfekcji zbierano równe objętości nadsączu komórkowego do analizy, po czym próbki rozcieńczano świeżą pożywką. W każdym z punktów czasowych obliczano całkowitą liczbę komórek, jak również liczbę komórek wyrażających d1EGFP za pomocą cytometru przepływowego (Becton-Dickinson FACSCalibur System). Na podstawie tych danych wyliczano procent komórek wyrażających d1EGFP, zmiany w całkowitej liczbie komórek oraz liczbę komórek wyrażających d1EGFP w próbkach przy zastosowaniu komórek transfekowanych jedynie nośnikiem jako kontroli negatywnej stanowiącej tło fluorescencji. Biorąc pod uwagę wykonane rozcieńczenia dokonano obliczeń liczby komórek. Ostatecznie, wyliczono wartości błędu na podstawie danych technicznych cytometru dotyczących zmian prędkości przepływu.

Wykonano dwa niezależne doświadczenia. Po pierwsze przeanalizowano utrzymanie się d1EGFP wyrażonego z plazmidów 2wtd1EGFP, 2wtd1EGFPS oraz NNVd1EGFP w ciągu ośmiu dni od transfekcji. W drugim doświadczeniu badano utrzymanie się d1EGFP wyrażonego z plazmidów 2wtd1EGFP, 2wtd1EGFPFS oraz gf10bse2 w ciągu trzynastu dni od transfekcji.

Jak widać na Figurze 20 i 21 nie było różnic w tempie wzrostu komórek transfekowanych którymś z wektorów lub jedynie nośnikiem. Oznacza to, że różnice w utrzymaniu ekspresji d1EGFP nie są spowodowane przez wpływ samych transfekowanych wektorów na podziały komórek. Ponadto, podczas oznaczenia wykryto logarytmiczny wzrost komórek z wyjątkiem okresu trwającego do drugiego punktu czasowego w doświadczeniu przedstawionym na Figurze 20. Ten spowolniony okres wzrostu jest prawdopodobnie spowodowany wstrząsem elektroporacyjnym komórek, ponieważ pierwszy punkt czasowy obrano już w 19 godzin po transfekcji.

Jak zobrazowano to na Rysunkach 22 i 23 procentowy udział komórek wyrażających białko o zielonej fluorescencji spada w przypadku wszystkich populacji transfekowanych każdym z plazmidów, ponieważ wektory nie ulegają replikacji w komórkach. Jednakże, jak widać na wykresach, frakcja komórek pozytywnych spada w sposób szybszy w przypadku wektorów kontrolnych w porównaniu do 2wtd1EGFP lub gf10bse. Jeśli porównać je ze sobą gf10bse2 ma wyraźną przewagę względem 2wtd1EGFP (Figura 23). Istnieje także zauważalna różnica w utrzymaniu pomiędzy plazmidami kontrolnymi 2wtFSd1EGFP a NNVd1EGFP (Figura 22).

Różnice pomiędzy wektorami stają się bardziej oczywiste, jeżeli dane przedstawione są jako zmiany ilości komórek w populacjach wyrażających d1EGFP (Figury 24 oraz 25). Ilości komórek pozytywnych w przypadku plazmidów kontrolnych nie ulegają znaczącej zmianie podczas oznaczenia. Odwrotnie, w przypadku 2wtd1EGFP ilość komórek wyrażających d1EGFP wzrasta podczas pierwszego tygodnia po transfekcji stając się około pięciokrotnie wyższa niż w próbkach kontrolnych (Figura 24). Po tym punkcie czasowym ilość zaczyna maleć (Figura 25). Różnica w utrzymaniu jest wyraźniejsza w przypadku wektora gf10bse2. Ilość komórek pozytywnych stale wzrasta podczas okresu oznaczeń. Po dwóch tygodniach jest 6 razy wyższa niż w próbkach transferowanych 2wtdEGFP i 45 razy wyższa niż w populacji transferowanej mutantem z przesunięciem ramki odczytu (Figura 25).

Dane jasno wskazują, że układ wektorowy według przedstawianego wynalazku posiada czynny mechanizm segregacji oparty na białku kotwiczonym w jądrze, tj. białku E2 bydlęcego wirusa wywołującego brodawczaki typu 1 oraz jego miejscach wiązania, które promują jego utrzymanie w populacji komórek dzielących się w postaci aktywnego transkrypcyjnie elementu.

P r z y k ł a d 9:

KLONOWANIE GENU AIRE DO SUPER6WT ORAZ EKSPRESJA W NABŁONKOWEJ LINII KOMÓRKOWEJ

Gen AIRE kodujący białko AIRE (AIRE = regulator autoimmunologiczny) zmutowany jest w autosomalnie dziedziczonym zespole APECED (zespół niedoczynności przytarczyc i kory nadnerczy).

PL 206 097 B1

AIRE wyrażany jest w nielicznych komórkach nabłonkowych w rdzeniu grasicy oraz w komórkach dendrytycznych we krwi obwodowej i obwodowych narządach limfatycznych. APECED można zatem leczyć przez dostarczenie ex vivo niezmutowanego genu AIRE do komórek dendrytycznych krwi obwodowej, a następnie przez wprowadzenie prawidłowych komórek dendrytycznych z powrotem do pacjenta. W celu sprawdzenia takiej możliwości ludzki gen AIRE oraz homologiczny mysi gen AIRE transferowano do komórek COS-1.

W celu klonowania genu AIRE do Super6wt przeprowadzono izolację wektora na dużą skalę. Na początku przeprowadzono transfekcję komórek TOP10 (chemicznie kompetentne Escherichia coli wyprodukowane przez Invitrogen) Super6wt zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki inkubowano w lodzie przez 30 minut, następnie poddawano je szokowi cieplnemu w łaźni wodnej w +42°C przez 30 sekund. Następnie komórki bezpośrednio przenoszono do lodu na 2 minuty i hodowano w 250 μl pożywki SOC (2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza) w 37°C z wytrząsaniem przez 1 godzinę.

Bakterie wysiano na szalki z podłożem LB stosując kanamycynę (50 μg/ml) do selekcji. W celu izolacji plazmidów na dużą skalę, kolonie przenoszono do 150 ml roztworu LB zawierającego kanamycynę (50 μg/ml) i hodowano przez noc w +37°C z wytrząsaniem. Przygotowanie izolacji plazmidów na dużą skalę przeprowadzono stosując zestaw Qiagen's Plazmid Maxi Kit zgodnie z instrukcją producenta.

W celu sprawdzenia wektora zastosowano trawienie enzymami restrykcyjnymi BamHI oraz SalI. Mieszanina reakcyjna zawierała 500 ng Super6wt, 5U BamHI, 5 U SalI, 2 μl buforu 2X TANGO (zarówno enzymy restrykcyjne jak i bufor zakupiono w Fermentas) oraz sterylną wodę w całkowitej objętości 10 gl. Trawienie przeprowadzono w +37°C przez jedną godzinę.

Strawiony wektor sprawdzano na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny 1 gg/ml w buforze 1X TAE.

W celu sklonowania zamplifikowanego za pomocą PCR genu AIRE i fragmentów Aire w Super6wt, trawiono 4 gg Super6wt z użyciem 10 U enzymu restrykcyjnego Notl (MBI Fermentas) w 2 gl buforu do enzymu i sterylnej wodzie dodanej do końcowej objętości 20 gl. Trawienie przeprowadzano w +37°C przez 1,5 godziny, po czym do mieszaniny reakcyjnej dodawano 1U enzymu ZIP (fosfataza alkaliczna) i inkubowano kolejne 30 minut. Traktowanie enzymem ZIP miało na celu ułatwienie wstawienia się genu AIRE do wektora przez zapobiegnięcie samoligacji wektora ponownie do kolistej postaci. Po trawieniu wektor oczyszczano stosując zestaw GFXTM PCR DNA i Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotach) i rozpuszczano do stężenia 0,2 mikrogramy/mikrolitr.

Produkty PCR ludzkiego i mysiego genu AIRE także trawiono enzymem restrykcyjnym Notl. Do trawienia użyto 26 gl produktu PCR, 3 gl odpowiedniego buforu do enzymu oraz 10U enzymu restrykcyjnego Notl (bufor i enzym zakupiono w MBI Fermentas). Trawienie przeprowadzono w +37°C przez 2 godziny, po czym strawiony produkt PCR oczyszczono i rozpuszczono w sterylnej wodzie w objętości 10 gl.

Zamplifikowany przy pomocy PCR i strawione ludzkie oraz mysie geny AIRE ligowano z Super6wt za pomocą DNA ligazy T4 (MBI Fermentas). Pobrano strawione DNA wstawki (całkowita objętość 10 gl), 1,5 gl buforu do ligacji (MBI Fermentas), 5U DNA ligazy T4 i dodano sterylnej wody do końcowego stężenia 15 gl. Ligację przeprowadzono w +17 C przez noc.

Po ligacji pobrano 10 gl mieszaniny ligacyjnej do transfekcji w komórkach TOP10 zgodnie z instrukcją producenta. Komórki inkubowano w lodzie przez 30 minut, po czym poddano je szokowi cieplnemu w łaźni wodnej w +42°C przez 30 sekund. Następnie komórki przenoszono bezpośrednio do lodu na 2 minuty i hodowano w 250 gl pożywki SOC (2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza) w +37°C z wytrząsaniem przez 1 godzinę.

Stransfekowane komórki bakteryjne wysiewano na szalki LB-kanamycyna, a kolonie przenoszono następnego dnia do 2 ml pożywki LB (1% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 170 mM NaCl) z kanamycyną i hodowano przez noc w +37°C.

Preparaty izolowanego na małą skalę plazmidowego DNA z wyselekcjonowanych kolonii oczyszczano stosując zestaw Qiagen's Plazmid Midi Kit i rozpuszczano w objętości 50 gl sterylnej wody. Obecność i rozmiar wstawki sprawdzano za pomocą trawienia Notl oraz BamHI. Do trawienia pobierano 10 gl wyizolowanego na mała skalę plazmidowego DNA, 5U enzymu Notl i 5U enzymu BamHI, 2 ml buforu enzymatycznego R+ i dodawano sterylnej wody do końcowej objętości 20 gl. Trawienie przeprowadzano w +37°C przez 1 godzinę.

PL 206 097 B1

Orientację wstawki analizowano za pomocą enzymu restrykcyjnego BamHI. Pobierano dziesięć gl wyizolowanego na małą skalę DNA, 5U BamHI, 2 μl buforu BamHI (MBI Fermentas) i dodawano sterylnej wody do końcowej objętości 20 gl. Trawienie przeprowadzano przez 1 godzinę w +37°C, a produkty sprawdzano na 1% żelu agarozowym z EtBr w 1X TAE.

Na podstawie tych wyników, pobrano plazmid zawierający mysi gen AIRE oraz plazmid zawierający ludzki gen AIRE i przeprowadzono izolację plazmidowego DNA na dużą skalę. W skrócie, 0,5 ml zawiesiny komórek E. coli zawierających dany plazmid lub hodowlę do izolacji na małą skalę dodawano do 150 ml pożywki LB zawierającej kanamycynę (50 gl/ml) i hodowano przez noc w +37°C. Plazmidowe DNA izolowane na dużą skalę przygotowywano stosując Qiagen's Plazmid Maxi Kit.

Plazmid zawierający mysi gen AIRE oznaczono jako pS6wtmAIRE, a plazmid zawierający ludzki gen AIRE jako pS6wthAIRE.

Otrzymane wektory sekwencjonowano dla około 500 pz z obu końców w celu sprawdzenia orientacji i prawidłowości wstawki. Sekwencjonowanie przeprowadzano stosując metodę dideoksy z PE Biosystem's Big Dye Termination RR-mix, który zawiera cztery różne kończące trifosforany dideoksy nukleotydów wyznakowane różnymi znacznikami fluorescencyjnymi.

Plazmidy zawierające gen AIRE oraz fragmenty genu AIRE wprowadzano do wyselekcjonowanych linii komórkowych w celu sprawdzenia, za pomocą transferu typu Western, wyrażania białka po transfekcji.

Komórki Cos-1 zbierano za pomocą roztworu Trypsyna-EDTA (Bio Whittaker Europę) i zawieszano 10x106 komórek/ml w pożywce MEM Dulbecco (Life Technologies), a 250 gl zawiesiny komórek pobierano do transfekcji. Transfekcję komórek Cos-1 przeprowadzano stosując elektroporację z 2,5x106 komórek, 50 gg DNA ze spermy łososia jako nośnika oraz 5 gg odpowiedniego wektora. Transfekcję przeprowadzono z pS6wthAIRE, pSwtmAIRE, super6wt, pCAIRE, psiAIRE oraz pCAIRE S1-4. pCAIRE oraz psiAIRE są pozytywnymi kontrolami dla ludzkiego AIRE, pCAIRE S1-4 jest pozytywną kontrolą dla mysiego AIRE, a Super6wt jest kontrolą negatywną.

Elektroporację przeprowadzono stosując Biorad Gene Pulser przy pojemności wynoszącej 960 gFd, 240 V i 1 pulsie. Po pulsie komórki trzymano w temperaturze pokojowej przez 10 minut i dodawano 400 gl pożywki. Komórki przenoszono do 5 ml pożywki i wirowano przez 5 minut przy 1000 rpm. Komórki wysiewano na szalki i hodowano przez 3 dni w 37°C, przy 5% CO2.

Komórki zbierano przy pomocy trypsyny-EDTA i odwirowywano. Następnie, komórki płukano raz 500 ml 1 x PBS (0,14 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 7,9 gM Na2HPO4, 1,5 gM KH2PO4). Dodawano 50 gl PBS i 100 gl buforu obciążającego SDS (5% merkaptoetanol, 16 gM błękitu bromofenolu, 20 gM ksylenu cyjanolowego, 1,6 mM Fikolu 400), po czym komórki ogrzewano przez 10 minut w +95°C.

Do celów analizy transferu Western przygotowywano SDS-PAGE z żelem rozdzielającym 10% i żelem zatężającym 5% w buforze SDS do rozdziału (25 mM Tris, 250 mM glicyną, 0,1% SDS). Próbki komórek oraz biotynylowany znacznik masy cząsteczkowej nałożono na żel i przeprowadzano elektroforezę przez 1 godzinę i 50 minut przy 150 V. Przeprowadzano transfer białek na filtr nitrocelulozowy przy 100 V przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej przy zastosowaniu chłodnicy w buforze do transferu.

Filtr blokowano 5 % mlekiem w TBS (0,05 M Tris-Cl, 0,15 M NaCl, pH 7,5) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na filtr nakładano mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych, przeciwciała anty-AIRE6.1 (ludzkie) oraz anty-AIRE8.1 (mysie) w rozcieńczeniu wynoszącym 1:100 w 5% mleku w TBS i inkubowano przez noc w +4°C. Filtr płukano dwukrotnie 0,1% Tween w TBS przez 5 minut i jednokrotnie w TBS przez 5 minut. Przeciwciało drugorzędowe, biotynylowane antymysie IgG w rozcieńczeniu 1:500 w 5% mleku w TBS inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Filtr płukano i dodawano awidynę D z peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu 1:1000 w 5% mleku w TBS. Filtr inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i płukano. Substrat peroksydazy przygotowywano z 5 ml chloronaftolu, 20 ml TBS i 10 gl nadtlenku wodoru i nakładano na filtr. Po uzyskaniu barwy filtr płukano w TBS i suszono.

Detekcja przeciwciałami przeciwko ludzkiemu AIRE (anty-AIRE6.1) wykryła wyrażanie białka AIRE w preparatach transfekowanych pS6wthAIRE, pCAIRE oraz psiAIRE. Detekcja przeciwciałami przeciwko mysiemu AIRE podobnie wykryła mysie AIRE w komórkach transfekowanych pS6wtmAIRE oraz pCAIRE S1-4. Kontrola negatywna (Super6wt) nie wykazała białek AIRE/aire.

P r z y k ł a d 10

WYKRYWANIE KOMÓRKOWEJ I HUMORALNEJ ODPOWIEDZI ODPORNOŚCIOWEJ PRZECIW HIV.1 NEF U MYSZY IMMUNIZOWANYCH KONSTRUKTEM NNV-NEF

PL 206 097 B1

IMMUNIZACJE DNA

Do dalszych badań indukcji odpowiedzi humoralnej przez wektory według wynalazku, zastosowano 5-8 tygodniowe samce i samice myszy szczepu BALB/c (H-2d). Do immunizacji DNA, myszy zostały uśpione 1,2 mg pentobarbitalu (dootrzewnowo), po czym na ostrzyżoną część skóry na brzuchu wprowadzano DNA stosując cząsteczki złota opłaszczone plazmidowym DNA. Wprowadzania dokonano za pomocą Helios Gene Gun (Bio-Rad) stosując ciśnienie 300 psi. Cząsteczki złota miały średnicę 1 μm, ~1 μg DNA/nabój. Myszy immunizowano dwukrotnie (dnia 0 i dnia 7) całkowitą ilością DNA po 0,4 lub 0,8 μg/mysz. Myszy kontrolne immunizowano 8 μg pustego wektora nie zawierającego genu nef, tj. NNV-deltanef.

Z ogona myszy pobierano próbki krwi w dwa tygodnie od ostatniej immunizacji. Myszy zabijano cztery tygodnie po ostatniej immunizacji i zbierano próbki krwi (100 μθ do probówek Eppendorfa zawierających 10 μl 0,5 M blottingu (++ vs. +) oraz w ELISA (wyższe OD, więcej myszy o wyższej dawce niż odcięcie EDTA. Dla każdej myszy wyliczano z tych próbek całkowitą liczbę leukocytów/ml krwi. Surowice zbierano do oznaczeń przeciwciał i przechowywano w -20°C. Śledziony izolowano jałowo, ważono, po czym homogenizowano do zawiesiny pojedynczej komórki do oznaczeń i barwień limfocytów T, B oraz komórek NK.

Wykrywanie humoralnej immunogenności wektorów według wynalazku

Do wykrywania za pomocą transferu Western specyficznych względem Nef przeciwciał, próbki surowic pochodzące od myszy immunizowanych konstruktami wektorów według wynalazku rozcieńczono 1:100 w 5% mleku w TBS i nakładano na nitrocelulozowe paski zawierające rekombinowane białko HIV-1 Nef. W celu przygotowania nitrocelulozowych pasków gotowano oczyszczone zrekombinowane białko w buforze do próbki zawierającej 1% SDS oraz 1% 2-merkaptoetanol, następnie rozdzielano na 10 lub 12,5% żelu poliakrylamidowym, po czym przenoszono na 0,45 μm nitrocelulozowy papier. Paski najpierw blokowano 2% BSA w 5% odtłuszczonym mleku-TBS, po czym inkubowano z rozcieńczonymi surowicami (1:100) przez noc. Po inkubacji, niezwiązane białka usuwano przez trzykrotne płukanie pasków w TBS-0,05% Tween-20 i dwukrotne płukanie w wodzie. Po płukaniach paski inkubowano z rozcieńczonym 1:500 biotynylowanym anty-mysim IgG (Vector Laboratories, USA) przez 2 godziny. Po kolejnych płukaniach dodawano awidynę sprzężoną z peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu 1:1000 (Vector Laboratories, USA) na 1 godzinę, po czym paski ponownie płukano, a związane przeciwciała wykrywano za pomocą substratu peroksydazy wodorowej, 4-chloro-1-naftolu (Sigma, USA).

Surowice poddawano także testowi ELISA celem określenia dokładnych mian przeciwciał indukowanych przez każdy z konstruktów. ELISA dla przeciwciał Nef została przeprowadzona w sposób opisany uprzednio (Tahtinen i wsp., 2001). W skrócie, płytki Nunc Maxi Sorp opłaszczano 50 ng Nef (izolat HAN), blokowano 2% BSA w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), po czym do podwójnych studzienek dodawano surowice w rozcieńczeniu od 1:100 do 1:25000 i inkubowano przez noc. Po intensywnych płukaniach, dodawano przeciwciała drugorzędowe, anty-mysie IgG lub IgM sprzężone z peroksydazą (DAKO), po czym płytki inkubowano przez dwie godziny, a następnie płukano. Mierzono intensywność barwy pochodzącej z substratu (kwas 2,2'-azyno-di(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy, ABTS, Sigma) w buforze fosforanowo-cytrynianowym przy 405 nm stosując czytnik płytek ELISA Labsystems Multiscan Plus ELISA-plate. Wartość odcięcia gęstości optycznej dla reakcji przeciwciała pozytywnego określano w sposób następujący:

odcięcie = OD (xl surowica myszy kontrolnej) + 3 SD.

Wykrywanie immunogenności komórkowej wektorów według wynalazku

W celu analizy zdolności wektorów według wynalazku do indukowania immunogenności komórkowej, przeprowadzono oznaczenia limfocytów T oraz limfocytów B jak również barwienie powierzchni komórkowej

Oznaczenie proliferacji limfocytów T. Komórki śledziony zawieszano do uzyskania końcowego stężenia 1 x 106/ml w RPMI-1640 (GibcoBRL) uzupełnionym 10% FCS (GibcoBRL), 1% penicyliostreptomycyną (GibcoBRL) oraz 50 μΜ beta-merkaptoetanolem (Sigma). Komórki inkubowano w płytkach miktrotitracyjnych po 200 μl/studzienkę jedynie z pożywką lub z różnymi bodźcami. Końcowe stężenia bodźców wynosiły: Con A 5 μg/ml, białko HIV-Nef w stężeniu 1 i 10 μg/ml oraz antygen HIV-gag jako kontrola negatywna w stężeniu 1 i 10 μg/ml. Wszystkie reakcje przeprowadzono w czterech powtórzeniach. Szóstego dnia inkubacji zbierano 100 μl nadsączu z każdej studzienki i przechowywano w -80°C w celu oznaczeń cytokin. Sześć godzin przed zbieraniem dodawano do każdej studzienki

PL 206 097 B1 μ Ci 3H-tymidyny (Amersham Pharmacia Biotech). Komórki zbierano i w liczniku scyntylacyjnym mierzono wstawioną radioaktywność (cpm). Obliczano indeksy stymulacyjne (SI) w następujący sposób: SI = średnie eksperymentalne cpm/ średnie pożywkowe cpm

Aktywacja limfocytów. Wykrywano aktywację limfocytów T oraz B przez podwójne barwienie powierzchni świeżych limfocytów śledzionowych przeciwciałami anty-CD3-FITC plus anty-CD69-PE (znacznik wczesnej aktywacji) oraz anty-CD19-FITC plus anty-CD69-PE (wszystkie z Pharmingen). Barwienie analizowano cytometrem przepływowym (FACSscan, Beton Dickinson).

Oznaczenia CTL. Mysie limfocyty śledzionowe hodowano przez pięć dni wspólnie z unieruchomionymi komórkami prezentującymi antygen (komórki P-815 zainfekowane MVA-HIV-nef lub kontrolnym MVA-F6) po czym testowano je w standardowym 4-godzinnym oznaczeniu uwalniania chromu 51 [Hiserodt, J., i wsp., J Immunol 135 (1995) 53-59; Lagranderie, M., i wsp., J Virol 71 (1997) 2303 -2309] względem komórek zainfekowanych MVA-HIV-nef lub kontrolnych komórek docelowych. W oznaczeniach CTL specyficzny rozpad 10% lub wię cej rozpatrzono pozytywnie.

Oznaczenie cytokin. Mierzono IFN-gamma oraz IL-10 z supernatantów hodowli komórkowych stymulowanych antygenowo w celu sprawdzenia, czy immunizowane myszy rozwijają odpowiedź typu Th1 czy Th2. Supernatanty zbierano z komórek stymulowanych antygenowo jak to zostało opisane powyżej. W surowicach immunizowanych myszy mierzono pro-zapalne cytokiny TNF-alfa i IL-10. Wszystkie cytokiny mierzono stosując handlowe zestawy ELISA (Quantikine, R&D Systems).

Spontaniczna proliferacja. Wykryto spontaniczną proliferację limfocytów śledzionowych za pomocą poboru 3H-tymidyny przez komórki hodowane przez 6 dni jedynie w pożywce.

Przeciwciała anty-dwuniciowe (ds) DNA. Przeciwciała dsDNA mierzono w surowicach immunizowanych myszy, myszy stanowiących pozytywną kontrolę (mrl/lpr, wspaniałomyślny dar od Dr Gene Shearer, NIH, USA) oraz myszy normalnych. Przeciwciała oznaczano za pomocą ELISA na dsDNA faga lambda ze związaną poli-L-lizyną. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2 oraz 3.

Tabela 2 przedstawia kompletne immunologiczne wyniki myszy immunizowanych za pomocą DNA plazmidu HIV-Nef. Pomimo, że rekombinowane białko HIV-1 Nef zastosowane w celu stymulacji limfocytów T in vitro, indukuje pewną niespecyficzną względem HIV proliferację komórek w każdej immunizowanej grupie, wystąpił znaczący wzrost w średnim SI myszy immunizowanych za pomocą

0,4 μg plazmidu (średni SI=72,2) w porównaniu do pozostałych. Ponadto, białko HIV-gag stanowiące kontrolę negatywną nie indukowało żadnej odpowiedzi limfocytów T. Jedynie limfocyty T myszy w grupie, w której wystąpiła proliferacja specyficzna względem nef również wytwarzały INF-afa specyficzny względem nef. Żadna spośród immunizowanych myszy nie posiadała komórek wytwarzających IL-10, co wskazuje, że odpowiedź limfocytów T u immunizowanych myszy była typu Th1 a nie typu Th2. W przeciwieństwie do odpowiedzi limfocytów T, myszy immunizowane wyższym stężeniem DNA plazmidu nef (8 μg) wykazywały silniejszą odpowiedź limfocytów B w porównaniu z myszami immunizowanymi 0,4 μg: odpowiedź humoralna u myszy immunizowanych wyższą dawką wykrywana była już w trzy tygodnie po ostatniej immunizacji i wykrywana odpowiedź była silniejsza także w przypadku Western). Wykryte przeciwciała należały do klasy IgG, nie wykryto natomiast odpowiedzi IgM. Żadna z myszy nie wytworzyła przeciwciał specyficznych względem E2.

Myszy immunizowane 0,4 μg DNA plazmidu HIV-nef miały podwyższoną liczbę leukocytów (6,38 x 10⁶/ml) w krwi obwodowej w porównaniu z pozostałymi grupami immunizowanych myszy i myszami normalnymi (3,8 x 10⁶/ml) (Tabela 3). Te same myszy miały dwukrotnie więcej zaktywowanych limfocytów T (21%, CD3+CD69+) w porównaniu z pozostałymi myszami (9% i 10%). Wynik ten skorelowany jest z pozytywną odpowiedzią limfocytów T na HIV-Nef (Tabela 2), ponieważ myszy z pozytywną odpowiedzią limfocytów T względem Nef miały również podwyższoną liczbę zaktywowanych limfocytów T w śledzionach. Wyniki przedstawione w Tabeli 3 pokazują także, że żadna z immunizowanych myszy nie wytwarzała przeciwciał anty-dsDNA w porównaniu z surowicami kontrolnymi (OD = 1,208), co wskazuje na brak niekorzystnego efektu immunizacji.

PL 206 097 B1

T a b e l a 2

Myszy	HIV-1 nef	HIV-1	IFN-g	IFN-g	HIV-1 nef	E2
SI*	gag SI	Th1	Th2	Ab	Ab
NNV-Nef 8 1	6	1	-	-	++	-
2	8	1	-	-	++	-
3	13	1	-	-	++	-
4	15	1	-	-	++	-
5	7	2	-	-	++	-
Średnia	9,8	1,2
NNV-NEF 0,4 1	24	1	+	-	+	-
2	112	1	+	-	+	-
3	83	1	+	-	+	-
4	73	1	+	-	+	-
5	69	1	+	-	+	-
Średnia	72,2	1
NN V- \Nef 8 1	6	1	-	-	-	-
2	nt	nt	-	-	-	-
3	11	1	-	-	-	-
4	23	2	-	-	-	-
5	12	1	-	-	-	-
Średnia	13	1,25

*SI = indeks stymulacji NT = nie testowane - = negatywne + = pozytywne ++ = silnie pozytywne

T a b e l a 3

Myszy	WBC x106/ml	CD3 % śledziona	CD3+CD69+ % śledziona	CD19 % śledziona	CD19+CD69+ % śledziona	ab anty-dsDNA OD(1:10 rozc)
1	2	3	4	5	6	7
NM 1						0,355
2						0,255
3						0,231
średnia						0,280
NNV-Nef 8 1	5	nt	nt	nt	nt	0,387
2	4,3	50	4	11	3	0,457
3	4,9	57	4	15	4	0,514

PL 206 097 B1 ciąg dalszy tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7
4	4,3	55	6	15	4	0,367
5	5,1	54	5	7	0	0,478
średnia	4,72	54	4,75 (9%)	12	2,75	0,441
NNV-Nef 0,4 1	3,9	nt	nt	nt	nt	0,418
2	8	41	9	18	5	0,263
3	7,5	39	8	25	9	0,375
4	5	46	9	16	6	0,285
5	7,5	43	10	13	7	0,396
średnia	6,38	42,25	9 (21%)	18	6,75	0,347
NNV-A Nef 8 1	4,5	61	4	9	2	0,413
2	4,6	59	4	15	1	0,353
3	3,8	50	6	17	5	0,382
4	3,1	46	7	25	8	0,448
5	3,5	nt	nt	nt	nt	0,501
średnia	3,9	54	5,25 (10%)	16,5	4	0,419

Normalna średnia WBC myszy = 3,8x10⁶/ml nt, nie testowane

OD kontroli pozytywnej surowicy a-dsDNA wynosiło 1,208 (1:10 rozc)

P r z y k ł a d 11

BEZPIECZEŃSTWO I IMMUNOGENNOŚĆ PROTOTYPOWEJ SZCZEPIONKI PRZECIWKO HIV GTU-NEF U PACJENTÓW ZAKAŻONYCH HIV

Wytwarzanie szczepionki NNV-2-Nef (SPRAWDZIĆ czy użyto NNV-2 czy NNVwt-2)

Szczepionka doświadczalna NNV-2-Nef została przygotowana według Przykładu 2 z Licencją na Wytwarzanie nr LLDnro 756/30/2000 (wydaną przez Fiński Narodowy Urząd Leków 21.12.2000).

Wykonany proces wytwórczy spełniał aktualne zasady Dobrej Praktyki Wytwórczej (cGMP) i dostarczył preparaty DNA plazmidowego nadające się do wykorzystania w testach klinicznych fazy I i II. Proces wytwórczy składał się z czterech etapów:

a) Ustanowienie głównych banków komórek i roboczych banków komórek

b) Fermentacja

c) Oczyszczanie

d) Aseptyczne napełnianie szczepionki

Szczegółowo, NNV-2-Nef wytworzono w bakteriach E. coli. Główne banki komórek (MCB) i robocze banki komórek (WCB) zawierające szczep E. coli DH5 alfa oporny na faga Tl ustanowiono zgodnie z konkretną Standardową Procedurą Operacyjną (SOP) dla czystych hodowanych i rozpowszechnianych badawczych banków komórek.

a) Ustanowienie głównych banków komórek i roboczych banków komórek

Schematyczna procedura ustanawiania systemu banków komórek jest przedstawiona poniżej:

Rozmrozić jedną probówkę badawczego banku komórek [szczep E. coli DH5 alfa oporny na faga T1 (Gibco BRL) stransformowany plazmidem NNV-2-Nef.]

Zaszczepić hodowlę na szalce ze zmodyfikowanym podłożem Lurii Bertaniego (zawierającym 25 μg/ml kanamycyny)

Inkubować przez noc (14-16h) w 37°C

Wybrać pojedynczą kolonię z szalki i zaszczepić 50 ml zmodyfikowanego podłoża Lurii Bertaniego (zawierającego 25 μg/ml kanamycyny)

Inkubować przez noc (14-16h) w 37°C

PL 206 097 B1

Zmierzyć gęstość optyczną hodowli bakterii (OD600=2,0-6,0)

Dodać do hodowli bakterii glicerolu

Rozdzielić mieszaninę hodowli z glicerolem na porcje

Oznaczyć i przechowywać główne banki komórek

Zgodnie z tym samym schematem roboczy bank komórek ustanowiono wykorzystując jedną probówkę głównego banku komórek jako materiał wyjściowy. Rutynowymi testami przeprowadzanymi na głównym i roboczym banku komórek były: charakterystyka mikrobiologiczna, brak zakażeń, ocena stabilności plazmidu przez wysiewanie replik i tożsamość plazmidu (trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie).

b) Fermentacja

W etapie fermentacji szczep E. coli DH5 alfa oporny na faga T1 (Gibco RBL, UK) stransformowany plazmidem NNV-2-Nef (WCB) najpierw hodowano na szalce. Z szalki pojedynczą kolonię zaszczepiano do 100 ml płynnej hodowli wstępnej przed właściwą fermentacją w bioreaktorze fermentacyjnym. Fermentację przeprowadzono w 5 l fermentorze (B. Braun Medical) na zasadzie wsadowej (ang. fed-batch), po czym zebrano komórki. W skład jednego litra podłoża hodowlanego wchodziło 7 g ekstraktu drożdżowego, 8 g peptonu z mączki sojowej, 10 g NaCl, 80 ml wody do zastrzyków (WFI), 1N NaOH, pH 7,0, kanamycyna 50 mg/ml (Sigma), silikonowy środek przeciwko spienianiu (Merck), 1M K2PO4 (BioWhittaker).

Na początku fermentacji pobrano 1 ml próbkę poprzez rurkę do zbierania materiału w celu wyznaczenia wstępnej gęstości komórek (OD600). Prekulturę użyto do zaszczepienia podłoża fermentacyjnego. Podczas fermentacji dostarczano do reaktora za pomocą pomp świeże podłoże hodowlane i 1 M bufor fosforanu potasu, pH 6,5-7,3. Dodawanie podłoża pozwalało na uzupełnienie niezbędnych składników odżywczych przed ich wyczerpaniem, zaś bufor fosforanowy utrzymywał stałe pH. Po upływie około 5 godzin fermentacji i na końcu procesu fermentacji (po około 10 godzinach fermentacji) pobierano próbki 1 ml jak powyżej i mierzono gęstość komórek. Po fermentacji podłoże hodowlane zwirowano (10 000 rpm, 30 minut, +4°C) i odzyskano osad bakterii (50-60 g).

c) Oczyszczanie Metodologia wykorzystana w oczyszczaniu DNA została oparta na technologii QIAGEN w skali procesowej (Qiagen Plasmid Purification Handbook 11/98). NN2-Nef oczyszczono przy zastosowaniu następujących etapów:

Zawiesić osad bakterii w buforze do zawieszania (100-150 ml, temp. pokojowa)

Lizować buforem do lizy (100-150 ml, 5 minut, temp. pokojowa)

Neutralizować buforami do neutralizacji (100-150 ml,+4°C)

Inkubować (30 minut, +4°C)

Przefiltrować nadsącz (0,22 mikrometra)

Usunąć endotoksyny buforem do usuwania endotoksyn (60-90 ml)

Zrównoważyć kolumnę Ultrapure buforem do równoważenia (350 ml, przepływ 10 ml/min)

Nanieść lizat na kolumnę (przepływ 4-6 ml/min)

Przepłukać kolumnę buforem do płukania (31, przez noc, przepływ 4-6 ml/min)

Wyeluować DNA plazmidu buforem do elucji (400ml, przepływ 3,1 ml/min)

Przefiltrować nadsącz (0,22 mikrometra)

Wytrącić DNA izopropanolem

Zwirować (20000 g, 30 minut, 4°C)

Oczyszczony DNA plazmidowy

Użyte do oczyszczania bufory były następujące. Bufor do zawieszania zawierał 50 mM Tris-CI, pH 8,0, plus RNaza A (50 mg); bufor do lizy to 200 mM NaOH; bufor to neutralizacji to 3 M octan potasu, pH 5,5; bufor do usuwania endotoksyn zawierał 750 mM NaCl, 10% Triton X100; 50 mM MOPS, pH 7,0; bufor do równoważenia zawierał 750 mM NaCl, 50 mM MOPS, pH 7,0;bufor do płukania zawierał 1 M NaCl, 50 mM MOPS, pH 7,0, 15% izopropanol; zaś bufor do elucji zawierał 1,6 M NaCl, 50 mM MOPS, pH 7,0, 15% izopropanol.

d) Aseptyczne napełnianie

Oczyszczony DNA stanowiący ostateczny produkt rozpuszczono w 0,9% jałowej soli fizjologicznej do końcowego stężenia 1 mg/ml i tego samego dnia jałowo przefiltrowano (0,22 mikrometra). Oczyszczony produkt rozporcjowano ręcznie (objętość porcji 0,5 ml) w szklanych ampułkach Schott Type 1 przy pomocy wyjałowionej parą Finnpipette® i jałowych wolnych od endotoksyn końcówek. Ampułki napełnione szczepionką NN2-Nef natychmiast zamknięto, oznakowano i zapakowano zgodnie z konkretną Standardową Procedurą Operacyjną (SOP).

PL 206 097 B1

2. Podawanie szczepionki doświadczalnej pacjentom

Dziesięcioro zakażonych wirusem HIV-1 pacjentów przechodzących wysoce aktywną terapię antyretrowirusową (HAART) immunizowano doświadczalną szczepionką DNA NN2-Nef wyrażającą gen Nef HIV-1 (Clade B). W celu immunizacji podano dwie domięśniowe iniekcje w mięsień pośladkowy w odstępie dwóch tygodni. Dawki wynosiły 1 i 20 mikrogramów/iniekcję. Próbki krwi pobrano w -4, 0, 1, 2, 4, 8 i 12 tygodniu. Próbki przeanalizowano pod kątem odpowiedzi odpornościowej humoralnej (ELISA, Western biot) i komórkowej (podklasy komórek T, proliferacja komórek T, ELISPOT, ekspresja cytokin, cytokiny wewnątrzkomórkowa).

U każdego z pacjentów uczestniczących w badaniu przeprowadzono badanie kliniczne. Badanie kliniczne obejmowało wywiad z pacjentem i oznaczenie wagi ciała. Funkcje serca i płuc sprawdzono przez osłuchiwanie i opukiwanie, zapisano ciśnienie krwi i częstość akcji serca. Powiększenie węzłów chłonnych, wątroby i tarczycy zbadano przez obmacywanie.

Przy każdej wizycie przeprowadzono badania laboratoryjne dla zbadania bezpieczeństwa szczepionki. Badania te obejmowały:

Hematologia: obliczono liczbę czerwonych krwinek, hemoglobinę, całkowitą i różnicową WBC (liczbę białych krwinek), liczbę płytek krwi, podstawowy czas protrombinowy i czas kaolinowokefalinowy, średnią objętość erytrocytu i zawartość hemoglobiny.

Immunologia: przeciwciała jądrowe i ds-DNA.

Chemia surowicy: całkowita bilirubina, alkaliczna fosfataza, SGOT/SLT lub SGPT/ALT, kreatynina surowicy, elektroforeza białek, całkowity cholesterol w surowicy, trój glicerydy, glukoza (podstawowa), sód, potas i wapń.

Analiza moczu: białko (na pasku), glukoza, ketony, krew utajona, barwniki żółciowe, pH, ciężar właściwy, i mikroskopowe badanie osadu moczowego (RBC, WBC, komórki nabłonkowe, bakterie, wałeczki) gdy test paskowy wykaże jedną lub więcej nieprawidłowych wartości.

Obciążenie wirusem: Wzrost większy niż jeden rząd wielkości powinien pociągnąć za sobą potwierdzającą analizę obciążenia wirusami po dwóch tygodniach.

Żaden z pacjentów nie doświadczył subiektywnych ani obiektywnych szkodliwych reakcji na szczepienie. Nie zaobserwowano szkodliwych nieprawidłowości testów laboratoryjnych w zestawie badań chemii klinicznej (szczegóły - patrz materiały i metody) wielokrotnie wykonywanych podczas szczepienia.

Przeprowadzono następujące badania immunologiczne:

Oznaczenie proliferacji limfocytów (LPA)

Mononuklocyty krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z heparynowanej krwi żylnej przez wirowanie w gradiencie Ficoll-Hypaque (Pharmacia) i zawieszono przy gęstości 1x10⁶ w podłożu RPMI 1640 (Gibco) uzupełnionym 5% połączoną inaktywowaną termicznie surowicą AB+ (Sigma), antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 gg/ml streptomycyny; Gibco) oraz L-glutaminą (podłoże pełne, CM). Następnie rozpoczęto hodowle w czterech powtórzeniach w płaskodennych płytkach mikrotitracyjnych (1x10⁵ PBMC/studzienkę) i inkubowano komórki przez 6 dni w obecności lub nieobecności następujących bodźców: rNef (0,2, 1 i 5 gg/ml), GST (0,2, 1 i 5 gg/ml), oczyszczonej białkowej pochodnej tuberkuliny (PPD, 12,5 gg/ml; Statens Seruminstitut), antygenu Candida albicans (20 gg/ml; Greer Laboratories) oraz fitohemaglutyniny (PHA; 5 gg/ml; Life Technologies). Na ostatnie 6 h okresu inkubacji dodano do hodowli ³H-tymidynę (1 gCi/studzienkę; Amersham), zebrano komórki na filtry z włókna szklanego i zmierzono włączoną radioaktywność w liczniku γ. Wyniki przedstawiono jako delta cpm (cpm w obecności antygenu - cpm bez antygenu) lub jako wskaźnik stymulacji (cpm w obecności antygenu/cpm bez antygenu).

Wyniki przedstawiono na Figurach 26 i 27. Żaden ze szczepionych nie wykazał znaczącej odpowiedzi proliferatywnej komórek T na antygen testowy, HIV-1 Nef, przed szczepieniem. Natomiast 2 z 5 szczepionych w grupie, która otrzymywała 1 mikrogramową dawkę szczepionki doświadczalnej (pacjenci 1 i 3) (Rysunek 26) i 2 z 5 w grupie otrzymującej 20 mikrogramamów szczepionki doświadczalnej (pacjenci 9 i 10) (Figura 27) wykazało silną odpowiedź proliferatywną komórek T po pierwszym szczepieniu. Po drugim szczepieniu jeden (pacjent 2) szczepiony odpowiedział w grupie 1 mikrograma.

Oznaczenia IFN-γ

Rodzaj odpowiedzi immunologicznej (Th1/Th2) zaindukowanej przez szczepionkę zbadano mierząc interferon-gamma (IFN-γ) uwolniony w nadsączu sześciodniowej hodowli po stymulacji PBMC antygenem (rNef, rGST, PPD) lub miogenem (PHA). Do oznaczeń wykorzystano handlowe zestawy ELISA (R&D Quantikine). W oznaczeniu wykorzystano technikę ilościowego imunoenzymatycznego

PL 206 097 B1 testu kanapkowego, gdzie przeciwciałem monoklonalnym swoistym wobec IFN-γ opłaszczono mikropłytkę. Standardy i próbki odpipetowano do studzienek, gdzie cały obecny IFN-γ jest związany przez unieruchomione przeciwciało. Po odpłukaniu niezwiązanych substancji, do studzienek dodaje się związane z enzymem przeciwciało poliklonalne swoiste wobec IFN-γ. Po płukaniu usuwającym niezwiązany odczynnik przeciwciało-enzym, do studzienek dodaje się roztworu substratu i wytwarza się zabarwienie proporcjonalnie do ilości cytokiny związanej w pierwszym etapie. Rozwijanie zabarwienia zostaje zatrzymane a jego intensywność zmierzona.

Dane odpowiedzi IFN-γ pacjenta #1 przedstawiono na Rysunku 28. Jak widać, szczepiony odpowiedział na antygen rNef przez wyraźną odpowiedź IFN-γ korelującą z proliferacją komórek T, co wskazuje na to, że odpowiedź obserwowana u szczepionego jest typu Th1.

Zakażenie HIV-1 charakteryzuje się niską komórkową odpowiedzią immunologiczną przeciwko wszystkim białkom HIV lub zupełnym jej brakiem. Wyniki wykazują, że możliwe jest zaindukowanie silnej odpowiedzi CMI (komórkowej) u takich pacjentów przy pomocy wyjątkowo niskich dawek szczepionki DNA NN2-Nef. Zastosowane dawki były minimalne w porównaniu z tym, co ogólnie jest wymagane dla szczepionek DNA. Tak, przykładowo, Merch ogłosił niedawno pozytywne wyniki z ich doświadczalną szczepionką, lecz wymagane dawki wynosiły od 1000 do 5000 mikrogramów (raport IAVI, 2002).

P r z y k ł a d 12

KONSTRUKCJA PLAZMIDU WYRAŻAJĄCEGO BIAŁKO EBNA-1 WIRUSA EPSTEINA-BARRA (EBV) I ZAWIERAJĄCEGO 20 MIEJSC WIĄZANIA EBNA-1 (ELEMENT FR)

W celu skonstruowania plazmidu wyrażającego białko EBNA-1 wirusa Epsteina-Barra i zawierającego 20 miejsc wiązania EBNA-1 (element FR) najpierw zastąpiono miejsca wiązania E2 BPV-1 miejscami wiązania EBNA-1 EBV (ori P bez elementu DS). Plazmid FRE2d1EGFP (Figura 29) skonstruowano izolując fragment DNA Xmil(AccI)/Eco32l(EcoRV) (stępiony enzymem Klenowa) z plazmidu pEBO LPP (Figura 29A) (fragment zawiera 20 miejsc wiązania EBNA-1) i wstawiając go przez ligację tępych końców w miejsce Spel/Nhel s6E2dEGFP (Figura 29B) (stępionego enzymem Klenowa). Skonstruowany plazmid FRE2d1EGFP (Figura 29) wykorzystano w dalszych doświadczeniach jako kontrolę negatywną. Zawiera miejsca wiązania EBNA-1 zamiast miejsc wiązania E2 10 BPV1, wyrażając E2, lecz nie EBNA-1.

Następnie sekwencja kodująca białko E2 BPV-1 w plazmidzie FRE2d1EGFP została zastąpiona sekwencją kodującą białko EBNA-1 EBV w następujący sposób. Fragment Xmil(AccI)/EcoRI pEBO LPP wyizolowano, stępiono enzymem Klenowa i wstawiono w miejsce Xbal/Xbal plazmidu FRE2d1EGFP (stępionego enzymem Klenowa). Wektor FRE2d1EGFP namnożono uprzednio w szczepie Escherichia coli DH5a pozbawionym metylacji Dam^-, gdyż jedno z miejsc Xbal jest wrażliwe na metylację. Skonstruowany plazmid FREBNAd1EGFP (Figura 30) wyraża białko EBNA-1 i zawiera 20 miejsc wiązania EBNA-1.

Dla ekspresji komórki Jurkat, zarodkowej linii komórek nerki 293 (ATCC CRL 1573) oraz mysiej linii fibroblastowej 2T6 (ATCC CCL 96) utrzymywano w podłożu Dulbecco z modyfikacją Iscove'a (IMDM) uzupełnionym 10% zarodkową surowicą cielęcą (FCS). Cztery miliony komórek (Jurkat), 75% konfluentne szalki (293) lub 1/4 75% konfluentnych szalek (3T6) wykorzystywano do każdej transfekcji, którą przeprowadzano przez elektroporację w następujący sposób. Komórki zbierano przez wirowanie (1000 rpm, 5 min w 20°C, Jouan CR 422) i zawieszano w pełnym podłożu zawierającym 5 mM bufor Na-BES (pH 7,5). 250 pl zawiesiny komórek mieszano z 50 pg DNA nośnikowego (DNA spermy łososia) i 1 pg (w przypadku Jurkat i 2T6) lub 5 pg (w przypadku 293) DNA plazmidowego i elektroporowano przy 200 V i 1000 pF dla komórek Jurkat, 170 V i 950 pF dla komórek 293 i 230 V i 975 pF dla komórek 3T6. Stransfekowane komórki Jurkat wysiewano na 6 cm szalki z 5 ml podłoża; 1/3 stransfekowanych komórek 293 i 3T6 wysiewano na 6 cm szalki z 5 ml podłoża a 2/3 komórek wysiewano na 10 cm szalki z 10 ml podłoża.

Stransfekowane komórki analizowano pod kątem ekspresji białka d1EGFP (zmodyfikowane ulepszone zielone białko fluoryzujące). Wszystkie skonstruowane plazmidy wyrażały białko d1EGFP, które wykrywano mierząc fluorescencję przy zastosowaniu cytometru przepływowego. Ze względu na krótki czas półtrwania białka d1EGFP, nie ulega ono akumulacji, a ekspresja białka odzwierciedla obecność aktywnych transkrypcyjnie plazmidów w komórkach. Zastosowano system Becton-Dickinson FACSCalibur. Objętość zawiesiny komórek Jurkat mierzono przed każdym punktem czasowym (w przybliżeniu po każdej co 24 godzinie), i gdy objętość ta wynosiła mniej niż 5 ml dodawano brakującą objętość podłoża. W zależności od gęstości zawiesiny komórek, odpowiednią objętość pobierano

PL 206 097 B1 do pomiaru (1 lub 2 ml) i zastępowano tą samą objętością podłoża. Uwzględniono to później przy obliczaniu rozcieńczenia.

W pierwszym punkcie czasowym komórki 293 z 6 cm szalki zawieszono w 5 ml podłoża do pomiaru. W każdym następnym punkcie czasowym połowę komórek pobierano z 10 cm szalki, zawieszano w 5 ml podłoża i następnie mierzono. W pierwszym punkcie czasowym komórki 3T6 z 6 cm szalki zawieszono w 1 ml trypsyny, którą następnie zinaktywowano 100 gl FCS. W każdym następnym punkcie czasowym komórki z 10 cm szalki zawieszano w 2 ml trypsyny. 1 ml tej zawiesiny traktowano tak, jak opisano powyżej. Do reszty zawiesiny dodawano 9 ml podłoża. Analizowane komórki wyjmowano z inkubatora tuż przed pomiarem. Odpowiednią szybkość przepływu (500-1000 komórek/sek) wyznaczano przed każdym punktem czasowym przy zastosowaniu jako kontroli komórek stransfekowanych wyłącznie DNA nośnikowym. Trzech różnych parametrów użyto dla zmierzenia wielkości, struktury powierzchni i fluorescencji komórek.

Wyniki przedstawiono w postaci wykresów na Rysunku 31. Komórki stransfekowane wyłącznie DNA nośnikowym wykorzystano do pomiaru fluorescencji własnej linii komórkowej. 1% tej własnej fluorescencji traktowano jako fluorescencję tła i odejmowano później od fluorescencji d1EGFP. Uzyskane dane przeanalizowano przy zastosowaniu programu Microsoft Excel.

Odsetek komórek wyrażających d1EGFP obliczono przy pomocy komórek stransfekowanych jedynie nośnikiem jako kontroli negatywnej fluorescencji tła. Jak przedstawiono to na Rysunku 33, dwa wektory utrzymywały się w komórkach z różnymi kinetykami.

Liczba komórek wyrażających d1EGFP została obliczona biorąc pod uwagę rozcieńczenia, przy zastosowaniu komórek stransfekowanych samym nośnikiem jako negatywnej kontroli fluorescencji tła. Jak widać na rysunku 53, plazmidy wyrażające EBNA-1 i niosące specyficzne dla EBNA-1 multimeryczne miejsca wiążące są bardzo wydajnie utrzymywane w stransfekowanych komórkach. W dniu 1 po transfekcji około 8 x 10⁴ komórek wyrażało EGFP. W dniu 8, w przypadku wektora utrzymywania (FREBNAd1EGFP), liczba komórek pozytywnych pod względem plazmidu i wyrażających d1EGFP wzrosła dziesięciokrotnie do 8 x 10⁵. Dla plazmidu pozbawionego ekspresji EBNA-1 (FRE2d1EGFP) lub nie posiadającego miejsc wiązania EBNA-1, liczba komórek pozytywnych pod względem plazmidu była utrzymana, lub w wielu przypadkach zmniejszona. Fakt ten odzwierciedla mechanizm segregacji/rozdziału wirusa Epsteina-Barra. Funkcja utrzymywania i segregacji przez EBNA1 i miejsca wiązania EBNA-1 dostarcza funkcji utrzymywania plazmidowi jeżeli EBNA-1 jest wyrażany a plazmid niesie miejsca wiązania EBNA-1. Ten sam mechanizm i te same składniki dostarczają w istocie funkcji segregacji wirusowi Epsteina-Barra w ukrytej fazie cyklu życiowego.

Podobne wyniki uzyskano też w ludzkiej zarodkowej linii komórkowej 293 i w mysiej linii komórkowej 3T6 (Figura 34). Jako kontroli utrzymywania dla komórek 293 i 3T6 użyto odpowiednio s6HPV11 i 2wtFS.

P r z y k ł a d 13

IMMUNOGENNOŚĆ WEKTORÓW GTU-WIELOGENOWYCH.

Immunogenność sześciu różnych wielogenowych konstruktów szczepionkowych przygotowanych w Przykładzie 12, tzn. wektorów GTU-1-RNT, GTU-1-TRN, GTU-1-RNT-CTL, GTU-1-TRN-CTL, GTU-1-TRN-optgag-CTL, i GTU-1-TRN-CTL-optgag zbadano u myszy. Wektorami stransformowano komórki TOP10 lub DH5alfa i przygotowano preparaty MegaPrep z zastosowaniem handlowych kolumn Qiagen. Endotoksyny usunięto żelem do usuwania endotoksyn firmy Pierce.

Badane wektory opłaszczono na 1 gm cząstkach złota zgodnie z zaleceniami producenta (BioRad) z drobnymi modyfikacjami. Myszy Balb/c immunizowano urządzeniem Helios Gene Gun przy ciśnieniu 400 psi i 0,5 mg złota/ładunek. Myszy immunizowano trzykrotnie w tygodniu 0, 1 i 3. Myszy poświęcono dwa tygodnie po ostatniej immunizacji.

Myszy podzielono na sześć grup doświadczalnych (5 myszy/grupę), które otrzymały 3 x 1 gg DNA następująco:

Grupa 1. GTU-1-RNT

Grupa 2. GTU-1-TRN

Grupa 3. GTU-1-RNT-CTL

Grupa 4. GTU-1-TRN-CTL

Grupa 5. GTU-1-TRN-optgag-CTL

Grupa 6. GTU-1-TRN-CTL-optgag

Grupa 7. Myszy kontrolne immunizowane pustymi cząstkami złota niezaładowanymi DNA.

PL 206 097 B1

Odpowiedź humoralną śledzono na podstawie próbek krwi z ogona z każdej myszy. Pierwszą próbkę preimmunizacyjną pobrano od myszy pod znieczuleniem przed podaniem pierwszej immunizacji. Drugą próbkę pobrano od myszy pod znieczuleniem przed podaniem trzeciej immunizacji. Przy poświęceniu całość próbki krwi wykorzystano do zliczania białych komórek krwi, zaś surowicę zebrano do badania odporności humoralnej.

Próbki krwi zbadano pod kątem zawartości przeciwciał przy pomocy testu ELISA przy zastosowaniu standardowej procedury. Płytki Nunc Maxi Sorp pokryto 100 ng białka Nef, Rev, Tat, Gag, CTL lub E2, zablokowano i dodano surowice w rozcieńczeniu 1:100 w dwóch powtórzeniach do studzienek do inkubacji przez noc. Po odpłukaniu, płytki inkubowano przez 2 godziny z rozcieńczonym (1:500) przeciwciałem drugorzędowym, IgG anty-mysz koniugowanym z peroksydazą (DAKO).

Intensywność zabarwienia wytworzoną z substratu (kwas 2,2'-azynowo-bis(3-etylobenztiazolino-6-sulfonowy) (ABTS) w buforze fosforanowo-cytrynianowym zmierzono przy długości fali 405 nm przy użyciu czytnika płytek Labsystems ELISA.

Wszystkie wektory zaindukowały przeciwciała przeciwko Nef u wszystkich myszy, podczas gdy u żadnej myszy nie wykazano przeciwciał przeciwko E2, CTL lub Rev (Figury 35, 36 i Tabela 4). Niektóre spośród myszy immunizowanych GTU-1-RNT lub GTU-1-RNT-CTL wytworzyły także przeciwciała przeciwko Tat (Figura 36 i Tabela 4). Ponadto, myszy immunizowane wektorami zawierającymi sekwencję optgag wytworzyły także przeciwciała przeciwko Gag, lecz konstrukt GTU-1-TRN-optgagCTL lepiej indukował przeciwciała niż konstrukt GTU-1-TRN-CTL-optgag (Figura 37 i Tabela 4). Zaindukowane przeciwciała należały głównie do klasy IgGl, co wskazuje na odpowiedź typu Th2, zwykle obserwowaną przy immunizacji biolistycznej. Oznaczenia przeciwciał przedstawione poniżej zostały przeprowadzone na surowicach zebranych po poświęceniu myszy.

Wyniki wykazują, że konstrukt wielogenowy, wyrażający kilka genów HIV w postaci białka fuzyjnego może zaindukować odpowiedź odpornościową przeciwko większości produktów genu. Orientacja i kolejność genów w układzie wielogenowym i odpowiednich białek w białku fuzyjnym ma jednak dramatyczny wpływ na wyniki. Odpowiedź przeciwko Tat była zatem obserwowana jedynie wówczas, gdy gen Tat był umieszczony wewnątrz białka fuzyjnego (wektory z motywem RNT), nie zaś gdy gen Tat stanowił N-koniec białka (wektory z motywem TRN). Odpowiedź na białko Gag była obserwowana tylko wówczas, gdy Gag był umieszczony przed CTL zawierającym ciąg epitopów Th i CTL.

T a b e l a 4

Wyniki testów ELISA u myszy Immuno III A (średnie OD z pięciu myszy)
Immunogen	Grupa nr	Nef (własne białko)	Tat	Rev	Gag	CTL
GTU-1-RNT	1	2,194	1,391	0,31	0,155	0,36
GTU-1-TRN	2	1,849	0,197	0,252	0,302	0,38
GTU-1-RNT-CTL	3	1,922	0,555	0,295	0,154	0,439
GTU-1 -TRN-CTL	4	1,677	0,211	0,298	0,14	0,425
GTU-1-TRN-optgag- -CTL	5	1,722	0,182	0,24	0,667	0,381
GTU-1-TRN-CTL- -optgag	6	0,547	0,225	0,322	0,228	0,43
Kontrole	7	0,316	0,226	0,282	0,16	0,405
Immunogen	Grupa	Procent odpowiedzi Nef	odpowiedź Tat	odpowiedź Rev	odpowiedź Gag	odpowiedź CTL
1	2	3	4	5	6	7
GTU-1-RNT	1	100	80	0	0	0
GTU-1-TRN	2	100	0	0	20	0

PL 206 097 B1 ciąg dalszy tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7
GTU-1-RNT-CTL	3	100	40	0	0	0
GTU-1-TRN-CTL	4	100	0	0	0	0
GTU-1-TRN-optgag- -CTL	5	80	0	0	60	0
GTU-1-TRN-CTL- -optgag	6	100	0	0	20	0

P r z y k ł a d 14

EKSPRESJA HYBRYDOWEGO BIAŁKA WYRAŻAJĄCEGO NEF, REV I TAT W RÓŻNYCH

KOMBINACJACH (MULTIREG)

Dla wytworzenia wielogenowych wektorów HIV wykorzystano jako szkielet wektor GTU-1 z polilinkerem do klonowania (Figura 38A). Kompletne sekwencje kodujące Nef, Rev i Tat namnożono przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) i połączono w różnych układach tworząc wieloregulatorowe (multireg) ramki odczytu kodujące antygeny (Nef-Tat-Rev, Tat-Rev-Nef, Rev-Tat-Nef, Tat-Nef-Rev i Rev-Nef-Tat; sekwencje nr id. odpowiednio od 1 do 5). Sekwencje te wklonowano w miejsca Bsp119I i Notl wektora GTU-1.

Podobnie, wektory GTU-2 i GTU-3 wyrażające białko Nef (Figura 38B i 38C; patrz też Figura 6B NNV-2wt) zostały też wykorzystane jako szkielet do wytworzenia wielogenowych wektorów HIV. Dodatkowo, jako platformę jednostki transferu genów (GTU) wykorzystano wektor super6wt wyrażający niestabilne, ulepszone zielone białko fluoryzujące czyli d1EGFP (super6wtd1EGFP; Figura 17 i Figura 38D) oraz plazmid wykorzystujący białko EBNA-1 i jego miejsca wiązania (FREBNAd1EGFP; Figura 38E). Do wektorów kontrolnych „nie-GTU” jako szkielet wykorzystano standardowy wektor oparty na wirusie cytomegalii (CMV) NNV-Rev, wyrażający Rev oraz plazmid zawierający EBNA-1 i E2BS niosący d1EGFP (odpowiednio NNV-Rev i E2BSEBNAd1EGFP; Figury 38G i F).

Dla przygotowania różnych wektorów GTU-2 i GTU-3 (pNRT, pTRN, pRTN, pTNR and pRNT; i p2TRN i p2RNT; i p3RNT, odpowiednio Rysunki 39A-E, 39F-G and 39H) gen Nef w wektorach GTU-2Nef i GTU-3Nef zamieniono na odpowiedni antygen multireg przy wykorzystaniu miejsc Ndel i PagI. Sekwencja liter N(ef), R(ev) i T(at) w nazwie przedstawia pozycje odpowiednich sekwencji kodujących białka w układzie wielogenowym. Przygotowano także dwa wektory zawierające element IRES umieszczony w miejscach Sali albo za sekwencją kodującą multi-antygen, albo E2 (odpowiednio pTRN-iE2-GMCSF i pTRN-iMG-GMCSF; Figury 391 i J). Tę ostatnią sekwencję, która kontroluje translację sekwencji kodującej czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) myszy, wklonowano w pojedyncze miejsce BspTI wprowadzone z IRES.

Dodatkowo skonstruowano zestaw wektorów, w których wykorzystano do budowania poliprotein jedynie immunodominujące części białek regulatorowych, klonując je w miejsca Bsp119l i Notl GTU-1 (pMV1 NTR, pMV2NTR, pMV1N11TR i pMV2N11TR; Figury 40A-D). W przypadku konstruktów pMV2 regiony multi-antygenu pochodzące z różnych białek regulatorowych przedzielone są łącznikami, które mogą być trawione przez proteazy wewnątrzkomórkowe.

Ponadto, przygotowano wektory GTU-1, GTU-2 i GTU-3 wyrażające białka strukturalne kodowane przez gen gag lub sztuczną poliproteinę, złożoną z opisanych wcześniej epitopów CTL. Sekwencje kodujące wklonowano jako strawione Bsp119l i Notl fragmenty PCR w wektor GTU-1 (pCTL = BNmCTL, pdgag = pBNdgag, psynp17/24 = pBNsynp17+24, poptp17/24 = pBNoptp17/24; Figury 41A-D), i przeniesiono we fragmencie Ndel-PacI do GTU-2 (p2mCTL i p2optp17/24; Figury 41E i F) i do GTU-3 (p3mCTL i p3optp17/24; Figury 41 G and H).

Segment kodujący oznaczony CTL (Sekwencja nr id. 10) zawiera fragmenty z regionów pol i env obejmujące wiele zidentyfikowanych wcześniej epitopów CTL. Wykorzystanie kodonów zoptymalizowano tak, by zaangażować wyłącznie kodony często wykorzystywane w komórkach ludzkich. Ta sekwencja kodująca zawiera również dobrze scharakteryzowany mysi epitop CTL wykorzystywany w oznaczeniu siły oraz epitop rozpoznawany przez przeciwciało przeciwko mysiemu CD43. Dołączono także dominujący epitop SIV p27 dla wykorzystania w badaniu siły u makaków.

dgag zawiera skrócone p17 (początek w pozycji 13 aminokwasu)+p24+p2+p7 (wyłączono p1 i p6) (Sekwencja nr id. 11) regionu gag izolatu Han2. synp17/24 (Sekwencja nr id. 12) koduje polipeptyd p17_p24 HIV-1 Han2. Wykorzystanie kodonów zmodyfikowano dla optymalizacji pod kątem

PL 206 097 B1 komórek ludzkich. W ten sposób usunięto też zidentyfikowane uprzednio bogate w AU elementy nadające niestabilność RNA. Region kodujący optp17/24 (Sekwencja nr id. 13) jest bardzo podobny do synp17/24 z wyjątkiem tego, że wprowadzone w nim dwie synonimiczne mutacje nie zmieniają składu białka, lecz usuwają potencjalne miejsce donorowe składania RNA.

Ponadto stworzono zestaw wektorów multi-HIV, które zawierają zarówno antygen multireg, jak i antygeny strukturalne w postaci pojedynczej poliproteiny: pTRN-CTL, pRNT-CTL, pTRN-dgag, pTRN-CTL-dgag, pRNT-CTL-dgag, pTRN-dgag-CTL, pRNT-dgag-CTL, pTRN-optp17/24-CTL, pTRN-CTL-optp17/24 i pRNT-CTL optp17/24; p2TRN-optp17/24-CTL, p2RNT-optp17/24-CTL, p2TRN-CTLopt17/24, p2RNT-CTL-optp17/24, p2TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF i p2RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF; p3TRN-CTL-optp17/24, p3RNTCTL-optp17/24, p3TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF i p3RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF, Rysunki 42A-T.

Do klonowania w pierwszym etapie usunięto kodon STOP z sekwencji kodujących multiantygen regulatorowy. Następnie dodano sekwencje kodujące antygen strukturalny przez klonowanie w miejsce Notl na końcu ramki tak, że miejsce Notl było odtwarzane. Jeżeli dodawano zarówno CTL, jak i gag, wówczas pierwsza sekwencja była pozbawiona kodonu STOP. Ogólnie, klonowanie przeprowadzano w kontekście GTU-1, zaś dla wytworzenia odpowiednich wektorów GTU-2 (p2...) i GTU-3 (p3...) zastępowano gen Nef w plazmidach GTU-2Nef i GTU-3Nef przy wykorzystaniu miejsc Ndel i PagI. Antygen RNToptp17/24-CTL zbudowano jednak bezpośrednio w wektorze GTU-2.

Multi-antygen HIV wklonowano w wektory super6wtd1EGFP i FREBNAd1EGFP w miejsce dlEGFP przy wykorzystaniu miejsc Eco105I i Notl (super6wt-RNT-CTL-optp17/24 i FREBNA-RNT-CTL-optp17/24; odpowiednio Rysunki 43V i 42 U). Tam, gdzie to zaznaczono, IRES i mysi mGM-CSF wklonowano w wektory GTU-2 i GTU-3 za sekwencją kodującą E2 w miejsca Mph1103l i Eco91I z pTRN-iE2-mGMCSF (wycięte przy pomocy tych samych restryktaz).

Wreszcie, wektor kontrolny „nie-GTU” E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24 (Figura 42W) dla systemu wykorzystującego EBNA-1 (zawiera kasetę ekspresyjną EBNA-1 z miejscami wiązania E2) przygotowano tak samo, jak FREBNARNT-CTL-optp17/24. Standardowy wektor CMV pCMV-RNT-CTL-optp17/24 wyrażający multi-antygen HIV (Rysunek 42D) przygotowano klonując fragment kodujący multi-HIV z odpowiedniego wektora GTU-1 przy wykorzystaniu miejsc Ndel i PagI.

P r z y k ł a d 15

WŁAŚCIWOŚCI EKSPRESJI ANTYGENÓW MULTIREG NIOSĄCYCH JEDYNIE IMMUNODOMINUJĄCE REGIONY BIAŁEK REGULATOROWYCH.

1. Lokalizacja wewnątrzkomórkowa antygenów MultiREG

Lokalizację wewnątrzkomórkową antygenów MultiREG wyrażanych przez wektory według wynalazku zbadano przez immunofluorescencję in situ w komórkach RD przy wykorzystaniu przeciwciał monoklonalnych przeciwko białkom Nef, Rev i Tat zasadniczo tak, jak opisano to w Przykładzie 4. Wyniki podsumowano w Tabeli 5 i zilustrowano na Figurze 45. Wszystkie antygeny złożone z kompletnych białek Nef, Rev i Tat wykazywały wyłącznie lokalizację w cytoplazmie. Nieprawidłowe białko, wstępnie opisane jako N(ef)T(at)R(ev), które zawiera przesunięcie ramki odczytu przed sekwencją Rev wykazywało wyłącznie lokalizację jądrową. Antygeny MultiREG niosące skrócone sekwencje białek regulatorowych były zlokalizowane w cytoplazmie. W tych przypadkach często obserwowano wyodrębnione struktury przypominające ciała inkluzyjne. To samo miało miejsce przy wektorach niosących miejsca cięcia przez proteazy wyrażane z wektorów pMV2. W tych przypadkach wykrywano jednak także białka w jądrze (Figura 45).

T a b e l a 5. Lokalizacja wewnątrzkomórkowa antygenów multireg

Konstrukt	anty-Nef	anty-Rev	anty-Tat
pusty GTU-1	negatywne	negatywne	negatywne
pTRN	silne barwienie w cytoplazmie	dobre barwienie w cytoplazmie	pozytywne barwienie w cytoplazmie
pNTR	silne barwienie w jądrze, jąderku	negatywne	pozytywne barwienie w jądrze,
pRNT	silne barwienie w cytoplazmie	dobre barwienie w cytoplazmie	dobre barwienie w cytoplazmie
pNRT	silne, cytoplazmatyczne	dobre barwienie w cytoplazmie	dobre barwienie w cytoplazmie

PL 206 097 B1

pRTN	silne, cytoplazmatyczne	dobre barwienie w cytoplazmie	pozytywne barwienie w cytoplazmie
pTNR	silne, cytoplazmatyczne	dobre barwienie w cytoplazmie	dobre barwienie w cytoplazmie
pMV1NTR	silne, cytoplazmatyczne	cytoplazmatyczne + inkluzje	cytoplazmatyczne + inkluzje
pMV1N11TR	silne, cytoplazmatyczne + inkluzje	cytoplazmatyczne + inkluzje	cytoplazmatyczne + inkluzje
pMV2NTR	inkluzje w jądrach i cytoplazmie	inkluzje w jądrach i cytoplazmie	inkluzje w jądrach i cytoplazmie
pMV2N11TR	tylko inkluzje w jądrach i cytoplazmie	tylko inkluzje w jądrach i cytoplazmie	tylko inkluzje w jądrach i cytoplazmie

Zbadano także lokalizację wewnątrzkomórkową dgag i p17+p24 w komórkach RD przez immunofluorescencję z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko p24. Zgodnie z wynikami analizy Western w komórkach Jurkat, nie dało się wykryć dgag. Białko p17/24 wykazywało jednak lokalizację w błonach komórkowych (Figura 45). Lokalizacji CTL nie analizowano ponieważ odpowiednie przeciwciało nie było dostępne.

P r z y k ł a d 15

ANALIZA WEKTORÓW KODUJĄCYCH ZREKOMBINOWANE ANTYGENY GAG ORAZ EPITOPY CYTOTOKSYCZNYCH KOMÓREK T (CTL) Z POL

EKSPRESJA

Analizę ekspresji wektorów wyrażających sekwencję kodującą CTL lub białka z regionu gag przeprowadzono techniką Western. Jak widać na Figurze 46A i 46B, jasno wykazano w komórkach Cos-7 ekspresję CTL i dgag w postaci białek o przewidywanym rozmiarze (odpowiednio 25kD i 47kD). Kotransfekcja Nef, Rev i Tat znacząco wzmocniła ekspresję białka dgag. Interpretujemy to jako wynik oddziaływania białka REV na ekspresję mRNA GAG. Próbowaliśmy także wyrazić białko dgag z wektora GTU-1 w komórkach Jurkat, nie udało się jednak wykryć żadnego sygnału (Figura 46C). Analiza wykorzystania kodonów wykazała że dzika (wt) sekwencja GAG nie miała optymalnego pod względem funkcjonowania w komórkach ludzkich wykorzystania kodonów. Po zoptymalizowaniu wykorzystania kodonów (konstrukty psynp17/24 i poptp17/24), stwierdzono silną ekspresję białka p17+p24 (40kD) w komórkach Jurkat (Figura 46C i 46D).

LOKALIZACJA WEWNĄTRZKOMÓRKOWA

Dla białek dgag i p17+p24 zbadano także lokalizację wewnątrzkomórkową w komórkach RD przez immunofluorescencję z przeciwciałami Mab przeciwko p24. Podobnie, jak dla wyników analizy Western w komórkach Jurkat, nie dało się wykryć dgag. Białko p17/24 wykazywało lokalizację w błonach komórkowych (Figura 47). Lokalizacji CTL nie analizowano ze względu na brak odpowiedniego przeciwciała.

P r z y k ł a d 16

EKSPRESJA MULTIREG + BIAŁEK STRUKTURALNYCH JAKO ANTYGENU MULTI-HIV

W następnym etapie przeanalizowano ekspresję antygenów MultiHIV, złożonych z normalnego układu wielogenowego razem z białkiem kodowanym przez gag, i/lub multiepitopu CTL w postaci pojedynczego polipeptydu. Na figurze 48 wynik analizy Western przedstawia ekspresję kilku wektorów wyrażających antygeny multiHIV transfekowanych do komórek Cos-7. Wyraźnie widać, że poziomy ekspresji wszystkich multiantygenów regulatorowych + strukturalnych są znacząco niższe niż dla białek RNT lub TRN. Wszystkie badane antygeny MultiHIV migrują w żelu jako odrębne prążki w pobliżu pozycji przewidywanego rozmiaru (73kD dla multireg+CTL; 95kD dla multireg+dgag i 120kD dla multireg+CTL+dgag). Podobnie jak w przypadku RNT i TRN, RNT-CTL migruje wolniej niż TRN-CTL. Także, zarówno w przypadku konstruktów TRN i RNT, kombinacja MultiREG-CTL-dgag wykazywała wyższy poziom ekspresji niż MultiREG-dgag-CTL.

Bardziej szczegółową analizę antygenów multiHIV przeprowadzono w komórkach Jurkat. W tym celu przeanalizowano większość skonstruowanych antygenów MultiHIV (multireg + strukturalne), w tym MultiREG+CTL+optp17.24 (o przewidywanej wielkości 113kD), techniką Western przy wykorzystaniu przeciwciał przeciwko różnym częściom antygenu. Wyniki przedstawione na Figurze 49 są zasadniczo podobne do tych, które omówiono w poprzedniej części dla komórek Cos-7. Jak zaobserwowano to w poprzednich doświadczeniach, multi-antygeny zawierające dgag wyrażają bardzo niskie

PL 206 097 B1 poziomy białka hybrydowego w komórkach Jurkat. Ekspresja z wektora pTRNdgag była na wszystkich filtrach niewykrywalna. W ścieżkach załadowanych materiałem z komórek transfekowanych innymi wektorami ekspresyjnymi antygenów zawierających dgag, jedynie na filtrze hybrydyzowanym z Mab Nef wykryto bardzo słabe sygnały w pozycji o przewidywanym rozmiarze. W przeciwieństwie do tego, gdy część dgag zastąpiono p17/24 optymalizowanym pod względem wykorzystania kodonów, zaobserwowano wzrost poziomu ekspresji. Ponieważ do dalszej analizy wstępnie wybrano TRN-CTL-optp17/24 i RNT-optp17/24, ekspresję antygenów przeanalizowano ze wszystkich wektorów GTU zawierających te kasety ekspresyjne. Przeanalizowano także ekspresję białka E2 z tych plazmidów. Wyniki przedstawiono na Rysunku 50. Nie ma znacznych różnic poziomów ekspresji zarówno multiantygenu, jak i E2 pomiędzy tymi wektorami. Obecność w plazmidzie elementu IRES i mysiego genu GM-CSF, podlegających translacji z tego samego mRNA, co E2 nie ma znaczącego wpływu na poziom ekspresji E2.

P r z y k ł a d 17

UTRZYMYWANIE SIĘ EKSPRESJI ANTYGENU

Utrzymywanie się plazmidu w populacji dzielących się komórek wykazano przy zastosowaniu zielonego białka fluoryzującego oraz Nef w charakterze znaczników. Zbadano też utrzymywanie się ekspresji antygenu RNT-CTL-optp17/24 wytwarzanego z różnych wektorów GTU i nie-GTU. Konkretnie, wektory GTU-1 (p RNT-CTL-optp17/24), GTU-2 (p2 RNT-CTL-optp17/24), GTU-3 (p3 RNT-CTL-optp17/24), super6wt (super6wt-RNT-CTL-optp17/24) wszystkie wykorzystują białko E2 i jego miejsce wiązania dla aktywności utrzymywania plazmidu. Do tego doświadczenia włączono też EBNA-1 i wykorzystujący jego miejsca wiązania wektor FREBNA-RNT-CTL-optp17/24. Jako kontrolę wykorzystano plazmid „nie-GTU” zawierający mieszaną parę kasety ekspresyjnej EBNA-1 razem z miejscami wiązania E2 (E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24. Wykorzystano również standardowy wektor ekspresyjny CMV pCMV-RNT-CTL-optp17/24.

Komórki Jurkat transfekowano równomolarnymi ilościami plazmidów i badano ekspresję antygenu w 2 i 5 dni po transfekcji przy zastosowaniu monoklonalnych przeciwciał anty-Nef. Jako negatywną kontrolę zastosowano transfekcję samym DNA nośnikowym. Wyniki przedstawiono na Figurze 51.

Jak widać na Figurze 51, ekspresja jest wykrywalna jedynie z wektorów GTU w drugim punkcie czasowym. Ekspresja antygenu z FREBNA-RNT-CTL-optp17/24 w obu punktach czasowych była niższa, gdyż w przeciwieństwie do E2, EBNA-1 nie ma zdolności aktywowania transkrypcji.

Zbadano także lokalizację wewnątrzkomórkową poliprotein multireg+strukturalne przez analizę immunofluorescencji in situ w komórkach RD zasadniczo tak, jak opisano to w Przykładzie 4. Wyniki przedstawiono na Figurze 52.

We wszystkich przypadkach przy zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych anty-Nef albo antyp24 wykryto jedynie lokalizację w cytoplazmie. Zgodnie z danymi uzyskanymi techniką Western, poziom ekspresji białek zawierających optp17/24 był znacznie silniejszy niż dla antygenów zawierających fragment dgag.

Wszystkie cytowane tu referencje są niniejszym włączone przez odniesienie w całości i dla wszystkich celów w tym samym zakresie, tak jak gdyby każda indywidualna publikacja, lub patent, lub zgłoszenie patentowe, były konkretnie i indywidualnie wskazywane jako włączone przez odniesienie w całości dla wszystkich celów.

Wiele modyfikacji i odmian niniejszego wynalazku można poczynić bez odejścia od jego ducha i zakresu, co będzie oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. Konkretne opisywane tu wykonania są przedstawione wyłącznie w charakterze przykładów, a wynalazek ma być ograniczony jedynie warunkami dołączonych zastrzeżeń wraz z pełnym zakresem równoważników, do których takie zastrzeżenia upoważniają.

PL 206 097 B1

LISTA SEKWENCJI <110> FIT Biotech Oyj Pic <12O> Nowe wektory ekspresyjne i ich zastosowania <130» 1X041-006-228 (2010149) <140» To be aseigned <141» 2002-05-03 <150» FI 20010922 <151» 2001-05-03 <160» 52 <170» Patent U <210» 1 <211» 1260 <212» DNA <213»

Sztuczna sekwencja <220» <223» Białko hybrydowe złożone z Nef-Tat-Rev (NTR) <400» 1 atggtgggca agtggtcaaa atgtagtgga tggcctactg taagggaaag aatgaaacaa 60 gctgagcctg agccagcagc agatggggtg ggagcagcat ctcgagacct ggaaaaacat 120 ggagcaatca caagtagcaa tacagcaact aataacgctg cttgtgcctg gctagaagca 180 caagaggaag aggaagtggg ttttccagtc agacctcagg tacctttaag accaatgact 240 tacaagggag ctttagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggtta 300 atttactccc caaaaagaca agagatcctt gatctgtggg tctaccacac acaaggctac 360 ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 420 tggtgcttca agttagtacc agttgaacca gatgaagaag agaacagcag cctgttacac 480 cctgcgagcc tgcatgggac agaggacacg gagagagaag tgttaaagtg gaagtttgac 540 agccatctag catttcatca caaggcccga gagctgcatc cggagtacta caaagactgc 600 actagtgcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt cagactcatc 660 aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca ggcccgaaga 720 aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag tgagcggatt 780 cttagcactt ttctgggacg acctgcggag cctgtgcctc ttcagctacc gccgcttgag 840 agacttactc ttgattgtag cgaagattgt ggaaactctg ggacgcaggg ggtgggaagt 900 cctcaagtat tggtggaatc tcctgcagta ttggagccag gaactaaaga aaagcttgag 960 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag 1260 <210» 2 <211» 1260 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Białko hybrydowe złożone z Tat-Rev-Nef (TRN) <400» 2 atggagccag ccttgtacca aaaggcttag gacagtcaga ccgacaggcc tagatcctag attgctattg gcatctccta ctcatcaagt cgaagaaatc actagagccc taaaaagtgt tggcaggaag ttctctacca gaagaagaag tggaagcatc tgccttcatt aagcggagac aagcaaccct gtggagagag caggaagtca gccaagtttg agcgacgaag cctcccagca agacagaggc gcctaggacc tttcacaaga agctcctcaa acgaggggac agatccgttc

120

180

240

300

PL 206 097 B1 gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc 360 atcaagttte tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga 420 agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg 480 attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt 540 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 600 agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt 660 gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcac&a 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgctga 1260 <210> 3 <211> 1260 <212> DNA .

<213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Białko hybrydowe złożone z Rev-Tat-Nef (RTN) <400> 3 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60 tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat 120 cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt 180 agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct 300 caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgagcca 360 gtagatccta gactagagcc ctggaagcat ccaggaagtc agcctaggac cccttgtaoc 420 aattgctatt gtaaaaagtg ttgccttcat tgccaagttt gtttcacaag aaaaggctta 480 ggcatctcct atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag 540 actcatcaag tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc 600 ccgaagaaat cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgataagctt 660 gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgctga 1260 <210> 4 <211> 1260 <212> DNA <213> (sztuczna sekwencja <220>

<223 > Białko hybrydowe złożone z Tat-Nef-Rev (TNR) <400> 4 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60 ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt Łgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga 120 aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa 180 gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac 240 ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc 300 gatactagtg tgggcaagtg gtcaaaatgt agtggatggc ctactgtaag ggaaagaatg 360

PL 206 097 B1 aaacaagctg agcctgagcc agcagcagat ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa 420 aaacatggag caatcacaag tagcaataca gcaactaata acgctgcttg tgcctggcta 480 gaagc&ca&g aggaagagga agtgggtttt ccagtcagac ctcaggtacc tttaagacca 540 atgacttaca agggagcttt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 600 gggttaattt actccccaaa aagacaagag atccttgatc tgtgggtcta ccacacacaa 660 ggctacttcc ctgattggca gaactacaca ccagggccag gggtcagata tccactgacc 720 tttggatggt gcttcaagtt agtaccagtt gaaccagatg aagaagagaa cagcagcctg 780 ttacaccctg cgagcctgca tgggacagag gacacggaga gagaagtgtt aaagtggaag 640 tttgacagcc atctagcatt tcatcacaag gcccgagagc tgcatccgga gtactacaaa 900 gactgcaagc ttgcaggaag aagcggagae agcgacgaag agctcctcaa gacagtcaga 960 ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac ccgacaggcc 1020 cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc gattagtgag 1080 cggattctta gcacttttet gggacgacct gcggagcctg tgcctcttca gctacegccg 1140 cttgagagac ttactcttga ttgtagcgaa gattgtggaa actctgggac gcagggggtg 1200 ggaagtcctc aagtattggt ggaatctcct gcagtattgg agccaggaac taaagaatag 1260 <210> 5 <211> 1260 <212 > DNA , <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223 > Białko hybrydowe złożone z Rev-Nef-Tat (RNT) <400> 5 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60 tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacagge ccgaagaaat 120 cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt 180 agcacttttc tgggacgacc tgcggageet gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct 300 caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc 360 aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct 420 gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaato 480 acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa 540 gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga 600 gctttagatc ttagccaett tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc 660 ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggctą cttccctgat 720 tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc 780 aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc 840 ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta 900 gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag 960 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag 1260 <210> 6 <211> 1164 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Białko złożone z immunodominujących części Nef-Tat-Rev (NTR) <400> 6 atgggatggc ctactgtaag ggaaagaatg aaacaagctg agcctgagcc agcagcagat 60 ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 120 gcaactaata acgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaagagga agtgggtttt 180 ccagtcagac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca agggagcttt agatcttagc 240 cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggttaattt actccccaaa aagacaagag 300 atccttgatc tgtgggtcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca gaactacaca 360 ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gcttcaagtt agtaccagtt 420

PL 206 097 B1 gaaccagatg aagaagagaa cagcagcctg ttacaccctg cgagcctgca tgggacagag 480 gacacggaga gagaagtgtt aaagtggaag tttgacagcc atctagcatt tcatcacaag 540 gcccgagagc tgcatccgga gtactacaaa gactgcgctc tggccgccgt tgagccagta 600 gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaggacccc ttgtaccaat 660 tgctattgta aaaagtgttg ccttcattgc caagtttgtt tcacaagaaa aggcttaggc 720 atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag cgacgaagag ctcctcaaga cagtcagact 780 catcaagttt ctctaccaaa gcaaccctcc tcccagcaac gaggggaccc gacaggcccg 840 aagaaatccg gaetggccat cctgctgagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc 900 atcaagtttc tcfcaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga 960 agaaafccgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg 1020 attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagoctgtgc ctcttcagct accgccgctt 1080 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat Łgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 1140 agtcctcaag tattggtgga atga 1164 <210> 7 <211> 1173 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Białko złożone z immunodominujących części Nef-Tat-Rev oddzielonych miejscami trawienia proteaz (NTR) ~ <400> 7 atgggatggc ctactgtaag ggaaagaatg aaacaagctg agcctgagcc agcagcagat 60 ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 120 gcaactaata acgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaagagga agtgggtttt 180 ccagtcagac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca agggagcttt agatcttagc 240 cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggttaattt actccccaaa aagacaagag 300 atccttgatc tgtgggtcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca gaactacaca 360 ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gcttcaagtt agtaccagtt 420 gaaccagatg aagaagagaa cagcagcctg ttacaccctg cgagcctgca tgggacagag 480 gacacggaga gagaagtgtt aaagtggaag tttgacagcc atctagcatt tcatcacaag 540 gcccgagagc tgcatccgga gtactacaaa gactgcgctc tggccttcaa gcgggttgag 600 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 660 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 720 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 780 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 840 ggcccgaaga aatccgtacg ggagaagcgg ctgctgagcg acgaagagct cctcaagaca 900 gtcagactca tcaagtttct ctaccaaagc aaccctcctc ccagcaacga ggggacccga 960 caggcccgaa gaaatcgaag aagaaggtgg agagagagac agaggcagat ccgttcgatt 1020 agtgagcgga ttcttagcac ttttctggga cgacctgcgg agcctgtgcc tcttcagcta 1080 ccgccgcttg agagacttac tcttgattgt agcgaagatt gtggaaactc tgggacgcag 1140 ggggtgggaa gtcctcaagt attggtggaa tga 1173 <210> 8 <211> 1161 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Białko złożone z immunodominujących części białek regulatorowych Nef-Tat-Rev począwszy od aal Nef (N11TR) <400> 8 atgtggccta ctgtaaggga aagaatgaaa caagctgagc ctgagccagc agcagatggg 60 gtgggagcag catctcgaga cctggaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca 120 actaataacg ctgcttgtgc ctggctagaa gcacaagagg aagaggaagt gggttttcca 180 gtcagacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg gagctttaga tcttagccac 240 tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ttaatttact ccccaaaaag acaagagatc 300 cttgatctgt gggtctacca cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca 360 gggccagggg tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct tcaagttagt accagttgaa 420 ccagatgaag aagagaacag cagcctgtta caccctgcga gcctgcatgg gacagaggac 480

PL 206 097 B1 acggagagag aagtgttaaa gtggaagttt gacagccato tagcatttca tcacaaggco 540 cgagagctgc atccggagta ctacaaagac tgcgctctgg ccgccgttga gccagtagat 600 cctagactag agccctggaa gcatccagga agtcagccta ggaccccttg taccaattgc 660 tattgtaaaa agtgttgcct tcattgccaa gtttgtttca caagaaaagg cttaggcaCc 720 tcctatggca ggaagaagcg gagacagcga cgaagagctc ctcaagacag tcagactcat 780 caagtttcte taccaaagca accctcctcc cagcaacgag gggacccgac aggcccgaag 840 aaatccggac tggccatcct gctgagcgac gaagagctcc tcaagacagt cagacfccatc 900 aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca ggcccgaaga 960 aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag tgagcggatt 1020 cttagcactt ttctgggacg acctgcggag cctgtgcctc ttcagctaco gccgcttgag 1080 agacttactc ttgattgtag cgaagattgt ggaaactctg ggacgcaggg ggtgggaagt 1140 cctcaagtat tggtggaatg a 1161 <210» 9 <211» 1170 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Białko złożone z immunodominujących części białek regulatorowych Nef-TatRev począwszy od aal Nef oddzielonych miejscami trawienia proteaz (N11TR) <400» 9 atgtggccta ctgtaagggą aagaatgaaa caagctgagc ctgagccagc agcagatggg 60 gtgggagcag catctcgaga cctggaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca 120 actaataacg ctgcttgtgc ctggctagaa gcacaagagg aagaggaagt gggttttcca 180 gtcagacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg gagctttaga tcttagccac 240 tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ttaatttact ccccaaaaag acaagagatc 300 cttgatctgt gggtctacca cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca 360 gggccagggg tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct tcaagttagt accagttgaa 420 ccagatgaag aagagaacag cagcctgtta caccctgcga gcctgcatgg gacagaggac 480 acggagagag aagtgttaaa gtggaagttt gacagccatc tagcatttca tcacaaggcc 540 cgagagctgc atccggagta ctacaaagac tgcgctctgg ccttcaagcg ggttgagcca 600 gtagatccta gactagagcc ctggaagcat ccaggaagtc agcctaggac cccttgtacc 660 aattgctatt gtaaaaagtg ttgccttcat tgccaagttt gtttcacaag aaaaggctta 720 ggcatctcct atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag 780 actcatcaag tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc 840 ccgaagaaat ccgtacggga gaagcggctg ctgagcgacg aagagctcct caagacagtc 900 agactcatca agtttctcta ccaaagcaac cctcctccca gcaacgaggg gacccgacag 960 gcccgaagaa atcgaagaag aaggtggaga gagagacaga ggcagatccg ttcgattagt 1020 gagcggattc ttagcacttt tctgggacga cctgcggagc ctgtgcctct tcagctaccg 1080 ccgcttgaga gacttactct tgattgtagc gaagattgtg gaaactctgg gacgcagggg 1140 gtgggaagtc ctcaagtatt ggtggaatga 1170 <210» 10 <211» 663 <212> ONA <213» Sztuczna sekwencja <220» ' <223» Białko złożone z epitopów cytotoksycznych komórek T genów Pol i Env (CTL) <400» 10 atgatcaccc tgtggcagcg ccccctggtg gccctgatcg agatctgcac cgagatggag 60 aaggagggca agatcagcaa gatcggcccc gccggcctga agaagaagaa gagcgtgacc 120 gtgctggacg tgggcgacgc ctacttcagc gtgcccctgg ataaggactt ccgcaagtac 180 accgccttca ccatccccag catctggaag ggcagccccg ccatcttcca gagcagcatg 240 accaagaagc agaaccccga catcgtgatc taccagtaca tggacgacct gtacgtgccc 300 atcgtgctgc ccgagaagga cagctggctg gtgggcaagc tgaactgggc cagccagatc 360 tacgccggca tcaaggtgaa gcagctgatc ctgaaggagc ccgtgcacgg cgtgtacgag 420 cccatcgtgg gcgccgagac cttctacgtg gacggcgccg ccaaccgcgc cggcaacctg 480 tgggtgaccg tgtactacgg cgtgcccgtg tggaaggagg ccaccaccac cctggtggag 540

PL 206 097 B1 cgctacctgo gcgaccagca gctgctgggc atctggggot gcgcctgcac cccctacgac 600 atcaaccaga tgctgcgcgg ccctggccgc gcottcgtga ccatccgcca gggcagoctg 660 tag ⁶⁶³ <210> 11 <211> 1266 <212> DMA .

<213» sztuczna sekwencja <220» <223> Skrócona sekwencja białka Gag (dgag) <400» 11 atgttagaca aatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atatcaatta 60 aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 120 gaaacatcag aaggctgtag acagataatg ggacagctac aaccgtccct tcagacagga 180 tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaaag 240 atagaggtaa aagacaccaa ggaagcttta gacaaggtag aggaagagca aaacaacagt 300 aagaaaaagg cacagcaaga agcagctgao gcaggaaaca gaaaccaggt cagccaaaat 360 taccctatag tgcaaaacct acagggacaa atggtacatc aggccatatc acctagaact 420 ttaaatgcat gggtaaaagt agtggaagag aaggctttca gcccagaagt aatacccatg 480 ttttcagcat tatcagaagg agccacccca caagatttaa acaccatgct aaacacagtg 540 gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagaaacca tcaatgagga agctgcagaa 600 tgggatagat tgcacccagt gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca 660 aggggaagtg acatagcagg aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca 720 aataatccac ctatcccagt aggagaaata tataagagat ggataatcct gggattaaat 780 aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc attctggata taaaacaagg accaaaagaa 840 ccctttagag attatgtaga ccggttctat aaaaccctaa gagccgagca agctacacag 900 gaagtaaaaa attggatgac agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaatcc agattgtaag 960 actattttaa aagcattagg accagcagct acactagaag aaatgatgac agcatgtcag 1020 ggagtggggg gacccggcca taaagcaaga gttttggctg aagcaatgag ccaagtaaca 1080 ggttcagctg ccataatgat gcagagaggc aattttagga accaaagaaa gactgttaag 1140 tgtttcaatt gtggcaaaga agggcacata gccagaaatt gcagggcccc taggaaaaag 1200 ggctgttgga aatgtggaaa ggaaggacat caaatgaagg attgcacaga aagacaggct 1260 aattag ¹²⁶⁶ <210» 12 <211» 1092 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <223» Syntetyczna sekwencja kodująca białko pl7/24 genu Gag (syn 17/24) <400» 12 atgggcgcaa gagcctccgt gctgagcggc ggagagctgg acaagtggga gaagatccgc 60 ctgcgccccg gcggcaagaa gaagtaccag ctgaagcaca tcgtgtgggc cagccgcgag 120 ctggagcgct tcgccgtgaa ccccggcctg ctcgagacca gcgaaggctg ccgccagatc 180 atgggccagc tccagcccag cctccagacc ggcagcgagg agctgcgcag cctgtacaac 240 accgtggcca ccctgtactg cgtgcaccag aagatcgagg tgaaggacac caaggaggcc 300 ctggacaagg tggaggagga gcagaacaac agcaagaaga aggcccagca ggaggccgcc 360 gacgccggca accgcaacca ggtgagccag aactacccca tcgtgcagaa cctgcagggc 420 cagatggtgc accaggccat cagcccccgc accctgaacg cctgggtgaa ggtggtggag 480 gagaaggcct tcagccccga ggtgatcccc atgttcagcg ccctgagcga gggcgctacc 540 ccccaggacc tgaacaccat gctgaacacc gtgggcggcc accaggccgc catgcagatg 600 ctgaaggaga ccatcaacga ggaggccgcc gagtgggacc gcctgcaccc cgtgcacgcc 660 gggcccatcg cccccggcca gatgcgcgag ccccgcggca gcgacatcgc cggcaccacc 720 agcaccctcc aggagcagat cggctggatg accaacaacc cccccatccc cgtgggcgag 780 atctacaagc gctggatcat cctgggcctg aacaagatcg tccgcatgta cagccccacc 840 agcatcctgg acatcaagca gggccccaag gagcccttcc gcgactacgt ggaccgcttc 900 tacaagaccc tgcgcgccga gcaggccacc caggaggtga agaactggat gaccgagacc 960 ctgctggtgc agaacgccaa ccccgactgc aagaccatcc tcaaggccct gggacccgcc 1020 gccaccctgg aggagatgat gaccgcctgc caaggcgtgg gcggccccgg ccacaaggcc 1080

PL 206 097 B1 cgcgtgctgt ga <210» 13 <211» 1092 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223» _Syntetyczna sekwencja kodująca białko pl7/24 genu Gag optymalizowane dla ' ekspresji w komórkach eukariotycznych (optl7/24) <400> 13 atgggcgcaa gagcctccgt gctgagcggc ggagagctgg acaagtggga gaagatccgc 60 ctgcgccccg gcggcaagaa gaagtaccag ctgaagcaca tcgtgtgggc cagccgcgag 120 ctggagcgct tcgccgtgaa ccccggcctg ctcgagacca gcgaaggctg ccgccagatc ISO atgggccage tccagcccag cctccagacc ggcagcgagg agctgcgcag cctgtacaac 240 accgtggcca ccctgtactg cgtgcaccag aagatcgagg tgaaggacac caaggaggcc 300 ctggacaagg tggaggagga gcagaacaac agcaagaaga aggcccagca ggaggccgcc 360 gacgccggca accgcaacca agtcagccag aactacccca tcgtgcagaa cctgcagggc 420 cagatggtgc accaggccat cagcccccgc accctgaacg cctgggtgaa ggtggtggag 480 gagaaggcct tcagccccga ggtgatcccc atgttcagcg ccctgagcga gggcgctacc 540 ceccaggacc tgaacaccat gctgaacacc gtgggcggcc accaggccgc catgcagatg 600 ctgaaggaga ccatcaacga ggaggccgcc gagtgggacc gcctgcaccc cgtgcacgce 660 gggcccatcg cccccggcca gatgcgcgag ccccgcggca gcgacatcgc ęggcaccacc 720 agcaccctcc aggagcagat cggctggatg accaacaacc cccccatccc cgtgggogag 780 atctacaagc gctggatcat cctgggcctg aacaagatcg tccgcatgta cagccccaca 840 agcatcctgg acatcaagca gggccccaag gagcccttcc gcgactacgt ggaccgctto 900 tacaagaccc tgcgcgccga gcaggccacc caggaggtga agaactggat gaccgagace 960 ctgctggtgc agaacgccaa ccccgactgc aagaccatcc tcaaggccct gggacccgce 1020 gccaccctgg aggagatgat gaccgcctgc caaggcgtgg gcggcaccgg ccacaaggce 1080 cgcgtgctgt ga 1092 <210» 14 <211» 1926 <212» DNA .

<213» Sztuczna sekwencja!

<223» Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Tat-Rev-Nef i CTL· (TRN-CTL) <400» 14 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60 ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga 120 aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa 180 gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac 240 ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc 300 gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc 360 atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga 420 agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg 480 attottagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt 540 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 600 agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt 660 gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatao agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260 gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320

PL 206 097 B1 gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380 accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440 tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500 atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560 cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620 atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680 gagcccateg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740 ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800 gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860 gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920 ctgtag 1926 <210> 15 <211> 1926 <212 > DNA ’ <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Rev-Nef-Tat i CTL (RNT-CTL) <400» 15 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60 tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat 120 cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt 180 agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct 300 caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc 360 aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct 420 gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc 480 acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa 540 gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga 600 gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc 660 ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat 720 tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc 780 aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc 840 ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta 900 gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag 960 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260 gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320 gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380 accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440 tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500 atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560 cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620 atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680 gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740 ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800 gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860 gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920 ctgtag 1926 <210> 16 <211» 2529 <212» DNA , <213» Sztuczna sekwencja <220» <223> Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Tat-Rev-Nef i skróconego białka Gag (TRN-dgag)

PL 206 097 B1 <400» 16 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60 ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga 120 aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa ISO gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac 240 ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc 300 gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc 360 atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga 420 agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg 480 attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt 540 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 600 agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt 660 gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagace aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260 gccgtgttag acaaatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatatcaa 1320 ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 1380 ttagaaacat cagaaggctg tagacagata atgggacagc tacaaccgtc ccttcagaca 1440 ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 1500 aagatagagg taaaagacac caaggaagct ttagacaagg tagaggaaga gcaaaacaac 1560 agtaagaaaa aggcacagca agaagcagct gacgcaggaa acagaaacca ggtcagccaa 1620 aattacccta tagtgcaaaa cctacaggga caaatggtac atcaggccat atcacctaga 1680 actttaaatg catgggtaaa agtagtggaa gagaaggctt tcagcccaga agtaataccc 1740 atgttttcag cattatcaga aggagccacc ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca 1800 gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg ttaaaagaaa ccatcaatga ggaagctgca 1860 gaatgggata gattgcaccc agtgcatgca gggcctattg caccaggcca gatgagagaa 1920 ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact agtacccttc aggaacaaat aggatggatg 1980 acaaataatc cacctatccc agtaggagaa atatataaga gatggataat cctgggatta 2040 aataaaatag taagaatgta tagccctacc agcattctgg atataaaaca aggaccaaaa 2100 gaacccttta gagattatgt agaccggttc tataaaaccc taagagccga gcaagctaca 2160 caggaagtaa aaaattggat gacagaaacc ttgttggtcc aaaatgcgaa tccagattgt 2220 aagactattt taaaagcatt aggaccagca gctacactag aagaaatgat gacagcatgt 2280 cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta 2340 acaggttcag ctgccataat gatgcagaga ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt 2400 aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac atagccagaa attgcagggc ccctaggaaa 2460 aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga catcaaatga aggattgcac agaaagacag 2520 gctaattag 2529

PL 206 097 B1 attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt 540 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 600 agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt 660 gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260 gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320 gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380 accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440 tacaccgcct tcaccatcco cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500 atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560 cccatcgtga tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620 atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680 gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740 ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800 gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860 gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920 ctggcggccg tgttagacaa atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa 1980 tatcaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct 2040 ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga cagataatgg gacagctaca accgtccctt 2100 cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg 2160 catcaaaaga tagaggtaaa agacaccaag gaagctttag acaaggtaga ggaagagcaa 2220 aacaacagta agaaaaaggc acagcaagaa gcagctgacg caggaaacag aaaccaggtc 2280 agccaaaatt accctatagt gcaaaaccta cagggacaaa tggtacatca ggccatatca 2340 cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtggaagaga aggctttcag cccagaagta 2400 atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta 2460 aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagaaaccat caatgaggaa 2520 gctgcagaat gggatagatt gcacccagtg catgcagggc ctattgcacc aggccagatg 2580 agagaaccaa ggggaagtga catagcagga actactagta cccttcagga acaaatagga 2640 tggatgacaa ataatccacc tatcccagta ggagaaatat ataagagatg gataatcctg 2700 ggattaaata aaatagtaag aatgtatagc cctaccagca ttctggatat aaaacaagga 2760 ccaaaagaac cctttagaga ttatgtagac cggttctata aaaccctaag agccgagcaa 2820 gctacacagg aagtaaaaaa ttggatgaca gaaaccttgt tggtccaaaa tgcgaatcca 2880 gattgtaaga ctattttaaa agcattagga ccagcagcta cactagaaga aatgatgaca 2940 gcatgtcagg gagtgggggg acccggccat aaagcaagag ttttggctga agcaatgagc 3000 caagtaacag gttcagctgc cataatgatg cagagaggca attttaggaa ccaaagaaag 3060 actgttaagt gtttcaattg tggcaaagaa gggcacatag ccagaaattg cagggcccct 3120 aggaaaaagg gctgttggaa atgtggaaag gaaggacatc aaatgaagga ttgcacagaa 3180 agacaggcta attag 3195 <210> 18 <211» 3195 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220» <223>

<400>

Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone skróconego białka Gag (RNT-CTL-dgag) z Rev-Nef-Tat, CTL i atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60 tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat 120 cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt 180 agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct 300 caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc 360

PL 206 097 B1 aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct 420 gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc 480 acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa 540 gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga 600 gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc 660 ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat 720 tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc 780 aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc 840 ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta 900 gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag 960 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260 gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320 gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaaga&gaa gaagagcgtg 1380 accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440 tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500 atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560 cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620 atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680 gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740 ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800 gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860 gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920 ctggcggccg tgttagacaa atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa 1980 tatcaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct 2040 ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga cagataatgg gacagctaca accgtccctt 2100 cagacaggat cagaagaact tagatcatta Łataatacag tagcaaccct ctattgtgtg 2160 catcaaaaga tagaggtaaa agacaccaag gaagctttag acaaggtaga ggaagagcaa 2220 aacaacagta agaaaaaggc acagcaagaa gcagctgacg caggaaacag aaaccaggtc 2280 agccaaaatt accctatagt gcaaaaccta cagggacaaa tggtacatca ggccatatca 2340 cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtggaagaga aggctttcag cccagaagta 2400 atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta 2460 aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagaaaccat caatgaggaa 2520 gctgcagaat gggatagatt gcacccagtg catgcagggc ctattgcacc aggccagatg 2580 agagaaccaa ggggaagtga catagcagga actactagta cccttcagga acaaatagga 2640 tggatgacaa ataatccacc tatcccagta ggagaaatat ataagagatg gataatcctg 2700 ggattaaata aaatagtaag aatgtatagc cctaccagca ttctggatat aaaacaagga 2760 ccaaaagaac cctttagaga ttatgtagac cggttctata aaaccctaag agccgagcaa 2820 gctacacagg aagtaaaaaa ttggatgaca gaaaccttgt tggtccaaaa tgcgaatcca 2880 gattgtaaga ctattttaaa agcattagga ccagcagcta cactagaaga aatgatgaca 2940 gcatgtcagg gagtgggggg acccggccat aaagcaagag ttttggctga agcaatgagc 3000 caagtaacag gttcagctgc cataatgatg cagagaggca attttaggaa ccaaagaaag 3060 actgttaagt gtttcaattg tggcaaagaa gggcacatag ccagaaattg cagggcccct 3120 aggaaaaagg gctgttggaa atgtggaaag gaaggacatc aaatgaagga ttgcacagaa 3180 agacaggcta attag 3195 <210> 19 <211> 3195 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Tat-Rev-Nef, skróconego białka Gag i CTL (TRN-dgag-CTL) <400> 19 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60 ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga 120 aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa 180 gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac 240

PL 206 097 B1 ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc 300 gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc 360 atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga 420 agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttegat tagtgagcgg 480 attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt 540 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 600 agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt 660 gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260 gccgtgttag acaaatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatatcaa 1320 ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 1380 ttagaaacat cagaaggctg tagacagata atgggacagc tacaaccgtc ccttcagaca 1440 ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 1500 aagatagagg taaaagacac caaggaagct ttagacaagg tagaggaaga gcaaaacaac 1560 agtaagaaaa aggcacagca agaagcagct gacgcaggaa acagaaacca ggtcagccaa 1620 aattacccta tagtgcaaaa cctacaggga caaatggtac atcaggccat atcacctaga 1680 actttaaatg catgggtaaa agtagtggaa gagaaggctt tcagcccaga agtaataccc 1740 atgttttcag cattatcaga aggagccacc ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca 1800 gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg ttaaaagaaa ccatcaatga ggaagctgca 1860 gaatgggata gattgcaccc agtgcatgca gggcctattg caccaggcca gatgagagaa 1920 ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact agtacccttc aggaacaaat aggatggatg 1980 acaaataatc cacctatccc agtaggagaa atatataaga gatggataat cctgggatta 2040 aataaaatag taagaatgta tagccctacc agcattctgg atataaaaca aggaccaaaa 2100 gaacccttta gagattatgt agaccggttc tataaaaccc taagagccga gcaagctaca 2160 caggaagtaa aaaattggat gacagaaacc ttgttggtcc aaaatgcgaa tccagattgt 2220 aagactattt taaaagcatt aggaccagca gctacactag aagaaatgat gacagcatgt 2280 cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta 2340 acaggttcag ctgccataat gatgcagaga ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt 2400 aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac atagccagaa attgcagggc ccctaggaaa 2460 aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga catcaaatga aggattgcac agaaagacag 2520 gctaatgcgg ccgtcatcac cctgtggcag cgccccctgg tggccctgat cgagatctgc 2580 accgagatgg agaaggaggg caagatcagc aagatcggcc ccgccggcct gaagaagaag 2640 aagagcgtga ccgtgctgga cgtgggcgac gcctacttca gcgtgcccct ggataaggac 2700 ttccgcaagt acaccgcctt caccatcccc agcatctgga agggcagccc cgccatcttc 2760 cagagcagca tgaccaagaa gcagaacccc gacatcgtga tctaccagta catggacgac 2820 ctgtacgtgc ccatcgtgct gcccgagaag gacagctggc tggtgggcaa gctgaactgg 2880 gccagccaga tctacgccgg catcaaggtg aagcagctga tcctgaagga gcccgtgcac 2940 ggcgtgtacg agcccatcgt gggcgecgag accttctacg tggacggcgc cgccaaccgc 3000 gccggcaacc tgtgggtgac cgtgtactac ggcgtgcccg tgtggaagga ggccaccacc 3060 accctggtgg agcgctacct gcgcgaccag cagctgctgg gcatctgggg ctgcgcctgc 3120 accccctacg acatcaacca gatgctgcgc ggccctggcc gcgccttcgt gaccatccgc 3180 cagggcagcc tgtag 3195 <210» 20 <211» 3195 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Rev-Nef-Tat, skróconego białka Gag i CTL (RNT-dgag-CTL) <400» 20 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60 tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacagge ccgaagaaat 120

PL 206 097 B1 cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt 180 agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct 300 caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc 360 aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct 420 gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaata 480 acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa 540 gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga 600 gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc 660 ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat 720 tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc 780 aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc 840 ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta 900 gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag 960 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260 gccgtgttag acaaatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatatcaa 1320 ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 1380 ttagaaacat cagaaggctg tagacagata atgggacagc tacaaccgtc ccttcagaca 1440 ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 1500 aagatagagg taaaagacac caaggaagct ttagacaagg tagaggaaga gcaaaacaac 1560 agtaagaaaa aggcacagca agaagcagct gacgcaggaa acagaaacca ggtcagccaa 1620 aattacccta tagtgcaaaa cctacaggga caaatggtac atcaggccat atcacctaga 1680 actttaaatg catgggtaaa agtagtggaa gagaaggctt tcagcccaga agtaataccc 1740 atgttttcag cattatcaga aggagccacc ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca 1800 gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg ttaaaagaaa ccatcaatga ggaagctgca 1860 gaatgggata gattgcaccc agtgcatgca gggcctattg caccaggcca gatgagagaa 1920 ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact agtacccttc aggaacaaat aggatggatg 1980 acaaataatc cacctatccc agtaggagaa atatataaga gatggataat cctgggatta 2040 aataaaatag taagaatgta tagccctacc agcattctgg atataaaaca aggaccaaaa 2100 gaacccttta gagattatgt agaccggttc tataaaaccc taagagccga gcaagctaca 2160 caggaagtaa aaaattggat gacagaaacc ttgttggtcc aaaatgcgaa tccagattgt 2220 aagactattt taaaagcatt aggaccagca gctacactag aagaaatgat gacagcatgt 2280 cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta 2340 acaggttcag ctgccataat gatgcagaga ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt 2400 aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac atagccagaa attgcagggc ccctaggaaa 2460 aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga catcaaatga aggattgcac agaaagacag 2520 gctaatgcgg ccgtcatcac cctgtggcag cgccccctgg tggccctgat cgagatctgc 2580 accgagatgg agaaggaggg caagatcagc aagatcggcc ccgccggcct gaagaagaag 2640 aagagcgtga ccgtgctgga cgtgggcgac gcctacttca gcgtgcccct ggataaggac 2700 ttccgcaagt acaccgcctt caccatcccc agcatctgga agggcagccc cgccatcttc 2760 cagagcagca tgaccaagaa gcagaacccc gacatcgtga tctaccagta catggacgac 2820 ctgtacgtgc ccatcgtgct gcccgagaag gacagctggc tggtgggcaa gctgaactgg 2880 gccagccaga tctacgccgg catcaaggtg aagcagctga tcctgaagga gcccgtgcac 2940 ggcgtgtacg agcccatcgt gggcgccgag accttctacg tggacggcgc cgccaaccgc 3000 gccggcaacc tgtgggtgac cgtgtactac ggcgtgcccg tgtggaagga ggccaccacc 3060 accctggtgg agcgctacct gcgcgaccag cagctgctgg gcatctgggg ctgcgcctgc 3120 accccctacg acatcaacca gatgctgcgc ggccctggcc gcgccttcgt gaccatccgc 3180 cagggcagcc tgtag 3195 <210> 21 <211> 3020 <212 > DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Rev-Nef-Tat, skróconego białka Gag i CTL (RNT-optpl7/24-CTL) <400> 21

PL 206 097 B1 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60 ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga 120 aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa 180 gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac 240 ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc 300 gatactagtg caggaagaag cggagacago gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc 360 atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga 420 agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg 480 attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtge ctcttcagct accgccgctt 540 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 600 agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt 660 gttggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatcte gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260 gccgtgggcg caagagccta cgtgctgagc ggcggagagc tggacaagtg ggagaagate 1320 cgcctgcgcc ccggcggcaa gaagaagtac cagctgaagc acatcgtgtg ggccagccgc 1380 gagctggagc gcttcgccgt gaaccccggc ctgctcgaga ccagcgaagg ctgccgccag 1440 atcatgggcc agctccagcc cagcctccag accggcagcg aggagctgcg cagcctgtac 1500 aacaccgtgg ccaccctgta ctgcgtgcac cagaagatcg aggtgaagga caccaaggag 1560 gccctggaca aggtggagga ggagcagaac aacagcaaga agaaggccca gcaggaggcc 1620 gccgacgccg gcaaccgcaa ccaagtcagc cagaactacc ccatcgtgca gaacctgcag 1680 ggccagatgg tgcaccaggc catcagcccc cgcaccctga acgcctgggt gaaggtggtg 1740 gaggagaagg ccttcagccc cgaggtgatc cccatgttca gcgccctaag cgagggcgct 1800 accccccagg acctgaacac catgctgaac accgtgggcg gccaccaggc cgccatgcag 1860 atgctgaagg agaccatcaa cgaggaggcc gccgagtggg accgcctgca ccccgtgcao 1920 gccgggccca tcgcccccgg ccagatgcgc gagccccgcg gcagcgacat cgccggcacc 1980 accagcaccc tccaggagca gatcggctgg atgaccaaca acccccccat ccccgtgggc 2040 gagatctaca agcgctggat catcctgggc ctgaacaaga tcgtccgcat gtacagcccc 2100 accagcatcc tggacatcaa gcagggcccc aaggagccct tccgcgacta cgtggaccgc 2160 ttctacaaga ccctgcgcgc cgagcaggcc acccaggagg tgaagaactg gatgaccgag 2220 accctgctgg tgcagaacgc caaccccgac tgcaagacca tcctcaaggc cctgggaccc 2280 gccgccaccc tggaggagat gatgaccgcc tgccaaggcg tgggcggccc cggccacaag 2340 gcccgcgtgc tggcggccgt catcaccctg tggcagcgcc ccctggtggc cctgatcgag 2400 atctgcaccg agatggagaa ggagggcaag atcagcaaga tcggccccgc cggcctgaag 2460 aagaagaaga gcgtgaccgt gctggacgtg ggcgacgcct acttcagcgt gcccctggat 2520 aaggacttcc gcaagtacac cgccttcacc atccccagca tctggaaggg cagccccgcc 2580 atcttccaga gcagcatgac caagaagcag aaccccgaca tcgtgatcta ccagtacatg 2640 .

gacgacctgt acgtgcccat cgtgctgccc gagaaggaca gctggctggt gggcaagctg 2700 aactgggcca gccagatcta cgccggcatc aaggtgaagc agctgatcct gaaggagccc 2760 gtgcacggcg tgtacgagcc catcgtgggc gccgagacct tctacgtgga cggcgccgcc 2820 aaccgcgccg gcaacctgtg ggtgaccgtg tactacggcg tgcccgtgtg gaaggaggcc 2880 accaccaccc tggtggagcg ctacctgcgc gaccagcagc tgctgggcat ctggggctgc 2940 gcctgcaccc cctacgacat caaccagatg ctgcgcggcc ctggccgcgc ctcgtgacca 3000 tccgccaggg cagcctgtag 3020 <210> 22 <211> 3021 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Tat-Rev-Nef, CTL i skróconego białka Gag (TRN-CTL-optpl7/24) <400» 22 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60

PL 206 097 B1 ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagttcg cttcacaaga 120 aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa 180 gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac 240 ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc 300 gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc 360 atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga 420 agaaatogaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg 480 attcttagea cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt 540 gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 600 agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt 660 gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct 720 gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga 780 gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa 840 gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 900 aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt 960 tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020 cctgattggc agaactacao accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080 tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140 gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200 catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260 gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320 gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380 accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440 tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500 atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560 cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620 atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 16B0 gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740 ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800 gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860 gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920 ctggcggccg tgggcgcaag agcctccgtg ctgagcggcg gagagctgga caagtgggag 1980 aagatccgcc tgcgccccgg cggcaagaag aagtaccagc tgaagcacat cgtgtgggcc 2040 agccgcgagc tggagcgctt cgccgtgaac cccggcctgc tcgagaccag cgaaggctgc 2100 cgccagatca tgggccagct ccagcccagc ctccagaccg gcagcgagga gctgcgcagc 2160 ctgtacaaca ccgtggccac cctgtactgc gtgcaccaga agatcgaggt gaaggacacc 2220 aaggaggccc tggacaaggt ggaggaggag cagaacaaca gcaagaagaa ggcccagcag 2280 gaggccgccg acgccggcaa ccgcaaccaa gtcagccaga actaccccat cgtgcagaac 2340 ctgcagggcc agatggtgca ccaggccatc agcccccgca ccctgaacgc ctgggtgaag 2400 gtggtggagg agaaggcctt cagccccgag gtgatcccca tgttcagcgc cctgagcgag 2460 ggcgctaccc cccaggacct gaacaccatg ctgaacaccg tgggcggcca ccaggccgcc 2520 atgcagatgc tgaaggagac catcaacgag gaggccgccg agtgggaccg cctgcacccc 2580 gtgcacgccg ggcccatcgc ccccggccag atgcgcgage cccgcggcag cgacatcgcc 2640 ggcaccacca gcaccctcca ggagcagatc ggctggatga ccaacaaccc ccccatcccc 2700 gtgggcgaga tctacaagcg ctggatcatc ctgggcctga acaagatcgt ccgcatgtac 2760 agccccacca gcatcctgga catcaagcag ggccccaagg agcccttccg cgactacgtg 2820 gaccgcttct acaagaccct gcgcgccgag caggccaccc aggaggtgaa gaactggatg 2880 accgagaccc tgctggtgca gaacgccaac cccgactgca agaccatcct caaggccctg 2940 ggacccgccg ccaccctgga ggagatgatg accgcctgcc aaggcgtggg cggccccggc 3000 cacaaggccc gcgtgctgtg a 3021

<210>	23
<211>	3021
<212>	DNA	sekwencj a
<213>	Sztuczna
<220>
<223>	Hybrydowa	sekwencja kodująca białko złożone z Rev-Nef-Tat, CTL i
	skróconego	białka Gag (RNT-CTL-optpl7/24)
<400>	23

atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60 tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat 120

PL 206 097 B1 cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt 180 agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct 300 caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc 380 aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct 420 gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc 480 acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa 540 gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga 600 gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc 660 ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat 720 tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc 780 aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc 840 ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta 900 gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag 960 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260 gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320 gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380 accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440 tacaccgcct tcaccatcco cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500 atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560 cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620 atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680 gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740 ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800 gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860 gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920 ctggcggccg tgggcgcaag agcctccgtg ctgagcggcg gagagctgga caagtgggag 1980 aagatccgcc tgcgccccgg cggcaagaag aagtaccagc tgaagcacat cgtgtgggcc 2040 agccgcgagc tggagcgctt cgccgtgaac cccggcctgc tcgagaccag cgaaggctgc 2100 cgccagatca tgggccagct ccagcccagc ctccagaccg gcagcgagga gctgcgcagc 2160 ctgtacaaca ccgtggccac cctgtactgc gtgcaccaga agatcgaggt gaaggacacc 2220 aaggaggccc tggacaaggt ggaggaggag cagaacaaca gcaagaagaa ggcccagcag 2280 gaggccgccg acgccggcaa ccgcaaccaa gtcagccaga actaccccat cgtgcagaac 2340 ctgcagggcc agatggtgca ccaggccatc agcccccgca ccctgaacgc ctgggtgaag 2400 gtggtggagg agaaggcctt cagccccgag gtgatcccca tgttcagcgc cctgagcgag 2460 ggcgctaccc cccaggacct gaacaccatg ctgaacaccg tgggcggcca ccaggccgcc 2520 atgcagatgc tgaaggagac catcaacgag gaggccgccg agtgggaccg cctgcacccc 2580 gtgcacgccg ggcccatcgc ccccggccag atgcgegagc cccgcggcag cgacatcgcc 2640 ggcaccacca gcaccctcca ggagcagatc ggctggatga ccaacaaccc ccccatcccc 2700 gtgggcgaga tctacaagcg ctggatcatc ctgggcctga acaagatcgt ccgcatgtac 2760 agccccacca gcatcctgga catcaagcag ggccccaagg agcccttccg cgactacgtg 2820 gaccgcttct acaagaccct gcgcgccgag caggccaccc aggaggtgaa gaactggatg 2880 accgagaccc tgctggtgca gaacgccaac cccgactgca agaccatcct caaggccctg 2940 ggacccgccg ccaccctgga ggagatgatg accgcctgcc aaggcgtggg cggccccggc 3000 cacaaggccc gcgtgctgtg a 3021 <210» 24 <211» 3021 <212» DNA .

<213» Sztuczna sekwencja <220» <223»

Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone białka Gag i CTL (RNT-optpl7/24-CTL) z Rev-Nef-Tat, skróconego <400» 24 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60 tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat 120 cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt 180

PL 206 097 B1 agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcctgagaga 24U cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct 300 caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc 360 aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct 420 gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc 480 acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa 540 gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga 600 gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactco 660 ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat 720 tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc 780 aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc 840 ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta 900 gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag 960 ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140 cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260 gccgtgggcg caagagcctc cgtgctgagc ggcggagagc tggacaagtg ggagaagate 1320 cgcctgcgcc ccggcggcaa gaagaagtac cagctgaagc acatcgtgtg ggccagccgc 1380 gagctggagc gcttcgccgt gaaccccggc ctgctcgaga ccagcgaagg ctgccgccag 1440 atcatgggco agctccagcc cagcctccag accggcagcg aggagctgcg cagcctgtac 1500 aacaccgtgg ccaccctgta ctgcgtgcac cagaagatcg aggtgaagga caccaaggag 1560 gccctggaca aggtggagga ggagcagaac aacagcaaga agaaggccca gcaggaggcc 1620 gccgacgccg gcaaccgcaa ccaagtcagc cagaactacc ccatcgtgca gaacctgcag 1680 ggccagatgg tgcaccaggc catcagcccc cgcaccctga acgcctgggt gaaggtggtg 1740 gaggagaagg ccttcagccc cgaggtgatc cccatgttca gcgccctaag cgagggcgct 1800 accccccagg acctgaacac catgctgaac accgtgggcg gccaccaggc cgccatgcag 1860 atgctgaagg agaccatcaa cgaggaggcc gccgagtggg accgcctgca ccccgtgcao 1920 gccgggccca tcgcccccgg ccagatgcgc gagccccgcg gcagcgacat cgccggcacc 1980 accagcaccc tccaggagca gatcggctgg atgaccaaca acccccccat ccccgtgggc 2040 gagatctaca agcgctggat catcctgggc ctgaacaaga tcgtccgcat gtacagcccc 2100 accagcatcc tggacatcaa gcagggcccc aaggagccct tccgcgacta cgtggaccgc 2160 ttctacaaga ccctgcgcgc cgagcaggcc acccaggagg tgaagaactg gatgaccgag 2220 accctgctgg tgcagaacgc caaccccgac tgcaagacca tcctcaaggc cctgggaccc 2280 gccgccaccc tggaggagat gatgaccgcc tgccaaggcg tgggcggccc cggccacaag 2340 gcccgcgtgc tggcggccgt catcaccctg tggcagcgcc ccctggtggc cctgatcgag 2400 atctgcaccg agatggagaa ggagggcaag atcagcaaga tcggccccgc cggcctgaag 2460 aagaagaaga gcgtgaccgt gctggacgtg ggcgacgcct acttcagcgt gcccctggat 2520 aaggacttcc gcaagtacac cgccttcacc atccccagca tctggaaggg cagccccgcc 2580 atcttccaga gcagcatgac caagaagcag aaccccgaca tcgtgatcta ccagtacatg 2640 gacgacctgt acgtgcccat cgtgctgccc gagaaggaca gctggctggt gggcaagctg 2700 aactgggcca gccagatcta cgccggcatc aaggtgaagc agctgatcct gaaggagccc 2760 gtgcacggcg tgtacgagcc catcgtgggc gccgagacct tctacgtgga cggcgccgcc 2820 aaccgcgccg gcaacctgtg ggtgaccgtg tactacggcg tgcccgtgtg gaaggaggcc 2880 accaccaccc tggtggagcg ctacctgcgc gaccagcagc tgctgggcat ctggggctgc 2940 gcctgcaccc cctacgacat caaccagatg ctgcgcggcc ctggccgcgc cttcgtgacc 3000 atccgccagg gcagcctgta g 3021 <210> 25 <211> 419 .

<212> PRT <213> Jajucj&na sekwencja ,/ <220» .

<223> Białko hybrydowe złożone z Nef-Tat-Rev (NTR) <400> 25

Met Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu 15 10 15

Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala

25 30

Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr

PL 206 097 B1

	35	40	45
Ala Thr Asn Asn Ala	Ala Cys Ala Trp Leu Glu	Ala Gln Glu Olu Glu
	50	55	60
Glu Val Oly Phe Pro	Val Arg Pro Gln Val Pro	Leu Arg Pro Met Thr
65		70 75	80
Tyr Lys Oly Ala Leu	Asp Leu Ser His Phe Leu	Lys Glu Lys Oly Gly
	85	90	95
Leu	Glu Oly Leu Ile	Tyr Ser Pro Lys Arg Gln	Glu Ile Leu Asp Leu
	100	105	110
Trp	Val Tyr His Thr	Gln Gly Tyr Phe Pro Asp	Trp Gln Asn Tyr Thr
	115	120	125
Pro	Gly Pro Gly Val	Arg Tyr Pro Leu Thr Phe	Gly Trp Cye Phe Lys
	130	135 .	140
Leu	Val Pro Val Glu	Pro Asp Glu Glu Glu Asn	Ser Ser Leu Leu His
145		150 155	160
Pro	Ala Ser Leu His	Gly Thr Glu Asp Thr Glu	Arg Glu Val Leu Lys
	165	170	175
Trp Lys Phe Asp Ser	Hie Leu Ala Phe His His	Lys Ala Arg Glu Leu
	180	185	190

His Pro Olu Tyr Tyr Łys Aep Cye Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp 195 200 205

Ser Asp Olu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg. Leu Ile Lys Phe Leu Tyr 210 215 220

Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Olu Gly Thr Arg Oln Ala Arg Arg

225	230	235	240
Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu	Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser	Ile
245		250 255
Ser Glu Arg Ile Leu	Ser Thr Phe	Leu Gly Arg Pro Ala Olu Pro	Val
260		265 270
Pro Leu Gln Leu Pro	Pro Leu Glu	Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser	Olu
275	280	285
Asp Cys Gly Asn Ser	Gly Thr Gln	Oly Val Oly Ser Pro Oln Val	Leu
290	295	300
Val Glu Ser Pro Ala	Val Leu Glu	Pro Oly Thr Lys Olu Lys Leu	Glu
305	310	315	320
Pro Val Asp Pro Arg	Leu Olu Pro	Trp Lys His Pro Gly Ser Gln	Pro
325		330 335
Arg Thr Pro Cys Thr	Asn Cys Tyr	Cys Lys Lys Cys Cys Leu His	Cys
340		345 350
Gln Val Cys Phe Thr	Arg Lys Gly	Leu Oly Ile Ser Tyr Oly Arg	Lys
355	360	365
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala	Pro Oln Asp Ser Gln Thr His	Gln
370	375	380
Val Ser Leu Pro Lys	Gln Pro Ser	Ser Gln Gln Arg Gly Asp Pro	Thr
385	390	395	400
Gly Pro Lye Lys Ser	Lys Lys Lys	Val Glu Arg Glu Thr Glu Ala	Asp
405		410 415

Pro Phe Asp <210> 26 <211> 419 <212 > PRT <213> . Sztuczna sekwencja <22 0» <223> Białko hybrydowe złożone z Tat-Rev-Nef (TRN) <400> 26

Met

Glu

Pro

Val

Asp

Pro

Arg

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

His

Pro

Oly

Ser

1

5

10

15

Oln

Pro

Arg

Thr

Pro

Cys

Thr

Asn

Cys

Tyr

Cys

Lys

Lys

Cys

Cys

Leu

20

25

30

His

Cys

Gln

Val

Cys

Phe

Thr

Arg

Lys

Gly

Leu

Gly

Ile

Ser

Tyr

Gly

PL 206 097 B1

	35	40	45
Arg Lys 50	Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala Pro Gin Asp Ser Gin Thr 55 60
His Gin 65	Val Ser Leu Pro 70	Lys Gin	Pro Ser Ser Gin Gin Arg Gly Asp - 75 80
Pro Thr	Gly Pro Lys Lys 85	Ser Lys	Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu 90 95
Ala Asp	Pro Phe Asp Thr 100	Ser Ala	Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu 105 110
Glu Leu	Leu Lys Thr Val 115	Arg Leu 120	Ile Lys Phe Leu Tyr Gin Ser Asn 125
Pro Pro 130	Pro Ser Asn Glu	Gly Thr 135	Arg Gin Ala Arg Arg Asn Arg Arg 140
Arg Arg Trp Arg Glu Arg 145 150	Gin Arg	Gin Ile Arg Ser Ile Ser Olu Arg 155 160
Ile Leu	Ser Thr Phe Leu 165	Gly Arg	Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gin 170 175
Leu Pro	Pro Leu Glu Arg 180	Leu Thr	Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly 185 190
Asn Ser	Gly Thr Gin Gly Val Gly 195 200	Ser Pro Gin Val Leu Val Glu Ser 205
Pro Ala 210	Val Leu Glu Pro	Gly Thr 215	Lys Glu Lys Leu Val Gly Lys Trp 220
Ser Lys 225	Cys Ser Gly Trp 230	Pro Thr	Val Arg Glu Arg Met Lys Gin Ala 235 240
Glu Pro	Glu Pro Ala Ala 245	Asp Gly	Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu 250 255
Glu Lys	His Gly Ala Ile 260	Thr Ser	Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala 265 270
Ala Cys	Ala Trp Leu Glu 275	Ala Gin 280	Glu Olu Glu Glu Val Gly Phe Pro 285
Val Arg 290	Pro Gin Val Pro	Leu Arg 295	Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu 300
Asp Leu 305	Ser His Phe Leu 310	Lys Glu	Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile 315 320
Tyr Ser	Pro Lys Arg Gin 325	Glu Ile	Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr 330 335
Gin Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gin 340	Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val 345 350
Arg Tyr	Pro Leu Thr Phe 355	Gly Trp 360	Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu 365
Pro Asp 370	Glu Glu Glu Asn	Ser Ser 375	Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His 380
Gly Thr 385	Glu Asp Thr Glu 390	Arg Glu	Val Leu Lys Trp Lya Phe Asp Ser 395 400
His Leu	Ala Phe His His	Lys Ala	Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr

405 410 415

Lys Asp Cys <210» 27 <211> 419 <212» PRT <213> Sztuczna sekwencja <220» <223» Białko hybrydowe złożone z Rev-Tat-Nef (RTN) <400» 27

Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val 15 10 15

Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gin Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu

25 30

Gly Thr Arg Gin Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg

PL 206 097 B1

40 45

Sin Arg sin Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg ile Leu Ser Thr Phe Leu
50	55	60
Gly Arg Pro Ala Siu Pro	Val	Pro Leu Sin Leu Pro Pro Leu Olu Arg
65 70		75 80
Leu Thr Leu Asp Cys Ser	Siu Asp Cys Sly Asn Ser Sly Thr Sin Gly
65		90 95
Val Gly Ser Pro Gin Val	Leu	val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro
100		105 110
Sly Thr Lys Siu Thr Ser	Siu	Pro Val Asp Pro Arg Leu Olu Pro Trp
115		120 125
Lys His Pro Sly Ser oln	Pro	Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys
130	135	140
Lys Lys Cys Cys Leu His	Cys	Oln Val Cys Phe Thr Arg Lys Sly Leu
145 150		155 160
Sly Ile Ser Tyr Sly Arg	Lys	Lys Arg Arg Sin Arg Arg Arg Ala Pro
165		170 175
Sin Asp Ser Sin Thr His	Oln Val Ser Leu Pro Lys Oln Pro Ser Ser
ISO		185 190
Sin Sin Arg Sly Asp Pro	Thr	Sly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val
195		200 205
Siu Arg Glu Thr Siu Ala	Asp	Pro Phe Asp Lys Leu Val Sly Lys Trp
210	215	220
Ser Lys Cys Ser Sly Trp	Pro	Thr Val Arg Siu Arg Met Lys Oln Ala
225 230		235 240
Siu Pro Glu Pro Ala Ala	Asp Sly Val Sly Ala Ala Ser Arg Asp Leu
245		250 255
Glu Lys His Gly Ala Ile	Thr	Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala
260		265 270
Ala Cys Ala Trp Leu Siu	Ala	Sin Olu Siu Olu Olu Val Sly Phe Pro
275		280 285
Val Arg Pro Gin Val Pro	Leu	Arg Pro Met Thr Tyr Lys sly Ala Leu
290	295	300
Asp Leu Ser His Phe Leu	Lys	Siu Lys Sly Sly Leu Glu Sly Leu Ile
305 310		315 320
Tyr Ser Pro Lys Arg Gin	Glu	Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr
325		330 335
Gin Gly Tyr Phe Pro Asp	Trp	Gin Asn Tyr Thr Pro sly Pro sly Val
340		345 350
Arg Tyr Pro Leu Thr Phe	Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu
355		360 365
Pro Asp Siu Glu Olu Asn	Ser	Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His
370	375	380
Gly Thr Glu Asp Thr Olu	Arg	Olu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser
385 390		395 400
His Leu Ala Phe His His	Lys	Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr
405		410 415

Lys Asp Cys <210> 28 <211> 419 ✓OT 9% PPT <213> Sztuczna sekwencja^ <220>

<223> Białko hybrydowe złożone z Tat-Nef-Rev (TNR) <400> 28

Met

Glu

Pro

Val

Asp

Pro

Arg

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

His

Pro

Gly

Ser

1

5

10

15

Gin

Pro

Arg

Thr

Pro

Cys

Thr

Asn

Cys

Tyr

Cys

Lys

Lys

Cys

Cys

Leu

20

25

30

His

Cys

Gin

Val

Cys

Phe

Thr

Arg

Lys

Gly

Leu

Gly

Ile

Ser

Tyr

Gly

PL 206 097 B1

40 45

Arg Lye Lye Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr

50	55	60
Kle Gln Val Ser Leu	Pro Lye Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp
65	70	75 80
Pro Thr Gly Pro Lye Lye Ser Lys Lye Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu
85		90 95
Ala Asp Pro Phe Asp Thr Ser Val	Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly
100		105 110
Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met	Lye Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala
115	120	125
Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser	Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala
130	135	140
Ile Thr Ser Ser Aen	Thr Ala Thr	Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu
145	150	155 160
Glu Ala Gln Glu Glu	Glu Glu Val	Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val
165		170 175
Pro Leu Arg Pro Met	Thr Tyr Lys	Gly Ala Leu Asp Leu Ser Hie Phe
180		185 190
Leu Lys Glu Lye Gly Gly Leu Glu	Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Łys Arg
195	200	205
Gln Glu Ile Leu Asp	Leu Trp Val	Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro
210	215	220
Asp Trp Gln Aen Tyr	Thr Pro Gly	Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr
225	230	235 240
Phe Gly Trp Cys Phe	Lys Leu Val	Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu Glu
245		250 255
Aen Ser Ser Leu Leu	His Pro Ala	Ser Leu His Gly Thr Glu Asp Thr
260		265 270
Glu Arg Glu Val Leu	Lys Trp Lys	Phe Asp Ser His Leu Ala Phe Hie
275	280	285
His Lys Ala Arg Glu	Leu His Pro	Glu Tyr Tyr Lye Asp Cys Lye Leu
290	295	300
Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp	Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg
305	310	315 320
Leu Ile Lye Phe Leu Tyr Gln Ser	Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly
325		330 335
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln
340		345 350
Arg Gln Ile Arg Ser	Ile Ser Glu	Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly
355	360	365
Arg Pro Ala Glu Pro	Val Pro Leu	Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu
370	375	380
Thr Leu Asp Cys Ser	Glu Asp Cys	Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val
385	390	395 400
Gly Ser Pro Gln Val	Leu Val Glu	Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro Gly
405		410 415
Thr Lys Glu

<210> 29 <211> 419 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Białko hybrydowe złożone z Rev-Nef-Tat (RNT) <400> 29

Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val 15 10 15

Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu

25 30

Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg

PL 206 097 B1

35	40	45
Gin Arg Gin 50	Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg 55	Ile Leu Ser Thr Phe Leu 60
Gly Arg Pro 65	Ala Glu Pro Val Pro Leu Gin 70	Leu Pro Pro Leu Glu Arg 75 80
Leu Thr Leu	Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly 85 90	Asn Ser Gly Thr Gin Gly 95
Val Gly Ser	Pro Gin Val Leu Val Glu Ser 100 105	Pro Ala Val Leu Glu Pro 110
Gly Thr Lys 115	Glu Thr Ser Val Gly Lys Trp 120	Ser Lys Cys Ser Gly Trp 125
Pro Thr Val 130	Arg Glu Arg Met Lys Gin Ala 135	Glu Pro Glu Pro Ala Ala 140
Asp Gly Val 145	Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu 150	Glu Lys His Gly Ala Ile 155 160
Thr Ser Ser	Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu 165 170 175
Ala Gin Glu	Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro 180 185	Val Arg Pro Gin Val Pro 190
Leu Arg Pro 195	Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu 200	Asp Leu Ser His Phe Leu 205
Lys Glu Lys 210	Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile 215	Tyr Ser Pro Lys Arg Gin 220
Glu Ile Leu 225	Asp Leu Trp Val Tyr His Thr 230	Gin Gly Tyr Phe Pro Asp 235 240
Trp Gin Asn	Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val 245 250	Arg Tyr Pro Leu Thr Phe 255
Gly Trp Cys	Phe Lys Leu Val Pro Val Glu 260 265	Pro Asp Glu Glu Glu Asn 270
Ser Ser Leu 275	Leu His Pro Ala Ser Leu His 280	Gly Thr Glu Asp Thr Glu 285
Arg Glu Val 290	Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser 295	His Leu Ala Phe His His 300
Lys Ala Arg 305	Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr 310	Lys Asp Cys Lys Leu Glu 315 320
Pro Val Asp	Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lye 325 330	His Pro Gly Ser Gin Pro 335
Arg Thr Pro	Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys 340 345	Lys Cys Cys Leu His Cys 350
Gin val Cys 355	Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly 360	Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 365
Lys Arg Arg 370	Gin Arg Arg Arg Ala Pro Gin 375	Asp Ser Gin Thr His Gin 380
Val Ser Leu 385	Pro Lys Gin Pro Ser Ser Gin 390	Gin Arg Gly Asp Pro Thr 395 400
Gly Pro Lys	Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu 405 410	Arg Glu Thr Glu Ala Asp 415

Pro Phe Asp <210> 30 <211> 387 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Biał

ko z

łożone

z immunodo:

minując

ych

czę

ści

Nef

-Tat-Rev (NTR)

<400> 30 ·

Met Gly Trp

Pro

Thr

Val

Arg

Glu

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Glu

Pro

Glu

1 .

5

10

15

Pro Ala Ala

Asp

Gly

Val

Gly

Ala

Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

20

25

30

Gly Ala Ile

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Thr

Asn

Asn

Ala

Ala

Cys

Ala

PL 206 097 B1

40 45

Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro 50 55 60

Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser

65	70	75	80
His Phe Leu Lys	Glu Lye Gly Gly Leu	Glu Gly	Leu Ile Tyr Ser Pro
	85	90	95
Lys Arg Gln Glu	Ile Leu Asp Leu Trp	Val Tyr	His Thr Gln Gly Tyr
100	105		110
Phe Pro Asp Trp	Gln Asn Tyr Thr Pro	Gly Pro	Gly Val Arg Tyr Pro
115	120		125
Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu	Val Pro	Val Glu Pro Asp Glu
130	135		140
Glu Glu Aan Ser	Ser Leu Leu Hie Pro	Ala Ser	Leu His Gly Thr Glu
145	150	155	160
Asp Thr Glu Arg	Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe	Asp Ser His Leu Ala
	165	170	175
Phe His His Lys	Ala Arg Glu Leu His	Pro Glu	Tyr Tyr Lys Asp Cys
180	185		190
Ala Leu Ala Ala	Val Glu Pro Val Asp	Pro Arg	Leu Glu Pro Trp Lys
195	200		205
His Pro Gly Ser	Gln Pro Arg Ihr Pro	Cys Thr	Asn Cys Tyr Cys Lys
210	215		220
Lys Cys Cys Leu	His Cys Gln Val Cys	Phe Thr	Arg Lys Gly Leu Gly
225	230	235	240
Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg	Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln
	245	250	255
Asp Ser Gln Thr	His Gln Val Ser Leu	Pro Lys	Gln Pro Ser Ser Gln
260	265		270
Gln Arg Gly Asp	Pro Thr Gly Pro Lye	Lys Ser	Gly Leu Ala Ile Leu
275	280		235
Leu Ser Asp Glu	Glu Leu Leu Lys Thr	Val Arg	Leu Ile Lys Phe Leu
290	295		300
Tyr Gln Ser Asn	Pro Pro Pro Ser Asn	Glu Gly	Thr Arg Gln Ala Arg
305	310	315	320
Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu	Arg Gln	Arg Gln Ile Arg Ser
	325	330	335
Ile Ser Olu Arg	Ile Leu Ser Thr Phe	Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro
340	345		350
Val Pro Leu Gln	Leu Pro Pro Leu Glu	Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser
355	360		365
Glu Asp Cys Gly	Asn Ser Gly Thr Gln	Gly Val Gly Ser Pro Gln Val
370	375		380
Leu Val Glu
385
<210» 31
<211» 390
<212» PRT
<213» Sztuczna sekwencja

<220» <223» Białko złożone z immunodominujących części Nef-Tat-Rev oddzielonych miejscami trawienia proteaz (NTR) <400» 31

Met

Gly

Trp

Pro

Thr

Val

Arg

Glu

Arg

Met

Lys

Gln

Ala

Glu

Pro

Glu

1

5

10

15

Pro

Ala

Ala

Asp

Gly

Val

Gly

Ala

Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

20

25

30

Gly

Ala

Ile

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Thr

Asn

Asn

Ala

Ala

Cys

Ala

35

40

45

Trp

Leu

Glu

Ala

Gln

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Gly

Phe

Pro

Val

Arg

Pro

PL 206 097 B1

50	55	60
Gin Val Pro Leu	Arg Pro Met Thr Tyr Lye Gly	Ala Leu Asp Leu Ser
65	70 75	80
His Phe Leu Lys	Glu Lye Gly Gly Leu Glu Gly	Leu ile Tyr Ser Pro
	85 90	95
Lys Arg Gin Olu	Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr	His Thr Gin Gly Tyr
100	105	110
Phe Pro Asp Trp	Gin Asn Tyr Thr Pro Gly Pro	Gly val Arg Tyr Pro
115	120	125
Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro	Val Glu Pro Asp Glu
130	135	140
Glu Glu Asn Ser	Ser Leu Leu His Pro Ala Ser	Leu His Gly Thr Glu
145	150 155	160
Asp Thr Glu Arg	Glu Val Leu Lys Trp Lye Phe	Asp Ser His Leu Ala
	165 170	175
Phe His His Lys	Ala Arg Glu Leu His Pro Glu	Tyr Tyr Lys Asp Cys
180	185	190
Ala Leu Ala Phe	Lys Arg Val Glu Pro Val Asp	Pro Arg Leu Glu Pro
195	200	205
Trp Lye His Pro	Gly Ser Gin Pro Arg Thr Pro	Cys Thr Asn Cys Tyr
210	215	220
Cys Lys Lys Cys	Cys Leu His Cys Gin Val Cys	Phe Thr Arg Lye Gly
225	230 235	240
Leu Gly Ile Ser	Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg	Gin Arg Arg Arg Ala
	245 250	255
Pro Gin Asp Ser	Gin Thr His Gin Val Ser Leu	Pro Lys Gin Pro Ser
260	265	270
Ser Gin Gin Arg Gly Aep Pro Thr Gly Pro Lys Lye Ser Val Arg Glu
275	280	285
Lys Arg Leu Leu	Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys	Thr Pal Arg Leu Ile
290	295	300
Lye Phe Leu Tyr	Gin Ser Aen Pro Pro Pro Ser	Asn Glu Gly Thr Arg
305	310 315	320

Gin Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gin Arg Gin

325

330

335

Ile

Arg

Ser

Ile

Ser Glu

Arg

Ile

Leu

Ser

Thr

Phe

Leu

Gly Arg

Pro

340

345

350

Ala

Glu

Pro

Val

Pro Leu

Gin

Leu

Pro

Pro

Leu

Glu

Arg

Leu Thr

Leu

355

360

365

Asp

Cys

Ser

Glu

Asp CyB

Gly

Asn

Ser

Gly

Thr

Gin

Gly

Val Gly

Ser

370

375

380

Pro Gin Val Leu Val Glu

385 390 <210> 32 <211> 386 <212> PET <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Białko złożone z immunodominu j ących części białek regulatorowych Nef-Tat Rev począwszy od aal Nef (NIITR)

<401

3> :

32

Met

Trp

Pro

Thr

Val

Arg

Glu

Arg

Met

Lye

Gin

Ala

Glu

Pro

Glu

Pro

1

5

10

15

Ala

Ala

Asp

Gly

Val

Gly

Ala

Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Gly

20

25

30

Ala

Ile

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Thr

Asn

Asn

Ala

Ala

Cys

Ala

Trp

35

40

45

Leu

Glu

Ala

Gin

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Gly

Phe

Pro

Val

Arg

Pro

Gin

50

55

60

Val

Pro

Leu

Arg

Pro

Met

Thr

Tyr

Lys

Gly

Ala

Leu

Asp

Leu

Ser

His

PL 206 097 B1

65	70	75	80
Phe Leu	Lye Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu ile Tyr Ser Pro 85 90 95	Lye
Arg Gln	Glu Ile Leu Asp 100	Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr 105 110	Phe
Pro Asp	Trp Gln Asn Tyr 115	Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro 120 125	Leu
Thr Phe 130	Gly Trp Cys Phe	Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu 135 140	Glu
Glu Asn 145	Ser Ser Leu Leu 150	His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu 155	Asp 160
Thr Glu	Arg Glu Val Leu 165	Lys Trp Lys Phe Asp Ser Hie Leu Ala 170 175	Phe
His Hia	Lys Ala Arg Glu 180	Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys 135 190	Ala
Leu Ala	Ala Val Glu Pro 195	Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys 200 205	Hie
Pro Gly 210	Ser Gln Pro Arg	Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr cys Lye 215 220	Lye
Cys cys 225	Leu His Cys Gln 230	Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly 235	Ile 240
Ser Tyr	Gly Arg Lys Lys 245	Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln 250 255	Asp
Ser Gln	Thr His Gln Val 260	Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln 265 270	Gln
Arg Gly Asp Pro Thr Gly 275	Pro Lys Lys Ser Gly Leu Ala Ile Leu 280 285	Leu
Ser Aep 290	Glu Glu Leu Leu	Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu 295 300	Tyr
Gln Ser 305	Asn Pro Pro Pro 310	Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg 315 320
Asn Arg Arg Arg Arg Trp 325	Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser 330 335	Ile
Ser Glu	Arg Ile Leu Ser 340	Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro 345 350	Val
Pro Leu	Gln Leu Pro Pro 355	Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser 360 365	Glu
Aep Cys 370 Val Glu	Gly Asn Ser Gly	Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val 375 380	Leu

385 <210> 33 <211> 389 <212> PRT .

<213> Sztuczna sekwencja <220>

<223» Białko złożone z immunodominujących części białek regulatorowych Nef-TatRev począwszy od aal Nef oddzielonych miejscami trawienia proteaz (NllTR) <400» 33

Met

Trp

Pro

Thr

Val

Arg

Glu

Arg

Met

Lys

Gln

Ala

Glu

Pro

Glu

Pro

1

5

10

15

Ala

Ala

Asp

Gly

Val

Gly

Ala

Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

Glu

Lys

His

Gly

20

25

30

Ala

Ile

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Thr

Asn

Asn

Ala

Ala

Cys

Ala

Trp

35

40

45

Leu

Glu

Ala

Gln

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Gly

Phe

Pro

Val

Arg

Pro

Gln

50

55

60

Val

Pro

Leu

Arg

Pro

Met

Thr

Tyr

Lys

Gly

Ala

Leu

Asp

Leu

Ser

Hie

65

70

75

80

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Gly

Gly

Leu

Glu

Gly

Leu

Ile

Tyr

Ser

Pro

Lys

PL 206 097 B1

	85	90	95
Arg Gin Olu Ile Leu Asp Leu	Trp Val Tyr His	Thr Gin Gly Tyr Phe
	100	105	110
Pro Asp Trp Asn TYr	Pro Gly Pro Gly	Val Arg Tyr Pro Leu
	115	120	125
Thr Phe	Gly Trp Cys Phe Lys	Leu Val Pro Val	Glu Pro Asp Glu Glu
130	135		140
Glu Asn	Ser Ser Leu Leu His	Pro Ala Ser Leu	His Gly Thr Glu Asp
145	150	155	160
Thr Glu	Arg Glu Val Leu Lys	Trp Lys Phe Asp	Ser His Leu Ala Phe
	165	170	175
His His	Lys Ala Arg Glu Leu	His Pro Glu Tyr	Tyr Lys Asp Cys Ala
	180	185	190
Leu Ala	Phe Lys Arg Val Glu	Pro Val Asp Pro	Arg Leu Glu Pro Trp
	195	200	205
Lys His	Pro Gly Ser Gin Pro	Arg Thr Pro Cys	Thr Asn Cys Tyr Cys
210	215		220
Lys Lys	Cys Cys Leu His Cys	Gin Val Cys Phe	Thr Arg Lys Gly Leu
225	230	235	240
Gly Ile	Ser Tyr Gly Arg Lys	Lys Arg Arg Gin	Arg Arg Arg Ala Pro
	245	250	255
Gin Asp	Ser Gin Thr His Gin	Val Ser Leu Pro	Lys Gin Pro Ser Ser
	260	265	270
Gin Gin	Arg Gly Asp Pro Thr	Gly Pro Lys Lys	Ser Val Arg Glu Lys
	275	280	285
Arg Leu	Leu Ser Asp Glu Glu	Leu Leu Lys Thr	Val Arg Leu Ile Lys
290	295		300
Phe Leu	Tyr Gin Ser Asn Pro	Pro Pro Ser Asn	Glu Gly Thr Arg Gin
305	310	315	320
Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu	Arg Gin Arg Gin Ile
	325	330	335
Arg Ser	Ile Ser Glu Arg Ile	Leu Ser Thr Phe	Leu Gly Arg Pro Ala
	340	345	350
Glu Pro	Val Pro Leu Gin Leu	Pro Pro Leu Glu	Arg Leu Thr Leu Asp
	355	360	365
Cys Ser	Glu Asp Cys Gly Asn	Ser Gly Thr Gin	Gly Val Gly Ser Pro
370	375		380
Gin Val	Leu Val Glu
385
<210> 34
<211> 220
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja

<223> Białko złożone z epitopów cytotoksycznych komórek T genów Pol i Env (CTL) <400> 34

Met

Ile

Thr

Leu

Trp

Gin

Arg

Pro

Leu

Val

Ala

Leu

Ile

Glu

Ile

Cys

1

5

10

15

Thr

Glu

Met

Glu

Lys

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Ile

Gly

Pro

Ala

Gly

20

25

30

Leu

Lys

Lys

Lys

Lys

Ser

Val

Thr

Val

Leu

Asp

Val

Gly

Asp

Ala

Tyr

35

40

45

Phe

Ser

Val

Pro

Leu

Asp

Lys

Asp

Phe

Arg

Lys

Tyr

Thr

Ala

Phe

Thr

50

55

60

Ile

Pro

Ser

Ile

Trp

Lys

Gly

Ser

Pro

Ala

Ile

Phe

Gin

Ser

Ser

Met

65

70

75

80

Thr

Lys

Lys

Gin

Asn

Pro

Asp

Ile

Val

Ile

Tyr

Gin

Tyr

Met

Asp

Asp

85

90

95

Leu

Tyr

Val

Pro

Ile

Val

Leu

Pro

Olu

Lys

Asp

Ser

Trp

Leu

Val

Gly

PL 206 097 B1

	100	105	110
Lys	Leu Asn Trp	Ala Ser Gln Ile Tyr Ala Gly	Ile Lys Val Lye Gln
	115	120	125
Leu	Ile Leu Lye	Glu Pro Val His Gly Val Tyr	Glu Pro Ile Val Gly
	130	135	140
Ala	Glu Thr Phe	Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn	Arg Ala Gly Asn Leu
145		150 155	160
Trp	Val Thr Val	Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp	Lye Glu Ala Thr Thr
		165 170	175
Thr	Leu Val Glu	Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln	Leu Leu Gly Ile Trp
	180	185	190
Gly	Cys Ala Cys	Thr Pro Tyr Asp ile Asn Gln	Met Leu Arg Gly Pro
	195	200	205
Gly Arg Ala Phe	Val Thr Ile Arg Gln Gly Ser	Leu
	210	215	220

<210> 35 <211> 421 <212> PR1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Skrócona sekwencja białka Gag (dgag) <400> 35

Met Leu Asp Lys Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lye Lye 15 10 is

Lys Tyr Gln Leu Lye His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg

25 30

Phe Ala Val Aen Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln

40 45

Ile Met Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu

55 60

Arg Ser Leu Tyr Aen Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val Hie Gln Lye

70 7S 80

Ile Glu Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lye Val Glu Glu Glu

90 95

Gln Asn Aen Ser Lys Lye Lys Ala Gln Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gly

100 105 no

Aen Arg Aen Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln

115 120 125

Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp

130 135 140

Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met

145 150 155 160

Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met

165 170 175

Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu

180 185 190

Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His

195 200 205

Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp

210 215 220

Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr 225 230 235 240

Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile • 245 250 255

Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu

260 265 270

Asp Ile Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg

275 280 285

Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Thr Gln Glu val Lya Asn

290 295 300

PL 206 097 B1

Trp

Met

Thr

Glu

Thr

Leu

Leu

Val

Gln

Asn

Ala

Asn

Pro

Asp

Cys

Lys

305

310

315

320

Thr

Ile

Leu

Lys

Ala

Leu

Gly

Pro

Ala

Ala

Thr

Leu

Glu

Glu

Met

Met

325

330

335

Thr

Ala

Cys

Gln

Gly

Val

Gly

Gly

Pro

Gly

His

Lys

Ala

Arg

Val

Leu

340

345

350

Ala

Glu

Ala

Met

Ser

Gln

Val

Thr

Gly

Ser

Ala

Ala

Ile

Met

Met

Gln

355

360

365

Arg

Gly

Asn

Phe

Arg

Asn

Gln

Arg

Lys

Thr

Val

Lye

Cys

Phe

Asn

Cys

370

375

380

Gly

Lys

Glu

Gly

His

Ile

Ala

Arg

Asn

Cys

Arg

Ala

pro

Arg

Lys

Lys

385

390

395

400

Gly

Cys

Trp

Lys

Cys

Gly

Lys

Glu

Gly

His

Gln

Met

Lye

Asp

Cys

Thr

405

410

415

Glu

Arg

Gln

Ala

Asn

420 <210> 36 <211> 363 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja:

<220>

<223> Syntetyczne białko ρ17/24 genu Gag (Syn 17/24) <400> 36

Met Gly Ala Arg Ala	Ser	Val Leu Ser Gly Gly Glu	Leu	Asp Lys Trp
1 5		10		15
Glu Lys Ile Arg Leu	Arg	Pro Gly Gly Lys Lys Lys	Tyr	Gln Leu Lys
20		25		30
His Ile Val Trp Ala	Ser	Arg Glu Leu Glu Arg Phe	Ala	Val Asn Pro
35		40	45
Gly Leu Leu Glu Thr	Ser	Glu Gly Cys Arg Gln Ile	Met	Gly Gln Leu
50		55 60
Gln Pro Ser Leu Gln	Thr	Gly Ser Glu Glu Leu Arg	Ser	Leu Tyr Asn
65	70	75		80
Thr Val Ala Thr Leu	Tyr Cys Val His Gln Lys Ile	Glu	Val Lys Asp
85		90		95
Thr Lys Glu Ala Leu	Asp	Lys Val Glu Glu Olu Gln	Asn	Asn Ser Lys
100		105		110
Lys Lys Ala Gln Gln	Glu	Ala Ala Asp Ala Gly Asn	Arg	Asn Gln Val
115		120	125
Ser Gln Asn Tyr Pro	Ile	Val Gln Asn Leu Gln Gly	Gln	Met Val His
130		135 140
Gln Ala Ile Ser Pro	Arg	Thr Leu Asn Ala Trp Val	Lys	Val Val Glu
145	150	155		160
Glu Lys Ala Phe Ser	Pro	Glu Val Ile Pro Met Phe	Ser	Ala Leu Ser
165		170		175
Glu Gly Ala Thr Pro	Gln	Asp Leu Asn Thr Met Leu	Asn	Thr Val Gly
180		185		190
Gly His Gln Ala Ala	Met	Gln Met Leu Lys Glu Thr	Ile	Asn Glu Glu
195		200	205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg	Leu His Pro Val His Ala	Gly	Pro Ile Ala
210		215 220
Pro Gly Gln Met Arg	Glu	Pro Arg Gly Ser Asp Ile	Ala Gly Thr Thr
225	230	235		240
Ser Thr Leu Gln Glu	Gln	Ile Gly Trp Met Thr Asn	Asn	Pro Pro Ile
245		250		255
Pro Val Gly Glu Ile	Tyr Lye Arg Trp Ile Ile Leu	Gly	Leu Asn Lys
260		265		270
Ile Val Arg Met Tyr	Ser	Pro Thr Ser Ile Leu Asp	Ile	Lys Gln Gly
275		280	285
Pro Lys Glu Pro Phe	Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe	Tyr Lys Thr Leu

PL 206 097 B1

290 295 300

Arg Ala Olu Oln Ala Thr oln Olu Val Lya Asn Trp Met Thr Olu Thr

305 310 315 320

Leu Leu Val Oln Asn Ala Asn Pro Aep Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Oly Pro Ala Ala Thr Leu Olu Olu Met Met Thr Ala Cys Oln Oly

340 345 350

Val Oly Oly Pro Oly His Lys Ala Arg Val Leu

355 360 <210» 37 <211» 363 <212» PRT <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Syntetyczne białko pl7/24 genu Gag optymalizowane dla ekspresji w komórkach eukariotycznych (optl7/24) <400» 37

Met	Gly Ala	Arg Ala Ser	Val Leu Ser Oly Oly	Olu Leu Asp	Lys	Trp
1 Olu	Lys Ile	5 Arg Leu Arg	10 Pro Oly Oly Lys Lys	Lys Tyr Oln	15 Leu	Lys
His	Ile Val	20 Trp Ala Ser	25 Arg Glu Leu Glu Arg	30 Phe Ala Val	Asn	Pro
Oly	35 Leu Leu	Olu Thr Ser	40 Glu Gly Cys Arg Gln	45 Ile Met Oly	Gln	Leu
Oln	50 Pro Ser	Leu Gln Thr	55 Gly Ser Glu Glu Leu	60 Arg 3er Leu	Tyr	Asn
65 Thr	Val Ala	70 Thr Leu Tyr	75 Cys Val His Gln Lys	Ile Olu Val	Lys	80 Asp
Thr	Lye Glu	85 Ala Leu Asp	90 Lys Val Glu Glu Glu	Gln Asn Asn	95 Ser	Lys
Lys	Lys Ala	100 Oln Gln Glu	105 Ala Ala Asp Ala Gly	110 Asn Arg Asn	Gln	Val
Ser	115 Gln Asn	Tyr Pro Ile	120 Val Gln Asn Leu Gln	125 Gly Gln Met	Val	His
Gln	130 Ala Ile	Ser Pro Arg	135 Thr Leu Asn Ala Trp	140 Val Lys Val	Val	Glu
145 Glu	Lys Ala	150 Phe Ser Pro	155 Glu Val Ile Pro Met	Phe Ser Ala	Leu	160 Ser
Glu	Gly Ala	165 Thr Pro Gln	170 Asp Leu Asn Thr Met	Leu Asn Thr	175 Val	Giy
Gly His Gln	180 Ala Ala Met	185 Gln Met Leu Lys Olu	190 Thr Ile Asn	Glu Glu
Ala	195 Ala Glu	Trp Asp Arg	200 Leu Hia Pro Val His	205 Ala Gly Pro	Ile Ala
Pro	210 Gly Gln	Met Arg Glu	215 Pro Arg Oly Ser Asp	220 Ile Ala Oly	Thr	Thr
225 Ser	Thr Leu	230 Gln Glu Gln	235 Ile Oly Trp Met Thr	Asn Asn Pro	Pro	240 Ile
Pro	Val Gly	245 Olu Ile Tyr	250 Lys Arg Trp Ile Ile	Leu Oly Leu	255 Asn	Lys
Ile	Val Arg	260 Met Tyr Ser	265 Pro Thr Ser Ile Leu	270 Asp Ile Lya	Gln Oly
Pro	275 Lye Glu	280 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg	285 Phe Tyr Lya	Thr	Leu
Arg	290 Ala Glu	Gln Ala Thr	295 Gln Glu Val Lys Asn	300 Trp Met Thr	Glu	Thr
305 Leu	Leu Val	310 Oln Asn Ala	315 Asn Pro Asp Cys Lys	Thr Ile Leu	Lys	320 Ala
Leu	Gly Pro	325 Ala Ala Thr	330 Leu Glu Glu Met Met	Thr Ala Cys	335 Gln	Gly

PL 206 097 B1

340 345 350

Val Gly Gly Pro Gly Hia Lys Ala Arg Val Leu

355 360 <210» 38 <211» 641 <212» PRT <213> Sztuczna sekwencja!

<220» . , , <223» Hybrydowe białko złożone z Tat-Rev-Nef i CTL (TRN-CTL) <400» 38

Met Glu Pro Val	Asp Pro Arg	Leu Glu Pro Trp	Lya His Pro Gly	Ser
1	5	10	15
Gin Pro Arg Thr	Pro Cys Thr	Asn Cys Tyr Cys	Lys Lye Cys Cys	Leu
20		25	30
His Cye Gin Val	Cys Phe Thr	Arg Lys Gly Leu	Gly Ile Ser Tyr	Gly
35		40	45
Arg Lye Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala Pro	Gin Asp Ser Gin	Thr
50	55		60
His Gin Val Ser	Leu Pro Lys	Gin Pro Ser Ser	Gin Gin Arg Gly Asp
65	70	75		80
Pro Thr Gly Pro	Lys Lys Ser	Lys Lys Lys Val	Glu Arg Glu Thr	Glu
	85	90	95
Ala Asp Pro Phe	Asp Thr Ser	Ala Gly Arg Ser	Gly Asp Ser Asp	Glu
100		105	110
Glu Leu Leu Lys	Thr Val Arg	Leu Ile Lys Phe	Leu Tyr Gin Ser	Asn
115		120	125
Pro Pro Pro Ser	Asn Glu Gly	Thr Arg Gin Ala	Arg Arg Asn Arg Arg
130	135		140
Arg Arg Trp Arg	Glu Arg Gin	Arg Gin Ile Arg	Ser Ile Ser Glu Arg
145	150	155		160
Ile Leu Ser Thr	Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu	Pro Val Pro Leu Gin
	165	170	175
Leu Pro Pro Leu	Glu Arg Leu	Thr Leu Asp Cys	Ser Glu Asp Cys Gly
180		185	190
Asn Ser Gly Thr	Gin Gly Val	Gly Ser Pro Gin	Val Leu Val Glu	Ser
195		200	205
Pro Ala Val Leu	Glu Pro Gly	Thr Lys Glu Lys	Leu Val Gly Lye	Trp
210	215		220
Ser Lys Cys Ser	Gly Trp Pro	Thr Val Arg Glu	Arg Met Lys Gin	Ala
225	230	235		240
Glu Pro Glu Pro	Ala Ala Asp	Gly Val Gly Ala	Ala Ser Arg Asp	Leu
	245	250	255
Glu Lys His Gly	Ala Ile Thr	Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn	Ala
260		265	270
Ala Cys Ala Trp	Leu Glu Ala	Gin Glu Glu Glu	Glu Val Gly Phe	Pro
275		280	285
Val Arg Pro Gin	Val Pro Leu	Arg Pro Met Thr	Tyr Lys Gly Ala	Leu
290	295		300
Asp Leu Ser His	Phe Leu Lys	Glu Lys Gly Gly	Leu Glu Gly Leu	Ile
305	310	315		320
Tyr Ser Pro Lye	Arg Gin Glu	Ile Leu Asp Leu	Trp Val Tyr His	Thr
	325	330	335
Gin Gly Tyr Phe	Pro Asp Trp	Gin Asn Tyr Thr	Pro Gly Pro Gly Val
340		345	350
Arg Tyr Pro Leu	Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys	Leu Val Pro Val	Glu
355		360	365
Pro Asp Glu Glu	Glu Asn Ser	Ser Leu Leu His	Pro Ala Ser Leu	His
370	375		380
Gly Thr Glu Asp	Thr Glu Arg	Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp	Ser

385 390 395 400

PL 206 097 B1

His Leu Ala Phe His Hia	Lys Ala Arg Glu ' 410	Leu	His Pro Glu Tyr 415	Tyr
	405
Lye	Aep Cye Ala Ala Val	Ile Thr Leu Trp Gin Arg Pro Leu Val	Ala
	420	425		430
Leu	Ile Olu Ile Cye Thr	Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile 9er Lys
	435	440		445
Ile	Gly Pro Ala Gly Leu	Lys Lye Lys Lys	Ser Val Thr Val Leu Asp
	450	455		460
Val	Gly Asp Ala Tyr Phe	Ser Val Pro Leu	Asp Lys Asp Phe Arg Lys
465	470		475		480
Tyr	Thr Ala Phe Thr Ile	Pro Ser Ile Trp	Lys	Gly Ser Pro Ala	Ile
	485	490		495
Phe	Gin Ser Ser Met Thr	Lys Lys Gin Asn	Pro	Asp Ile Val Ile	Tyr
	500	505		510
Gin	Tyr Met Asp Asp Leu	Tyr Val Pro Ile	Val	Leu Pro Glu Lys Asp
	515	520		525
Ser	Trp Leu Val Gly Lye	Leu Asn Trp Ala	Ser	Gin Ile Tyr Ala	Gly
	530	535		540
Ile	Lys Val Lye Gin Leu	Ile Leu Lys Glu	Pro	Val His Gly Val	Tyr
545	550		555		560
Glu	Pro Ile Val Gly Ala	Glu Thr Phe Tyr	Val	Asp Gly Ala Ala	Asn
	565	570		575
Arg	Ala Gly Aen Leu Trp	Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val	Trp
	580	585		590
Lye	Glu Ala Thr Thr Thr	Leu Val Glu Arg Tyr	Leu Arg Asp Gin	Gin
	595	600		605
Leu	Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ala Cye Thr	Pro	Tyr Asp Ile Asn	Gin
	610	615		620
Met	Leu Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val	Thr	Ile Arg Gin Gly	Ser

625 630 635 640

Leu <210> 39 <211> 641 <212> PRT . , <213> Sztuczna sekwencja) <220>

<223> Hybrydowe białko złożone z Rev-Nef-Tat i CTL (RNT-CTL) <400> 39

Met	Ala Gly Arg Ser Gly Aep	Ser	Asp Glu Glu Leu	Leu Lys Thr	Val
1	5		10	15
Arg	Leu Ile Lys Phe Leu Tyr	Gin	Ser Asn Pro Pro	Pro Ser Asn	Glu
	20		25	30
Gly	Thr Arg Gin Ala Arg Arg	Asn	Arg Arg Arg Arg	Trp Arg Glu	Arg
	35	40		45
Gin	Arg Gin Ile Arg Ser Ile	Ser	Glu Arg Ile Leu	Ser Thr Phe	Leu
	50 55		60
Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val	Pro	Leu Gin Leu Pro	Pro Leu Glu	Arg
65	70		75		80
Leu	Thr Leu Asp Cys Ser Glu	Asp	Cys Gly Asn Ser	Gly Thr Gin	Gly
	85		90	95
Val	Gly Ser Pro Gin Val Leu	Val	Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu	Pro
	100		105	110
Gly	Thr Lys Glu Thr Ser Val	Gly	Lys Trp Ser Lys	Cys Ser Gly Txp
	115	120		125
Pro	Thr Val Arg Glu Arg Met	Lys	Gin Ala Glu Pro	Glu Pro Ala	Ala
	130 135		140
Asp	Gly Val Gly Ala Ala Ser	Arg Asp Leu Glu Lys	His Gly Ala	Ile
145	150		155		160
Thr	Ser Ser Asn Thr Ala Thr	Asn Aen Ala Ala Cys	Ala Trp Leu	Glu

PL 206 097 B1

165 170 175

Ala Gin Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gin Val Pro

180 185 190

Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser Kia Phe Leu

195 200 205

Lya Glu Lya Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg Gin 210 215 220

Glu	Ile Leu	Asp Leu Trp Pal Tyr	His Thr Gin Gly	Tyr Phe	Pro Asp
225 Trp	Gin Aan	230 Tyr Thr Pro Gly Pro	235 Gly Pal Arg Tyr	Pro Leu	240 Thr Phe
Gly Trp CyB	245 Phe Lys Leu Val Pro	250 Pal Olu Pro Asp	Glu Glu	255 Glu Asn
Ser	Ser Leu	260 Leu His Pro Ala Ser	265 Leu His Gly Thr	270 Glu Asp	Thr Glu
Arg	275 Glu Val	280 Leu Lys Trp Lys Phe	Aep Ser His Leu	285 Ala Phe	His His
Lya	290 Ala Arg	295 Glu Leu His Pro Glu	. 300 Tyr Tyr Lys Asp	Cys Lys	Leu Olu
305 Pro	Pal Asp	310 Pro Arg Leu Glu Pro	315 Trp Lys His Pro	Gly Ser	• 320 Gin Pro
Arg	Thr Pro	325 Cys Thr Asn Cys Tyr	330 Cys Lys Lys Cys	Cye Leu	335 His Cys
Gin	Pal Cye	340 Phe Thr Arg Lys Gly	345 Leu Gly Ile Ser	350 Tyr Gly Arg Lys
Lya	355 Arg Arg	360 Gin Arg Arg Arg Ala	Pro Gin Asp Ser	365 Gin Thr	His Gin
Val	370 Ser Leu	375 Pro Lys Gin Pro Ser	380 Ser Gin Gin Arg Gly Asp	Pro Thr
385 Gly	Pro Lye	390 Lys Ser Lys Lys Lys	395 Pal Glu Arg Glu	Thr Glu	400 Ala Asp
Pro	Phe Asp	405 Ala Ala Pal Ile Thr	410 Leu Trp Gin Arg	415 Pro Leu Val Ala
Leu	Ile Glu	420 Ile cys Thr Glu Met	425 430 Glu Lys Glu Gly Lye Ile	Ser Lys
Ile	435 Gly Pro	440 Ala Gly Leu Lys Lys	Lys Lys Ser Pal	445 Thr Pal	Leu Asp
Pal	450 455 Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Pal	460 Pro Leu Asp Lye	Asp Phe	Arg Lys
465 Tyr	Thr Ala	470 Phe Thr Ile Pro Ser	475 Ile Trp Lys Gly	Ser Pro	480 Ala Ile
Phe	Gin Ser	485 Ser Met Thr Lys Lys	490 Gin Asn Pro Asp	Ile Pal	495 Ile Tyr
Gin	Tyr Met	500 Asp Asp Leu Tyr Pal	505 Pro Ile Val Leu	510 Pro Glu	Lys Asp
Ser	515 Trp Leu	520 Val Gly Lys Leu Asn	Trp Ala Ser Gin	525 Ile Tyr	Ala Gly
Ile	530 Lys Val	535 Lys Gin Leu Ile Leu	540 Lys Glu Pro Val	His Gly	Pal Tyr
545 Glu	Pro Ile	550 Pal Gly Ala Glu Thr	555 Phe Tyr Pal Asp	Gly Ala	Ξ60 Ala Asn
Arg	565 Ala Gly Asn Leu Trp Val Thr	570 Pal Tyr Tyr Gly	Pal Pro	575 Pal Trp
Lya	Glu Ala	580 Thr Thr Thr Leu val	585 Glu Arg Tyr Leu	590 Arg Asp	Gin Gin
Leu	595 Leu Gly	600 Ile Trp Gly Cys Ala	605 Cys Thr Pro Tyr Asp Ile	Asn Gin
Met	610 615 Leu Arg Gly Pro Gly Arg Ala	620 Phe Pal Thr Ile Arg Gin Gly Ser

625 Leu	630	635	640
<210»	40
<211»	842

PL 206 097 B1 <212» PRT <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Hybrydowe białko złożone z Tat-Rev-Nef i skróconego białka

Gag (TRN-dgag)
<400» 40
Met Siu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lye His Pro Gly Ser
1 S 10 15
Gln Pro Arg Thr Pro Cye Thr Aen Cye Tyr Cye Lye Lye Cye Cys Leu
20 25 30
His Cye Gln Val Cys Phe Thr Arg Lya Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Lye Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr
50 55 60
Hie Gln Val Ser Leu Pro Lye Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp
65 70 75 80
Pro Thr Gly Pro Lye Lye Ser Lye Lye Lye Val Glu Arg Glu Thr Glu
85 90 95
Ala Asp Pro Phe Aep Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Aep Glu
100 · 105 110
Glu Leu Leu Lye Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn
115 120 125
Pro Pro Pro Ser Aen Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg
130 135 140
Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg
145 150 155 160
Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln
165 170 175
Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cya Ser Glu Asp Cys Gly
180 185 190
Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser
195 200 205
Pro Ala Val Leu Glu Pro Gly Thr Lye Glu Lys Leu Val Gly Lys Trp
210 215 220
Ser Lye Cys Ser Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lye Gln Ala
225 230 235 240
Glu Pro Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Aep Leu
245 250 255
Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala
260 265 270
Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro
275 280 285
Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lye Gly Ala Leu
290 295 300
Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lye Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile
305 310 315 320
Tyr Ser Pro Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr
325 330 335
Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val
340 345 350
Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu
355 360 365
Pro Asp Glu Glu Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His
370 375 380
Gly Thr Glu Asp Thr Glu Arg Glu Val Leu Lya Trp Lys Phe Asp Ser
385 390 395 400
His Leu Ala Phe His His Lys Ala Arg Olu Leu His Pro Glu Tyr Tyr
405 410 415
Lys Asp Cys Ala Ala Val Leu Asp Lys Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
420 425 430
Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser

PL 206 097 B1

435 440 445

Arg	Glu Leu Glu 450	Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser
455	460
Glu 465	Gly Cys Arg	Gln Ile Met Gly Gln Leu 470	Gln Pro Ser Leu Gln Thr 475 480
Gly	Ser Glu Glu	Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 485 490	Thr Val Ala Thr Leu Tyr 495
Cys	Val His Gln 500	Lys Ile Glu Val Lys Asp 505	Thr Lys Glu Ala Leu Asp 510
Lys	Val Glu Glu 515	Glu Gln Asn Asn Ser Lys 520	Lys Lys Ala Gln Gln Glu 525
Ala	Ala Asp Ala 530	Gly Asn Arg Asn Gln Val 535	Ser Gln Asn Tyr Pro Ile 540
Val 545	Gln Asn Leu	Gln Gly Gln Met Val His 550	Gln Ala Ile Ser Pro Arg 555 560
Thr	Leu Asn Ala	Trp Val Lye Val Val Glu 565 570	Glu Lys Ala Phe Ser Pro 575
Glu	Val Ile Pro 580	Met Phe Ser Ala Leu Ser 585	Glu Gly Ala Thr Pro Gln 590
Asp	Leu Asn Thr 595	Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met 600 605
Gln	Met Leu Lys 610	Glu Thr Ile Asn Glu Glu 615	Ala Ala Glu Trp Asp Arg '620
Leu 625	His Pro Val	His Ala Gly Pro Ile Ala 630	Pro Gly Gln Met Arg Glu 635 640
Pro	Arg Gly Ser	Asp Ile Ala Gly Thr Thr 645 650	Ser Thr Leu Gln Glu Gln 655
Ile	Gly Trp Met 660	Thr Asn Asn Pro Pro Ile 665	Pro Val Gly Glu Ile Tyr 670
Lys Arg Trp Ile 675	Ile Leu Gly Leu Asn Lys 680	Ile Val Arg Met Tyr Ser 685
Pro	Thr Ser Ile 690	Leu Asp Ile Lys Gln Gly 695	Pro Lye Glu Pro Phe Arg 700
Asp 705	Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 710	Arg Ala Glu Gln Ala Thr 715 720
Gln	Glu Val Lys	Asn Trp Met Thr Glu Thr 725 730	Leu Leu Val Gln Asn Ala 735
Asn	Pro Asp Cys 740	Lys Thr Ile Leu Lys Ala 745	Leu Gly Pro Ala Ala Thr 750
Leu	Glu Glu Met 755	Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His 760 765
Lys	Ala Arg Val 770	Leu Ala Glu Ala Met Ser 775	Gln Val Thr Gly Ser Ala 780
Ala 785	Ile Het Met	Gln Arg Gly Asn Phe Arg 790	Asn Gln Arg Lys Thr Val 795 800
Lys	Cys Phe Asn	Cys Gly Lys Glu Gly His 805 810	Ile Ala Arg Asn Cys Arg 815
Ala Met	Pro Arg Lys 820 Lys Asp Cys	Lys Gly Cys Trp Lys Cys 825 Thr Glu Arg Gln Ala Asn	Gly Lys Glu Gly His Gln 830

835 840 <210» 41 <211> 1064 <212» PRT , <213» sztuczna sekwencja <220» <223» Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Tat-Rev-Nef, CTL i ' skróconego białka Gag (TRN-CTL-dgag) <400> 41

Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser

PL 206 097 B1

5

Sin Pro Arg	Thr Pro 20	Cys	Thr Asn
Hie Cys Gln Val Cys	Phe	Thr Arg
35			40
Arg Lys Lys Arg Arg	Gln	Arg Arg
50			55
Hie Gln Val	Ser Leu	Pro	Lys Gln
65		70
Pro Thr Gly	Pro Lye	Lys	Ser Lye
	85
Ala Asp Pro	Phe Asp	Thr	Ser Ala
	100
Glu Leu Leu	Lys Thr	Val	Arg Leu
115			120
Pro Pro Pro	Ser Asn	Glu	Gly Thr
130			135
Arg Arg Trp Arg Glu	Arg	Gln Arg
145		150
Ile Leu Ser	Thr Phe	Leu	Gly Arg
	165
Leu Pro Pro	Leu Glu	Arg	Leu Thr
	180
Asn Ser Gly	Thr Gln	Gly	Val Gly
195			200
Pro Ala Val	Leu Glu	Pro	Gly Thr
210			215
Ser Lys Cys	Ser Gly	Trp	Pro Thr
225		230
Glu Pro Glu	Pro Ala	Ala	Asp Gly
	245
Glu Lys His	Gly Ala	Ile	Thr Ser
	260
Ala Cys Ala	Trp Leu	Glu	Ala Gln
275			280
Val Arg Pro	Gln Val	Pro	Leu Arg
290			295
Asp Leu Ser	His Phe	Leu	Lys Glu
305		310
Tyr' Ser Pro	Lys Arg	Gln	Glu Ile
	325
Gln Gly Tyr	Phe Pro	Asp	Trp Gln
	340
Arg Tyr Pro	Leu Thr	Phe	Gly Trp
355			360
Pro Asp Glu	Glu Glu	Asn	Ser Ser
370			375
Gly Thr Glu Asp Thr	Glu	Arg Glu
385		390
His Leu Ala	Phe His	His	Lys Ala
	405
Lys Asp Cys	Ala Ala	Val	Ile Thr
	420
Leu Ile Glu	Ile Cys	Thr	Glu Met
435			440
Ile Gly Pro	Ala Gly	Leu	Lys Lys
450			455
Val Gly Asp	Ala Tyr	Phe	Ser Val
465		470
Tyr Thr Ala	Phe Thr	Ile	Pro Ser
	485
Phe Gln Ser	Ser Met	Thr	Lys Lys
	500

10	10
Cys Tyr Cys Lye Lye Cys	Cys Leu
25 30
Lye Gly Leu Gly Ile Ser	Tyr Gly
45
Arg Ala Pro Gln Asp Ser	Gln Thr
60
Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp
75	80
Lys Lye Val Glu Arg Glu	Thr Glu
90	95
Gly Arg Ser Gly Asp Ser	Asp Glu
105 110
Ile Lye Phe Leu Tyr Gln	Ser Asn
125
Arg Gln Ala Arg Arg Asn	Arg Arg
140
Gln Ile Arg Ser Ile Ser	Glu Arg
155	160
Pro Ala Glu Pro Val Pro	Leu Gln
170	175
Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cye Gly
185 190
Ser Pro Gln Val Leu Val	Glu Ser
205
Lys Glu Lye Leu Val Gly Lye Trp
220
Val Arg Glu Arg Met LyB Gln Ala
235	240
Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu
250	255
Ser Asn Thr Ala Thr Asn	Asn Ala
265 270
Glu Glu Glu Glu Val Gly	Phe Pro
285
Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu
300
Lys Gly Gly Leu Glu Gly	Leu Ile
315	320
Leu Asp Leu Trp Val Tyr	His Thr
330	335
Asn Tyr Thr Pro Gly Pro	Gly Val
345 350
Cys Phe Lys Leu Val Pro	Val Glu
365
Leu Leu Kie Pro Ala Ser	Leu His
380
Val Leu Lys Trp Lys Phe	Asp Ser
395	400
Arg Glu Leu His Pro Glu	Tyr Tyr
410	415
Leu Trp Gln Arg Pro Leu	Val Ala
425 430
Glu Lys Glu Gly Lys Ile	Ser Lys
445
Lys Lys Ser Val Thr Val	Leu Asp
460
Pro Leu Asp Lys Asp Phe	Arg Lys
475	480
Ile Trp Lys Gly Ser Pro	Ala Ile
490	495
Gln Asn Pro Asp Ile Val	Ile Tyr
505 510

PL 206 097 B1

Gin Tyr	Met 515	Asp	Asp Leu	Tyr Pal Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp
520	525
Ser Trp	Leu	Pal	Gly Lys	Leu Asn Trp Ala Ser Oln Ile Tyr Ala Gly
530				535 540
Ile Lys	val	Lys	Gin Leu	Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Pal Tyr
545			550	555	560
Glu Pro	Ile	Pal	Gly Ala	Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn
			565	570	575
Arg Ala	Gly	Asn	Leu Trp	Pal Thr Pal Tyr Tyr Gly Val Pro Pal Trp
		580		585	590
Lys Glu Ala	Thr	Thr Thr	Leu Pal Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gin Gin
	595			600	605
Leu Leu	Gly	Ile	Trp Gly Cys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin
610				615 620
Met Leu	Arg	Gly	Pro Gly Arg Ala Phe Pal Thr Ile	Arg Gin Gly Ser
625			630	635	640
Leu Ala	Ala	Pal	Leu Asp Lys Trp Glu Lys Ile Arg	Leu Arg Pro Gly
			645	650	655
Gly Lys	Lys	Lys	Tyr Gin	Leu Lys His Ile Pal Trp	Ala Ser Arg Glu
		660		665	670
Leu Glu	Arg	Phe	Ala Val	Asn Pro Gly Leu Leu Glu	Thr Ser Glu Gly
	675			680	685
Cys Arg	Gin	Ile	Met Gly	Gin Leu Gin Pro Ser Leu	Gin Thr Gly Ser
690				695 700
Glu Glu	Leu	Arg	Ser Leu	Tyr Asn Thr Pal Ala Thr	Leu Tyr Cys Pal
705			710	715	720
His Gin	Lys	Ile	Glu Pal	Lys Asp Thr Lys Glu Ala	Leu Asp Lya Pal
			725	730	735
Glu Glu	Glu	Gin	Asn Asn	Ser Lys Lys Lys Ala Gin	Gin Glu Ala Ala
		740		745	750
Asp Ala	Gly	Asn	Arg Asn	Gin Pal Ser Gin Asn Tyr	Pro Ile Pal Gin
	755			760	765
Asn Leu	Gin	Gly	Gin Met	Pal His Gin Ala Ile Ser	Pro Arg Thr Leu
770				775 780
Asn Ala	Trp	Pal	Lys Val	Pal Glu Glu Lys Ala Phe	Ser Pro Glu Pal
785			790	795	800
Ile Pro	Met	Phe	Ser Ala	Leu Ser Glu Gly Ala Thr	Pro Gin Asp Leu

805 810 815

Asn	Thr Met	Leu Asn Θ20	Thr Pal Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met
825	830
Leu	Lys Glu	Thr Ile	Asn Glu Glu Ala	Ala Glu Trp Asp Arg Leu His
	835		840	845
Pro	Pal His	Ala Gly	Pro Ile Ala Pro	Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg
	850		855	860
Gly	Ser Asp	Ile Ala	Gly Thr Thr Ser	Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly
865			870	875 880
Trp	Met Thr	Asn Asn	Pro Pro Ile Pro	Pal Gly Glu Ile Tyr Lys Arg
		885		890 895
Trp	Ile Ile	Leu Gly	Leu Asn Lys Ile	Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr
		900	905	910
Ser	Ile Leu	Asp Ile	Lys Gin Gly Pro	Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr
	915		920	925
Val	Asp Arg	Phe Tyr	Lys Thr Leu Arg	Ala Glu Gin Ala Thr Gin Glu
	930		935	940
val	Lys Asn	Trp Met	Thr Glu Thr Leu	Leu Pal Gin Asn Ala Asn Pro
945			950	955 960
Asp Cys Lys	Thr Ile	Leu Lys Ala Leu	Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu

965 970 975

Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala 980 985 990

Arg Pal Leu Ala Glu Ala Met Ser Gin Pal Thr Gly Ser Ala Ala Ile 995 1000 1005

Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gin Arg Lys Thr Pal Lys

PL 206 097 B1

1010 1015 10au

Cye Phe Aso Cye Gly Lye Glu Gly Hie Ile Ala Arg Asn Cye Arg

1025 1030 1035

Ala Pro Arg Lye Lya Gly Cye Trp Lya Cye Gly Lye Glu Gly Hie

1040 1045 1050

Gln Met LyB Asp Cya Thr Glu Arg Gln Ala Asn

1055 1060 <210> 42 <211> 1064 <212» PRT .

<213» sztuczna sekwencja <220>

<223» Hybrydowe białko złożone z Tat-Rev-Nef, CTL i skróconego białka Gag (TRN ’ CTL-dgag) <400» 42

Met	Ala	Gly Arg Ser Gly	Aap Ser Asp	Glu Glu Leu Leu Lys Thr	Val
1 Arg	Leu	5 Ile Lya Phe Leu Tyr Gln Ser	10 15 Aan Pro Pro Pro Ser Aen	Glu
Gly	Thr	20 25 30 Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Olu	Arg
Gln	Arg	35 Gln Ile Arg Ser	40 Ile Ser Olu	45 Arg Ile Leu Ser Thr Phe	Leu
Gly	50 Arg	Pro Ala Glu Pro	55 Val Pro Leu	60 Gln Leu Pro Pro Leu Glu	Arg
65 Leu	Thr	70 Leu Asp Cys Ser	Glu Asp Cys	75 Gly Asn Ser Gly Thr Gln	80 Gly
Val	Gly	85 Ser Pro Gln Val	Leu Val Glu	90 95 Ser Pro Ala Val Leu Glu	Pro
Gly	Thr	100 Lye Glu Thr Ser	105 Val Gly Lye	110 Trp Ser Lye Cye Ser Gly	Trp
Pro	Thr	115 Val Arg Glu Arg	120 Met Lys Gln	125 Ala Glu Pro Glu Pro Ala	Ala
Asp	130 Gly	Val Gly Ala Ala	135 Ser Arg Asp	140 Leu Glu Lys His Gly Ala	Ile
145 Thr	Ser	150 Ser Asn Thr Ala	Thr Asn Asn	155 Ala Ala Cys Ala Trp Leu	160 Glu
Ala	Gln	165 Glu Glu Glu Glu	Val Gly Phe	170 175 Pro Val Arg Pro Gln Val	Pro
Leu	Arg	180 Pro Met Thr Tyr	185 Lya Gly Ala	190 Leu Asp Leu Ser Hie Phe	Leu
Lys	Glu	195 Lys Gly Gly Leu	200 Glu Gly Leu	205 Ile Tyr Ser Pro Lya Arg	Gln
Glu	210 Ile	Leu Asp Leu Trp	215 Val Tyr Hia	220 Thr Gln Gly Tyr Phe Pro	Asp
225 Trp	Gln	230 Asn Tyr Thr Pro	Gly Pro Gly	235 Val Arg Tyr Pro Leu Thr	240 Phe
Gly	Trp	245 Cys Phe Lys Leu	Val Pro Val	250 255 Glu Pro Asp Glu Glu Glu	Asn
Ser	Ser	260 Leu Leu His Pro	265 Ala Ser Leu	270 His Gly Thr Glu Asp Thr	Glu
Arg	275 280 Glu Val Leu Lye Trp Lye Phe Aep	285 Ser His Leu Ala Phe His	His
Lya	290 Ala	Arg Glu Leu His	295 Pro Glu Tyr	300 Tyr Lys Asp Cys Lye Leu	Glu
305 Pro	Val	310 Asp Pro Arg Leu	Glu Pro Trp	315 Lys His Pro Gly Ser Gln	320 Pro
Arg	Thr	325 Pro Cya Thr Asn	Cys Tyr Cya	330 335 Lys Lys Cya Cys Leu His	Cys
Gln	Val	340 345 350 Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys

PL 206 097 B1

355	360	365
Lye Arg Arg Gln Arg Arg Arg	Ala	Pro Gln Asp Ser Gln Thr His Gln
370 375		380
Val Ser Leu Pro Lya Gln Pro	Ser	Ser Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr
385 390		395 400
Gly Pro Lys Lys Ser Lya Lya	Lys	Val Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp
405		410 415
Pro Phe Asp Ala Ala val ile	Thr	Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Ala
420		425 430
Leu Ile Glu Ile Cye Thr Glu	Met	Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys
435	440	445
Ile Gly Pro Ala Gly Leu Lya	Lys	Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp
450 455		460
Val Gly Aap Ala Tyr Phe ser	Val	Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys
465 470		475 480
Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro	Ser	Ile Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile
485		490 495
Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys	Lys	Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr
500		505 510
Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr	Val	Pro ile Val Leu Pro Glu Lys Asp
515	520	525
Ser Trp Leu Val Gly Lys Leu	Asn	Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Ala Gly
530 535		540
Ile Lys Val Lys Gln Leu Ile	Leu	Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr
545 550		555 560
Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu	Thr	Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn
565		570 575
Arg Ala Gly Asn Leu Trp Val	Thr	Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp
580		585 590
Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu	Val	Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln
595	600	605
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cye	Ala	Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Aen Gln
610 615		620
Met Leu Arg Gly Pro Gly Arg	Ala	Phe Val Thr Ile Arg Gln Gly Ser
625 630		635 640
Leu Ala Ala Val Leu Aep Lys	Trp	Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly
645		650 655
Gly Lys Lye Lys Tyr Gln Leu	Lys	His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu
660		665 670
Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn	Pro	Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly
675	680	685
Cys Arg Gln Ile Met Gly Gln	Leu	Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser
690 695		700
Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr	Asn	Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val
705 710		715 720
His Gln Lys Ile Glu Val Lys Asp	Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Val
725		730 735
Glu Glu Glu Gln Asn Asn Ser	Lys	Lys Lye Ala Gln Gln Glu Ala Ala
740		745 750
Asp Ala Gly Asn Arg Asn Gln	Val	Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln
755	760	765
Asn Leu Gln Gly Gln Met Val	His	Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu
770 775		780
Asn Ala Trp Val Lys Val Val	Glu	Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val
785 790		795 800
Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu	Ser	Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu
805		810 815
Asn Thr Met Leu Asn Thr Val	Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met
820		825 830
Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu	Glu	Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu Hia
835	840	845
Pro Val His Ala Gly Pro Ile	Ala	Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg
850 855		860

PL 206 097 B1

Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly 865 870 875 880

Trp Met Thr Asn Asn	Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg
885	890	895
Trp Ile Ile Leu Gly 900	Leu Asn Lys Ile Tal Arg Met 905	Tyr Ser Pro Thr 910
Ser Ile Leu Asp Ile 915	Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro 920	Phe Arg Asp Tyr 925
Val Asp Arg Phe Tyr Lya Thr Leu Arg Ala Glu Gln 930 935 940	Ala Thr Gln Glu
Val Lys Asn Trp Met 945	Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln 950 955	Asn Ala Asn Pro 960
Asp Cys Lys Thr Ile 965	Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala 970	Ala Thr Leu Glu 975
Glu Met Met Thr Ala	Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro	Gly His Lys Ala

980 985 990

Arg Val Leu Ala Glu Ala Ket Ser Gln Val Thr Gly Ser Ala Ala Ile 995 1000 . 1005

Met Met Gln Arg Gly Aen Phe Arg Asn Gln Arg Lye Thr Val Lye 1010 1015 1020

Cys

Phe

Asn

Cys

Gly

Lys

Glu

Gly

His

Ile

Ala

Arg

Asn

Cys

Arg

1025

1030

1035

Ala

Pro

Arg

Lys

Lys

Gly

Cys

Trp

Lys

Cys

Gly

Lys

Glu

Gly

Kle

1040

1045

1050

Gln

Met

Lys

Aap

Cys

Thr

Glu

Arg

Gln

Ala

Asn

1055 1060 <210> 43 <211> 1064 <212> PRT . , <213> Sztuczna sekwencja <223> Hybrydowe białko złożone z Tat-Rev-Nef, skróconego białka Gag i CTL (TRN

c	tgag-CTL)
<400> 43
Met Glu 1	Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 5 10 15
Gln Pro	Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu 20 25 30
His Cys	Gln Val Cys Phe Thr Arg Lye Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 35 40 - 45
Arg Lys 50	Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr 55 60
His Gln 65	Val Ser Leu pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp 70 75 80
Pro Thr	Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu 85 90 95
Ala Asp	Pro Phe Asp Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu 100 105 110
Glu Leu	Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn 115 120 125
Pro Pro 130	Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg 135 140

Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg 145 150 155 160 Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln

165 170 175

Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Aap Cys Ser Glu Aap Cys Gly

180 185 190

Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser

195 200 205

PL 206 097 B1

Pro Ala Val 210	Leu	Glu Pro Gly Thr Lys Glu Lys Leu vax uiy nys rrp
215	220
Ser Lya Cys 225	Ser	Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gin Ala 230 235 240
Olu Pro Olu	Pro	Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu 245 250 255
Olu Lya His	Gly Ala Ile Thr Ser 260	Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala 265 270
Ala Cya Ala 275	Trp	Leu Glu Ala Gin 280	Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro 285
Val Arg Pro 290	Gin	Val Pro Leu Arg 295	Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu 300
Asp Leu Ser 305	His	Phe Leu Lys Glu 310	Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile 315 320
Tyr Ser Pro	Lys Arg Gin Glu ile 325	Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr 330 335
Gin Gly Tyr	Phe 340	Pro Asp Trp Gin	Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val 345 350
Arg Tyr Pro . 355	Leu	Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu 360 365
Pro Asp Glu 370	Glu Glu Asn Ser Ser 375	Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His 380
Gly Thr Glu 385	Asp	Thr Glu Arg Glu 390	Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser 395 400
His Leu Ala	Phe	His His Lys Ala 405	Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr 410 415
Lys Asp Cys	Ala 420	Ala Val Leu Asp	Lys Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg 425 430
Pro Gly Gly Lys 435	Lys Lys Tyr Gin 440	Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser 445
Arg Olu Leu Glu 450	Arg Phe Ala Val 455	Asn Pro Gly Leu Leu Olu Thr Ser 460
Glu Gly Cys Arg 465	Gin Ile Met Gly 470	Gin Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr 475 480
Gly Ser Glu	Glu	Leu Arg Ser Leu 485	Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr 490 495
Cys Val His	Gin 500	Lys Ile Glu Val	Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp 505 510
Lys Val Glu 515	Glu	Glu Gin Asn Asn 520	Ser Lys Lys Lys Ala Gin Gin Glu 525
Ala Ala Asp 530	Ala	Gly Asn Arg Asn 535	Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro Ile 540
val Gin Asn 545	Leu	Gin Gly Gin Met 550	Val His Gin Ala Ile Ser Pro Arg 555 560
Thr Leu Asn	Ala	Trp Val Lys Val 565	Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro 570 575
Glu Val Ile	Pro 580	Met Phe Ser Ala	Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin 585 590
Asp Leu Asn 595	Thr	Met Leu Asn Thr 600	Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met 605
Gin Met Leu 610	Lys	Glu Thr Ile Asn 615	Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg 620
Leu His Pro 625	Val	His Ala Gly Pro 630	Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu 635 640
Pro Arg Gly	Ser	Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin 645 650 655
Ile Gly Trp	Met 660	Thr Asn Asn Pro	Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr 665 670
Lys Arg Trp 675	Ile	Ile Leu Gly Leu 680	Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser 685
Pro Thr Ser 690	Ile	Leu Asp Ile Lys 695	Gin Gly Pro Lye Glu Pro Phe Arg 700
Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys	Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Thr

PL 206 097 B1

705	710	715	720
Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr 725	Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala 730 735
Asn Pro	Asp Cys Lys Thr Ile Leu 740	Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr 745 750
Leu Glu	Glu Met Met Thr Ala Cys 755 760	Gin Gly Val Gly Gly Pro 765	Gly His
Lys Ala 770	Arg Val Leu Ala Glu Ala 775	Met Ser Gin Val Thr Gly 780	Ser Ala
Ala Ile 785	Met Met Gin Arg Gly Asn 790	Phe Arg Asn Gin Arg Lys 795	Thr Val 800
Lys Cye	Phe Asn Cys Gly Lys Glu 805	Gly His Ile Ala Arg Asn 810	Cys Arg 815
Ala Pro	Arg Lys Lys Gly Cys Trp 820	Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin 825 830
Met Lys	Asp Cys Thr Glu Arg Gin 835 840	Ala Asn Ala Ala Val Ile 845	Thr Leu
Trp Gin 850	Arg Pro Leu Val Ala Leu 855	Ile Glu Ile Cye Thr Glu 860	Met Glu
Lys Glu 865	Gly Lys Ile Ser Lys Ile 870	Gly Pro Ala Gly Leu Lys 875	Lya Lys Θ80
Lys Ser	Val Thr Val Leu Asp Val 885	Gly Asp Ala Tyr Phe Ser 890	Val Pro 895
Leu Asp	Lys Asp Phe Arg Lys Tyr 900	Thr Ala Phe Thr Ile Pro 905 910	Ser Ile
Trp Lys	Gly Ser Pro Ala Ile Phe 915 920	Gin Ser Ser Met Thr Lys 925	Lys Gin
Asn Pro 930	Asp Ile Val Ile Tyr Gin 935	Tyr Met Asp Asp Leu Tyr 940	Val Pro
Ile Val 945	Leu Pro Glu Lys Asp Ser 950	Trp Leu Val Gly Lys Leu 955	Asn Trp 960
Ala Ser	Gin Ile Tyr Ala Gly Ile 965	Lys Val Lys Gin Leu Ile 970	Leu Lys 975
Glu Pro	Val His Gly Val Tyr Glu 980	Pro Ile Val Gly Ala Glu 985 990	Thr Phe
Tyr Val	Asp Gly Ala Ala Asn Arg	Ala Gly Asn Leu Trp Val Thr Vi

995 1000 1005

Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lya Glu Ala Thr Thr Thr Leu Val

1010 1015 1020

Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gin Gin Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys

1025 1030 1035

Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met Leu Arg Gly Pro Gly

1040 1045 1050

Arg Ala Phe Val Thr Ile Arg Gin Gly Ser Leu

1055 1060 <210> 44 <211> 1064 <212> PRT <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Hybrydowe białko złożone z Rev-Nef-Tat, skróconego białka Gag i CTL ' (RNT-dgag-CTL) <400> 44

Met

Ala

Gly

Arg

Ser

Gly

Asp

Ser

Asp

Glu

Glu

Leu

Leu

Lys

Thr

Val

1

5

10

15

Arg

Leu

Ile

Lys

Phe

Leu

Tyr

Gin

Ser

Asn

Pro

Pro

Pro

Ser

Asn

Glu

20

25

30

Gly

Thr

Arg

Gin

Ala

Arg

Arg

Asn

Arg

Arg

Arg

Arg

Trp

Arg

Glu

Arg

35

40

45

Gin

Arg

Gin

Ile

Arg

Ser

Ile

Ser

Glu

Arg

Ile

Leu

Ser

Thr

Phe

Leu

PL 206 097 B1

50

55

60

Gly

Arg

Pro

Ala

Glu

Pro

Val

Pro

Leu

Gin

Leu

Pro

Pro

Leu

Glu

Arg

65

70

Gly

75

80

Leu

Thr

Leu

Asp

cye

Ser

Glu

Asp

Cys

Asn

Ser

Gly

Thr

Gin

Gly

B5

90

95

Val

Gly

Ser

Pro

Gin

Val

Leu

Val

Glu

Ser

Pro

Ala

Val

Leu

Glu

Pro

100

105

110

Gly

Thr

Lys

Glu

Thr

Ser

Val

Gly

Lys

Trp

Ser

Lys

cys

Ser

Gly

Trp

115

120

125

Pro

Thr

Val

Arg

Glu

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Glu

Pro

Glu

Pro

Ala

Ala

130

135

140

Asp

Gly

Val

Gly

Ala

Ala

Ser

Arg

Aep

Leu

Olu

Lys

His

Gly

Ala

Ile

145

150

155

160

Thr	Ser Ser	Asn	Thr 165	Ala Thr Asn Asn Ala 170	Ala Cys Ala Trp Leu 175	Glu
Ala	Gin Glu	Glu	Glu Glu Val Gly Phe Pro	Val Arg Pro Gin Val	Pro
		180		185	190
Leu	Arg Pro	Met	Thr	Tyr Lys Gly Ala Leu	Asp Leu Ser His Phe	Leu
	195			200	205
Lys	Glu Lys	Gly Gly	Leu Glu Gly Leu Ile	Tyr Ser Pro Lye Arg	Gin
	210			215	220
Glu	Ile Leu	Asp	Leu	Trp Val Tyr His Thr	Gin Gly Tyr Phe Pro	Asp
225				230	235	240
Trp	Gin Aen	Tyr	Thr	Pro Gly Pro Gly Val	Arg Tyr Pro Leu Thr	Phe
			245	250	255
Gly Trp Cys	Phe	Lys	Leu Val Pro Val Glu	Pro Asp Glu Glu Glu	Aen
		260		265	270
Ser	Ser Leu	Leu	His	Pro Ala Ser Leu His	Gly Thr Glu Asp Thr	Glu
	275			280	285
Arg	Glu Val	Leu	Lys	Trp Lys Phe Asp Ser	His Leu Ala Phe His	His
	290			295	300
Lys	Ala Arg	Olu	Leu	His Pro Glu Tyr Tyr	Lys Asp Cys Lys Leu	Glu
305				310	315	320
Pro	Val Asp	Pro	Arg	Leu Glu Pro Trp Lye	His Pro Gly Ser Gin	Pro
			325	330	335
Arg	Thr Pro	Cys	Thr	Aen Cys Tyr Cys Lys	Lys Cys Cys Leu His	Cye
		340		345	350

Gin Val Cye Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 355 360 365

Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala Pro Gin Aep Ser Gin Thr His Gin

370	375	380
Val Ser Leu Pro	Lys Gin Pro Ser Ser	Gin Gin Arg Gly Asp Pro Thr
385	390	395 400
Gly Pro Lye Lys	Ser Lys Lys Lys Val	Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp
	405	410 415
Pro Phe Asp Ala	Ala Val Leu Asp Lys	Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
420	425	430
Pro Gly Gly Lys	Lys Lys Tyr Gin Leu	Lys His Ile Val Trp Ala Ser
435	440	445
Arg Glu Leu Glu	Arg Phe Ala Val Asn	Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser
450	455	460
Glu Gly Cys Arg	Gin Ile Met Gly Gin	Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr
465	470	475 480
Gly Ser Glu Glu	Leu Arg Ser Leu Tyr	Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr
	485	490 495
Cys Val His Gin	Lys Ile Glu Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Aap
500	505	510
Lys Val Glu Glu	Glu Gin Asn Asn Ser Lys Lys Lys Ala Gin Gin Glu
515	520	525
Ala Ala Asp Ala	Gly Asn Arg Asn Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro Ile
530	535	540
Val Gin Asn Leu	Gin Gly Gin Met Val	His Gin Ala Ile Ser Pro Arg
545	550	555 560

PL 206 097 B1

Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro
	565	570	575
Glu Val Ile	Pro Met	Phe Ser Ale Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln
	580	585	590
Asp Leu Asn	Thr Met	Leu Asn Thr Val Gly Gly His	Gln Ala Ala Met
595		600	605
Gln Met Leu	Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala	Glu Trp Asp Arg
610		615 620
Leu His Pro	Val His	Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly	Gln Met Arg Glu
625		630 635	640
Pro Arg Gly	Ser Asp	Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr	Leu Gln Glu Gln
	645	650	655
Ile Gly Trp	Met Thr	Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val	Gly Glu Ile Tyr
	660	665	670
Lys Arg Trp	Ile Ile	Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val	Arg Met Tyr Ser
675		680	685
Pro Thr Ser	Ile Leu	Asp ile Lys Gln Gly Pro Lys	Glu Pro Phe Arg
690		695 700
Asp Tyr Val	Asp Arg	Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala	Glu Gln Ala Thr
705		710 715	720
Gln Glu Val	Lys Asn	Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu	val Gln Asn Ala
	725	730	735
Asn Pro Asp Cys Lys	Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly	Pro Ala Ala Thr
	740	745	750
Leu Glu Glu	Met Met	Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His
755		760	765
Lys Ala Arg	Val Leu	Ala Glu Ala Met Ser Gln Val	Thr Gly Ser Ala
770		775 780
Ala Ile Met	Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lye Thr Val
785		790 795	800
Lys Cys Phe	Asn Cys Gly Lys Olu Gly His Ile Ala	Arg Asn Cys Arg
	805	810	815
Ala Pro Arg	Lys Lys	Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys	Glu Gly Hie Gln
	820	825	830
Met Lys Asp	Cys Thr	Glu Arg Gln Ala Asn Ala Ala	Val Ile Thr Leu
835		840	845
Trp Gln Arg	Pro Leu	Val Ala Leu Ile Glu Ile Cys	Thr Glu Met Glu
850		855 860
Lys Glu Gly Lys Ile	Ser Lys Ile Gly Pro Ala Gly	Leu Lys Lys Lys
865		870 875	880
Lys Ser Val Thr Val	Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr	Phe Ser Val Pro
	885	890	895
Leu Asp Lys Aap Phe	Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr	Ile Pro Ser Ile
	900	905	910
Trp Lys Gly	Ser Pro	Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met	Thr Lys Lys Gln
915		920	925
Asn Pro Asp	Ile Val	Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp	Leu Tyr Val Pro
930		935 940
Ile Val Leu	Pro Glu	Lys Asp Ser Trp Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp
945		950 955	960
Ala Ser Gln	Ile Tyr	Ala Gly Ile Lys Val Lys Gln Leu Ile Leu Lys
	965	970	975
Glu Pro Val	His Gly Val Tyr Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe
	980	. 985	990
Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg Ala Gly Asn Leu Trp Val Thr Val

995 1000 1005

Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Val

1010 1015 1020

Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys

1025 1030 1035

Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln (fet Leu Arg Gly Pro Gly

1040 1045 1050

Arg Ala Phe Val Thr Ile Arg Gln Gly Ser Leu

PL 206 097 B1

1055 1060 <210> 45 <211> 1006 <212> PRT .

<21ϊ> Sztuczna sekwencja <223» Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Tat-Rev-Nef, skróconeg ' białka Gag i CTL (TRN-optpl7/24-CTL) <400> 45

Met	Glu Pro	Val Asp Pro Arg Leu	Glu Pro Trp Lys	His	Pro Gly	Ser
1		5	10		15
Gln	Pro Arg	Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys	Lys	Cys Cys Leu
		20	25.		30
His	Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly	Ile	Ser Tyr Gly
	35	40		45
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln	Asp	Ser Gln Thr
	50	55	60
His	Gln Val	Ser Leu Pro Lys Gln	Pro Ser Ser Gln	Gln Arg Gly Asp
65		70	75			80
Pro	Thr Gly	Pro Lys Lys Ser Lys	Łys Lys Val Glu	Arg	Glu Thr	Glu
		85	90		95
Ala	Asp Pro	Phe Asp Thr Ser Ala	Gly Arg Ser Gly Asp	Ser Asp	Glu·
		100	105		110
Glu	Leu Leu	Lys Thr Val Arg Leu	Ile Lys Phe Leu Tyr	Gln Ser	Asn
	115	120		125
Pro	Pro Pro	Ser Asn Glu Gly Thr	Arg Gln Ala Arg Arg	Asn Arg Arg
	130	135	140
Arg	Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg	Gln Ile Arg Ser	Ile	Ser Glu	Arg
145		150	155			160
Ile	Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg	Pro Ala Glu Pro	Val	Pro Leu	Gln
		165	170		175
Leu	Pro Pro	Leu Glu Arg Leu Thr	Leu Asp Cys Ser	Glu	Asp Cye	Gly
		180	185		190
Asn	Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly	Ser Pro Gln val	Leu	Val Glu	Ser
	195	200		20S
Pro	Ala Val	Leu Glu Pro Gly Thr	Lys Glu Lys Leu	Val	Gly Lys	Trp
	210	215	220
Ser	Lys Cys	Ser Gly Trp Pro Thr	Val Arg Glu Arg	Met	Lys Gln Ala
225		230	235			240
Glu	Pro Glu	Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala	Ser	Arg Asp	Leu
		245	250		255
Glu	Lys His	Gly Ala Ile Thr Ser	Ser Asn Thr Ala	Thr	Asn Asn	Ala
		260	265		270
Ala	Cys Ala	Trp Leu Glu Ala Gln	Glu Glu Olu Glu	Val	Gly Phe	Pro
	275	280		285
Val	Arg Pro	Gln Val Pro Leu Arg	Pro Met Thr Tyr Lys	Gly Ala	Leu
	290	295	300
Asp	Leu Ser	His Phe Leu Lys Glu	Lys Gly Gly Leu	Glu	Gly Leu	Ile
305		310	315			320
Tyr	Ser Pro	Lys Arg Gln Glu Ile	Leu Asp Leu Trp	Val	Tyr His	Thr
		325	330		335
Gln	Gly Tyr	Phe Pro Asp Trp Gln	Asn Tyr Thr Pro	Gly	Pro Gly Val
		340	345		350
Arg	Tyr Pro	Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu	Val	Pro Val	Glu
	355	360		365
Pro	Asp Glu	Olu Glu Asn Ser Ser	Leu Leu His Pro	Ala	Ser Leu	His
	370	375	380
Gly	Thr Glu	Asp Thr Glu Arg Glu	Val Leu Lys Trp Lys	Phe Asp	Ser
365		390	395			400
His	Leu Ala	Phe His His Lys Ala	Arg Glu Leu His	Pro	Glu Tyr	Tyr

PL 206 097 B1

405 410 415

Lys Asp Cya Ala Ala Val Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly

420 425 430

Glu Leu Aap Lye	Trp Glu Lye	Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lya
	435	440	445
Lya Tyr	Gln Leu	Lye Hie Ile	Val	Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg
450		455		460
Phe Ala	Val Asn	Pro Gly Leu	Leu	Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln
465		470		475 480
Ile Met	Gly Gln	Leu Gln Pro	Ser	Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu
		485		490 495
Arg Ser	Leu Tyr	Asn Thr Val	Ala	Thr Leu Tyr Cya Val Hia Gln Lya
	500			505 510
Ile Glu	Val Lye	Asp Thr Lye	Glu Ala Leu Aap Lye Val Glu Glu Glu
	515		520	525
Gln Aan	Asn Ser	Lya Lye Lya	Ala Gln Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gly
530		535		540
Aan Arg	Aan Gln	Val Ser Gln	Aen	Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln
545		550		555 560
Gly Gln	Met Val	Hia Gln Ala	Ile	Ser Pro Arg Thr Leu Aan Ala Trp
		565		570 575
Val Lya	Val Val	Glu Glu Lye	Ala	Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met
	580			585 590
Phe 9er	Ala Leu	Ser Glu Gly Ala	Thr Pro Gln Aap Leu Aan Thr Met
	595		600	605
Leu Aen	Thr Val	Gly Gly Hie	Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu
610		615		620
Thr Ile	Asn Glu	Glu Ala Ala	Glu Trp Aap Arg Leu His Pro Val Hia
625		630		635 640
Ala Gly	Pro Ile	Ala Pro Gly	Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Aep
		645		650 655
Ile Ala	Gly Thr	Thr Ser Thr	Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr
	660			665 670
Asn Asn	Pro Pro	Ile Pro Val	Gly Glu Ile Tyr Lya Arg Trp Ile Ile
	675		680	685
Leu Gly	Leu Asn	Lya Ile Val	Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu
690		695		700
Asp Ile	Lys Gln Gly Pro Lya	Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg
705		710		715 720
Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala	Glu Gln Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn
		725		730 735
Trp Met	Thr Glu Thr Leu Leu	Val	Gln Asn Ala Aan Pro Asp Cys Lye
	740			745 750
Thr Ile	Leu Lys	Ala Leu Gly	Pro	Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met
	755		760	765
Thr Ala	Cys Gln	Gly Val Gly Gly	Pro Gly His Lya Ala Arg Val Leu
770		775		780
Ala Ala Val Ile	Thr Leu Trp	Gln	Arg Pro Leu Val Ala Leu Ile Glu
785		790		795 300
Ile Cys	Thr Glu	Met Glu Lys	Glu	Gly Lya Ile Ser Lys Ile Gly Pro
		805		810 815
Ala Gly	Leu Lys	Lya Lys Lya	Ser	Val Thr Val Leu Aap Val Gly Asp
	820			825 ' 830
Ala Tyr	Phe Ser	Val Pro Leu	Asp Lya Aap Phe Arg Lya Tyr Thr Ala
	835		840	845
Phe Thr	Ile Pro	Ser Ile Trp	Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser
850		855		860
Ser Met	Thr Lys	Lys Gln Aan	Pro	Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met
865		Θ70		875 880
Asp Asp	Leu Tyr	Val Pro Ile	Val	Leu Pro Glu Lya Asp Ser Trp Leu
		385		890 895
Val Gly Lya Leu	Aan Trp Ala	Ser	Gln Ile Tyr Ala Gly Ile Lys Val
	900			905 910

PL 206 097 B1

Lys

Gin

Leu

Ile

Leu

Lys

Glu

Pro

Val

His

Gly

Val

Tyr

Glu

Pro

Ile

915

920

925

Val

Gly

Ala

Glu

Thr

Phe

Tyr

Val

Asp

Gly

Ala

Ala

Asn

Arg

Ala

Gly

930

935

940

Asn

Leu

Trp

Val

Thr

Val

Tyr

Tyr

Gly

Val

Pro

Val

Trp

Lys

Glu

Ala

945

Thr

950

955

960

Thr

Thr

Leu

Val

Glu

Arg

Tyr

Leu

Arg

Asp

Gin

Gin

Leu

Leu

Gly

965

970

975

Ile

Trp

Gly

Cys

Ala

Cys

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ile

Asn

Gin

Met

Leu

Arg

980

985

990

Gly

Pro

Gly

Arg

Ala

Phe

Val

Thr

Ile Arg Gin Gly Ser Leu

995 1000 1005 <210> 45 <211> 1006 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Hybrydowa sekwencja kodująca białko złożone z Tat-Rev-Nef, CTL i skróconego białka Gag (TRN-CTL-optpl7/24)

<400> 46

Met

Glu

Pro

Val

Asp

Pro

Arg

Leu

Glu

Pro

Trp

Lys

His

Pro

Gly

Ser

1

5

10

15

Gin

Pro

Arg

Thr

Pro

Cys

Thr

Asn

cys

Tyr

Cys

Lys

Lys

cys

Cys

Leu

20

25

30

His

Cys

Gin

Val

Cys

Phe

Thr

Arg

Lys

Gly

Leu

Gly

Ile

Ser

Tyr

Gly

35

40

45

Arg

Lys

Lys

Arg

Arg

Gin

Arg

Arg

Arg

Ala

Pro

Gin

Asp

Ser

Gin

Thr

50

55

60

HiS

Gin

Val

Ser

Leu

Pro

Lys

Gin

Pro

Ser

Ser

Gin

Gin

Arg

Gly

Asp

65

70

75

80

Pro

Thr

Gly

Pro

Lys

Lys

Ser

Lys

Lys

Lys

Val

Glu

Arg

Glu

Thr

Glu

85

90

95

Ala

Asp

Pro

Phe

Asp

Thr

Ser

Ala

Gly

Arg

Ser

Gly

Asp

Ser

Asp

Glu

100

105

110

Glu

Leu

Leu

Lys

Thr

Val

Arg

Leu

Ile

Lys

Phe

Leu

Tyr

Gin

Ser

Asn

115

120

125

Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gin Ala Arg Arg Asn Arg Arg 130 135 140

Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gin Arg Gin Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg

145 150 155 160

Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gin

165 170 175

Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly

180 185 190

Asn Ser Gly Thr Gin Gly Val Gly Ser Pro Gin Val Leu Val Glu Ser

195 200 205

Pro Ala Val Leu Glu Pro Gly Thr Lys Glu Lys Leu Val Gly Lys Trp

210 215 220

Ser Lys Cys Ser Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Mfet Lye Gin Ala

225 230 235 240

Glu Pro Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu

245 250 255

Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala

260 265 270

Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gin Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro

275 280 285

Val Arg Pro Gin Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu

290 295 300

Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lye Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile 305 310 315 320

PL 206 097 B1

Tyr Ser Pro Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp vai Tyr His Tnr 325 330 335

Gln Gly Tyr Phe Pro Aep Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val 340 345 350

Arg Tyr Pro	Leu Thr	Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu
355	360	36S
Pro Aep Glu Glu Glu 370	Asn Ser Ser Leu 375	Leu Hia Pro Ale Ser Leu His 3Θ0
Gly Thr Glu 385	Aep Thr	Glu Arg Glu Val 390	Leu Lys Trp Lye Phe Asp Ser 395 400
His Leu Ala	Phe His 405	His Lys Ala Arg	Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr 410 415
Lys Asp Cys	Ala Ala Val Ile Thr Leu 420 425	Trp Gln Arg Pro Leu Val Ala 430
Leu Ile Glu 435	Ile Cye	Thr Glu Met Glu 440	LyB Glu Gly Lys Ile Ser Lys 445
Ile Gly Pro 450	Ala Gly	Leu Lye Lye Lys 455	Lye Ser Val Thr Val Leu Asp 460
Val Gly Asp 465	Ala Tyr	Phe Ser Val Pro 470	Leu Asp Lye Asp Phe Arg Lye 475 480
Tyr Thr Ala	Phe Thr 485	Ile Pro Ser Ile	Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile 490 495
Phe Gln Ser	Ser Met 500	Thr Lys Lye Gln 505	Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr 510
Gln Tyr Met Asp Asp 515	Leu Tyr Val Pro 520	Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp 525
Ser Trp Leu 530	Val Gly Lye Leu Asn Trp 535	Ala Ser Gln ile Tyr Ala Gly 540
Ile Lye Val	Lys Gln Leu Ile Leu Lys	Glu Pro Val His Gly Val Tyr

545 550 555 560

Glu Pro Ile	Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn
565	570	575
Arg Ala Gly	Asn Leu Trp Val Thr	Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp
	580	585	590
Lys Glu Ala	Thr Thr Thr Leu Val	Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln
595	600		605
Leu Leu Gly	ile Trp Gly Cys Ala	Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln
610	615	620
Met Leu Arg	Gly Pro Gly Arg Ala	Phe Val Thr Ile Arg Gln Gly Ser
625	630	635	640
Leu Ala Ala	Val Gly Ala Arg Ala	Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu
	645	650	655
Asp Lys Trp	Glu Lys Ile Arg Leu	Arg Pro Gly Gly Lye Lys Lys Tyr
	660	665	670
Gln Leu Lys	His Ile Val Trp Ala	Ser Arg Glu Leu	Glu Arg Phe Ala
675	680		685
Val Asn Pro	Gly Leu Leu Glu Thr	Ser Glu Gly Cys	Arg Gln Ile Met
690	695	700
Gly Gln Leu	Gln Pro Ser Leu Gln	Thr Gly Ser Glu	Glu Leu Arg Ser
705	710	715	720
Leu Tyr Asn	Thr Val Ala Thr Leu	Tyr Cys Val His	Gln Lys Ile Glu
	725	730	735
Val Lys Asp	Thr Lys Glu Ala Leu	Asp Lys Val Glu	Glu Glu Gln Asn
	740	745	750
Asn Ser Lys	Lys Lys Ala Gln Gln	Glu Ala Ala Asp	Ala Gly Asn Arg
755	760		765
Asn Gln Val	Ser Gln Asn Tyr Pro	Ile Val Gln Asn	Leu Gln Gly Gln
770	775	7Θ0
Met Val His	Gln Ala Ile Ser Pro	Arg Thr Leu Asn	Ala Trp Val Lys
785	790	795	800
Val Val Glu	Glu Lys Ala Phe Ser	Pro Glu Val Ile	Pro Met Phe Ser
	805	810	815
Ala Leu Ser	Glu Gly Ala Thr Pro	Gln Asp Leu Asn	Thr Met Leu Asn

PL 206 097 B1

820 825 830

Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala	Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile 845
	835	840
Asa	Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly
	350	855	860
Pro	Ile Ala	Pro Gly Gln Met Arg	Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala
865		870	875 880
Gly	Thr Thr	Ser Thr Leu Gln Glu	Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn
		885	890 895
Pro	Pro Ile	Pro Val Gly Glu Ile	Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly
		900	905 910
Leu	Asn Lys	Ile Val Arg Met Tyr	Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile
	915	920	925
Lys	Gln Gly	Pro Lys Glu Pro Phe	Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr
	930	935	940
Lys	Thr Leu	Arg Ala Glu Gln Ala	Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met
945		950	955 960
Thr	Glu Thr	Leu Leu Val Gln Asn	Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile
		965	970 975
Leu	Lys Ala	Leu Gly Pro Ala Ala	Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala

930 985 990

Cy· Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu 995 1000 1005 «210» 47 <211> 1006 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <223» Hybrydowe białko złożone z Rev-Nef-Tat, CTL i skróconego białka Gag (RNT ' CTL-optpl7/24) <400> 47

Met Ala Gly Arg Ser Gly	Asp Ser Asp Glu Olu Leu Leu Lys	Thr	Wal
1 5	10	15
Arg Leu Ile Lye Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser	Asn	Glu
20	25 30
Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg	Glu	Arg
35	40 45
Gln Arg Gln Ile Arg Ser	Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr	Phe	Leu
50	55 60
Gly Arg Pro Ala Glu Pro	Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu	Glu	Arg
65 70	75		80
Leu Thr Leu Asp Cys Ser	Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr	Gln Gly
35	90	95
Val Gly Ser Pro Gln Val	Leu Val Glu Ser Pro Ala Val Leu	Glu	Pro
100	105 110
Gly Thr Lys Glu Thr Ser	Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser	Gly Trp
115	120 125
Pro Thr Val Arg Glu Arg	Met Lys Gln Ala Glu Pro Olu Pro	Ala Ala
130	135 140
Asp Gly Val Gly Ala Ala	Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala	Ile
145 150	155		160
Thr Ser Ser Asn Thr Ala	Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp	Leu	Glu
165	170	175
Ala Gln Glu Glu Glu Glu	Val Gly Phe Pro Pal Arg Pro Gln	Wal	Pro
180	185 190
Leu Arg Pro Met Thr Tyr	Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His	Phe	Leu
195	200 205
Lys Glu Lys Gly Gly Leu	Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg	Gln
210	215 220
Olu Ile Leu Asp Leu Trp	Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe	Pro	Asp

PL 206 097 B1

225	230	235	24U
Trp Gin Asn Tyr Thr Pro	Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe
	245	250	255
Gly Trp Cya Phe Lya Leu	Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu Glu Asn
	260	265	270
Ser Ser Leu Leu Hia Pro	Ala Ser Leu Hi· Gly Thr Glu Asp Thr Glu
275		280	285
Arg Glu Val Leu Lya Trp	Lys Phe Asp Ser His	Leu Ala Phe His His
290		295	300
Lya Ala Arg Glu Leu Hia	Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Lys Leu Glu
305	310	315	320
Pro Val Asp	Pro Arg Leu	Glu Pro Trp Lys His	Pro Gly Ser Gin Pro
	325	330	335
Arg Thr Pro	Cys Thr Asn	Cys Tyr Cys Lys Lys	Cys Cys Leu His Cys
	340	345	350
Gin Val Cya	Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile	Ser Tyr Gly Arg Lys
355		360	365
Lys Arg Arg	Gin Arg Arg Arg Ala Pro Gin Asp	Ser Gin Thr His Gin
370		375	380
Val Ser Leu	Pro Lys Gin	Pro Ser Ser Gin Gin Arg Gly Asp Pro Thr
385	390	395	400
Gly Pro Lya Lya Ser Lya	Lys Lys Val Glu Arg	Glu Thr Glu Ala Asp
	405	410	415
Pro Phe Asp	Ala Ala Val	Ile Thr Leu Trp Gin	Arg Pro Leu Val Ala
	420	425	430
Leu Ile Glu	Ile Cys Thr	Glu Met Glu Lys Glu	Gly Lys Ile Ser Lys
435		440	445
Ile Gly Pro	Ala Gly Leu	Lys Lys Lye Lys Ser	Val Thr Val Leu Asp
450		455	460
Val Gly Asp	Ala Tyr Phe	Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys
465	470	475	430
Tyr Thr Ala	Phe Thr Ile	Pro Ser Ile Trp Lys	Gly Ser Pro Ala Ile
	485	490	495
Phe Gin Ser	Ser Met Thr	Lys Lys Gin Asn Pro	Asp Ile Val Ile Tyr
	500	505	510
Gin Tyr Met	Asp Asp Leu	Tyr val Pro Ile Val	Leu Pro Glu Lys Asp
515		520	525
Ser Trp Leu	Val Gly Lys	Leu Asn Trp Ala Ser	Gin Ile Tyr Ala Gly
530		535	540
Ile Lya Val	Lys Gin Leu	Ile Leu Lys Glu Pro	Val Kie Gly Val Tyr
545	550	555	560
Glu Pro Ile	Val Gly Ala	Glu Thr Phe Tyr Val	Asp Gly Ala Ala Asn
	565	570	575
Arg Ala Gly	Asn Leu Trp	Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp
	580	585	590
Lys Glu Ala	Thr Thr Thr	Leu Val Glu Arg Tyr	Leu Arg Asp Gin Gin
595		600	605
Leu Leu Gly	Ile Trp Gly Cya Ala Cys Thr Pro	Tyr Asp Ile Asn Gin
610		615	620
Met Leu Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr	Ile Arg Gin Gly Ser
625	630	635	640
Leu Ala Ala	Val Gly Ala	Arg Ala Ser Val Leu	Ser Gly Gly Glu Leu
	645	650	655
Asp Lys Trp	Glu Lys Ile	Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr
	660	665	670
Gin Leu Lys	His Ile Val	Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala
675		680	685
Val Asn Pro	Gly Leu Leu	Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin Ile Met
690		695	700
Gly Gin Leu	Gin Pro Ser	Leu Gin Thr Gly Ser	Glu Glu Leu Arg Ser
705	710	715	720
Leu Tyr Asn	Thr Val Ala	Thr Leu Tyr Cys Val	His Gin Lys Ile Glu

725 730 735

PL 206 097 B1

Val	Lys	Asp	Thr 740	Lye	Glu Ala Leu Asp Lye Val Glu Glu Glu Gln Asn
745	750
Asn	Ser	Lye Lye	Lye Ala Gln Gln Glu Ala Ala Aap Ala Gly Asn Arg
		755			760	765
Asn	Oln	Val	Ser	Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln
	770				775	780
Net	Wal	His	Gln	Ala	Ile Ser Pro Arg	Thr Leu Aan Ala Trp Wal Lye
785					790	795 800
val	Val	Glu	Glu	Lye	Ala Phe Ser Pro	Glu Val Ile Pro Met Phe Ser
				805		810 815
Ala	Leu	Ser	Glu	Gly	Ala Thr Pro Gln	Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn
			820		825	830
Thr	Val	Gly Gly	His	Gln Ala Ala Met	Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile
		835			840	345
Asn	Glu	Glu	Ala	Ala	Glu Trp Asp Arg	Leu His Pro Wal His Ala Gly
	850				855	860
Pro	Ile	Ala	Pro	Gly	Gln Met Arg Glu	Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala
865					870	875 880
Gly	Thr	Thr	Ser	Thr	Leu Gln Glu Gln	Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn
				885		890 895
Pro	Pro	Ile	Pro	Val	Gly Glu Ile Tyr Lye Arg Trp Ile Ile Leu Gly
			900		905	910
Leu	Asn	Lys	Ile	Val	Arg Met Tyr Ser	Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile
		915			920	925
Lye	Gln	Gly	Pro	Lye	Glu Pro Phe Arg	Asp Tyr Wal Asp Arg Phe Tyr
	930				935	940
Lys	Thr	Leu	Arg	Ala	Glu Gln Ala Thr	Gln Glu Val Lys Asn Trp Met
945					950	955 960
Thr	Glu	Thr	Leu	Leu	Val Gln Asn Ala	Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile
				965		970 975
Leu	Lys	Ala	Leu	Gly	Pro Ala Ala Thr	Leu Glu Glu Met Met Thr Ala
			980		985	990
Cys	Gln	Gly	Val	Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
		995			1000	1005

<210» 48 <211» 1006 <212» PRT <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Hybrydowe białko złożone z Rev-Nef-Tat, skróconego białka Gag i CTL (RNT optpl7/24-CTL) <400» 48

Met Ala Gly Arg Ser Gly	Asp Ser Asp Glu	Glu	Leu	Leu Lys Thr	Val
1 5	10			15
Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn	Pro	Pro	Pro Ser Asn	Glu
20	25			30
Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu	Arg
35	40			45
Gln Arg Gln Ile Arg Ser	Ile Ser Glu Arg	Ile	Leu	Ser Thr Phe	Leu
50	55		60
Gly Arg Pro Ala Glu Pro	Val Pro Leu Gln	Leu	Pro	Pro Leu Glu	Arg
65 70		75			80
Leu Thr Leu Aap Cye Ser	Glu Asp Cys Gly	Asn	Ser	Gly Thr Gln	Gly
85	90			95
Wal Gly Ser Pro Gln Wal	Leu Wal Glu Ser	Pro	Ala	Wal Leu Glu	Pro
100	105			110
Gly Thr Lye Glu Thr Ser	Val Gly Lys Trp	Ser	Lys	Cys Ser Gly Trp
115	120			125
Pro Thr Val Arg Glu Arg	Met Lys Gln Ala	Glu	Pro	Glu Pro Ala Ala
130	135		140

PL 206 097 B1

Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg	Asp	Leu Glu Lys uis Giy Aia ne
145 150		155 160
Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn	Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu
165		170 175
Ala Gin Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe	Pro Val Arg Pro Gin Val Pro
180	185	190
Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lye Gly Ala	Leu Asp Leu Ser His Phe Leu
195 200		205
Lye Glu Lye Gly Gly Leu Glu Gly	Leu	Ile Tyr Ser Pro Lys Arg Gin
210 215		220
Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr	His	Thr Gin Gly Tyr Phe Pro Asp
225 230		235 240
Trp Gin Asn Tyr Thr Pro Gly Pro	Gly	Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe
245		250 255
Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro	Val	Glu Pro Asp Glu Glu Glu Asn
260	265	270
Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser	Leu	His Gly Thr Glu Asp Thr Glu
275 280		285
Arg Glu Val Leu Lys Trp Lye Phe	Asp	Ser His Leu Ala Phe His His
290 295		300
Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu	Tyr Tyr Lys Asp Cys Lys Leu Glu
305 310		315 320
Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro	Trp	Lys His Pro Gly Ser Gin Pro
325		330 335
Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys	Lys Lys Cys Cys Leu His Cys
340	345	350
Gin Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly	Leu	Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys
355 360		365
Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala	Pro	Gin Asp Ser Gin Thr His Gin
370 375		380

Val Ser Leu Pro Lya Gin Pro Ser Ser Gin Gin Arg Gly Asp Pro Thr 385 390 395 400 Gly Pro Lys Lye Ser Lya Lya Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp

405 410 415

Pro Phe Asp Ala Ala Val Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly
	420	425	430
Glu Leu Aep Lys Trp Glu Lys	Ile Arg Leu Arg	Pro Gly Gly Lys Lys
435		440	445
Lys Tyr Gin	Leu Lys His Ile	Val Trp Ala Ser	Arg Glu Leu Glu Arg
450	455		460
Phe Ala Val	Asn Pro Gly Leu	Leu Glu Thr Ser	Glu Gly Cys Arg Gin
465	470	475	480
Ile Met Gly	Oln Leu Gin Pro	Ser Leu Gin Thr	Gly Ser Glu Glu Leu
	485	490	495
Arg Ser Leu	Tyr Asn Thr Val	Ala Thr Leu Tyr Cye Val His Gin Lys
	500	505	510
Ile Glu Val	Lys Asp Thr Lys	Glu Ala Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu
515		520	525
Gin Asn Asn	Ser Lys Lys Lys	Ala Gin Gin Glu	Ala Ala Asp Ala Gly
530	535		540
Asn Arg Asn	Gin Val Ser Gin	Asn Tyr Pro Ile	Val Gin Asn Leu Gin
545	550	555	560
Gly Gin Met	Val His Gin Ala	Ile Ser Pro Arg	Thr Leu Asn Ala Trp
	565	570	575
Val Lys Val	Val Glu Glu Lye	Ala Phe Ser Pro	Glu Val Ile Pro Met
	580	585	590
Phe Ser Ala	Leu Ser Glu Gly	Ala Thr Pro Gin	Asp Leu Asn Thr Met
595		600	605
Leu Asn Thr	Val Gly Gly His	Gin Ala Ala Met	Gin Met Leu Lys Glu
610	615		620
Thr Ile Asn	Glu Glu Ala Ala	Glu Trp Asp Arg	Leu His Pro Val His
625	630	635	640
Ala Gly Pro	Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu	Pro Arg Gly Ser Asp

PL 206 097 B1

	645	650	655
Ile Ala Gly Thr	Thr ser Thr	Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr
660		665	670
Asn Asn Pro Pro	Ile Pro Val	Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile
675		680	685
Leu Gly Leu Asn	Lys Ile Val	Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu
690	695	700
Asp Ile Lys Gin	Gly Pro Lye	Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg
705	710	715	720
Phe Tyr Lys Thr	Leu Arg Ala	Glu Gin Ala Thr Gin Glu Val Lys Asn
	725	730	735
Trp Met Thr Glu	Thr Leu Leu	Val Gin Asn Ala Asn	Pro Asp Cys Lys
740		745	750
Thr Ile Leu Lye	Ala Leu Gly	Pro Ala Ala Thr Leu	Glu Glu Met Met
755		760	765
Thr Ala Cys Gin	Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys	Ala Arg Val Leu
770	775	780
Ala Ala Val Ile	Thr Leu Trp	Gin Arg Pro Leu Val	Ala Leu Ile Glu
785	790	795	800
Ile Cye Thr Glu	Met Glu Lys	Glu Gly Lys Ile Ser	Lys Ile Gly Pro
	805	810	815
Ala Gly Leu Lys	Lys Lys Lys	Ser Val Thr Val Leu Aep Val Gly Asp
820		825	830
Ala Tyr Phe 9er	Val Pro Leu	Asp Lys Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala
835		840	845
Phe Thr Ile Pro	Ser Ile Trp Lye Gly Ser Pro Ala	Ile Phe Gin Ser
850	S5S	860
Ser Met Thr Lye	Lys Gin Asn	Pro Asp Ile Val Ile	Tyr oln Tyr Met
865	870	875	880
Asp Asp Leu Tyr	Val Pro Ile	Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Leu
	885	890	895
Val Gly Lys Leu	Asn Trp Ala	Ser Gin ile Tyr Ala	Gly Ile Lys Val
900		905	910
Lys Gin Leu Ile	Leu Lys Glu	Pro Val His Gly Val	Tyr Glu Pro Ile
915		920	925
Val Gly Ala Glu	Thr Phe Tyr	Val Asp Gly Ala Ala	Asn Acg Ala Gly
930	935	940
Asn Leu Trp Val	Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val	Trp Lys Glu Ala
945	950	955	960
Thr Thr Thr Leu	Val Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gin	Gin Leu Leu Gly
	965	970	975
Ile Trp Gly Cys	Ala Cys Thr	Pro Tyr Asp Ile Asn	Gin Met Leu Arg
980		985	990
Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val	Thr Ile Arg Oln Gly Ser Leu

995 1000 1005 <210> 49 <211> 7945 <212> DNA <213> wirus brodawczaka bydła <220>

<221> misc feature <222> 1205~ <223> n - A,T,C or G <400> 49 gttaacaata atcacaccat caccgttttt tcaagcggga aaaaatagcc agctaactat 60 aaaaagctgc tgacagaccc cggttttcac atggacctga aaccttttgc aagaaccaat 120 ccattctcag ggttggattg tctgtggtgc agagagcctc ttacagaagt tgatgctttt 180 aggtgcatgg tcaaagactt tcatgttgta attcgggaag gctgtagata tggtgcatgt 240 accatttgtc ttgaaaactg tttagctact gaaagaagac tttggcaagg tgttccagta 300 acaggtgagg aagctgaatfc attgcatggc aaaacacttg ataggctttg cataagatgc 360

PL 206 097 B1 tgctactgtg ggggcaaact aacaaaaaat gaaaaacatc ggcatgtgct ttttaatgag 420 cctttctgca aaaccagago taacataatt agaggacgct gctacgactg ctgcagacat 480 ggttcaaggt ccaaataccc atagaaactt ggatgattca cctgcaggac cgttgctgat 540 tttaagtcca tgtgcaggca cacctaccag gtctcctgca gcacctgatg cacctgattt 600 cagacttccg tgccatttcg gcogtcctac taggaagcga ggtcccacta cccctccgct 660 ttcctctcce ggaaaactgt gtgcaacagg gccacgtcga gtgtattctg tgactgtctg 720 ctgtggaaao tgcggaaaag agctgacttt tgctgtgaag accagctcga cgtccctgct 780 tggatttgaa caccttttaa actcagattt agacctcttg tgtccacgtt gtgaatctog 840 cgagcgtcat ggcaaacgat aaaggtagca attgggattc gggcttggga tgctcatatc 900 tgctgactga ggcagaatgt gaaagtgaca aagagaatga ggaacccggg gcaggtgtag 960 aactgtctgt ggaatctgat cggtatgata gccaggatga ggattttgtt gacaatgcat 1020 cagtctttca gggaaatcac ctggaggtct tccaggcatt agagaaaaag gcgggtgagg 1080 agcagatttt aaatttgaaa agaaaagtat tggggagttc gcaaaacagc agcggttccg 1140 aagcatctga aactccagtt aaaagacgga aatcaggagc aaagcgaaga ttatttgctg 1200 aaaangaagc taaccgtgtt cttacgcccc tccaggtaca gggggagggg gaggggaggc 1260 aagaacttaa tgaggagcag gcaattagtc atctacatct gcagcttgtt aaatctaaaa 1320 atgctacagt ttttaagctg gggctcttta aatctttgtt cctttgtagc ttccatgata 1380 ttacgaggtt gtttaagaat gataagacca ctaatcagca atgggtgctg gctgtgtttg 1440 gccttgcaga ggtgtttttt gaggcgagtt tcgaactcct aaagaagcag tgtagttttc 1500 tgcagatgca aaaaagatct catgaaggag gaacttgtgc agtttactta atctgcttta 1560 acacagctaa aagcagagaa acagtccgga atctgatggc aaacacgcta aatgtaagag 1620 aagagtgttt gatgctgcag ccagctaaaa ttcgaggact cagcgcagct ctattctggt 1680 ttaaaagtag tttgtcaccc gctaeactta aacatggtgc tttacctgag tggatacggg 1740 cgcaaactac tctgaacgag agcttgcaga ccgagaaatt cgacttcgga actatggtgc 1800 aatgggccta tgatcacaaa tatgctgagg agtctaaaat agcctatgaa tatgctttgg 1860 ctgcaggatc tgatagcaat gcacgggctt ttttagcaao taacagccaa gctaagcatg 1920 tgaaggactg tgcaactatg gtaagacact atctaagagc tgaaacacaa gcattaagca 1980 tgcctgcata tattaaagct aggtgcaagc tggcaactgg ggaaggaagc tggaagtcta 2040 tcctaacttt ttttaactat cagaatattg aattaattac ctttattaat gctttaaagc 2100 tctggctaaa aggaattcca aaaaaaaact gtttagcatt tattggccct ccaaacacag 2160 gcaagtctat gctctgcaac tcattaattc attttttggg tggtagtgtt ttatcttttg 2220 ccaaccataa aagtcacttt Łggcttgctt ccctagcaga tactagagct gctttagtag 2280 atgatgctac tcatgcttgc tggaggtact ttgacacata cctcagaaat gcattggatg 2340 gctaccctgt cagtattgat agaaaacaca aagcagcggt tcaaattaaa gctccacccc 2400 tcctggtaac cagtaatatt gatgtgcagg cagaggacag atatttgtac ttgcatagtc 2460 gggtgcaaac ctttcgcttt gagcagccat gcacagatga atcgggtgag caacctttta 2520 atattactga tgcagattgg aaatottttt ttgtaaggtt atgggggcgt ttagacctga 2580 ttgacgagga ggaggatagt gaagaggatg gagacagcat gcgaacgttt acatgtagcg 2640 caagaaacac aaatgcagtt gattgagaaa agtagtgata agttgcaaga tcatatactg 2700 tactggactg ctgttagaac tgagaacaca ctgctttatg ctgcaaggaa aaaaggggtg 2760 actgtcctag gacactgcag agtaccacac tctgtagttt gtcaagagag agccaagcag 2820 gccattgaaa tgcagttgtc tttgcaggag ttaagcaaaa ctgagtttgg ggatgaacca 2880 tggtctttgc ttgacacaag ctgggaccga tatatgtcag aacctaaacg gtgctttaag 2940 aaaggcgcca gggtggtaga ggtggagttt gatggaaatg caagcaatac aaactggtac 3000 actgtctaca gcaatttgta catgcgcaca gaggacggct ggcagcttgc gaaggctggg 3060 gctgacggaa ctgggctcta ctactgcacc atggccggtg ctggacgcat ttactattct 3120 cgctttggtg acgaggcagc cagatttagt acaacagggc attactctgt aagagatcag 3180 gacagagtgt atgctggtgt ctcatccacc tcttctgatt ttagagatcg cccagacgga 3240 gtctgggtcg catccgaagg acctgaagga gaccctgcag gaaaagaagc cgagccagcc 3300 cagcctgtct cttctttgct cggctccccc gcctgcggtc ccatcagagc aggcctcggt 3360 tgggtacggg acggtcctcg ctcgcacccc tacaattttc ctgcaggctc ggggggctct 3420 attctccgct cttcctccac cccgtgcagg gcacggtacc ggtggacttg gcatcaaggc 3480 aggaagaaga ggagcagtcg cccgactcca cagaggaaga accagtgact ctcccaaggc 3540 gcaccaccaa tgatggattc cacctgttaa aggcaggagg gtcatgcttt gctctaattt 3600 caggaactgc taaccaggta aagtgctatc gctttcgggt gaaaaagaac catagacate 3660 gctacgagaa ctgcaccacc acctggttca cagttgctga caacggtgct gaaagacaag 3720 gacaagcaca aatactgatc acctttggat cgccaagtca aaggcaagac tttctgaaac 3780 atgtaccact acctcctgga atgaacattt ccggctttac agccagcttg gacttctgat 3840 cactgccatt gccttttctt catctgactg gtgtactatg ccaaatctat ggtttctatt 3900 gttcttggga ctagttgctg caatgcaact gctgctatta ctgttcttac tcttgttttt 3960 tcttgtatac tgggatcatt ttgagtgctc ctgtacaggt ctgccctttt aatgccttta 4020 catcactggc tattggctgt gtttttactg ttgtgtggat ttgatttgtt ttatatactg 4080 tatgaagttt tttcatttgt gcttgtattg ctgtttgtaa gttttttact agagtttgta 4140

PL 206 097 B1 ttccccctgc tcagatttta tatggtttaa gctgcagcaa taaaaatgag tgcaogaaaa 4200 agagtaa&ac gtgccagtgc ctatgacctg tacaggacat gcaagcaagc gggcacatgt 4260 ccaccagatg tgataccaaa ggtagaagga gatactatag cagataaaat tttgaaattt 4320 gggggtcttg caatctactt aggagggeta ggaataggaa catggtctac tggaagggtt 4380 gctgcaggtg gatcaccaag gtacacacca ctccgaacag cagggtccac atcatcgctt 4440 gcatcaatag gatccagage tgtaacagca gggacccgcc ccagtatagg tgcgggcatt 4500 cctttagaca cccttgaaao tcttggggcc ttgcgtccag gggtgtatga ggacactgtg 4560 ctaccagagg cccctgcaat agtcactcct gatgctgttc ctgcagattc agggcttgat 4620 gccctgteca taggtacaga ctcgtccacg gagacectca ttactctgct agagcetgag 4680 ggtcccgagg acatagcggt tcttgagctg caacccctgg acogtccaac ttggcaagta 4740 agcaatgctg ttcatcagtc ctctgcatac cacgcccctc tgcagetgca atcgtccatt 4800 gcagaaacat ctggtttaga aaatattttt gtaggaggct cgggtttagg ggatacagga 4860 ggagaaaaca ttgaactgac atacttcggg tccccacgaa caagcacgcc ccgcagtatt 4920 gcctctaaat cacgtggcat tttaaactgg ttcagtaaac ggtactacac acaggtgccc 4980 acggaagate ctgaagtgtt ttcatcccaa acatttgcaa acccactgta tgaagcagaa 5040 ccagctgtgo ttaagggacc tagtggacgt gttggactca gtcaggttta taaacctgat 5100 acacttacaa cacgtagcgg gacagaggtg ggaccacaga tacatgtcag gtactcattg 5160 agtactatac atgaagatgt agaagcaatc ccctacacag ttgatgaaaa tacacaggga 5220 cttgcattcg tacccttgca tgaagagcaa gcaggttttg aggagataga attagatgat 5280 tttagtgaga cacatagact gctacctcag aacacctctt ctacacctgt tggtagtggt 5340 gtacgaagaa gcctcattcc aactcaggaa tttagtgcaa cacggcctae aggtgttgta 5400 acctatggot cacctgacac ttactctgct agcccagtta ctgaccctga ttctacctct 5460 cctagtctag ttatcgatga cactactact acaccaatca ttataattga tgggcacaca 5520 gttgatttgt acagcagtaa ctacaccttg catccctcct tgttgaggaa acgaaaaaaa 5580 cggaaacatg cctaattttt tttgcagatg gcgttgtggc aacaaggcca gaagctgtat 5640 ctccctccaa cccctgtaag caaggtgctt tgcagtgaaa cctatgtgca aagaaaaagc 5700 attttttatc atgcagaaac ggagcgcctg ctaactatag gacatccata ttacccagtg 5760 tctatcgggg ccaaaactgt tcctaaggtc tctgcaaatc agtatagggt atttaaaata 5820 caactacctg atcccaatca atttgcacta cctgacagga ctgttcacaa cccaagtaaa 5880 gagcggctgg tgtgggcagt cataggtgtg caggtgtcca gagggcagcc tcttggaggt 5940 actgtaactg ggcaccccac ttttaatgct ttgcttgatg cagaaaatgt gaatagaaaa 6000 gtcaccaccc aaacaacaga tgacaggaaa caaacaggcc tagatgctaa gcaacaacag 6060 attctgttgc taggctgtac ccctgctgaa ggggaatatt ggacaacagc ccgtccatgt 6120 gttactgatc gtctagaaaa tggcgcctgc cctcctcttg aattaaaaaa caagcacata 6180 gaagatgggg atatgatgga aattgggttt ggtgcagcca acttcaaaga aattaatgca 6240 agtaaatcag atctacctct tgacattcaa aatgagatct gcttgtaccc agactacctc 6300 aaaatggctg aggacgctgc tggtaatagc atgttctttt ttgcaaggaa agaacaggtg 6360 tatgttagac acatctggac cagagggggc tcggagaaag aagcccctac cacagatttt 6420 tatttaaaga ataataaagg ggatgccacc cttaaaatac ccagtgtgca ttttggtagt 6480 cccagtggct cactagtctc aactgataat caaattttta atcggcccta ctggctattc 6540 cgtgcccagg gcatgaacaa tggaattgca tggaataatt tattgttttt aacagtgggg 6600 gacaatacac gtggtactaa tcttaccata agtgtagcct cagatggaac cccactaaca 6660 gagtatgata gctcaaaatt caatgtatac catagacata tggaagaata taagctagcc 6720 tttatattag agctatgctc tgtggaaatc acagctcaaa ctgtgtcaca tctgcaagga 6780 cttatgccct ctgtgcttga aaattgggaa ataggtgtgc agcctcctac ctcatcgata 6840 ttagaggaca cctatcgcta tatagagtct cctgcaacta aatgtgcaag caatgtaatt 6900 cctgcaaaag aagaccctta tgcagggttt aagttttgga acatagatct taaagaaaag 6960 ctttctttgg acttagatca atttcccttg ggaagaagat ttttagcaca gcaaggggca 7020 ggatgttcaa ctgtgagaaa acgaagaatt agccaaaaaa cttccagtaa gcctgcaaaa 7080 aaaaaaaaaa aataaaagct aagtttctat aaatgttctg taaatgtaaa acagaaggta 7140 agtcaactgc acctaataaa aatcacttaa tagcaatgtg ctgtgtcagt tgtttattgg 7200 aaccacaccc ggtacacatc ctgtccagca tttgcagtgc gtgcattgaa ttattgtgct 7260 ggctagactt catggcgcct ggcaccgaat cctgccttct cagcgaaaat gaataattgc 7320 tttgttggca agaaactaag catcaatggg acgcgtgcaa agcaccggcg gcggtagatg 7380 cggggtaagt actgaatttt aattcgacct atcccggtaa agcgaaagcg acacgctttt 7440 ttttcacaca tagcgggacc gaacacgtta taagtatcga ttaggtctat ttttgtctct 7500 ctgtcggaac cagaactggt aaaagtttcc attgcgtctg ggcttgtcta tcattgcgtc 7560 tctatggttt ttggaggatt agacggggcc accagtaatg gtgcatagcg gatgtctgta 7620 ccgccatcgg tgcaccgata taggtttggg gctccccaag ggactgctgg gatgacagct 7680 tcatattata ttgaatgggc gcataatcag cttaattggt gaggacaagc tacaagttgt 7740 aacctgatct ccacaaagta cgttgccggt cggggtcaaa ccgtcttcgg tgctcgaaac 7800 cgccttaaac tacagacagg tcccagccaa gtaggcggat caaaacctca aaaaggcggg 7860 agccaatcaa aatgcagcat tatattttaa gctcaccgaa accggtaagt aaagactatg 7920

PL 206 097 B1 tattttttcc cagtgaataa ttgtt 7945 <210> 50 <211> 30« .

<212> PRT <213» wirus brodawczaka bydła typ 1 <400> 50

Met Glu Thr Ala Cys Glu Arg Leu	His Val Ala Gln Glu Thr Gln Met
1 5	10 15
Gln Leu Ile Glu Lys Ser Ser Asp Lys Leu Gln Asp His Ile Leu Tyr
20	25 30
Trp Thr Ala Val Arg Thr Glu Asn	Thr Leu Leu Tyr Ala Ala Arg Lys
35 40	45
Lys Gly Val Thr Val Leu Gly His	Cys Arg Val Pro His Ser Val Val
50 55	60
Cys Gln Glu Arg Ala Lys Gln Ala	Ile Glu Met Gln Leu Ser Leu Gln
65 70	75 80
Glu Leu Ser Lys Thr Glu Phe Gly Asp Glu Pro Trp Ser Leu Leu Asp
85	90 95
Thr Ser Trp Aep Arg Tyr Met Ser	Glu Pro Lys Arg Cys Phe Lys Lys
100	105 110
Gly Ala Arg Val Val Glu Val Glu	Phe Asp Gly Asn Ala Ser Asn Thr
115 120	125
Asn Trp Tyr Thr Val Tyr Ser Asn	Leu Tyr Met Arg Thr Glu Asp Gly
130 135	140
Trp Gln Leu Ala Lys Ala Gly Ala Asp Gly Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
145 150	155 160
Thr Met Ala Gly Ala Gly Arg Ile	Tyr Tyr Ser Arg Phe Gly Asp Glu
165	170 175
Ala Ala Arg Phe Ser Thr Thr Gly	His Tyr Ser Val Arg Asp Gln Asp
180	185 190
Arg Val Tyr Ala Gly Val Ser Ser	Thr Ser Ser Asp Phe Arg Asp Arg
195 200	205
Pro Asp Gly Val Trp Val Ala Ser	Glu Gly Pro Glu Gly Asp Pro Ala
210 215	220
Gly Lys Glu Ala Glu Pro Ala Gln	Pro Val Ser Ser Leu Leu Gly Ser
225 230	235 240
Pro Ala Cys Gly Pro Ile Arg Ala	Gly Leu Gly Trp Val Arg Asp Gly
245	250 255
Pro Arg Ser His Pro Tyr Asn Phe	Pro Ala Gly Ser Gly Gly Ser Ile
260	265 270
Leu Arg Ser Ser Ser Thr Pro Cys	Arg Ala Arg Tyr Arg Trp Thr Trp
275 230	285
His Gln Gly Arg Lye Lys Arg Ser	Ser Arg Pro Thr Pro Gln Arg Lys
290 295	300
Asn Gln
305
<210> 51
<211> 622
<212> DNA
<213> Ludzki wirus opryszczki 4

<400> 51 gggtatcata tgctgactgt atatgcatga ggatagcata tgctacccgg atacagatta 60 ggatagcata tactacccag atatagatta ggatagcata tgctacccag atatagatta 120 ggatagccta tgctacccag atataaatta ggatagcata tactacccag atatagatta 180 ggatagcata tgctacccag atatagatta ggatagccta tgctacccag atatagatta 240 ggatagcata tgctacccag atatagatta ggatagcata tgctatccag atatttgggt 300 agtatatgct acccagatat aaattaggat agcatatact accctaatct ctattaggat 360 agcatatgct acccggatac agattaggat agcatatact acccagatat agattaggat 420 agcatatgct acccagatat agattaggat agcctatgct acccagatat aaattaggat 480

PL 206 097 B1 agcatatact acccagatat agattaggat agcatatgct acccagatat agattaggat 540 agcctatgct acccagatat agattaggat agcatatgct atccagatat ttgggtagta 600 tatgctaccc atggcaacat ta 622 <210> 52 <211> 641 <212> PRT <213> Ludzki wirus opryszczki 4 <400> 52

Met Ser Asp Olu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu 15 10 15

Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln 20 25 30

Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 35 40 45

Arg Gly Gly Gly Arg	Pro	Gly	Ala	Pro	Gly	Gly	Ser	Gly	Ser	Gly	Pro
50		55					60
Arg His Arg Asp Gly	Val	Arg	Arg	Pro	Gln	Lys	Arg	Pro	Ser	Cys	Ile
65	70					75					80
Gly Cys Lys Gly Thr	His	Gly	Gly	Thr	Gly	Ala	Gly	Ala	Gly	Ala	Gly
85					90					95
Gly Ala Gly Ala Gly	Oly	Ala	Gly	Ala	Gly	Gly	Gly	Ala	Gly	Ala	Gly
100				105					110
Gly Gly Ala Gly Gly	Ala	Gly	Gly	Ala	Gly	Gly	Ala	Gly	Ala	Gly	Gly

115 120 125

Gly Ala Gly Ala Gly Qly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala

130 135 140

Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly

165 170 175

Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly

ISO 185 ISO

Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly

195 200 205

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala

210 215 220

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala

225 230 235 240

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

245 250 255

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

260 265 270

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

275 280 285

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

290 295 300

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

305 310 315 320

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

325 330 335

Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg

355 360 365

Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro

370 375 380

Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro

385 390 395 400

Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu

405 410 415 .

Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly

100

PL 206 097 B1

420 425 %ju

Ala

Ile

Olu

Gin

Gly

Pro

Ala

Aap

Asp

Pro

Gly

Glu

Gly

Pro

Ser

Thr

435

440

445

Gly

Pro 450

Arg

Gly

Gin

Gly

Aap 455

Gly

Gly

Arg

Arg

Lya

Lya

Gly

Gly

Trp

Phe

WWW Gly

Lye

Hi·

Arg

Gly

O W Gin

Gly

Gly

Ser

Aaa

łOU Pro

Lya

Phe

Glu

Asa

465

470

475

4fl0

Ile Ala Olu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg 4S5 490 493

Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 500 505 510

Ser Lye Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile 515 ' 520 523

Pro Gin Cya 530

Arg Leu

Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro

Phe

Gly

Met

Ala

535

540

Pro

Gly

Pro

Gly

Pro

Gin

Pro

Gly

Pro

Leu Arg Glu

Ser

Ile

Vąl

cya

545

550

555 .

560

Tyr

Phe

Met

Val

Phe

Leu

Oln

Thr

His

Ile Phe Ua

Glu

Val

Leu

Lys

565

570

575

Aap

Ala

Ile

Lys

Asp

Leu

Val

Met

Thr

Lys Pro Ala

Pro

Thr

cys

Asn

580

585

590

Ile

Arg

Val

Thr

Val

cya

Ser

Phe

Asp Asp Gly Val

Asp

Leu

Pro

Pro

595

600

605

Trp

Phe

Pro

Pro

Met

Val

Glu

Gly Ala Ala Ala Glu

Gly Asp Asp Gly

610

615

620

Aap Aap Gly Asp

Glu

Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gin

625

630

635

640

Olu

PL 206 097 B1

Claims (59)

1. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje:

(a) sekwencję DNA kodują c ą ją drowe biał ko kotwiczą ce funkcjonalnie połączoną z heterologicznym promotorem, które to jądrowe białko kotwiczące obejmuje (i) domenę wiążąc ą DNA, która wiąże specyficzną sekwencję DNA, i (ii) domenę funkcjonalną białka E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1, która wiąże się ze składnikiem jądra i (b) multimeryczną sekwencję DNA wiążącą jądrowe białko kotwiczące przy czym wektor pozbawiony jest miejsca startu replikacji mogącego działać w komórce ssaka.

2. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że jądrowe białko kotwiczące jest białkiem kotwiczącym w chromatynie, a domena funkcjonalna wiąże chromatynę mitotyczną.

3. Wektor według zastrz. 1-2, znamienny tym, że jądrowe białko kotwiczące zawiera region zawiasu lub łącznika.

4. Wektor według zastrz. 1-3, znamienny tym, że domena wiążąca DNA jest domeną wiążącą

DNA białka E2 wirusa brodawczaka bydła typu 1.

5. Wektor według zastrz. 1-4, znamienny tym, że multimeryczna wiążąca sekwencja DNA obejmuje multimeryczne miejsca wiązania E2.

6. Wektor według zastrz. 1-5, znamienny tym, że ją drowe białko kotwiczące jest naturalnym białkiem pochodzenia wirusowego.

7. Wektor wedł ug zastrz. 1-5, znamienny tym, ż e ją drowe biał ko kotwiczą ce jest białkiem rekombinowanym, białkiem fuzyjnym lub białkiem uzyskanym przez techniki modelowania molekularnego.

8. Wektor według zastrz. 1-7, znamienny tym, ż e obejmuje dalej jedną lub więcej kaset ekspresyjnych sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania.

9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest sekwencją z genu otrzymanego od zakaźnego patogenu.

10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że zakaźnym patogenem jest wirus.

11. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że wirus jest wybrany z grupy składającej się z ludzkiego wirusa niedoboru odpornoś ci (HIV), wirusa opryszczki (HSV), wirusa zapalenia wątroby typu C, wirusa grypy i enterowirusa.

12. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest sekwencją z genu otrzymanego od bakterii.

13. Wektor według zastrz. 12, znamienny tym, że bakteria jest wybrana z grupy składającej się z Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis i Mycoplasma pneumonia.

14. Wektor według zastrz. 12, znamienny tym, że bakterią jest Salmonella.

15. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest sekwencją z genu otrzymanego od patogenu grzybowego.

16. Wektor według zastrz. 15, znamienny tym, że patogenem grzybowym jest Candida albigens.

17. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest pochodzenia HIV.

18. Wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje niestrukturalne białko regulatorowe HIV.

19. Wektor według zastrz. 18, znamienny tym, że niestrukturalnym białkiem regulatorowym

HIV jest Nef, Tat lub Rev.

20. Wektor według zastrz. 19, znamienny tym, że niestrukturalnym białkiem regulatorowym

HIV jest Nef.

21. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje strukturalne białko HIV.

22. Wektor według zastrz. 21, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest genem kodującym gp120/gp160 HIV.

23. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że pierwsza kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą Nef, Tat lub Rev i druga kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą Nef, Tat lub Rev.

24. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że pierwsza kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą Nef, Tat lub Rev, a druga kaseta ekspresyjna obejmuje sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania kodującą strukturalne białko HIV.

102

PL 206 097 B1

25. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko związane z rakiem.

26. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko związane z dojrzałością odpornościową, regulacją odpowiedzi odpornościowych lub regulacją odpowiedzi autoimmunologicznych.

27. Wektor według zastrz. 26, znamienny tym, że białkiem jest APECED.

28. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania jest genem Aire.

29. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko, które wykazuje defekt w jakiejkolwiek dziedzicznej chorobie jednogenowej.

30. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje lek wielkocząsteczkowy.

31. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje cytokinę.

32. Wektor według zastrz. 31, znamienny tym, że cytokina jest interleukiną wybraną z grupy obejmującej IL1, IL2, IL4, IL6 i IL12.

33. Wektor według zastrz. 31, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje interferon.

34. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje aktywną biologicznie cząsteczkę RNA.

35. Wektor według zastrz. 34, znamienny tym, że biologicznie aktywna cząsteczka RNA wybrana jest z grupy składającej się z cząsteczek inhibitorowych antysensownych i rybozymów.

36. Wektor według zastrz. 35, znamienny tym, że cząsteczki inhibitorowe antysensowne lub rybozymy hamują funkcję onkogenu.

37. Wektor określony w zastrz. 1-36, do zastosowania jako lek.

38. Wektor określony w zastrz. 1-36, do zastosowania jako lek do leczenia dziedzicznych lub nabytych defektów genetycznych.

39. Wektor określony w zastrz. 1-36, do zastosowania jako terapeutyczna szczepionka DNA przeciwko czynnikowi zakaźnemu.

40. Wektor określony w zastrz. 1-36, do zastosowania do wytwarzania białka kodowanego przez sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania w komórce lub w organizmie.

41. Wektor określony w zastrz. 1-36, do zastosowania do wytwarzania terapeutycznego wielkocząsteczkowego środka in vivo.

42. Zastosowanie wektora określonego w zastrz. 1-8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do dostarczania białka pacjentowi, przy czym wektor ten (i) obejmuje ponadto drugą sekwencję DNA kodującą białko, które ma być dostarczane pacjentowi, która to druga sekwencja DNA jest funkcjonalnie połączona z drugim promotorem, oraz (ii) nie koduje białka El wirusa brodawczaka bydła, a pacjent ten nie wyraż a biał ka E1 wirusa brodawczaka bydł a.

43. Zastosowanie wektora określonego w zastrz. 1-8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku u pacjenta, przy czym wektor ten (i) obejmuje ponadto drugą sekwencję DNA kodującą to białko, która jest funkcjonalnie połączona z drugim promotorem, i (ii) nie koduje białka E1 wirusa brodawczaka bydła, a pacjent nie wyraża białka E1 wirusa brodawczaka bydła.

44. Zastosowanie wektora określonego w zastrz. 1-8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby zakaźnej u pacjenta wymagającego tego leczenia, przy czym sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko obejmujące immunogenny epitop czynnika zakaźnego.

45. Zastosowanie wektora określonego w zastrz. 1-8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia dziedzicznych lub nabytych defektów genetycznych u pacjenta wymagającego tego leczenia, przy czym sekwencja DNA będąca przedmiotem zainteresowania koduje białko, które ma wspomniany dziedziczny lub nabyty defekt genetyczny.

46. Zastosowanie wektora określonego w zastrz. 1-36 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do ekspresji sekwencji DNA u pacjenta.

47. Zastosowanie wektora określonego w zastrz. 1-11 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia HIV.

PL 206 097 B1

103

48. Sposób wytwarzania wektora określonego w zastrz. 1-36, znamienny tym, że obejmuje: a) hodowanie komórki gospodarza zawierającej ten wektor, i b) odzyskanie wektora.

49. Sposób według zastrz. 48, znamienny tym, że obejmuje ponadto przed etapem (a) etap transformowania tej komórki gospodarza tym wektorem.

50. Sposób według zastrz. 48, znamienny tym, że komórka gospodarza jest komórką prokariotyczną.

51. Sposób według zastrz. 48, znamienny tym, że komórka gospodarza jest komórką Escherichia coli.

52. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 1-36.

53. Komórka gospodarza według zastrz. 52, znamienna tym, że jest komórką bakteryjną.

54. Komórka gospodarza według zastrz. 52, znamienna tym, że jest komórką ssaka.

55. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje wektor określony w zastrz. 1-36 i odpowiedni nośnik farmaceutyczny.

56. Szczepionka DNA, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 1-36.

57. Szczepionka DNA według zastrz. 56, znamienna tym, jest szczepionką zapobiegawczą.

58. Genowy czynnik terapeutyczny, znamienny tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 1-36.

59. Sposób wytwarzania szczepionki DNA określonej w zastrz. 56 lub 57, znamienny tym, że obejmuje połączenie wektora z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym.