JP2022536364A

JP2022536364A - 操作されたヒト内在性ウイルス様粒子および細胞への送達のためのその使用方法

Info

Publication number: JP2022536364A
Application number: JP2021573607A
Authority: JP
Inventors: ジョウン，ジェイ．キース; ケイブセイラス，ピーター
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2022-08-15
Also published as: EP3982989A4; WO2020252455A1; EP3982989A1; US20240011049A1; US20240011050A1; CA3143327A1; CN114258398A; US20240018544A1; US20220259617A1

Abstract

ヒト由来のウイルス様粒子（ｈｅＶＬＰ）であって、外側に、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のエンベロープタンパク質を有するリン脂質二重層を含む膜、膜の内側のｈｅＶＬＰコアに１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＧＡＧタンパク質、およびｈｅＶＬＰのコアに配置されたカーゴ分子、例えば、生体分子および／または化学カーゴ分子を含み、ヒトゲノムにおいてコードされるｇａｇタンパク質またはヒトゲノムに見出されるｇａｇタンパク質に由来するコンセンサス配列によってコードされるｇａｇタンパク質を除いて、ｇａｇタンパク質を含まないｈｅＶＬＰ、ならびに細胞へのカーゴ分子の送達のためのその使用方法。

Description

優先権主張
本出願は、２０１９年６月１３日に出願された、米国特許出願第６２／８６１，１８６号明細書の権利を主張するものである。上述の内容全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

連邦政府により資金援助された研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から交付された助成金番号ＧＭ１１８１５８に基づく政府の支援により行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。

技術分野
本明細書において、操作されたヒト内在性ウイルス様粒子（ｈｅＶＬＰ）であって、外側にリン脂質二重膜を含む膜、および膜の内側のｈｅＶＬＰのコアに配置されたカーゴ、例えば生体分子および／または化学カーゴを含み、非ヒトｇａｇまたはｐｏｌ由来のタンパク質を含まないｈｅＶＬＰ、ならびに細胞へのカーゴの送達のためのその使用方法を記載する。

タンパク質、核酸、および／または化学物質等のカーゴを生細胞のサイトゾルに送達することは、生物学的療法の開発において重要な課題となっている。

本明細書において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、化学化合物および／または分子、およびこれらの４つの実体の任意の組合せをパッケージングし、真核細胞に送達することができるｈｅＶＬＰが記載されている。本明細書に記載されている非ウイルスｈｅＶＬＰシステムは、従来の人工的に得られる脂質／金属ナノ粒子およびウイルス粒子ベースの送達システムよりも単純で、より効率的かつより安全である可能性があり、これは、ｈｅＶＬＰがヒト由来の構成要素から構成されているためである。内部のカーゴは、ヒト由来であってもまたはそうでなくてもよいが、ｈｅＶＬＰは、完全にヒトおよび合成非免疫原性構成要素によって構成されている。「合成」構成要素は、免疫刺激性でないことが示されており、ｈｅＶＬＰの標的化および細胞取り込みを増強するのに使用し得る表面ｓｃＦｖ／ナノボディ／ダーピン（darpin）ペプチドを含む。これは、粒子の外部表面が有意に免疫刺激性である構成要素を欠いていることを意味しており、これは、これらの粒子の免疫原性および抗体中和を最小化するものである。カーゴを除けば、ｈｅＶＬＰは、他のＶＬＰに固有の外来性のウイルス構成要素を含まず、このことは、技術の顕著および新規の進歩を表している。さらに、ｈｅＶＬＰは、化学ベースの二量体化因子（dimerizer）を利用することができ（必要ではない）、ｈｅＶＬＰは、治療剤または診断剤を含むカーゴ分子、例えば生体分子および化学物質、例えば特殊一本および／または二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド、ミニサークル、閉環直鎖ＤＮＡ、ＡＡＶＤＮＡ、エピソーム、バクテリオファージＤＮＡ、相同組換えテンプレート等）、一本および／または二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡ、プライム編集ガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ＲＮＡレプリコン、環状または直鎖スプライシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、ｐｉｗｉ－相互作用ＲＮＡ、ｔｏｅｈｏｌｄスイッチＲＮＡ、ＲＮＡ結合タンパク質が結合し得るＲＮＡ、バクテリオファージＲＮＡ、内部リボソーム侵入部位含有ＲＮＡ等）、タンパク質、化学化合物および／または分子（例えば、低分子）、および上記に列挙したカーゴの組合せ（例えば、ＡＡＶ粒子）をパッケージングおよび送達する能力を有する。

本明細書に記載のｈｅＶＬＰは、従来のレトロウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、エキソソーム、および以前に報告されている、カーゴを導入し得る他の細胞外小胞とは異なっており、これは少なくとも、ｈｅＶＬＰが、ヒト細胞におけるヒト由来の構成要素の戦略的な過剰発現によって産生することができ、ｈｅＶＬＰが、広範にわたる可能なカーゴおよび導入戦略を有し、ｈｅＶＬＰが、限定的なＤＮＡ／ＲＮＡ長さ制約を欠いており、ｈｅＶＬＰが、ｐｏｌおよび外来性ｇａｇ由来のタンパク質を欠いており、ｈｅＶＬＰが、特有の細胞進入機構を有しているためである。

本明細書において、多くの疾患療法に適用可能な、種々のタンパク質および核酸分子と共に使用し得るカーゴ送達のための組成物および方法、例えばゲノム編集、エピゲノム調節、トランスクリプトーム編集およびプロテオーム調節試薬が記載されている。

したがって、本明細書において、外側に、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＥＮＶ／糖タンパク質（例えば、ｈｅＶＬＰ産生細胞において、外来供給源、例えばプラスミドまたは安定的に組み込まれた導入遺伝子から過剰発現される）（例えば、表１に示す）を有するリン脂質二重層を含む膜、および膜の内側のｈｅＶＬＰのコアに配置されたヒト内在性ＧＡＧタンパク質、他の細胞膜動員ドメイン、および／または生体分子／化学カーゴを含む、操作されたｈｅＶＬＰが提供され、生体分子カーゴは、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメイン（例えば表６に示す）と融合していてもしていなくてもよく、ｈｅＶＬＰは、非ヒトｇａｇおよび／またはｐｏｌタンパク質を発現せず、ヒトゲノムにおいてコードされるｇａｇタンパク質またはヒトゲノムに見出されるｇａｇタンパク質由来のコンセンサス配列によってコードされるｇａｇタンパク質を除いて、ｇａｇおよび／またはｐｏｌタンパク質を発現しない。ヒト由来のＧＡＧまたは生体分子カーゴと融合した他の細胞膜動員ドメインは、ｈｅＶＬＰ産生細胞において、外来供給源、例えばプラスミドまたは安定的に組み込まれた導入遺伝子から過剰発現することができる。

いくつかの実施形態において、ＨＥＲＶＥＮＶは、切断されていてもよく、またはｓｃＦｖもしくは他の標的化ポリペプチドと融合していてもよい。

いくつかの実施形態において、ＨＥＲＶＧＡＧは、細胞膜動員ドメイン（例えば表６に示す）と融合していてもよい。

他の実施形態において、操作されたｈｅＶＬＰは、外側に１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＥＮＶ／糖タンパク質（例えば、ｈｅＶＬＰ産生細胞において、外来供給源、例えばプラスミドまたは安定的に組み込まれた導入遺伝子から過剰発現される）（例えば、表１に示す）有するリン脂質二重層を含む膜；および粒子内部に、所望によって細胞膜動員ドメイン（例えば、表６に示す）；および所望によって生体分子／化学カーゴを含む。

また、カーゴとして生体分子および／または化学物質を含む、請求項１のｈｅＶＬＰと細胞を接触させることによって、カーゴを標的細胞、例えばインビボまたはインビトロの細胞に送達する方法が提供される。

さらに、本明細書において、生体分子カーゴを含むｈｅＶＬＰを産生する方法が提供される。前記方法は、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のエンベロープタンパク質（例えば、表１に示す）およびカーゴを発現する（例えば、発現または過剰発現するように操作された）細胞であって、ヒトゲノムにおいてコードされるｇａｇタンパク質またはヒトゲノムに見出されるｇａｇタンパク質に由来するコンセンサス配列によってコードされるｇａｇタンパク質を除いて、ｇａｇおよび／またはｐｏｌタンパク質を発現しない細胞を用意すること；および細胞がｈｅＶＬＰを産生するような条件下で細胞を維持することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、産生されたｈｅＶＬＰを回収し、場合によって精製および／または濃縮することをさらに含む。

また、本明細書において、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のエンベロープタンパク質（例えば、外来供給源、例えばプラスミドまたは安定的に組み込まれた導入遺伝子から過剰発現される）（例えば、表１に示す）、およびヒト内在性または他の細胞膜動員ドメインと融合したカーゴ（例えば、表６に示す）を組み合わせて発現する、例えば過剰発現するように誘導された細胞（例えば、単離細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）であって、ヒトゲノムにおいてコードされるｇａｇタンパク質またはヒトゲノムにおいて見られるｇａｇタンパク質に由来するコンセンサス配列によってコードされるｇａｇタンパク質（外来供給源、例えばプラスミドまたは安定的に組み込まれた導入遺伝子から過剰発現される）を除いて、ｇａｇタンパク質を発現しない細胞が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、初代のまたは安定的なヒト細胞株、例えば、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはＢｅＷｏ細胞である。前記細胞は、本明細書に記載するようにｈｅＶＬＰを産生するために使用し得る。

いくつかの実施形態において、前記方法は、ＨＥＲＶエンベロープ以外の任意の外来性タンパク質（例えば、表１に示す）および所望により細胞膜動員ドメイン（例えば表６に示す）を発現するように操作された、またはされていない細胞を使用することを含む。本実施形態において、産生される「空」の粒子は、カーゴと混合された精製粒子のヌクレオフェクション、脂質、ポリマー、またはＣａＣｌ_２トランスフェクション、超音波処理、凍結融解および／または熱ショックを使用することによって、生体分子または化学分子カーゴを担持し得る。全ての実施形態において、産生細胞は、ヒト外来性ｇａｇタンパク質を全く発現しない。この種類の担持によって、細胞膜動員ドメインとの融合によってカーゴが改変されないことが可能になっており、既存のＶＬＰ技術からの著しい進歩を表す。

他の実施形態において、産生され、単離された、カーゴを含むｈｅＶＬＰは、カーゴと混合された精製粒子のヌクレオフェクション、脂質、ポリマー、またはＣａＣｌ_２トランスフェクション、超音波処理、凍結融解、種々の温度におけるインキュベーションおよび／または熱ショックを使用することによって、さらなる生体分子または化学物質カーゴを担持することができる。

いくつかの実施形態において、カーゴは、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タンパク質をコードする核酸である。

いくつかの実施形態において、カーゴは化学化合物または分子である。

いくつかの実施形態において、化学分子は、タンパク質－タンパク質二量体化または多量体化のトリガー、例えばＡ／Ｃヘテロ二量体形成因子またはラパマイシンである。

いくつかの実施形態において、化学化合物は、ＤＮＡＰＫ阻害剤、例えばＭ３８１４、ＮＵ７０２６またはＮＵ７４４１であり、これは強度に相同組換え修復遺伝子編集を増強する。

いくつかの実施形態において、生体分子カーゴは遺伝子編集試薬である。

いくつかの実施形態において、遺伝子編集試薬は、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む。

いくつかの実施形態において、遺伝子編集試薬は、表２、３、４＆５に列挙するタンパク質から選択される。

いくつかの実施形態において、遺伝子編集試薬は、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、ｈｅＶＬＰは、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、これらを標的配列に向かわせる１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む。

いくつかの実施形態において、カーゴは、好ましくは表６に示される、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメインへの共有または非共有結合を含む。例えば、共有結合は、単一のリーディングフレームから生成された直接的なタンパク質－タンパク質融合、ペプチド結合を形成することができるインテイン、Ｒ－基および／またはＲＮＡスプライシングにおいて共有結合を形成することができる他のタンパク質を含むことができる。非共有結合は、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、および／またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（水素結合相互作用を介する他の核酸に対する核酸塩基対形成）、タンパク質－タンパク質結合を誘導するのに化学化合物／分子を必要とする、または必要とせずに二量体または多量体化するタンパク質ドメイン、一本鎖可変フラグメント、ナノボディ、アフィボディ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡに結合するタンパク質、４次構造相互作用を有するタンパク質、特定の光波長の存在下で二量体または多量体化することができる光遺伝学タンパク質ドメインおよび／または自然に再構成するスプリットタンパク質を含み得る。

いくつかの実施形態において、カーゴは、二量体化またはタンパク質－タンパク質結合を引き起こすのに分子を必要としてもしなくてもよい二量体化ドメインまたはタンパク質－タンパク質結合ドメインに対する融合体を含む。

いくつかの実施形態において、産生細胞は、ＦＤＡ承認細胞株、同種異系細胞、および／またはドナー由来の自家細胞である。

いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ４７の完全または活性ペプチドドメインを、免疫原性を低下させるためにｈｅＶＬＰ表面に取り込んでもよい。

本明細書に含まれるＡＡＶタンパク質の例は、ＡＡＶＲＥＰ５２、ＲＥＰ７８、およびＶＰ１－３である。タンパク質が挿入され得るカプシド部位は、ＶＰ１アミノ酸カウントから出発してＴ１３８である。二量体化ドメインは、この点において例えばカプシドに挿入され得る。

低分子誘導因子を必要としてもしなくてもよい、本明細書に含まれる二量体化ドメインの例は、ｄＤＺＦ１、ｄＤＺＦ２、ＤｍｒＡ、ＤｍｒＢ、ＤｍｒＣ、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、ＧＣＮ４ｓｃＦｖ、１０ｘ／２４ｘＧＣＮ４、ＧＦＰナノボディ、およびＧＦＰである。

本明細書に含まれるスプリットインテインの例は、ＮｐｕＤｎａＥ、Ｃｆａ、Ｖｍａ、およびＳｓｐＤｎａＥである。

共に共有結合を作成する、本明細書に含まれる他のスプリットタンパク質の例は、ＳｐｙタグおよびＳｐｙキャッチャーである。

本明細書に含まれるＲＮＡ結合タンパク質の例は、ＭＳ２、Ｃｏｍ、およびＰＰ７である。

本明細書に含まれる合成ＤＮＡ結合ジンクフィンガーの例は、ＺＦ６／１０、ＺＦ８／７、ＺＦ９、ＭＫ１０、ジンクフィンガー２６８、およびジンクフィンガー２６８／ＮＲＥである。

本明細書に含まれる、４次構造の結果として多量体化するタンパク質の例は、大腸菌（E. coli）フェリチン、およびフェリチンの他のキメラ形態である。

本明細書に含まれる光遺伝学「光誘導性タンパク質」の例は、Ｃｒｙ２、ＣＩＢＮ、およびＬｏｖ２－Ｊａである。

本明細書に含まれる形質導入を増強するペプチドの例は、Ｌ１７Ｅ、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ、ＫＡＬＡ、および種々の形態のナイシンである。

特に断らない限り、本明細書において使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明において使用するための方法および材料は本明細書に記載されており、他の、当技術分野において公知の適切な方法および材料もまた使用し得る。材料、方法および例は、例示のためのみであり、限定することを意図するものではない。本明細書において言及する全ての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参照文献は、参照によりその全体が取り込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先される。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

ＲＮＰ／タンパク質送達のための例示的なＴ２ｈｅＶＬＰ／Ｔ４ｈｅＶＬＰ産生および形質導入の図示。全てのｈｅＶＬＰ発現コンストラクトは、産生細胞のゲノムに安定的に組み込まれている。コンストラクト１－０は、ヒト内在性ＧＡＧ（ｈＧＡＧ）に対応する。コンストラクト１－１は、ヒト内在性ＧＡＧまたは他のリン脂質二重層動員ドメインに対応する。１－２はカーゴに対応する。２は任意のガイドＲＮＡに対応する。１－０、１－１、および１－２は、サイトゾルにおいて翻訳され、ここで、１－１および１－２の融合体がガイドＲＮＡと複合体化した後、リン脂質二重層に動員される。３は、ＨＥＲＶ由来の糖タンパク質（ｈＥＮＶ）に対応する。ＨＥＲＶ由来の糖タンパク質は、細胞膜上において膜貫通タンパク質として発現する。ｈＧＡＧは、カーゴ含有ｈｅＶＬＰを細胞膜から細胞外空間へと出芽させる。これらの粒子は精製され、標的細胞表面において表面受容体と相互作用することによって、標的細胞と融合し、カーゴを送達することができる。標的細胞に進入し、カーゴをサイトゾルに送達する精製ｈｅＶＬＰの図示。重要なことに、カーゴが核酸局在配列を有する限り、ヒト内在性ＧＡＧまたは他のリン脂質二重層動員ドメインによって、標的細胞核にカーゴが進入することが可能になる。インビトロにおける例示的Ｔ１ｈｅＶＬＰ送達ｓｐＣａｓ９ゲノム編集。ＶＥＧＦ部位＃３を標的とする、ｓｐＣａｓ９と融合したＰＬＣＰＨ、ｓｐＣａｓ９と融合したｈＧＡＧＫ_ｃｏｎ、またはｓｐＣａｓ９と融合したヒト活動調節細胞骨格関連タンパク質（ｈＡｒｃ）を含有するＴ１ｈｅＶＬＰによって形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。ｈｅＶＬＰは、ｈＥＮＶＷ（左図）またはｈＥＮＶＦＲＤ（右図）のいずれかによってシュードタイプ化される。遺伝子改変はアンプリコン配列決定によって測定される。Ｔ１ｈｅＶＬＰ／Ｔ３ｈｅＶＬＰ産生の図示。トランスフェクションに使用されるプラスミドＤＮＡコンストラクトは、カーゴ、任意のガイドＲＮＡ、ｈＧＡＧおよびＨＥＲＶ由来の糖タンパク質をコードする。プラスミド、または他の種類のＤＮＡ分子は、産生細胞にわたって分布し、核内に局在するコンストラクトがｈｅＶＬＰ構成要素およびカーゴを発現し、細胞膜またはエンドソーム付近に局在するコンストラクトが、出芽ｈｅＶＬＰ内に封入されるようになっている。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴ－ｇａｇ融合体を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴ－ＰＨ融合体を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴ－ｇａｇ／ＰＨ融合体を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したｐＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴおよびカーゴと複合体化しているＭＳ２ＲＮＡステムループ（ＭＳ２ＳＬ）に結合する、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、ＭＳ２と融合したｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴおよびカーゴと複合体化しているＲＮＡステムループ（ＭＳ２ＳＬ）に結合する、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、ＭＳ２と融合したＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴおよびカーゴと複合体化しているＲＮＡステムループ（ＭＳ２ＳＬ）に結合する、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、ＭＳ２と融合したｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、カーゴおよびｇａｇおよびカーゴと複合体化しているＲＮＡステムループ（ＭＳ２ＳＬ）に結合する、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合した、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、ＭＳ２を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、カーゴおよびＰＨおよびカーゴと複合体化しているＲＮＡステムループ（ＭＳ２ＳＬ）に結合する、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合した、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、ＭＳ２を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、カーゴおよびｇａｇ／ＰＨおよびカーゴと複合体化しているＲＮＡステムループ（ＭＳ２ＳＬ）に結合する、ＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合した、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、ＭＳ２を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴおよびカーゴと融合したｓｃＦＶが結合している反復ＧＣＮ４ドメインと融合したｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴおよびカーゴと融合したｓｃＦＶが結合している反復ＧＣＮ４ドメインと融合したＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、カーゴおよびカーゴと融合したｓｃＦＶが結合している反復ＧＣＮ４ドメインと融合したｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、ｇａｇおよびＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合した反復ＧＣＮ４ドメインを発現する産生細胞によって、粒子内にパッケージングされた。ＧＣＮ４は、産生細胞においても発現されているカーゴと融合したｓｃＦＶが結合している。本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、ＰＨおよびＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合している反復ＧＣＮ４ドメインを発現する産生細胞によって、粒子内にパッケージングされた。ＧＣＮ４は、産生細胞においても発現されているカーゴと融合したｓｃＦＶが結合している。本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴは、二量体化分子（Ａ／Ｃヘテロ二量体化因子）の存在下で、ｇａｇ／ＰＨおよびＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合している反復ＧＣＮ４ドメインを発現する産生細胞によって、粒子内にパッケージングされた。ＧＣＮ４は、産生細胞においても発現されているカーゴと融合したｓｃＦＶが結合している。本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＡＡＶ粒子）は、カーゴを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＡＡＶ粒子）は、カーゴおよびｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＡＡＶ粒子）は、カーゴおよびＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＡＡＶ粒子）は、カーゴおよびｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（カプシドタンパク質、ＶＰ２に挿入されたＤｍｒＢを有するＡＡＶ粒子）は、ＤｍｒＢ二量体化分子の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＢと融合したｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（カプシドタンパク質、ＶＰ２に挿入されたＤｍｒＢを有するＡＡＶ粒子）は、ＤｍｒＢ二量体化分子の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＢと融合したＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（カプシドタンパク質、ＶＰ２に挿入されたＤｍｒＢを有するＡＡＶ粒子）は、ＤｍｒＢ二量体化分子の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＢと融合したｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（カプシドタンパク質、ＶＰ２に挿入されたＤｍｒＢを有するＡＡＶ粒子）は、ＤｍｒＢ二量体化およびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＡ、ＤｍｒＢ、またはＤｍｒＣと融合したｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（カプシドタンパク質、ＶＰ２に挿入されたＤｍｒＢを有するＡＡＶ粒子）は、ＤｍｒＢ二量体化およびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＡ、ＤｍｒＢ、またはＤｍｒＣと融合したＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（カプシドタンパク質、ＶＰ２に挿入されたＤｍｒＢを有するＡＡＶ粒子）は、ＤｍｒＢ二量体化およびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下で、カーゴおよびＤｍｒＡ、ＤｍｒＢ、またはＤｍｒＣと融合したｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（一本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびｇａｇを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（一本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（一本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびｇａｇ／ＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（一本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびｇａｇを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびｇａｇ／ＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したｇａｇを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したｇａｇ／ＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびｇａｇおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびＰＨおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびｇａｇ／ＰＨおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したｇａｇを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体が結合した二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。あるいは、Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体は、産生細胞によって発現させることもでき、本明細書に記載の種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体が結合した二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。あるいは、Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体は、産生細胞によって発現させることもでき、本明細書に記載の種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびカーゴ内で特定の配列に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したｇａｇ／ＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体が結合した二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングせることもできる。あるいは、Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体は、産生細胞によって発現させることもでき、本明細書に記載の種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でカーゴ内で特定の配列に結合するＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したｇａｇを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体が結合した二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。あるいは、Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体は、産生細胞によって発現させることもでき、本明細書に記載の種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でカーゴ内で特定の配列に結合するＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体が結合した二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。あるいは、Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体は、産生細胞によって発現させることもでき、本明細書に記載の種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質およびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でカーゴ内で特定の配列に結合するＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と融合したｇａｇ／ＰＨを発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体が結合した二本鎖ＤＮＡ）は、本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子内にパッケージングすることもできる。あるいは、Ｃａｓ９ＲＮＰ－ＺＦＰ融合体は、産生細胞によって発現させることもでき、粒子は、本明細書に記載の種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することもできる。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＮＡ）は、カーゴを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＮＡ）は、カーゴおよびｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＮＡ）は、カーゴおよびＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＮＡ）は、カーゴおよびｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＭＳ２ステムループを有するＲＮＡ）は、カーゴおよびＭＳ２と融合したｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＭＳ２ステムループを有するＲＮＡ）は、カーゴおよびＭＳ２と融合したＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＭＳ２ステムループを有するＲＮＡ）は、カーゴおよびＭＳ２と融合したｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＭＳ２ステムループを有するＲＮＡ）は、カーゴおよびｇａｇおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化因子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したＭＳ２を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＭＳ２ステムループを有するＲＮＡ）は、カーゴおよびＰＨおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化因子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したＭＳ２を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＭＳ２ステムループを有するＲＮＡ）は、カーゴおよびｇａｇ／ＰＨおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化因子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合したＭＳ２を産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＢＰステムループを有するＲＮＡ）は、ＲＢＰと融合したカーゴおよび他のＲＢＰと融合したｇａｇを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＢＰステムループを有するＲＮＡ）は、ＲＢＰと融合したカーゴおよび他のＲＢＰと融合したＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＢＰステムループを有するＲＮＡ）は、ＲＢＰと融合したカーゴおよび他のＲＢＰと融合したｇａｇ／ＰＨを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＢＰステムループを有するＲＮＡ）は、ＲＢＰと融合したカーゴおよびｇａｇおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合した他のＲＢＰを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的ｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＢＰステムループを有するＲＮＡ）は、ＲＢＰと融合したカーゴおよびＰＨおよびＡ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下でＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合した他のＲＢＰを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。例示的なｈｅＶＬＰおよびカーゴ構成の図示この粒子は、エンベロープタンパク質を発現する産生細胞によって作出された。カーゴ（ＲＢＰステムループを有するＲＮＡ）は、Ａ／Ｃヘテロ二量体化分子の存在下で、ＲＢＰと融合したカーゴおよびｇａｇ／ＰＨおよびＤｍｒＡまたはＤｍｒＣと融合した他のＲＢＰを産生細胞に発現させること、または本明細書に記載する種々の粒子導入法、例えばエレクトロポレーションによって粒子に導入することのいずれかによって、粒子内にパッケージングされた。

治療用のタンパク質および核酸は、大きな見込みを有するものであるが、これらの多くについて、大きい生体分子の細胞内への送達が、臨床開発への障害となっている。ゲノム編集試薬、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡガイドされた、酵素的に活性／不活性のＤＮＡ結合タンパク質、例えばＣａｓ９は、実行し得る編集の特異性および種類という観点において急速に進歩しているが、安全なインビボ送達の障害により、未だに有効な遺伝子編集療法は妨げられている。以下は、ｈｅＶＬＰをゲノム編集試薬の送達についての新規かつ最適なプラットフォームにするその特性の詳細を記載しており、これによってｈｅＶＬＰは古典的な送達様式とは対照的なものになっている。

ゲノムＤＮＡに組み込まれても組み込まれなくてもよいＤＮＡに逆転写されるＲＮＡを送達するためのレンチウイルス等のレトロウイルス粒子が開発された。自己会合能力においてウイルス粒子を模倣しているが、コアウイルス遺伝子のいくつかを欠いているため感染性ではない、ＶＬＰが開発された。レンチウイルスベクターおよびＶＬＰベクターは共に、典型的には、レンチウイルス粒子またはＶＬＰの産生に必要な全ての構成要素をコードするプラスミドによって産生細胞株を一過的にトランスフェクションすることによって産生される。この従来の一過性トランスフェクション法で産生されるレンチウイルス粒子およびＶＳＶＧベースのＶＬＰに関して、我々が発見した１つの主要な欠点は、従来のカーゴに加えて、これらの粒子が最初の一過性トランスフェクションで使用されたプラスミドＤＮＡをパッケーングおよび送達することである。この意図しないプラスミドＤＮＡ送達は、免疫原性である可能性があり、例えばプラスミドＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれる等、望ましくない影響を引き起こし得る。粒子内に送達される生体分子および／または化学物質の種類を特定することは重要であり、ｈｅＶＬＰはこの重要な機能を持つように設計されている。

本明細書に記載するｈｅＶＬＰは、ＤＮＡのみ、ＤＮＡ＋ＲＮＡ＋タンパク質、またはＲＮＡ＋タンパク質を送達し得る。重要なことに、ｈｅＶＬＰは、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）から選択された構成要素を活用して、真核細胞にカスタマイズ可能なカーゴを送達するための粒子を作出する最初のＶＬＰ送達様式である。ｈｅＶＬＰは、カーゴ（ＤＮＡ、タンパク質、および／またはＲＮＡ）の形態を制御することができる。他の全ての以前に報告されているＶＬＰおよびウイルス粒子は、意図されたタンパク質および／またはＲＮＡカーゴに加えて、一過性のトランスフェクションによって粒子産生細胞に導入された望ましくないプラスミドＤＮＡ（または他の種類のＤＮＡベースの遺伝子発現コンストラクト）をパッケージングして送達する。

ｈｅＶＬＰの他の自明でない態様は、ｈｅＶＬＰの表面にあるＥＮＶタンパク質である。ＥＮＶタンパク質は、ｈｅＶＬＰがカーゴを効率的に細胞内に送達する能力を担っている。レトロウイルスのＥＮＶタンパク質の大部分は、ＥＮＶタンパク質の融合性を活性化するために、ＥＮＶタンパク質の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）をタンパク質分解により切断するという形態の翻訳後修飾を必要とし、これは感染性に不可欠である^１。表１に記載されているエンベロープタンパク質は全て、健常なヒト組織において種々のレベルで発現するＨＥＲＶ由来である（またはＨＥＲＶＥＮＶコンセンサス配列）。これらの配列のいくつかは、融合性を増強することが示されているＩＣＤ切断を有するが、ほとんどは切断を必要としない。

ｈｅＶＬＰは、ＨＥＲＶ由来のヒト内在性ＧＡＧタンパク質（またはＨＥＲＶＧＡＧコンセンサス配列）を利用するため、粒子形成に外来性のウイルス由来のＧＡＧを必要としない^１。これらのＨＥＲＶＧＡＧタンパク質は、ｈｅＶＬＰ形成を可能にし、健常なヒト組織においては種々のレベルで発現されている。重要なことに、ｈｅＶＬＰは、以前に報告されているウイルス粒子、ＶＬＰ、および細胞外小胞とは異なっており、これは、ｈｅＶＬＰがＨＥＲＶＥＮＶとＧＡＧ構成要素との新しい組合せによって構成されており、外来性ウイルス由来の構成要素を含まないためである^２、３。上記のような設計上の最適化により、ｈｅＶＬＰは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはＤＮＡコードまたはＲＮＰベースのゲノム編集試薬等の生体分子および／または化学物質の組合せの送達に特に適している。

ゲノム編集試薬、特にＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ、ジンクフィンガー、およびＴＡＬヌクレアーゼベースの試薬は、遺伝性疾患の処置のためのインビボ療法となる潜在的可能性を有するが、ゲノム編集試薬を細胞内に送達する技術は、患者にとって厳しい制限があるか、または安全ではない。従来の治療用モノクローナル抗体の送達は、タンパク質の直接注入を利用して成功している。残念ながら、Ｃａｓ９等の遺伝子編集タンパク質を直接注入する戦略は、免疫原性、分解性、細胞特異性の低さ、および細胞膜を越えられない、またはエンドソーム／リソソームを回避できないことが障害となっている^４～１０。タンパク質療法および遺伝子編集のより広範の適用が、治療用タンパク質カーゴを細胞内に送達することによって達成され得る。例えば、Ｃａｓ９は、リン脂質二重層を効率的に通過して細胞内に進入することができず、自然免疫原性および適応免疫原性を有することが示されている^４～８。したがって、直接注入、または細胞毒性および免疫原性を有し、しばしば低レベルの所望の遺伝子改変をもたらす脂質、タンパク質、または金属ベースのナノ粒子への外側／内側コンジュゲートとしてＣａｓ９を送達することは実用的でも、好ましくもない^９～２０。

カーゴを封入したナノ粒子は、ＤＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ、およびＲＮＰを細胞内に送達するために使用し得る他の送達戦略である^９～１８。ナノ粒子は、細胞特異性について操作することができ、エンドサイトーシスおよびそれに続くエンドソーム溶解を引き起こすことができる。しかしながら、ナノ粒子は、人工的に得られたビヒクルシェルによって種々のレベルの免疫原性を有し得る^９～２０。多くのナノ粒子は、粒子の構造的統合性を維持するために強い反対の電荷分布に依存しており、静電気によって毒性となり、多くのインビボ治療場面には適さないものになっている^９。ＲＮＡを送達するナノ粒子は、最近の臨床試験で成功を収めているが、ほとんどはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの送達にのみ使用されている。かかるナノ粒子からの毒性は未だに主要な関心事である^９。ゲノム編集用ＲＮＰをコードするｍＲＮＡを送達するナノ粒子も近年成功しているが、タンパク質の送達と比較してオフターゲット効果の数が多く、ＲＮＡの安定性はタンパク質に比べて低い^１７。ゲノム編集ＲＮＰおよびＤＮＡを送達するナノ粒子は、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の両方を利用できるために画期的な突破口であるが、インビトロおよびインビボにおける遺伝子改変頻度が非常に低く、かつそのために遺伝子編集療法としてのインビボでの適用が限られている^１５。

現在、ゲノム編集療法を送達するための臨床的な標準ビヒクルは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶベクターは、真核細胞へのＤＮＡの送達が成功している有望な送達様式であるが、ＡＡＶは４．５ｋｂを超えるＤＮＡコンストラクトを効率的にパッケージングおよび送達することができないため、より大きなＤＮＡ発現コンストラクトを必要とする多くのＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集試薬を送達することができていない。ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集試薬は、複数の異なるＡＡＶ粒子に分割することができるが、この戦略は送達および編集効率を大幅に低下させる。ＡＡＶおよびアデノウイルスベクターは、必要な投与量に応じて、種々のレベルの免疫原性を有し得る。さらに、ＡＡＶのＤＮＡコンストラクト中の逆位末端反復（ＩＴＲ）は、自発的なエピソームの形成を促進し、これがゲノム編集試薬の発現を長引かせ、オフターゲット効果を高める可能性がある。ＩＴＲはまた、ＡＡＶＤＮＡのゲノムＤＮＡへの望ましくない組み込みを促進し得る^{２１～２４}。

近年、ＶＬＰは、ｍＲＮＡおよびタンパク質のカーゴを細胞のサイトゾルに送達するために利用されている^{２、３、２５～３０}。ＶＬＰは、レトロウイルス粒子についての代替的な送達様式として現れたものである。ＶＬＰは、レトロウイルスＤＮＡを組み込む能力を欠損しており、タンパク質／ＲＮＰ／ＤＮＡをパッケージングおよび送達するように設計し得る。しかし、現在までに公知であるゲノム編集試薬を送達する近年考案されたＶＬＰを含むほとんどのＶＬＰは、ＨＩＶまたは他のウイルス由来のｇａｇ－ｐｏｌタンパク質融合体およびウイルスプロテアーゼを利用してレトロウイルス様粒子を生成する^{２５～２７、２９、３０}。第２に、ＲＧＮを含むいくつかのＶＬＰはまた、レンチウイルスＤＮＡ転写物からのガイドＲＮＡをパッケージングおよび発現しなければならない^２７。第３に、いくつかのＶＬＰは、機能的な粒子を形成し、ゲノム編集カーゴを放出するために、ウイルスプロテアーゼを必要とする^{２５～２７、２９}。このウイルスプロテアーゼは、複数のアミノ酸モチーフを認識して切断するため、タンパク質カーゴに損傷を与える可能性があり、これは治療適用にとって危険なものであり得る。第４に、現在までに公開されたゲノム編集タンパク質を送達するＶＬＰ様式のほとんどは、パッケージングおよび形質導入の効率が低いため、インビトロおよびインビボにおける遺伝子改変効率が低いことが示されている^{２５～２７}。第５に、これらのＶＬＰ構成要素に利用される複雑なウイルスゲノムは、複数のリーディングフレームを有し、擬似的な融合タンパク質産物の送達をもたらし得るＲＮＡスプライシングを使用している^{２５～２７、２９、３０}。第６に、これらのＶＬＰに、逆転写酵素、インテグラーゼ、カプシド、およびウイルス由来のエンベロープタンパク質が存在することは、免疫原性およびオフターゲット編集が懸念されるために、ほとんどの治療用途には適していない。最後に、レンチウイルス粒子等のレトロウイルス粒子のほとんどはＶＳＶＧでシュードタイプ化されており、ゲノム編集試薬を送達する、記載されているＶＬＰのほとんど全てはこれまで、ＶＳＶＧを有し、それを利用している^{２、３、２５～３０}。我々は、産生細胞を一過性にトランスフェクションすることによって形成されているＶＳＶＧベースの粒子が、トランスフェクションされたＤＮＡをパッケージングおよび送達することを発見した。現在のＶＳＶＧベースのＶＬＰのバージョンでは、この不用意なＤＮＡの送達を防ぐことができず、これによって、免疫原性およびオフターゲット効果を最小限に抑える必要がある場面でのＶＬＰの使用が妨げられている。

細胞外小胞は、エキソソームおよびエクトソーム内でカーゴをパッケージングおよび送達し得る、他の送達様式である^{３１、３２}。ＶＬＰと同様に、細胞外小胞は、哺乳動物細胞由来のリン脂質二重層によって構成されている。ＶＬＰとは異なり、細胞外小胞はウイルス構成要素を欠いているため、免疫原性は限定的である。ＶＬＰが外側の融合性糖タンパク質（ＶＳＶＧ）により細胞内に入る能力が高いのに対し、細胞外小胞は主にマイクロピノサイトーシスによる細胞取り込みに依存しており、このことによって細胞外小胞の送達効率が制限されている。

ｈｅＶＬＰは、細胞外小胞およびＶＬＰの送達の利点を活用しようとするものである。ｈｅＶＬＰは、潜在的に有害な外来性のウイルス由来の構成要素を全て排除した最初のＶＬＰ様式である。ｈｅＶＬＰの構成要素は、細胞外小胞の生合成に関与することが知られており、局所的な免疫抑制特性を有することが知られており、健常なヒトの組織において発現することにより、中枢性寛容のために免疫反応を引き起こす可能性が最小限化される^１。ｈｅＶＬＰは、以前に報告されているＶＬＰ、細胞外小胞、ＡＡＶ、およびナノ粒子と比較して、特にゲノム編集試薬の送達についてより安全および効果的な代替品であり、これは、ｈｅＶＬＰは、全てヒト由来の構成要素で構成されており、ＤＮＡ＋ＲＮＰまたはＲＮＰのみを送達することができるが、以前に報告された他のＶＬＰは、一過性のトランスフェクション用ＤＮＡが意図せずにパッケージングおよび送達されるのを防ぐことができず、ｈｅＶＬＰは、特殊ＤＮＡ分子を送達することができるが、一方以前に報告されたＶＬＰ、ナノ粒子、およびＡＡＶは、そのことができない、またはせず、また、ｈｅＶＬＰは、有害な免疫反応のリスクをさらに低減するために、患者由来の細胞（自家ｈｅＶＬＰ）および他のＦＤＡ承認細胞株（同種異系ｈｅＶＬＰ）を用いて産生することができるためである。ここでは、ゲノム編集、エピゲノム調節、トランスクリプトーム編集、およびプロテオーム調節をインビトロおよびインビボで適用するためにｈｅＶＬＰの産生、精製、および投与するための方法および組成物について記載する。望ましい編集結果は、治療の状況によって異なり、異なる遺伝子編集試薬が必要となる。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）およびアシダミノコッカス属種（acidaminococcus sp.）のＣａｓ１２ａ（機能化）は、停止コドンまたは欠失の導入にはＮＨＥＪ、または挿入を引き起こすにはＨＤＲを活用する編集用のＲＮＡガイド酵素として最も一般的なものの２つである^{３４～３６}。塩基編集因子としても公知であるＣａｓ９デアミナーゼ融合体は、二本鎖ＤＮＡの切断を伴わずに単一ヌクレオチドを正確に編集するための現在の標準である^{３７、３８}。重要なことに、本発明は、ゲノム編集、エピゲノム調節、トランスクリプトーム編集、およびプロテオーム調節の適用のために、試薬をパッケージングおよび送達する新しい方法を提供している。重要なことに、本発明はまた、ＶＬＰにおける不用意なＤＮＡ送達の現象に初めて取り組み、送達される生体分子の種類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質）を初めて制御するものであり、これによって可能な治療用のインビボゲノム改変の種類を増加させ、有害なオフターゲット効果を最小限に抑えるものである。

セクション１：ＤＮＡ、タンパク質、化合物およびＲＮＡを含むカーゴのｈｅＶＬＰ介在性送達
タンパク質ベースのカーゴを封入して送達するように操作されている従来のＶＬＰは、一般的にはカーゴをＩＮＴまたはＧＡＧポリプロテインと融合させる^{２５～２７、２９、３０、３９、４０}。産生プラスミドＤＮＡコンストラクトを一過性にトランスフェクションした後、これらのタンパク質融合体は、従来のＶＬＰ産生細胞株のサイトゾル内で翻訳され、ｇａｇマトリックスはアセチル化されて細胞膜に動員され、ＶＬＰが膜から細胞外に出芽する際に、ｇａｇ融合体はＶＬＰ内に封入される（一過性のトランスフェクション用ＤＮＡも意図せずに封入される）。

対照的に、本明細書に記載されているｈｅＶＬＰは、全ての産生ＤＮＡを産生細胞株のゲノムＤＮＡに組み込むことによって、タンパク質ベースのカーゴをパッケージングすることができる。一度細胞株が作出されると、タンパク質送達ｈｅＶＬＰは、構成的または誘導的な方法で産生することができる。タンパク質は、選択したヒト内在性ＧＡＧタンパク質または他の細胞膜動員ドメインをタンパク質ベースのカーゴと融合させることにより、ｈｅＶＬＰにパッケージングされる（例えば、表６に示す）。ヒト内在性ＧＡＧタンパク質とヒトプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインは、生体膜に局在する。ＰＨドメインは、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＧＰＣＲのβγサブユニット、およびＰＫＣ等の、生体膜内のホスファチジルイノシトール脂質およびタンパク質と相互作用する^{４１、４２}。しかしながら、ヒト内在性ＧＡＧタンパク質は、リン脂質二重層に局在することに加えて、出芽および粒子形成を促進する^４２。このようなヒト内在性ＧＡＧの二重機能により、カーゴのパッケージングおよび粒子の出芽／形成が可能になる。この目的のために使用されるかかるヒト内在性ＧＡＧタンパク質の１つは、リン脂質二重層のサイトゾル側にカーゴを動員するためにタンパク質ベースのカーゴと融合されていてもよいヒトＡｒｃタンパク質である^４３。これらのヒト内在性ＧＡＧリン脂質二重層動員ドメインは、カーゴ内の１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）の位置にかかわらず、可変長のポリペプチドリンカーを介して、タンパク質ベースのカーゴのＮ末端またはＣ末端と融合し得る。好ましくは、タンパク質ベースのカーゴとヒト内在性ＧＡＧリン脂質二重層動員ドメインとの間のリンカーは、グリシンおよびセリンを主成分とする長さ５～２０、例えば８～１２、例えば１０アミノ酸のポリペプチドリンカーである。ヒト内在性ＧＡＧまたは他のリン脂質二重層動員ドメインは、カーゴをリン脂質二重層に局在化させ、このタンパク質カーゴは、産生細胞から細胞外空間に向かって出芽するｈｅＶＬＰ内にパッケージングされる（図１）。この適用において、これらのヒト内在性ＧＡＧおよび他のリン脂質二重層動員ドメインを使用することは、これらのヒト内在性ＧＡＧおよび他のタンパク質が、カーゴをｈｅＶＬＰ産生細胞内の細胞膜のサイトゾル面に局在させることを容易にし、また、外来性のレトロウイルスＧＡＧまたは化学および／または光ベースの二量体化システムを利用することなく、カーゴをｈｅＶＬＰ形質導入細胞の核に局在させることを可能にするという点において新規かつ特有である（図２）。例えば、ヒト内在性ＧＡＧタンパク質と融合させた場合、ＰＨ細胞膜動員ドメインと融合させた場合、または全く融合させない場合と比較して、Ｃａｓ９のｈｅＶＬＰで送達は大幅に効率が向上する（図３）。

ｈｅＶＬＰはまた、産生細胞株への一過性トランスフェクションによって産生された場合、ＤＮＡとＲＮＡとの組合せをパッケージングおよび送達し得る。細胞にトランスフェクションされたＤＮＡは、サイズ依存性の移動性を有しており、トランスフェクションされたＤＮＡのある画分はサイトゾルに留まるが、トランスフェクションされたＤＮＡの他の画分は核に局在するようになっている^{４４～４６}。核内のトランスフェクションされたＤＮＡの１つの画分は、ｈｅＶＬＰを作出するために必要な構成要素を発現し、サイトゾル中／細胞膜付近の他の画分は封入され、ｈｅＶＬＰ内で送達される（図４）。

本明細書において使用するｈｅＶＬＰ「カーゴ」は、例えば、治療または診断的使用のため、またはゲノム編集、エピゲノム調節、および／またはトランスクリプトーム調節の用途のための、化学物質、例えば低分子化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の組合せ、ＲＮＡとタンパク質との組合せ、ＤＮＡとタンパク質との組合せ、またはタンパク質の１つまたは複数を指していてもよい。さらに、産生細胞からの内在性ＲＮＡおよびタンパク質がパッケージングされ、および／またはｈｅＶＬＰに組み込まれる。これらの区別を簡単にするために、外来性ＤＮＡ、外来性ＲＮＡ、およびタンパク質（外来性および／または内在性タンパク質）の組合せを１型カーゴ（Ｔ１ｈｅＶＬＰ）と称し、外来性ＲＮＡおよびタンパク質（外来性および／または内在性タンパク質）を２型カーゴ（Ｔ２ｈｅＶＬＰ）と称し、また、外来性ＤＮＡおよびタンパク質（外来性および／または内在性タンパク質）の組合せを３型カーゴ（Ｔ３ｈｅＶＬＰ）、タンパク質（外来性および／または内在性タンパク質）を４型カーゴ（Ｔ４ｈｅＶＬＰ）と称する。したがって、Ｔ１はＤＮＡ、ＲＮＡ、＋／－外来性タンパク質を含み、Ｔ２は、ＲＮＡ＋／－外来性タンパク質を含み、Ｔ３は、ＤＮＡ＋／－外来性タンパク質を含み、そして、Ｔ４は、外来性タンパク質のカーゴを持つまたは持たない粒子である。したがって、外来性タンパク質を含まないＴ４は、「外来性カーゴ」がないため、「空の粒子」とみなされる。「外来性カーゴ」は、産生細胞に内在しないカーゴであって、ｈｅＶＬＰにパッケージングおよび／または組み込むことができるカーゴである。さらに、Ｔ１～Ｔ４ｈｅＶＬＰは、Ｔ１～Ｔ４ｈｅＶＬＰに存在するカーゴの種類に加えて、外来性の化学分子をパッケージングすることができる。この文脈におけるＲＮＡは、例えば、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および／またはカーゴをコードするｍＲＮＡであり得る。

本明細書において使用する、「低分子」は、分子量が約３０００ダルトン未満の有機または無機の低分子を指す。一般的に、本発明に有用な低分子は、３０００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する。低分子は、例えば、少なくとも約１００Ｄａ～約３０００Ｄａ（例えば、約１００～約３０００Ｄａ、約１００～約２５００Ｄａ、約１００～約２０００Ｄａ、約１００～約１７５０Ｄａ、約１００～約１５００Ｄａ、約１００～約１２５０Ｄａ、約１００～約１０００Ｄａ、約１００～約７５０Ｄａ、約１００～約５００Ｄａ、約２００～約１５００、約５００～約１０００、約３００～約１０００Ｄａ、または、約１００～約２５０Ｄａ）であり得る。

カーゴは、粒子の直径によって制限され、例えば、いくつかの実施形態においては、１５０ｎｍ～５００ｎｍの範囲である。

ゲノム編集の用途のために開発されたカーゴには、ヌクレアーゼおよび塩基編集因子も含まれる。ヌクレアーゼとしては、ＦｏｋＩおよびＡｃｕＩＺＦＮ、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはその機能的誘導体（例えば、表２に示す）（ＺＦＮは、例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書、第２００５０２０８４８９号明細書、第２００５００２６１５７号明細書、第２００５００６４４７４号明細書、第２００６０１８８９８７号明細書、第２００６００６３２３１号明細書、および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットに記載されている）（ＴＡＬＥＮは、例えば、米国特許第９３９３２５７号明細書、および国際公開第２０１４１３４４１２号パンフレットに記載されている）（ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８６９７３５９号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２０８９７６号明細書、および国際公開第２０１４０９３６６１号パンフレット、国際公開第２０１７１８４７８６号パンフレットに記載されている）^{３４～３６}。本研究によって記載されている塩基編集因子としては、可変長のポリペプチドリンカーを用いた１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）とのＣ末端での融合を伴う、または伴わない、例えば、表２に示すように、Ｎ末端でデアミナーゼと融合した、任意のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼオルソログ（ｗｔ、ニッカーゼ、または触媒的に不活性（ＣＩ））、またはその機能的誘導体（例えば表３に示す）を含む（塩基編集因子は、例えば、米国特許出願公開第２０１５０１６６９８２号明細書、米国特許出願公開第２０１８０３１２８２５号明細書、米国特許第１０１１３１６３号明細書、および国際公開第２０１５０８９４０６号パンフレット、国際公開第２０１８２１８１８８号パンフレット、国際公開第２０１７０７０６３２号パンフレット、国際公開第２０１８０２７０７８号パンフレット、国際公開第２０１８１６５６２９号パンフレットに記載されている）^{３７、３８}。さらに、プライム編集因子は、ｈｅＶＬＰ送達様式にも適合性である（プライム編集因子は、例えば、Anzalone et al., Nature. 2019 Dec;576(7785):149-157に記載されている）。

ｓｇＲＮＡはパッケージングの過程でゲノム編集試薬と複合体化し、ｈｅＶＬＰ内で共送達される。現在までに、この概念はインビトロにおいて、内在性の部位を部位特異的に編集する目的でＲＧＮＲＮＰをＴ２ｈｅＶＬＰで送達することを示す実験によって実証されている（図３）。例えば、内在性のＶＥＧＦ部位＃３を編集する目的で、Ｔ２ｈｅＶＬＰを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣａｓ９ＲＮＰが送達されている（図３）。

エピゲノム調節を目的として設計されたカーゴは、エピゲノム調節因子またはエピゲノム調節因子の組合せ、または１つもしくは複数の可変長ポリペプチドリンカーで結合したその機能性誘導体と融合したＣＩＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼ、ジンクフィンガー（ＺＦ）およびＴＡＬＥを含む（表２および４）。トランスクリプトーム編集を目的として設計されたＴ１～Ｔ４カーゴは、表５のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはその任意の機能的誘導体、または１つまたは複数の可変長ポリペプチドリンカーによって表３のデアミナーゼと融合した、表５のＣＩＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはその任意の機能的誘導体を含む。

カーゴはまた、治療的または診断的に有用な任意のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＰ、またはＤＮＡ、タンパク質および／またはＲＮＰの組合せを含み得る。例えば、国際公開第２０１４００５２１９号パンフレット、米国特許第１０１３７２０６号明細書、米国特許出願公開第２０１８０３３９１６６号明細書、米国特許第５８９２０２０号明細書、欧州特許第２１３４８４１号明細書、国際公開第２００７０２０９６５号パンフレットを参照されたい。例えば、ヌクレアーゼまたは塩基編集タンパク質もしくはＲＮＰまたはその誘導体をコードまたはこれらによって構成されるカーゴを、リーバー先天性甘皮症１０型の原因となるスプライシング部位の欠陥を修正する目的で網膜細胞に送達することができる。哺乳動物の内耳では、β－カテニンをより安定化させるために、β－カテニンを編集する（β－カテニンＳｅｒ３３はＴｙｒ、Ｐｒｏ、またはＣｙｓに編集される）目的で、塩基編集試薬またはＨＤＲ促進カーゴを蝸牛支持細胞および有毛細胞等の感覚細胞にｈｅＶＬＰ送達することによって、難聴の回復に役立つ可能性がある。

他の適用において、ＲＮＡ編集試薬またはプロテオーム撹乱試薬のｈｅＶＬＰ送達は、１つまたは複数の特定の目的のタンパク質の細胞レベルの一過性の低下を引き起こし（潜在的には、全身レベルで、特定の器官または腫瘍などの細胞の特定のサブセットにおいて）、これにより、副次的な薬剤を投与できる治療的に作用可能なウィンドウが作成され得る（この副次的な薬剤は、目的のタンパク質が存在しないか、または目的のタンパク質の存在のレベルが低くなっている際に、より効果的である）。例えば、ＲＮＡ編集試薬またはプロテオーム擾乱試薬のｈｅＶＬＰによる送達によって、ベムラフェニブ／ダブラフェニブ耐性のＢＲＡＦ駆動腫瘍細胞において、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴタンパク質ならびに関連するｍＲＮＡの標的化分解が引き起こされ、ＢＲＡＦ阻害剤耐性が一時的に無効化される（ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路に基づく耐性機構がｈｅＶＬＰカーゴによって一時的に下方制御される）ために、ベムラフェニブ／ダブラフェニブ投与のためのウィンドウが開かれ得る。この例は、抗原誘導性があり、したがって腫瘍細胞に特異的なｈｅＶＬＰと組み合わせた場合に特に適切である。

他の適用において、ｈｅＶＬＰは、山中因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃをヒトまたはマウスの線維芽細胞に送達し、人工多能性幹細胞を作製することができる。

他の適用において、ｈｅＶＬＰは、治療効果を引き出すために、ドミナントネガティブ形態のタンパク質を送達し得る。

抗原特異的なｈｅＶＬＰを、がん細胞に対して標的化して、アポトーシス促進タンパク質であるＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、および／またはＨＲＫを送達し、がん細胞のアポトーシスを引き起こし得る。

膵臓がん患者の９０％は切除不能な疾患を呈している。切除不能な膵臓腫瘍患者の約３０％は局所的な疾患の進行により死亡するため、局所進行膵臓腫瘍を放射線で切除して処置することが望ましいが、腸管は腫瘍切除を引き起こすのに必要な高線量の放射線に耐えることができない。腸管を選択的に放射線保護することによって、周囲の消化管に対する損傷を最小限に抑えながら、膵臓腫瘍の切除放射線療法を行うことが可能になる。この目的のために、転写抑制因子ＫＲＡＢおよびＥＧＬＮを標的とするガイドＲＮＡと融合したｄＣａｓ９をｈｅＶＬＰに導入し得る。ＥＧＬＮの阻害は、膵臓腫瘍ではなく消化管の選択的な放射線保護を引き起こすため、切除的放射線処置による消化管傷害性を有意に軽減することが示されている^４７。

結合していないステロイド受容体は、サイトゾルに存在する。リガンドへの結合後、これらの受容体は核へと局在移行し、応答遺伝子の転写を開始する。ｈｅＶＬＰは、サイトゾルのステロイド受容体に結合し、それを破壊する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体を細胞のサイトゾルに送達することができる。例えば、ｓｃＦｖは、グルココルチコイド受容体に結合し、デキサメタゾンとの結合を阻害することで、腫瘍形成と関連しているメタロチオネイン１Ｅ等の応答遺伝子の転写を阻止し得る^４８。

ｈｅＶＬＰは、タンパク質の標的化破壊を伴う処置に適応し得る。例えば、抗体／ｓｃＦｖｓを細胞のサイトゾルに送達することによって、細胞のサイトゾル内のタンパク質を標的化し、破壊するために、ｈｅＶＬＰを利用し得る。従来、細胞膜を介して細胞のサイトゾルに抗体を送達することが、困難かつ非効率的であることが周知されていた。このようなタンパク質の阻害方法は、標的化された低分子がサイトゾル内のタンパク質に結合して破壊する方法と類似しており、多様な疾患の処置に有用であり得る^{４９～５１}。

さらに、標的化低分子の標的化は、触媒機能またはタンパク質－タンパク質の相互作用に関連する結合ポケットを含む一定の大きさのタンパク質に限定される。ｓｃＦｖは、触媒機能および他のタンパク質との相互作用を阻害するために、タンパク質の多くの異なる部位に結合するように生成し得るため、これらの制限に妨げられない。例えば、ＲＡＳがんタンパク質は、多くのがんのサブタイプに関与しており、ＲＡＳはがんにおいて最も頻繁に観察されるがん遺伝子の１つである。例えば、国際がんゲノムコンソーシアムでは、膵臓腺がんサンプルの９５％でＫＲＡＳが変異していることが見出されている。ＲＡＳアイソフォームは、ＰＩ３Ｋ経路およびＭＡＰＫ経路のような、ヒトのがんで制御不能となっている種々の経路を活性化することが知られている。ＲＡＳはがんにおいて異常な役割を果たしているにもかかわらず、効果的な薬理学的な直接または間接のＲＡＳの低分子阻害剤は開発されておらず、臨床使用が承認されていない。ＲＡＳを標的とする１つの戦略は、複数のＲＡＳアイソフォームに結合し、その機能を阻害するｓｃＦｖをがん細胞に特異的に送達できるｈｅＶＬＰであり得る^{４９～５１}。

図５～６９は、例示的なｈｅＶＬＰの構成およびカーゴ分子の非限定的な例を示している。

セクション２：ｈｅＶＬＰ組成、産生、精製および適用
ｈｅＶＬＰは、少なくとも１つのプラスミドで一過性にトランスフェクションされたか、または産生細胞株のゲノムＤＮＡに組み込まれたコンストラクトを安定的に発現している産生細胞株から産生される。いくつかの実施形態において、Ｔ１およびＴ３ｈｅＶＬＰについて、単一のプラスミドをトランスフェクションに使用する場合、それは、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメイン（例えば、表６に示す）と融合した、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来の糖タンパク質（例えば、表１に示す）、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＧＡＧタンパク質、カーゴ（例えば、治療用タンパク質または遺伝子編集試薬、例えばジンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集／調節タンパク質および／またはＲＮＰ、例えば表２、３、４および５に記載される他のもの）、ならびに必要に応じてガイドＲＮＡをコードする配列を含んでいるはずである。好ましくは、トランスフェクションには２～３個のプラスミドを用いる。これらの２～３個のプラスミドは、以下のものを含むことができる（任意の２つ以上を１つのプラスミドにおいて組み合わせ得る）：
１．ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメインと融合した、治療用タンパク質またはゲノム編集試薬をコードする配列を含む、プラスミド。
２．１つまたは複数のＨＥＲＶ由来の糖タンパク質（例えば、表１に列挙するもの）を含む、プラスミド。
３．１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＧＡＧタンパク質を含むプラスミド。
４．プラスミド１からのゲノム編集試薬が、１つまたは複数のガイドＲＮＡを必要とする場合、プラスミド１におけるゲノム編集試薬に適切な１つまたは複数のガイドＲＮＡを含むプラスミド。

プラスミド以外の種類のＤＮＡ分子を送達することが望ましい場合、二本鎖の閉環直鎖ＤＮＡ、エピソーム、ミニサークル、二本鎖オリゴヌクレオチドおよび／または他の特殊ＤＮＡ分子を用いて、上記のトランスフェクションを行うことができる。あるいは、Ｔ２およびＴ４ｈｅＶＬＰについては、上記トランスフェクションで説明したコンストラクト（１～３）を安定的に発現する産生細胞株を作製し得る。

また、プラスミド、または上記の他の種類の特殊ＤＮＡ分子は、好ましくは、コードされた配列の発現または翻訳を駆動するための他の要素、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲ、ポリアデニル化部位、インシュレーター配列、または発現を上昇させる、または制御する他の配列（例えば、誘導性プロモーター要素）も含むであろう。

好ましくは、適切な産生細胞株は、トランスフェクション試薬の影響および糖タンパク質による融合効果に抵抗性のある初代のまたは安定的なヒト細胞株である。適切な細胞株の例としては、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ＳＦ細胞腎臓由来のＰｈｏｅｎｉｘ－ＡＭＰＨＯ細胞、および胎盤由来のＢｅＷｏ細胞が挙げられる。例えば、かかる細胞は、接着細胞、または懸濁細胞として成長する能力について選択され得る。いくつかの実施形態において、産生細胞は、血清条件、無血清条件、またはエキソソーム無血清条件において古典的なＤＭＥＭ中で培養し得る。Ｔ１およびＴ３ｈｅＶＬＰは、患者に由来する細胞（自家ｈｅＶＬＰ）および他のＦＤＡ承認細胞株（同種異系ｈｅＶＬＰ）から、これらの細胞に、当技術分野で公知の種々の技術によって前述のｈｅＶＬＰ産生構成要素をコードするＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトし得る限り、産生し得る。

さらに、望ましい場合には、２つ以上のゲノム編集試薬をトランスフェクションに含めることができる。ＤＮＡコンストラクトは、産生細胞株でタンパク質を過剰発現させるように設計し得る。トランスフェクションに使用されるプラスミド骨格は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物のためのＣＭＶプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物のためのＵ６プロモーターを用いるｐＣＤＮＡ３骨格のような、当技術分野の当業者に周知のものであり得る。核酸分子を産生細胞に導入するために、当技術分野で公知の種々の技術を採用することができる。かかる技術としては、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー等の化合物を用いた化学促進トランスフェクション、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００または３０００、およびＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２）のようなカチオン性リポソーム、ポリエチレンイミン等のリポソーム介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、マイクロインジェクション等の非化学的方法が挙げられる。

必要なｈｅＶＬＰ構成要素を構成的および／または誘導的に安定して発現するヒト産生細胞株を、Ｔ２およびＴ４ｈｅＶＬＰの産生に用いることができる。Ｔ２およびＴ４ｈｅＶＬＰは、患者に由来する細胞（自家ｈｅＶＬＰ）および他のＦＤＡ承認細胞株（同種異系ｈｅＶＬＰ）から、これらの細胞が前述のｈｅＶＬＰ構成要素を発現する安定的な細胞株に変換されている場合、産生することができる。

本明細書において、産生細胞自体も提供される。

いくつかの実施形態において、ｈｅＶＬＰへのカーゴの効率的な動員のために、カーゴは、好ましくは表６に示される、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメインへの共有結合または非共有結合を含む。共有結合は、例えば、単一のリーディングフレームから生成された直接的なタンパク質－タンパク質融合体、ペプチド結合を形成することができるインテイン、Ｒ－基および／またはＲＮＡスプライシングで共有結合を形成することができる他のタンパク質を含み得る^{５２～５４}。非共有結合としては、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、および／またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（核酸が水素結合相互作用を介して他の核酸と塩基対形成する）、タンパク質－タンパク質結合を誘導する化学化合物／分子を必要とする、または必要とせずに二量体化または多量体化するタンパク質ドメイン（例えば、ＤｍｒＡ／ＤｍｒＢ／ＤｍｒＣ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ^５５、ｄＤＺＦ^５６、およびロイシンジッパー^５７等）、一本鎖可変フラグメント^５８、ナノボディ^５９、アフィボディ^６０、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡに結合するタンパク質、４次構造相互作用を有するタンパク質、特定の光波長の存在下で二量体化または多量体化できる光遺伝学的タンパク質ドメイン^６１、および／または自然に再構成されるスプリットタンパク質^６２が挙げられる。

いくつかの実施形態において、カーゴは、二量体化またはタンパク質－タンパク質結合を引き起こす分子を必要としてもしなくてもよい二量体化ドメインまたはタンパク質－タンパク質結合ドメインとの融合体を含む。

いくつかの実施形態において、産生細胞は、ＦＤＡ承認細胞株、同種異系細胞、および／またはドナーに由来する自家細胞である。

いくつかの実施形態において、免疫原性を低減するために、ヒトＣＤ４７の完全または活性ペプチドドメインをｈｅＶＬＰ表面に組み込んでもよい。

本明細書に含まれるＡＡＶタンパク質の例は、ＡＡＶＲＥＰ５２、ＲＥＰ７８、およびＶＰ１－３である。タンパク質が挿入され得るカプシド部位は、ＶＰ１のアミノ酸カウントから出発してＴ１３８である^６３。二量体化ドメインは、例えば、カプシドのこの点に挿入され得る。

低分子誘導因子を必要としても必要としなくてもよい、本明細書に含まれる二量体化ドメインの例は、ｄＤＺＦ１^５６、ｄＤＺＦ２^５６、ＤｍｒＡ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）、ＤｍｒＢ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）、ＤｍｒＣ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）、ＦＫＢＰ^５５、ＦＲＢ^５５、ＧＣＮ４ｓｃＦｖ^５８、１０ｘ／２４ｘＧＣＮ４^５８、ＧＦＰナノボディ^５９、およびＧＦＰ^６４である。

本明細書に含まれるスプリットインテインの例は、ＮｐｕＤｎａＥ、Ｃｆａ、Ｖｍａ、およびＳｓｐＤｎａＥである^５２。

本明細書に含まれる、共有結合を共に作成する他のスプリットタンパク質の例は、ＳｐｙタグおよびＳｐｙキャッチャーである^５３。

本明細書に含まれるＲＮＡ結合タンパク質の例は、ＭＳ２、Ｃｏｍ、およびＰＰ７である^６５。

本明細書に含まれる合成ＤＮＡ結合ジンクフィンガーの例は、ＺＦ６／１０、ＺＦ８／７、ＺＦ９、ＭＫ１０、ジンクフィンガー２６８、およびジンクフィンガー２６８／ＮＲＥである^{６６、６７}。

本明細書に含まれる４次構造の結果として多量体化するタンパク質の例は、大腸菌（E. Coli）のフェリチン、および他のフェリチンのキメラ形態である^{６８、６９}。

本明細書に含まれる光遺伝学的な「光誘導性タンパク質」の例は、Ｃｒｙ２、ＣＩＢＮ、およびＬｏｖ２－Ｊａである^６１。

本明細書に含まれる、形質導入を増強するペプチドの例は、Ｌ１７Ｅ^７０、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、ＫＡＬＡ^７１、および種々の形態のナイシン^７２である。

他の実施形態において、産生され、単離されたＴ１～Ｔ４ｈｅＶＬＰは、カーゴと混合された精製粒子のヌクレオフェクション、脂質、ポリマー、またはＣａＣｌ_２トランスフェクション、超音波処理、凍結融解、種々の温度でのインキュベーション、および／または熱ショックを利用して、生体分子または化学分子カーゴを導入することができる。これらの技術は、治療用または研究用用途のためにエキソソームにカーゴを導入するために使用される技術から適応される^{７３～７５}。例えば、１００μｇのｈｅＶＬＰをＰＢＳ中の５０ｍＭトレハロース２００～４５０μｌに再懸濁し、所望の濃度のカーゴと混合し、０．４ｃｍのキュベット内で０．２００ｋＶ、および１２５μＦでエレクトロポレーション（静電容量エクステンダーを備えたＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を行うことができる。

カーゴ導入ｈｅＶＬＰおよび組成物の産生
好ましくは、トランスフェクションの３６～４８時間後、またはｈｅＶＬＰが産生細胞の培地中で最大濃度であるときに、細胞培養液の上清からｈｅＶＬＰを回収する（産生細胞は培地中に粒子を排出しており、ある時点で培地中の粒子濃度が粒子を回収するのに最適である）。上清は、遠心分離、超遠心分離、沈殿、限外ろ過、および／またはクロマトグラフィー等、当技術分野における任意の公知の方法によって精製し得る。いくつかの実施形態において、上清を最初にろ過し、例えば、０．４５孔径のポリフッ化ビニリデン親水性膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｉｌｌｅｘ－ＨＶ）または０．８μｍ孔径の混合セルロースエステル親水性膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｉｌｌｅｘ－ＡＡ）を通して、１μｍより大きい粒子を除去する。ろ過後、例えば、超遠心分離を、例えば、１℃～５℃の温度で８０，０００～１００，０００ｘｇの速度で１～２時間、または１℃～５℃の温度で８，０００～１５，０００ｇの速度で１０～１６時間使用して、上清をさらに精製および濃縮し得る。この遠心分離ステップの後、ｈｅＶＬＰを遠心分離物（ペレット）の形態で濃縮し、これを所望の濃度に再懸濁し、形質導入促進試薬と混合し、緩衝剤交換に供しても、またはそのまま使用してもよい。いくつかの実施形態において、ｈｅＶＬＰ含有上清をろ過し、沈殿させ、遠心分離し、濃縮溶液に再懸濁し得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ８０００、またはｈｅＶＬＰ表面タンパク質または膜構成要素に結合する抗体ビーズコンジュゲートを使用して、粒子を沈殿させることができる。精製された粒子は安定しており、４℃で１週間まで、または－８０℃で数年間保存しても、評価可能な活性を失わない。

好ましくは、ｈｅＶＬＰは再懸濁されるか、または粒子が適切なキャリアに懸濁されるように緩衝剤交換を受ける。いくつかの実施形態において、緩衝剤交換は、限外ろ過（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＶｉｖａｓｐｉｎ５００ＭＷＣＯ１００，０００）によって行うことができる。インビトロ用途に使用するｈｅＶＬＰの例示的な適切なキャリアは、好ましくは、ｈｅＶＬＰによって形質導入されるべき細胞に適した細胞培養培地であろう。インビトロ用途のための精製および濃縮されたｈｅＶＬＰ溶液に混合することができる形質導入促進試薬としては、当技術分野の当業者に知られている試薬（ＭｉｌｔｅｎｙｌＢｉｏｔｅｃＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｏｌｙｂｒｅｎｅ、ＴａｋａｒａＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ、およびＳｉｇｍａＰｒｏｔａｍｉｎｅＳｕｌｆａｔｅ等）が挙げられる。適切なキャリア中のｈｅＶＬＰを形質導入すべき細胞に適用した後、遠心分離によって形質導入効率をさらに上昇させることができる。好ましくは、細胞に適用したｈｅＶＬＰを含むプレートを、室温で１，１５０ｇの速度で３０分間遠心分離することができる。遠心分離後、細胞を適切な細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター）に戻す。

哺乳動物、特にヒトに投与するｈｅＶＬＰの適切なキャリアは、好ましくは薬学的に許容される組成物であろう。「薬学的に許容される組成物」は、任意の種類の非毒性の半固体、液体、またはエアロゾル化された充填剤、希釈剤、カプセル化材料、コロイド懸濁液、または製剤補助剤を指す。好ましくは、この組成物は注射に適している。特に等張性の無菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化マグネシウムおよびかかる塩の類似の溶液または混合物）、または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であって、場合によって滅菌水または生理食塩水を添加することにより、注射用液剤を構成することができるものであり得る。他の適切な医薬形態は、鼻腔内吸入または気管内挿管によって投与するためにエアロゾル化された粒子であり得る。

注射使用に適した医薬形態としては、無菌水性液剤または懸濁剤が挙げられる。液剤または懸濁剤は、ｈｅＶＬＰと適合性であり、標的細胞へのｈｅＶＬＰの進入を妨げない添加物を含んでいてもよい。いずれの場合も、形態は無菌でなければならず、前記形態を注射器で投与できる程度の流動性がなければならない。製造および保存の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。適切な液剤の例は、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝剤である。

適切な医薬組成物を製剤する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005およびDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker、NY)シリーズの書籍を参照されたい。例えば、非経口、皮内、または皮下の適用に使用される液剤または懸濁剤は、以下の構成要素、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の無菌希釈剤、ベンジルアルコール、またはメチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸、または重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等の緩衝剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張性調整剤等を含んでいてもよい。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整し得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。

注射使用に適した医薬組成物は、無菌水性液剤（水溶性の場合）または分散剤、および無菌注射用液剤または分散剤を即座に調製するための無菌粉末を含み得る。静脈内投与に適切なキャリアとしては生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針を追加できる程度の流動性がなければならない。製造および保存の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌等の微生物による汚染作用から保護されていなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用、分散剤の場合は必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持し得る。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール等の種々の抗菌および抗真菌剤によって達成し得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらし得る。

無菌注射用液剤は、必要な量の活性化合物を、上に挙げた成分の１つまたは複数と組み合わせて適切な溶媒に取り込み、その後、必要に応じてろ過滅菌することによって調製し得る。一般的に、分散剤は、無菌ビヒクルに活性化合物を取り込むことによって調製され、これは、基本的な分散媒と上に列挙するものからの必要な他の成分とを含む。無菌注射用液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらの方法では、活性成分の粉末に加えて、事前に滅菌ろ過された溶液からの任意の追加の所望の成分を得ることができる。

カーゴ導入ｈｅＶＬＰを含む組成物は、投与のための指示書と共に、コンテナ、パック、またはディスペンサーに含め得る。

本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

方法
ｈｅＶＬＰ粒子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのプラスミドのトランスフェクションを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって産生された。ＰＥＩはポリエチレニミン２５ｋＤ直鎖（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２３９６６－２）である。「ＰＥＩＭＡＸ」のストック溶液を作製するために、１ｇのＰＥＩを１Ｌの事前に約８０℃まで加熱したエンドトキシンフリーのｄＨ_２Ｏに添加し、室温まで冷却した。この混合物を１０ＮのＮａＯＨの添加によってｐＨ７．１に中和し、０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）でろ過滅菌した。ＰＥＩＭＡＸは－２０℃で保存する。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクション時に７０％～９０％コンフルエントになるように分割し、１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地で培養する。カーゴベクター、例えば、コドン最適化Ｃａｓ９へのｈＰＬＣδ１ＰＨ融合体の発現を駆動するＣＭＶプロモーターをコードするベクターを、Ｕ６プロモーター－ｓｇＲＮＡコードプラスミド、ｈＥＲＶＫ_ｃｏｎＧＡＧ（ｈＧＡＧＫ_ｃｏｎ）コードプラスミド、およびｈＥＮＶＷ（シンシチン－１）コードプラスミドと共トランスフェクションした。トランスフェクション反応は、還元血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ＃３１９８５－０７０）中で組み立てた。１０ｃｍプレートでのｈｅＶＬＰ粒子産生のために、５μｇのＰＨ－Ｃａｓ９発現プラスミド、５μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミド、５μｇのｈＥＲＶＫ_ｃｏｎＧＡＧ発現プラスミド、および５μｇのシンシチン－１発現プラスミドを１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合し、次いで２７．５μｌのＰＥＩＭＡＸを添加した。室温で２０～３０分インキュベーションした後、トランスフェクション反応物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に滴下分散させた。

ｈｅＶＬＰは、トランスフェクションの４８～７２時間後に回収した。ｈｅＶＬＰ上清は、０．８μｍ孔径の混合セルロースエステル膜フィルタを用いてろ過し、ＳＷ２８ローター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ＃３２６８２３）と共に使用するポリプロピレンのＢｅｃｋｍａｎ超遠心チューブに移した。各超遠心チューブは、３枚の１０ｃｍプレートからのｈｅＶＬＰ含有上清によって最終容積が約３５～３７．５ｍｌに達するように充填されている。ｈｅＶＬＰ上清は、４℃で２時間、約１００，０００ｘｇ、または２５，０００ｒｐｍで超遠心分離された。超遠心分離後、上清をデカンテーションし、ｈｅＶＬＰペレットをＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ培地に、超遠心分離前の約１，０００倍の濃度になるように再懸濁した。ｈｅＶＬＰを形質導入の２４時間前に２４ウェルプレートに播種した細胞に滴加した。必要に応じて、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（細胞培養液中５～１０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＴＲ－１００３－Ｇ）を補充して、形質導入効率を高めた。必要に応じて、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（細胞培養液中１０μｇ／ｍＬ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ＃１３０－１１１－１６３）を添加して、形質導入効率を高めた。ｈｅＶＬＰを添加した直後に、必要に応じて、２４ウェルプレートを１，１５０ｘｇで３０分間、室温で遠心分離し、形質導入効率を高めた。

[実施例１]
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＶＥＧＦ部位＃３を標的とした、ｓｐＣａｓ９と融合したＰＬＣＰＨ、ｓｐＣａｓ９と融合したｈＧＡＧＫ_ｃｏｎ、またはｓｐＣａｓ９と融合したｈＡｒｃを含むＴ１ｈｅＶＬＰによって形質導入した。Ｔ１ｈｅＶＬＰは、ｈＥＮＶＷ（左図）またはｈＥＮＶＦＲＤ（右図）のいずれかによってシュードタイプ化された。遺伝子改変はアンプリコン配列決定によって測定した。粒子の精製および濃縮は、ＰＶＤＦろ過および１００，０００ｘｇ、２時間の超遠心分離によって行った。結果を図３に示す。重要なことに、ＨＥＲＶ由来のＧＡＧ（ｈＧＡＧＫ_ｃｏｎ）が産生細胞において単独で過剰発現しておらず、その際、効率的な送達は達成されなかった。

Claims

操作されたヒト由来ウイルス様粒子（ｈｅＶＬＰ）であって、ｈｅＶＬＰが、外側に、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＥＮＶ／糖タンパク質を有するリン脂質二重層を含む膜；膜の内側のｈｅＶＬＰコアにＨＥＲＶ由来のＧＡＧタンパク質、およびｈｅＶＬＰのコアに配置されたカーゴを含み、前記カーゴがヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメインと融合しており、ｈｅＶＬＰが非ヒトのｇａｇおよび／またはｐｏｌタンパク質を含まない、前記ｈｅＶＬＰ。
前記カーゴが、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タンパク質をコードする核酸、または低分子である、請求項１に記載のｈｅＶＬＰ。
前記カーゴが遺伝子編集試薬である、請求項１に記載のｈｅＶＬＰ。
前記遺伝子編集試薬が、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む、請求項１に記載のｈｅＶＬＰ。
前記遺伝子編集試薬が、表２、３、４および５に列挙するタンパク質から選択される、請求項４に記載のｈｅＶＬＰ。
前記遺伝子編集試薬が、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、前記ｈｅＶＬＰが、前記ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、それを標的配列に誘導する１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項４に記載のｈｅＶＬＰ。
前記カーゴが、好ましくは表６に示される、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメインとの融合体を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｈｅＶＬＰ。
カーゴ分子を標的細胞、任意にインビボまたはインビトロの細胞に送達する方法であって、前記カーゴ分子を含む、請求項１に記載のｈｅＶＬＰと前記細胞を接触させることを含み、好ましくは前記カーゴ分子が生体分子および／または化学物質である、前記方法。
１つまたは複数のカーゴ分子を含むｈｅＶＬＰを産生する方法であって、
１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のエンベロープタンパク質、１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＧＡＧタンパク質、および１つまたは複数のカーゴ分子を発現する細胞であって、ヒトゲノムにおいてコードされるｇａｇタンパク質またはヒトゲノムに見出されるｇａｇタンパク質に由来するコンセンサス配列によってコードされるｇａｇタンパク質を除いて、ｇａｇおよび／またはｐｏｌタンパク質を発現せず細胞を用意すること、ならびに
細胞がｈｅＶＬＰを産生するような条件で細胞を維持すること
を含む、前記方法。
産生されたｈｅＶＬＰを回収し、任意に精製および／または濃縮することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
前記カーゴ分子が、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タンパク質をコードする核酸、または低分子の治療剤または診断剤である、請求項９に記載の方法。
前記カーゴ分子が遺伝子編集試薬である、請求項９に記載の方法。
前記遺伝子編集試薬が、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む、請求項９に記載の方法。
前記遺伝子編集試薬が、表２、３、４、および５に列挙するタンパク質から選択される、請求項１３に記載の方法。
前記遺伝子編集試薬が、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、前記ｈｅＶＬＰが、前記ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、それを標的配列に誘導する１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
前記カーゴ分子が、好ましくは表６に示される、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメインとの融合体を含む、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のエンベロープタンパク質、
１つまたは複数のＨＥＲＶ由来のＧＡＧタンパク質、および
好ましくは、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員メントドメインと融合している、カーゴ分子
を組み合わせて発現し、
非ヒトＧＡＧタンパク質を発現しない、細胞。
前記カーゴ分子が、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タンパク質をコードする核酸である、請求項１７に記載の細胞。
前記カーゴ分子が遺伝子編集試薬である、請求項１７に記載の細胞。
前記遺伝子編集試薬が、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む、請求項１７に記載の細胞。
前記遺伝子編集試薬が、表２、３、４、および５に列挙するタンパク質から選択される、請求項２０に記載の細胞。
前記遺伝子編集試薬が、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、前記ｈｅＶＬＰが、前記ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、それを標的配列に誘導する１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項２０に記載の細胞。
前記カーゴ分子が、好ましくは表６に示される、ヒト内在性ＧＡＧまたは他の細胞膜動員ドメインとの融合体を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の細胞。
初代のまたは安定的なヒト細胞株である、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の細胞。
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはＢｅＷｏ細胞である、請求項２４に記載の細胞。