ES2708856T3 - Vectores de transferencia de gen lentivírico y sus aplicaciones medicinales - Google Patents

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Anne-Sophie Beignon
Fréderic Coutant
Karine Courbeyrette
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Institut Pasteur de Lille
Theravectys SA
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Theravectys SA
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Abstract

Una combinación de compuestos para su uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de una infección por un Virus de la Inmunodeficiencia en donde los compuestos se administran secuencialmente a un hospedador mamífero, para provocar una respuesta inmunitaria celular específica protectora contra dicha infección, que comprende al menos: (i) partículas de vector lentivírico, pseudotipificadas con una primera proteína glucosilada (G) determinada de un Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV); (ii) partículas de vector lentivírico, pseudotipificadas con una segunda proteína VSV G determinada diferente de dicha primera proteína VSV G determinada; en donde dicha partícula de vector lentivírico de (i) y (ii) comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica uno o varios polipéptidos que comprenden al menos un antígeno procedente de un antígeno GAG de dicho Virus de la Inmunodeficiencia y; en donde dichas primera y segunda proteínas VSV G son respectivamente VSV-G de la cepa de Indiana y VSV-G de la cepa de Nueva Jersey, y, opcionalmente: (iii) partícula de vector lentivírico, pseudotipificada con una tercera proteína VSV G determinada, en donde dicha tercera proteína VSV G no sero-neutraliza con dichas primera y segunda proteínas VSV G.

Description

DESCRIPCION
Vectores de transferencia de gen lentivmco y sus aplicaciones medicinales
La invencion se refiere al diseno de vectores de transferencia de genes y especialmente proporciona vectores de transferencia de genes lentivmcos adecuado para una administracion unica o para administracion repetitiva en un hospedador, y a su aplicacion medicinal.
En una realizacion particular, la presente invencion depende especialmente de los resultados obtenidos en ensayos pre-clmicos realizados con vectores de transferencia de genes lentivmcos en un modelo homologo, con un periodo de seguimiento de mas de 5 meses, para disenar candidatos para la vacunacion contra el Virus de la Inmunodeficiencia, especialmente adecuado en los hospedadores humanos.
La presente invencion se refiere especialmente al uso de vectores de transferencia de genes para la administracion unica o multiple in vivo en un hospedador que la necesita. El campo de aplicacion de la presente descripcion se refiere en particular al tratamiento de animales o tratamiento de seres humanos (por ejemplo, el tratamiento profilactico o terapeutico o sintomatico o curativo).
La combinacion de los vectores lentivmcos de acuerdo con la presente invencion es en particular adecuada para utilizarse en el campo de la terapia genetica o vacunacion in vivo. Sin embargo tambien es mas generalmente adecuado para cualquier tratamiento medicinal que requiere las inyecciones unicas o multiples in vivo de los vectores.
La presente invencion proporciona especialmente medios adecuados para utilizar los vectores lentivmcos en la administracion repetitiva, ya sea para la prevencion o para el tratamiento de una enfermedad en un hospedador mairnfero, especialmente en seres humanos. Una aplicacion particular de estos vectores es promover una respuesta inmune para prevenir o tratar una condicion patogena, incluyendo infecciones por virus, infecciones por parasitos y bacterianos o canceres, y preferentemente para promover una respuesta inmune duradera y protectora. De acuerdo con una realizacion particular de la presente invencion, los vectores disenados son especialmente de interes en el campo del tratamiento o prevencion, contra el Virus de la Inmunodeficiencia y especialmente contra el SIDA.
Otro aspecto de la presente invencion es que los vectores de transferencia de genes son ya sea integrativos o no integrativos (NI). La eleccion de cualquier forma de vectores debe depender del proposito de su uso.
Los virus, en particular los virus de ARN, y especialmente los lentivirus han sido utilizados en el pasado para disenar vectores de transferencia de genes especialmente debido a la capacidad de los lentivirus para lograr la importacion nuclear independiente de la mitosis que hace posible que se dupliquen de manera eficiente y que no dividan las celulas objetivo. Por consiguiente, los vectores basados en lentivirus han sido explorados para diversas aplicaciones incluyendo la vacunacion profilactica o terapeutica o con la intencion de usar estos vectores como herramientas para la terapia genetica.
Cuando se prueban vectores lentivmcos in vivo, sin embargo se ha observado que el numero de inyecciones in vivo esta limitado por la respuesta humoral del hospedador promovida contra la protema de la envoltura utilizada en la pseudotipificacion de las partfculas del vector.
La respuesta que es promovida en el hospedador contra la envoltura de las partfculas del vector pseudotipificado es por consiguiente una desventaja para el uso eficiente de dichos vectores, cuando se requieren multiples administraciones in vivo.
La presente invencion propone medios que pretenden remediar, por lo menos en parte, las desventajas debidas a la respuesta inmune contra la envoltura de las partfculas del vector pseudotipificadas, cuando son administradas varias veces a un hospedador en el contexto de la profilaxis o tratamiento.
La invencion por lo tanto se refiere a diferentes estructuras de vectores lentivmcos, y tambien especialmente a su asociacion en una combinacion de compuestos (tambien disenados como un equipo de compuestos), adecuados para utilizarse en un hospedador que los necesita, en condiciones que permiten ya sea la administracion unica o repetitiva de dichos vectores lentivmcos.
En particular, la invencion aprovecha el uso consecutivo de diferentes vectores lentivmcos para administrar un transgen en un hospedador.
Los vectores lentivmcos de acuerdo con la presente invencion y especialmente su combinacion, es en particular adecuada para utilizarse en el campo del tratamiento medicinal donde especialmente una respuesta inmune, incluyendo una respuesta inmune celular, promovida por el antfgeno expresado de manera endogena es beneficiosa o necesaria; por consiguiente, la presente invencion proporciona herramientas para el diseno de protocolos de vacunacion para utilizarse en hospedadores que necesitan el tratamiento preventivo o curativo contra organismos patogenos intracelulares, incluyendo virus especialmente retrovirus, o mas generalmente contra una condicion patogena, incluyendo realizar una terapia genica in vivo. Es particularmente adecuada para cualquier tratamiento medicinal que requiera inyecciones multiples de los vectores in vivo.
Los inventores han proporcionado en particular pruebas de que los vectores lentivfticos como se definen en el presente documento, especialmente cuando se utilizan en una combinacion, son apropiados para promover una respuesta inmune celular en un modelo de primate no humano, que puede ser protector en el contexto de la exposicion vftica, cuando los vectores lentivmcos expresan un antigeno de dicho virus.
En una realizacion particular de la invencion, los inventores han mostrado especialmente que una respuesta inmune protectora celular se ha obtenido en un modelo de primates no humanos en el contexto de la exposicion vmca con el Virus de la inmunodeficiencia de Simios. Los inventores han mostrado especialmente en una estrategia de sensibilizacion-refuerzo que utiliza vectores lentivmcos pseudotipificados con una glucoprotema G de dos serotipos VSV no reactivos cruzados que estos vectores promovieron respuestas inmunes celulares amplias y robustas contra el antigeno codificado por el vector. Esto se ha mostrado en un modelo que consiste en macaco cynomolgus, y se han disenado de este modo vectores adaptados en particular con respecto al antigeno codificado por el vector, para proporcionar vectores adecuados para la aplicacion especialmente en hospedadores humanos.
En vista de estos resultados, los inventores han disenado herramientas que senan adecuadas para promover una respuesta inmune eficiente y preferentemente protectora cuando son administradas a un hospedador, especialmente en situaciones de prevencion o tratamiento de infecciones vfticas y en particular en hospedadores humanos, para proporcionar una respuesta inmune contra dichas infecciones vmcas, en particular retrovmcas, por ejemplo, lentivmcos incluyendo contra el Virus de la Inmunodeficiencia Humana y posiblemente para evitar el desarrollo de la patogenia asociada con la infeccion.
Por consiguiente, la combinacion de vectores lentivmcos de la presente invencion, proporciona especialmente un sistema eficiente de sensibilizacion-refuerzo para el uso para administracion repetitiva, que hace posible la sensibilizacion y el refuerzo sucesivamente de la respuesta inmune en un hospedador, especialmente despues de inyecciones en un hospedador que lo necesita. El termino “repetitivo” significa que el principio activo, es decir, el polinucleotido heterologo contenido en el vector lentivmco de la invencion se administra dos veces o mas, especialmente tres veces, al hospedador, como resultado de la administracion de vectores lentivmcos descritos en el presente documento.
La invencion por consiguiente se relaciona con una combinacion de compuestos para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico de una infeccion mediante un virus de la inmunodeficiencia en donde los compuestos se administran secuencialmente a un hospedador mairnfero, para inducir una respuesta inmune celular espedfica protectora contra dicha infeccion, que comprende al menos:
(i) partfculas de vector lentivmco (tambien designadas vectores lentivmcos), pseudotipificadas con una primera protema glucosilada (G) determinada de un virus de la estomatitis vesicular (VSV);
(ii) partfculas de vector lentivmco (tambien designadas “vectores lentivmcos”), pseudotipificadas con una segunda protema G de VSV determinada diferente de dicha primera protema G de VSV determinada;
en donde dicha partfcula de vector lentivmco de (i) y (ii) comprende en su genoma un polinucleotido recombinante que codifica uno o varios polipeptidos que comprenden al menos un antfgeno procedente de un antfgeno GAG de dicho virus de la inmunodeficiencia y; en donde dichas primera y segunda protemas de la envoltura vmca son respectivamente VSV-G de la cepa de Indiana y VSV-G de la cepa de Nueva Jersey.
El polinucleotido codificado (contenido) por las partfculas de vector lentivmco en dicho “heterologo”, debido a que se aporta como un inserto en la construccion del genoma del vector. En realizaciones particulares, el vector del genoma y el polinucleotido pueden originarse del mismo grupo de lentivirus, aun del mismo tipo.
En una realizacion particular de la invencion, el polinucleotido determinado heterologo, codifica uno o varios polipeptidos que comprenden por lo menos un antfgeno procedente de un antfgeno GAG de dicho Virus de la inmunodeficiencia. Especialmente, el antfgeno es o comprende uno o mas epftopos inmunogenicos. El antfgeno procedente de GAG se define en la presente solicitud e ilustrado en los ejemplos. Comprende fragmentos particulares del GAG. El antfgeno GAG ilustrado en los ejemplos se origina del SIV, de acuerdo con el diseno del modelo para el ensayo de la proteccion contra la infeccion por SIV. Cuando se pretende para el diseno de un vector adecuado para un hospedador humano, el antfgeno GAG procede de una poliprotema GAG de un Virus de la Inmunodeficiencia Humana, especialmente el VIH-1 o VIH-2.
En una realizacion particular de la presente invencion, el polinucleotido determinado heterologo que es un polinucleotido recombinante (o transgen) que codifica uno o varios polipeptidos no codifica un antfgeno POL biologicamente activo de un Virus de la Inmunodeficiencia.
En una realizacion particular, el antfgeno codificado procedente de GAG, especialmente el epftopo o epftopos inmunogenicos procedentes de GAG, no es un antfgeno GAG funcional biologicamente y no comprende dicho GAG funcional biologicamente; en otras palabras el antigeno es un GAG no funcional biologicamente.
Los vectores lentivmcos para su uso de acuerdo con la presente invencion son vectores lentivmcos pseudotipificados que consisten en partmulas del vector (por consiguiente tambien designadas “partmulas de vector lentivmco”), portadoras de protema de envoltura o protemas de envoltura (de una envoltura de poliprotema particular), en donde dicha protema o dichas protemas de envoltura se originan de un virus que es diferente al lentivirus particular que proporciona el genoma del vector lentivmco. Por consiguiente, dicha protema de envoltura o protemas de envoltura, son denominadas “protema de envoltura vmca o protemas de envoltura vmca heterologas”. En las paginas siguientes, tambien se hara referencia a la “protema(s) de envoltura” que comprenden cualquier tipo de protema de envoltura o protemas de envoltura adecuadas para realizar la invencion.
Los vectores lentivmcos para su uso de acuerdo con la invencion son vectores de reemplazo, lo que significa que las secuencias del lentivirus original que codifican las protemas lentivmcas son esencialmente eliminadas del genoma del vector o, cuando estan presentes, son modificadas, y especialmente evitan la expresion del antfgeno POL activo biologicamente y opcionalmente de protemas adicionales estructurales y/o accesorias y/o reguladoras del lentivirus.
El “genoma del vector" de las partfculas del vector tambien comprende el polinucleotido o transgen de interes. En una realizacion particular, dicho transgen esta tambien desprovisto de un polinucleotido que codifica protemas POL activas biologicamente. Como consecuencia, el genoma del vector no hace posible recuperar los antfgenos de POL activos biologicamente. Un antfgeno de POL activo biologicamente comprende la proteasa de enzimas vmcas (RT), transcriptasa inversa (RT y RNasa H) y la integrasa (IN) producida por la escision de la poliprotema GAG-POL. El antfgeno POL no es activo biologicamente, cuando la actividad biologica de por lo menos una de estas enzimas no es habilitada. La actividad biologica se describe con estas enzimas en Fields (Virology - Vol. 2 Capftulo 60, paginas 1889 a 1893, Edicion 1996).
En una realizacion particular, el polinucleotido o transgen del genoma del vector esta desprovisto del gen pol funcional, y especialmente no contiene un gen pol completo.
El genoma del vector como se define en el presente documento contiene, aparte del polinucleotido denominado heterologo de interes terapeutico colocado bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas, las secuencias del genoma lentivmco que no son regiones de codificacion de dicho genoma, y que son necesarias para proporcionar senales de reconocimiento para la smtesis y el procesamiento de ADN o ARN. Estas secuencias son secuencias de accion en cis. La estructura y composicion del genoma del vector utilizado para preparar los vectores lentivmcos de la invencion estan basadas en los principios descritos en la tecnica. Los ejemplos de dichos vectores lentivmcos se describen en (Zennou et al., 2000; Firat H. et al., 2002; VandenDriessche T. et al). Especialmente, se pueden preparar vectores mmimos de administracion de gen lentivmco de un genoma del vector, que solamente contiene, aparte del polinucleotido heterologo de interes terapeutico bajo control de secuencias reguladoras correctas, las secuencias del genoma lentivmco que son regiones no codificantes de dicho genoma, necesarias para proporcionar senales de reconocimiento para la smtesis y procesamiento de ADN o ARN.
Por lo tanto, un genoma del vector puede ser un vector de reemplazo en el cual todas las secuencias que codifican protemas vmcas entre las 2 repeticiones terminales largas (LTR) han sido reemplazadas por el polinucleotido de interes.
A menos que se manifieste lo contrario, o a menos que no sea importante tecnicamente, las caractensticas descritas en la presente solicitud con respecto a cualquiera de las diversas caractensticas, realizaciones o ejemplos de la estructura o uso de los vectores lentivmcos, especialmente con respecto a su protema(s) de envoltura, o el polinucleotido heterologo, pueden ser combinados de acuerdo con cualesquiera combinaciones posibles.
La expresion “combinacion de compuestos” o “equipo de compuestos” significa que los vectores lentivmcos que constituyen los principios activos de los equipos o combinaciones, son proporcionados como compuestos separados en dicho equipo o combinacion, y se pretende la administracion separada a un hospedador, especialmente la administracion separada en el tiempo. Por consiguiente, la invencion hace posible realizar una administracion de sensibilizacion-refuerzo en un hospedador que la necesita, donde la primera etapa de administracion promueve una respuesta inmune, especialmente celular, y la posterior etapa o etapas de administracion refuerza o refuerzan la reaccion inmune.
Los compuestos de los equipos por lo tanto son proporcionados por separado al hospedador que los necesita, especialmente a un hospedador mairnfero, en particular un paciente humano.
Por consiguiente, dichos vectores lentivmcos pueden ser proporcionados en paquetes separados o pueden ser presentados en un paquete comun para un uso separado de los mismos.
Por lo tanto, las notas incluidas en los paquetes y que comprenden las direcciones de uso, pueden indicar que dichas partfculas de vector lentivmco que son pseudotipificadas con diferente protema de envoltura o protemas de envoltura que son para administracion separada en el tiempo, especialmente para sensibilizar y posteriormente reforzar una reaccion immune en un hospedador.
De acuerdo con la invencion, se proporcionan partmulas de vector lentivmco que son pseudotipificadas con una primera protema de envoltura vmca heterologa determinada, o protemas de envoltura vmca, y las partmulas de vector lentivmco que son pseudotipificadas con una segunda protema de envoltura vmca heterologa determinada o protemas de envoltura vmca. Por consiguiente, dicha primera y segunda protema(s) de envoltura vmca heterologas son diferentes y en particular se estan originando de cepas de virus diferentes. Por lo: tanto, las partfculas de vector lentivmco del equipo de compuestos de la invencion son diferentes, por lo menos debido a la protema(s) de envoltura particular utilizada para la pseudotipificacion de las partmulas del vector.
En una realizacion particular de la invencion, la combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la invencion comprende un tercer o un tipo adicional de partfculas de vector lentivmco pseudotipificadas con una tercera protema G de VSV determinada, en donde dicha tercera protema G de VSV no se seroneutraliza con dichas primera y segunda protemas G de VSV.
Aparte de su protema(s) de envoltura de pseudotipificacion, los vectores lentivmcos de la invencion pueden ser identicos y especialmente pueden tener genomas identicos del vector.
Como alternativa, sus genomas del vector pueden ser diferentes, siempre que porten el mismo polinucleotido determinado heterologo (tambien designado transgen), especialmente el mismo polinucleotido que tiene un interes terapeutico.
En otra realizacion de la invencion, los genomas de vector de los vectores lentivmcos son diferentes teniendo un polinucleotido diferente, siempre que dichos polinucleotidos diferentes codifiquen polipeptidos que tienen determinantes antigenicos comunes, o epftopos comunes. De aim que los polinucleotidos diferentes pueden ser variantes entre ellos.
Como se especifico anteriormente, la expresion “genoma del vector” se refiere al acido nucleico, es decir, el acido nucleico de origen lentivmco, que constituye el genoma de las partfculas de vector lentivmco. Por consiguiente, la expresion se relaciona con cualquier acido nucleico apropiado, es decir, ADN o ARN, ya sea bi o monocatenario, incluyendo en la forma que contiene el ala de ADN como una secuencia triple. La naturaleza del acido nucleico (ADN, ARN) y su organizacion dependen de la etapa del ciclo de las partfculas, e incluyen el plasmido del vector - usado para la cotransfeccion de las celulas con el plasmido de encapsidacion y el plasmido de envoltura - para la expresion de las partfculas, o el genoma de ARN de las partfculas cuando son formadas, o las diferentes formas (incluyendo el transcrito de ARNm genomicos, el retrotranscrito de ADN no integrado lineal, o una o dos formas circulares de ADN de LTR no integradas o provirus integrados) (vease en Fields Virology) de acido nucleico de este genoma en las celulas transducidas del hospedador al que se administran las partfculas, incluyendo el complejo de pre-integracion del vector.
Como resultado de la administracion de las partfculas al hospedador, el polinucleotido heterologo permite la expresion endogena de los polipeptidos que codifica en las celulas del hospedador que son transducidas por los vectores lentivmcos.
Dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera y posiblemente adicional, protema(s) de envoltura vmca, son seleccionadas por su capacidad para no hacer una seroneutralizacion entre ellas (es decir, no reaccionar de forma cruzada). Por consiguiente, cada una de dicha primera y segunda protema(s) vmca y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema(s) vmca, utilizadas para la pseudotipificacion de las partfculas del vector en combinacion, no reacciona con y especialmente no es reconocida por los anticuerpos dirigidos contra la otra de dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional, protema(s) de envoltura. Por consiguiente, cada una de dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional, protema(s) de envoltura vmca, cuando son administradas dentro de un vector lentivmco, no promueven la produccion de anticuerpos, que reconocen otra protema(s) de envoltura vmca, donde dicha produccion de dichos anticuerpos antienvoltura (denominada inmunidad anti-vector) dana como resultado una incapacidad de promover una respuesta inmune contra el producto expresado del polinucleotido.
En una realizacion particular, en el equipo de los compuestos, dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional, protema(s) de envoltura vmca se originan de virus humanos, ya sea virus de ADN o ARN.
En una realizacion particular del equipo de compuestos de la invencion, dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema(s) de envoltura se originan de virus de la misma familia de virus.
De acuerdo con una realizacion particular de la presente invencion, dicha primera y segunda protema(s) vmcas de envoltura se originan de diferentes tipos de cepas del mismo virus, o de serotipos que no son reactivos cruzados del mismo virus.
En otra realizacion de dicho equipo de compuestos, dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema(s) de envoltura se originan de virus de diferentes generos.
En otra realizacion de dicho equipo de compuestos, dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema(s) de envoltura se originan del mismo genero o del mismo serotipo pero de diferentes tipos de cepas, o de serotipos no reactivos cruzados del virus.
La presente invencion se refiere especialmente a un equipo de compuestos, en donde dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema de envoltura vmca o protemas de envoltura vmca se originan de Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV).
Se ha propuesto que el VSV proporciona protema o protemas de la envoltura, tambien designadas protemas de superficie, para pseudotipificar vectores vmcos, especialmente partmulas de vector lentivmco.
La glucoprotema del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) es una protema transmembrana que funciona como el recubrimiento de superficie de las partmulas vmcas de tipo silvestre. Tambien es una protema de recubrimiento comun para vectores lentivmcos obtenidos por ingeniena genetica. Actualmente, estan clasificadas definitivamente nueve especies del virus en el genero VSV, y diecinueve en el rhabdovirus son clasificadas provisionalmente en este genero (vease posteriormente en el presente documento), mostrando todas ellas varios grados de neutralizacion cruzada. Cuando se secuencian, los genes de la protema G indican similitudes de secuencia. La protema VSV-G presenta un ectodominio N terminal, una region transmembrana y una cola citoplasmica C terminal. Es exportada a la superficie de la celula por medio de la red transGolgi (retmulo endoplasmico y aparato de Golgi).
Las cepas de VSV incluyen varios serotipos que pueden proporcionar protema(s) de envoltura para la preparacion de los vectores lentivmcos: La glucoprotema de VSV-G puede especialmente ser seleccionada entre las especies clasificadas en el genero de vesiculovirus: virus de Carajas (CJSV), virus de Chandipura (CHPV), virus Cocal (COCV), virus Isfahan (ISFV), virus Maraba (MARAV), virus Piry (PIRIV), virus de Alagoas de estomatitis Vesicular (VSAV), virus de estomatitis vesicular de Indiana (VSIV) y virus de estomatitis vesicular de Nueva Jersey (VSNJV) y/o cepas provisionalmente clasificadas en el genero de vesiculovirus como el rhabdovirus de carpa Grass, el virus BeAn 157575 (BeAn 157575), virus de Boteke (BTKV), virus de Calchaqui (CQIV), virus de Anguila Americana (EVA), virus de Gray Lodge (GLOV), virus de Jurona (jURV), virus de Klamath (KlAV), virus de Kwatta (KWAV), virus de La Joya (LJV), virus de Malpais Spring (MSPV), virus de murcielago de Monte Elgon (FEB), virus de Perinet (PERV), rhabdovirus de Esox indus (PFRV), virus de Porton (PORV), virus de Radi (RADIV), virus de viremia primaveral de carpa (SVCV), virus de Tupaia (TUPV), el rhabdovirus de la enfermedad ulcerativa (UDRV) y virus de Yug Bogdanovac (YBV).
El virus de estomatitis vesicular de Indiana (VSIV) y el virus de estomatitis vesicular de Nueva Jersey (VSNJV) son cepas preferidas para la pseudotipificacion de los vectores lentivmcos de la presente invencion, o para disenar protema(s) de envoltura recombinante para pseudotipificar los vectores lentivmcos. Sin embargo, las envolturas de Isfahan y SVCV proporcionan tambien buenos candidatos para la preparacion de las partmulas pseudotipificadas. Tambien es de interes el virus Cocal, en la medida en que no es usado en las partmulas que senan administradas primero y especialmente sena preferido para una administracion tardfa o la ultima en un regimen de sensibilizacionrefuerzo. Cuando se administran sucesivamente partmulas que tienen diferentes envolturas de pseudotipificacion, podna preferirse el orden de administracion siguiente con respecto a dichas envolturas, Indiana; Nueva Jersey; Isfahan; SVCV/Cocal. Debido a que los vectores lentivmcos pseudotipificados de Cocal seroneutralizan varias otras envolturas, es preferible, en la cronologfa de la vacunacion, cuando las envolturas de Cocal van a ser utilizadas en la preparacion de partmulas, para administrarlas como las ultimas.
Las cepas VSV de los serotipos de Indiana y Nueva Jersey son particularmente interesantes para ser utilizados en los vectores lentivmcos de la invencion. Sus protemas VSV-G se describen en GenBank, donde son presentadas varias cepas. Para la cepa de Nueva Jersey VSV-G se hace referencia especialmente a la secuencia que tiene el numero de referencia V01214.
Entre los VSV, el virus de Chandipura (CHPV), el virus Cocal (COCV), el virus de Perinet (PERV), el virus de Piry (PIRYV), el virus SVCV o Isfahan pueden ser buenos candidatos para disenar protemas de envoltura alternativas, y especialmente disenar una tercera protema de envoltura o terceras protemas de envoltura, o protema(s) adicionales de envoltura. Sin embargo, se ha mostrado en los ejemplos que el virus de Chandipura (CHPV) y el virus de Piry (PIRYV) proporcionan protemas de envoltura que tienen una capacidad baja de pseudotipificacion cuando son comparadas con los tftulos del vector obtenidos con partmulas preparadas con diferentes envolturas. Por lo tanto en un primer enfoque estas envolturas pueden ser excluidas de la eleccion de envolturas con el objeto de preparar partmulas con una capacidad eficiente de transduccion.
Otros ejemplos de protema(s) de envoltura adecuados para la pseudotipificacion lentivmca se proporcionan posteriormente en la descripcion, especialmente con referencia a sus celulas objetivo en un hospedador.
De acuerdo con una realizacion particular, el equipo de compuestos para su uso de acuerdo con la invencion utiliza la primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema(s) de envoltura de envoltura vmcas, que se originan de Rhabdoviridae, en particular de VSV o de Paramyxoviridae en donde la primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema(s) de envoltura se originan de virus de diferentes generos, o se originan de diferentes cepas de virus en el mismo serogrupo, especialmente en el serogrupo de la estomatitis vesicular o como alternativa se originan de diferentes serotipos del mismo genero.
En una realizacion particular de la invencion, la protema(s) o glucoprotema(s), adecuadas para utilizarse en el diseno de vectores lentivmcos pseudotipificados del equipo de compuestos son especialmente producidas como protema(s) monomericas o multimericas.
En una realizacion particular de la invencion, dicha primera y segunda y si existe cualquiera de dicha tercera o adicional protema(s) envoltura, tienen capacidad de captacion por celulas presentadoras de antfgeno y especialmente por las celulas dendnticas por medio de fusion y/o endocitosis. En una realizacion particular, la eficiencia de la captacion puede ser utilizada como una caractenstica para elegir la envoltura de una VSV para la pseudotipificacion. A este respecto, el tftulo de transduccion relativo (Tftulo DC/Tttulo de otras celulas transducidas, por ejemplo, celulas 293T) puede considerarse y se preferina una envoltura que tiene una capacidad relativamente buena para fusionarse con la DC. Los tttulos de transduccion relativos se ilustran en los ejemplos.
Las Celulas Presentadoras de Antigeno (APC) y especialmente las celulas Dendnticas (DC) son celulas objetivo apropiadas para los vectores lentivmcos pseudotipificados que se utilizan como composiciones de vacunas, ya sea para un proposito profilactico o terapeutico.
La protema(s) de envoltura utilizadas para pseudotipificar las partfculas del vector lentivmco por lo tanto pueden ser seleccionadas con respecto a las celulas objetivo en un hospedador.
El polinucleotido que codifica la protema(s) de envoltura de VSV (VSV-G) tambien tiene como objetivo los esplenocitos, en particular, las Celulas Presentadoras de Antigeno (APC) o Celulas Dendnticas (DC) o celulas del tngado incluyendo los hepatocitos o celulas no parenquimatosas.
Otras celulas objetivo pueden ser cardiomiocitos activados o en proliferacion.
Los polinucleotidos que codifican la protema(s) de envoltura adecuados para dirigirse a celulas determinadas y para ser utilizados para la pseudotipificacion del vector lentivmco de la invencion se ilustran posteriormente en el presente documento: polinucleotidos que codifican la protema(s) de envoltura de VSV (VSV-G), (Virus de la coriomeningitis Linfodtica) pueden utilizarse para preparar vectores adecuados para dirigirse a celulas del tngado (Park 2003) (Kang et al., 2002).
Se dice que la protema(s) de envoltura, tambien designada a veces protema de superficie en virus particulares, se "origina” de un organismo diferente, y especialmente de cepas de virus de ARN diferentes, lo que significa que en dichas protema(s), se mantienen caractensticas esenciales de la protema(s) correspondiente expresada en un virus determinado de ARN. Dichas caractensticas esenciales, se relacionan con la estructura o la funcion de la protema y son las que hacen posible especialmente que la protema(s) obtenida sea expresada en la superficie de las partfculas del vector para la pseudotipificacion de dichos vectores. Las protemas de envoltura entonces tienen la capacidad de ser reconocidas e internalizadas en las celulas objetivo de los hospedadores cuando estan presentes en las partfculas del vector.
En una realizacion particular, la protema(s) o glucoprotema(s), adecuadas para utilizarse en el diseno de los vectores lentivmcos pseudotipificados del equipo de compuestos son utilizadas como protemas multimericas, tales como la protema VSV-G que es trimerica.
La protema(s) de envoltura es expresada desde un polinucleotido que contiene la secuencia de codificacion de dicha protema(s), cuyo polinucleotido se inserta en un plasmido (plasmido de expresion de envoltura o plasmido de env de pseudotipificacion) utilizado para la preparacion del vector lentivmco de la invencion. El polinucleotido que codifica la protema(s) de envoltura se encuentra bajo el control de las secuencias reguladoras para la transcripcion y/o expresion de la secuencia de codificacion (incluyendo opcionalmente un polinucleotido tal como una secuencia WPRE de Invitrogen).
La presente descripcion describe una construccion de acido nucleico que comprende un promotor interno adecuado para el uso en mairnferos, especialmente en ser humano, celulas, in vivo y el acido nucleico que codifica la protema de envoltura bajo el control de dicho promotor. La invencion tambien se refiere a un plasmido que contiene esta construccion. En particular se pueden seleccionar los promotores por sus propiedades como promotores constitutivos, promotores espedficos del tejido o promotores inducibles. Los ejemplos de los promotores adecuados abarcan los promotores de los siguientes genes: EF1a, PGK humano, PPI (preproinsulina), tiodextrina, cadena invariante de HLA DR (P33), cadena alfa de HLA DR, cadena de Ferritina L o cadena de Ferritina H, Beta 2 microglobulina, Quimosina beta 4, Quimosina beta 10 o Protema de Ribosoma de Cistatina L41.
La secuencia de nucleotidos utilizada para la expresion de la protema(s) de envoltura requerida para la pseudotipificacion de las partmulas del vector lentivmco tambien puede modificarse con respecto al acido nucleico que codifica la protema(s) de envoltura natural utilizada como referencia. La modificacion se puede llevar a cabo para mejorar el uso de los codones (optimizacion de codones) en las celulas para la preparacion de las partmulas del vector y/o en las celulas transducidas del hospedador. Puede modificarse para expresar una protema diferente de las protema(s) nativas, especialmente una que tiene una capacidad mejorada de pseudotipificacion, una capacidad mejorada en el nivel de produccion, o una capacidad mejorada con respecto a la prevencion de la seroneutralizacion con otra protema(s) de envoltura utilizada en el equipo de compuestos.
Dicha modificacion de la protema(s) de envoltura puede afectar y especialmente mejorar su nivel de produccion en una celula hospedadora o su capacidad para pseudotipificar las partmulas del vector posiblemente mejorando la densidad de las protema(s) de envoltura asociadas con los pseudoviriones. Dicha modificacion puede proceder de una mutacion en la secuencia de aminoacidos de dicha protema(s), por ejemplo, mediante la adicion, eliminacion o sustitucion de uno o varios nucleotidos o fragmentos nucleotfdicos o se pueden relacionar con las modificaciones posteriores a la traduccion y en particular a la condicion de glucosilacion de dichas protema(s) de envoltura.
La protema(s) de envoltura utilizadas para pseudotipificar los vectores lentivmcos de la invencion son de hecho especialmente glucoprotemas.
Ya se ha mostrado que la pseudotipificacion de los vectores vmcos con la glucoprotema del Virus de Estomatitis Vesicular (VSV-G) hace posible la transduccion de un amplio rango de tipos de celulas de diferentes especies. Esta glucoprotema de VSV-G, ademas de su tropismo amplio, tiene una estabilidad interesante cuando es utilizada para la pseudotipificacion del vector. Por lo tanto, la protema VSV-G se ha utilizado como un patron para evaluar la eficiencia de otros pseudotipos (Cronin J. et al., 2005). Por consiguiente, VSV-G es un candidato apropiado para la pseudotipificacion de los vectores lentivmcos de la presente invencion.
La invencion se relaciona especialmente con un equipo de compuestos para su uso como se define en la presente descripcion, en donde ambas de dicha primera y la segunda y si existe dicha tercera o adicionales protemas de envoltura vmca son protemas glucosiladas (G) transmembrana de un virus VSV, teniendo dichas protemas G diferente especificidad del tipo VSV en los vectores lentivmcos del equipo.
En particular, dicha primera protema G se origina de un serotipo VSV-Indiana y dicha segunda protema G se origina de un serotipo VSV-Nueva Jersey, o viceversa.
Se ha mostrado y senalado en los siguientes ejemplos que tener recurso en un equipo, para partmulas vmcas pseudotipificadas en donde la protema(s) de envoltura, son protemas G del serotipo VSV de Indiana y el serotipo VSV de Nueva Jersey respectivamente hace posible sensibilizar y reforzar una reaccion inmunologica cuando los vectores lentivmcos pseudotipificados con cualquiera de dichas protemas G se utilizan sucesivamente para promover una reaccion en un hospedador al cual son administradas. En dicho caso, se ha mostrado que no se produce una respuesta humoral (sin respuesta humoral reactiva cruzada) o se produce una respuesta humoral baja (baja respuesta humoral reactiva cruzada) contra la primera protema(s) de envoltura utilizada que puede perjudicar a la respuesta promovida en el hospedador contra el producto de expresion del polinucleotido, cuando se administra dicho vector lentivmco pseudotipificado con una segunda protema(s) de envoltura diferente. Esto es habilitado por el hecho de que dichas protema(s) de envoltura diferente no neutralizan de forma cruzada o no reaccionan de forma cruzada de manera significativa entre ellas y por consiguiente no originan una respuesta inmune antivector.
En una realizacion particular, la invencion se refiere a una protema G que se origina de un VSV que esta modificado con respecto a su forma natural, y/o esta codificado por una molecula de acido nucleico que esta modificada con respecto a la natural, con el objeto de mejorar la pseudotipificacion. Puede ser como resultado de la mejora de la captacion de la protema(s) de envoltura por las partmulas lentivmcas que permiten la mejora de la transduccion de las partmulas lentivmcas por las celulas del hospedador al cual son administradas.
Un equipo de compuestos particular comprende vectores lentivmcos en donde uno o dos o mas de ellos es (son) pseudotipificados con protema(s) de envoltura recombinante que comprende dominios o fragmentos que se originan de diferente protema(s) de envoltura de virus diferentes, especialmente de generos diferentes de especies diferentes de VSV.
En una realizacion particular de la invencion, por lo menos una de la primera, segunda y si existe una tercera o protema(s) de envoltura adicional(es) es (son) protema(s) de envoltura recombinante que comprenden el determinante de exportacion de la VSV-G de la cepa de Indiana.
El determinante de exportacion de la VSV-G de la cepa de Indiana es un polipeptido codificado por el fragmento citoplasmico del marco de lectura abierto de la envoltura.
El determinante de exportacion de la VSV-G de la cepa de Indiana es un polipeptido que comprende o tiene una secuencia de aminoacidos YTDIE en la cola citoplasmica (Nishimura N. et al. 20 O2 ).
Dichas protema(s) de envoltura recombinantes pueden comprender la cola citoplasmica de la VSV-G de una cepa de Indiana que es la porcion intracelular de la VSV-G delimitada por un dominio transmembrana hidrofobico.
Un equipo de compuestos particular comprende vectores lentivmcos en donde uno o dos o mas de ellos es (son) pseudotipificado con protema(s) de envoltura recombinante que comprenden el dominio citoplasmico del VSV de Indiana y el ectodominio de una cepa de un serotipo de VSV diferente. El dominio transmembrana puede tambien ser el de VSV-G de Indiana.
Un equipo de compuestos particular comprende vectores lentivmcos en donde uno o ambos de ellos es (son) pseudotipificado con protema(s) de envoltura recombinante que comprenden el dominio transmembrana y el dominio citoplasmico del VSV de Indiana y el ectodominio del VSV de Nueva Jersey.
Otras modificaciones apropiadas comprenden mutaciones, especialmente mutaciones puntuales, que mejoran la pseudotipificacion. Dichas mutaciones de las protemas VSV-G pueden ser llevadas a cabo en el dominio transmembrana sustituyendo o eliminando uno o varios restos de aminoacidos. Otros ejemplos de las mutaciones apropiadas se describen en Fredericksen B.L. et al (1995) o en Nishimura N. et al (2003).
Cuando se hace referencia a los “fragmentos" en la presente descripcion, se refiere a polinucleotidos o polipeptidos que tienen respectivamente una secuencia de nucleotidos o una secuencia de aminoacidos de por lo menos o mas largas de 6 nucleotidos, respectivamente de por lo menos o mas largas de 2 restos de aminoacidos.
Tambien es especialmente posible modificar las condiciones de glucosilacion de las VSV-G con el objeto de mejorar la eficiencia de transduccion del vector lentivmco pseudotipificado con estas protemas VSV-G, cuando son administradas a un hospedador.
Las protemas VSV-G de diversas cepas de VSV se describen en las figuras y sus secuencias tambien pueden obtenerse de bases de datos, especialmente de GenBank.
Considerando las glucoprotemas de las cepas de Nueva Jersey e Indiana de la VSV, se ha propuesto que la glucosilacion en dos residuos de asparagina (N180 y N336) favorece la pseudotipificacion eficiente de los vectores lentivmcos. Esta caractenstica particular puede ser aplicada en la preparacion de los vectores lentivmcos de la invencion.
La invencion se refiere especialmente a las siguientes construcciones que codifican protemas de envoltura procedentes de VSV-G, para su uso en la preparacion de la combinacion de partmulas del vector lentivmco de la invencion. La invencion tambien se refiere a las protemas de envoltura codificadas por dichas construcciones:
Un gen de VSV-G de Indiana con codones optimizados se describe en la figura 6 y es parte de la invencion. La invencion tambien se refiere a plasmidos de encapsidacion que contienen un gen de envoltura para VSV-G de Indiana. Un plasmido particular de encapsidacion es el pThV-VSV.G (IND-CO) depositado en el CNCM (Pans, Francia) el 10 de octubre de 2007, bajo el numero I-3842 o en una version alternativa de la construccion del plasmido, el 31 de julio de 2008, bajo el numero CNCM I-4056. Otras construcciones pueden proceder de este plasmido particular, especialmente sustituyendo el promotor por un promotor entre los de la lista de la presente descripcion.
Un gen VSV-G de Nueva Jersey con codones optimizados se describe en la figura 7 y es parte de la invencion. La invencion tambien se refiere a los plasmidos de encapsidacion que contienen un gen de envoltura para VSV-G de Nueva Jersey. Un plasmido de encapsidacion particular es el pThV-VSV.G (NJ-CO) depositado en el CNCM (Pans, Francia) el l0 de octubre de 2007, bajo el numero I-3843 o en una version alternativa de la construccion del plasmido, el 31 de julio de 2008, bajo el numero CNCM I-4058. Se pueden obtener otras construcciones de este plasmido particular, especialmente sustituyendo el promotor por un promotor entre los enumerados en la presente descripcion. La invencion se refiere a estos plasmidos y el inserto que contienen, que codifica la protema de envoltura del VSV-G.
Otros genes de envoltura que tienen secuencias con codones optimizados se ilustran en las figuras de la 6 a la 12 y de la 14 a la 19 y especialmente comprenden el gen VSV-G de Chandipura y su producto de expresion, el gen VSV-G de Cocal y su producto de expresion, el gen VSV-G de Piry y su producto de expresion, el gen VSV-G de Isfahan y su producto de expresion, el gen del virus de la viremia de carpa primaveral VSV-G y su producto de expresion. Un plasmido de encapsidacion particular, que contiene un gen de envoltura para el VSV-G Cocal, es el pThV-VSV.G (COCAL-CO) depositado en el CNCM (Pans, Francia) el 31 de julio de 2008, bajo el numero CNCM I-4055. Otro plasmido de encapsidacion particular, que contiene un gen de envoltura para el VSV-G Isfahan, es el pThV-VSV.G (ISFA-CO) depositado en el Cn CM (Pans, Francia) el 31 de julio de 2008, bajo el numero CNCM I-4057. Otro plasmido de encapsidacion particular, que contiene un gen de envoltura para el virus de viremia de carpa primaveral VSV-G, es el pThV-VSV.G (SVCV-CO) depositado en el CNCM (Pans, Francia) el 31 de julio de 2008, bajo el numero CNCM I-4059. La invencion se refiere a estos plasmidos y el inserto que contienen, que codifica la protema de envoltura VSV-G.
La presente descripcion tambien describe protemas de envoltura de fusion, especialmente protemas de fusion que comprenden varios fragmentos diferentes de las protemas VSV-G de diferentes virus y a las construcciones de acido nucleico que codifican dichas protemas. Una envoltura de fusion particular es la fusion entre el ectodominio de la protema de envoltura de Nueva Jersey y el dominio transmembrana y el dominio citoplasmico de la protema de envoltura de Indiana como se ilustra en las figuras.
Otra protema de envoltura de fusion de acuerdo con la invencion comprende el ectodominio de una protema VSV-G seleccionada entre VSV-G Chandipura, VSV-G Cocal, VSV-G Piry, VSV-F Isfahan o VSV-G SVCV y los dominios transmembrana y citoplasmicos de VSV-G de Indiana. La presente invencion tambien se refiere a una molecula de acido nucleico que codifica dicha protema de fusion ilustrada en las figuras, y especialmente un acido nucleico con codones optimizados que codifica la protema de fusion tambien descrita en las figuras.
La presente invencion tambien se refiere a los vectores de expresion, especialmente los plasmidos que contienen las construcciones de acido nucleico que codifican las protemas de fusion.
Las caractensticas esenciales basicas que caracterizan el genoma del vector utilizado en la construccion de las partroulas del vector lentivmco pseudotipificado de la invencion han sido descritas anteriormente. Las caractensticas adicionales para la preparacion del genoma del vector adecuado (tambien designado vector de transferencia) se describen mas adelante, incluyendo en los ejemplos y en los dibujos.
En una realizacion particular de la invencion, los vectores lentivmcos pseudotipificados son vectores basados en lentivirus humanos. De acuerdo con su genoma se obtiene de un lentivirus humano, especialmente del lentivirus del VIH. En particular, el vector lentivmco pseudotipificado es un vector basado en el VIH, tal como un vector basado en VIH-1 o VIH-2, en particular se obtiene del VIH-1M, por ejemplo, de los aislados BRU o LAI.
En otra realizacion, los vectores lentivmcos pseudotipificados son vectores basados en lentivirus de primates o felinos.
Como se manifesto anteriormente, cuando se considera aparte del transgen que finalmente contiene, el genoma del vector es un vector de reemplazo en el que el acido nucleico entre las 2 repeticiones terminales largas (LTR) en el genoma original del lentivirus han sido restringidas a secuencias de accion en cis para la smtesis de ADN o ARN y el procesamiento, o por lo menos son eliminadas o mutadas para los segmentos esenciales de acido nucleico que hanan posible la expresion de las protemas de estructura lentivmica incluyendo la poliprotema GAG funcional biologica y posiblemente las protemas POL y ENV.
En una realizacion particular, el genoma del vector es defectuoso para la expresion del Gag funcional biologicamente, y provechosamente para las protemas POL y ENV funcionales biologicamente.
Las secuencias 5' LTR y 3' LTR del lentivirus son utilizadas en el genoma del vector, pero la 3'-LTR por lo menos es modificada con respecto a la 3'LTR del lentivirus original por lo menos en la region U3. La 5'LTR tambien puede modificarse, especialmente en su region del promotor.
En una realizacion particular, el genoma del vector esta desprovisto en consecuencia de las secuencias de codificacion para los genes accesorios Vif, Vpr, Vpu y Nef (para vectores lentivmcos de VIH-1), o sus genes funcionales o completos.
En una realizacion preferida, el genoma del vector de las partroulas del vector lentivmco comprende, como un fragmento de accion en cis insertado, por lo menos un polinucleotido que consiste en el ala de ADN o que contiene dicha ala de ADN. En una realizacion particular, el ala de ADN es insertada cadena arriba del polinucleotido de interes, provechosamente pero no necesariamente para ser localizada en una posicion aproximadamente central en el genoma del vector. Un ala de ADN adecuada para la presente invencion puede obtenerse de un retrovirus, especialmente de un lentivirus, en particular un lentivirus humano, o de un organismo similar a un retrovirus tal como un retrotransposon. Puede obtenerse como alternativa del virus CAEV (Virus de Encefalitis de Artritis Caprina), el virus EIAV (Virus de Anemia Infecciosa Equina), el virus VISNA, el virus SIV (Virus de la Inmunodeficiencia de Simios) o el virus FIV (Virus de la Inmunodeficiencia Felina). El ala de ADN puede prepararse sinteticamente (smtesis qmmica) o mediante la amplificacion del ADN proporcionando el ala del ADN de la fuente apropiada como se definio anteriormente tal como por medio de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). En una realizacion mas preferida, el ala de ADN se obtiene de un retrovirus de VIH, por ejemplo, el virus VIH-1 o VIH-2 incluyendo cualquier aislado de estos dos tipos.
El ala de ADN (definida por Zennou V. et al., 2000, en Cell vol 101, 173-185 o en los documentos WO 99/55892 y WO 01/27304), es una estructura que es central en el genoma de algunos lentivirus especialmente en el VIH, donde dan origen a una estructura de ADN tricatenario normalmente sintetizada durante la transcripcion inversa del VIH especialmente y que actua como un determinante cis del genoma de VIH de importacion nuclear. El ala de ADN hace posible el evento de desplazamiento de cadena central controlado en cis por el tramo de polipurina central (cPPT), y la secuencia de terminacion central (CTS) durante la transcripcion inversa. Cuando se inserta en los vectores de origen lentivmco, el polinucleotido que hace posible que el ala de ADN sea producida durante la transcripcion inversa, estimula la eficiencia de transferencia del gen y complementa el nivel de Importacion nuclear de los niveles de tipo silvestre (Zennou et al., Cell, 2000).
Las secuencias de las alas de ADN han sido descritas en la tecnica anterior, especialmente en las solicitudes de patente anteriormente mencionadas. Estas secuencias tambien se describen en las figuras adjuntas como de la SEQ ID NO 1 a la SEQ ID NO 7. Son preferentemente insertadas como fragmented posiblemente con secuencias flanqueantes adicionales en el genoma del vector en una posicion que es cercana al centro de dicho genoma del vector. Como alternativa pueden ser insertadas inmediatamente cadena arriba del promotor que controla la expresion del polinucleotido de la invencion. Dichos fragmentos que comprenden el ala de ADN, insertados en el genoma del vector pueden tener una secuencia de aproximadamente 80 hasta aproximadamente 200 pb, dependiendo de su origen y preparacion.
De acuerdo con una realizacion particular, el ala de ADN tiene una secuencia de nucleotidos de aproximadamente 90 hasta aproximadamente 140 nucleotidos.
En el VIH-1, el ala de ADN es un solapamiento de cadenas estable de 99 nucleotidos de longitud. Cuando se utiliza en el vector del genoma del vector lentivmco de la presente invencion, puede insertarse como una secuencia mas larga, especialmente cuando se prepara como un fragmento de PCR. Un polinucleotido apropiado particular que comprende la estructura que proporciona el ala de ADN es un fragmento de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de 178 pares de bases que comprende las regiones cPPT y CTS del ADN de VIH-1 (Zennou et al., 2000).
Este fragmento de PCR puede obtenerse especialmente del clon de ADN infeccioso del LAI de VIH-1, especialmente el pLAI3 de VIH1, como un fragmento correspondiente a la secuencia de los nucleotidos 4793 a 4971. Si es apropiado, se agregan sitios de restriccion a uno o ambos extremos del fragmento obtenido para la clonacion. Por ejemplo, pueden agregarse sitios de restriccion Nar I en los extremos 5' de los cebadores utilizados para llevar a cabo la reaccion de PCR.
Por lo tanto, el ala de ADN se utiliza, en la presente invencion, se elimina de las partes 5' y 3' innecesarias del gen pol y se recombina con secuencias de un origen diferente. El ala de ADN puede prepararse sinteticamente (smtesis qmmica) o mediante la amplificacion del ADN proporcionando el ala de a Dn de la fuente apropiada como se definio anteriormente tal como mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). En una realizacion mas preferida, el ala de ADN se obtiene de un retrovirus VIH, por ejemplo, virus VIH-1 o VIH-2 incluyendo cualquier aislado de estos dos tipos.
Se ha especificado que el ala de ADN utilizada en el vector del genoma y los polinucleotidos del plasmido de encapsidacion que codifican las poliprotemas GAG y POL deben originarse de la misma sub-familia de lentivirus o del mismo organismo similar al retrovirus.
Preferentemente, las otras secuencias de activacion en cis del vector del genoma tambien se originan del mismo lentivirus o de un organismo similar al lentivirus, como el que proporciona el ala de ADN.
El genoma del vector puede comprender ademas uno o varios sitios de restriccion unicos para la clonacion del polinucleotido de interes.
De acuerdo con la presente invencion, el vector lentivmco pseudotipificado es un vector lentivmco incompetente para replicacion como resultado del hecho de que los genes funcionales gag y pol son proporcionados exclusivamente en trans y por lo tanto no se presentan en el genoma del vector. En dicho caso, cuando el vector lentivmco se ha administrado al hospedador, no tiene la capacidad de replicarse en las celulas hospedadoras. Por lo tanto, proporciona el polinucleotido de interes terapeutico a las celulas hospedadoras para la expresion pero no forma partteulas adicionales del vector lentivmco. Esta condicion incompetente para la replicacion del vector lentivmco se logra especialmente cuando los genes gag, pol, env lentivmcos no se proporcionan en el genoma del vector o no se proporcionan como genes funcionales. Por “funcional" se entiende un gen que se transcribe correctamente y/o se expresa correctamente. Por lo tanto, el genoma del vector lentivmco de la invencion en esta realizacion contiene por lo menos uno de los genes gag, pol y env que no se transcribe o se transcribe de manera incompleta; la expresion “transcrito de manera incompleta” se refiere a la alteracion de los transcritos gag, gag-pro o gag-pro-pol, no estando transcritos uno o varios de estos. Otras secuencias implicadas en la replicacion lentivmca tambien pueden mutarse en el genoma del vector, con el objeto de lograr esta condicion.
En una realizacion preferida, en dicho genoma del vector, la secuencia 3' LTR del genoma del vector lentivmco esta desprovista de por lo menos el activador (potenciador) y posiblemente el promotor de la region U3. En otra realizacion particular, la region 3' LTR esta desprovista de una region U3 (delta U3). En este aspecto, se hace referencia a los documentos WO 01/27300 y WO 01/27304.
En una realizacion particular, en el genoma del vector, la region U3 de la LTR 5' es reemplazada por una U3 no lentivmca o por un promotor adecuado para operar la transcripcion primaria independiente de tat. En dicho caso, el vector es independiente del transactivador tat.
El genoma del vector tambien comprende la senal de empaquetamiento psi (y). La senal de empaquetamiento se obtiene del fragmento N terminal del ORF de gag. En una realizacion particular, su secuencia podna modificarse mediante mutacion (mutaciones) de desplazamiento de fase con el objeto de evitar cualquier interferencia de una posible transcripcion/traduccion del peptido gag, con la del transgen.
El genoma del vector puede opcionalmente comprender tambien elementos seleccionados entre un sitio donante (SD) de corte y empalme, un sitio aceptor (SA) de corte y empalme y/o un elemento de respuesta a Rev (RRE).
De acuerdo con una realizacion particular, el plasmido del vector (o vector de genoma agregado) comprende las siguientes secuencias de accion en cis para un casete de expresion transgenica:
1. La secuencia LTR (Repeticion Terminal Larga), requerida para la transcripcion inversa, la integracion del ADN vmco y la transcripcion. La 3' LTR se ha eliminado en la region U3, sin alterar las funciones necesarias para la transferencia del gen, por dos razones principales: primero, para evitar la trans-activacion de un gen hospedador, una vez que el ADN se ha integrado en el genoma, y en segundo lugar para permitir la auto-desactivacion de las secuencias en cis vmcas despues de la retrotranscripcion. Opcionalmente, la secuencia U3 dependiente de tat de la 5'-LTR que opera la transcripcion del genoma es reemplazada por una secuencia promotora. Por lo tanto, en celulas diana solamente se transcribiran las secuencias del promotor interno (transgenes) (Figuras 23 y 24). 2. La region y , necesaria para la encapsidacion del ARN vmco.
3. La secuencia RRE (Elemento de Respuesta a REV) permite la exportacion de ARN mensajero vmco del nucleo al citosol despues de la union de la protema Rev.
4. La secuencia del ala de ADN (cPpT/CTS, normalmente contenida en el Pol) para facilitar la importacion nuclear.
5. Opcionalmente, la secuencia WPRE activa en cis (Elemento Posterior a la Respuesta del virus de la hepatitis B de la marmota) tambien agregado para optimizar la estabilidad del ARNm (Zufferey et al., 1999). No se tradujo el WPRE.
En una realizacion particular, aparte del polinucleotido de interes terapeutico que puede proceder de una region de codificacion de un lentivirus, el plasmido del vector descrito con respecto a las secuencias de accion en cis citadas anteriormente, esta desprovisto de otras secuencias de nucleotidos lentivmcos.
El vector lentivmco para su uso de acuerdo con la invencion no es replicativo, por ejemplo, el vector y el genoma del vector lentivmco no pueden formar partmulas nuevas a partir de la celula hospedadora infectada. Esto puede conseguirse mediante la ausencia en el genoma lentivmco de los genes gag, pol o env, como se indica en el parrafo anterior; y esto tambien puede lograrse eliminando otra secuencia(s) de codificacion vmca y/o elementos geneticos de accion en cis necesarios para la formacion de partmulas. La ausencia de replicacion del vector lentivmco debe ser distinta de la replicacion del genoma lentivmco. De hecho, como se describio con anterioridad, el genoma lentivmco puede contener un origen de replicacion que asegura la replicacion del genoma del vector lentivmco sin asegurar necesariamente la replicacion del vector (o partmula).
En una realizacion adicional, particularmente cuando el polinucleotido que codifica el al menos un polipeptido antigenico se origina de un lentivirus, dicho genoma del vector lentivmco no comprende un polinucleotido que codifica gag, pol o rev lentivmco completo, lo que significa que dicho genoma del vector lentivmco comprende un polinucleotido mas corto que los genes gag, pol o rev lentivmcos. Por lo tanto, la secuencia de codificacion de gag es mas corta de 1500 pb para el VIH-1 o VIH-2; la secuencia de codificacion de pol es mas corta de 3000 pb para el VIH-1 y 3300 pb para el VIH-2; la secuencia de codificacion de env es mas corta de 2700 pb para el VIH-1 y 2500 pb para el VIH-2. Este tamano se refiere a la secuencia de nucleotidos continua mas larga encontrada como tal en el genoma lentivmco natural. Sin embargo, en otra realizacion particular, el genoma lentivmco esta desprovisto de todas las secuencias lentivmcas de codificacion endogenas.
Con el objeto de obtener vectores lentivmcos de acuerdo con la presente invencion, el genoma del vector (como un plasmido vector) debe estar encapsidado en partmulas o pseudo-partmulas. Por consiguiente, las protemas lentivmcas, excepto las protemas de envoltura, tienen que proporcionarse en trans al genoma del vector en el sistema de produccion, especialmente en celulas de produccion, junto con el genoma del vector, que tiene el recurso de por lo menos un plasmido de encapsidacion portador de los genes lentivmcos gag y pol o gen pol incompetente para integracion, y preferentemente que carece de las secuencias de codificacion para los genes accesorios Vif, Vpr, Vpu y Nef (para los vectores lentivmcos de VIH-1).
Se utiliza un plasmido adicional, que porta un polinucleotido que codifica la protema(s) de envoltura seleccionada para la pseudotipificacion de cada vector lentivmco.
En una realizacion preferida, el plasmido de empaquetamiento codifica solamente las protemas lentivmcas esenciales para la smtesis de partmulas vmcas. Los genes accesorios cuya presencia en el plasmido podna originar preocupaciones de seguridad son en consecuencia retirados. Las protemas vmcas provistas en trans son respectivamente como se ilustran para el VIH-1:
1. Las protemas gag para la construccion de la matriz (MA, con un Peso Molecular aparente p17), la capsida (CA, p24) y la nucleocapsida (NC, p6).
2. Enzimas codificadas pol: integrasa, proteasa y transcriptasa inversa.
3. Las protemas reguladoras de codificacion de Tat y Rev, Tat es necesaria para el inicio de la transcripcion mediada por la LTR; puede omitirse si la region U3 de 5'LTR es substituida por un promotor que conduce la transcripcion independiente de tat.
Con el objeto de evitar cualquier empaquetamiento del ARNm generado de los genes contenidos en el plasmido de empaquetamiento en las partmulas vmcas, la region ^ se elimina del plasmido de empaquetamiento. Un promotor heterologo se inserta en el plasmido para evitar problemas de recombinacion y una cola poli-A es agregada 3' de las secuencias que codifican las protemas.
El plasmido de envoltura codifica la protema(s) de envoltura para la pseudotipificacion que se describe en el presente documento, bajo el control de un promotor interno.
Cualquiera o todos los plasmidos descritos para la preparacion de las partmulas del vector lentivmco de la invencion pueden tener los codones optimizados (CO) en el segmento que codifica las protemas. La optimizacion de codones de acuerdo con la invencion se lleva a cabo preferentemente para mejorar la traduccion de las secuencias de codificacion contenidas en los plasmidos, en celulas de mairnferos, especialmente celulas humanas. De acuerdo con la invencion, la optimizacion de codones es especialmente adecuada para mejorar directa o indirectamente la preparacion de las partmulas del vector o para mejorar su captacion por las celulas del hospedador al que se administran, o para mejorar la eficiencia de la transferencia del polinucleotido de interes (transgen) en el genoma de las celulas transducidas del hospedador. Se conocen bien en la tecnica metodos para optimizar los codones y la optimizacion de codones se realiza especialmente utilizando los programas disponibles para ello. La optimizacion de codones es ilustrada por las secuencias de codificacion contenidas en los plasmidos pTRIP descritos y plasmidos pThV de la invencion ilustrados en las figuras.
En una realizacion particular de la presente invencion, el vector lentivmco pseudotipificado es tambien, o como alternativa, incompetente para integracion. En dicho caso, el genoma del vector y por lo tanto el polinucleotido heterologo de interes terapeutico no se integran en el genoma de las celulas transducidas o en las celulas del hospedador al que se ha administrado.
La presente invencion se refiere al uso de un vector lentivmco en donde la protema de integrasa expresada es defectuosa y que ademas comprende un polinucleotido que codifica especialmente por lo menos un polipeptido antigenico, para producir una composicion inmunogenica adecuada para promover una respuesta inmune contra dicho al menos un polipeptido, en un hospedador que lo necesita. El polinucleotido es uno que tiene las caractensticas descritas en el presente documento.
Dicho polinucleotido (o genoma del vector lentivmco) comprende todos los elementos necesarios para la importacion nucleica y la expresion correcta del polinucleotido que codifica por lo menos un polipeptido antigenico. Como ejemplos de los elementos que pueden insertarse en el genoma lentivmco del vector lentivmco de la invencion se encuentra por lo menos una (preferentemente dos) Repeticion Terminal Larga (LTR), tal como una LTR5' y una LTR3', una secuencia psi involucrada en la encapsidacion del genoma lentivmco, y opcionalmente por lo menos un ala de ADN que comprende un cRPT y un dominio CTS. El genoma del vector lentivmco tambien puede comprender elementos seleccionados entre un sitio donante (SD) de corte y empalme, un sitio aceptor (SA) de corte y empalme y/o un elemento de respuesta a Rev (RRE).
Dicho vector lentivmco es pseudotipificado con una protema VSV-G, como se describe en el presente documento.
Por “defectuoso" se entiende que la integrasa, preferentemente de origen lentivmco, esta desprovista de la capacidad de integracion del genoma lentivmco en el genoma de las celulas hospedadoras, es decir, una protema de integrasa mutada para alterar espedficamente su actividad de integrasa.
Los vectores lentivmcos incompetentes para la integracion se obtienen mediante la modificacion del gen pol que codifica la integrasa, dando como resultado un gen pol mutado que codifica una integrasa deficiente en integracion, estando contenido dicho gen pol modificado en el plasmido de encapsidacion. Dichos vectores lentivmcos incompetentes para la integracion se han descrito en la Solicitud de Patente WO 2006/010834. Por consiguiente, la capacidad de la integrasa de la protema se altera mientras que la expresion correcta del plasmido de encapsidacion de las protemas GAG, PRO y POL y/o la formacion de la capsida y por tanto de las partmulas del vector, asf como otras etapas del ciclo vmco, precedentes o posteriores a la etapa de integracion, tales como la transcripcion inversa, la importacion nuclear, permanecen intactos. Una integrasa se denomina defectuosa cuando la integracion que debena habilitar es alterada de modo que la etapa de integracion tiene lugar en menos de 1 entre 1000, preferentemente 1 entre 10000, comparado con el vector lentivmco que contiene una integrasa correspondiente de tipo silvestre.
En una realizacion particular de la invencion, la integrasa defectuosa es el resultado de una mutacion de clase 1, preferentemente sustituciones de aminoacidos (una sustitucion de un aminoacido) o eliminaciones cortas que cumplen con los requisitos de la expresion de una integrasa defectuosa. La mutacion se lleva a cabo dentro del gen pol. Estos vectores pueden portar una integrasa defectuosa con la mutacion D64V en el dominio catalttico de la enzima, que bloquea espedficamente las reacciones de escision y union del ADN de la etapa de integracion. La mutacion D64V disminuye la integracion del VIH-1 pseudotipificado hasta 1/10.000 de tipo silvestre, pero mantiene su capacidad para transducir celulas que no se dividen, permitiendo la expresion eficiente del transgen.
Otras mutaciones en el gen pol que son adecuadas para afectar la capacidad de integrasa de la integrasa del VIH-1 son las siguientes: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N120I, N120E, E152G, E152A, D-35-E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199C, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A y K264H.
En una realizacion particular, la mutacion en el gen pol se lleva a cabo en cualquiera de las siguientes posiciones D64, D116 o E152, o en varias de estas posiciones que se encuentran en el sitio catalftico de la protema. Cualquier sustitucion en estas posiciones es adecuada, incluyendo las que se describieron anteriormente.
Otra sustitucion propuesta es el reemplazo de los restos de aminoacidos RRK (posiciones de la 262 a la 264) por los restos de aminoacidos AAH.
En una realizacion particular de la invencion, cuando el vector lentivmco es incompetente para la integracion, el genoma lentivmco comprende ademas un origen de replicacion (ori), cuya secuencia depende de la naturaleza de las celulas donde el genoma lentivmco va a expresarse. Dicho origen de replicacion puede ser de origen eucariotico, preferentemente de origen mairnfero, y mas preferentemente de origen humano. Puede como alternativa ser de origen vmco, especialmente viniendo de virus episomicos circulares de ADN, tales como el SV40 o el RPS. Es una realizacion provechosa de la invencion que tenga un origen o replicacion insertado en el genoma lentivmco del vector lentivmco de la invencion. De hecho, debido a que el genoma lentivmco no se integra en el genoma de la celula hospedadora (debido a la integrasa defectuosa), el genoma lentivmco se pierde en las celulas que experimentan divisiones celulares frecuentes; y esto sucede particularmente en celulas inmunes, tales como linfocitos B o T. La presencia de un origen de replicacion asegura que por lo menos un genoma lentivmco esta presente en cada celula, aun despues de la division de la celula, maximizando la eficiencia de la respuesta inmune.
En una realizacion particular de la presente invencion, el genoma del vector lentivmco es un genoma basado en VIH y tiene las caractensticas de secuencia representadas en las figuras 2 o de la 23 a la 25, en donde dicha secuencia de interes se selecciona por su interes terapeutico y el promotor interno que hace posible su expresion (representada en las figuras por el promotor de CMV) se selecciona de manera provechosa para que sea adecuado para la administracion en seres humanos.
El promotor interno contenido en el transgen o en el casete de expresion del genoma del vector puede seleccionarse de los promotores de los siguientes genes: EF1a, PGK humano, PPI (preproinsulina), tiodextrina, cadena invariable DR de HLA (P33), cadena DR alfa de HLA, cadena L de Ferritina o cadena H de Ferritina, Beta 2 microglobulina, Quimosina beta 4, Quimosina beta 10 o Protema de Cistatina del Ribosoma L41.
El genoma del vector lentivmco de dichos vectores lentivmcos de la invencion puede especialmente proceder del plasmido de VIH-1 pTRIPAU3.CMV-GFP depositado en el CNCM (Paris, Francia) el 11 de Octubre de 1999 bajo el numero I-2330. La estructura y los sitios de restriccion de las diversas secuencias contenidas en el plasmido se muestran en la Figura 2D. La secuencia del pTRIPAU3.CMV-GFP se proporciona en la Figura 6.
En una realizacion particular de la invencion, el genoma del vector lentivmco puede proceder del plasmido de VIH-1 pTRIP[delta]U3EF1[alfa]-GFP depositado en el CNCM el 11 de Octubre de 1999 bajo el numero I-2328. Una descripcion de las secuencias constitutivas del plasmido se ilustra en la Figura 2E, con los sitios de restriccion de las diversas secuencias.
Cuando el genoma del vector procede de estos plasmidos particulares, se inserta una secuencia de un polinucleotido heterologo descrito en la presente solicitud en el mismo, ademas o en reemplazo del fragmento de codificacion de GFP. La secuencia de codificacion de GFP tambien puede ser substituida por un marcador diferente. El promotor de CMV tambien puede ser substituido por otro promotor, especialmente uno de los promotores descritos anteriormente, especialmente en relacion con la expresion del transgen.
Otros genomas del vector lentivmco adecuados para llevar a cabo la presente invencion son los contenidos en el material depositado enumerados posteriormente en el presente documento o proceden de estos plasmidos depositados, especialmente sustituyendo el transgen ya sea por un polinucleotido diferente de interes y/o por un promotor interno diferente. La secuencia WPRE tambien contenida en los vectores pTRIP depositados particulares tambien puede eliminarse.
La invencion por lo tanto se refiere al genoma del vector lentivmco proporcionado por el plasmido pTRIPDeltaU3-CMV-SIV-GAGco-WpRE depositado en el CNCM (Paris, Francia) el 10 de octubre de 2007 bajo el Numero 1-3841. La composicion del plasmido se describe en las figuras y se proporciona su secuencia. Este plasmido expresa la protema GAG del SIV como una protema no miristilada. Se han optimizado los codones del ORF del transgen para la expresion en celulas humanas.
La presente invencion tambien se refiere al genoma del vector lentivmco proporcionado por el plasmido pTRlPDelta U3-CMV-SIV-GAG-WPRE depositado en el CNCM (Pans, Francia) el 10 de octubre de 2007 bajo el Numero I 3840. La composicion del plasmido se describe en las figuras y se proporciona su secuencia. Este plasmido expresa la protema GAG del SlV como una protema no miristilada. El ORF del transgen no tiene codones optimizados.
Las partmulas del vector pueden producirse despues de la transfeccion de las celulas apropiadas, tales como celulas 293T, por dichos plasmidos, o por otros procesos. En las celulas utilizadas para la expresion de las partmulas lentivmcas, todos o algunos de los plasmidos pueden utilizarse para expresar de manera estable sus polinucleotidos de codificacion, o para expresar de manera transitoria o semi-estable sus polinucleotidos de codificacion.
La concentracion de las partmulas producidas puede determinarse midiendo el contenido de P24 (protema de la capsida para el VIH-1) de los sobrenadantes de las celulas.
El vector lentivmco para su uso de acuerdo con la presente invencion, una vez que se administra al hospedador, infecta celulas del hospedador, posiblemente celulas espedficas, dependiendo de las protemas de envoltura con las que se pseudotipifico. La infeccion conduce a la liberacion del genoma lentivmco en el citoplasma de la celula hospedadora donde tiene lugar la retrotranscripcion. Una vez bajo una forma triple (por medio de un ala de ADN), el genoma lentivmco se importa dentro del nucleo, donde el polinucleotido de interes se expresa por medio de la maquinaria celular. Cuando se transducen celulas que no estan en division (tales como DC), la expresion puede ser estable. Cuando se transducen celulas en division, tales como linfocitos B, la expresion es temporal en ausencia del origen de replicacion en el genoma lentivmco, debido a la dilucion del acido nucleico y la division celular. La expresion puede ser mas larga proporcionando un origen de replicacion que asegura la difusion apropiada del genoma lentivmco en celulas hijas despues de la division celular. La estabilidad y/o la expresion tambien puede aumentarse mediante la insercion de los elementos MAR (Region Asociada a la Matriz) o SAR (Region Asociada al armazon).
De hecho, estas regiones SAR o MAR son secuencias ricas en AT que hacen posible anclar el genoma lentivmco a la matriz del cromosoma de la celula, regulando de esta manera la transcripcion del polinucleotido que codifica por lo menos un polipeptido antigenico, y particularmente estimulando la expresion genica del transgen y mejorando la accesibilidad a la cromatina.
Si el genoma lentivmco no es integrador, no se integra en el genoma de la celula hospedadora. No obstante, el al menos un polipeptido codificado por el transgen se expresa lo suficiente y es suficientemente mas largo para ser procesado, asociado con las moleculas del MHC y finalmente dirigido hacia la superficie de la celula. Dependiendo de la naturaleza del polinucleotido de interes, el al menos un epttopo polipeptfdico asociado con la molecula del MHC desencadena una respuesta inmune humoral o celular. La preparacion del vector lentivmco incompetente para integracion, se ha descrito en el presente documento: el plasmido de encapsidacion utilizado para transcomplementar el genoma del vector esta mutado en la region de la protema de integrasa, de modo que dicha integrasa no se expresa o no se expresa funcionalmente en el vector lentivmco cuando dicho vector se produce como partmulas pseudotipificadas en una celula hospedadora, despues de que dicho vector lentivmco se ha administrado a un paciente.
La expresion “composicion inmunogenica" se refiere a una composicion que comprende por lo menos el vector lentivmco como se usa en la invencion como principio activo, siendo adecuada dicha composicion para la administracion en un hospedador. Esta composicion puede comprender ademas un excipiente o transportador y/o vehmulo farmaceuticamente adecuado, cuando se utiliza para la administracion sistemica o local. Un “vehculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un material de encapsulacion solido, semisolido o carga lfquida, diluyente no toxico o un adyuvante de formulacion de cualquier tipo convencional. Un “vehculo farmaceuticamente aceptable" no es toxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulacion; los vehmulos adecuados incluyen, pero sin limitacion, soluciones salinas tamponadas por fosfato, agua destilada, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversostipos de agentes humectantes, soluciones esteriles y similares, dextrosa, glicerol, solucion salina, etanol y combinaciones de los mismos.
La composicion inmunogenica descrita tiene la capacidad, a pesar de la ausencia de integracion del transgen en el genoma de la celula hospedadora, de promover una respuesta inmune, es decir, cualquier reaccion del sistema inmune del hospedador contra dicho al menos un polipeptido (codificado por dicho transgen).
La respuesta inmune puede ser una respuesta humoral, por ejemplo, se producen anticuerpos, promovidos por dicha composicion, contra dicho al menos un polipeptido del vector lentivmco. En una realizacion particular, dicha respuesta humoral es una respuesta humoral protectora. La respuesta humoral protectora da como resultado principalmente anticuerpos madurados, que tienen una alta afinidad por su antfgeno, tales como IgG. En un aspecto particular, la respuesta humoral protectora depende de los linfocitos T. En una realizacion particular, la respuesta humoral protectora induce la produccion de anticuerpos neutralizantes.
La respuesta immune puede ser una respuesta immune celular (respuesta immune de linfocitos T), particularmente una respuesta immune celular portada por CD8 o una respuesta immune celular mediada por CD4, es decir, una respuesta immune que esta mediada por celulas activadas que albergan receptores CD8 o CD4, preferentemente linfocitos T citotoxicos (CTL).
En una realizacion particular de la invencion, el vector lentivftico para su uso de acuerdo con la invencion, a pesar de la integrasa defectuosa, puede promover una respuesta inmune temprana. La expresion “respuesta inmune temprana" se refiere a una respuesta inmune protectora (proteccion contra el patogeno o la celula tumoral portadora de dicho al menos un polipeptido) que es conferida en un periodo de aproximadamente una semana despues de la administracion de la composicion.
En otra realizacion, la respuesta inmune conferida por la composicion para su uso de acuerdo con la invencion es una respuesta inmune de larga duracion, es decir, dicha respuesta inmune puede detectarse todavfa por lo menos dos meses, preferentemente por lo menos 3 meses y mas preferentemente por lo menos 6 meses despues de la administracion de la composicion. Cuando la respuesta inmune es humoral, la respuesta de larga duracion puede ser mostrada por la deteccion de anticuerpos espedficos, por cualquier metodo adecuado tal como ELISA, inmunofluorescencia (IFA), pruebas de neutralizacion de reduccion del foco (FRNT), inmunoprecipitacion o transferencia de Western.
En otra realizacion, independiente de la realizacion anterior, la resistencia de la respuesta inmune conferida por la composicion para su uso de acuerdo con la presente invencion depende de las dosis inyectadas de los vectores lentivfticos; cuanto mayor sea la dosis, mayor sera fuerza de la respuesta inmune.
De manera interesante, dicha respuesta inmune, ya sea humoral o celular, una respuesta inmune temprana y/o respuesta inmune de larga duracion, es promovida con el vector de transferencia del gen no integrador, despues de una sola administracion de la composicion para su uso de acuerdo con la presente invencion.
Con la intencion de usar las partmulas del vector lentivmco y especialmente el equipo de compuestos en el diseno de protocolos de tratamiento medicinales, los vectores lentivmcos para su uso de acuerdo con la presente invencion portan en su genoma de vector, un polinucleotido heterologo (o transgen) que tiene un interes terapeutico. Por la expresion "polinucleotido heterologo”, se entiende que el genoma del vector comprende, independientemente de las secuencias de accion en cis en el genoma del vector que se originan del genoma del lentivirus y que son necesarias o utiles para la actividad del vector, por lo menos un polinucleotido que no es necesario o que no es util para la actividad del vector pero que es adecuado para obtener un efecto biologico, especialmente un efecto medicinal cuando se expresa en un hospedador, especialmente un hospedador humano. En una realizacion preferida, el polinucleotido de interes codifica un polipeptido y preferentemente esta incluido en un casete de expresion.
El polinucleotido heterologo del presente documento codifica un polipeptido o varios polipeptidos que es (son) adecuados para promover una respuesta inmune en un hospedador, siendo dicha respuesta inmune una respuesta inmune celular y posiblemente una respuesta humoral. El polipeptido(s) codificado(s) (es decir, antfgeno) comprende(n) uno o varios epftopos o consiste(n) en epftopo(s) de un antfgeno. En una realizacion particular, puede ser un poliepftopo. Puede(n) ser procesado(s) en las celulas del hospedador para la presentacion por la APC, especialmente la DC, del hospedador para originar una respuesta inmune, o puede(n) promover directamente una respuesta inmune. Por consiguiente, el polinucleotido de interes comprende o consiste en secuencias de epftopo(s) B y/o epftopo(s) T de uno o varios antfgenos, Incluyendo la asociacion de ambas categonas de epftopos, posiblemente originando un polipeptido quimerico (es decir, no natural).
El epftopo puede depender ya sea de una conformacion antigenica tridimensional espedfica (epftopo de conformacion), o puede corresponder a una region de secuencia primaria simple (epftopo lineal). El tamano del polipeptido vana de al menos 9 aminoacidos hasta 500 aminoacidos, y preferentemente es de menos de 200 aminoacidos.
En un aspecto particular, el polinucleotido heterologo codifica un antfgeno o varios antfgenos o fragmentos de los mismos incluyendo los epftopos (epftopos B y/o T) de un organismo patogeno tal como un virus, especialmente un retrovirus, lentivirus, flavivirus o coronavirus, bacteria o parasito, o de un agente patogeno o compuesto. Puede codificar un antfgeno del organismo patogeno o antfgenos recombinantes, en la medida en que no habilite la expresion del organismo patogeno cuando se administra el vector lentivftico.
El polinucleotido heterologo puede expresarse como un antfgeno endogeno en las celulas del hospedador especialmente despues de la transferencia de dicho polinucleotido en el genoma de las celulas del hospedador y procesado en dichas celulas para la presentacion en asociacion con las moleculas del MHC.
El polinucleotido de interes puede seleccionarse de modo que la respuesta inmune promovida con el vector, posiblemente despues de la presentacion del APC, puede comprender especialmente una promocion de la respuesta de linfocitos T, incluyendo linfocitos T auxiliares o CTL (citotoxicos). Una respuesta de linfocitos T CD8+, contra el producto de expresion procesado de dicho polinucleotido, en un hospedador es especialmente de interes.
Tambien se puede expresar una respuesta de linfocitos T CD4+ (inducida o promovida).
Son celulas particulares a las que se dirigen los vectores lentivrncos de la presente invencion ya sea en una version integradora o no integradora celulas implicadas en la respuesta inmune, tales como celulas presentadoras de antigeno (APC), celulas dendnticas (DC), incluyendo DC convencionales (cDC) o plasmacitoides (pDC), linfocitos T, incluyendo CD4+ o CD8+, linfocitos B, monocitos, macrofagos, linfocitos citolfticos naturales, linfocitos T citolfticos naturales, celulas del endotelio y celulas del epitelio. De modo interesante, se ha mostrado recientemente que los linfocitos B interaction con DC maduras en circulacion, activando de esta manera estos linfocitos B, que a su vez presentan de manera eficiente antfgenos a linfocitos T vfrgenes (amplificacion de la poblacion de APC madura); por lo tanto, esto senala el papel crftico de los linfocitos B en las celulas de sensibilizacion comprendidas en la respuesta inmune celular, y particularmente los linfocitos T CD8+ vfrgenes (Dfaz de Durana; 2006).
El polinucleotido de interes puede seleccionarse de modo que el vector de lentivirus para su uso de acuerdo con la presente invencion puede usarse tambien o como alternativa para promover una respuesta inmune humoral, especialmente una respuesta inmune humoral neutralizante, contra el producto de expresion de dicho polinucleotido, en un hospedador.
En una realizacion particular de la invencion en donde se pretende usar las partfculas del vector lentivrnco para la prevencion o tratamiento de infecciones no lentivrncas, el polinucleotido heterologo que tiene un interes biologico o terapeutico es de un origen diferente al polinucleotido que constituye el genoma del vector. Especialmente, se origina de un organismo diferente que el lentivirus que proporciona las secuencias del genoma del vector.
En una realizacion particular, donde se busca la prevencion o tratamiento de una infeccion lentivrnco, el polinucleotido heterologo puede originarse de la misma familia o del mismo serotipo del lentivirus que proporciona el vector, especialmente cuando las partfculas del vector lentivrnco son vectores lentivrncos basados en VIH.
En una realizacion particular, el polinucleotido heterologo codifica un antfgeno procedente de una proterna lentivrnca o de un fragmento antigenico de la misma o una combinacion de dichos antigenos. En dicho caso, dicho antfgeno de la proterna lentivrnca procedente del mismo o fragmento antigenico del mismo se utiliza en condiciones que evitan la formacion de partfculas lentivrncas naturales o competentes para la replicacion.
En una realizacion particular, se utiliza en condiciones que tambien previenen la formacion de pseudopartfculas de lentivirus tales como pseudopartfculas GAG o GAG-POL. Estos antfgenos pueden proceder del mismo lentivirus, especialmente el VIH, en particular el VIH-1, como el utilizado para el diseno del vector lentivrnco.
Por consiguiente, el polinucleotido puede ser una secuencia de codificacion de uno o varios polipeptidos o poliepftopos de VIH, especialmente polipeptidos o poliepftopos de VIH-1, adecuados para promover una respuesta celular, especialmente una respuesta de linfocitos T citotoxicos (CTL), y posiblemente una respuesta de T auxiliares en un hospedador.
Los vectores lentivrncos comprenden en su genoma un polinucleotido recombinante que codifica uno o varios polipeptidos que comprenden por lo menos un antfgeno procedente de un antfgeno GAG o poliproterna de un Virus de la inmunodeficiencia, especialmente del VIH, SIV o FIV.
La poliproterna GAG abarca la proterna de Matriz (MA), la proterna de Capsida (CA) y la proterna de Nucleocapsida (NP). Tambien puede comprender la proterna p7.
Los antfgenos procedentes de GAG como se definieron anteriormente abarcan polipeptidos procedentes de cada una de estas proternas, incluyendo fragmentos de las mismas o versiones mutadas (mediante la eliminacion, sustitucion o adicion) de la misma. Tambien abarca combinaciones de dichos polipeptidos procedentes de cada una de estas proternas.
En una realizacion particular, un antfgeno procedente de GAG de un virus de la inmunodeficiencia tiene la secuencia de aminoacidos de los antfgenos GAG naturales, especialmente de la poliproterna GAG o la proterna de Matriz o la proterna de Capsida o la proterna de nucleocapsida, o es un fragmento de dicha poliproterna o de dicha proterna, o es un antfgeno GAG que se modifica con respecto al antfgeno GAG natural, especialmente mediante mutacion, incluyendo mediante eliminacion, sustitucion o adicion de uno o varios restos de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos, o que se modifica mediante modificaciones post-traduccionales. El antfgeno GAG modificado se selecciona para que sea funcional biologicamente o no funcional biologicamente.
En una realizacion particular, el polinucleotido recombinante que codifica uno o varios polipeptidos que comprenden por lo menos un antfgeno procedente de una poliproterna Ga g de un Virus de la inmunodeficiencia codifica un polipeptido que es un polipeptido GAG no funcional biologicamente (incluyendo un fragmento antigenico del GAG) del SIV especialmente SIVmac, o del FlV, o del VIH en particular el VIH-1 o VIH-2, y que no tiene la capacidad de formar proternas de capsidas funcionales biologicamente dentro de las celulas transducidas con los vectores lentivrncos, y especialmente no induce la secrecion de las proternas de capsidas de estas celulas que habilitanan la formacion de pseudo partmulas GAG o de pseudo partmulas GAG-POL.
En una realizacion particular, el polinucleotido que incluye el acido nucleico que codifica el antigeno procedente de GAG no habilita la expresion de polipeptidos POL biologicamente activos (poliprotema tambien designada precursor) y por lo tanto no comprende los genes pol naturales o un gen funcional equivalente.
En una realizacion particular, el polinucleotido recombinante que codifica uno o varios polipeptidos que comprenden por lo menos un antigeno procedente de un antfgeno GAG de un virus de la inmunodeficiencia tambien codifica un polipeptido procedente de los antfgenos NEF, TAT o REV de un virus de la inmunodeficiencia y/u opcionalmente de un antfgeno POL de un virus de la inmunodeficiencia o una combinacion de los mismos. Estos polipeptidos son especialmente fragmentos antigenicos de dichos antigenos.
Los ejemplos del polinucleotido recombinante que codifica un antigeno procedente de GAG (de VIH-1) y fragmentos adicionales de nucleotidos que codifican otros antigenos de VIH-1 en una protema de fusion, es uno que codifica una protema GAG como se ilustra en la figura 21, y un fragmento POL y/o un fragmento NEF o una fusion de dichos fragmentos POL y NEF tambien descritos en la figura 21. Estos fragmentos pueden fusionarse 5' y/o 3' del antfgeno GAG, pueden ser contiguos entre ellos y/o con el antfgeno GAG o pueden estar separados por un peptido tal como el peptido 2A del picornavirus. Dicha construccion se ilustra en las figuras. La secuencia del peptido 2A es la siguiente: APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP. Una organizacion particular de la estructura de la protema de fusion es una de las siguientes: 5' GAG POL NEF 3', o 5' POL NEF GAG 3' o 5' POL GAG NEF 3', o 5' NEF GAG POL 3' o 5' NEF POL GAG 3' o 5' GAG NEF POL 3'.
En una realizacion preferida, los antfgenos procedentes de los antfgenos GAG y/o NEF y/o POL proceden del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), en particular VIH-1 o VIH-2.
En una realizacion particular, el polipeptido procedente del antfgeno GAG es una protema GAGAmyr que no es miristilada contraria a la GAG natural.
El GAG del VIH-1 no miristilado puede obtenerse mutando la secuencia de codificacion del GAG en el codon 2 para cambiar el resto de Gly [GGA] a un resto de Ala [GCA], o mediante la eliminacion de dicho codon 2.
Otros antfgenos procedentes del GAG de interes para la invencion son antfgenos formados de fragmentos de por lo menos una de las protemas de Matriz, Capsida o Nucleocapsida de GAG, especialmente estan formadas de una fusion de fragmentos de cada una de dichas protemas.
Se ha observado que el antfgeno derivado codificado puede proceder del antfgeno GAG del VIH-1, especialmente del subtipo B del VIH-1 o del grupo O del VIH-1 (figura 21) y utilizarse en una combinacion de compuestos para promover una respuesta inmune contra diversos grupos de VIH, incluyendo diferentes subtipos de VIH-1, VIH-1 y posiblemente VIH-2.
La invencion tambien se refiere al uso de un vector lentivmco como se define en el presente documento que comprende en su genoma, un polinucleotido recombinante que tiene una secuencia con codones optimizados humano que codifica un antfgeno procedente de una poliprotema g Ag de un Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), o que codifica un antfgeno de fusion incluyendo un antfgeno procedente del GAG y de por lo menos un fragmento antigenico de NEF, TAT, REV o POL como se describen en el presente documento.
Un antfgeno procedente del VIH-1 quimerico de la presente invencion es, en una realizacion particular, una protema de fusion que comprende o consiste en la combinacion del antfgeno procedente de GAG que tiene la secuencia de la figura 21, con un antfgeno procedente de NEF, POL, TAT o REV de la cepa del virus VIH-1 o con una combinacion de dichos antfgenos.
Una protema de fusion particular como se ha descrito anteriormente es una en donde el antfgeno procedente de POL comprende o tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 21.
Una protema de fusion particular como se ha descrito anteriormente es una en donde el antfgeno procedente de NEF comprende o tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 21.
Los antfgenos codificados por el polinucleotido del genoma del vector, y especialmente el antfgeno procedente de GAG, pueden ser de origen natural, sintetico o recombinante y por consiguiente expresados por cualquier metodo convencional.
La presente descripcion tambien describe construcciones nucleotidicas que codifican dicho antfgeno de fusion, incluyendo en su version con codones optimizados para la expresion en mairnferos, especialmente en celulas humanas.
De acuerdo con un aspecto particular de la divulgacion, el polinucleotido recombinante codifica un antfgeno procedente de la poliprotema GAG de la cepa de consenso B del VIH-1.
En otro aspecto particular de la divulgacion, el polinucleotido recombinante codifica un antigeno procedente de una poliprotema GAG y un grupo de epftopos del antigeno NEF del VIH y opcionalmente un grupo de epftopos de la poliprotema POL del VIH.
La presente descripcion describe moleculas de acido nucleico que codifican el antigeno descrito en el presente documento. Se refiere en particular a moleculas de acido nucleico insertadas en plasmidos depositados en el CNCM y especialmente los plasmidos pTRlPDelta U3-CMV-SIV-GAG-WPRE o pTRlPDelta U3-CMV-SIV-GAG co-WPRE, depositados en el CNCM o los plasmidos pThV-VSV-G(IND-co), pTh V-VSV-G(NJ-co), pThV-VSV-G(COCAL-co), pThV-VSV-G(ISFA-co) o pThV-VsV-G(SVCV-co) depositados en el CNCM, o a secuencias de hibridacion en condiciones rigurosas con estas moleculas de acido nucleico y que tienen especialmente la misma longitud o que son mas cortas. Los acidos nucleicos particulares codifican por lo menos un antigeno de GAG o un fragmento del mismo y especialmente codifican el antigeno GAG de VIH-1 o VlH-2 o un fragmento del mismo.
La especificidad de la respuesta celular se mide cuando se compara la respuesta obtenida con las partfculas del vector del lentivirus que expresan un polinucleotido heterologo que codifica un antigeno del VIH o un antigeno procedente del mismo con la respuesta obtenida con partmulas que no expresan dicho antigeno. Se ha observado que la administracion de las partmulas con capacidad de expresar dicho antigeno del VIH o antigeno procedente del VIH promueve la respuesta inmune de los linfocitos T que no es promovida con las partfculas que no expresan el antigeno.
Esto se ilustra en los ejemplos con partfculas que expresan un antigeno procedente de SIV.
La respuesta es provechosamente protectora lo que significa que hace posible lograr una disminucion en la carga vmca o controlar la carga vftica medida en el plasma del hospedador infectado con un virus de la inmunodeficiencia, que ha recibido por lo menos una sensibilizacion y una o varias administraciones de refuerzo de los compuestos de la combinacion de compuestos para un uso profilactico o terapeutico contra la infeccion por un virus de la inmunodeficiencia, especialmente por un VIH en un hospedador humano o por un SIVmac en un hospedador primate no humano.
En otras palabras, cuando se utiliza para el tratamiento profilactico o terapeutico de una infeccion por un virus de la inmunodeficiencia, especialmente un VIH, la combinacion administrada de compuestos permite la eliminacion del virus de cuerpo, o control de la carga vmca, durante un periodo de tiempo de larga duracion (mas de seis meses) y preferentemente hace posible la proteccion contra la enfermedad del SIDA in vivo. Los inventores han mostrado especialmente que, cuando se administra a un hospedador que esta infectado con el virus de la inmunodeficiencia, la combinacion de compuestos de acuerdo con la invencion hace posible la preservacion de la respuesta de linfocitos T CD4+ de Memoria Central durante la fase aguda de la infeccion, que es una correlacion valiosa con proteccion contra la patogenia del retrovirus, por ejemplo, contra el desarrollo del SIDA en un hospedador humano (Letvin, N.L. et al., 2006).
La capacidad de la combinacion de compuestos para producir herramientas para promover una respuesta inmune celular espedfica protectora en un hospedador humano, se obtiene de los resultados experimentales que se han obtenido en un modelo de primate no humano macaco/SIVmac en condiciones que se asemejan esencialmente a las observadas en la situacion humana/VIH-1.
Por consiguiente, la invencion se refiere al uso de una combinacion de compuestos para la preparacion de un producto medicinal para la administracion consecutiva a un hospedador mairnfero, para promover una respuesta inmune celular espedfica protectora contra un virus de la inmunodeficiencia, especialmente el VIH.
Los vectores lentivmcos particulares se han disenado de acuerdo con la presente invencion, para promover una respuesta inmune celular espedfica que se ha mostrado que es protectora en el contexto de una exposicion al virus. Aunque por razones obvias, esta demostracion todavfa no se ha llevado a cabo en el ser humano, los resultados descritos en el primate no humano son altamente favorables para una expectativa similar en seres humanos.
Los vectores lentivmcos particulares obtenidos proporcionan candidatos espedficos interesantes para la vacunacion terapeutica o para la vacunacion profilactica contra el SIDA.
En un aspecto particular de la divulgacion, los polinucleotidos que codifican los epftopos B y/o epftopos T que se originan de un organismo patogeno son polinucleotidos que codifican la E-glucoprotema (Ewnv) del Virus del Nilo Occidental (WNV) o la envoltura del Virus de la Fiebre Amarilla, o del virus del Dengue (DV), el virus de la encefalitis japonesa (JEV) o el coronavirus asociado con SARS. Otros polipeptidos vfticos interesantes son de la capsida del VIH.
En un aspecto particular, el al menos un polipeptido es codificado por un polinucleotido de origen lentivftico (por ejemplo, de gag como se ha descrito anteriormente o pol, o por ejemplo, del env). En una realizacion particular, dichos polinucleotidos de codificacion no son el gen gag o pol completo o no el gen env completo, o no son una version funcional de estos genes, es decir, un gen que codifica una protema funcional. Por ejemplo, tienen un tamano que vana de 30 a 1000, preferentemente de 30 a 500 pb, preferentemente de 30 a 300 pb, mas preferentemente de 30 a 100 pb o su forma soluble o epftopos de codificacion de la misma. La insercion de la secuencia de codificacion de la glucoprotema E soluble de w N v (sEwnv) puede lograrse siguiendo la descripcion de Reimann et al (J. Virol.; 2005), utilizando el sEwnv como se describe en Hel et al (J. Immunol.; 2006).
De acuerdo con otro aspecto particular de la divulgacion, el polinucleotido heterologo codifica un polipeptido que es un antigeno asociado con un tumor (TAA) o un fragmento del mismo.
Son ejemplos conocidos no limitantes del TAA especialmente:
- peptidos mutados encontrados en el melanoma tales como p-catetina, MART-2, o leucemia tal como brc-abl, - protemas espedficas del tejido tales como gp100, MART-1, tirosinasa, encontradas en el melanoma, o PSA, PAP, PSM, PSMA encontradas en el cancer de prostata,
- antigeno de cancer-testfculos tal como MAGE,
- Moleculas relacionadas con la tumorigenesis tales como Survivina, hTERT, encontradas en diversos canceres, - Mucinas como MUC-1 encontradas en el cancer de mama, ovarios o pancreas,
- protemas vfticas de virus que transforma una celula normal en una celula tumoral (virus tumoral) incluyendo los del VPH (Virus del Papiloma Humano), especialmente VPH16 o VPH 18, incluyendo el antigeno de VPH16-E7 (encontrados expresados en el cancer del cuello uterino), VEB (virus de Epstein-Barr) que ocasiona un linfoma que incluye la protema VEB-EBMA (en el linfoma), VHB (virus de Hepatitis B), VHC (virus de Hepatitis C), VHH (Virus de Herpes Humano) tal como VHH8 o HTLV (Virus de Leucemia T Humana) tales como HTLV-1, tal como la protema HTLV-1 tax (en Leucemia T Aguda).
Mas generalmente, estos polinucleotidos pueden proceder de las secuencias de peptidos descritas en la base de datos de peptidos titulada Inmunidad del Cancer. Los polinucleotidos pueden ser seleccionados especialmente entre los antfgenos espedficos del tumor compartidos, antfgenos de diferenciacion, antfgenos sobre-expresados en tumores o antfgenos de tumores resultantes de mutaciones. Estos polipeptidos (o parte de los mismos) se pueden originar de la celula (auto peptido) ya sea en una forma mutada o de tipo silvestre.
En una realizacion particular, el polinucleotido de interes codifica antfgenos humanos.
En otra realizacion de la divulgacion, el polinucleotido de interes puede codificar un polipeptido cuya expresion o expresion funcional pone esta danada en el hospedador afectado por la patologfa considerada. En una realizacion particular, los vectores lentivmcos de la invencion se utilizan para administrar el polinucleotido a celulas diana en el hospedador para buscar la correccion genetica en un tratamiento medicinal de terapia genetica, por ejemplo, enfermedades geneticas que son el resultado de las deficiencias de protema en el suero, o para estrategias de vacunacion genetica contra el cancer o enfermedades infecciosas, vmcas o autoinmunes. En otra realizacion, otras patologfas tales como la diabetes pueden tratarse con el equipo de compuestos de la invencion.
Finalmente dicho por lo menos un polipeptido puede ser un polipeptido artificial (no natural), preferentemente un polipeptido de epftopos multiples. Este polipeptido de epftopos multiples codifica por lo menos dos epftopos, originandose de un organismo patogeno, incluyendo virus y/u origen tumoral. En una realizacion particular, dichos al menos dos epftopos se originan del mismo virus o de la misma celula del tumor; en ese caso, dichos al menos dos epftopos pueden seleccionarse por su restriccion de CMH (HLA) diferente. En otra realizacion, dichos al menos dos epftopos se originan de virus diferentes, o de diferentes celulas de tumor. Dichos epftopos pueden disponerse consecutivamente, es decir, el extremo 3' del epftopo esta directamente unido al extremo 5' del segundo epftopo (y asf sucesivamente), correspondiendo a un polinucleotido que codifica una secuencia de peptidos exclusivamente compuesta de epftopos consecutivos. Los al menos dos epftopos de la invencion pueden separarse como alternativa por un separador de un aminoacido o un separador peptfdico, es decir, lo que significa que las unidades de polinucleotido diferentes estan separadas por uno o varios codones que codifican respectivamente uno o varios aminoacidos. Como separadores que mejoran el procesamiento de epftopos multiples, se prefieren peptidos de 4 aminoacidos compuestos de una arginina (R) en la posicion C terminal y restos hidrofflicos (A, K, D y/o T) en otras posiciones. Especialmente, se pueden utilizar peptidos de 4 aminoacidos que tienen un resto con carga positiva o un resto acido en la posicion C terminal, dependientemente o independientemente de los restos hidrofflicos (A, K, D y/o T) en otras posiciones. En una realizacion particular, dichos separadores son secuencias de procesamiento interno tales como secuencia de procesamiento del endosoma o lisosoma, haciendo posible el mejor procesamiento de los epftopos multiples y evitando el procesamiento de nuevos peptidos que resultan del corte solapante. Dicha separacion tiene como recurso un separador puede utilizarse para separar todos o parte de los epftopos.
El polinucleotido heterologo se inserta en el genoma del vector, bajo el control de secuencias reguladoras para la transcripcion y expresion, incluyendo un promotor y para posiblemente un potenciador. En una realizacion particular, las secuencias reguladoras no son de origen lentivftico. Dichos promotores comprenden el CMV, tambien denominado promotor CMVie, o promotor EF1a, promotor CGA, promotor CD11c y promotores de genes constitutivos tales como promotor PGK, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor de histona, promotor de alfa- tubulina, promotor de beta-tubulina, promotor de superoxido dismutasa 1 (SOD-1), promotor de dihidrofolato reductasa (DHFR), promotor de hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), promotor de adenosina desaminasa, promotor de timidilato sintetasa, promotor de dihidrofolato reductasa P1, promotor de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o promotor de nucleolina. Otros promotores adecuados abarcan los promotores de los siguientes genes: EF1a, PGK humano, PPI (preproinsulina), tiodextrina, cadena invariable DR de HLA (P33), cadena DR alfa de HLA, cadena de Ferretina L o cadena de Ferretina H, Beta 2 microglobulina, Quimosina beta 4, Quimosina beta 10 o Protema de Cistatina de Ribosoma L41.
El equipo de compuestos para su uso de acuerdo con la invencion es especialmente adecuado para utilizarse en un tratamiento medicinal, en donde dicho vector lentivmco pseudotipificado con dicha primera protema(s) de envoltura vmca se administra separado en el tiempo de dicho vector lentivmco pseudotipificado con dicha segunda protema(s) de envoltura vmca, y si es apropiado dicha sensibilizacion y primer refuerzo son seguidos por una o varias etapas de refuerzo, en un tiempo posterior.
Por consiguiente, el equipo de compuestos de la presente invencion es especialmente adecuado para la administracion repetitiva de los principios activos, especialmente en una reaccion del tipo de sensibilizacion-refuerzo, que abarca posiblemente varias etapas de refuerzo.
En particular, los compuestos del equipo son tales que dichos vectores lentivmcos pseudotipificados ya sea con la primera protema(s) de envoltura vmca o con dichas segundas protemas de envoltura vmca se utilizan respectivamente para la sensibilizacion de una reaccion inmunogenica o como alternativa para reforzar dicha reaccion inmunogenica en un hospedador que la necesita. La reaccion inmune puede reforzarse adicionalmente mediante el uso de un vector lentivmco que tiene una tercera protema(s) de envoltura como se describe en el presente documento, y opcionalmente etapas de refuerzo adicionales con protemas de envoltura adicionales que no se seroneutralizan con uno de los otros vectores lentivmcos.
En una realizacion particular, el vector lentivmco pseudotipificado con el VSV-G de la cepa de Indiana se administra primero, con el objeto de sensibilizar la reaccion inmunologica, y el vector lentivmco pseudotipificado con el VSV-G de la cepa de Nueva Jersey o con el VSV-G recombinante o modificado como se describe en el presente documento se administra en un segundo caso, para reforzar la reaccion inmunologica.
En otra realizacion particular, el vector lentivmco pseudotipificado con el VSV-G de la cepa de Nueva Jersey o con el VSV-G modificado o recombinante como se describe en el presente documento se administra primero, con el objeto de sensibilizar la reaccion inmunologica, y el vector lentivmco pseudotipificado con el VSV-G de la cepa de Indiana se administra en el segundo caso, para reforzar la reaccion inmunologica.
La invencion se relaciona especialmente con una realizacion correspondiente a un protocolo de administracion con un ciclo de administracion de ambos compuestos del equipo que puede ser suficiente para promover una respuesta fuerte.
Para mejorar posiblemente la intensidad o el espectro o la duracion de la respuesta, se pueden realizar etapas de administracion adicionales. En particular, se puede utilizar un vector lentivmco pseudotipificado con una envoltura seleccionada entre los virus VSV-G, Cocal, Perinet, SVCV o Isfahan o una envoltura recombinante que comprende un dominio de una de estas envolturas, como se describen en el presente documento.
El equipo de compuestos para su uso de acuerdo con la invencion es adecuado para utilizarse en el tratamiento profilactico o tratamiento terapeutico, incluyendo de curacion, contra una enfermedad vmca o contra una enfermedad infecciosa o tumoral, en donde dicho vector lentivmco comprende un polinucleotido que codifica uno o varios antfgenos vmcos o fragmentos de los mismos adecuados para promover una respuesta inmune.
Ademas de ser adecuados para preparar una combinacion de compuestos para el tratamiento terapeutico de hospedadores mairnferos infectados con un virus de la inmunodeficiencia, en particular un hospedador humano infectado con un VIH o un hospedador primate no humano infectado con un SIVmac o un animal infectado con el FIV, los vectores lentivmcos descritos en el presente documento tambien proporcionan herramientas para el diseno de una combinacion de compuestos para un uso profilactico contra la infeccion por un virus de la inmunodeficiencia, especialmente por un VIH en un hospedador humano o por un SIVmac en un hospedador primate no humano o por FIV en un animal.
La combinacion de compuestos descritos en el presente documento puede utilizarse especialmente para el tratamiento terapeutico de hospedadores humanos infectados con VIH-1 o VIH-2.
La combinacion de compuestos descritos en el presente documento puede utilizarse especialmente para el tratamiento profilactico de hospedadores humanos contra la infeccion por un VIH-1 o VIH-2.
Los datos proporcionados en la seccion experimental posteriormente en el presente documento proporcionan pruebas indudablemente fuertes de la relevancia del vector lentivmco disenado para la transposicion para aplicaciones medicinales en seres humanos. El nivel de proteccion logrado en el modelo de primate no humano ilustrado en los ejemplos es mas fuerte que los resultados senalados en la bibliograffa con otros candidatos de vacuna y es notable que se obtuvo en el contexto de la exposicion al virus con una dosis particular alta del virus SIVmac infeccioso.
A partir de los datos e xpe rim en ta l obtenidos, todav^a se observa que la combinacion de compuestos para la promocion de una respuesta immune celular espedfica protectora contra un virus de la inmunodeficiencia puede prepararse sin agregar un adyuvante de la respuesta immune.
La persona experta puede sin embargo decidir incluir en la combinacion de compuestos, en asociacion con todos o parte de los vectores lentivmcos y/o como un compuesto separado adicional, un agente inmunomodulador. Por ejemplo, una citocina tal como II12 puede incluirse en la combinacion.
La invencion proporciona especialmente una combinacion de compuestos para su uso en donde dichos vectores lentivmcos se formulan en composiciones adecuadas para la inyeccion a un hospedador, especialmente para la inyeccion subcutanea. En otra realizacion, la administracion de los compuestos de la invencion puede llevarse a cabo de manera provechosa por la via intramuscular, especialmente mediante inyeccion. Los inventores han mostrado, en un modelo de raton experimental, que la respuesta inmune promovida cuando los compuestos que incluyen las partfculas del vector de transferencia del gen que expresan un antigeno SIV GAG se administran a traves de la via intramuscular, es mas alta que cuando se administran en el mismo modelo, por medio de una inyeccion subcutanea.
La combinacion de compuestos es por lo tanto en particular para utilizarse en un regimen de administracion que comprende la inyeccion al hospedador y que comprende sensibilizar la respuesta inmune y posteriormente reforzar la respuesta inmune en un hospedador mamnfero, en donde dicho (i) vector lentivmco pseudotipificado con dicha primera protema(s) de envoltura vmca se administra separado en el tiempo de dicho (ii) vector lentivmco pseudotipificado con dicha segunda protema(s) de envoltura vmca, y si cualquier forma de dichos (iii) vectores lentivmcos pseudotipificados con dicha tercera protema(s) de envoltura vmca, administrandose cada uno de dichos vectores lentivmcos (i) y (ii) y si existe el (iii) ya sea para la sensibilizacion o para el refuerzo de la respuesta inmune.
La seleccion del regimen de administracion puede ser adaptada por el experto en la tecnica en vista de la intensidad y espectro de la respuesta obtenida con dosis seleccionadas utilizadas y el numero de etapas de refuerzo llevadas a cabo.
En una realizacion particular, la invencion se refiere a una combinacion de compuestos para administracion secuencial a un hospedador humano, para promover una respuesta inmune celular espedfica protectora contra un VIH y el regimen de administracion abarca la administracion de la misma dosis del vector lentivmco para las etapas de sensibilizacion y refuerzo.
La invencion tambien se refiere a una composicion inmunogenica que comprende una partfcula lentivmca definida en la presente descripcion, adecuada para la inhibicion in vivo de una infeccion de VIH-1 o VIH-2 o una infeccion de SIV o de FIV en un hospedador mairnfero.
La presente descripcion tambien describe un metodo para el tratamiento de un hospedador o paciente que lo necesita, que comprende la administracion sucesiva al hospedador de:
(i) un vector lentivmco, pseudotipificado con una primera protema de envoltura vmca heterologa determinada o protemas de envoltura vmca; seguido por,
(ii) un vector lentivmco, pseudotipificado con una segunda protema de envoltura vmca heterologa determinada o protemas de envoltura vmca diferentes de dicha primera protema de envoltura determinada o protemas de envoltura;
en donde dicho vector lentivmco de (i) a (ii) codifica un polinucleotido heterologo que tiene un interes terapeutico.
En una realizacion particular, se lleva a cabo una tercera etapa de administracion al hospedador de un vector lentivmco pseudotipificado con una tercera protema(s) de envoltura como se describe en el presente documento.
De acuerdo con una realizacion particular de la invencion, se realizan etapas de administracion adicional con el objeto de reforzar mas la reaccion inmune.
El tiempo que se deja entre las dos primeras etapas de administracion puede estar en el intervalo de 3 a 12 semanas o mas dependiendo de la respuesta a la sensibilizacion. El tiempo que se deja entre el primer refuerzo y la ultima etapa de refuerzo puede estar en el intervalo de varias semanas, especialmente mas de 12 semanas, por ejemplo, 6 meses, e incluso puede ser de uno o incluso varios anos.
De acuerdo con otra realizacion, los vectores de transferencia del gen de la invencion pueden utilizarse como un unico principio activo, por ejemplo, para una unica administracion a un hospedador.
Por consiguiente, la descripcion de las realizaciones de la invencion, de las caractensticas de los vectores de transferencia del gen o de sus propiedades, se aplica para los vectores cuando se utilizan como un compuesto unico administrado (en contraste con una combinacion), especialmente en su version no integradora.
Un tratamiento o tratamiento medicinal de acuerdo con la invencion tiene por objeto mejorar la condicion clmica de un paciente, especialmente un ser humano, que lo necesita, que se ha diagnosticado como infectado (aun en una etapa de primo-infeccion) por un patogeno o que padece una condicion patologica, o este tratamiento tiene por objeto la eliminacion del agente causante u organismo de la enfermedad, o la disminucion de dicho agente u organismo. En una situacion de infeccion vmca, el tratamiento puede dar como resultado una disminucion significativa de la carga vmca en el plasma del hospedador y posiblemente una carga vmca en el plasma que es menor que lo que puede detectarse cuando se mide o, reducir el tamano o el desarrollo de un tumor si es que lo hay.
El tratamiento medicinal incluye, cuando se hace referencia a un paciente diagnosticado con una condicion patologica, mejorar la condicion clmica de dicho paciente y, en una realizacion preferida, restaurar la salud.
Tambien abarca un tratamiento profilactico de un hospedador que lo necesita, especialmente la vacunacion para evitar la aparicion de la condicion patologica en un hospedador.
Los resultados experimentales obtenidos por los inventores, hacen posible que se definan los usos espedficos para la combinacion de compuestos, equipos, metodos y aplicaciones generalmente terapeuticas o profilacticas descritas en la presente descripcion, especialmente en el campo de las aplicaciones medicas relacionadas con el virus de la inmunodeficiencia, especialmente el VIH y en particular el VIH-1 o VIH-2.
Estos usos espedficos de acuerdo con la invencion incluyen, independientemente entre ellos, o en combinacion, las siguientes indicaciones, posiblemente asociadas con las diferentes etapas de la infeccion por un virus de la inmunodeficiencia, especialmente por el VIH o antes de dicha infeccion o antes de la exposicion al retrovirus:
- el control de la viremia despues de la exposicion a y especialmente despues de la infeccion por el retrovirus, y en particular limitar o reducir la carga vmca en el hospedador;
- la induccion de inmunidad celular protectora contra el retrovirus en un hospedador; especialmente contra el VIH en un hospedador humano;
- la proteccion contra la replicacion vmca despues de la exposicion a o infeccion por el retrovirus, especialmente el retrovirus VIH;
- la proteccion contra el agotamiento de la respuesta de los linfocitos T CD4+ de Memoria Central, especialmente en la fase aguda de infeccion por el retrovirus, especialmente VIH;
- la conservacion de la respuesta de linfocitos T CD4+ de Memoria Central, especialmente en la fase cronica de infeccion por el retrovirus, especialmente VIH;
- la promocion de un rebote temprano y/o mas alto de la respuesta de linfocitos T CD8+ de Memoria Central y no expuestos previamente durante la infeccion primaria por el retrovirus, especialmente el VIH;
- la prevencion contra el escape vmco de la presion inmune permitiendo de esta manera el control a largo plazo de la infeccion por un retrovirus, especialmente el VIH.
Estos usos espedficos son beneficiosos para el desarrollo de una respuesta inmune eficiente en una aplicacion profilactica o terapeutica, en el campo de la infeccion por un virus de la inmunodeficiencia. Tambien permiten la direccion de aplicaciones de la invencion a diversas categonas de hospedadores, dependiendo de su perfil clmico, en relacion con el estadio de la infeccion por el retrovirus (incluyendo antes de la infeccion o la exposicion al retrovirus) o patogenia, debido a que influyen en diversos compartimentos del sistema inmune, que estan involucrados en diferentes estadios de la respuesta inmune dependiendo del estadio de la infeccion.
Aunque no parece ser necesario en el caso de la administracion de vectores lentivmcos que expresan los antfgenos de SIV o VIH, se puede decidir, en otras aplicaciones incluir ademas en la combinacion de compuestos, adyuvante y/o vehnculo cuando se utiliza para la administracion sistemica o local, o pueden estar desprovistos de dichos componentes.
En cualquier caso pueden agregarse excipientes adecuados para la formulacion de las composiciones medicinales.
Las composiciones citadas anteriormente pueden inyectarse en un hospedador por medio de diferentes vfas: inyeccion subcutanea (s.c.), intradermica (i.d.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), administracion oral y administracion a la mucosa, especialmente administracion intranasal o inhalacion. La cantidad que se va a administrar (dosificacion) depende del sujeto que va a ser tratado, incluyendo la consideracion de la condicion del paciente, el estado del sistema inmune individual, la via de administracion y el tamano del hospedador. Los intervalos de dosificacion adecuados se expresan con respecto al contenido en el antfgeno p24 equivalente de partfculas del vector (para vectores lentivmcos de VIH-1) y pueden determinarse.
Cuando se utiliza para una sola administracion, el vector para su uso de acuerdo con la invencion puede administrarse en dosificaciones que vanan de 1 a 100 |jg, preferentemente de 1 a 50 |jg y mas preferentemente de 1 a 10 |jg, y pueden ser modificadas por un experto en la tecnica, dependiendo de las circunstancias. Cuando se formulan para la inyeccion subcutanea, la composicion inmunogenica de la invencion comprende preferentemente entre 1 y 100 jig del vector lentivmco por peso corporal del hospedador, y mas preferentemente de 1 a 30 jg/dosis, especialmente alrededor de 10 jg/dosis, en una sola inyeccion.
Otros ejemplos y caractensticas de la invencion resultaran evidentes en los ejemplos y las figuras.
Figura 1: Diversos ejemplos de secuencias de alas de ADN procedentes de diferentes virus.
Figura 2: (A) Una organizacion de construccion del genoma del vector para el fin de la invencion, basada en una secuencia del genoma tipico de VIH-1; (B) La representacion esquematica del vector TRIP/sEwnv; (C) Representacion esquematica del vector TRIP/Es(WNV); (D) Representacion esquematica del plasmido pTRIPAU3.CMV-GFp; (E) Representacion esquematica del plasmido pTRIP[deltaJU3EF1[alfa]-GFP.
Se usan las siguientes abreviaturas: U3, R y U5 representan los dominios del LTR; AU3: eliminacion del dominio U3; RRE: elemento de respuesta a Rev; ^: senal de encapsidacion; cPPT y CTS representan el ala de ADN; CMVie: representa el promotor temprano inmediato del citomegalovirus.
Estan disponibles detalles sobre la construccion y especialmente sobre el ala de ADN y su insercion en un genoma basado en VIH-1 en (Zennou et al., 2000).
Figura 3: (A) Alineacion de las secuencias de protema VSV-G de diferentes serotipos conocidos en el genero Vesiculovirus para las especies VSV: Indiana (NCBI Numero de Referencia J02428), Chandipura (J04350), Piry (D26175), Nueva Jersey, Cocal /AF045556), Isfahan (AJ810084) y la viremia primaveral de virus de carpa (SVCV) (AY527273). La protema de Indiana y la protema de Nueva Jersey son las utilizadas en los ejemplos. (B) Secuencias de protemas VSV-G de diferentes serotipos conocidos en el genero Vesiculovirus para las especies VSV: Indiana, Chandipura, Piry, Nueva Jersey, Cocal, Isfahan y viremia primaveral del virus de carpa (SVCV). Figura 4: Secuencia de Nucleotidos del vector TRIPsEwnv. La region cPPT/CTS esta subrayada. En esta region, los dominios cPPT y CTS aparecen en minuscula. La secuencia sEwnv, representada en negritas, es un inserto de ADN de BsiWi-BssHIl. Este vector se ha depositado en el CNCM (Paris, Francia), bajo el numero I-3076, el 27 de agosto de 2003.
Figura 5: Secuencia de nucleotidos del vector TRIP GFP. La region cPPT/CTS esta subrayada. En esta region, los dominios cPPT y CTS aparecen en minuscula. La secuencia GFP esta localizada entre los nucleotidos 2816 a 3573. Este vector se ha depositado en la CNCM, bajo el numero I-2330, el 11 de octubre de 1999 (pTRIP [deltaU3] CMV GFP).
Figuras de la 6 a la 12: secuencia de la protema VSV-G (con el dominio transmembrana subrayado) (A) y el acido nucleico con codones optimizados codificante (B) para diversas cepas del VSV. Se describe un plasmido de envoltura que comprende cada secuencia con codones optimizados (C). El plasmido procede del plasmido pThV y comprende
- Un promotor CMV que puede ser substituido por otro promotor;
- Un polinucleotido con codones optimizados que codifica el VSV-G;
- Una secuencia WPRE (AATG) que es opcional;
- Una secuencia poliA
- Un kanR (gen de resistencia a la kanamicina) que puede substituirse o eliminarse
- Un origen de replicacion (pUC ORI)
La envoltura VSV-G representada es respectivamente:
Figura 6: VSV-G de Indiana. Esta envoltura se ha insertado en el plasmido pThV-VSV-G (IND-CO) depositada bajo el numero I-3842.
Figura 7: VSV-G de Nueva Jersey. Esta envoltura se ha insertado en el plasmido pThV-VSV-G (NJ-CO) depositada bajo el numero I-3843. Los plasmidos depositados estan en celulas de E. coli.
Su medio de cultivo adecuado es la Kanamicina LB 10 pg/ml y la temperatura de incubacion es de 37 °C. Para el almacenamiento pueden suspenderse en un lfquido con LB al 50 % y glicerol al 50 %.
Figura 8: Chandipura VSV-G
Figura 9: Cocal VSV-G
Figura 10: Piry VSV-G
Figura 11: Isfahan VSV-G
Figura 12: SVCV VSV-G
Figura 13: representa un gen de fusion entre los genes VSV-G de Nueva Jersey y VSV-G de Indiana. El dominio transmembrana se encuentra en negritas y esta subrayado. Se describe la estrategia de PCR para la preparacion del gen de fusion. Los oligonucleotidos utilizados como cebadores tambien se describen.
Las Figuras de la 14 a la 19 describen las protemas de fusion obtenidas recombinando diferentes dominios de diversas protemas VSV-G. Para cada protema, se proporciona el acido nucleico con codones optimizados (para la expresion en las celulas humanas) (A), junto con un plasmido (B) que comprende dicho acido nucleico.
Figura 14: protema de fusion de VSV-G Chandipura/lndiana.
Figura 15: protema de fusion de VSV-G Cocal/lndiana.
Figura 16: protema de fusion de VSV-G Piry/lndiana.
Figura 17: protema de fusion de VSV-G Isfahan/lndiana.
Figura 18: protema de fusion de VSV-G SVCV/Indiana.
Figura 19: protema de fusion de VSV-G Nueva Jersey/lndiana.
Figura 20: muestra el efecto de la optimizacion de codones en los vectores lentivmcos pseudotipificados con la glucoprotema de VSV-G de Nueva Jersey. La optimizacion de codones humanos del gen de VSV-G (serotipo NJ) estimula la transferencia del gen en un factor 100 x.
Figura 21: ilustra secuencias de antigenos de interes para la invencion. Los acidos nucleicos que codifican estos antigenos, especialmente en una version con codones optimizados para las celulas humanas pueden insertarse en el polinucleotido heterologo del genoma del vector. Los antigenos ilustrados son:
Un antigeno GAG natural del aislado LAI de VIH-1 (subtipo B) (D) y la secuencia de acido nucleico correspondiente (E);
un antfgeno GAG de VIH-1 modificado, que es un antfgeno Myr-GAG delta que prohnbe la miristilacion y procedente de la secuencia de consenso del subtipo B (A);
un antfgeno procedente del POL de VIH-1, que es un fragmento de la poliprotema POL (B);
un antfgeno procedente de la NEF de VIH-1, que es un fragmento de la protema NEF (C).
Estos antfgenos pueden utilizarse en combinacion en una protema de fusion. Los fragmentos POL y/o NEF pueden insertarse 5' o 3' del antfgeno procedente de GAG.
Pueden ser contiguos entre ellos e insertarse en posiciones 5' o 3' del antfgeno procedente de GAG.
Pueden estar separados e insertados, uno en posicion 5' y otro en posicion 3' del antfgeno procedente de GAG. Los antfgenos procedentes de POL, NEF y GAG pueden estar separados o no por un peptido, especialmente uno que hace posible la autoescision. Un peptido de separacion adecuado es un peptido 2A proveniente de picornavirus que tiene la secuencia: APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP.
La Figura 22 ilustra diversas construcciones de antfgeno de acuerdo con la figura 21, para el diseno del antfgeno del VIH-1 humano para la vacunacion contra el SIDA.
Figuras de la 23 a la 27: Principio de la generacion y aplicacion de Vectores Lentivmicos TRIP para la preparacion de las partmulas del vector Lentivmico que expresan un antfgeno procedente de la poliprotema SIVmac239 GAG. El mismo principio se aplicana para otros antfgenos. Las figuras describen especialmente las siguientes caractensticas:
Figura 23: Principio de la generacion de los Vectores Lentivmcos TRIP.
El genoma del VIH-1 (A) se divide entre un plasmido de vector (B), que contiene las secuencias de accion en cis (LTR, senal de encapsidacion, RRE, Ala de ADN) y el gen de interes (antfgeno para la vacunacion) bajo el control de un promotor heterologo (CMV) u otro promotor, un plasmido de empaquetamiento (C) que contiene los genes gag, pol, tat y rev, necesarios para la encapsidacion (durante la produccion de la partmuia de vector) y para la etapa temprana del ciclo de replicacion vmca (en celulas transducidas), y un plasmido de envoltura (D), que contiene un serotipo Indiana de la glucoprotema G del VSV. El plasmido de empaquetamiento y el plasmido de la envoltura tienen elementos de regulacion de transcripcion heterologos del CMV y se eliminan en la secuencia de encapsidacion, en cPPT, y CTS.
Figura 24: Principio del Vector Lentivmico con el U3' eliminado.
Durante la transcripcion inversa de un ARN vmco monocatenario, existe una duplicacion de las secuencias U3' y U5' que permite entonces la formacion de los 5'LTR y 3'LTR en el ADN vmco bicatenario. La transcripcion del ADN vmico comienza en la celula del LTR 5'. Si la region U3' se elimina en el plasmido del vector (AU3), el ARN vmco es tambien AU3, consecuentemente, despues de la transcripcion inversa, el ADN vmco pierde la secuencia U3 en el 5'LTR, y no puede comenzar la transcripcion desde el promotor de LTR vmco. Como consecuencia, la transcripcion esta mediada solamente por medio del promotor interno del transgen.
Figura 25: Representacion esquematica de los 2 plasmidos del vector utilizados para la produccion de vectores TRIP.
A: TRIP-SIVmac239 Gag. Este plasmido del vector contiene la secuencia que codifica el antfgeno, gag de SIVmac239, eliminado en la secuencia de miristilacion. Esto permite trabajar solamente en el L1, el nivel de bioseguridad P1 debido a que anula la secrecion de protema en las celulas transfectadas y las celulas transducidas.
B: TRIP-GFP. Este plasmido del vector contiene la protema fluorescente verde del antfgeno irrelevante (GFP). Ambos plasmidos del vector contienen cadena arriba el promotor de CMV para la expresion del antfgeno y cadena abajo la secuencia WPRE para mejorar la expresion del antfgeno. Tambien contienen las secuencias vmcas necesarias para la formacion de las partmulas del vector y las primeras etapas de la replicacion vmca en las celulas transducidas: Repeticion Terminal Larga (LTR), Ala de ADN (cPPt, CTS), RRE, senal de encapsidacion ^.
C. Mapa de restriccion del pTRIP DeltaU3-CMV-SIVGag- WPRE del genoma del vector (C1) y su secuencia de acido nucleico (C2). La construccion del vector se ha depositado en el CNCM bajo el numero I-3840.
D. Mapa de restriccion del pTRIP DeltaU3-CMV-SIVGag co-WPRE del genoma del vector (D1) y su secuencia de acido nucleico (D2). La construccion del vector se ha depositado en el CNCM bajo el numero 1-3841;
Los plasmidos de los depositos se introducen en celulas de E. coli. El medio de cultivo de la celula es LB Ampi 100 |jg/ml y la incubacion es a 37 °C. El almacenamiento es en un lfquido de suspension con LB al 50 % y glicerol al 50 %.
Figura 26: Es una representacion esquematica de la protema SIVmac239 GAG dividida en peptidos de 15 unidades de longitud.
La protema SIV mac239 GAG es de un largo de 511 Aminoacidos de longitud. Esta protema se dividio en 125 peptidos. Estos Peptidos son de 15 aminoacidos de longitud; y existe un solapamiento de 11 aminoacidos entre peptidos consecutivos.
Los peptidos se distribuyen en 11 conjuntos denominados de la letra M a la W que contienen de 5 a 12 peptidos.
Figura 27: (A) Secuencias de cebadores y sondas y programa qPCR utilizados para la titulacion del vector; (B) Esquema de plasmido de estandarizacion utilizado para construir una curva patron en la titulacion del vector Q-PCR con la localizacion de sondas y sitios de hibridacion de cebadores.
Figura 28(1): Una estrategia de vacunacion de sensibilizacion/refuerzo basada en el vector lentivmco induce una inmunidad celular robusta.
El seguimiento longitudinal de las respuestas de los linfocitos T espedficos de SIVmac239 GAG se realizo en diversos puntos temporales despues de la sensibilizacion, despues del refuerzo y despues de la exposicion mediante un ensayo ELISPOT de IFN-y despues de la re-estimulacion de PBMC completas con conjuntos de peptidos solapantes que comprenden el p55 del SIVmac239 GAG. Las respuestas individuales acumulativas espedficas de GAG de los 6 animales vacunados inyectados con TRIP-SIVmac239 GAG (dosis baja: 20022, 20089; dosis mediana: 20293, 20256; dosis alta: 20195 y 20158, Figura 28a), se muestran 2 animales de control inmunizados con un antfgeno irrelevante (TRIP-GFP) a una dosis alta de p24 (21544 y 20456, Figura 28b) y animales sin vacunar (15661, 14184, 15885 y 14468, Figura 28c).
Brevemente, se estimularon de nuevo 0,2x106 PBMC por pocillo in vitro durante 40 horas con 11 grupos de 5 a 12 peptidos de 15 unidades solapantes (2 pg/ml de cada peptido). El numero medio de celulas formadoras de manchas IPN-y (SFC) por millon de PBMC se calculo a partir de los pocillos triplicados despues de restar uno de los pocillos de control (sin peptidos). Las respuestas acumulativas mostradas corresponden a la suma del SFC de IPN-Y/millon de PBMC obtenida con cada grupo de peptidos. El sfmbolo indica una subestimacion de la respuesta acumulativa debida a los pocillos ELISPOT saturados para a menos un grupo de peptidos (vease Figura 29(2)). Dos semanas despues de la exposicion, no fue posible cuantificar el numero de manchas en los pocillos de control y por lo tanto calcular la respuesta acumulativa para el animal 20022 (marcado con +) (nd, no determinado). Figura 28(2): La inyeccion subcutanea del vector lentivmco no dio como resultado inflamacion sistemica.
La presencia del FN-a (PBL Biomedical Laboratories) (Figura 28(2)a). IL-6 (U-Cytech Bioscience) (Figura 28(2)b) y TNF-a (U-Cytech Bioscience) (Figura 28(2)c) en el plasma poco tiempo despues de la inyeccion subcutanea se midio mediante ELISA. La ausencia de aumento significativo (IFN-ay TNF-a) o importante (IL-6) en su nivel sugirio que no existfa inflamacion sistemica inducida por la administracion in vivo de las partmulas del vector lentivmco, incluso a dosis alta (2,5x108 TU/animal). Estos datos no excluyeron una inflamacion local probablemente desencadenada por el PAMP intrmseco (Brown B, D et al., 2007; Pichlmair A et al., 2007; Georgel P. et al., 2007). Figura 29(1): Los macacos vacunados tienen un control mejorado de la viremia comparado con los animales de control y sin vacunar.
Las cargas vmcas en el plasma se siguieron durante 5 meses despues de la exposicion, dos veces a la semana durante las primeras 3 semanas, luego una vez a la semana durante las 3 siguientes semanas y finalmente una vez al mes. Se muestran la viremia de los animales sin vacunar (Figura 29a lmeas 15661; 14184; 15885; 14468 marcadas con □; 0; A; V ), de control (Figura 29a 21544 con x) y animales vacunados (Figura 29b), asf como la media para el grupo sin exposicion previa y de control (en negro) frente al grupo vacunado (en gris) (Figuras 29a, 29b y 29c). La media de los niveles de replicacion vmca fue mas bajo en el grupo vacunado en todos los puntos temporales probados (Figura 29c). Los valores de P <0,05 se indican con *. Se observo un promedio de reduccion de 10 veces 2 log de la viremia en el pico de la primo-infeccion (Figura 29e). La viremia media de los animales vacunados (en gris), tambien se comparo con la viremia media de los animales en progreso (14184-21544-20456) en color naranja y con la viremia media de los animales que no estan en progreso (15661-15885-14468) en azul claro (Figura 29d). La viremia post-aguda fue menor en los animales vacunados en comparacion con los animales en progreso. Los valores de P. <0,05 se indican con *. Una medida de la replicacion vmca durante los primeros 154 dfas despues de la infeccion se determino integrando las cargas vmcas entre el dfa 0 y el dfa 154 (area bajo de la curva, ABC) para comparar los animales vacunados con los de control sin exposicion previa (Figura 29f). Brevemente, se aislo ARN vmco del plasma (200 pl) con un Reactivo TRI BD (Molecular Research Center). El numero de copias de ARN se determino en una RT-PCR cuantitativa una etapa utilizando la EZ RT-PCR Taqman (Applied Biosystem) y el Mastercycler® ep realplex (Eppendorf). Los cebadores estaban respectivamente en la posicion 389 y 456 del genoma del ARNm de SIVmac251 g Ag (directo, TGTCCACCTGCCATTAAGCCCGA; inverso GCAGAGGAGGAAATTACCCAGTAC). El metodo de cuantificacion de Taqman® se selecciono con una sonda interna que contema los fluoroforos Fam y Tamra respectivamente en posiciones 5' y 3' (TGTCCACCTGCCATTAAGCCCGA). La cantidad de las copias de ARN vmco se evaluo mediante extrapolacion de los valores del umbral de fluorescencia en una curva patron interna preparada a partir de las diluciones en serie en dH20 del ARN obtenido por la transcripcion in vitro con el equipo MAXIscript® (Ambion) de un plasmido pGEM-5Zf(+) GAG linealizado con Spel. El umbral de deteccion fue de 375 copias de ARN/ml (2,57 copias de ARN Iog10/ml).
Figura 29(2): Saturacion del ensayo ELISPOT.
Se realizo un ensayo ELISPOT de IFN-y utilizando diluciones en serie de PBMC para determinar la curva de saturacion del lector de ELISPOT (280 manchas/pocillo correspondientes a 1400 manchas/millon de PBMC ya que se utilizan 200.000 celulas) Figura 29(2)a). Cuando la frecuencia de los linfocitos T espedficos era alta y las manchas se solapaban (adquisicion), el numero de SFC de IPN-Y/millon por lo tanto se subestimo a 1400 antes de restar el fondo (analisis). Se proporciona el ejemplo de PBMC del animal 20056 nuevamente estimulado con los conjuntos de peptidos que abarcan los SIVmac339 GAG: 385-443 y el SIVmac339 GAG: 443-491, 2 semanas despues de la exposicion (Figura 29(2)b).
Figura 30(1): El compartimento de linfocitos T CD4+ de memoria central esta bien conservado en los macacos vacunados.
Los cambios en los numeros de los linfocitos T CD4+ de memoria central (CM) en la sangre periferica, un indicador fuerte de la evolucion, se siguieron durante 5 meses despues de la exposicion. La dinamica de otros compartimentos celulares (linfocitos T CD4+ totales, CD4+ vftgenes, CD8 totales, CD8+ vftgenes, CM CD8+, y CD8+ efectores de memoria (EM)) estan disponibles en la Figura 32(2).
Se muestran el % de la medida basal de linfocitos T CD4+ CM de los animales sin exposicion previa (Figura 30a 15661-14184-15885-14468), de control (Figura 30a 21544-20456 marcado con o o x ) y vacunados (Figura 30b todas las lmeas menos la que tiene la marca ♦), asf como la media para el grupo sin exposicion previa y de control (marcado con ▲ en negro) frente al grupo vacunado (marcado con ♦ en gris) (Figuras 30a, 30b y 30c). Los animales vacunados mostraron una conservacion completa de su compartimento de linfocitos T CD4+ de CM durante la primo-infeccion y sin agotamiento gradual en la fase cronica en contraste con los animales sin exposicion previa y de control (Figura 30c), y animales en progreso (14184-21544-20456) con ▲ (Figura 30d) (valores de p. <0,05 estan marcados con un *). Los linfocitos T CD4+ CM de todos los animales se comparan en el pico de la primoinfeccion (Figura 30e).
Se describieron con anterioridad (Karlsson I et al., 2007) las cuantificaciones de recuentos absolutos de linfocitos, proporciones de linfocitos T CD3+CD4+ y de linfocitos T sin exposicion previa, EM y CM (definidos como celulas CD28*CD95-, CD28+CD95+ y CD28'CD95+).
Figura 30(2): Las respuestas de los linfocitos T inducidas por la vacuna fueron amplias y reconocieron anftgenos procedentes del SIV con AT2 desactivado.
La diversidad y la contribucion relativa de las protemas codificadas por GAG (matriz MA, capsida CA, nucleocapsida NC y p6) para las respuestas de linfocitos T espedficos de GAG inducidas por la vacuna, inducidas por el virus e invocadas por el virus en los se estudiaron mediante el ensayo ELISPOT de IPN-y en el pico de las respuestas primarias (2 semanas despues de la sensibilizacion, Figura 30(2)a), una semana despues del refuerzo (Figura 30(2)b) y durante la fase aguda de infeccion (3 semanas despues de la exposicion, Figura 30(2)c). Tambien se utilizo SIVmac251 con AT-2 desactivado (5 pg/ml de protemas vfticas totales) para volver a estimular los linfocitos T CD4+ y CD8+ espedficos de GAG dos semanas despues del refuerzo en un ensayo ELISPOT de IPN-Y PBMC completas (Figura 30(2)d). Se resto el fondo despues del cocultivo con las microvesmulas de control. Las respuestas saturadas se indicaron con . La protema SIVmac251 con AT-2 desactivado y sus microvesmulas de control se obtuvieron de JD Lifson (Frederick, MA) a traves de la Instalacion Centralizada EVA del Programa de la UE para los Reactivos del SIDA (NIBSC, Potters Bar, Reino Unido).
Figura 31(1): Indicadores de proteccion inmune
El control de las cargas vmcas en el plasma en el pico de la primo-infeccion se ensayaron para determinar su correlacion (clasificacion de Spearman) con las respuestas de linfocitos T espedficos de GAG. Una alta frecuencia de linfocitos T secretores de IPN-y despues de la primera inyeccion (Figura 31a), la inyeccion de refuerzo (Figura 31 b) y despues de la exposicion (Figura 31c) correlacionada con un mejor control de la viremia en el pico de la primo-infeccion. Las significaciones de las correlaciones es subestiman debido a la saturacion ocasional de los pocillos de ELISPOT. La conservacion de los linfocitos T CD4+ de memoria central (CM) durante la fase aguda tambien se correlacionaron de manera fuerte con la reeducacion de las cargas vmcas en el pico de la primoinfeccion (Figura 31d).
Figura 31(2): Los animales inyectados desarrollan respuestas humorales hacia la glucoprotema G del VSV utilizadas para pseudotipificar las partmulas del vector
La presencia del anticuerpo de neutralizacion contra la envoltura utilizada para la pseudotipificacion se midio con un ensayo de transduccion in vitro. Las celulas P4 (procedentes de HeLa) se cultivaron en presencia de vectores lentivfticos que codifican el GFP pseudotipificado con VSV-G Indiana (Figura 31(2)a) o VSV-G Nueva Jersey (Figura 31(2)b) previamente incubados con plasma diluido en una proporcion de 1:20 de animales inmunizados recogido en diferentes puntos temporales. La eficacia de transduccion se evaluo mediante citometna de flujo. En ausencia de plasma y a la dosis del vector utilizada, el 61 % y 23 % de las celulas P4 fueron GFP+ despues de la transduccion con los vectores lentivmcos que codifican GFP pseudotipificados con VSV-G de Indiana y de Nueva Jersey, respectivamente.
Figura 32: Las dinamicas de los linfocitos T CD4+ y CD8+ totales, vftgenes y de memoria en las vacunas difieren de las de los macacos de control y sin vacunar despues de la infeccion
Se siguieron los porcentajes de la medida basal total de linfocitos T CD4+ (Figura 32a), linfocitos T CD4+ vftgenes (Figura 32b), linfocitos T CD8+ (Figura 32c), linfocitos T CD8+ vftgenes (Figura 32d), linfocitos T CD8+ de memoria central (CM) (Figura 32e) y linfocitos T CD8+ de memoria efectora (EM) (Figura 32f). Se muestran la media para el grupo sin exposicion previa y de control (triangulo negro) frente al grupo vacunado (rombo gris). Los valores de P. <0,05 estan marcados con un *.
Figura 33: La optimizacion de codones mejora de manera crftica la respuesta de CTL inducida por las vacunas basadas en TRIP.NI LV. Las repuestas inmunes celulares espedficas de gag contra el epftopo de los linfocitos T CD8+ de GAG inmunodominante se evaluaron mediante la tincion del tetramero (A ) o ELISPOT de IFN-y (B). SFC, celulas formadoras de manchas. (C) ensayos ELISPOT de IFN-y en respuesta al epftopo inmunodominante de los linfocitos T CD8+ y el epftopo de los linfocitos T CD4+ del gag. Los ratones se sensibilizaron mediante i.p. con 100 ng de TRIP.NI gagAmyr LV o TRIP.NI gagAmyr CO LV. 10 dfas despues, se estimularon los esplenocitos de los ratones inmunizados con los peptidos correspondientes y se analizaron mediante el ensayo ELISPOT. Las frecuencias de fondo se restaron antes de hacer la grafica. Las barras de error representan la DT para 3 ratones por grupo. (D) Comparacion de las actividades lfticas espedficas de gag inducidas por TRIP.NI gagAmyr LV frente a la inmunizacion de TRIP.NI gagAmyr CO LV. La actividad CTL se midio 10 d^as despues de la inmunizacion utilizando un ensayo de 20 horas de CTL in vivo como se describe en Materiales y Metodos. Se muestran la media /- DT de tres ratones.
Figura 34: Una sola inmunizacion con pardculas TRIP.NI GAGAmyr CO induce respuestas inmunes celulares duraderas y fuertes. El ensayo ELISPOT en los esplenocitos (A) o las celulas de medula osea (B) de los ratones inmunizados o no con partmulas TRIP.NI GAGAmyr CO o TRIP.I GAGAmyr de tipo natural a las 8 semanas despues de la inyeccion.
Figura 35: Los ratones se inmunizaron con partmulas TRIP.NI GAGAmyr CO o TRIP.I GAG de tipo silvestre pseudotipificadas con VSV-G de Indiana y 13 semanas despues se reforzaron con partfculas TRIP.NI GAGAmyr CO o TRIP.I GAG de tipo silvestre respectivamente, pseudotipificadas con VSV-G de Nueva Jersey. Los grupos de control para el protocolo de sensibilizacion-refuerzo incluye los ratones inyectados solamente una vez con las partfculas TRIP pseudotipificadas con VSV-G de Indiana (diagramas grises) o partfculas TRIP pseudotipificadas con VSV-G de Nueva Jersey (diagramas azules). Todos los ratones se sacrificaron a los 10 dfas despues de la inmunizacion, y la respuesta inmune celular contra el GAG se evaluo mediante ELISPOT de IFN-y (A) o la tincion del tetramero (B).
Figura 36: Vacunacion de los ratones con un vector lentivftico que codifica el SIVmac239 GAGAmyr WPRE. Los grupos de 2 a 5 ratones 129 se vacunaron una vez con 1 ,l0e7 TU por raton. 10 dfas despues de una sola administracion, las respuestas inmunes espedficas se analizaron mediante un ensayo de citotoxicidad in vivo utilizando esplenocitos congenitos sin exposicion previa tenidos con CFSE y promovidos con peptidos de 15 unidades (SIVmac239 Gag(73-87) y SIVmac239 Gag(309-323) que contienen un epftopo CTL subdominante o inmunodominante) como celulas objetivo, i.d., intradermica; i.p., intraperitoneal; s.c., subcutanea.
Figura 37: Vacunacion de los ratones con un vector lentivmco que codifica el SIVmac239 GagAMyr WPRE. Los grupos de 2 a 3 ratones 129 se vacunaron una vez con 300 ng de p24 por raton. Diez dfas despues de una sola administracion, se analizaron las respuestas inmunes espedficas mediante un ensayo de citotoxicidad in vivo utilizando esplenocitos sin exposicion previa congenicos tenidos con CFSE y promovidos con peptidos de 15 unidades (SIVmac239 Gag(73-87) y SIVmac239 Gag(309-323) que contienen un epftopo CTL subdominante o inmunodominante) como celulas objetivo. t.c.i., transcutanea, i.d., intradermica; i.p., intraperitoneal.
Figura 38: Vacunacion de ratones con un vector lentivftico que codifica el SIVmac239 GagAMyr WPRE. Los grupos de 5 a 6 ratones C57BL/6j se vacunaron una vez con 1.10e7 TU por raton. Diez dfas despues de una sola administracion, las respuestas inmunes espedficas se analizaron mediante un ensayo de citotoxicidad in vivo utilizando esplenocitos sin exposicion previa congenicos tenidos con CFSE y promovidos con peptidos de 15 unidades (SIVmac239 Gag(73-87) y SIVmac239 Gag(309-323) que contienen un epftopo CTL subdominante o inmunodominante) como celulas objetivo, i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; s.c., subcutanea.
Figura 39: Vacunacion de ratones con un virus lentivftico que codifica el SIVmac239 GagAMyr WPRE. Los grupos de 6 ratones C57BI/6j se vacunaron una vez con 2.10e6 TU por raton. Doce dfas despues de una sola administracion, las respuestas inmunes espedficas se analizaron mediante un ensayo ELISPOT de INFgamma que estimula las celulas con peptidos de 15 unidades (SIVmac239 GAG(73-87) y SIVmac239 GAG(309-323) que contienen un epftopo CTL subdominante o inmunodominante). i.p., intraperitoneal; i.m., intramuscular. El sfmbolo “asterisco" indica una subestimacion de la respuesta debido a los pocillos ELISPOT saturados.
Figura 40: Neutralizacion in vitro de transduccion de celulas con un vector lentivftico pseudotipificado con el VSV-G de Indiana o con el VSV-G de Nueva Jersey, en donde las celulas son de ratones sin exposicion previa o de un raton previamente inmunizado con un vector lentivftico pseudotipificado con el VSV-G de Indiana.
Figura 41: Lisis espedfica in vivo contra un epftopo -CD8 inmunodominante que contiene el peptido (A) o contra un epftopo CD8 subdominante que contiene el peptido (B). Se realizaron reacciones de sensibilizacion, o de sensibilizacion-refuerzo en ratones individuales, ya sea con vectores lentivfticos que tienen la misma envoltura de VSV-G o con vectores lentivfticos que tienen diferentes envolturas de VSV-G en las reacciones de sensibilizacion y refuerzo.
Figura 42: La prueba Elispot de IFN-gamma para determinar la actividad de CTL contra un epftopo -CD8 inmunodominante que contiene el peptido (A) o contra un epftopo CD8 subdominante que contiene el peptido (B) o contra un CD4 que contiene el peptido (C). Se realizaron reacciones de sensibilizacion o sensibilizacion-refuerzo en los ratones individuales, ya sea con vectores lentivfticos que tienen la misma envoltura de VSV-G o con vectores lentivfticos que tienen diferentes envolturas de VSV-G en las reacciones de sensibilizacion y refuerzo.
Figura 43: Transduccion eficiente de celulas que no se dividen con LV defectuoso para la integracion. Las celulas HeLa tratadas con Afidicolina se transdujeron con dosis graduadas (de 1 a 100 ng del anftgeno p24 por ml del medio) del LV integrador de eGFP (eGFP-ILV) o LV no integrador de eGFP (eGFP-NILV). A las 48 horas despues de la transduccion, la expresion del eGFP se analizo mediante citometna de flujo. El panel superior muestra el porcentaje de celulas positivas para GFP y el panel inferior muestra la IFM (intensidad fluorescente media) de las celulas GFP positivas.
Figura 44: La transduccion del vector lentivftico conduce a la expresion efectiva del anftgeno tanto en las celulas dendrfticas convencionales (cDC) como en las DC plasmacitoides (pDC). (A) Experimentos de transduccion de respuesta a la dosis (de 0 a 300 ng/ml) con el LV integrador de eGFP (eGFP-ILV) o el LV no integrador de eGFP (eGFP-NILV) o con 300 ng/ml de eGFP-ILV o eGFP-NILV inactivadas por calor (Hl). En el dfa 6, los FL-DC se expusieron a las partfculas del vector durante 48 horas, y la transduccion de las celulas positivas para CD11c se evaluo mediante la medicion de la expresion de eGFP por citometna de flujo. Los numeros indican el porcentaje de celulas CD11c que expresan eGFP. (B) Se muestra una transduccion de pDC y cDC mediante LV. La expresion del eGFP por cDC (CD11c+ B220') y pDC (CD11c+ B220+). Lmeas delgadas, celulas de control (Ctl); perfiles llenos, FL-DC transducido con 300 ng/ml de partmulas del vector.
Figura 45: Una sola dosis de sEwnv-NILV promueve una respuesta del anticuerpo fuerte y espedfica. Los grupos de ratones adultos se inmunizaron i.p. con dosis graduadas de sEwnv-NILV (de 1 a 100 ng del antigeno p24) (A, B) o sEwnv-ILV (B). En ratones de control se inyectaron sEwnv-LV NI (A, B) o I (B) (Hl 100) inactivado por calor. Despues de 21 dfas, los sueros agrupados (6 ratones por grupo) se evaluaron para determinar anticuerpos espedficos de WNV.
Figura 46: Proteccion rapida contra la infeccion por WNV conferida mediante la inmunizacion de sEwnv-NILV. Seis ratones/grupo se vacunaron con 100 ng de sEwnv-NILV o 100 ng de sEwnv-ILV. Se incluyo un grupo de control de ratones inoculados con solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Una semana despues de la vacunacion, los ratones se expusieron a 1.000 DL50 i.p. de la cepa WNV IS-98-ST1. La supervivencia se registro durante 21 dfas. Figura 47: Proteccion eficiente a largo plazo mediante el sEwnv-NILV contra la infeccion por WNV.
Dos meses despues de la inmunizacion con dosis graduadas de sEwnv-NILV (de 1 a 100 ng del antfgeno p24) (A, B), o sEwnv-ILV (B), los ratones se inocularon con 1.000 DL50 i.p. de la cepa WNV IS-98-ST1. La supervivencia se registro durante 21 dfas.
Figura 48: Influencia de la optimizacion de codones en el nivel de expresion de gagAmyr. Los celulas 293T se cotransfectaron con plasmidos del vector TRIP que contienen ya sea una secuencia de tipo silvestre (panel izquierdo) o una secuencia con codones optimizados (panel derecho) de gagAmyr, el plasmido de encapsidacion p8.7 D64V y el plasmido de expresion VSV-G.
Figura 49: Los grupos de ratones (n = 5) se inmunizaron o no (Sin exposicion previa) con TRIP.NI GAGAmyr CO (100 ng) o partfculas TRIP.I GAG de tipo silvestre (100 ng) pseudotipificadas con el VSV-G de Indiana y 13 semanas despues se reforzaron con TRIP.NI GAGAmyr CO (100 ng) o las partfculas TRIP.I GAG de tipo silvestre (100 ng) pseudotipificadas con el VSV-G de Nueva Jersey, respectivamente. Todos los ratones se sacrificaron a los 10 dfas despues de la inmunizacion, y la respuesta inmune celular contra el GAG se evaluo mediante ELISPOT de IFN-y (A) o la tincion del tetramero (B).
Figura 50: Titulacion de partfculas del vector lentivmco pseudotipificadas por diversos serotipos de VSV-G con codones optimizados (CO) o de tipo silvestre (WT), cuando estan disponibles.
Figura 51: Ensayo in vitro para la cuantificacion de las actividades neutralizantes del suero. El suero de los ratones se recogio de los animales inyectados dos veces, en intervalos de dos meses, con 300 ng de P24 de partfculas de vector lentivmco por inyeccion, pseudotipificado por las protemas VSV.G de los serotipos diferentes. Las partfculas de vector que codifican la luciferasa, nuevamente pseudotipificadas con los diversos serotipos de las protemas VSV.G, se incubaron en presencia de diluciones de suero durante 1 hora a 37 °C. Despues de la incubacion, las partmulas del vector lentivmco que codifican la luciferasa se utilizaron para transducir las celulas 293T en placas de 96 pocillos con 1 ng de P24 por pocillo.
Despues de una incubacion de 48 horas, la actividad de la luciferasa se midio utilizando un equipo de deteccion de luminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer). Los resultados se expresan como porcentaje de la actividad de luminiscencia despues de la incubacion sin suero.
Figura 52: Neutralizacion cruzada de las partfculas del vector lentivmco con diferentes sueros de raton: Las partfculas vmcas pseudotipificadas con las diferentes protemas VSV.G se ensayan en experimentos de transduccion en presencia de diversos sueros de raton. A: La transduccion esta inhibida totalmente (++), parcialmente (+ o /-) o no esta inhibida (-). B: detalles de estos experimentos.
Figura 53: Actividad de las partfculas de Indiana pseudotipificadas en presencia de diversos sueros de mono. A: Sueros de monos pre-inmunizados, B: sueros de monos inyectados con partfculas de Indiana pseudotipificadas a diversas dosis (sensibilizacion) y C: sueros de monos despues de una inyeccion con las partfculas de Nueva Jersey pseudotipificadas (refuerzo).
Figura 54: Actividad de las partfculas de Nueva Jersey pseudotipificadas en presencia de diversos sueros de monos. A: Sueros de los monos pre-inmunizados, B: sueros de monos inyectados con las partfculas de Indiana pseudotipificadas a diversas dosis (sensibilizacion) y C: sueros de monos despues de una inyeccion con las partfculas de Nueva Jersey pseudotipificadas (refuerzo).
Figura 55: Actividad de las partfculas de Cocal pseudotipificadas en presencia de diversos sueros de monos. A: sueros de monos pre-inmunizados, B: sueros de monos inyectados con las partfculas del vector lentivmco de Indiana pseudotipificadas en diferentes dosis (sensibilizacion) y C: sueros de monos despues de una inyeccion con las partfculas del vector lentivmco de Nueva Jersey pseudotipificadas (refuerzo).
Figura 56: Actividad de las partmulas Isfahan pseudotipificadas en presencia de diversos sueros de monos. A: Sueros de monos pre-inmunizados, B: sueros de monos inyectados con partfculas de Indiana pseudotipificadas a diversas dosis (sensibilizacion) y C: sueros de monos despues de una inyeccion con las partmulas de Nueva Jersey pseudotipificadas (refuerzo).
Figura 57: Actividad de las partfculas de SVCV pseudotipificadas en presencia de diversos sueros de monos. A: Sueros de monos pre-inmunizados, B: sueros de monos inyectados con las partmulas de Indiana pseudotipificadas a diversas dosis (sensibilizacion) y C: sueros de monos despues de una inyeccion con las partfculas de Nueva Jersey pseudotipificadas (refuerzo).
Figura 58: Prevalencia de anticuerpos contra las protemas VSV.G en el suero humano.
La presencia de anticuerpos neutralizantes contra las protemas VSV-G se determino mediante ensayos de transduccion de partfculas pseudotipificadas con A: VSV-G Indiana, B: VSV-G Nueva Jersey, C: VSV-G Cocal, D: VSV-G SVCV y E: VSV-G Isfahan, en presencia de diversos sueros humanos, calentados o sin calentar.
Figura 59: Prevalencia de anticuerpos contra la protema VSV.G Cocal en el suero humano. 96 sueros humanos (tanto calentados como sin calentar) se ensayaron en los experimentos de transduccion (en 1/2 dilucion) en presencia de partteulas vmcas pseudotipificadas con protemas de A: Indiana, B: Nueva Jersey, C: Cocal, D: Isfahan y E: SVCV v Sv .G. Estos experimented se han hecho dos veces para cada una de las condiciones.
Figura 60: Analisis del suero humano de pacientes que neutralizan las protemas VSV-G. Los pacientes cuyo suero presenta una actividad de neutralizacion contra las protemas VSV-G se investigan mediante ensayos de transduccion (partteulas de A: Indiana, B: Nueva Jersey, C: SVCV, D: Cocal y E: Isfahan en diluciones en serie). Figura 61: Capacidad de las partteulas del vector pseudotipificadas mediante envolturas de VSV-G diferentes para fusionarse o no con el mDCh. Las DC procedentes de monocitos humanos (mDC) se transdujeron con partteulas del vector de GFP pseudotipificadas mediante la envoltura VSV-G de Indiana, Nueva Jersey, Isfahan, SVCV, Cocal y Chandipura. Cinco dfas despues de la transduccion, los mDC se analizaron mediante citometna de flujo para determinar el tftulo. Los tttulos relativos se expresan como la proporcion entre el titulo determinado en mDC y el titulo determinado en las celulas 293T.
LA APLICACION DE LOS VECTORES LENTIVIRICOS TRIP EN UNA ESTRATEGIA DE VACUNACION CONTRA LA INFECCION POR SIV COMO UN MODELO PARA LA ILUSTRACION DE LA VACUNACION CONTRA LA INFECCION POR VIH.
I. Potencial del vector TRIP para Inducir respuestas de los linfocitos T especificas anti-SIV en modelos de raton.
Para determinar si los vectores del lentivirus que albergan una protema de envoltura que se originan de un virus VSV podnan modificarse para permitir el refuerzo de las respuestas inmunes, los inventores desarrollaron una nueva estrategia de vector basada en vectores lentivmcos que expresan la glucoprotema de diferentes serotipos de VSV que se esperaba que no tuvieran una reaccion cruzada.
Los aislados del virus de estomatitis Vesicular (VSV) son virus de ARN con envoltura, no segmentados, de cadena negativa que pertenecen al genero Vesiculovirus en la familia Rhabdoviridae. El VSV infecta animales domesticos tales como el ganado, cerdos y caballos, ocasionando lesiones vesiculares en la lengua, los tejidos orales, las ubres y las pezunas. El genoma de VSV se administra al citoplasma de las celulas hospedadoras, donde se produce replicacion, por medio de la endocitosis mediada por receptor de las partteulas vmcas y la fusion inducida por el pH posterior de la envoltura vmca con la membrana del endosoma. La protema VSV G, la untea glucoprotema de superficie vteica, es necesaria para el enlace y la fusion. Existen dos serotipos principales de VSV, Indiana y Nueva Jersey, que se distinguen mediante anticuerpos de neutralizacion contra la glucoprotema G. Ademas de sus estructuras antigenicas, las glucoprotemas de Indiana y Nueva Jersey tambien difieren en el numero (511 y 517, respectivamente) y composicion de aminoacidos (solamente 50 % de identidad), en modificaciones posteriores a la traduccion, y en el plegamiento. De manera correspondiente, las cepas de Indiana y Nueva Jersey no son igualmente importantes con respecto a la patogenia de VSV. Los brotes ocasionados por las cepas de Nueva Jersey son mas frecuentes y mas graves que los ocasionados por las cepas de Indiana.
Materiales y Metodos
Ratones. Ratones hembra C57BL/6 (elevage Janvier, Francia) tambien fueron criados en las instalaciones del Instituto Pasteur.
Cultivo celular. Las celulas HeLa (adenocarcinoma del cuello uterino humano) (disponibles en el ECACC) y las celulas 293T de rinon embrionario humano (disponibles en el ATCC), utilizadas en la produccion del vector lentivmco, se cultivaron en un medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) Glutamax (GIBCO), complementado por suero de ternero fetal inactivado por calor al 10 % (FCS) y antibioticos (penicilina-estreptomicina).
Construccion y produccion del vector
El plasmido del vector pTRIP.AU3.CMV.SIVmac239gagAmyr contiene una forma no miristilada de la secuencia de SIVmac239 gag bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMVie).
Las partteulas del vector se produjeron mediante la co-transfeccion transitoria con fosfato de calcio de celulas 293T con el plasmido del vector, un plasmido de encapsidacion (p8.7) y un plasmido de expresion de envoltura de VSV-G, el serotipo de Indiana (pHCMV-G) (10) contra el serotipo de Nueva jersey (pcDNA3.1(-) NJ-G) (procedente del plasmido pcDNA3.1 comercializado disponible en Invitrogen). La secuencia de la protema se describe en la Figura 3.
La estrategia de clonacion abarcaba las siguientes etapas:
Se ha utilizado un plasmido que contiene el gen de la glucoprotema del serotipo VSV de Nueva Jersey (pBS VSV-G NJ).
Se clono en un vector pcDNA 3.1 (-) (Invitrogen) despues de la digestion por Xhol/Notl. El plasmido obtenido mediante este metodo se designo pcDNA3.1(-) VSV-G NJ.
La secuencia WPRE (elemento post-regulador del virus de hepatitis de la marmota) (11) es un elemento regulador post-transcripcion que se sabe que aumenta de manera significativa la expresion del gen. Se clono en un vector de Clonacion TOPO® (Invitrogen).
La secuencia WPRE se clono en el pcDNA3.1(-) VSV-G NJ despues de la digestion con EcoRI y la desfosforilacion.
El plasmido obtenido mediante este metodo se designo pcDNA3.1 (-) VSV-G NJ WPRE.
La cuantificacion de WPRE del contenido del antigeno p24 de partmulas del vector concentradas se hizo con un equipo de analisis de ELISA p24 comercial de VIH-1 (Perkin-Elmer Life Sciences). Para titulacion de la reserva del vector, las celulas 293T se transdujeron con concentraciones diferentes del vector por 72 horas y se lisaron. Los lisados se trataron con Rnasa y la proteinasa K y luego se utilizaron para la PCR cuantitativa (Lightcycler).
Ensayo de inhibicion de la transduccion in vitro. Se sembraron celulas HeLa en placas en una cantidad de 10.000 celulas por placas de 96 pocillos. Un dfa despues, las celulas se transdujeron con los vectores lentivmcos que codifican el eGFP (GFP mejorado) y se pseudotipificaron con la glucoprotema del serotipo VSV de Indiana o Nueva Jersey, despues de 30 minutos previos a la incubacion con el suero de raton descomplementado diluido en una concentracion de 1:6. Los ratones fueron ya sea ratones sin exposicion previa o ratones inmunizados una vez con 0,25x107 unidades de transduccion (TU) del vector lentivmco que codifica una forma no miristilada del SIVmac239 Gag y pseudotipificado con la glucoprotema del serotipo VSV de Indiana y se tomaron muestras de sangre 14 dfas despues de la inmunizacion. Despues de 72 horas, se ensayo la transduccion mediante citometna de flujo. El porcentaje de neutralizacion de transduccion se calculo en comparacion con la transduccion en ausencia de suero.
Inmunizacion de ratones. Todos los experimentos de animales se realizaron de acuerdo con las instrucciones del Laboratorio de la Oficina de Cuidado de Animales en el instituto Pasteur. En ratones de nueve semanas de edad se inocularon intraperitonealmente (i.p.) 0,25x107 unidades de transduccion (TU) de partmulas del vector pTRIP.AU3.CMV.SIVmac239gagAmyr en 0,2 ml de PBS de Dulbecco dos veces en el dfa 0, y luego en el dfa 21. Se tomaron muestras de sangre de los ratones en el dfa 14. Las respuestas inmunes se analizaron en el dfa 28.
Para la sensibilizacion, se administro un vector lentivmco que codifica una forma no miristilada del SIVmac239 Gag y pseudotipificado con la glucoprotema del serotipo VSV de Indiana, mientras que para el refuerzo, se inyecto el mismo vector pero pseudotipificado con la glucoprotema del VSV de Nueva Jersey.
La comparacion se hizo con la estrategia de sensibilizacion/refuerzo homologa, utilizando dos inyecciones posteriores del vector lentivmco pseudotipificado con la glucoprotema del serotipo de VSV de Indiana. Como controles, las respuestas primaria (dfa 7) y de memoria (dfa 28) se caracterizaron despues de una sola inyeccion del vector lentivmco pseudotipificado con la glucoprotema del serotipo VSV de Indiana. La respuesta primaria (dfa 7) de los ratones inmunizados solamente una vez con el vector lentivmco pseudotipificado con la glucoprotema del serotipo VSV de Nueva Jersey tambien se ensayaron.
Ensayo Elispot de IFN-v
Las microplacas de nitrocelulosa (MAHA S4510, Millipore) se recubrieron durante la noche con el anticuerpo de captura (par de Elispot de raton de IPN-y, BD Pharmingen) y se bloquearon con un medio completo compuesto de Glutamax RPMI1640 complementado con FCS al 10%, antibioticos, HEPES, aminoacidos no esenciales, b-mercaptoetanol y piruvato de sodio. Se agregaron esplenocitos de los ratones inmunizados con el vector a las placas por triplicado en cantidades de 0,25x106 celulas/pocillo y se estimularon con peptidos SIVmac239 gag (Programa de Reactivos de Investigacion y Referencia del SIDA del NIH), concanavalina A (1 pg/ml). Cuarenta horas despues, las manchas se revelaron con el anticuerpo conjugado con biotina (par de Elispot de Raton de IPN-y, BD Pharmingen) seguido por estreptavidina-AP (Roche) y solucion de sustrato BCIP/NBT (Promega). Las manchas se contaron utilizando el Bioreader® 2000 (Biosys. Karben, Alemania) y los resultados se expresaron en las celulas formadoras de manchas de IFN-g (SFC) por millon de esplenocitos.
Ensayo de citotoxicidad in vivo
Para la preparacion de las celulas objetivo, los esplenocitos de los ratones sin exposicion previa se marcaron con diversas concentraciones (alta, 5 pM; media, 1 pM; baja, 0,2 pM) de CFSE (ester carbosilfluorescein-diacetato succidimidilo, equipo de seguimiento de celulas Vybrant® CFDA-SE, Molecular Probes). Los esplenocitos se impulsaron entonces con peptidos en una cantidad de 5 pg/ml. Cada raton recibio 107 celulas marcadas con CFSE de una mezcla que contiene un numero igual de celulas de cada fraccion, a traves de la vena retroorbital. Despues de 15 a 18 horas, se analizaron por medio de citometna de flujo suspensiones de una sola celula de los bazos (Becton Dickingson, CelIQuest software). La desaparicion de las celulas promovidas por peptido se determino comparando la proporcion de las poblaciones promovidas (intensidad de fluorescencia de CFSE alta/media) con las poblaciones sin promover (baja intensidad de fluorescencia de CFSE) en los ratones inmunizados frente a los ratones sin exposicion previa. El porcentaje de exterminacion espedfica se establecio de acuerdo con el siguiente calculo: [1-[(CFSEbaj0sin exposicion previa/CFSEalto/mediosin exposicion previa)/(CFSEbajoinmunizado/CFSEalto/medioinmunizado)]]x100.
Resultados (Figuras de la 40 a la 42)
Primero los inventores han mostrado que los ratones inmunizados solamente una vez con una dosis baja (0,25 10e7 TU/raton, correspondiente a 650 ng de p24 para este lote) del vector lentivmco pseudotipificado con la glucoprotema del serotipo VSV de Indiana desarrollan una respuesta humoral fuerte que neutraliza la transduccion in vitro de las celulas con un vector lentivmco pseudotipificado con la misma envoltura. Por el contrario, existe solamente una baja seroneutralizacion de transduccion por el vector pseudotipificado con la glucoprotema del serotipo VSV de Nueva Jersey que se puede detectar.
Un experimento de respuesta a la dosis preliminar utilizando el vector lentivftico que codifica una forma no miristilada del SIVmac239 Gag y pseudotipificada con la glucoprotema del serotipo VSV de Indiana permitio caracterizar las respuestas inmunes e identificar los peptidos que contienen un epftopo CD8 inmunodominante (SIVmac239 gag: 309­ 323 (QTDAAVKNWMTQTLL)), as ^ como un epftopo CD8 subdominante (SIVmac239 gag: 73-97 (ENLKSLYNTVCVIWC) (datos no mostrados). Una dosis tan baja como de 0,45 107 TU/raton fue suficiente para alcanzar un nivel estable de 100 % de ratones que responden con una lisis espedfica de casi el 100 % para el peptido que contiene el epftopo CD8 inmunodominante. En contraste, incluso dosis altas (hasta de 23107 TU/raton) no fueron suficientes para estimular una actividad citolftica in vivo del 100 % en el caso de peptido que contiene el epftopo CD8 subdominante.
En paralelo, un artmulo recientemente publicado que utiliza los vectores adenovfticos que codifican el mismo anftgeno caracterizaron un peptido que contiene el epftopo CD4 (SI Vmac239 gag: 297-311 (y Vd RFYKSLRAEQTD)).
Por lo tanto, los inventores eligieron supervisar la inmunidad dirigida contra estos 3 peptidos e inmunizar a los ratones con una dosis sub-optima del vector 0,25107 TU/raton) con el objeto de poder detectar un efecto de refuerzo tanto en terminos del numero de ratones que responden como de la amplitud de las respuestas.
II - Respuesta Protectora contra el SIVMAC en un modelo de primate no humano
Introduccion
1 Infeccion por VIH y SIDA
1.1 VIH y su influencia
1.1.1 Epidemiologfa
Desde que los primeros casos del smdrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se notificaron en 1981, la difusion global del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) ha alcanzado proporciones pandemicas y representa ahora una amenaza del desarrollo global y salud publica (Girard et al., 2006). De hecho, el numero de personas que viven con el VIH en el mundo es en la actualidad de alrededor de 39,5 millones y todavfa esta creciendo exponencialmente, con 4,3 millones de personas infectadas en el ultimo anos y una estimacion de 14.000 personas que se infectan cada dfa (http//www.unaids.org).
1.1.2 Biologfa del VIH
La fisiopatologfa de la infeccion esta directamente correlacionada con las caractensticas del VIH. Este virus pertenece a la familia del Retroviridae, genero lentivirus. Es un virus con envoltura de alrededor de 110 a 120 nm de diametro. La glucoprotema gp120 es la responsable del tropismo del virus; de hecho permite la fijacion al receptor celular CD4 y los correceptores CCR5 o CXCR4, haciendo por lo tanto que los linfocitos CD4+ sean sus celulas objetivo principales. Una vez que el virus se une a los linfocitos CD4+, el ciclo vftico se divide en 2 etapas principales: la etapa temprana y terminal. En el citoplasma, el ARN vftico se transcribe de manera inversa en un ADN bicatenario dentro de la capsida vftica y se importa activamente al nucleo donde se puede integrar en el genoma de la celula (Arhel et al., 2007). La transcripcion del ADN vftico y la traduccion del ARNm vftico permiten la formacion de nuevas partmulas vfticas.
La mayor parte de los estudios de la patogenia del SIDA se llevan a cabo en primates no humanos con un equivalente del VIH de simios: SIV. De hecho, la estructura vftica y la biologfa de SIV estan directamente relacionadas con las del VIH.
1.1.3 Fisiopatologfa de la infeccion por VIH
El progreso de la enfermedad se define exactamente mediante mediciones combinadas del ARN del VIH-1 y los linfocitos CD4+ en plasma. La infeccion por VIH natural puede dividirse en 3 fases principales: la primo-infeccion o la infeccion aguda, caracterizada por un pico de carga vftica (alrededor de 106 copias de ARN/ml de sangre) y mediante una disminucion rapida pero transitoria de los linfocitos T CD4+ en circulacion (Weber, 2001). Ademas, en su etapa temprana de la infeccion, los linfocitos T CD4+ espedficos del VIH son los objetivos principales del virus y preferentemente se destruyen en ausencia de cualquier tratamiento (Rosenberg et al., 2000). Sin embargo, este aumento en la carga vftica generalmente esta bien controlado por una respuesta inmune espedfica, principalmente celular. De hecho, existen pruebas de una correlacion temporal entre la aparicion de los linfocitos T CD8+ espedficos del VIH y la disminucion de la viremia primaria (Koup et al., 1994). Como consecuencia, el numero de linfocitos T CD4+ regresa a un nivel mas alto (inferior al nivel anterior a la infeccion) y se estabiliza la viremia (entre 103 y 106 copia de ARN/ml): se alcanza el punto de ajuste (SP); su nivel con frecuencia se correlaciona con la evolucion de la enfermedad (Mellors, 1996). Los individuos infectados entonces entran en un periodo asintomatico, que puede durar de meses hasta anos. Este periodo se caracteriza por una disminucion lenta y lineal en el numero de celulas CD4+ en circulacion, debido a un equilibrio entre el sistema inmune y la replicacion del VIH. En ausencia de un tratamiento, esta fase asintomatica es seguida por el SIDA. En este punto, la viremia regresa progresivamente a un nivel alto y se observa una inflexion en la pendiente de agotamiento de los linfocitos T CD4+ (recuento de celulas CD4 inferior a 200 celulas/mm3 de sangre). Eventualmente, el sistema inmune se colapsa y los agentes que ocasionan la enfermedad que generalmente estan controlados de manera completa o se eliminan facilmente llegan a ser potencialmente letales.
2. Tratamientos medicos
2.1 De la Monoterapia a HAART
Con el objeto de ralentizar el progreso de la enfermedad hacia SIDA, se colocaron nuevos medicamentos en el mercado en el ano 1986. Se denominaron farmacos antirretrovmcos, su meta era prevenir la replicacion del VIH y por lo tanto posponer el agotamiento de los linfocitos T CD4+. El mas famoso de estos farmacos ciertamente fue AZT (Zidovudina), un inhibidor de la Transcriptasa Inversa (RT) del virus. Sin embargo, se descubrio eventualmente que este metodo monoterapeutico tema una efectividad limitada, ya que el VIH es un virus que tiene el potencial de desarrollar rapidamente una resistencia (a traves de mutaciones) a cualquier medicamento antirretrovmco. En el ano 1996, se comercializaron nuevos inhibidores de RT; fueron qmmicamente diferentes a inhibidores de tipo AZT. Eventualmente, en el ano 1995 aparecio una nueva clase de medicamento del VIH, inhibidores de proteasa (Pl). La combinacion que es el “estandar" en la actualidad en la terapia anti-VIH, llamada Terapia Antirretrovmca Altamente Activa (HAART), consiste en un asociacion de 3 clases de medicamentos antirretrovmcos, normalmente 2 diferentes inhibidores de RT y uno de Pl. HAART permite una potente disminucion de la carga vmca de larga duracion (Figura 5B), para la mayona de los pacientes, las copias de los virus en la sangre pueden incluso volverse indetectables (Gulick et al., 2000). Como consecuencia, aumenta el recuento de CD4, el sistema inmune se recupera parcialmente y nuevamente puede rechazar patogenos oportunistas (Autran et al., 1997). Para pacientes que tienen acceso al tratamiento, HAART ha permitido una reduccion impresionante de la morbilidad relacionada con el SIDA (Palella et al., 1998).
2.2 Lfmites de HAART
Aunque el exito de HAART es irrefutable, presenta ciertas limitaciones y pueden surgir dudas con respecto a su uso a largo plazo. En primer lugar, el tratamiento de HAART es realmente costoso y no es accesible para pafses en desarrollo. Posteriormente, la toxicidad de estos medicamentos es relativamente alta, desencadena con frecuencia efectos secundarios importantes (diabetes, lipodistrofia, diarrea, cefaleas...). Ademas, se ha mostrado que el VIH tuvo la capacidad de desarrollar resistencias contra el tratamiento HAART. Con frecuencia aparecen mutaciones en regiones de VIH restringidas por el tratamiento. El tratamiento HAART tambien limita la produccion de antfgenos del VIH, aparentemente hasta un valor de umbral debajo de lo que se necesita para estimular los linfocitos T efectores espedficos del VIH o para expandir los linfocitos T vfrgenes espedficos del VIH. Sin embargo, aun persiste la memoria inmune a VIH, como se indica a traves de la restauracion temporal de respuestas inmunes CD4 y CD8 a VIH cuando el sistema inmune se vuelve exponer al virus despues de interrupciones del tratamiento (Autran et al., 2004).
2.3 Vacunacion de VIH
2.3.1. Vacuna Profilactica/Terapeutica
Debido a que la eficacia de los farmacos aun esta limitada y debido a que HAART debe convertirse en una terapia cronica, demasiado costosa y diffcil de administrar en la mayona de las instalaciones del tercer mundo, se han descubierto otras estrategias para prevenir de forma duradera la aparicion del SIDA. El desarrollo de una vacuna del VIH puede representar la unica forma de ralentizar la pandemia. Se estan probando dos diferentes estrategias de vacunacion. Por una parte, una vacuna profilactica debe tener la capacidad de inducir la inmunidad de esterilizacion y debe evitar tanto la infeccion como sus complicaciones. Dicha vacuna debe tener la capacidad de operar en el momento de la entrada del virus y en la etapa muy temprana de infeccion, antes de que el virus pueda diseminarse a los organos linfaticos. Por otra parte, una vacuna terapeutica esta disenada para pacientes infectados de forma cronica bajo el tratamiento HAART (Autran et al., 2004). Consistina en tratar primero a los pacientes con HAART para restaurar la competencia inmunitaria, y despues inmunizarlos para reforzar posteriormente sus respuestas inmunes en reposo al VIH antes de interrumpir el tratamiento. Eventualmente, si se puede mejorar el control inmune del virus, se atenuana el progreso de la enfermedad, permitiendo interrupciones de tratamiento, y en consecuencia una limitacion en el uso de HAART, minimizando de esta forma su toxicidad y coste.
2.3.2 Estado de la investigacion de la vacuna del SIDA actual
Siempre que se elija una estrategia, el desarrollo de una vacuna se enfrenta a grandes desaffos cientfficos, tales como la alta variabilidad genetica del virus, la carencia de correlaciones inmunes de proteccion y limitaciones en los modelos animales existentes. Hasta ahora, se han probado mas de 50 candidatos de vacuna en pruebas clmicas fase l/ll (www.iavi.org) (vease apendice 1 para un resumen de pruebas en curso anti-VIH-1). Se han probado hasta la fecha multiples estrategias de vacunacion (Tonks, 2007). En primer lugar, se probaron vacunas atenuadas vivas tradicionales debido a su exito en el pasado contra la viruela, la polio o el sarampion. Un virus atenuado vivo con una eliminacion del gen nef (SIV-Anef), ha sido la vacuna mas efectiva en el modelo SlV/macaco. Sin embargo, su aplicacion esta restringida ya que el virus de la vacuna persiste indefinidamente en un nivel bajo en macacos vacunados y puede ser patogeno para neonatos. Ademas, SIV-Anef puede originar enfermedad en adultos varios anos despues de la vacunacion. No obstante, estas vacunas atenuadas vivas proporcionan una prueba importante de principio para la factibilidad del desarrollo de vacunas del VIH y permiten la caracterizacion de la naturaleza de la inmunidad protectora (Koff et al., 2006). Otra estrategia de vacuna tradicional fue inducir anticuerpos de neutralizacion amplia y de larga duracion para deshabilitar la entrada vmca y evitar la infeccion. Para este fin, se desarrollaron vacunas de subunidad. Han estado compuestas de protemas o peptidos del VIH, con frecuencia recombinantes. Aqu se puede mencionar la prueba VaxGen, evaluada en la fase II en los Estados Unidos de America, con una vacuna basada en un gp120 monomerico administrado en alumbre. Sin embargo, ninguna de estas pruebas de vacuna de subunidades mostro una reduccion estadfsticamente significativa de la infeccion de VIH en las vacunas. Ya que las vacunas que provocan respuestas humorales no consiguieron proporcionar resultados prometedores, los investigadores se han dirigido al aspecto de transmision por celulas. De hecho, anteriormente se ha mostrado que los linfocitos T efectores citotoxicos CD8+ pueden despejar celulas infectadas que despliegan peptidos vmcos en sus moleculas del MHC de clase I. Ademas, los linfocitos T CD8+ son conocidos como importantes para controlar infeccion por SIV y VIH debido (i) a la eliminacion de linfocitos T CD8+ durante la infeccion por SIV cronica en monos incrementa la carga vmca (Jin et al., 1999), (ii) los pacientes positivos para VIH que son heterocigotos en loci del HLA de clase I, tienen menores tasas de progreso de enfermedad (Carrington et al., 1999) y (iii) el virus acumula mutaciones en epttopos en linfocitos T c D8+ (Goulder y Watkins, 2004). Una vacuna que estimula la respuesta de linfocitos T no prevendna la infeccion en la forma tradicional, pero puede al menos suprimirla lo suficiente para evitar las apariciones del SIDA. Entre las vacunas de linfocitos T se encuentran las vacunas de ADN, actualmente en pruebas de fase I, que utilizan genes de VIH aislados codificados por plasmidos, pero que se enfrentan a problemas de inmunogenicidad. Las estrategias mas comunmente utilizadas para inducir respuestas de linfocitos T, es uno de los vectores recombinantes. Consiste en el uso de vectores vmcos (procedentes de viruela, vaccinia o adenovirus) para transportar genes de VIH aislados en celulas humanas.
Finalmente, es importante mencionar la tecnica de vacunacion a base de celulas dendnticas, cuyos resultados contra los estfmulos de SIV fueron muy estimulantes. Consiste en inmunizar macacos con celulas dendnticas autologas (DC) impulsadas con SIV qmmicamente desactivado (desactivacion con aldritiol-2, AT-2). El virus desactivado no tiene la capacidad de invertir la transcripcion, pero las partmulas vmcas conservan su estructura intacta y la mayona toda su capacidad de fusion. Esta tecnica se probo incluso con exito en seres humanos infectados cronicamente y no tratados, con DC autologas impulsadas con VIH autologo desactivado (Andrieu y Lu, 2007). A pesar de su eficacia, esta tecnica es mas bien costosa y larga.
2.3.3 Problemas encontrados con las estrategias de vacuna previas
Aunque muchos tipos de vacuna han sido y aun estan siendo probados, ninguno de ellos ha sido completamente exitoso hasta ahora. De hecho, no se ha observado efecto a largo plazo en la carga vmca con vacunas de ADN, incluso si se estimularon respuestas espedficas de CTL. Las vacunas que provocan una respuesta humoral padecen la gran variabilidad del virus e incluso si se generaron anticuerpos, nunca fueron lo suficientemente versatiles para alcanzar la diversidad genetica del VIH. Incluso la inmunizacion pasiva de individuos infectados por VIH con anticuerpos monoclonales de neutralizacion, de forma subyacente a los lfmites de inmunidad humoral para controlar la infeccion por VIH-1 (Trkola et al., 2005). Los vectores de viruela tuvieron exito en la generacion de respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ espedficos, pero no permitieron un mejor control de la carga vmca despues de muchas semanas de interrupcion de HAART. En consecuencia, se necesita probar otras estrategias de vacunacion. Aqu los inventores proponen probar una nueva estrategia de vacuna de VIH-1, con base en el uso de Vectores Lentivmcos (LV) procedentes de VIH-1 como una vacuna candidata.
3. Vectores Lentivmcos como candidatos para vacunacion de VIH
3.1 Tecnologfa de Vectores Lentivmcos
Se describieron LV por primera vez hace 20 anos (Poznansk et al., 1991). Como un vector recombinante, un LV tiene la capacidad de integrar un transgen (hasta 8-10 kb) en el ADN de la celula hospedadora. La unica particularidad de los vectores procedentes de VIH-1 y de un LV es su capacidad de transducir celulas sin division. De hecho, los lentivirus tipo LV, tienen la capacidad de integrarse independientemente de la mitosis celular. Esta capacidad procede de una importacion nuclear activa del ADN vmco (o ADN de vector) a traves de la membrana nuclear de la celula hospedadora. Una explicacion de esta importacion nuclear activa, es la formacion de un ADN tricatenario unico, denominado Ala o Triplex de ADN a traves de dos secuencias activas en cis en la secuencia pol: cPPT (Tramo de Polipurina central) y CTS (Secuencia de Terminacion Central) descubiertos en el laboratorio (Zennou et al., 2000).
El proyecto de vacunacion de los inventores utiliza un LV procedente de VIH-1 habitualmente denominado TRIP (debido a que contiene la estructura de Aleta/Triplex de ADN central). Este vector, que pertenece a la tercera generacion de LV, se ha optimizado en terminos de diseno, produccion, eficacia de transduccion y parametros de bioseguridad (Delenda, 2004).
Uno de los principales intereses en utilizar VIH-1 como un vector de transferencia genica es que los retrovirus, de forma contraria a los virus ARN positivos o ADN no son directamente infecciosos. De hecho, un genoma ARN positivo necesita transcripcion inversa y muchas protemas adyuvantes para comenzar la replicacion y patogenia vmca in vivo. Sin embargo, con el objeto de utilizarse como un vector de transferencia genica, el genoma del VIH-1 se ha reducido a las mmimas secuencias vmcas necesarias para la expresion y empaquetamiento de transgen (Figura 8). Las secuencias de accion en cis necesarias para un casete de expresion transgenica, son las siguientes:
La secuencia LTR (Repeticion Terminal Larga) es necesaria para transcripcion inversa, integracion y transcripcion de ADN vmco. Este 3'LTR se ha eliminado en la region U3, sin alterar las funciones necesarias para la transferencia genica, por dos razones importantes: en primer lugar, para evitar la trans-activacion de un gen hospedador, una vez que el ADN esta integrado en el genoma, y en segundo lugar para permitir la auto-desactivacion de las secuencias en cis vmcas despues de la retrotranscripcion. Por lo tanto, en celulas objetivo unicamente las secuencias del promotor interno se transcribiran (transgen) (Figura 9).
La region ^ es necesaria para la encapsulacion de ARN vmco.
La secuencia de RRE (Elemento que Responde a REV) permite la exportacion del ARN mensajero vmco del nucleo al citosol despues de la union de la protema Rev.
La secuencia de ala de ADN (cPPT/CTS, normalmente contenido en Pol) facilita la importacion nuclear.
La secuencia activa en cis WPRE (Elemento de Post-Respuesta de virus de hepatitis B de marmota) tambien se agrega para optimizar la estabilidad de ARNm (Zuffere et al., 1999). WPRE no se traduce.
El gen de interes (por ejemplo, que codifica el antfgeno) se inserta en el plasmido del vector de transferencia bajo el control de un promotor fuerte y con frecuencia ubicuo.
Con el objeto de generar partmulas vmcas (ARN, capsida y envoltura), ciertas protemas de empaquetamiento auxiliar de VIH-1 tiene que llevarse simultaneamente dentro de las celulas productoras. Estan codificadas por dos plasmidos adicionales denominados el plasmido de empaquetamiento o encapsulacion y el plasmido de expresion de envoltura. El plasmido de empaquetamiento codifica unicamente las protemas vmcas esenciales para la smtesis de partfculas vmcas. Los genes adyuvantes, cuya presencia en el plasmido puede dar lugar a preocupaciones de seguridad, se eliminaron. Las protemas vmcas llevadas en trans son respectivamente:
Protemas Gag para construccion de la matriz (MA, p17), la capsida (CA, p24) y la nucleocapsida (NC, p6).
Enzimas codificadas por Pol: integrasa, proteasa y transcriptasa inversa.
Protemas reguladoras que codificaron Tat y Rev, Tat es necesario para el inicio de la transcripcion mediada por LTR.
Con el objeto de evitar cualquier empaquetamiento de estos ARNm generados en las partfculas vmcas, se elimino la region ^. Se eligio un promotor heterologo para evitar problemas de recombinacion.
El plasmido de expresion de envoltura no codifica las protemas ENV naturales del VIH-1 (gp120, gp41). De hecho, estas protemas son demasiado labiles para permitir una produccion y concentracion eficiente mediante ultracentrifugacion de partfculas vmcas. Ademas, las protemas ENV de VIH-1 tienen un tropismo limitado (CD4, CCR5, CXCR4). Para contrarrestar estos problemas, la produccion de LV utiliza un proceso llamado pseudotipificacion. Este consiste en generar partmulas vmcas con una glucoprotema de envoltura heterologa. Entre las primeras glucoprotemas y las aun mas ampliamente utilizadas para pseudotipificacion de LV, se encuentra la Glucoprotema G de Virus de Estomatitis Vesicular (VSV-G) del serotipo Indiana. LV pseudotipificado con VSV-G ofrece ventajas significativas, ya que VSV-G interactua con un receptor celular ubicuo en las celulas, dotando al vector con una amplia serie de celulas hospedadoras. Ademas, VSV-G confiere alta estabilidad de partfculas de vector lo que permite un procesamiento corriente abajo de partmulas vmcas: principalmente concentracion mediante ultracentrifugacion.
3.2. ^Por que los Vectores Lentivmcos son candidatos prometedores para vacunacion contra VIH-1?
3.2.1 Transduccion de DC
LV se utilizaron inicialmente en terapia genetica y sus capacidades unicas como un sistema de transferencia genica hasta la fecha son innegables.
En primer lugar y de forma contraria al adenovirus y a los vectores procedentes de virus vaccinia, no existe una inmunidad preexistente en seres humanos contra virus lentivmcos. Desde su aparicion, LV se ha probado con exito in vitro en una gran variedad de celulas y tejidos de importancia terapeutica, incluyendo Imgado, cerebro y celulas dendnticas (DC) dentro del contexto de protocolos de terapia genica.
DC son un grupo heterogeneo de Celulas que Presentan Antfgenos (APC) que desempenan un papel crucial en inmunidad innata, as ^ como en el inicio de respuestas inmunes de adaptacion. Las DC actuan como centinelas del sistema inmune mediante la captura continua de antigenos en tejidos perifericos. Una vez activadas por productos microbianos o senales inflamatorias, experimentan maduracion, migran para drenar los tejidos linfoides donde posteriormente procesan y presentan los antfgenos capturados dentro del contexto de MHC I y II a linfocitos T CD8+ y CD4+. Resulta interesante que entre los tipos celulares que pueden ser transducidos eficientemente por LV, se descubrieron las DC humanas procedentes de CD34+ y monocitos mitoticamente hipoactivas asf como DC procedentes de medula osea de raton. In vitro, la transduccion mediante LV no afecto a su viabilidad. Eventualmente, la transduccion estable de DC permite una presentacion endogena del antfgeno durante toda la vida de las celulas. Por lo tanto, esto hace que LV sea una buena vacuna candidata.
3.2.2 Historia del uso de LV con fines de vacunacion
Ademas de la expresion eficiente de una protema transgenica, se mostro que DC transducidas in vitro con LV, procesan y presentan de forma eficiente peptidos procedentes de la protema. De hecho, las DC transducidas de forma lentivmca tanto humanas como murinas tuvieron la capacidad de re-estimular las lmeas de linfocitos T espedficas o clones in vitro. De manera mas importante, diversos grupos senalaron la sensibilizacion in vitro de linfocitos T vfrgenes contra antigenos relevantes cuando se utilizan DC humanas.
Posteriormente muchos grupos evaluaron el uso de DC transducidas de forma lentivmca como agentes inmunoterapeuticos in vivo, principalmente en modelos de raton aunque tambien de forma mas reciente en un modelo de primate. Consistio en inmunizar animales con DC transducidas de forma lentivmca ex vivo, y analizar las respuestas de linfocitos T CD8+ resultantes in vitro. Cuando fue posible, tambien se probo in vivo la capacidad de proteccion dentro del contexto de estimulacion. La mayona de estos estudios utilizo antfgenos de tumor como modelos y probo la capacidad de la respuesta CTL inducida para eliminar las celulas de tumor. Muy pocos equipos de investigacion han demostrado la pertinencia de DC transducidas de forma lentivmca ex vivo contra infecciones vmcas. Zarei et al., por ejemplo demostraron la capacidad de proteccion contra una exposicion a LCMV en ratones inmunizados con DC transducidas con LV que codifican la glucoprotema de virus (Zarei et al., 2004).
Sin embargo, esta tecnica parecio ser diffcil de aplicar en un protocolo de vacunacion humana, en consecuencia LV se probo rapidamente mediante administracion directa in vivo. Muchos grupos han demostrado la eficacia de inyeccion in vivo de Lv en ratones con el objeto de provocar una respuesta inmune espedfica de transgen. Una vez mas, se utilizaron principalmente anffgenos de tumor. Por ejemplo, el laboratorio mostro que la inoculacion directa in vivo de lentivirus que codifican el poliepftopo de melanoma en ratones transgenicos HLA-A*0201, puede provocar respuestas CTL vigorosas contra la mayor parte de los epftopos de melanoma codificados (Firat et al., 1999). Se ha demostrado incluso que la inyeccion de LV fue superior a la inyeccion de DC transducidas ex vivo, tanto en terminos de amplitud como de longevidad de la respuesta CTL (Esslinger et al., 2003). Ademas, se puede generar una respuesta de memoria de linfocitos T CD8+ funcional despues de la inmunizacion directa in vivo con el vector TRIP, incluso en ausencia de linfocitos T CD4+, una ventaja innegable hacia la vacunacion de VIH (Iglesias et al., 2007). Muchos equipos de investigacion ahora estan investigando los intrincados mecanismos que podnan contribuir al alto potencial de LV como herramientas de vacunacion. La expresion antigenica sostenida, particularmente en DC, asf como la activacion de inmunidad innata, podna desempenar un papel principal (Breckpot et al., 2003).
4. Prueba de Vacunacion en macacos Cynomolgus
4.1 Trabajo previo en laboratorio, primeros dfas del proyecto
En el laboratorio, los estudios de inmunogenicidad han demostrado el potencial de respuestas de linfocitos T espedficas anti-SIV en ratones endogamicos inmunizados con vector TRIP, que codifica una forma no miristoilada de SIVmac239 Gag (anterior). Estos modelos murinos permitieron subrayar el potencial de los vectores TRIP como candidatos para vacunacion contra VIH. Sin embargo, no permitieron probar la capacidad de la proteccion de inmunizaciones con vector TRIP dentro del contexto de estfmulo vmco.
4.2. El modelo de macaco
Para este proposito, se eligio un modelo de primate no humano para estudios de eficacia de proteccion, mas particularmente el macaco Cynomolgus. El modelo humano/VIH-1 se tradujo al modelo de primate no humano macaco/SIVmac. Los macacos son altamente susceptibles a infeccion por SlVmac y desarrollan de forma progresiva un smdrome de inmunodeficiencia, que se asemeja al SIDA humano. De forma interesante, se pueden observar cargas vmcas en plasma durante infeccion primaria y cronica paralelas a las observadas en seres humanos, como en personas infectadas por VIH-1 que no progresan a largo plazo, asf como progresivas rapidas. Como en seres humanos infectados con VIH-1, las respuestas inmunes celulares a SlVmac durante infeccion primaria y cronica difieren significativamente y las pruebas del escape inmune estan bien documentadas. Como en individuos infectados con VIH-1, el tejido linfoide asociado con intestino, es el sitio principal de replicacion vmca y agotamiento de linfocitos T CD4+.
Actualmente, los datos de vacuna/estfmulo de SIDA se generan esencialmente en 3 especies de macaco principales: principalmente macacos rhesus de origen indio, pero tambien macacos rhesus de origen chino y macacos Cynomolgus. Cada modelo de especie, presenta ventajas e inconvenientes para estudiar respuestas a la infeccion vmca. Los macacos cynomolgus fueron elegidos para el ensayo de los inventores, debido a que estan mas facilmente disponibles en Europa que los macacos rhesus. Reinman et al., mostraron que la patogenia de SIV estaba atenuada en macacos Cynomolgus en comparacion con rhesus indios (viremia en plasma inferior, conservacion del numero de linfocitos T CD4+, tiempo de supervivencia incrementado). Esta patogenia atenuada estuvo asociada con respuestas de ELISPOT de IPN-y tempranas y mas fuertes a GAG y ENV que en especies rhesus. Estas observaciones apoyan por lo tanto un papel de las respuestas inmunes de linfocitos T tempranas. Finalmente, a pesar de la menor carga vmca en plasma, la viremia despues del estfmulo puede utilizarse de forma significativa como un criterio de valoracion experimental en macacos Cynomolgus, asumiendo que la dosis de virus usada para el estimulo es lo suficientemente alta y que el grupo sin exposicion previa es lo suficientemente grande para limitar la significacion estadfstica de controladores espontaneos. De forma interesante, los macacos Cynomolgus muestran cargas vmcas mas similares a las observadas en la infeccion humana (Reimann et al., 2005).
4.3. Eleccion del antfgeno
Dentro del contexto de una prueba de vacuna en primates no humanos, tiene que surgir la cuestion de la eleccion del antfgeno. Se eligio como el antfgeno la protema no miristilada GAG SIVmac239. Los resultados y observaciones previas, asf como datos con respecto a la infeccion por VIH-1 natural y a la estructura vmca pueden justificar la eleccion de esta protema como un antfgeno potencialmente eficiente. En primer lugar, la variabilidad importante en cepas del VIH-1 restringio a los inventores a elegir una protema bien conservada entre las diferentes cepas de VIH-1/SIV. Unicamente GAG, POL y NEF pueden cumplir con este criterio. Sin embargo, se ha mostrado que CTL reconoce principalmente epttopos localizados en GAG y NEF (Addo et al., 2003). Mas recientemente, se demostro que de las protemas de VIH-1 diana, unicamente respuestas espedficas de GAG estuvieron asociadas con reduccion de la viremia y de forma independiente del tipo de HLA particular (Kiepiela et al., 2007). Ademas, cuanto mas diversificadas fueron las respuestas espedficas de GAG, menor fue la viremia en plasma. Ademas, como compone la matriz vmca, GAG es la primera protema que sera procesada y presentada por el MHC de clase I (Sacha et al., 2007), debido a que la entrada/captura es suficiente y que no hay la necesidad de una replicacion de virus. GAG tambien es la mas representada entre las protemas del VIH-1 (1000-1500 CA) (Briggs et al., 2004). Todos estos datos justificaron la eleccion de esta protema como un antfgeno relevante para la primera prueba de vacuna de los inventores. Ademas, esta prueba fue disenada para dar una prueba de concepto de la eficiencia de vectores TRIP como herramientas de vacunacion. Para este fin, un antfgeno sencillo se eligio voluntariamente con el objeto de destacar el papel protector desempenado por parte del propio vector (eficacia de transferencia de gen). Ademas, teniendo la protema GAG sencilla como antfgeno, se permite hacer comparaciones con los estudios de vacunas previos.
4.4. Protocolo de Vacunacion
Se eligio una estrategia de sensibilizacion-refuerzo con el objeto de reforzar las respuestas primarias. Se supone que una segunda inyeccion incrementa el numero de elementos de respuesta, la frecuencia y avidez de los linfocitos T espedficos de antfgeno y la intensidad de respuestas de linfocitos T. Tambien puede mejorar la diversidad de respuestas asf como las funciones de linfocitos T, tales como exterminacion o migracion a la periferia.
Para la sensibilizacion, se inmunizaron 3 grupos de 2 macacos con el vector LV TRIP-SIVmac239 Gag pseudotipificado con un serotipo Indiana VSV-G, en 3 diferentes dosis. Dos animales recibieron un vector TRIP-GFP pseudotipificado con el serotipo Indiana VSV-G como un vector irrelevante. Para el refuerzo, 3 meses despues de la sensibilizacion, todos los animales inmunizados recibieron una dosis similar de TRIP-SIVmac239 Gag o TRIP-GFP pseudotipificado con un serotipo VSV-G sin reaccion cruzada de Indiana.
Con el objeto de probar las capacidades de proteccion activadas por esta vacuna a base de vector TRIP, dos meses despues del refuerzo los 8 animales se expusieron por via intrarrectal a 500 Dosis Infecciosas de Animal 50 (DIA50) de SIVmac251. La via de inoculacion y la dosis muy alta de virus para el estfmulo estuvieron justificadas por el tamano de la cohorte, de hecho incrementando la dosis infecciosa, por lo que los inventores esperan limitar el numero de controladores espontaneos en la rama de los animales sin exposicion previa del estudio compuesto unicamente de 4 macacos.
Se ha llevado a cabo un seguimiento longitudinal de la respuesta inmune celular despues de la sensibilizacion, refuerzo y estfmulo mediante ELISPOT de IPN-y en PBMC.
Materiales y Metodos
1. Materiales
1.1 Antfgenos
La protema SIVmac239 GAGAmyr fue elegida como un antfgeno. Es una protema de 511 aminoacidos. Se elimino el dominio de miristilacion de protema para permitir manipulaciones en niveles de bioseguridad L1, laboratorios y para promover la presentacion de clase I mediante APC. La secuencia completa de la poliprotema GAG de SIV mac239, se puede encontrar a traves de la ID de protema: AAA47632. La protema GFP se eligio como antigeno irrelevante.
1.2. Plasmidos
Todos los plasmidos utilizados para transfecciones se produjeron en la cepa JM109 de bacterias E. coli K12 (F' traD36 proA+B+ laclq A(lacZ)M15/ A(lac-proAB) glnV44 e 14- gyrA96 recA1 relAI endAI thi hsdR17), cultivada en un medio LB complementado con ampicilina y extrafdo con el equipo Maxi-prep Nucleobound de Macherey-Nagel (Hoerdt, Francia).
Se utilizaron tres construcciones de plasmido para generar las partmulas de TRIP-AU3-CMV-Gag Amyr-WPRE (aqu nombradas TRIP-SIVmac239 Gag, Figura 25A) o TRIP-AU3-c Mv - eGFP-WPRE (aqu nombradas TRIP-GFP, Figura 25B). Un plasmido de vector, que contiene genes activos en cis del VIH-1 (LTR, AU3 en 3', senal de encapsidacion y , RRE y ala de ADN, es decir, cPPT/CTS), y el transgen que codifica ya sea la protema SIVmac239 GAG Amyr o la GFP, bajo control de elementos reguladores de transcripcion heterologa: promotor de Citomegalovirus. La secuencia WPRE (elemento post-regulador de virus de hepatitis de marmota) (Donella J. E. et al., 1998), se agrego para incrementar la expresion de transgen.
Un plasmido de empaquetamiento (plasmido de encapsidacion), que contiene los genes de VIH-1 gag, pol, tat y rev, necesarios para la construccion de partmulas vmcas en la lmea celular de produccion, que se pueden disenar como p. 8.7.1 en Zufferey et al., 1998.
Un plasmido de envoltura (plasmido de expresion de envoltura), que codifica la Glucoprotema G del Virus de Estomatitis Vesicular (VSV-G) serotipo Indiana (ph CMV VSV-G) (Yee J. et al., 1994, Genebank AJ318514) o serotipo sin reaccion cruzada Indiana tal como el serotipo Nueva Jersey (pcDNA3.1 (-)NJ-G WPRE). pcDNA 3.1 (-)NJG se obtiene del plasmido pcDNA3.1 disponible en Invitrogen. Especialmente, para construir el pcDNA3.1 (-)NJ WPRE, pBS-NJG (GenBank V01214)17 se digirio con Xhol y Notl y se clono en el vector pcDNA3.1(-) (Invitrogen). Para incrementar la expresion, una secuencia WPRE (elemento de regulacion post-transcripcion de marmota) preamplificado mediante PCR y clonado en un vector de clonacion TOPO TA, se agrego mediante digestion con EcoRI.
Los plasmidos de empaquetamiento y envoltura tienen elementos de transcripcion heterologos (promotor de CMV y senal de poliadenilacion). Todos los plasmidos contienen el gen de resistencia a ampicilina para facilitar la seleccion de crecimiento en bacterias.
1.3 Cultivo celular
La lmea celular de rinon embrionario humano (293T humana) se utilizo para produccion del vector TRIP. Para inhibicion de los ensayos de transduccion, se utilizo la lmea celular P4, una lmea celular procedente de HeLa.
Estas celulas se cultivaron en un medio completo compuesto de medio de Eagle modificado por Dulbecco que contiene glutamina (DMEM, Complemento GlutaMAX-l, GIBCO), complementado con Suero de Ternero Fetal desactivado con calor al 10 % (FCS) (pAa Laboratories GmbH, Pasching, Austria) y penicilina, estreptomicina (100 Unidades/ml de penicilina G (sal de sodio) y 100U/mI de sulfato de estreptomicina, GIBCO, Invitrogen). Se cultivaron celulas primarias de macacos en medio completo de RPMI GlutaMAX-l (FCS y antibioticos a 10 %, concentraciones similares a DMEM).
1.4 Primates no humanos
Se incluyeron en la prueba de vacunacion doce Macacos Cynomolgus adultos (Macaca fascicularis), machos de la Isla Mauricio del oceano fndico. Fueron negativos para virus de herpes SIV B, filovirus, STLV-1, SRV-1, SRV-2, sarampion, hepatitis B-HbsAg y hepatitis B-HBcAb antes de la inclusion en este estudio. Las inmunizaciones, estfmulos y recoleccion de sangre fueron manejadas, de acuerdo con las directrices de EC para experimentos utilizando primates no humanos.
1.5 Virus SIV para estfmulo
Se utilizo para estfmulo la cepa SIVmac251 (genoma provmco completo y secuencia flanqueante: numero de referencia: M19499).
1.6 Conjuntos de peptidos SIVmac239 GAG y SIVmac251 NEF
La re-estimulacion de PBMC in vitro en ELISPOT se llevo a cabo ya sea con grupos de peptido SIV mac239 GAG o SIVmac251 NEF que conteman 125 peptidos o 64 peptidos respectivamente (Programa de Reactivos de Investigacion y Referencia de SIDA del NIH). Los peptidos tuvieron 15 aminoacidos de longitud, con 11 aminoacidos solapantes entre los peptidos secuenciales. Los peptidos GAG se distribuyeron en 11 grupos que conteman de 5 a 12 peptidos consecutivos y solapantes, nombrados de orden de la letra M a W y recuperando la protema SIVmac239 GAG (Figura 26). Los peptidos NEF se dividieron en 12 grupos de 8 peptidos que recuperan la protema NEF SIV mac251 y nombrados en orden de la letra a a h. La mayor parte de los peptidos tuvieron mas del 80 % de pureza. Se suministraron liofilizados cada uno en 1 mg. En el momento de la recepcion, se resuspendieron a 2 mg/ml en DMSO al 5 % para peptidos GAG y a 1 mg/ml en DMSO puro para peptidos NEF, con base en el porcentaje de contenido de peptidos y pureza HPLC.
2. Metodos
2.1 Produccion de Vectores
Se produjeron partfculas de vector mediante transfeccion de fosfato de calcio temporal de celulas 293T (CaCl20,125 mM, solucion salina tamponada por HEPES 1X pH 7,10, NaCI 70 mM, Na2HP04 2 H2O 0,75 mM, HEPES 25 mM). Se requirieron diez |jg de plasmido de vector que codifica ya sea GAGAmyr o GFP con 5 a 10 |jg del plasmido que codifica la envoltura de glucoprotema VSV-G, y 10 jg del plasmido de empaquetamiento tal como lo describio previamente Zennou et al 2000 (Zennou et al., 2000). Las celulas se sembraron en placas de Petri de cultivo de tejido tratado con poliestireno de 10 cm2 (Falcon) a 6,106 en medio completo, 24 horas antes de la transfeccion, y el medio se cambio antes de la transfeccion. Las celulas tuvieron al menos el 80 % de confluencia. Veinticuatro horas despues de la transfeccion, se agrego un medio completo sin FCS a las celulas en un volumen menor para concentrar las partfculas. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, los sobrenadantes se recogieron de las placas de Petri, se centrifugaron para sedimentar las celulas flotantes (2500 rpm, 5 min) y se trataron 15 minutos a 37 °C con DNasa I (Roche Boehringer, 20 U) y MgCl2 (Sigma, 1 mM) con el objeto de eliminar el ADN de plasmidos residuales. Los vectores se recogieron despues de ultracentrifugacion del sobrenadante (22000 rpm; 1 hora) y se resuspendieron en PBS fno. Los vectores se conservaron a -80 °C en alfcuotas con volumen pequeno.
2.2 Medicion de produccion de antfgeno p24 GAG
Se determinaron los contenidos de antfgeno de vectores VIH-1 p24 GAG mediante Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (Perkin-Elmer Life Sciences, Paris, Francia). Las concentraciones de p24 se proporcionaron en ng/ml de vector.
2.3 Titulacion de vector
Se llevo a cabo la titulacion mediante transduccion de celulas 293T (sembradas 24 horas antes de transduccion en 5.105 celulas/pocillo en placas de Petri de 6 pocillos) con 3 diferentes volumenes de vector. Las celulas tambien se transdujeron con la misma cantidad de vector desactivado con calor previamente a 70 °C. Setenta y dos horas despues de la transduccion, las celulas se lisaron con un tampon de lisado 1X (Tris 20 mM pH = 8.8; NP400,1 %; Tween 0,1 % final) que contiene RNasa, libre de DNasa (Roche Boehringer, 50 jg/m l final). Las protemas celulares se degradaron mediante la adicion de proteinasa K (Proteinasa K estabilizada 100 jg/m l final, Eurobio).
Se evaluaron los tttulos de vector llevando a cabo una PCR de tiempo real en lisados celulares, utilizando el instrumento Light Cycler (Roche Diagnostics, Meylan Francia). Se determino el numero de copias de ADN de VIH-1 totales mediante la deteccion de una secuencia de ADN vmco, localizada en la region LTR U5 (cebadores AASM inverso y M667 directo). Se utilizaron dos sondas de hibridacion para cada ciclo de PCR, una sonda etiquetada con Fluorescema (FL) en el donante de extremo 3' y la otra etiquetada con LightCycler® Red 640 (FC) como un aceptor 5'. La normalizacion a numero de celulas se realizo detectando la secuencia de CD3 (gen constitutivo), con cebadores CD3 en 3' y CD3 en 5' y sondas FL e iFC. Para PCR, se probaron 5 j l de lisado por duplicado para cada condicion, en 15 j l de mezcla de PCR (Jumpstart taq readymix para Q-PCR, Sigma 1X, MgCh 1,9 mM, 1,5 U de polimerasa Taq (Invitrogen), 1,5 jM de cebadores directo e inverso y 0,2 jM de sondas de hibridacion fluorogenicas). Los numeros de copias se determinaron con referencia a una curva patron preparada mediante amplificacion de 102 a 108 de plasmido clonado diluido en lisado de celulas de raton (3T3) con secuencias de correspondencia (U5R y CD3) (Figura 27).
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2.4 Inmunizacion de Macacos
Los macacos se dividieron en cuatro grupos de 2 animales (Tabla A) y se inyectaron de forma subcutanea en 2 puntos con TRIP-SIVmac239 Gag pseudotipificado con la envoltura de VSV-G serotipo Indiana, a 3 dosis diferentes (dosis alta 2,5x108 Unidades de Transduccion (TU), 6863 ng de p24; dosis media 1x108 TU, 2745 ng de p24 o dosis baja 2,5x107 TU, 686 ng de p24) o con TRIP-GFP a la misma dosis de p24 que la dosis alta de TRIP-SIVmac239 Gag (6863 ng de p24).
Para la segunda inmunizacion realizada 87 dfas despues de la sensibilizacion, los animales se inyectaron de forma subcutanea en 4 puntos con un vector pseudotipificado con serotipo de glucoprotema VSV-G sin reaccion cruzada Indiana (VSV-G serotipo Nueva Jersey). Los macacos recibieron 1x108 TU de TRIP-SIVmac239 Gag, 60185 ng de p24 cuando se sensibilizaron con antfgeno GAGdeltamyr, o 60185 ng de p24 de vector TRIP-GFP cuando se sensibilizaron con el antfgeno GFP.
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Tabla A: Reparticion de macacos Cynomolgus utilizados en la prueba de vacunacion de TRIP
Los animales fueron clasificados de acuerdo con el numero de tatuaje y naturaleza/dosis del vector TRIP recibido en la inmunizacion de sensibilizacion.
2.5. Estimulo de SIV mac251
Se estimularon macacos inmunizados y sin exposicion previa (12 macacos en total) por via intrarrectal 57 dfas despues del refuerzo (es decir, 136 dfas despues de la sensibilizacion) con una sola dosis de 500 DIA50 en 1 ml (dosis infecciosa para Animales suficiente para infectar el 50 % de los animales) de SlVmac 251 patogeno (reserva de A.M. AUBERTIN, Universite Louis Pasteur, Estrasburgo, Francia distribuido por ANRS-o reserva equivalente disponible del NIH). Los animales fueron anestesiados con 10 a 20 mg/kg de Ketamina (Imalgene, Rhone-Merieux) y el procedimiento completo se llevo a cabo de acuerdo con las regulaciones y directrices de la Union Europea del Cuidado y Uso de Animales. Despues de la inoculacion, los macacos se alojaron por separado con precauciones de acuerdo con un alojamiento de animales de bioseguridad de Nivel 3.
2.6 ELISPOT de IPN-y
Se anestesiaron animales con 10 a 20 mg/Kg de Ketamina (Imalgene, Rhone-Merieux) para recogida de sangre. Se recogieron 8 ml de sangre para cada macaco en Tubos de Preparacion Celular con Citrato de Sodio (BD Vacutainer™ CPT™) para PBMC y recogida de plasma-citrato y 3 ml en un tubo separador de suero (Vacuette®) para recogida de suero. Despues de la centrifugacion (10 min, 2500 rpm para tubos Vacuette® y 30 minutos, 3000 rpm, sin detencion, para CPT™), y lisis de globulos rojos con 3 a 5 ml de tampon de lisis 1X (tampon de lisis 10X lOtest®, Beckman-Coulter), se sedimentaron PBMC a traves de una centrifugacion de 1600 rpm durante 10 minutos, y posteriormente se enumeraron en una camara de Kova Hycor®, y se distribuyeron a placas ELISPOT de 96 pocillos por triplicado en 2x105 celulas/pocillo, si hubo suficientes celulas disponibles.
Las placas de 96 pocillos con membrana lmmobilon®-P (Fluoruro de Polivinilideno, PVFD) (Sistema de Ensayo de HTS MultiScreen, MSIP; Millipore), se humedecieron previamente (etanol 35 %) y se recubrieron durante la noche a 4 °C con anticuerpo de captura (anticuerpo monoclonal anti- IFN-y humano-de mono IgG1 de raton GZ-4 purificado (Mabtech), 10 pg/ml final en PBS; 50 pl por pocillo). Las placas se lavaron 4 veces en PBS de Dulbecco 1X y se bloquearon con RPMI completo.
Las celulas se volvieron a estimular ya sea mediante la adicion de un conjunto de peptidos (2 ug/ml de cada peptido), SIVmac251 desactivado por AT-2 (5 pg/ml de protemas vmcas totales), o PMA-iono (PMA 0,1 pM e ionomicina 1 pM) como control positivo (4000 celulas/pocillo), o se estimularon de forma simulada con DMSO/RpMI.
Despues de 40 horas, se revelaron las manchas con un anticuerpo conjugado con biotina (anticuerpo monoclonal antiinterferon-y humano-de mono IgG1 7-B6-1 purificado (Mabtech); 1 pg/ml final en PBS 0,5 % FCS;100 pl por pocillo 2 horas a 37 °C), seguido de estreptavidina-AP (1 h, 1/5000 en PBS 0,5 % FCS, 100 pl por pocillo, 1 h, 37 °C) y solucion de sustrato BCIP/NBT (Mezcla lista para utilizarse, 60 pl por pocillo; 15 minutos, Ta , en la oscuridad). Las manchas se numeraron utilizando un Bioreader® 4000 (Biosys, Karben, Alemania). Los resultados se expresaron como celulas formadoras de manchas de IFN-y (SFC) por millon de PBMC. Las SFC de IPN-Y/millon de PBMC que resultan de una estimulacion por DMSO/RPMI al 5 % se restaron de los resultados como una senal de fondo.
2.7 ELISA
La cuantificacion de citocinas innatas (IL6; TNF-a e IFN-a) se llevo a cabo a traves de ELISA utilizando equipos comerciales (equipo de ELISA de IL-6 y TNF-a de mono de U-Cytech Bioscience (Utrech, Pafses Bajos), equipo de IFN-a humano de PBL Biomedical Laboratories (Nueva Jersey, Estados Unidos)). Los plasmas se ensayaron para cada animal 40 dfas antes de la inyeccion de sensibilizacion, 1 hora, 6 horas, 24 horas y 7 dfas despues de la inyeccion de sensibilizacion.
2.8. Ensayo de seroneutralizacion in vitro
Se sembraron celulas P4 en 1x105/pocillo en placa de 96 pocillos en un medio completo 24 horas antes de la transduccion. El dfa de la transduccion, las celulas se cultivaron con TRIP-GFP (pseudotipificadas con un VSV-G serotipo Indiana o con un VSV-G sin reaccion cruzada con Indiana tal como VSV-G de Nueva Jersey) incubadas previamente con diferentes diluciones de plasma. Las celulas se transdujeron de forma simulada con el mismo volumen de medio completo. Setenta y dos horas despues de la transduccion, se evaluo la eficiencia de transduccion analizando la fluorescencia de GFP mediante citometna de flujo utilizando un FACScalibur™ (BD).
2.9 Determinacion de carga vmca
En resumen, se aislo el ARN vmco de citrato-plasma (200 pl en total) con el Equipo de ARN Vmco de Alta Pureza de Roche. La elucion se llevo a cabo en 50 pl de tampon de elucion (libre de nucleasa, esteril, con doble destilado de agua). El numero de SIV-ARN aislado de plasma se determino en una RT-PCR de una unica etapa cuantitativa utilizando el la qRT-PCR Platinum™ de Invitrogen. Se llevaron a cabo reacciones por duplicado en el Mastercycler ep realplex (Eppendorf) en placas de 96 pocillos de ABgene (AB1100) en un volumen final de 25 pl (10 pl de extracto de ARN y 15 pl de Mezcla). Se eligio el metodo de cuantificacion Taqman, con una sonda interna (500 nM final) que contiene los fluoroforos Fam y Tamra respectivamente en 5' y 3'. Los cebadores (450 nM final) estuvieron respectivamente en la posicion 389 y 456 del genoma de ARNm de SlVmac 251 GAG (Tabla B).
La cantidad de copias de ARN vmco, presentada inicialmente, se evaluo mediante extrapolacion de los valores de fluorescencia de umbral en una curva patron interna preparada a partir de diluciones en serie en dH2O de una reserva de virus SIVmac251 titulada previamente mediante la tecnica de “ADN ramificado". Como un control positivo para PCR, se utilizo el plasmido de vector TRIP-SIVmac239 Gag (104 copias/pl).
Tabla B: Secuencias de cebadores y sondas y programa de Taqman RT-PCR utilizado para determinacion de carga vin n l m
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Resultados: la vacunacion de sensibilizacion-refuerzo de vector lentivirico confiere una fuerte proteccion contra estimulo de SlVmac 251 masivo en macacos
Muchos estudios han destacado el importante papel desempenado por linfocitos T CD8+ en controlar la infeccion por VIH y han sugerido que una vacuna efectiva debe inducir respuestas de linfocitos T CD8+ vigorosas, amplias y de larga duracion. Aun asf, varios vectores vmcos que se ha mostrado que provocan respuestas de linfocitos T CD8+ de SIV espedficas no han conseguido posteriormente controlar la viremia en modelos de SlV/macacos (Schoenly, K. A. y Weiner, 2007). Ya que los inventores y otros han demostrado que los vectores lentivmcos son muy potentes para inducir inmunidad celular (revisado por He, Y. y Falo, L. D., 2007 y Breckpot, K, Aerts, J. L. y Thielemans, K., 2007), los inventores han evaluado si pueden conferir inmunidad celular protectora contra infeccion por SIV y SIDA de simios. Optaron por el modelo de infeccion de SIVmac251 de macacos Cynomolgus que presenta niveles de carga vmca y una diversidad de velocidades de progreso similares a las observadas en infeccion por VIH-1 en seres humanos (Karlsson, I. et al., 2007 y Reimann, K.A., et al., 2005).
Se inmunizaron dos veces seis macacos Cynomolgus mediante inyecciones subcutaneas de vectores lentivmcos procedentes de VIH-1 que codifican una protema SIVmac239 GAG no secretada en su secuencia nativa (TRIP-SIVmac239 GAG). Este antfgeno individual y no optimizado se eligio para destacar el potencial del sistema de vector lentivirico para vacunacion. Con el objeto de evitar la presencia de anticuerpos antivector neutralizantes, y por lo tanto permitir un efecto de refuerzo eficiente, se diseno una estrategia de intercambio de envoltura. De hecho, los experimentos de preparacion en ratones habfan mostrado que un regimen de sensibilizacion-refuerzo utilizando partmulas TRIP-SIVmac239 GAG pseudotipificadas con VSV-G procedentes de dos serotipos sin reaccion cruzada, Indiana seguido de Nueva Jersey, fue mas eficiente que una sensibilizacion-refuerzo homologa. Los grupos de inmunizacion y diseno experimental se resumen en la tabla 1 que se encuentra mas adelante.
Fue suficiente una unica inyeccion de vector lentivirico para inducir inmunidad celular robusta en cada animal inmunizado, independientemente de la dosis recibida (Figura 28a) y sin estimular inflamacion sistemica (Figura 28(2)). Las respuestas de linfocitos T espedficas de SIVmac239 GAG alcanzaron un maximo 16 dfas despues de la sensibilizacion, alcanzando una alta frecuencia de celulas que segregan IPN-y (hasta 3000 SFC de IFN-Y/millon de PBMC), y regresaron a niveles de preinmunizacion dos meses despues de la inmunizacion (Figuras 28(1)a y 28(1)b). Ademas de la robustez de la respuesta primaria, tambien se descubrio que estas eran amplias, abarcando varios conjuntos de peptidos (Figura 30(2)a y Tabla 2a). En la cohorte exogamica de los inventores, observaron que las respuestas de IPN-y espedficas de SIVmac239 GAG se digirieron preferentemente contra dos conjuntos dentro de la region C-terminal de g Ag abarcando una parte de p27 CA y p9 NC. Las 6 vacunas montaron una respuesta vigorosa contra el conjunto SIVmac239 GAG: 337-395 y 4 de 6 contra el conjunto SIVmac239 GAG:385-443.
Los animales tambien desarrollaron respuestas humorales neutralizantes contra VSV-serotipo Indiana (Figura 31(2)a), aunque, de manera importante, los sueros de animales vacunados no neutralizaron vectores pseudotipificados con VSV-G Nueva Jersey in vitro (Figura 31(2)b). Por consiguiente los macacos se inyectaron posteriormente con una dosis mediana de partmulas TRIP-SIVmac239 GAG pseudotipificadas con VSV-G Nueva Jersey, 11 semanas despues de la sensibilizacion. Se obtuvo el conjunto completo de peptidos SIVmac239GAG (15 unidades) a traves del Programa de Reactivos de Investigacion y Referencia del SIDA, Division de SIDA, NIAID, NIH.
Las respuestas de linfocitos T espedficas de SIVmac239 GAG se re-estimularon de forma eficiente a traves de la segunda inyeccion (Figura 28(1)a). La magnitud de respuestas se incremento con la cinetica tfpica de respuestas secundarias, es decir una aparicion mas rapida y una persistencia mas duradera. Las celulas que segregan IPN-y se detectaron de forma tan temprana como una semana despues de la segunda inmunizacion y hasta dos meses y mas. El alcance de las respuestas celulares no se mejoro (Figura 30(2)b o Tabla 2b). Para imitar de forma mas cercana las etapas de procesamiento y trafico que ocurren en celulas infectadas para presentacion de antfgenos, pero que se evitan por pulsacion de peptidos, tambien se utilizo como antfgeno SIVmac251 desactivada por A T-2. Se observaron respuestas de debiles (macaco 20089) a fuertes (macacos 20022, 20195 y 20056) (Figura 30(2)d). Las tinciones intracelulares llevadas a cabo 10 semanas despues del refuerzo indicaron que los linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ contribuyeron a la produccion de IPN-y en respuesta a conjuntos de peptidos (datos no mostrados).
Debido a las respuestas inmunes celulares robustas y amplias inducidas por la vacuna, los inventores probaron su eficacia protectora contra infeccion por SIV. Los macacos se expusieron 11 semanas despues del refuerzo mediante inoculacion intrarrectal a una alta dosis de SIVmac251 (500 DIA50) (Tabla 1). Se observaron respuestas espedficas de SIV GAG anamnesicas masivas en la sangre periferica de animales inmunizados poco despues del estfmulo (en una semana) en contraste con animales no vacunados y de control. Estas respuestas alcanzaron maximos de forma mas temprana y mas vigorosa (mas de 4.000 SFC de IPN-y espedficas de SIV GAG/millon de PBMC) (Figura 28). Tambien se documento un rebote mas temprano y mayor de linfocitos T CD8+ totales, vfrgenes y de memoria central, durante la infeccion primaria en animales vacunados en comparacion con los no vacunados y de control (TRIP GFP) (Figura 32(2)). Las regiones GAG mapeadas despues de las inmunizaciones fueron reinvocadas por el estfmulo y tambien se detectaron despues de la infeccion nuevas regiones inmunogenicas. La diversidad de las respuestas espedficas de GAG fue comparable entre animales vacunados y no vacunados o de control (Figura 30(2)c y Tabla 2c).
Aunque el estimulo vmco condujo a infeccion en todos los animales, la inmunizacion confirio una fuerte proteccion contra replicacion vmca y agotamiento de linfocitos T CD4+ de memoria central durante la fase aguda. Los animales de control inyectados con TRIP GFP, tuvieron una evolucion de infeccion muy comparable con macacos no vacunados y por consiguiente se reunieron como un unico grupo. En el plasma de estos animales sin exposicion previa y de control, el pico de la replicacion vmca fue alto con una media de 1,02x107 copias de ARN/ml. Posteriormente disminuyeron las cargas vmcas en los 6 animales no vacunados y de control hasta alcanzar niveles de ARN vmco en plasma de punto de ajuste de leve a moderado (dfas 70 a 154) con una media de 3,44x105 copias de ARN/ml (Figuras 29(1)a y 29(1)c). En contraste, la viremia en el pico de primo-infeccion de los 6 animales inmunizados, fue menor que en animales sin exposicion previa y de control en al menos dos ordenes de magnitud con una media de 9,25x104 copias de ARN/ml (Figuras 29(1)b y 29(1)c). De los 6 macacos vacunados, 4 suprimieron la viremia maxima en mas de 2 log de 10 veces (20022, 20293, 20l58), 2 en mas de 3 log de 10 veces (20293 y 20158) y 1 en mas de 4 log de 10 veces (20195) (Figura 29(1)e). Despues de la resolucion de la viremia maxima, las cargas vmcas disminuyeron y permanecieron persistentemente por debajo de las de animales no vacunados y de control en alrededor de un factor de 10 veces, y estadfsticamente inferiores el dfa 49 posterior a la infeccion (Figura 29(1)c). Cuando se compararon las replicaciones acumulativas durante los primeros 154 dfas de infeccion (expresados como area bajo la curva de carga vmca en funcion del tiempo), el beneficio proporcionado por la vacunacion fue estadfsticamente significativo (Figura 29(1)f).
Los inventores tambien supervisaron la evolucion de linfocitos T CD4+ en la sangre periferica durante el transcurso de la infeccion y mas particularmente los linfocitos T CD4+ de memoria central (CM), debido a que su agotamiento se correlaciona con las cargas vmcas en plasma (Karlsson, I. et al., 2007) y su conservacion durante infeccion SIV aguda y cronica anticipa la supervivencia a largo plazo de monos vacunados, mejor que los niveles de carga vmca de punto de ajuste (Mattapallil, J.J. et al., 2006 y Letvin, N. L., et al., 2006).
Durante la infeccion aguda, hubo una disminucion rapida y profunda de linfocitos T CD4+ en la sangre periferica de los animales vacunados y de CM (Figura 30a). Los recuentos de linfocitos T CD4+ CM permanecieron bajos con signos de agotamiento gradual pira 3 de ellos (21544, 14184 y 20456), en tanto que el agotamiento fue temporal y seguido de un regreso a la medida basal para los otros 3 (15661, 15885 y 14468). Estos dos subgrupos demostraron de forma adicional una viremia postaguda moderada y baja de forma correspondiente, y por consiguiente se clasificaron como animales progresivos (14184- 21544-20456) y no progresivos (15661-15885-14468).
En contraste, los animales vacunados mostraron conservacion completa o unicamente un agotamiento leve de sus linfocitos T CD4+ CM durante la viremia maxima, y todos recuperaron rapidamente sus linfocitos T CD4+ CM, excepto el macaco 20089 (Figuras 30(1)b y 30(1)c).
Todos los animales sin exposicion previa y de control experimentaron una perdida profunda de linfocitos T CD4+ CM y viremia de alto nivel en el maximo de la primo-infeccion, aunque la mitad de ellos recuperaron rapidamente su compartimento de linfocitos T CD4+ CM en tanto que la otra mitad, por el contrario, mostro una lenta disminucion del numero de linfocitos T CD4+ CM. Estos dos subgrupos demostraron una viremia post-aguda de baja a moderada de forma correspondiente y por consiguiente se clasificaron como animales no progresivos (15661-15885-14468) y progresivos (14184-21544-20456). De manera importante, la viremia de animales vacunados en los ultimos puntos temporales, se redujo en alrededor de un factor de 2 log 10 veces cuando se compararon con animales no vacunados progresivos, en tanto que la viremia post-aguda y los recuentos de linfocitos T CD4+ CM fueron similares entre animales vacunados y no vacunados no progresivos (Figuras 29d y 30d).
Se encontraron correlaciones entre respuestas inmunes inducidas por vacunas y cargas vmcas, a pesar de la subevaluacion de respuestas celulares debido a la saturacion de algunos pocillos ELISPOT (Figura 29(2)). De manera importante, hubo una correlacion inversa entre el nivel de viremia maxima y la magnitud de respuestas IFN-y espedficas de GAG medidas 2 semanas despues de la sensibilizacion, 1 semana despues del refuerzo y 1 semana despues de la exposicion (Figuras 32a, 32b y 32c). Estos descubrimientos estan en perfecto acuerdo con los estudios en cohortes grandes de pacientes infectados por VIH-1 que muestran una correlacion entre linfocitos T CD8+ espedficos de VIH61 GAG y cargas vmcas bajas y una lenta evolucion de la enfermedad (Kiepiela, P. et al., 2007). Los inventores tambien han observado una fuerte correlacion entre la conservacion de linfocitos T CD4+ CM y las cargas vmcas durante infeccion aguda (Figura 32d).
En resumen, este estudio proporciona pruebas de que un regimen de vacunacion de sensibilizacion/refuerzo basado en vector lentivmco provoca una inmunidad celular fuerte y amplia en macacos cynomologus y confiere proteccion efectiva contra infeccion por SIVmac251 masiva disminuyendo la viremia y evitando completamente la perdida de linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD4+ CM en el maximo de la primo-infeccion.
Un seguimiento a largo plazo indicara si puede suceder o no un escape vmco de la presion inmune en este cohorte de macaco. Despues de un seguimiento de 5 meses, la estabilidad de los numeros de linfocitos T CD4+ y la tendencia de disminucion de las cargas vmcas en animales vacunados apoyan el control a largo plazo. A pesar de esta primera prueba preclmica aunque en una cohorte limitada de macaco es muy prometedora debido a que la proteccion dependfa unicamente de las respuestas dirigidas contra un antfgeno GAG no optimizado. Los inventores esperan una mejora del control de la replicacion incrementando la expresion de antfgeno y la inmunogenicidad mediante optimizacion de codones (Demi, L. et al., 2001 y zur Megede, J. et al., 2000), y a traves del incremento de la diversidad de las respuestas celulares mediante fusion de otros antigenos de SIV con GAG (Wilson, N. A. et al., 2006 y Hel, Z. et al., 2006). A este respecto se presentan algunos resultados mas adelante en un modelo de raton, y una version optimizada de esta estrategia de vacunacion, con un cumplimiento total de los requisitos tanto de eficacia como de seguridad, entrara por consiguiente en pruebas clmicas de vacunacion terapeutica en seres humanos.
Tabla 1: Grupos de inmunizacion y diseno experimental
Grupo Vacuna Subgrupo n.° de animal Sensibilizacion Refuerzo Estfmulo
Partmulas Partmulas pseudotipificada pseudotipificadas
s con VSV-G con VSV-G
Indiana Nueva Jersey
Dfa 0 Dfa 79 posterior Dfa 76 posterior a la al refuerzo sensibilizacion
Dosis baja 20022, 20089 2,5x107 TU
Vacunado TRIP- Dosis media 20293, 20058 1x108 TU 1,2 108 TU 500 DIA50
SIVmac239 Dosis Alta 20195,20158 2,5x108 TU SIVmac251 n=6 GAG
Control TRIP-GFP 21544,20456 6869 ng de p24 6018 ng de p24 500 DIA50 n=2 SIVmac251
No vacunado Ninguno 15661,14184 ninguno ninguno 500 DIA50 n=4 15885, 14468 SIVmac251
Se incluyeron en la prueba preclmica doce macacos Cynomolgus adultos y macho exogamicos (Macaca fascicularis) de la Isla del oceano fndico de Isla Mauricio. Fueron negativos para SIV, Virus de Herpes B, filovirus, STLV-1, SRV-1, SRV-2, sarampion, hepatitis B-HbsAg y hepatitis B-HBcAb antes de la inclusion en el estudio. Las inmunizaciones, recolecciones de sangre y estfmulo fueron manejadas de acuerdo con las directrices de la Union Europea para experimentos utilizando primates no humanos (decreto N° 2001-486). Las inmunizaciones se realizaron mediante inyecciones subcutaneas el dfa 0 y el dfa 79 de partfculas lentivmcas pseudotipificadas con 2 diferentes envolturas, las glucoprotemas G de 2 serotipos sin reaccion cruzada de VSV, Indiana y Nueva Jersey. La dosis de partfculas de vector lentivmco se expresaron como unidad de transduccion (TU)/animal y ng de p24/animal. Se inmunizaron seis animales con 3 dosis de vectores lentivmcos que codifican una forma no secretada de SIVmac239 GAG (con deficiencia de miristoilacion). Debido a la ausencia de la respuesta de dosis despues de la primera inyeccion, los 6 animales vacunados recibieron la misma dosis de medio de vector para la segunda inyeccion. Dos animales de control se inmunizaron con vector lentivmco que codifica un antfgeno irrelevante, GFP, en la misma dosis de p24 que el subgrupo relevante de alta dosis. Los macacos vacunados, de control y no vacunados se expusieron por via intrarrectal 76 dfas despues del refuerzo a una alta dosis de SIVmac251 patogeno (A-M Aubertin, Universite Louis Pasteur, Estrasburgo, Francia) expresando una protema GAG que corresponde cercanamente a la vacuna (estfmulo homologo). Se eligio una dosis alta de virus (500 DIA50 en comparacion con 20-50 DIA50, normalmente utilizado en estudios de eficacia protectora de vacunas) para limitar el numero de controladores espontaneos5.
Tabla 2: Las respuestas de linfocitos T inducidas por vacuna fueron amplias
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La diversidad y la contribucion relativa de las protemas codificadas por GAG (matriz MA, capsida CA, nucleocapsida NC y p6) a las respuestas de linfocitos T espedficas por GAG inducidas por vacuna, inducidas por virus y reinvocadas por virus, se estudiaron mediante ensayo ELISPOT de IFN-Yen el maximo de las respuestas primarias (dos semanas despues de la sensibilizacion, Tabla Complementaria 1a), una semana despues del refuerzo (Tabla Complementaria 1b) y durante la fase aguda de la infeccion (3 semanas despues del esftmulo, Tabla Complementaria 1c) utilizando 11 conjuntos de peptidos mostrados en la segunda lrnea de las tablas. Las primeras 2 columnas indican el identificador del animal. Los numeros corresponden a SFC de IFN-Y/millon de PBMC. El subrayado indica pocillos de ELISPOT saturados. Los cuadros sombreados con gris claro corresponden a respuestas positivas (>375 SFC de IFN-g/millon de PBMC) y los cuadros sombreados con gris oscuro representan la respuesta mas fuerte en un animal individual. Las columnas de la derecha muestran el numero de conjuntos de peptidos reconocidos por cada animal, mientras que la fila inferior representa el numero de animales de la cohorte que montaron una respuesta contra cada conjunto individual de peptidos.
COMPARACION DE LA RESPUESTA INMUNE OBTENIDA EN RATONES INMUNIZADOS CON UN VECTOR LENTIVIRICO QUE CODIFICA UN ANTIGENO GAG O UNA FORMA CON CODONES OPTIMIZADOS DE DICHO ANTIGENO
1. La optimizacion de codones del polinucleotido que codifica el antfgeno mejora la respuesta de CTL
Se inmunizaron ratones sin exposicion previa (n=3/grupo) i.p. con una sola inyeccion de diversas dosis de TRIP. NI gag delta myr o TRIP.NI LV que codifican una forma con codones optimizados de GAG delta myr (TRIP NI gagAmyrCO). A los 10 dfas despues de la inmunizacion, se evaluaron las respuestas inmune celulares espedficas de GAG contra el epftopo de linfocitos T CD8+ de gag inmunodominante (Figura 33) mediante tincion de tetramero (A) o ELISPOT de IPN-y (B). Los ensayos ELISPOT de IPN-y de celulas formadoras de manchas SFC (C) en respuesta al epftopo inmunodominante de linfocitos T CD8+ y el epftopo de linfocitos T CD4+ de GAG. Los ratones se sensibilizaron 1. p. con 100 ng de TRIP.N gagAmyr LV o TRIP.NI gagAmyr CO LV. 10 dfas despues, los esplenocitos de ratones inmunizados se estimularon con los peptidos correspondientes y se analizaron mediante ensayos ELISPOT. Las frecuencias de fondo se restaron antes de la representacion grafica. Las barras de error representan DT para 3 ratones por grupo. (D) Comparacion de actividades lfticas espedficas de GAG inducidas por inmunizacion de TRIP.NI gagAmyr LV frente a TRIP.NI gagAmyr CO LV. Se midio la actividad CTL 10 dfas despues de la inmunizacion utilizando un ensayo de 20 horas de CTRL in vivo como se describe en la seccion de Materiales y Metodos, se muestra la Media /- DT de tres ratones.
Los resultados obtenidos muestran que la optimizacion de codones mejora de forma crftica la respuesta CTL inducida por vacunas a base de TRIP. NI LV.
2. Partfculas de vector lentivftico que codifican el anftgeno con codones optimizados inducen una respuesta inmune celular fuerte y duradera despues de incluso una unica inyeccion.
Los resultados obtenidos muestran que la optimizacion de codones mejora de forma crftica la respuesta CTL inducida por vacunas a base de TRIP.NI LV.
Las respuestas de linfocitos T de memoria inducidas por vectores lentivfticos de no integracion se ensayaron en ratones, despues de una unica inyeccion de partfculas TRIP.NI gag Amyr o TRIP.NI gag Amyr CO. La Figura 34 muestra que las partfculas de vector lentivftico que codifican el anftgeno con codones optimizados inducen una respuesta inmune celular fuerte y duradera despues incluso de una unica inyeccion.
3. La estrategia de sensibilizacion-refuerzo basada en partfculas TRIP.NI gagAmyr CO pseudotipificadas con una glucoprotema G de serotipos VSV sin reaccion cruzada aumenta la respuesta inmune celular
Los ratones se inmunizaron con partfculas TRIP.NI GAGAmyr CO o TRIP.I GAG de tipo silvestre pseudotipificadas con VSV-G Indiana y 13 semanas despues se reforzaron con partfculas TRIP.NI GAGAmyr CO o TRIP.I GAG de tipo silvestre, respectivamente, pseudotipificadas con VSV-G Nueva Jersey. Los grupos de control para el protocolo de sensibilizacion-refuerzo incluyen ratones inyectados unicamente una vez con partfculas TRIP pseudotipificadas con VSV-G Indiana (diagramas grises) o partfculas TRIP pseudotipificadas con VSV-G New Jersey (diagramas azules). Todos los ratones se sacrificaron 10 dfas despues de la inmunizacion, y se evaluo la respuesta inmune celular contra GAG mediante ELISPOT de IPN-y (A) o tincion de tetramero (B) (Figura 35). Los resultados obtenidos muestran que la optimizacion de codones de las partfculas a base de lentivirus, potencia el regimen de vacuna de sensibilizacionrefuerzo.
Los datos obtenidos en ratones muestran que la optimizacion de codones del polinucleotido que codifica el anftgeno en las partfculas de vector lentivftico, proporciona mejona en el nivel de respuesta inmune celular y especialmente la respuesta de CTL en el hospedador, despues de una sola inyeccion o despues de una inyeccion de sensibilizacionrefuerzo. Ademas, la respuesta obtenida es fuerte y duradera.
COMPARACION DE RESPUESTA INMUNE OBTENIDA EN RATONES INMUNIZADOS A TRAVES DE DIFERENTES VIAS
Se vacunaron varios grupos de dos diferentes tipos de ratones con partfculas de vector lentivftico que codifican SIVmac239GagA. La respuesta inmune provocada se analizo en cada grupo 10 dfas despues de una unica inyeccion de las partfculas, Nevada a cabo ya sea por via intramuscular (i m.), intradermica (i.d.), intraperitoneal (i.p), subcutanea (s.c.) o transcutanea (t.c.i.).
Especialmente la respuesta se analizo en un ensayo de citotoxicidad in vivo (Figuras 36-38) o en un ELISPOT de IFNgamma.
En los grupos de ratones (C57BI/6J), cuando la inyeccion se llevo a cabo a traves de la via intramuscular, se genero una mayor respuesta que cuando la inyeccion se llevo a cabo a traves de otra via.
VECTORES LENTIVIRICOS SIN INTEGRACION PARA SU USO PARA GENERAR RESPUESTA INMUNE CUANDO SE ADMINISTRAN PARA PROTECCION EN UN REGIMEN DE VACUNA
MATERIALES Y METODOS
Cultivo celular y preparaciones de virus
Se cultivaron celulas HeLa (ATCC CCL-2), celulas 293T Humanas y celulas Vero de rinon de mono verde Africano (ATCC CCL-81) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con 10 % (celulas HeLa, celulas 293T) o 5 % (celulas Vero) de suero de ternero fetal desactivado por calor (FCS), penicilina, estreptomicina y Glutamax (GIBCO). Se propago el virus del Nilo occidental (WNV) cepa IS-98-ST1 (numero de referencia GenBank AF 481 864), una variante estrechamente relacionada de la cepa NY9910, en monocapas de celulas AP61 de mosquito Aedes pseudoscutellaris. Se llevo a cabo purificacion en gradientes de sacarosa y titulacion de virus en celulas AP61 (celulas de Aedes pseudoscutellaris) mediante ensayo de inmunodeteccion de focos (FIA) utilizando ftquido ascftico de raton hiperinmune anti-WNV (HMAF) como se ha descrito previamente. Se expresaron tftulos de infectividad como unidades formadoras de focos (UFF).
Produccion de vector lentivftico
Se construyeron plasmidos de vector TRIPs e w n v (Figura 2) y TRIPg f p como se ha descrito previamente (Iglesias et al., J. Gene Med. Mar 2006; 8(3): 265-74). Las secuencias de nucleotidos de estos dos vectores se presentan respectivamente en las Figuras 4 y 5. Se produjeron partfculas vector mediante cotransfeccion de fosfato de calcio temporal de celulas 293T con el plasmido de vector pTRIPsEwnv o pTRIPg f p , un plasmido de expresion de envoltura de VSV-G (pHCMV-G) y un plasmido de encapsidacion (p8.74 o pD64V para la produccion de vectores proficientes en integracion o deficientes en integracion, respectivamente), como se ha descrito anteriormente. La cuantificacion del contenido de anftgeno p24 de partfculas de vector concentradas se llevo a cabo con un equipo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas VIH-1 p24 comercial (ELISA) (Perkin Elemer Life Sciences). Los tftulos de vector de partfculas TRIP.I y TRIP.NI se determinaron transduciendo celulas HeLa tratadas con afidicolina y realizando una PCR cuantitativa como se ha descrito previamente en Iglesias et al., (J Gene Med. Mar 2006; 8(3): 265-74). Los tftulos de vectores lentivfticos de integracion y no integracion fueron similares de acuerdo con el contenido p24 y PCR cuantitativa medida en celulas con crecimiento detenido.
Preparacion de DC procedentes de medula osea
Las celulas de medula osea se aislaron enjuagando femures y tibias de ratones con RPMI complementado con FCS al 10%. Posteriormente las celulas se pasaron a traves de un tamiz de celulas de 45 pm, se centrifugaron y se resuspendieron en solucion de lisado lOTest® 3 (una solucion de lisado de eritrocitos, mezcla de cloruro de amonio, bicarbonato de potasio y acido etilendiamintetracetico (EDTA); Beckman Coulter) y se incubaron a 4 °C durante 5 minutos para lisar globulos rojos. Las celulas se centrifugaron y se cultivaron durante 8 dfas en 1 x106 celulas/ml en un medio de cultivo que consiste en RPMI con FCS al 10 %, L-glutamina, penicilina, estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 10 mM y 2-mercaptoetanol 50 pM complementado con 100 ng/ml de ligando FLT3 de raton recombinante (R&D Systems).
Experimentos de transduccion y analisis de citometna de flujo
Para experimentos de transduccion en celulas sin division, se sembraron celulas HeLa en placas de 48 pocillos a 40.000 celulas/pocillo en presencia de afidicolina 8 pM (Sigma). Las celulas se transdujeron con vectores lentivfticos a una concentracion que vana de 1 a 100 ng/ml, 24 horas despues del bloque de afidicolina, que se relleno en el medio en el momento de la transduccion. A los 2 dfas despues de la transduccion, se recogieron las celulas y se analizo la expresion de eGFP mediante citometna de flujo.
Para experimentos de transduccion de DC, se transdujeron 500.000 DC procedentes de medula osea generadas por FLT3 (FL-DC) el dfa 6 de la diferenciacion, con vectores lentivmcos a una concentracion que vana de 50 a 300 ng/ml. A los 2 d^as despues de la transduccion, se recolectaron FL-DC y se resuspendieron en PBS con FCS al 2 % y azida de sodio al 0,01 % (tampon de tincion). Las celulas se filtraron con un anticuerpo anti-CD11c conjugado por APC (aloficocianina) y un anticuerpo anti-B220 conjugado por PerCP (protema de clorofila peridinina), se lavaron dos veces y se analizaron mediante citometna de flujo en un FACSCalibur™ (BD biosciences, Franklin Lakes, NJ).
Inmunizacion de ratones
Todos los experimentos animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Laboratorio de Cuidado de Animales del Instituto Pasteur (Office Laboratory of Animal Care at the Pasteur Institute). Se inocularon por via intraperitoneal (i.p.) ratones C57/BI6 de seis semanas de edad con diversas dosis de partmulas de vector TRIP/sE WNV (de 1 a 100 ng/ml) en 0,1 ml de solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; pH 7,5) complementado con albumina de suero bovino al 0,2 % tamponada (DPBS/BSA al 0,2 %, Sigma).
Medicion de respuesta de anticuerpo en suero
Se tomaron muestras de sangre de ratones a traves de la ruta periorbital y las muestras de suero fueron desactivadas por calor durante 30 minutos a 56 °C. Se detectaron anticuerpos anti-WNV mediante ELISA, a traves del uso de placas de microtitulacion recubiertas con WNV IS-98-ST1 purificadas con sacarosa. Se utilizo antiinmunoglobulina (H L) de raton de cabra con peroxidasa (Jackson Immuno Research) a una dilucion de 1:4.000 como anticuerpos secundarios. El tftulo de punto final se calculo como el redproco de la ultima dilucion que genera dos veces la densidad optica (DO) del suero de ratones no inmunizados.
Exposicion a WNV
Se llevo a cabo la exposicion a WNV mediante inoculacion i.p. de la cepa de WNV neurovirulenta IS-98-ST1 (i.p. DL 50 = 10 UFF) como se ha descrito anteriormente, ya sea una semana o dos meses despues de vacunacion de vector lentivmco. Los ratones estimulados se supervisaron diariamente con respecto a signos de morbilidad o mortalidad durante hasta 21 dfas despues de la inoculacion de la cepa de WNV.
RESULTADOS
Transduccion de celulas sin division con vectores TRIP deficientes para resultados de integracion en altos niveles de expresion de transgen
Para probar la hipotesis de que LV deficiente en integracion (vectores TRIP.NI) puede ser una herramienta eficiente para suministrar antfgenos (Ag) a APC sin division, tal como DC, los inventores evaluaron inicialmente su eficiencia de transduccion de celulas con crecimiento detenido. Para este proposito, las celulas HeLa tratadas con afidicolina, un inhibidor espedfico del ciclo celular, se expusieron a dosis graduadas de partmulas TRIP.NI o TRIP.I que codifican eGFP. Posteriormente la eficiencia de transduccion se determino mediante citometna de flujo. Como se muestra en la Figura 43 (panel superior), los vectores TRIP.NI transdujeron celulas sin division con alta eficiencia y de una forma dependiente de la dosis. Ademas, el analisis del porcentaje de celulas positivas para eGFP revelo diferencias marginales en las capacidades de transduccion de vectores TRIP.NI en comparacion con la de vectores TRIP.I. La transduccion con partmulas TRIP.NI tambien produjo altos niveles de expresion del transgen (Figura 43, panel inferior) aunque significativamente menores en un factor de 2 veces en comparacion con celulas transducidas mediante TRIP.I.
La transduccion de vector lentivmco sin integracion TRIP conduce a expresion de antfgeno efectiva tanto en celulas dendnticas convencionales como en plasmacitoides
Posteriormente los inventores estudiaron la capacidad de los vectores TRIP.NI de transducir DC. Las DC se clasifican como convencionales (cDC) (CD11c+B220‘) y plasmacitoides (pDC) (CD11c+B220+) y ambos de estos subtipos de DC tienen la capacidad de estimular respuestas inmune espedficas de Ag. Posteriormente los inventores investigaron la transduccion de DC procedentes de medula osea diferenciadas en presencia de Flt3L (FL-DC), que permite la generacion de grandes numeros de pDC y cDC. Se expusieron FL-DC a dosis graduadas de partmulas TRIP.NIg f p o TRIP.I g f p . Como se muestra en la Figura 44A, los vectores tanto TRIP.I como TRIP.NI tuvieron la capacidad de transducir FL-DC con una transduccion de eficiencia maxima de 60 % y 56 % respectivamente. De forma interesante, los inventores observaron que la transduccion con partmulas TRIP.I conduda a una pequena proporcion de DC que expresan altos niveles de eGFP, en tanto que los experimentos de transduccion con TRIP.NI no lo hacen (vease la presencia de puntos en la esquina superior derecha de la transferencia puntual, experimentos donde las celulas se han transducido con los vectores lentivmcos de la invencion en comparacion con vectores Hl). Para descartar la posibilidad de una pseudotransduccion conferida por protemas eGFP residuales que contaminan la reserva de vector, los inventores tambien evaluaron el porcentaje de DC transducidas despues de la exposicion a partmulas sometidas antes a tratamiento con calor, que se ha mostrado que anula las capacidades de transduccion de LV en diferentes tipos de celulas. Como se esperaba, el tratamiento con calor redujo drasticamente el porcentaje de celulas positivas para eGFP (Figura 2A).
Posteriormente los inventores clasificaron celulas dendrfticas CD11c+B220+ y celulas dendrfticas CD11c+B220- para evaluar la capacidad de LV de transducir cada subconjunto de DC. Como se muestra en la Figura 44B, no unicamente cDC procedente de FL sino tambien pDC procedente de FL pueden transducirse eficientemente con LV, independientemente de sus competencias de integracion.
La eficiencia de transduccion con partmulas TRIP.NI, fue dependiente de la dosis y ligera, aunque insignificantemente, menor que la obtenida con partfculas TRIP.I. De forma interesante, los inventores observaron que la transduccion con vectores TRIP.I, conduce a una pequena proporcion de DC que expresan altos niveles del transgen, en tanto que la exposicion de DC a vectores TRIP.NI no lo hizo (Fig. 44A). Esta poblacion celular, que unicamente se observo en experimentos de transduccion con vectores TRIP.I, puede ser la consecuencia de integraciones de multiples vectores o integracion del vector en regiones de transcripcion activa del genoma.
Vectores lentivmcos sin integracion TRIP inducen la produccion de anticuerpos espedficos de Ag
Teniendo en cuenta que TRIP.NI, puede suministrar eficientemente un gen extrano a DC, los inventores exploraron posteriormente su capacidad de montar una respuesta inmune espedfica. En un estudio reciente, los inventores han disenado vectores TRIP.I que codifican una forma secretada de envoltura de WNV (TRIP.IEw n v ) que posee epftopos neutralizantes y han demostrado que TRIP.I Ew n v puede estimular una inmunidad protectora a base de anticuerpos en un modelo de raton de infeccion por WNV. Para investigar la capacidad de vectores TRIP.NI para iniciar una respuesta de linfocitos B, los animales se inmunizaron con diversas dosis de partmulas TRIP.NI Ew n v que vanan de 1 a 100 ng de antfgeno p24 por raton. Como un control, los ratones se inocularon con 100 ng de partfculas TRIP.NI Ew n v desactivadas por calentamiento (Hl) para anular sus capacidades de transduccion. Tres semanas despues de la inmunizacion, se tomaron muestras de sangre de los ratones por via periorbital y se ensayaron sueros individuales o agrupados mediante ELISA para determinar los anticuerpos totales anti-WNV. Como se esperaba, las inmunizaciones con vectores TRIP.NI Ew n v desactivados con calor no estuvieron seguidas de la produccion de Abs (Fig. 45A). En contraste, los ratones inmunizados con una dosis tan baja como 10 ng de vectores TRIP.NI Ew n v presento niveles detectables de anticuerpos anti-WNV e inmunizaciones con 100 ng de sE-NILV indujeron una secrecion masiva de Ig anti-WNV con un tftulo promedio que alcanza 8 x 104.
Posteriormente los inventores compararon la fuerza de la respuesta inmune provocada mediante vectores TRIP.NI Ew n v y TRIP.I Ew n v . Como se muestra en la Fig. 45B, la vacunacion con TRIP.I Ew n v a una dosis tan baja como 3 ng de partfculas genero una secrecion muy alta de anticuerpos anti-WNV y los tftulos fueron relativamente constantes dentro del intervalo de dosis de inmunizacion de 3 a 100 ng, sin respuesta a la dosis evidente. En contraste y de forma contraria a todas las expectativas, los tftulos en suero de ratones inmunizados con vectores TRIP.NI Ew n v fueron proporcionales a la dosis de partmulas inyectadas. Aunque los vectores TRIP.I provocaron una mayor respuesta inmune de vectores TRIP.NI a dosis inferiores a 30 ng, las vacunaciones con 100 ng de cualquiera de los vectores condujeron a una respuesta equivalente.
Tomados juntos, estos resultados demostraron que una unica inmunizacion con vectores TRIP.NI fue suficiente para provocar una respuesta inmune espedfica humoral con una fuerza comparable a la obtenida con vectores TRIP.I, por encima de una dosis umbral de partfculas. De forma interesante y sorprendente, el uso de vectores de no integracion permitio obtener una respuesta inmune, cuya fuerza depende de la dosis de vectores lentivmcos inyectados.
Las inmunizaciones de ratones con una sola dosis de TRIP.NisEwnv proporcionan los siguientes tftulos de anticuerpo.
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Como se muestra en la figura 45A, se puede obtener una potente secrecion de anticuerpos de WNV espedficos, con un tftulo medio que alcanza 8 x 104 a una dosis 100 ng de antfgeno p24. A esta dosis, las inmunizaciones con TRIP.NI condujeron a una respuesta equivalente a la obtenida con TRIP.I. Sin embargo, los experimentos de respuesta a dosis revelaron que la dosis minima requerida para la induccion de una respuesta de linfocitos B fue inferior con partfculas TRIP.I en comparacion con las partmulas TRIP.NI. Una posible explicacion para este resultado puede relacionarse con la capacidad de los vectores TRIP.I para generar una DC que expresa altamente Ag, ya que, en terminos teoricos, los altos niveles de expresion del Ag en DC pueden favorecer una presentacion mas sostenida de peptidos antigenicos y por lo tanto puede explicar por que las bajas dosis de partteulas TRIP.I fueron suficientes para provocar una respuesta inmune espedfica. Esta hipotesis tambien puede explicar la ausencia de linealidad de la produccion de anticuerpo de WNV observada en experimented de inmunizacion de respuesta a dosis con vectores TRIP.I (Fig. 45B). De hecho, los experimented de respuesta a dosis in vitro llevados a cabo en DC revelaron que la aparicion de DC que expresan en gran cantidad Ag, no parecen correlacionarse con la dosis de partteulas TRIP.I (Fig. 44A). Por lo tanto, la capacidad de generar DC que expresan en gran cantidad Ag, puede contribuir a explicar las diferencias observadas entre TRIP.I y TRIP.NI con bajas dosis de partteulas inyectadas. Otra posibilidad esta ligada al hecho de que LV pseudotipificado con VSV-G tiene un gran tropismo celular y, por lo tanto, puede translucir en el sitio de inyeccion otros tipos celulares distintos de DC, incluyendo celulas en division. Esto puede dar como resultado una expresion mas sostenida del Ag en experimentos de vacunacion con partteulas TRIP.I. Que tipos celulares que son transducidos despues de inyecciones in vivo de LV y hasta que punto estan implicados en la magnitud de la respuesta inmune provocada por vectores TRIP.I y TRIP.NI, es el objeto de investigacion en curso.
La inmunizacion con vectores TRIP.NI Ew n v confiere proteccion temprana contra exposicion a WNV
Los inventores han mostrado anteriormente que TRIP.I Ew n v confiere una inmunidad protectora temprana contra una exposicion a WNV. Para determinar si la respuesta inmune provocada por vectores TRIP.NI, tambien puede conducir a una rapida proteccion, se inmunizaron ratones con 100 ng de partteulas TRIP.NI Ew n v y se estimularon 7 dfas despues con 10.000 UFF de la cepa de WNV altamente virulenta IS-98-ST1 (miles de veces la dosis requerida para exterminar el 50 % de los animales infectados). Los inventores tambien incluyeron en este experimento de exposicion, un grupo de ratones inmunizados con 100 ng de TRIP.I Ew n v como un control positivo de proteccion y otro grupo de ratones inoculados con D-PBS como un control negativo. Como se esperaba, todos los ratones que recibieron D-PBS murieron a los 12 despues de la exposicion (Fig. 46). En contraste, todos los ratones inmunizados con una sola dosis de TRIP.NI Ew n v , estaban protegidos de la exposicion, como tambien los ratones inmunizados con TRIP.I Ew n v . Los ratones protegidos de la exposicion a WNV no desarrollaron senales clmicas de enfermedad durante el periodo de observacion de 3 semanas posterior a la exposicion. Estos resultados demostraron que se consiguio una inmunidad protectora temprana contra WNV con una sola administracion de TRIP Ew n v defectuosa para integracion.
TRIP.NI Ew n v induce proteccion de larga duracion
Como se ha demostrado anteriormente, la inmunizacion de ratones con TRIP.I Ew n v dio como resultado el establecimiento de inmunidad protectora a largo plazo contra exposicion a WNV. Para evaluar la duracion de la inmunidad protectora provocada por TRIP.NI Ew n v , y la dosis minima de partteulas requeridas para inducir la proteccion a largo plazo, los ratones se inmunizaron con diferentes cantidades de partteulas (1, 3, 10, 30 y 100 ng de anrtgeno p24) y se expusieron despues de un periodo de espera de 2 meses despues de la inmunizacion. Tal como se muestra en la Figura 47A, hubo una relacion dependiente de la dosis entre la dosis de partteulas TRIP.NI Ew n v administradas y el grado de proteccion, con una proteccion total lograda con una dosis de 100 ng de partteulas de vacuna inyectadas.
Por lo tanto, los vectores TRIP.NI Ew n v indujeron inmunidad de larga duracion contra infeccion por WNV.
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Un resultado importante de los presentes experimentos es la demostracion de que la vacunacion con partteulas TRIP.NI puede proporcionar una respuesta inmune eficiente y fuerte, es decir una respuesta inmune tanto temprana como de larga duracion, y de forma adicional ser dependiente de la dosis de anrtgeno, a pesar de la ausencia de integracion del genoma lentivmco administrado. Por lo tanto, se demostro una proteccion completa contra una exposicion a una dosis letal de WNV.
Como se esperaba, la inmunidad protectora de memoria estuvo directamente correlacionada con el tftulo de anticuerpos anti-WNV inducidos mediante partteulas TRIP.NI (Fig. 45 y Fig. 47). De hecho, esta bien establecido que la inmunidad humoral es un componente importante para el establecimiento de inmunidad protectora total contra WNV, ya que anticuerpos espedficos limitan la diseminacion de la infeccion. De forma intrigante, las partteulas TRIP.NI desactivadas con calor asf como las partteulas HI-TRIP.I tuvieron la capacidad de conferir una proteccion parcial (30 %) contra exposicion a WNV (datos no mostrados), aunque no se detectaron anticuerpos de WNV en los sueros de animales 3 semanas despues de la inyeccion de partteulas HI-TRIP (Fig. 45A, B). Esto sugiere que la inmunidad celular tambien puede desempenar un papel parcial en el establecimiento de proteccion contra WNV. De forma coherente con esta hipotesis, los ratones que carecen de celulas CD8+ tienen una mortalidad incrementada despues de infeccion por WNV (Shoresta y Diamonds, datos no publicados). Ademas, los epftopos de linfocitos T citotoxicos se han definido en el dominio III de la envoltura de varios flavivirus. Se requieren trabajos adicionales para aclarar la contribucion relativa de respuestas CTL a la proteccion a largo plazo conferida por vacunas TRIP.NI y TRlP.I. Tambien se necesitan estudios adicionales para definir los mecanismos moleculares que permiten la entrada de partteulas HI-TRIP en DC, ya que el tratamiento con calor desnaturaliza la envoltura de VSV-G y se ha demostrado que anula las capacidades de transduccion de LV en diferentes lmeas celulares. Sin embargo, es tentador especular que, con respecto a las capacidades de internalizacion excepcionales de DC, se puede incorporar una fraccion de partmulas HI TRIP en DC a traves de un mecanismo independiente de VSV-G, permitiendo una expresion de Ag de bajo nivel aunque suficiente, para explicar la proteccion parcial conferida por partmulas HI-TRIP.
Los experimentos de exposicion cinetica en ratones vacunados revelaron que las vacunas TRIP.NI no unicamente confirieron una inmunidad protectora a largo plazo, sino que tambien provocaron proteccion de forma tan temprana como una semana despues de una unica inyeccion de las partmulas. Aunque aun no se comprenden en su totalidad los mecanismos exactos implicados en esta proteccion temprana, los inventores han detectado anticuerpos de WNV espedficos una semana despues de inmunizaciones con partmulas TRIP.NI y TRIP.I. Los inventores han mostrado previamente que esta oleada temprana de anticuerpos estuvieron compuestos exclusivamente de IgM espedfico procedente de ratones 4 dfas despues la inyeccion, ratones completamente protegidos contra infeccion por WNV.
En el estudio de los inventores, un regimen de vacunacion basado en una inyeccion directa de una sola dosis de partmulas TRIP.NI provoco una respuesta inmune espedfica robusta, rapida y a largo plazo, logrando una proteccion completa contra WNV. Por lo tanto, la estrategia de vacuna a base de TRIP.NI representa una plataforma segura y eficaz para el desarrollo de vacunas contra agentes patogenos tales como flavivirus que requieren inmunidad de linfocitos B.
LA OPTIMIZACION DE CODONES PERMITE MEJORAR LA RESPUESTA INMUNE CELULAR DE VECTORES SIN INTEGRACION. SE OBTIENE UNA MEJORIA ADICIONAL CON UN REGIMEN DE SENSIBILIZACION-REFUERZO
Materiales y Metodos
Tincion intracelular de gag p27. Se transfectaron celulas 293T junto con plasmidos de vector TRIP que contienen ya sea una secuencia tipo silvestre o una secuencia con codones optimizados de gagAmyr, el plasmido de encapsidacion p8.7 D64V y el plasmido de expresion de Indiana VSV-G. 48 horas despues, las celulas se lavaron y permeabilizaron durante 20 minutos en una solucion Cytofix/Cytoperm™ (BD Pharmingen). Despues de dos lavados con tampon PermWash (BD Pharmingen), las celulas permeabilizadas se incubaron con anticuerpo Anti-GAGSIV p27 (55-2F12, Programa de Reactivos de Investigacion y Referencia del SIDA) durante 30 minutos a 4 °C en una dilucion 1:3 en tampon PermWash™. Las celulas se lavaron dos veces y se incubaron con anticuerpo monoclonal lgG2b kappa de rata conjugado por FITC (553988, BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C en una dilucion 1:30 en tampon PermWash™. Despues de dos lavados adicionales, las celulas se analizaron mediante citometna de flujo.
Inmunizacion de ratones. Para experimentos de sensibilizacion, los grupos de ratones se inocularon de forma intraperitoneal con diversas dosis de partmulas TRIP.NI gagAmyr de tipo silvestre o con codones optimizados (CO) pseudotipificadas con glucoprotema de serotipo de VSV Indiana. Para experimentos de sensibilizacion-refuerzo, los grupos de ratones se inocularon por via intraperitoneal con 100 ng de p24 de TRIP.NI gagAmyr con codones optimizados (CO) o 100 ng de p24 de partmulas TRIP.I gagAmyr pseudotipificadas con la glucoprotema de serotipo de VSV indiana. 13 semanas despues, los ratones sensibilizados con partmulas TRIP NI gagAmyr CO se reforzaron con 100 ng de p24 de partmulas TRIP.NI gagAmyr CO pseudotipificadas con la glucoprotema del serotipo de VSV Nueva Jersey. En paralelo, los ratones sensibilizados con partmulas TRIP.I gagAmyr se reforzaron con 100 ng de p24 de partmulas TRIP.I gagAmyr pseudotipificadas con la glucoprotema de serotipo de VSV Nueva Jersey.
Ensayo Elispot. Se recubrieron microplacas de nitrocelulosa (MAHA S4510, Millipore) con anticuerpo de captura (par Elispot IFNg de Raton, BD Pharmingen) y se bloquearon con medio completo compuesto de RPMI 1640 Glutamax complementado con FCS al 10%, antibiotico, Hepes, aminoacidos no esenciales, b-mercaptoetanol y piruvato de sodio. Se agregaron esplenocitos de ratones inmunizados con vector a las placas por triplicado en 0,25x106 celulas/pocillo, y se estimularon con peptidos SlVmac 239 gag (Programa de Reactivos de Investigacion y Referencia del SIDA del NIH). Cuarenta horas despues, las manchas se revelaron con el anticuerpo conjugado con biotina (par Elispot IFNg de Raton, BD Pliarmingen) seguido de estreptavidina-AP (Roche) y solucion de sustrato BCIP/NB (Promega). Las manchas se contaron utilizando un Bioreader® 2000 (Biosys, Karben, Alemania) y los resultados se expresaron como celulas formadoras de manchas (SFC) de IFNg por millon de esplenocitos.
Ensayo citotoxico in vivo. Para la preparacion de celulas objetivo, los esplenocitos de ratones sin exposicion previa se etiquetaron con diversas concentraciones (alta, 5 pM; baja, 1 pM) de CFSE (ester de succinimidilo de carbocifluorescein-diacetato, equipo de seguimiento celular Vybrant c FdA-SE, Molecular Probes). Los esplenocitos etiquetados con altas concentraciones de CFSE fueron pulsados con peptidos en 5 pg/ml. La poblacion de control tenida con bajas dosis de CFSE se incubo en un medio sin peptidos. Cada raton recibio 107 celulas etiquetadas con CFSE de una mezcla que contiene un numero igual de celulas de cada fraccion, a traves de la vena retroorbital. Despues de 15 a 18 horas, se analizaron suspensiones de celulas individuales procedentes de bazo mediante citometna de flujo (Becton Dickinson, software CelIQuest). La desaparicion de las celulas pulsadas con peptidos se determino comparando la proporcion de poblaciones pulsadas (Alta intensidad de fluorescencia de CFSE) con respecto a no pulsadas (Baja intensidad de fluorescencia de CFSE) en ratones inmunizados frente a sin exposicion previa. El porcentaje de exterminacion espedfica se establecio de acuerdo con el siguiente calculo: (1 -((CFSEbajosin exposicion previa/CFSEalto sin exposicion previa)/(CFSEbajo inmunizado/ CFSEalto inmunizado)))*100.
Tincion de tetramero. Se tineron 2x106 esplenocitos de ratones inmunizados a temperature ambiente durante 5 minutes con anti-CD3-FITC (Becton Dickinson), un anti-CD8-APC (Becton Dickinson) y un tetramero-PE especifico de peptido inmunodominante de GAGs i v - Los datos se recogieron utilizando FACSCalibur y se analizaron utilizando CeliQuest.
Conclusion
La presente invencion proporciona una solucion para mejorar la respuesta inmune celular inducida con vectores lentivmcos sin integracion a traves del uso de:
1. Una forma con codones optimizados del transgen que codifica el anrtgeno y/o
2. un regimen de sensibilizacion-refuerzo
1. Los inventores han demostrado que los vectores lentivmcos sin integracion que codifican el anrtgeno de tipo silvestre GAGAmyrsiv, son mucho menos potentes en la induccion de respuestas de linfocitos T espedficas que los vectores lentivmcos de integracion que codifican el mismo anrtgeno. De manera mas importante, los inventores han demostrado que esta deficiente inmunogenicidad puede superarse a traves del uso de una forma con codones optimizados del transgen que codifica GAGAdmyrsiv. La necesidad absoluta de un anrtgeno con codones optimizados con vectores lentivmcos sin integracion para inducir fuertes respuestas de linfocitos T no pudo anticiparse. Este resultado fue inesperado ya que los inventores han demostrado que los vectores lentivmcos sin integracion pueden transducir de forma eficiente celulas sin division y especialmente celulas dendnticas, las celulas presentadoras de anrtgenos mas eficientes, asf como los vectores lentivmcos de integracion. Sin embargo, la expresion de un transgen sin optimizacion de codones fue menor en un factor de dos veces en celulas transducidas con vectores lentivmcos sin integracion o en comparacion con celulas transducidas con vectores lentivmcos de integracion. Este resultado sugirio que in vivo, la respuesta inducida por vectores lentivmcos sin integracion puede ser menos fuerte en un factor de dos veces en comparacion con la respuesta inducida por vectores lentivmcos de integracion y puede anticiparse que la inyeccion de dos veces mas vectores lentivmcos en integracion puede proporcionar respuestas similares a las obtenidas con vectores lentivmcos de integracion. Esto no sucedio en absoluto, ya que las respuestas de linfocitos T espedficas provocadas por vectores lentivmcos sin integracion son de 5 a 10 veces menores que las observadas con vectores lentivmcos de integracion. Ademas, la induccion de respuestas de linfocitos T espedficas con vectores lentivmcos sin integracion puede lograrse unicamente con altas dosis de partteulas inyectadas (la dosis minima requerida para inducir una respuesta de linfocitos T cuantificable con vectores lentivmcos sin integracion es al menos 10 veces mayor que la dosis minima requerida con vectores lentivmcos de integracion). La optimizacion de codones (CO) supera esta deficiente inmunogenicidad. Por lo tanto, a una dosis de 100 ng, los vectores lentivmcos sin integracion que contienen una forma con codones optimizados de gagAmyrsiv indujeron respuestas de linfocitos T de memoria contra el anrtgeno, en tanto que los vectores que contienen la forma de tipo silvestre no lo hicieron. Sin embargo, la respuesta provocada por TRIP.NI gagAmyrsiv CO aun es inferior en un factor de 2 veces a la provocada por TRIP.I gagAmyrsiv de tipo silvestre.
2. Un regimen de sensibilizacion-refuerzo basado en TRIP.N gagAmyrsiv CO provoca una respuesta similar en terminos de intensidad a un regimen de sensibilizacion-refuerzo basado en TRIP.NI gagAmyrsiv de tipo silvestre. En experimentos de sensibilizacion-refuerzo, los ratones se inmunizaron con 100 ng de TRIP.NI gagAmyrsiv CO o 100 ng de TRIP.NI gagAmyrsIv de tipo silvestre. Los vectores lentivmcos se pseudotipificaron con la envoltura de v s v -G Indiana. 13 semanas despues, los ratones inmunizados con partteulas TRIP.NI se reforzaron con 100 ng de partteulas TRIP.NI gagAmyrsiv CO pseudotipificadas con la envoltura de VSV-G Nueva Jersey sin reaccion cruzada. En paralelo, los ratones sensibilizados con partteulas TRIP.I se reforzaron con 100 ng de TRIP.NI gagAmyrsiv de tipo silvestre pseudotipificado con la envoltura de VSV-G Nueva Jersey. El analisis de la respuesta inmune espedfica de gagAmyrsiv (ELISPOT IFNg, tincion de tetramero) llevado a cabo en ratones en esplenocitos de ratones inmunizados revelo que un regimen de sensibilizacion-refuerzo basado en TRIP.NI gagAmyrsiv CO provoca respuestas al menos similares en terminos de amplitud al regimen de sensibilizacion-refuerzo basado en partteulas TRIP.NI gagAmyrsiv de tipo silvestre. Este resultado nunca se ha publicado y no pudo anticiparse ya que una sola inyeccion con partteulas TRIP.NI gagAmyrsiv CO indujo respuestas inferiores en comparacion con una sola inyeccion de partteulas TRIP.NI gagAmyrsiv de tipo silvestre.
USO DE PROTEINA DE ENVOLTURA DE VSV-G DE DIFERENTES SEROTIPOS PARA PSEUDOTIPIFICAR PARTICULAS DE VECTOR LENTIVIRICO
La glucoprotema G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) del serotipo Indiana es una protema de transmembrana habitualmente utilizada como una protema de recubrimiento para construir vectores lentivmcos.
Actualmente, nueve especies de virus estan clasificadas de forma definitiva en el genero de VSV y diecinueve rabdovirus estan clasificados provisionalmente en este genero, mostrando todos diversos grados de neutralizacion cruzada. Cuando se secuencian, los genes de protema G indican similitudes de secuencia. La protema VSV-G presenta un ectodominio N-terminal, una region de transmembrana y una cola citoplasmica C-terminal. Se exporta a la superficie celular a traves de la red transgolgi (retteulo endoplasmico y aparato de Golgi).
Se ha generado un gen con codones optimizados, y se ha clonado entre los sitios BamHI y EcoRI del vector pThV, generando pThV-VSV.G (IND-CO) (Figura 6). La optimizacion de codones para la expresion de las protemas VSV-G en celulas humanas puede estimular la eficiencia de transferencia genica en un factor de 100 veces, como se muestra en el caso del serotipo Nueva Jersey (Figura 20). Los inventores han mostrado de forma adicional que varios serotipos de protemas VSV-G, dentro del contexto espedfico de partmulas de vector lentivmco pseudotipificadas, no inducen anticuerpos de neutralizacion cruzada despues de inyecciones in vivo.
Cuando se requieren serotipos VSV-G adicionales para disenar una combinacion adecuada para su uso en el ensayo de vacunas que incluye al menos una inyeccion de refuerzo, se han probado otros serotipos de VSV-G para recubrir partmulas. El primero utilizado fue el serotipo VSV-GNuevaJersey. Un gen con codones optimizados se ha sintetizado y clonado entre los sitios de BamHI y EcoRI del plasmido pThV, generando el vector pThV-VSV.G (NJ CO) (Figura 7). Actualmente, se han secuenciado otros cinco genes de VSV-G (Chandipura, Cocal, Piry, Isfahan y viremia primaveral de virus de carpa, Figura 3) y se han preparado en una version con codones optimizados.
MATERIALES Y METODOS
1. Materiales
1.1 Plasmidos
Los genes de codones optimizados han sido generados por Gene Art AG (Alemania) para los cinco serotipos VSV-G caracterizados. Los genes se clonaron entre los sitios BamHI y EcroRI del plasmido pThV, generando los siguientes vectores: pThV-VSV.G (CHANDI-CO; Figura 8), pThV-VSV.G (ClOCAL-CO; Figura 9), pThV-VSV.G (PIRY-CO; Figura 10), pThV-VSV.G (ISFA-CO; Figura 11) y pThV-VSV.G (SVCV-CO; Figura 12).
2. Metodos
2.1 Ensayos de neutralizacion cruzada
Se inyectaron por via intraperitoneal en ratones C57BI/6 (haplotipo H2b, con edades de entre 12 y 23 semanas de edad) las partmulas de vector lentivmco pseudotipificadas con los serotipos de VSV-G (Indiana, Nueva Jersey, Isfahan, Cocal y SVCV, 6 ratones por grupo, 450 pl/raton). 4 semanas despues, los ratones se reforzaron con las mismas partmulas (500 pl/raton). Se realiza una primera recogida de sangre retroorbital (en tubos Capiject®) 15 dfas despues del refuerzo y una segunda 21 dfas despues del refuerzo. La sangre se centrifuga 6 minutos a 3500 rpm y el suero se recoge y se mantiene a -20 °C.
Se realizaron ensayos de transduccion en presencia de diversas diluciones de estos sueros.
2.2. Generacion de DC procedentes de monocitos humanos
Se obtuvieron capas leucodticas del Banco de Sangre Frances (EFS-Rungis) con consentimiento informado detodos los sujetos y de acuerdo con directrices eticas. Se aislaron PBMC mediante centrifugacion de densidad de Ficoll. Las celulas monodticas se enriquecen mediante adhesion en placas tratadas con cultivo de tejido. Despues de la etapa de adhesion, las celulas se cultivan en un medio RPMI que contiene FCS 10%, Piruvato 0,1 mM Hepes 1 mM y complementados con granulocito-macrofago rhGM-CSF (50 ng/ml, R&D systems) y rlL-4 (20 ng/ml, R&D Systems). Este medio fue reemplazado con un medio nuevo que contiene rhGM-CSF (50 ng/ml) y rhlL-4 (20 ng/ml) cuatro dfas despues. El dfa 7, las celulas se fenotipificaron y transdujeron con vectores lentivmcos. Dos horas despues de las transducciones se agrego medio RPMI (INVITROGEN) que contiene rhGM-CSF y rhlL-4. Las celulas se recogieron 5 dfas despues de la transduccion y se analizaron mediante citometna de flujo LSR II (Becton Dickinson). La expresion de GFP mediante DCs, fue revisada directamente mediante citometna de flujo en el canal de isotiocianato de fluorescema.
2.3. Analisis fenotfpico de DC procedentes de monocitos humanos
Para analisis fenotfpico, se incubaron DC (1 x106 celulas en 100 pl) durante 5 minutos a temperatura ambiente con anticuerpo anti-CD14, CD86, CD1a y HLA-DR etiquetado con FITC o PE a una concentracion de 0,1 pg/pl (Becton Dickinson). Las celulas tenidas se analizaron mediante citometna de flujo LSR II (Becton Dickinson).
RESULTADOS
1. Evaluacion de capacidades de pseudotipificacion de los diferentes serotipos de VSV-G
Se han generado genes con codones optimizados humanos para los cinco serotipos de VSV-G caracterizados, y se han clonado dentro del plasmido pThV, generando los siguientes vectores: pThV-VSV.G (CHANDI-CO), pThV-VSV.G (COCAL-CO), pThV- VSV.G (PIRY-CO), pThV-VSV.G (ISFA-CO) y pThV-VSV.G (SVCV-CO), (Figuras 8 a 12). Estos plasmidos de envoltura se han utilizado para producciones de partmulas de vector lentivftico, y sus capacidades de pseudotipificacion se han evaluado determinando los tftulos de vector (TU/ml). Como se muestra en la figura 50, ademas de VSV-G Indiana y Nueva Jersey, unicamente tres de las cinco protemas VSV-G, tienen la capacidad de pseudotipificar de forma eficiente partmulas de vector lentivftico de los inventores: los serotipos Cocal, Isfahan y SVCV. Se observa el mejor tftulo con el serotipo Indiana (sin diferencia significativa observada entre la protema de tipo silvestre y la de codones optimizados). Los otros serotipos dan lugar a 54 % (Nueva Jersey), 25 % (Cocal), 22 % (SVCV) y 7 % (Isfahan) del tftulo de Indiana.
Los serotipos de VSV-G tanto Chandipura como Piry dan lugar unicamente al 0,07 % del tftulo de Indiana. Parece que su actividad de fusion muy baja puede evitar su uso efectivo para pseudotipificar las partmulas de vector lentivftico de los inventores, ya que no tendran la capacidad de transducir suficientes celulas diana. Esta baja eficiencia de la protema Chandipura VSV-G puede explicar su carencia senalada en cuanto a la capacidad de reforzar una respuesta inmune dentro del contexto de partmulas del virus de la inmunodeficiencia humana defectuoso en replicacion pseudotipificado por VSV-G (Baliga CS, et al., Molecular Therapy, 2006).
2. Ensayos de neutralizacion cruzada
La caracterizacion de la aptitud de las protemas VSV-G de los inventores para generar anticuerpos de neutralizacion y revisar si estos anticuerpos neutralizan de forma cruzada potencialmente los serotipos de VSV-G heterologos, puede ser de ayuda para decidir un orden preferido en que los vectores pseudotipificados deben inyectarse en pruebas de vacunacion.
Se inyectaron dos veces partmulas de vector lentivftico pseudotipificadas con las protemas VSV-G eficientes (Indiana, Nueva Jersey, Cocal, Isfahan y SVCV) en ratones C57BI/6, con un intervalo de cuatro semanas entre las inyecciones.
15 dfas despues de la segunda inyeccion, se recogio sangre de los ratones y se probo su capacidad de neutralizar partmulas de vector lentivftico pseudotipificadas con diversas protemas VSV- G. Como se muestra en las Figuras 51 y 52, los pseudotipos VSV-G Indiana, Nueva Jersey, SVCV e Isfahan no inducen anticuerpos detectables contra cualquier otra protema VSV-G. Por lo tanto pueden utilizarse en cualquier orden para la primera inyeccion. En contraste, los anticuerpos anti-Cocal inhiben fuertemente las partmulas pseudotipificadas Indiana y SVCV. Por consiguiente, si se utilizan, las partmulas pseudotipificadas Cocal deben utilizarse para la ultima inyeccion, con el objeto de evitar cualquier reaccion de neutralizacion que inhiba el efecto de la vacunacion. En resumen, cuando las diversas protemas VSV-G probadas se utilizan de forma sucesiva en un regimen de sensibilizacion-refuerzo, las combinaciones de partmulas pseudotipificadas tendnan en cuenta, en particular, el hecho que las partmulas pseudotipificadas VSV-G deben inyectarse en el siguiente orden: Indiana - Nueva Jersey - Isfahan - SVCV / Cocal.
3. Prevalencia de anticuerpo en suero de monos v humanos
La presencia en suero humano de anticuerpos que tiene la capacidad de neutralizar las protemas VSV-G debe determinarse antes de utilizarlas para pseudotipificar las partmulas de vector de los inventores. Con el objeto de evaluar la intensidad de las respuestas de neutralizacion que pueden obtenerse con suero humano, primero los inventores decidieron probar sus partmulas pseudotipificadas con las protemas VSV-G seleccionadas en presencia de diversos sueros de monos, obtenidos de animales utilizados en esta prueba. De este modo recogieron suero de cuatro monos (uno no vacunado, tres vacunados con diversas dosis de paiimulas pseudotipificadas con dosis bajas, medias y altas de VSV-G Indiana y reforzados con una dosis unica de partmulas pseudotipificadas de VSV-G Nueva Jersey) en diversos momentos (antes de la inyeccion, despues de la sensibilizacion y despues del refuerzo). Se ha probado la capacidad de estos sueros de mono de neutralizar las partmulas pseudotipificadas con las protemas VSV-G seleccionadas (Indiana, Nueva Jersey, Cocal, Isfahan y SVCV) y los resultados se muestran las figuras 53 a 57, respectivamente. Como se esperaba, se descubrio una fuerte actividad neutralizante contra VSV-G Indiana en sueros de monos que han sido vacunados con partmulas pseudotipificadas Indiana (Figura 53) de una forma dependiente de la dosis, y tambien contra partmulas Nueva Jersey en sueros de monos reforzados con partmulas pseudotipificadas de Nueva Jersey (Figura 54). De este modo se puede ver que una actividad neutralizante homologa se caracteriza por una CI50 de alrededor de 1/1024 de dilucion en suero (se obtiene 50 % de la actividad total con una dilucion en suero de 1/1024). En la figura 55, se puede ver que el mono que ha recibido una alta dosis de partmulas Indiana ha desarrollado espedficamente una actividad neutralizante contra el serotipo VSV-G Cocal (esta respuesta no se observa con dosis inferiores de partmulas Indiana). Sin embargo, no se ha descubierto una actividad neutralizante espedfica contra los serotipos Isfahan ni SVCV en los sueros de monos inmunizados previamente o vacunados (Figura 56 y 57).
La presencia en suero humano de anticuerpos que tienen la capacidad de neutralizar las protemas VSV-G se ha determinado en 96 sueros humanos seleccionados de forma aleatoria. Se realizaron experimentos de transduccion con partmulas de vector lentivftico pseudotipificadas con las protemas VSV-G seleccionadas, en presencia de suero humano (calentado y no calentado). Los resultados resumidos en la Figura 58 (los detalles de los experimentos se muestran en la Figura 59) muestran que los sueros de algunos pacientes presentaron fuertes actividades neutralizantes contra protemas VSV-G (2 pacientes contra Indiana, 4 contra Nueva Jersey y 3 contra Cocal). Con el objeto de determinar si esta actividad neutralizante es homologa o no espedfica, estos pacientes se investigaron de forma adicional y se realizaron ensayos de transduccion de partmulas pseudotipificadas con diferentes VSV-G en la presencia de diluciones en serie de estos sueros. Como se muestra en la Figura 60, los pacientes que presentaron una actividad neutralizante contra VSV-G Indiana en presencia de una dilucion de 2 veces de su suero (pacientes n.° 39, 47, 54, 83, 94 y 99) no mostraron esta actividad de neutralizacion mas en un factor de dilucion adicional. Se puede realizar la misma observacion con los pacientes que mostraron previamente actividad neutralizante contra la protema Nueva Jersey VSV-G (pacientes n.° 7, 9, 63, 70, 84 y 88), la protema G-VSV de SVCV (pacientes 10, 78, 94, 39, 84 y 98) y la protema Isfahan VSV-G (pacientes n.° 10, 78, 9, 94, 70, 84 y 98). En contraste, de los pacientes que presentan actividad neutralizante contra la protema Cocal VSV-G (pacientes n.° 9, 57, 67, 80, 88, 54, 62, 69, 83 y 93), dos aun presentaron una actividad neutralizante a altas diluciones de suero (pacientes n.° 67 y 69) con una CI 50 alrededor de 1/512 de dilucion de suero. Estos resultados indican que puede tener que determinarse una prevalencia anti-Cocal en los pacientes, si el serotipo Cocal se utiliza para pseudotipificar las partmulas de vector lentivmco de los inventores.
4. Transduccion de celulas dendriticas derivadas de monocitos humanos con particulas de vector pseudotipificadas con diferentes envolturas de VSV-G
En un protocolo de vacunacion propuesto de la invencion, el vector lentivmco pseudotipificado con el pseudotipo Indiana VSV-G, se inyecta primero para sensibilizar la reaccion inmunologica. Con el objeto de reforzar la reaccion inmunologica, se utiliza un vector lentivmco pseudotipificado con uno de los serotipos VSV-G descritos anteriormente para la segunda inyeccion de partmulas de vector lentivmco. Las celulas dendriticas desempenan un papel central en inmunidades innatas y de adaptacion. De este modo los inventores han caracterizado la capacidad de particulas de vector pseudotipificadas mediante diferentes protemas VSV-G para fusionarse con DC humanas. Por consiguiente, las celulas dendriticas procedentes de monocitos humanos (mDC) se transdujeron con vectores lentivmcos pseudotipificados con diversas protemas VSV-G (Nueva Jersey, Isfahan, SVCV, Cocal o Chandipura), lo que conduce a la determinacion de los tftulos (TU/ml) para las diferentes particulas, lo cual se correlaciona directamente con la fusogenicidad de cada VSV-G. Ademas, el tftulo de las particulas de vector, realizado clasicamente en celulas 293T, tambien se caracterizo para establecer el tftulo relativo de transduccion (tftulo DC/tftulo 293T). Los experimentos demostraron que todas las envolturas VSV-G probadas presentaron una capacidad relativa de fusionarse con mDC con la excepcion notable del serotipo Chandipura de VSV-G (Figura 61). VSV-G Indiana parece ser la envoltura mas fusogenica en comparacion con las otras probadas. Sin embargo, VSV-G Nueva Jersey, Isfahan, SVCV y Cocal tambien presentan una buena capacidad de fusionarse con mDC. Considerando las diferentes envolturas, los datos proporcionados (Figura 61) por 2 diferentes experimentos mostraron el mismo patron de fusogenicidad, cualquiera que fuera el valor de tftulo relativo (tftulo DC/tftulo 293 T). Esto se debe a la diferencia en el estado fisiologico de las mDCs utilizadas al momento de la transduccion.
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Claims (41)

REIVINDICACIONES
1. Una combinacion de compuestos para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico de una infeccion por un Virus de la Inmunodeficiencia en donde los compuestos se administran secuencialmente a un hospedador mairnfero, para provocar una respuesta inmunitaria celular espedfica protectora contra dicha infeccion, que comprende al menos: (i) partmulas de vector lentivmco, pseudotipificadas con una primera protema glucosilada (G) determinada de un Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV);
(ii) partmulas de vector lentivmco, pseudotipificadas con una segunda protema VSV G determinada diferente de dicha primera protema VSV G determinada;
en donde dicha partmula de vector lentivmco de (i) y (ii) comprende en su genoma un polinucleotido recombinante que codifica uno o varios polipeptidos que comprenden al menos un antigeno procedente de un antigeno GAG de dicho Virus de la Inmunodeficiencia y; en donde dichas primera y segunda protemas VSV G son respectivamente VSV-G de la cepa de Indiana y VSV-G de la cepa de Nueva Jersey,
y, opcionalmente:
(iii) partmula de vector lentivmco, pseudotipificada con una tercera protema VSV G determinada, en donde dicha tercera protema VSV G no sero-neutraliza con dichas primera y segunda protemas VSV G.
2. Una combinacion de compuestos para su uso segun la reivindicacion 1, en donde el polinucleotido recombinante del genoma de la partmula de vector no codifica una poliprotema POL activa biologicamente.
3. Una combinacion de compuestos para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dichas primera y segunda y, si existiera, dicha tercera protemas VSV G se originan de virus de diferentes serotipos, y se seleccionan en particular entre protemas VSV G expresadas por los plasmidos depositados en el CNCM como pThV-VSV.G (IND-CO) CNCM I-3842 o como una version alternativa de pThV-VSV.G (IND-CO), CNCM I-4056, pThV-VSV.G (NJ-CO) CNCM I-3843 o como una version alternativa de pThV-VSV.G (NJ-CO) CNCM I-4058, o pThV-VSV.G (COCAL-CO) CNCM I-4055, pThV-VSV.G (ISFA-CO) CNCM I-4057, y pThV-VSV.G (SVCV-CO) CNCM I-4059.
4. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde al menos una de las primera y segunda protema(s) VSV G es (son) recombinantes y dicha protema(s) VSV G recombinante(s) comprenden el determinante de exportacion YTDIE de la VSV-G de una cepa de serotipo de Indiana, y en donde, si esta presente, dicha tercera protema VSV G es recombinante y dicha protema VSV G recombinante comprende el determinante de exportacion YTDIE de la VSV-G de una cepa de serotipo de Indiana.
5. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde uno o varios vectores lentivmicos se pseudotipifican con protema(s) VSV G que esta(n) mutada(s), especialmente por sustitucion, adicion o supresion de uno o varios restos de aminoacidos con respecto a protema(s) VSV G nativas determinadas de referencia, o se modifica(n) para aumentar su glucosilacion, o para aumentar su capacidad de expresion o su capacidad de captacion por las partmulas lentivmcas.
6. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde la mutacion de la protema VSV G afecta a uno o varios restos de aminoacidos del dominio transmembrana de VSV-G.
7. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las primera y segunda protema(s) VSV G son diferentes y estan codificadas por una molecula de acido nucleico comprendida en el plasmido pThV-VSV-G (IND-co) depositado con el numero I-3842 o una variante del mismo depositada con el numero I-4056, o en el plasmido pThV-VSV-G (NJ-co) depositado con el numero I-3843 o una variante del mismo depositada con el numero I-4058.
8. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las primera o segunda protema(s) VSV G esta(n) codificadas por la molecula de acido nucleico que comprende la secuencia de la figura 6 o 7, o en donde las primera y segunda protemas de envoltura son diferentes y tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las representadas en las figuras 6 o 7.
9. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la tercera o adicional(es) protema(s) VSV G se selecciona(n) entre la protema(s) codificada por una molecula de acido nucleico o que tiene una secuencia de aminoacidos representada en las figuras 6 a 13 o 14 a 18.
10. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el vector lentivmco pseudotipificado es un vector basado en lentivirus humano.
11. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10 en donde el vector lentivmco pseudotipificado es un vector basado en VIH.
12. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en donde las partmulas de vector lentivmco pseudotipificado son vectores lentivmcos incompetentes para replicacion.
13. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, en donde las partmulas de vector lentivmco pseudotipificado son vectores lentivmcos incompetentes para integracion.
14. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el genoma de vector lentivmco comprende un ala de ADN lentivmco funcional de VIH-1.
15. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde:
- la secuencia de 3' LTR del genoma de vector lentivmco esta desprovista de al menos el activador (potenciador) de la region U3, en particular en donde la 3' LTR esta desprovista de la region U3 o tiene una supresion de parte de la region U3; y/o
- la region U3 de la LTR5' es reemplazada por una U3 no lentivmca o por un promotor adecuado para conducir la transcripcion primaria independiente de tat.
16. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el genoma de vector lentivmco comprende las siguientes secuencias:
1. una 5' LTR, opcionalmente en donde la secuencia de U3 dependiente de tat que conduce la transcripcion del genoma se reemplaza por una secuencia promotora;
2. una senal de encapsidacion psi (^);
3. una secuencia de elemento de respuesta a Rev (RRE);
4. una secuencia de ala de ADN insertada cadena arriba del antigeno, y preferentemente localizada en una posicion aproximadamente central en el genoma del vector;
el antfgeno bajo el control de un promotor, en particular un promotor de Citomegalovirus (CMV);
5. opcionalmente, una secuencia de Elemento Posterior a la Respuesta del virus de la hepatitis B de la marmota (WPRE); y
6. una region 3' LTR, desprovista de la region U3.
17. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el vector de genoma lentivmco de dichas partmulas de vector lentivmco se obtiene del plasmido pTRIPAU3.CMV-GFP depositado en el CNCM con el numero I-2330, el 11 de octubre de 1999, o de pTRIPAU3.CMV-SIV-GAGco-WPRE depositado en el CNCM con el numero I-3841, el 10 de octubre de 2007, o de pTRIPAU3.CMV-SIV-GAG-WPRE depositado en el CNCM con el numero I-3840, el 10 de octubre de 2007 mediante reemplazo de la GFP o de la secuencia codificante de SIV-GAG, mediante un antfgeno procedente de VIH-GAG.
18. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el polinucleotido codifica un antfgeno procedente de un antfgeno de GAG de VIH-1.
19. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el polinucleotido codifica un antfgeno procedente de GAG de un virus de la inmunodeficiencia y tiene la secuencia de aminoacidos de los antfgenos GAG naturales entre la poliprotema GAG o la protema de la Matriz o la protema de la Capsida o la protema de la nucleocapsida, o es un fragmento de dicha poliprotema o de dicha protema de la Matriz, la Capsida o la nucleocapsida, o es un antfgeno GAG que se modifica con respecto al antfgeno GAG natural, especialmente mediante mutacion, incluyendo mediante supresion, sustitucion o adicion de uno o varios restos de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos, o que se modifica mediante modificaciones postraduccionales, seleccionandose el antfgeno GAG modificado para ser biologicamente funcional o biologicamente no funcional.
20. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el polinucleotido recombinante codifica un polipeptido biologicamente no funcional que procede de un antfgeno GAG de VIH o de SIV o de FIV en donde dicho polipeptido no permite la formacion de pseudopartfculas de GAG o pseudopartfculas de GAG-POL de celulas transducidas con los vectores lentivmcos.
21. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el antfgeno procedente de GAG es una protema GAGAmyr que esta desprovista de miristilacion.
22. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde el antfgeno procedente de GAG tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 21, 26 o 38.
23. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el polinucleotido que codifica la poliprotema GAG o un polipeptido procedente de la misma es expresado por una secuencia de nucleotidos con codones optimizados para permitir la traduccion mejorada en celulas de mamffero, especialmente en celulas humanas con respecto a la secuencia de nucleotidos del gen nativo.
24. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el polinucleotido recombinante codifica ademas un polipeptido seleccionado entre polipeptidos procedentes de un antigeno NEF, un antigeno TAT, un antigeno REV de un Virus de la Inmunodeficiencia, un antigeno POL de un Virus de la Inmunodeficiencia o una combinacion de los mismos.
25. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el polinucleotido recombinante codifica una protema de fusion que comprende el antigeno procedente de GAG que tiene la secuencia de la figura 21, el antfgeno procedente de POL que comprende o tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 21, y el antfgeno procedente de NEF que comprende o tiene la secuencia de aminoacidos desvelada en la figura 21, en donde la protema de fusion tiene una de las siguientes estructuras: 5' GAG POL NEF 3', o 5' POL NEF GAG 3' o 5' POL GAG NEF 3', o 5' NEF GAG POL 3' o 5' NEF POL GAG 3' o 5' GAG NEF POL 3'.
26. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en donde dichos vectores lentivmcos (i) y/o (ii) se formulan en una composicion que esta desprovista de un adyuvante de la respuesta inmunitaria.
27. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que comprende ademas un agente inmunomodulador.
28. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde dichos vectores lentivmcos se formulan en composiciones adecuadas para inyeccion a un hospedador.
29. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde dichos vectores lentivmcos se formulan en composiciones adecuadas para inyeccion subcutanea.
30. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para su uso en un regimen de administracion que abarca sensibilizar la respuesta inmunitaria y posteriormente reforzar la respuesta inmunitaria en un hospedador mamffero, en donde dicho (i) vector lentivmco pseudotipificado con dicha primera protema VSV G se administra separado en el tiempo de dicho (ii) vector lentivmco pseudotipificado con dicha segunda protema VSV G y, si existen, de dichos (iii) vectores lentivmcos pseudotipificados don dicha tercera protema VSV G, administrandose cada uno de dichos vectores lentivmcos (i) y (ii) y, si existen, (iii) para sensibilizacion o para refuerzo de la respuesta inmunitaria.
31. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 30, en donde el vector lentivmco, pseudotipificado con la protema VSV-G de la cepa de Indiana se usa para sensibilizar y el vector lentivmco, pseudotipificado con la protema VSV-G de la cepa de Nueva Jersey se usa para reforzar, o en donde el vector lentivmco, pseudotipificado con la protema VSV-G de la cepa de Nueva Jersey se usa para sensibilizar y el vector lentivmco, pseudotipificado con la protema VSV-G de la cepa de Indiana se usa para reforzar.
32. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, para el tratamiento terapeutico de hospedadores humanos infectados con un Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH).
33. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, para el tratamiento terapeutico de hospedadores humanos infectados con VIH-1 o VIH-2.
34. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, para el tratamiento profilactico de hospedadores humanos contra infeccion por un Virus de la Inmunodeficiencia Humana.
35. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, para el tratamiento profilactico de hospedadores humanos contra infeccion por VIH-1 o VIH-2.
36. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, para su uso en un protocolo terapeutico que comprende tambien la administracion de farmaco(s) qmmico(s) antirretrovmco(s) que previenen la replicacion del retrovirus.
37. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, para su uso en un protocolo terapeutico que comprende tambien la administracion de farmaco(s) qmmico(s) antirretrovmco(s) que previenen la replicacion de retrovirus seleccionados entre inhibidor(es) de la transcriptasa inversa (RT) retrovmca e inhibidor(es) de la proteasa retrovmca.
38. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 37, en donde uno o varios inhibidores de la transcriptasa inversa retrovmca y uno o varios inhibidores de la proteasa retrovmca se usan para administracion.
39. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 37 o 38, para su uso simultaneamente en el tiempo con farmacos antirretrovmicos.
40. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en donde la administracion de dichos compuestos se prolonga despues de haberse detenido la administracion de farmaco(s) antirretrovmco(s) o en donde la administracion de farmacos antirretrovrncos se interrumpe varias veces durante un periodo de tiempo determinado durante la administracion de dichos compuestos.
41. Una combinacion de compuestos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39 en un regimen de administracion que abarca sensibilizar la respuesta inmunitaria y posteriormente reforzar la respuesta inmunitaria en un hospedador mairnfero,
- para controlar la viremia despues de exposicion a o despues de infeccion por retrovirus, especialmente un VIH, y en particular limitar o reducir la carga vmca en el hospedador; y/o
- para la induccion de inmunidad celular protectora contra el retrovirus especialmente VIH en un hospedador; y/o - para la proteccion contra replicacion vmca despues de exposicion a o infeccion por el retrovirus VIH, y/o - para la proteccion contra el agotamiento de la respuesta de linfocitos T CD4+ de Memoria Central, especialmente en la fase aguda de la infeccion por el retrovirus, especialmente VIH; y/o
- para la conservacion de la respuesta de linfocitos T CD4+ de Memoria Central, especialmente en la fase cronica de la infeccion por el retrovirus, especialmente VIH; y/o
- para el rebote mas temprano y/o mas alto de la respuesta de linfocitos T CD8+ de Memoria Central y sin exposicion previa durante infeccion primaria por el retrovirus, especialmente VIH; y/o
- para la prevencion contra escape vmco de presion inmunitaria permitiendo de este el control a largo plazo de la infeccion por el retrovirus, especialmente VIH.
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