JP7277466B2 - 疾患の予防および/または治療における使用のためのワクチン - Google Patents
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Description
発明の概要
本発明は、ウイルス様粒子(VLP)をコードすることができるアデノウイルスベクターを含む、疾患の予防および/または治療における使用のためのワクチンに関するものであり、該VLPは、不活性型免疫抑制性ドメイン(ISD)を提示する。
表面サブユニット
膜貫通サブユニット
免疫抑制性ドメイン(ISD/ISD)*
膜貫通ドメイン
細胞質尾部
2.Env蛋白質についてのアミノ酸配列(配列番号11):
3.Env蛋白質についてのアミノ酸配列(配列番号13):
4.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号15):
5.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号17):
6.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号19):
7.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号21):
8.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号22)::
9.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号24):
10.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号26):
11.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号27):
12.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号28):
13.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号30):
14.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号31):
15.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号32および33):
16.Env蛋白質のアミノ酸配列(配列番号339):
種々の細胞株を異なる実験において使用した。細胞株はすべて、37℃で、加湿雰囲気中で5%CO2で維持した。
組換えアデノウイルスを作製するために、標的蛋白質を改変型アデノウイルスベクター捕獲pBGHへとクローン化した。このベクターは、E1遺伝子およびE3遺伝子に欠失があるAd5ゲノムを含有する。さらに、該ベクターは、CMVプロモーターおよび3’ポリアデニル化(ポリA)尾部を必要とし、かつTetオペレーターの下で組換えタンパク質を発現するベクター768tetに対する相同領域を含有する(図4)[Becker,T.C.,et al.,Use of recombinant adenovirus for metabolic engineering of mammalian cells.Methods Cell Biol,1994.43 Pt A:p.161~89。]。それゆえ、標的蛋白質をまず、768tet内へとサブクローニング、PCRクローニングまたはGibsonアセンブリによって挿入し、その後、相同組換え(図5)を介して捕獲pBGH内へとクローン化した(図4)。アデノウイルスのpIX改変のために、標的蛋白質を共通の発現ベクターpcDNA3内へとクローン化し、該発現ベクターは、pIXおよびリンカー配列(FLAGタグを含有)に続いて制限部位を追加的にコードして、関心対象の遺伝子(pcDNA3_pIX_タグリンカー_xxx、xxx=標的抗原)を挿入した。発現ベクターを産生細胞内へとトランスフェクトして、これらの細胞内での組換えpIXの発現を誘導した。使用した異なるプラスミドコンストラクトを表1に列挙する。
異なるクローン化戦略を使用して、アデノウイルスワクチンの製造および検査のための新たなDNAコンストラクトを構築した。
サブクローニングのために、標的DNA配列をあるプラスミド(ドナーベクター)から別のプラスミド(標的ベクター)へと移した。ドナーおよび標的ベクターを、ライゲーション部位において制限消化を介して切断した。再ライゲーションを防止するために、標的ベクターを、DNAの5’末端および3’末端で脱リン酸化を触媒するウシ腸管アルカリホスファターゼ(CIP)で処理した。消化したDNAを、GelGreen色素(#41004,Biotium)を含有する1%アガロースゲル上で分離した。所望のDNAバンドを切り出し、DNA内容物を、E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(D2500;OMEGA bio-tek)を用いて抽出した。簡潔には、ゲルを1容積結合緩衝液(XP2)中に溶解し、HiBind(登録商標)DNA Mini Column上に負荷した。2回洗浄した後、カラムを乾燥させ、DNAを溶離緩衝液中で2回溶離した。
サブクローニングとは対照的に、PCRクローニングは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)における挿入物の生成を特徴とする。標的配列を、特異的伸長プライマーを用いてドナーベクターからPCRを介して増幅して、酵素制限部位を挿入する。プライマーをTAG Copenhagenに注文し、テンプレートおよびPfuUltra II Hotstarter PCR Master Mix(#600850,Agilent Genomics)と混合した。PCRを95℃で2分間インキュベートすることによって開始して、Taqポリメラーゼを活性化させ、DNAテンプレートの完全な変性を促進した。初回のステップに続いて、95℃での変性、60℃でのアニーリングおよび72℃でのDNA伸長を30周期とした。PCRは、最終ステップを72℃で3分間で完了して、DNA伸長を終了する。
Gibsonアセンブリを使用して、いくつかのDNA断片を1つのコンストラクトへ組み込んだ。断片を伸長PCRによって増幅して、標的ベクターと相同のオーバーハングを付加した。PCR産物をPCRクローニングについて説明したとおり処理および精製した。標的ベクターを挿入部位での制限消化を介して開環した。断片をアセンブリするために、開環した標的ベクターおよび精製した挿入物を1:3の化学量論比で混合し、50℃で1時間、Gibson Assembly Master Mix(E2611、New England BioLabs)とともにインキュベートした。Master Mixにおける3つの鍵となる酵素は、アセンブリを促進した。エキソヌクレアーゼは、DNAを断片の5’末端から取り出し、相同領域において他の断片とアニールする一本鎖の3’オーバーハングを創生する。ヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによって残余の間隙中へと挿入される。最終的に、DNAリガーゼは、アセンブリしたDNAにおいてニックを接合する。先に説明したクローン化技術と同様に、アセンブリしたDNAを細菌内へと形質転換した後、正確なコンストラクトについてスクリーニングした。
アデノウイルスゲノム(Ad5)内への標的遺伝子の挿入を、E.coliにおける相同組換えによって実施した。相同領域を有する768tetから標的ベクターまでの挿入物(標的遺伝子)を、制限消化を介して切り出し、ゲル電気泳動法によって精製した。アクセプターベクターである捕獲pBGH(Ad5ゲノム)を同様に、制限消化によって線状化した。再ライゲーションを防止するために、切断ベクターをCIP処理へ供した(サブクローニングを参照されたい)。その後、ベクター-DNAをエタノール沈殿によって精製した。簡潔には、DNAを0.3M酢酸ナトリウムおよび70%エタノール中に沈殿させ、-80℃で20分間凍結させ、16.000gで15分間(4℃)遠心分離した。ペレットを70%エタノール中で洗浄し、さらに5分間遠心分離した。室温(RT)で乾燥させた後、DNAを水中に再懸濁した。さらなる再ライゲーションを防止するために、アデノシンオーバーハングを、TempaseホットスタートDNAポリメラーゼ(#230306、Ampliqon)を用いて生成した。その後、DNAを、フェノールクロロホルム抽出を介して精製した。この目的のために、フェノールクロロホルムを反応混合物へ添加した後、16.000gで10分間遠心分離した。上部の水相を新たな反応チューブへ移し、DNAを先に説明したとおり、エタノール沈殿によって抽出した。
cDNA_HERV-K(Gag_p2A_Env-(Q6A)ISD-突然変異体)。
Escherichia coli(E.coli)形質転換
形質転換のため、化学的に受容能力を持つE.coli XL1-Blue Supercompetent Cells(Agilent,200236)およびOne Shot(商標)PIR1 Chemically Competent Cells(Thermofisher Scientific,C101010)を使用した。20μLの後者を10ngのプラスミドDNAと一緒にまとめて混合し、氷上で3分間維持した。その後、この混合物にWaterbath TW80(Julabo)で42℃で45秒間熱ショックを与え、再度氷上で3分間置いた。直後に、200μLのCatabolite抑制(SOC)培地(20gトリプトン、5g酵母抽出物、0.58g NaCl、0.19g KCl、3.96gグルコースおよび5.04g MgSO4・7H2O)含有の200μLのSuper Optimal Brothを試料へ添加し、これを振盪中のインキュベーター内へ入れ、37℃で1時間置いた。最終ステップは、本発明者らのプラスミドが耐性を有する、対応する抗生物質(アンピシリン(Amp):100μg/mL、カナマイシン(Kan):50μg/mL)を含有するLBアガープレート上へ試料を播種することからなり、E.coliアガープレート(Binder)についてはインキュベーター内へ入れ37℃で一晩置いた。
形質転換が正確に実施されたかどうかをチェックするために、DNAを精製されたコンストラクトを、臭化エチジウムまたはGelGreen(商標)色素(Biotium,41004)を含有する1%(w/v)アガロースゲル上で泳動して、紫外(UV)光の下でDNAを可視化することができた。1×ローディング緩衝液(6×)を試料へ添加し、この試料をサイズマーカーGeneRuler 1kb Plus DNA Ladder(Thermo Fisher Scientific,SM1331)と一緒にゲルへ負荷した。使用する緩衝液は、トリス-酢酸-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(TAE)緩衝液(4.86g/L Trizma(登録商標)塩基、0.37g/L Na2EDTA・2H2O、および0.11%(v/v)酢酸、pH=8.3)とした。電気泳動法を120Vで1時間、電気泳動用電源EPS3501XL(GE Healthcare)を用いて実施した。
クローン化後の正確なコンストラクトについてスクリーニングするために、DNAの小規模増幅を実施した。細菌コロニーを3mLまたは5mLのLB培地(関心対象のプラスミドにおける耐性遺伝子によって対応する抗生物質Amp100μg/mLまたはKan50μg/mLを含有)内へと移し、37℃で一晩生育させた。プラスミドDNAの単離を、E.Z.N.A.(登録商標)Plasmid DNA Mini Kit I(D6943,Omega bio-tek)を用いて実施した。簡潔には、細菌を遠心分離によってペレットにし、RNアーゼ含有溶液I(再懸濁緩衝液)中で再懸濁した。溶液II(溶解緩衝液)を添加してDNAを細胞から放出した。反応を終止させ、ゲノムDNAを細胞デブリとともに沈殿させるために、溶液III(中和緩衝液)を添加した。沈殿物を遠心分離によってペレットにし、上清をHiBind(登録商標)DNA Mini Columnへと移した。遠心分離によってDNAをカラム膜へ結合させ、かつHB緩衝液を添加した後、カラムをDNA洗浄緩衝液で2回洗浄し、その後乾燥させた。最終的に、プラスミドDNAを溶離緩衝液中に溶離させた。
より多量かつより精製されたDNA収量を得るために、100mLのLB培地(ここでも適切な抗生物質を含有)中で一晩生育させたE.coliから、NucleoBond(登録商標)Xtra Midiキット(#740410,AH Diagnostics)を用いてミディ調製を行った。原理は、細菌を再懸濁および溶解することで出発するミニ調製と同様であった。中和後、溶解物を、平衡化したNucleoBond(登録商標)Xtra Column上に負荷し、平衡化緩衝液で洗浄した。残余の細胞デブリを含有する挿入されたカラムフィルターを取り出し、カラムを洗浄緩衝液で洗浄した。DNAを溶離緩衝液中に溶離し、その後、イソプロパノール中で沈殿させた。沈殿したDNAを遠心分離によってペレットにし、70%エタノールで洗浄した。追加の遠心分離ステップの後、上清を取り出し、DNAペレットをRTで乾燥させた。DNAを100μLの10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中にまたはE.Z.N.A.(登録商標)Plasmid DNA Mini Kitからの100μLの溶離緩衝液で再構成して、濃度をNanoDrop(商標)2000で決定した。
異なるウイルスを本実験で作製および検査した(表2)。通常の組換えアデノウイルスに加えて、表面上に組換えpIXを提示するAd5ベクターが検査され、異なる手順で作製されなければならなかった。
Env蛋白質は、次の配列(配列番号41)を有する。
Ad5生成の出発点は、アデノウイルスゲノムプラスミド捕獲pBGHである。プラスミドは、感染性Ad5粒子の形成に必要とされる遺伝子をすべて含有しているが、遺伝子E1およびE3が欠失している。E1は、ウイルス複製に必要とされ、代わりに、産生細胞株HEK293/アデノウイルス毒素産生によって提供される(Kovesdi,I.and S.J.Hedley,Adenoviral producer cells.Viruses,2010.2(8):p.1681~703)。E3は、ウイルス産生に非必須の遺伝子であり、該ゲノム内で欠失しており、組換え標的遺伝子のための空間を創生する。捕獲クローン化の過程(「0 組換えアデノウイルスゲノムを生成するための相同組換え」を参照されたい)で、これらの標的遺伝子は、相同組換えを介してベクター内へと挿入される。標的蛋白質を捕獲pBGH内へクローン化することおよび後続のウイルス産生の過程を図5に要約する。
ウイルス精製の第1のステップにおいて、収穫した大規模溶解物へ0.5%のIgepal CA-630(#56741、Sigma-Aldrich)を添加した。RTで10分間のインキュベーションの間、界面活性剤は、残存する細胞の破壊および培地中へのウイルス含有物の放出を生じた。細胞残渣を除去するために、溶解物を12186gで4℃で20分間遠心分離した。上清を回収し、容積の半分を20%ポリエチレングリコール(PEG)+2.5M NaCl溶液として添加し、次いで、4℃で一晩緩徐に振盪させた。このステップの間、上清中のウイルスを沈殿させ、これは、次のステップにおいてウイルスの濃縮を可能にした。沈殿したウイルスを12186gで20分間の遠心分離によってペレットにした。ウイルスペレットを5mLの冷リン酸塩類緩衝液(PBS)中で再懸濁し、15mLのファルコンチューブへ移した。この試料を784gで5分間遠心分離して、残存する細胞残渣を除去した。上清を新品の15mLファルコンチューブへ移し、先の遠心分離ステップを、完全には除去することができない細胞残遺物の少量のペレットしかチューブ内に存在しなくなるまで数回反復した。ウイルス含有上清にほとんどの飽和CsCl溶液を添加して、1.34g/mLの最終密度に到達した。結果として生じる溶液を超遠心分離チューブ(#342413、Beckman Coulter)へと移し、その後密封し、Beckman Coulter Ti 70.1ロータにおいて257,300gで一晩遠心分離した。明確に視認できるウイルスバンドを針および注射器で抽出し、平衡化したPD-19脱塩カラム(#17-0851-01、GE Healthcare)上に負荷した。フロースルー画分を70%グリセロール中に回収し、グリセロール終濃度は10%であった。最大ウイルス濃度(最大濁度)の画分をプールし、分注し、-80℃で保存した。ウイルスの分注物を解凍して凍結するのは2回までとした。
Ad5-pIXウイルスの生成を、通常の組換えAd5ウイルスとは異なる戦略を用いて実施した。産生細胞株は、先に説明したHEK293(CCS)-shmir-pIX_221-ピューロ細胞株(pIX細胞)とした。pIX細胞を175cm2フラスコ内へ播種し(ウイルス1つにつき4つのフラスコ)、70%培養密度まで生育させた。組換えpIX蛋白質を生成するために、細胞に、pIXを遺伝子融合によって組換え蛋白質にカップリングさせたpcDNA3_pIXプラスミドをトランスフェクトした。ドキシサイクリンを培地に添加(0.5μg/mL)した後、トランスフェクトし、このことは、未処置のpIXの翻訳を阻害するpIX特異的shRNAの転写を誘導した。細胞培養用培地をトランスフェクションの18時間後に交換し、ドキシサイクリンを再度添加した。その後、細胞に5MOI(感染多重度)の個々の基部アデノウイルス(関心対象の組換え蛋白質についてコードするアデノウイルス)を感染させた。ウイルスの複製は、ウイルスの細胞変性効果が視認できるまで、通常の培養条件下で48時間行わせた。細胞を収集し、750gで10分間の遠心分離によってペレットにした。ペレットを0.5%デオキシコール酸ナトリウム含有PBS中で再懸濁し、RTで30分間インキュベートして、細胞を分解し、ウイルスを放出した。産生細胞株からのゲノムDNAを消化するために、0.2M MgCl2および0.05mg/mL DNAse I(A3778、AppliChem)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。細胞デブリを3000gで15分間の遠心分離によって除去し、CsClをウイルス含有上清に添加して、終濃度を1.34g/mLとした。ウイルスをAd5精製について先に説明したとおり、CsCl勾配において超遠心分離した。抽出したウイルスバンドを透析膜(Spectra/Por(登録商標)Dialysis Membrane,300kDa,#131450,Biotech CE Tubing)へ移し、PBS中で4℃で一晩透析した。最終的に、ウイルスを10%グリセロール中で分注し、-80℃で保存した。
実験の再現性のため、精製されたウイルスを滴定して、1mLあたりの感染単位数(IFU/mL)を取得した。平底△処理した表面の96ウェルプレートをポリリジンで15分間コーティングし、PBSで3回洗浄した。HEK293細胞をウェル中へ、100μLの培地中の5×104個の細胞濃度で播種した。ウイルスを培地中で10倍連続希釈で希釈し、1:50の希釈で出発した。50μLの希釈因子5×104~5×107を96ウェルプレート中の細胞懸濁液へ二つ組で添加した。感染細胞を通常の細胞培養条件下で48時間インキュベートした。培地を除去した後、ウェルをRTで乾燥させ、細胞を冷メタノールで-20℃で10分間固定した。その後、ウェルを、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSで3回洗浄した。ウイルス感染細胞を検出するために、抗Ad5ヘキソン抗体(1E11、#sc-51746、Santa Cruz Biotechnologies)をPBS+BSA中に1:1000の希釈で添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBS+BSAで3回洗浄した後、PBS+BSA中に1:500希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合したマウス免疫グロブリンに対する二次抗体(#P0447、Dako)を、ウェル中で37℃で1時間インキュベートした。残余抗体を洗い出し、ウイルスプラークを3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)基質を用いてRTで10分間可視化した。
組換えアデノウイルスからのDNAの単離を実施して、アデノウイルスゲノムへの組換え遺伝子の正確な挿入を確認した。DNAをGenElute(商標)Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(G1N70、Sigma-Aldrich)で、改変プロトコルを用いて抽出した。この目的のため、100μLの精製されたウイルス試料を100μLの再懸濁溶液と混合した。プロテイナーゼKおよび溶解溶液Cを添加した後、70℃で10分間インキュベートした。96%エタノールを添加した後、溶液を、調製された上に負荷した。その後のステップは、元のプロトコルに従ったが、2回の洗浄ステップおよびその後のカラムの乾燥があった。ウイルスDNAを溶離溶液中に溶離した。ウイルスの質的確保のため、DNAを配列決定のために送付して(GENEWIZ UK Ltd.)、相同組換えの領域における突然変異を除外した。加えて、ウイルスDNAを制限酵素で切断して、ゲル電気泳動法によって正確なバンドの大きさを確認した。
ウイルス様粒子(VLP)の生成および精製を主として、VLPをコードするワクチンの機能性を検査するために行った。1×107個の細胞密度で175cm2培養フラスコ内へ播種し、2時間インキュベートして付着させておいたベロ細胞において、VLP生成を検査した。その後、細胞に50MOIのAd5(5×108個のIFU/フラスコ)を5時間感染させた。培地を除去した後、細胞をPBSで2回洗浄し、無血清培地中で48時間インキュベートした。上清(SN)を282gで10分間遠心分離し、0.45μMの膜で濾過して、細胞混入物を除去した。開口32mL肉厚チューブ(#355631、Beckman Coulter)を用いたBeckman Coulter Ti 70ロータにおいて82.700gで20%スクロースクッションを経てペレットにすることによって、VLPを精製した。SNを除去し、ペレットを100μLのPBS(160×元の濃度)中で再懸濁した。
MVAの生成、精製および滴定のための手順は、Staib et al.2004によって説明される指針を用いて実施した。この実験を実施するのに使用されるHERV-K GagまたはEnv蛋白質シード溶解物を発現する出発MVAは、Barbara Schnierle博士教授(Langen,Germany)によって提供された。175cm2フラスコを用いて大規模にMVAを生じる前に、ウイルスの量をこれもまた175cm2フラスコを用いて小規模で増量し、いずれの場合もCEF細胞で播種した。
6~8週齢の雌C57BL/6マウス、Balb/Cマウス、およびCD1マウスをTaconic(C57BL/6)またはEnvigo(Balb/CおよびCD1)から取得した。マウスを1週間順化させておいた後、実験を開始した。実験はすべて、国の動物実験検査官(デンマーク語で動物実験検査官(Dyreforsogstilsynet))によって承認された国の指針および実験プロトコルにより実施した。
血清試料を取得するために、全血量のおよそ10%をマウスから顔面静脈をGoldenrod lancetを用いて穿刺することによって採取した。
異なる注射手順を実施した。静脈内(i.v.)注射については、マウスを加温チャンバ内で加温し、表在性静脈血流を増大させた。最大200μLを尾静脈内へ注射した。HERV-K関連実験において、106個のRLZ Gag細胞およびEnv細胞(B.Schnierle由来)を含有する100μLの容積をマウスへ静脈内注射して、肺への転移を誘発させた。
5回の異なる予防接種試行をマウスにおいて実施した。
B16F10-GP細胞の生体内での転移を評価するために、培養細胞をPBSで3回洗浄し、ベルセン中で37℃で15分間インキュベートすることによって脱離させた。細胞をその後282gで遠心分離し、PBSで洗浄して、PBS中の2×10^6個/mLの濃度まで希釈した。100μL PBS中の2×10^5個の細胞をマウスの尾静脈内へと静脈内注射し、その結果として、肺における腫瘍の転移が生じた。負荷したマウスを14日後に安楽死させた。肺を分離し、PBS中の2%パラホルムアルデヒド(PFA)の溶液中で一晩固定した後、PBS中で4℃で保存した。転移を解剖用顕微鏡下で肺表面上の黒色結節として計数した。試料を盲検化し、転移を少なくとも2名によって計数した。CT26腫瘍の原発成長を分析するために、CT26細胞をB16F10-GP細胞について説明したとおり調製し、PBS中の5×10^5個の細胞の右大腿部における皮下注射は結果として、注射部位における腫瘍の形成を生じた。腫瘍の大きさを長さおよび幅において週3回測定した。腫瘍量を長さ×幅2×0,5236として決定した(Janik,P.,et al.,The Effect of Estrone-Progesterone Treatment on Cell Proliferation Kinetics of Hormone-dependent GR Mouse Mammary Tumors.Cancer Research,1975.35(12):p.3698~3704)。腫瘍がいかなる側部においても16mmを超過したか、壊死性創傷が生じたか、またはマウスの可動性が顕著に低減したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍の測定の間、異なる予防接種群を盲検化して、偏向のある評価を防止した。
pIX-蛋白質の検出のために、細胞溶解物(約10μg)または精製されたウイルス(1010個のウイルス粒子)を、DDTを含有する6×SDS負荷緩衝液と混合し、95℃で5分間加熱した。MelARV蛋白質の発現を示すために、細胞溶解物(5μg)、細胞上清(15μg)および精製されたVLP(約2μg)を同様にDDT含有負荷緩衝液と混合したが、試料を加熱しなかった。この混合物をNuPAGE(商標)4~12%Bis-Tris Protein Gel(#NP0322、Thermo Fisher)に負荷し、150VでMOPS緩衝液中で1時間泳動した。ゲル中の蛋白質含有量を湿式転移系においてニトロセルロース膜へ30Vで1時間転写した。
予防接種したマウスにおけるMelARV特異的抗体の検出のために、BSAに結合したMelARV Envサブユニットp15EのペプチドをSchafer-N(Copenhagen、Denmark)から購入した。
HERV-K関連実験において、FACSを用いて、予防接種したマウス由来の活性化型免疫細胞の細胞外マーカーおよび細胞内マーカーの両方、ならびに感染A549細胞の表面上でのHERV-K Env蛋白質の存在を検出した。細胞選別に使用される機械は、フローサイトメーターBD LSR II(BD Biosciences)とした。
非HERV-K実験において、癌細胞に対する血清抗体の結合を検出するために、フローサイトメトリーを実施した。B16F10-GP細胞またはCT26細胞を再懸濁し、丸底96ウェルプレート中に1ウェルあたり4×105個で播種した。プレートを784gで3分間(4℃)遠心分離して、ウェルの底部に細胞を固定した。プレートを上下逆転させて弾くことによって、培地を除去し、マウス血清を1:50の希釈で含有する50μLの蛍光標示式細胞分取(FACS)培地(PBS+1%BSA+0.1%NaN3)中に細胞を再懸濁した。4℃で20分間のインキュベーション後、プレートを784gで3分間(4℃)遠心分離し、培地を除去した。細胞を200μLの洗浄培地(PBS+0.1%NaN3)で2回洗浄し、1;100希釈したマウス免疫グロブリンG(IgG)に対する蛍光標識した二次抗体(ヤギ抗マウスIgG_APC、#405308、Biolegend)を含有する50μLのFACS培地中で再懸濁した。細胞を4℃で20分間インキュベートし、洗浄緩衝液で2回洗浄し、200μLのPFA溶液(PBS中1%)中で4℃で15分間固定した。細胞をFACS培地中で2回再懸濁し、BD LSR II Flow Cytometerにおいて蛍光について分析した。
Ad19a(II)-(TetO)-CMV-ISD突然変異体_MelARV-P2TS
Sirion製のAd19a(II)-(TetO)-CMV-coHERV-K-P2TS
Sirion製のAd19a(II)-(TetO)-CMV-ISD突然変異体_coHERV-K-P2TS
マウスを予防接種の3~4週間後に安楽死させ、脾臓を分離した。摘出された脾臓をHANKS B.S.S.へ移し、滅菌ネットを経てマッシュ状にし、単一細胞の懸濁液を取得した。完全RPMI中での遠心分離および再懸濁の後、脾細胞の濃度を決定し、必要とされる濃度へ細胞を希釈した。
FlowJo10(FlowJo LLC)を使用して、細胞外染色およびIC FACS染色からのデータを解析した(図27を参照されたい)。まず、細胞を順方向スキャッタ(FSC)-HおよびFSC-Aにおいてプロットし。ゲート処理した。このゲートを使用して、側部スキャッタ(SSC)-AおよびFSC-Aのプロットにおけるリンパ球集団を分離した。後者の集団をCD8+ CD4-細胞について、その後CD8+ B220細胞をゲート処理して、CD8+ T細胞集団を取得し、CD4+ T-細胞およびB細胞(B220マーカー)の両方を解析から除去する(Coffman & Wei
ssman 1981)。次に、細胞をCD8+ CD44+ T細胞についてゲート処理し、活性化型CD8+ T細胞のみを取得した。これらを、IFNγ+ CD44+細胞についてさらにゲート処理したが、これらはいずれも、T細胞活性化に対する結果として発現したマーカーである。その上、IFNγは、活性化型CD8+ T細胞にとって、TNFαサイトカインと比較したとき、より高い感受性のマーカーであることは公知である(Badovinac & Harty 2000)、(Kristensen et al.2004)。加えて、CD8+ CD44+ T細胞をIFNγ+ TNFα+ 細胞についてゲート処理し、その理由は、多重のサイトカインを産生するCD4+ T細胞がより高いレベルの活性、活性化を有し、記憶細胞となることが公知であるからである(Kannanganat et al.2007)。
ELISPOTアッセイを実施して、抗原特異的T細胞を検出した。本実験において使用されるペプチドはAH1(SPSYVYHQF)としたが、これはMelARV Envサブユニットgp70内に位置するBalb/Cマウスにおける公知のH2-Ld制限T細胞エピトープである、(Huang,A.Y.,et al.,The immunodominant major histocompatibility complex class I-restricted antigen of a murine colon tumor derives from an endogenous retroviral gene product.Proc Natl Acad Sci U S A,1996.93(18):p.9730~5)。
陽性対照血清LEV76を、マウス血清試料のフローサイトメトリーおよびELISA分析のための標準物質として使用した。C57BL/6マウスがMelARV Envに対して予防接種され、B16F10-GP肺への転移からの防御を示した初期のパイロット試験からLEV76血清は生じている。したがって、この血清における抗体応答は、腫瘍負荷から防御することが潜在的にできるレベルと対応しており、それゆえ、うまくいく抗体応答のための参照値として機能した。加えて、LEV76対照血清を使用して、異なる実験間の比較が可能となった。
統計分析はすべて、GraphPad Prismソフトウェア(第5.03版)を用いて実施した。群を対応のない両側Mann-Whitney検定を用いて比較した。有意性を星印によって示す。*(P≦0.05)、**(P≦0.01)、***(P≦0.001)。予防接種したマウスの異なる群を比較するとき、結果を各群の平均として平均の標準誤差(SEM)とともに示す。
ワクチンによりコードされた免疫抑制性ドメイン(ISD)における突然変異
改善の第1の戦略として、2つの点突然変異をMelARV Envの配列中に導入して、免疫抑制性ドメイン(ISD)を不活性化した(図3)。これらの特異的な突然変異をマウス白血病ウイルスについてSchlecht-Louf et al.によって以前検査および分析した(Schlecht-Louf,G.,et al.,Retroviral infection in vivo requires an immune escape virulence factor encrypted in the envelope protein of oncoretroviruses.Proc Natl Acad Sci U S A,2010.107(8):p.3782~7)。MelARV Envのこの改変版についてコードするウイルスは、Ad5-MelARV-ISDと呼ばれる。
非近交系CD1マウスをDNA-MelARVまたはDNA-MelARV-ISDで初回免疫し、その後、予防接種タイムラインIVにより、AD5-MelARVまたはAd5-MelARV-ISDのいずれかで追加免疫した。アデノウイルス予防接種の4週間後、血液試料を回収し、ELISAによって分析した。
C57BL/6マウスにおける抗体応答および転移に及ぼすAd5-MelARV-ISDの効果
予防接種タイムラインIIIによりC57BL/6マウスに予防接種および負荷した。マウスは、DNA-MelARVまたはDNA-MelARV-ISDのいずれかの後、個々のアデノウイルスを受けた。抗体応答の解析で、MelARV-ISDがB16F10-GP細胞特異的抗体のレベルをわずかに上昇させることが明らかとなった(図8A)。しかしながら、上昇は有意ではなく、PBSを接種したマウスの背景をわずかに上回った。図8Bに示すように、p15Eに特異的な抗体に及ぼす効果は観察されなかった。腫瘍細胞結合抗体に対応して、転移は、MelARV-ISD接種したマウスにおいてわずかに低減したが、有意差はなかった(図8C)。
Balb/CマウスにおけるT細胞応答に及ぼすAd5-MelARV-ISDの効果
抗体応答に加えて、T細胞の初回免疫および活性化に及ぼすAd5-MelARV-ISDの効果を解析した。ELISPOT(図9)およびICS(図10)のいずれも、Ad5-MelARVと比較してAd5-MelARV-ISDを接種したマウスにおいてAH1特異的T細胞のレベルの上昇を示した。ICSによって観察されるように、二重陽性IFNγ+ TNFα+ CD8+ T細胞は、未処置の形態と比較してAd5-MelARV-ISD接種したマウスにおいて有意に上昇していた。また、IFNγ+細胞の積分幾何平均(IGM)は、未処置のAd5-MelARVに対して有意差を示す。IGMは、陽性細胞の数を平均蛍光強度と組み合わせ、したがって、活性化された免疫細胞の量も考慮している。TNFαのIGMはなおも有意ではなかった(データ非表示)。
免疫抑制に及ぼすAd5-MelARV/Ad5-MelARV-ISDの効果
Ad5-MelARV-ISDの免疫応答の上昇に潜む機序を解析するために、ワクチンによる免疫抑制を分析した。Ad5-MelARVまたはAd5-MelARV-ISDを接種したマウスの、図7にあるのと同じマウス血清を、ELISAによるウイルスベクターに対する免疫応答について分析した。ISD不活性化MelARV Envワクチン(Ad5-MelARV-ISD)は、MelARV Envの未処置版(機能的ISDを有するAd5-MelARV)と比較してAd5結合抗体の力価の有意な上昇を示した。
アデノウイルスベクターのカプシド蛋白質pIX上での抗原提示
防御抗体応答を上昇させる試みで、p15Eをすでに検査したアデノウイルスワクチン上のアデノウイルスカプシド蛋白質pIXへ連結させた。検査された異なるコンストラクトを図12に示す。未処置のp15E(膜貫通サブユニットおよび細胞質尾部を除外)をpIX(1)またはそれに代わるものとしてISD突然変異版(2)のいずれかに付加した。加えて、追加のシステインを提示した(3)かまたは提示しなかった(4)かのいずれかで、ISDに対して切断型のp15Eのバリアントを検査した。ウイルスベクターのコアは、提示されたp15Eと一致しており、すなわち、pIX-p15EについてはAd5-MelARV、pIX-p15E-ISDについてはpIX-p15E-切端-CありおよびpIX-p15E-切端-Cなし、ならびにAd5-MelARV-ISDであった。
新たなpIXプラスミドコンストラクト(pcDNA3-pIX-タグリンカー―xxx、xxx=p15E抗原)を、HEK293細胞をトランスフェクトすることによって組換えpIXの正確な発現について検査した。トランスフェクトした細胞の溶解物を図13Aの抗pIX抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。4つのコンストラクトはすべて、切断型p15E版について期待されたより低いバンドで組換えpIXの発現を示した(ライン3および4)。pIXに連結したGFPは、約50kDaのより高いバンドを有する陽性対照として使用した。組換えpIXのウイルスベクター内への組込みを確証するために、精製されたウイルスを、図13Bの抗pIX抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。未処置のpIXバンド(約10kDa)の隣で、コンストラクトはすべて、組換えpIXの発現を示した。未改変Ad5
CD1マウスにおけるpIX改変したウイルスによって誘導される抗体応答の分析
CD1マウスに予防接種タイムラインIXにより、DNA初回免疫(DNA-MelARVまたはDNA-MelARV-ISD)に続いてアデノウイルス追加免疫(通常ウイルス対pIX改変型)を用いて予防接種した。血清をELISAによってp15E特異的抗体について分析した図14A。ELISAに使用したp15Eペプチド配列は、pIX改変の切断型板には含まれていなかったので、Ad5-MelARV_pIX-p15EおよびAd5-MelARV-ISD_pIX-p15E-ISDのみがこの設定において査定されることができた。ほとんどの場合、pIX上でのp15Eの提示は、p15E特異的抗体(A対B、C対D、E対F)のレベルを上昇させた。しかしながら、これらの比較において、唯一の有意差は、DNA-MelARV+Ad5-MelARV(A対B)について観察された。DNA-MelARV-ISD+Ad5-MelARV-ISD(G対H)の場合、pIX-p15E-ISDの提示は、非改変型ワクチンと比較して悪化した効果および有意に低下した抗体応答を有していた。加えて、B16F10-GP細胞に対する血清抗体の結合を分析した(図14B)。pIX上での未処置のp15Eの提示は、腫瘍細胞に対する抗体応答に影響しなかった。その一方で、Ad5-MelARV-ISD_pIX-p15E-ISDは、ISD突然変異型MelARV Envにより低減するB16F10-GP特異的抗体の欠失を収縮することができた(図7と比較されたい)。
C57BL/6マウスにおける抗体応答および転移に及ぼすAd5-MelARV_pIX-p15Eの効果
pIX改変型ウイルスAd5-MelARV_pIX-p15EをC57BL/6マウスにおける抗体応答および転移からの防御についてのパイロット試験において検査した。マウスに予防接種タイムラインVにより、2回予防接種および負荷した。図15Aおよび15Bに示すように、ワクチンはB16F10-GP細胞(15A)にもp15E(図15B)にも抗体応答を有意に上昇させなった。また、転移数は、予防接種によって有意に低下しなかった(図15C)。しかしながら、腫瘍細胞特異的抗体と転移計数との間に相関は検出されなかった(図15D)が、p15E特異的抗体のレベルと転移数との間に有意な負の相関が観察された(図15E)。
(より天然の立体配座において)量だけでなく質に関してもVLP上でのMelARV Envの提示を改善する試みにおいて、機能的ドメインを未処置の配列へ適用した。これらの改変を完全長のMelARV Envにだけでなく、p15E単独へも適用した(図16)。この改変には、Gaussiaルシフェラーゼ(LucSP)からのシグナルペプチド、インフルエンザA型ウイルス赤血球凝集素H3N2(HA-TMCT)由来の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部、ならびに三量体化配列(GCN4)が含まれた(図16)。キメラEnv蛋白質またはp15E蛋白質をSIVのうちのGag蛋白質と共コードした。
改変型ワクチンをマウスで検査しなかったが、アデノウイルスからの発現を感染ベロ細胞においてフローサイトメトリーによって検査した(図17)。本実験は、蛋白質の発現を示すだけでなく、該蛋白質の標的エピトープに関する抗MelARV Envのいくつかも特徴とする。19F8(図17A)および4F5(図17B)の両方が、未処置のワクチン(Ad5-MelARVおよびAd5-MelARV-ISD)と比較してMelARV Envおよびp15Eの改変版に対する非常に高い結合を示した。Ad5-LucSP_GCN4_p15E_HA-TMCTに対する結合は、同様に観察されることができたので、本実験は、両抗体が、膜貫通サブユニットp15Eを結合することを示す。さらに、Ad5-MelARV-ISD感染細胞に対する19F8の結合は観察されなかったのに対し、明確なシグナルが4F5に対して検出され、ISDを19F8の標的エピトープとして確認した。MM2抗体はいずれもp15Eコンストラクトに対する結合を示さなかったが、3つの抗体がすべて、表面サブユニットgp70に対して指向することを実証した。MM2-9B6(図17C)およびMM2-3C6(図17D)は、Ad5-MelARV感染細胞およびAd5-LucSP_MelARV_HA-TMCT感染細胞に対する抗体の等しく強力な結合で、同様の特性を示した。その一方で、Ad5-MelARV-ISD感染細胞は、非常に低い抗体結合を示した。MM2-9A3(図17E)の特性は、同様であるが、例外は、Ad5-MelARV感染細胞がAd5-LucSP_MelARV_HA-TMCT感染細胞よりも抗体結合性が低かったことは例外である。
次のコンストラクトを使用して、balb/cマウスを免疫化した;HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD(野生型)、HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD ISD#4(Y75G)、HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD ISD#19(L70Q)、HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD G19Rdb(G83K,S88F)。抗体応答をHIV ConB gp140野生型蛋白質に対する免疫化の4週間後(d.28-図20A)および7週間後(d.49-図20B)に分析した。IiGP-P2A-IFNalpha4およびHIV B gag P2A ConB gp140 G/CD(野生型)(420B)は、I型インターフェロン誘導性応答のための対照群として機能する。
次のコンストラクトを使用して、balb/cマウスを免疫化した。HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD(野生型)、HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD ISD#4(Y75G)、HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD ISD#19(L70Q)、HIV B gag P2A ConB gp140 G/CD G19Rdb(G83K,S88F)。免疫化の4か月後(d.114)、マウスを、Gag遺伝子(MA(p17,マトリックス)(ペプチド1~31)、CA(p24、カプシド)(ペプチド32~89)、p2、NC(ヌクレオカプシド)、p1、およびp6を網羅する単一のプール(ペプチド90~124)、gp120(1)(ペプチド1~62)、gp120(2)(ペプチド63~124)、gp41(ペプチド125~211)を網羅するペプチドのプールに対するT細胞応答について分析した。
BALB/cマウスにMVA発現gag、env、gag+env、VE-VLPまたはアデノウイルス発現gag-envもしくはgag+envISD突然変異体VE-VLP、およびこれらの組み合わせのいずれかを予防接種し、9アミノ酸長のペプチドを結合する推定MHCに向けて、ELISPOTまたは細胞内サイトカイン染色を用いて測定される。
BALB/cマウスに、VE-VLPとしてgag、env、gag+env、gag+envISD突然変異体を発現するMVA、またはgag-envもしくはgag+envISD突然変異体VEVLPを発現するアデノウイルスのいずれか、およびこれらの組み合わせを予防接種し、HERV-Kconの膜貫通ドメインp15Eの細胞外部分の配列に由来するペプチド応答を測定する。
動物に、HERVcon-gagおよびHERVcon-envをそれぞれ発現するRENCA腎癌細胞を皮下負荷する。その後、動物に、gag、env、gag+env、gag+envISD突然変異体をVE-VLPとして発現するMVA、またはgag-envもしくはgag+envISD突然変異体VEVLPを発現するアデノウイルスのいずれか、およびこれらの組み合わせを予防接種し、腫瘍の成長をモニターする。
動物にそれぞれHERVcon-gagおよびHERVcon-envを発現するRENCA腎癌細胞を静脈内負荷する。その後、動物に、gag、env、gag+env、gag+envISD突然変異体をVE-VLPとして発現するMVAまたはgag-envもしくはgag+envISD突然変異体VEVLPを発現するアデノウイルスのいずれか、およびこれらの組み合わせを予防接種し、腫瘍の成長を生体解剖によってモニターし、腫瘍負荷の30日後に転移を計数する。
先行実施例において説明された免疫療法戦略に関する翻訳の研究に関して、形質導入された細胞におけるVLP形成をもたらすよう企図された(Muster et al.2993)、コンセンサス塩基配列ヒト内在性レトロウイルスK型(HERV-K)エンベロープ(Env)蛋白質および群特異的抗原(Gag)蛋白質についてコードするアデノウイルスベクター(Ad5/Ad19a)(Dewannieux et al.2006)を用いて、ワクチンのヒト関連版を設計した。予防接種戦略を改善するために、HERV-K Env蛋白質のp15Eサブユニット中に含有されるISDは、単一の点突然変異によって不活性化される(図22を参照されたい)が、その選択は、Morozov et al.2012およびHERV-KとHIVとの間の保存に基づいていた(van der Kuyl 2012)(Dewannieux et al.2005)。
Ad19_HERV-K野生型/ISD突然変異体ワクチンによって誘導されるT細胞応答を検査するために、BALB/cマウスにおけるP-HKE(配列TYHMVSGMSLを有するHERV-K Envの10マーのペプチド)に対するTリンパ球応答を分析した。P-HKEはMHCクラスI束縛エピトープであるので、CD8+ T細胞の活性化、したがって、BALB/cマウスにおけるペプチド刺激後のインターフェロンガンマ(IFNγ)および腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)サイトカインの分泌を、FACSを用いてサイトカインの細胞内染色(ICS)によって測定した。
ワクチンの有効性を検査および比較するために、マウスに負荷し、その後予防接種し、腫瘍の進行と相関のあるマウスの生存を格付けした(図26を参照されたい)。本実験のために、BALB/cマウスに、HERV-K Envを発現するRENCA細胞を静脈内負荷した。腫瘍負荷の10日後、マウスにMVA Env、Ad19_HERV-K野生型/ISD突然変異体、および対照としての無関係ワクチンを接種した。本実験は、(Kraus et al.,2013 PLoS One.Aug 30;8(8):e72756)に基づいており、注射40日後に転移性腫瘍量をスコア化するよう企図したが、動物は縦断的に秤量し、何らかの物理的、行動的、もしくは身体的変化が動物において観察された場合、または体重減少が10%を超えた場合、マウスを安楽死させた。マウスをいったん屠殺すると、肺を収穫し、4%PFA中で保存して、転移の存在についてさらに分析した。特筆すべきことに、体重減少により屠殺した動物はすべて、実質的な大きな腫瘍量を有していた。予期せぬことに、有意な死亡率を本実験の実施中に記録し、生存曲線を確立して、異なる群間で比較した。このことは、既に報告されたものと比較してRENCA-HERV-K腫瘍のより迅速な進行を示した。このむしろ厳密な腫瘍負荷モデルの下で、Ad19_HERV-K_ISD突然変異体ワクチンを受けているマウスは、対照と比較して平均余命の有意な延長を示した。3つの異なる統計学的検定(対数順位、Wilcoxon、およびTarone-Ware)は、有意なp値(0.037、0.046および0.040)を示した。このことは、Ad19_HERV-K_ISD突然変異体ワクチンが、抗体およびCD8+ T細胞応答の増大を示す上述の結果と一致して、BALB/cマウスにおける肺腫瘍の進行および転移を遅延させることを示唆した。他のワクチンはいずれも生存時間を延長しなかった。
ヒトの系においても本知見をさらに確証するために、組織試料をヒト乳房腫瘍から取得した。4μmに薄片化し、非免疫化マウス(出血前血清)から取得した1:1000希釈した一次抗体で染色し、Ad5_HERV-K_Envで初回免疫したマウスは、Ad19_HERV-K_ISD(8週間後)およびMVA_Env(2か月後)の予防接種投与計画で追加免疫を受けた。図28に示されるように、予防接種したマウス由来のHERV-K抗体は、HERV-K標的蛋白質を発現する癌組織を染色することができる。
1.ウイルス様粒子(VLP)をコードすることができるアデノウイルスベクターを含む、疾患の予防および/または治療における使用のためのワクチンであって、該VLPが、不活性型免疫抑制性ドメイン(ISD)を提示する、ワクチン。
Claims (14)
- ヒト内在性レトロウイルス(HERV)エンベロープ蛋白質をコードする、疾患の予防および/または治療における使用のための核酸分子であって、前記蛋白質の免疫抑制性ドメイン(ISD)が、前記ISDを不活性にする突然変異を含有し、かつ、不活性型の前記ISDが、NSQSSIDQKLANAINDLRQT(配列番号50)またはLQNRRGLDLLFLKRGGL(配列番号8)を含む、核酸分子。
- アデノウイルスベクターである、請求項1記載の使用のための、請求項1記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、ウイルス様粒子(VLP)をコードし、前記VLPが、不活性型免疫抑制性ドメイン(ISD)を有するヒト内在性レトロウイルス(HERV)エンベロープ蛋白質を提示する、請求項2記載の使用のための、請求項2記載のベクター。
- 疾患の予防および/または治療における使用のための、請求項3記載のベクターの発現産物を含む、蛋白質。
- 疾患の予防および/または治療における使用のための、請求項1から3までのいずれか1項記載の核酸分子またはベクター、もしくは請求項4記載の蛋白質を含む、ワクチン。
- 癌の予防および/または治療における使用のための、請求項1から5までのいずれか1項記載の核酸分子、ベクター、蛋白質またはワクチン。
- 前記エンベロープ蛋白質が、配列番号41のアミノ酸配列を有する、請求項6記載の使用のための、請求項1から6までのいずれか1項記載の核酸分子、ベクター、蛋白質またはワクチン。
- 前記ISDの上流または下流の10アミノ酸領域における前記アミノ酸の少なくとも1つが、異なるアミノ酸と交換された、請求項7記載の使用のための、請求項1から7までのいずれか1項記載の核酸分子、ベクター、蛋白質またはワクチン。
- 前記ヒト内在性レトロウイルス(HERV)が、HERV-K、HERV-H、HERV-W、HERV-FRD、およびHERV-Eからなる群のうちで選択され、かつ前記HERV-Kが、HERV-K108(=ERVK-6)、ERVK-19、HERV-K115(=ERVK-8)、ERVK-9、HERV-K113、ERVK-21、ERVK-25、HERV-K102(=ERVK-7)、HERV-K101(=ERVK-24)、およびHERV-K110(=ERVK-18)からなる群のうちで選択され、HERV-Hが、HERV-H19(=HERV-H_2q24.3)、およびHERV-H_2q24.1からなる群のうちで選択され、HERV-WがERVW-1(=シンシチン1)として選択され、かつHERV-FRDがERVFRD-1(=シンシチン2)として選択される、請求項8に記載の使用のための、請求項1から8までのいずれか1項記載の核酸分子、ベクター、蛋白質またはワクチン。
- 突然変異を含有するISDを含む前記エンベロープ蛋白質が、配列番号41のアミノ酸配列を有する、請求項1から9までのいずれか1項に記載の核酸分子、ベクター、蛋白質またはワクチン。
- 前記アデノウイルスベクターの蛋白質産物には、gag蛋白質、2Aペプチド、およびエンベロープ蛋白質(Env)が含まれ、前記Env蛋白質が、表面単位(gp70)、開裂部位、および膜貫通単位(p15E)を含み、前記膜貫通単位(p15E)が、融合ペプチド、免疫抑制性ドメイン(ISD)、膜貫通アンカー、および細胞質尾部を含み、かつp15Eもしくはその免疫原性部分が、アデノウイルスカプシド蛋白質pIXに連結され、かつ/または前記アデノウイルスベクターによってコードされたシグナルペプチドが、Gaussiaルシフェラーゼ由来のシグナルペプチド(LucSP)と交換され、かつ/または前記アデノウイルスベクターによってコードされた前記膜貫通アンカーおよび前記細胞質尾部が、インフルエンザA型ウイルス赤血球凝集素H3N2由来の前記膜貫通ドメインおよび細胞質尾部(HA-TMCT)と交換される、請求項1から3または5から10までのいずれか1項記載の使用のための、請求項2または3記載のベクター、もしくは請求項5記載のワクチン。
- 前記アデノウイルスベクターを用いて前記患者を初回免疫した少なくとも5日間後に、請求項5から10までのいずれか1項記載のワクチンで追加免疫するステップを含む、癌の予防および/または治療における使用のための、請求項5から11までのいずれか1項記載のワクチン。
- アデノウイルスベクター由来の前記VLPとは異なる、ウイルスによってコードされたVLPが、改変型Vaccina Ankara(MVA)に由来するVLPである、アデノウイルスベクター由来の前記VLPとは異なる、ウイルスによってコードされたVLPを用いて、前記ワクチンに対する前記患者の曝露の5日間以上後に前記患者を後治療するステップを含む、癌の予防および/または治療における使用のための、請求項5から12までのいずれか1項記載のワクチン。
- 前記ヒト内在性レトロウイルス(HERV)が、HERV-Kである、請求項1記載の核酸分子。
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