CN117940156A

CN117940156A - 治疗性乳头瘤病毒疫苗

Info

Publication number: CN117940156A
Application number: CN202280053653.9A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂安·蒂里翁; 科杜拉·珀特尔; 亚历山大·卡拉斯; 沃尔克·桑迪格; 英格·乔丹; 彼得·乔纳斯·霍斯特; 迪特·拉贝克·布伊勒森; 拉夫·瓦格纳; 帕特里克·奈克曼; 贝内迪克·阿斯巴赫
Original assignee: Inprose Private LLC; Cirian Biotechnology Co ltd; ProBioGen AG; Universitaet Regensburg
Current assignee: Inprose Private LLC; Cirian Biotechnology Co ltd; ProBioGen AG; Universitaet Regensburg
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2022-08-17
Publication date: 2024-04-26
Also published as: WO2023021116A1; AU2022331111A1; EP4137153A1; CA3229203A1

Abstract

本发明涉及包含编码乳头瘤病毒蛋白E1、E6和E7的核酸序列或由编码乳头瘤病毒蛋白E1、E6和E7的核酸序列组成的核酸；其中所述核酸分子编码单个多聚蛋白。

Description

治疗性乳头瘤病毒疫苗

技术领域

背景技术

在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文献。这些文献的公开内容虽然不被认为与本发明的可专利性相关，但其全部内容通过引用并入本文。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的文献被具体地和单独地指示通过引用并入。

尽管存在高效的预防性疫苗和筛查宫颈病变的可能性，但2020年全球仍有超过34万例宫颈癌相关死亡与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关(H.宋等，《2020年全球癌症统计:全球185个国家36种癌症的发病率和死亡率估计》，CA:临床医生癌症杂志，71(3)，209-249,2001)。

超过85％的病例发生在中低收入国家(Haghshenas，M.宫颈癌患者中高危人乳头瘤病毒的患病率和类型分布：一项基于人群的研究。感染.剂.癌症8，20，2013)。目前，有三种批准的预防性疫苗提供针对疫苗靶向的HPV类型的接近完全的保护，但疫苗摄取是不完全的(Brotherton，J.M.L.，Zuber，P.L.F.&Bloem，P.J.N.通过疫苗接种进行HPV的一级预防：当前全球状况的更新.《现代妇产科学报告》2016年第5期，210-224)。此外，这些疫苗并不能消除已经感染的细胞，因为它们针对的是主要的外壳蛋白L1，而这种蛋白在感染的基底层和宫颈癌细胞中并不表达(Lehtinen,M.等。HPV-16/18as04辅助疫苗对3级或更大程度宫颈上皮内瘤变的总疗效:PATRICIA随机双盲试验研究结束后4年分析.《柳叶刀》第13期，89-99页，2012；Hildesheim,A.等人,人乳头瘤病毒16/18L1病毒样颗粒疫苗对已有感染的年轻女性的影响：一项随机试验。JAMA 298,743–753,2007；Schiller,J.T.,Castellsagué,X.&Garland,S.M.对人乳头瘤病毒预防性疫苗临床试验的回顾。疫苗30增刊5,F123-38；2012；Hung,C.-F.,Ma,B.,Monie,A.,Tsen,S.-W.&Wu,T.-C.治疗性人乳头瘤病毒疫苗：当前临床试验和未来发展方向.专家意见生物疗法.8,421–439,2008)。因此，希望出现新的干预手段，如治疗性疫苗。

虽然大多数HPV感染在几个月内会自发清除，但有些会持续数年(Ho,G.Y.,Bierman,R.,Beardsley,L.,Chang,C.J.&Burk,R.D.年轻女性宫颈阴道乳头状瘤病毒感染的自然史。新英格兰医学杂志。338,423–428,1998)这些可以进展为低度鳞状上皮内病变(LSIL)，其可以进一步进展为高度鳞状上皮内病变(HSIL)和宫颈癌。病毒蛋白的表达模式在SIL进展过程中发生变化：在LSIL中，主要表达早期蛋白E1/E2，而在HSIL和转化细胞中，E6/E7高表达，E2低表达或不表达(Xue,Y.等人。HPV16 E2是病毒感染的即时早期标志，先于宫颈癌前体结构中E7的表达。癌症研究。70,5316–5325,2010；Chang,L.,He,X.,Yu,G.&Wu,Y.HPV 16病毒载量和E2/E6比率对中国妇女宫颈癌风险预测的有效性。J.Med.Virol.85,646–654,2013)。

然而，在许多SIL病例中，由于CD4+和CD8+T细胞浸润而发生自然消退(Hibma,M.H.在感染持续和消退期间对乳头瘤病毒的免疫反应。《开放病毒学杂志》2012年第6期)研究表明，CD4+T细胞在病变消退中起主要作用，在LSIL的基质中发现CD4:CD8比率增加(Monnier-Benoit,S.等人。CD4+和CD8+T细胞亚群在高危人乳头瘤病毒相关的子宫颈癌前病变和恶性病变中的免疫组化分析。《妇科肿瘤学》102，22–31,2006)遗传学研究表明，慢性感染和癌症的耐药和易感基因座聚集在MHC II区域。此外，HPV 16+宫颈癌患者对E2和E6的记忆性CD4+T辅助细胞应答受损，这强调了T细胞应答在预防进展和清除病变中的重要作用(Brotherton等人，2016年；Lehtinen等人，2012年；Hildesheim等人，2007年；Schiller等人，2012年；Hung等人，2008年；Ho等人，1998年；Xue等人，2010年；Chang等人，2013年；Hibma，2012年；Monnier-Benoit等人，2006年；de Jong,A.等。人乳头瘤病毒16型阳性宫颈癌与CD4+T细胞对早期抗原E2和E6的免疫受损有关。癌症研究64,5449LP-5455,2004；Woo,Y.L.等人。关于低级别鳞状上皮内病变自然进程和HPV16 E2、E6和E7特异性T细胞反应存在的前瞻性研究。《国际癌症杂志》126，133-141，2010；Ragonnaud,E.,Pedersen,A.G.&Holst,P.J.腺病毒载体编码祖先抗原或多价乳头瘤病毒抗原免疫接种后的T细胞反应广度。Scand.J.免疫学报，85,182-190,2017；Dillon,S.等人.子宫颈异型增生的消退与对人乳头瘤病毒16型E2蛋白的T细胞增殖反应相关。《J.Gen.Virol.》88，803-813，2007)另据报道，暴露于HPV的儿童在清除感染后会产生E2特异性T细胞反应(Koskimaa,H.M.等人。与母亲患有宫颈上皮内瘤变(CIN)和持续HPV阴性的母亲所生的儿童中的人乳头瘤病毒16特异性细胞介导免疫。《J.Transl.Med.》13,1-11,2015)然而，目前对治疗性HPV疫苗的研究主要集中在疾病的HSIL和癌症阶段，并针对致癌病毒蛋白E6和E7(Hung等人，2008)。然而，针对癌症发生前的感染可能有利于减少与癌症治疗相关的发病率和痛苦，并且可能更容易实现。因此，为了靶向恶性前期感染，应将其他早期蛋白质作为抗原包括在内。

目前还没有合适的动物模型来研究临床前环境中的持续性HPV感染，但猴束状瘤病毒3型(MfPV3)与HPV16具有密切的系统发育和表型关系(Ragonnaud等人,2017；Chen,Z.等人.非人类灵长类动物乳头状瘤病毒与人类同源体的进化历史和生态适应性相似。《Front.Microbiol.》10，2093，2019)这种病毒的自然发生的感染与繁殖雌性食蟹猴(Macaca fascicularis)的宫颈中的长期持续性和至少LSIL样病变相关，使其成为理想的非人灵长类(NHP)动物模型(Chen,Z.等人。猕猴(Macaca fascicularis)乳头状瘤病毒(MfPVs)alpha12型的基因组多样性和种间宿主感染。《病毒学》393,304-310,2009；Wood,C.E.,Chen,Z.,Cline,J.M.,Miller,B.E.&Burk,R.D.对雌性猕猴患癌型乳头状瘤病毒的特征和实验传播的表征。J.Virol.81,6339-6345(2007)。

发明内容

鉴于现有技术的缺陷，本发明的技术问题在于提供用于根除乳头瘤病毒以及预防和治疗乳头瘤病毒相关病症的改进手段和方法。该技术问题通过所附权利要求的主题来解决。

在第一方面，本发明提供了一种核酸，其包含编码乳头瘤病毒蛋白E1、E6和E7的核酸序列或由编码乳头瘤病毒蛋白E1、E6和E7的核酸序列组成；其中所述核酸分子编码单个多聚蛋白。

根据第一方面的核酸需要存在编码三种乳头瘤病毒蛋白的序列。优选的是编码正好三种或正好四种乳头瘤病毒蛋白。就编码第四种蛋白质而言，优选乳头瘤病毒蛋白质E家族的另一种蛋白质，特别是E2。优选的乳头瘤病毒种和株在下文进一步公开。特别优选的是人乳头瘤病毒16(HPV 16)。

根据本发明，采用编码相应全长或基本全长蛋白质的编码序列。同时存在三个或四个全长蛋白编码序列，可使接种了本发明第一方面的核酸或包含该核酸的载体或质粒的生物体呈现多种免疫原表位。此处所述的术语“基本全长”指的是蛋白质中可选择地缺少多达20个、15个、10个或9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或多达2个或1个氨基酸。优选地，这些缺失在C-末端、N-末端和/或在缺失不去除免疫原性表位或不影响存在于编码蛋白质的氨基酸序列的其它部分中的表位的免疫原性的区域中。特别优选的是，所述缺失降低乳头瘤病毒蛋白的致癌潜力。后者的优选实施方案在下文进一步详述(E6的C-末端修饰)。此外，优选的是，“基本上全长”仅适用于E6，而E1、E7和E2(在存在的程度上)是全长。

针对三种或更多种，优选四种不同全长蛋白的免疫应答，如T细胞，将对乳头状瘤病毒感染及其相关疾病表现出协同活性。特别是，成功刺激E1/E2特异性细胞免疫主要清除LSIL阶段的感染，而E6/E7特异性反应主要靶向HSIL和癌症阶段。

本发明的其他优点包括完全根除乳头瘤病毒感染的惊人能力，以及所述核酸不仅用于预防目的，而且用于治疗目的的有用性。鉴于乳头瘤病毒的致癌潜力，这是特别有利的。

值得注意的是，不仅在本发明的疫苗中同时存在三种、优选四种全长抗原提供了优异的性能，而且特别是它们在载体上的特定顺序。令人惊讶的是，偏离本发明的顺序不能确保所有四种抗原的适当表位呈递。换言之，本发明不仅涉及扩大抗原的数量，而且特别涉及如本文所定义的它们的顺序。

利用全长编码序列的方法优于先前利用仅编码片段而非全长蛋白质的疫苗。特别是，由于同时表达三个或四个全长病毒蛋白所产生的协同效应优于仅同时使用多个蛋白片段，这是因为提供了更多的免疫表位。另一方面，在许多情况下，使用全长蛋白质进行免疫需要进一步的措施，以达到具有致癌潜力的蛋白质在所述蛋白质中的程度。这些措施是下文进一步公开的某些实施例的主题。

本文所附的实施例证明了出乎意料的和优异的性能。如图17所示和实施例4中所讨论的，根据本发明的构建体(其特征在于抗原的数量和它们的顺序)显著优于仅包含两种抗原的构建体。图17A显示了肿瘤体积减小的显著改善，图17B显示了存活率的大幅改善。

此外，已知在持续性HPV感染的情况下，可能发生T细胞耗竭。在这种情况下，T细胞反应降低。如实施例3所示，本发明的构建体能够在患有持续HPV感染和T细胞耗竭的非人灵长类动物中引发免疫应答。这是进一步令人惊讶的发现，其表明本发明的构建体作为疫苗和治疗性疫苗是有用的和优越的。

本发明的乳头瘤病毒抗原，即E1、E6、E7，以及(在一定程度上存在)E2，被本发明的核酸编码为单一多聚蛋白。换句话说，由此产生的编码序列是单个开放读取帧的一部分。术语“多聚蛋白”包括上述抗原的融合，更具体地说，是在各自蛋白质序列之间没有干预氨基酸的直接融合。术语“多聚蛋白”还包括蛋白质，其中在两个相邻蛋白质的序列之间插入了一个或多个氨基酸，或者被置于最N-末端E蛋白质的N-末端，或者被置于最C-末端E蛋白质的C-末端。下文给出了这些插入序列的优选实施方式，可以用来提供特定功能，如佐剂功能或自裂解功能，并/或避免相邻蛋白质之间的结构干扰。后者问题可以通过编码短柔性连接肽的序列位于编码抗原的核酸序列之间来解决。

本发明的核酸编码的单一多聚蛋白并不排除这样的多聚蛋白，在翻译过程中或一旦翻译完成后，会产生多于一个的蛋白分子。后者特别适用于本发明的核酸的实施方式，其中除了所述的乳头状瘤病毒蛋白外，还编码了一个自裂解肽。

术语“核酸”是指核苷酸的缩聚物。优选被聚合酶和/或核糖体识别和加工的核酸。优选的实施方式是DNA和RNA；详情进一步参见下文。尽管不太优选，但术语“核酸”还延伸至包含一个或多个修饰的核苷酸的缩聚物。核苷酸中的修饰位点是本领域公知的那些，即，糖磷酸盐和碱在这方面优选的修饰是2'修饰，例如包括2'OMe的2'O-烷基和2'卤素取代，例如2'F。优选的磷酸酯修饰包括硫代磷酸酯。优选的修饰碱基是假尿苷；参见例如Nance和Meier，ACS Cent Sci.2021年5月26日；7(5)：748-756。所提及的碱基、糖和/或磷酸修饰在RNA疫苗的上下文中是特别优选的，即，其中本发明的核酸作为RNA实施。

乳头瘤病毒E家族蛋白是指在病毒生命周期中被称为“早期”的蛋白质。就功能而言，E1具有酶功能；它是ATP依赖性解旋酶；参见例如，Bergvall等人，病毒学2013年10月；445(1-2):35-56。E6能够在静息细胞中诱导细胞分裂。它抑制细胞凋亡和免疫应答；参见例如Vande Pol和Klingelhutz，病毒学2013年10月；445(1-2)：115-37。与E7一起，它具有转化作用。E7参与病毒基因组的复制(参见，例如，Roman和Munger，病毒学2013 445：138-68)，并且与E6一起转化细胞。图9显示了野生型E蛋白与本发明优选的E蛋白的多重序列比对。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含编码乳头瘤病毒蛋白E2的核酸序列或进一步由编码乳头瘤病毒蛋白E2的核酸序列组成。

E2是多功能的，主要参与基因组复制和转录；参见，例如McBride，病毒学。2013年10月；445(1-2):57-79。

术语“进一步由...组成”是指前述方面或实施方案的封闭列表，并且通过添加明确记载的特征来提供所述封闭列表的扩展，其中所述列表保持封闭并限于所述前述方面或实施方案的特征，通过所述明确记载的附加特征来增强。

值得注意的是，添加E2作为另外的抗原不会使免疫应答恶化；参见例如实施例4和图10。

根据本发明的抗原序列在序列表中给出如下：

MfPV3的E1、E2、E6和E7的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:2、4、6和8中。

HPV 16的E1、E2、E6和E7的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：10、12、14和16中。

HPV 18的E1、E2、E6和E7的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：18、20、22和24中。

这些蛋白质的编码核酸以相同的顺序分别显示在SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23中。

根据所述优选实施方案，本发明的核酸编码作为多聚蛋白的四种蛋白质E1、E2、E6和E7，其中优选所述核酸不编码另外的乳头瘤病毒起源的蛋白质。

在另一个优选的实施方案中，编码所述蛋白质的核酸的顺序从5'到3'为(a)E2存在的程度为(i)E1、E2、E6、E7或(ii)E1、E6、E7、E2；或(b)E1、E6、E7。优选地，这些列表中的任何一个都是封闭的，即，不存在编码乳头瘤病毒来源的其它蛋白质的其它序列。另一方面，该实施方案扩展到其中存在另外的氨基酸序列，优选功能性氨基酸序列的实施方案(关于细节，进一步参见下文)。

最优选的是编码四种蛋白质E1、E2、E6和E7的序列以所示的顺序(从5′到3′)存在。虽然具有不同顺序的本发明的构建体也表现良好，但例如在图3B中可以看出，最优选的构建体中的顺序确保了在E2响应方面甚至更好的性能。

在另一个优选的实施方案中，第一方面的所述核酸包含编码乳头瘤病毒蛋白E6和/或E7的核酸序列，其中所述核酸序列与野生型对应物相比通过点突变和/或缺失而被修饰，其中所述点突变和/或缺失(i)在软琼脂测定中消除集落形成，至少达到背景水平；和(ii)所述修饰的蛋白E6和E7保持至少70％的预测的高亲和力表位(IC₅₀≤50nM)和至少50％、至少55％或至少58％的预测的低亲和力表位(50nM<IC₅₀≤5μM)的相应野生型蛋白的预测表位，优选地根据(预测的)与最常见的HLA-A、-B和-C等位基因的结合，这些等位基因优选地一起分别构成每个HLA的人类HLA多样性的75％。该优选实施方案允许存在另外的乳头瘤病毒蛋白，E1和任选的E2在本文中是优选的。

所述最常见的等位基因如下：

HLA-A*01:01

HLA-A*02:01

HLA-A*02:02

HLA-A*02:03

HLA-A*02:05

HLA-A*02:06

HLA-A*02:07

HLA-A*02:11

HLA-A*02:12

HLA-A*02:16

HLA-A*02:17

HLA-A*02:19

HLA-A*02:50

HLA-A*03:01

HLA-A*11:01

HLA-A*24:02

HLA-A*24:03

HLA-A*30:01

HLA-A*30:02

HLA-A*33:01

HLA-B*07:02

HLA-B*08:01

HLA-B*08:02

HLA-B*08:03

HLA-B*15:01

HLA-B*15:02

HLA-B*15:03

HLA-B*15:09

HLA-B*15:17

HLA-B*18:01

HLA-B*27:05

HLA-B*27:20

HLA-B*35:01

HLA-B*35:03

HLA-B*39:01

HLA-B*40:01

HLA-B*40:02

HLA-B*40:13

HLA-B*44:02

HLA-B*44:03

HLA-B*51:01

HLA-B*58:01

HLA-B*58:02

HLA-C*03:03

HLA-C*04:01

HLA-C*06:02

HLA-C*07:01

HLA-C*07:02

HLA-C*08:02

在一个特别优选的实施方案中，所述修饰的E6蛋白维持野生型E6的预测表位的至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的预测高亲和力表位(IC₅₀≤50nM)和至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少93％的预测低亲和力表位(50nM<IC₅₀≤5μM)，优选如上所述确定。

与此相关，并且在单独的方面，本发明提供了包含编码乳头瘤病毒蛋白E6和/或E7的核酸序列或由编码乳头瘤病毒蛋白E6和/或E7的核酸序列组成的核酸，其中所述核酸序列与野生型对应物相比通过点突变和/或缺失而被修饰，其中所述点突变和/或缺失(i)在软琼脂试验中消除菌落形成；和(ii)所述修饰的蛋白E6和E7保持至少70％的预测的高亲和力表位(IC₅₀≤50nM)和至少50％、至少55％或至少58％的预测的低亲和力表位(50nM<IC₅₀≤5μM)的相应野生型蛋白的预测表位，优选与最常见的HLA-A、-B和-C等位基因结合，这些等位基因优选一起分别构成每个HLA的75％的人HLA多样性。在所述单独方面的优选实施方案中，所述修饰的E6蛋白保持至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的预测的高亲和力表位(IC₅₀≤50nM)和至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或野生型E6的预测表位的至少93％的预测低亲和力表位(50nM<IC₅₀≤5μM)，优选如上所述测定。该方面不需要存在编码乳头瘤病毒蛋白的任何其他核酸序列。

如上所述，蛋白质E6和E7在控制和改变宿主细胞行为中起作用，并且可以展现致癌或转化潜力。因此，使用这些蛋白质作为免疫原是期望的和有吸引力的，特别是当涉及到控制、根除、预防、减轻或治疗乳头瘤病毒相关的恶性疾病时。另一方面，它们的致癌潜力带来了与其作为疫苗或疫苗组分使用相关的相应风险。根据这些考虑，上述优选实施方案提供了减轻或消除所述致癌潜力的措施。在这种情况下，所述实施方案达到了平衡，因为在保持免疫原性的同时控制了致癌性。优选地，所述点突变和缺失在数量上是最少的。

作为致癌潜力的量度，使用本领域建立的标准，其为软琼脂测定；也参见所附实施例。

作为免疫原性的测量，使用预测免疫原性和/或免疫原性表位数量的计算机方法。这种方法包括预测与MHC I分子结合的T细胞表位的计算机算法。在这方面，一种优选的计算机方法是IEDB分析资源ANN(也称为NetMHC)，版本4.0(Nielsen等人，蛋白质科学12：1007(2003)；Lundegaard等人，核酸研究36，W509(2008)；Andreatta等人，生物信息学32，511(2016))。还优选的是，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或所有免疫原性表位如它们存在于相应的野生型蛋白质中那样保留在修饰的E6和/或E7中。

如将在下文中变得明显的，在优选的实施方案中，本发明提供了与相应的野生型序列相比的最小修饰，其中所述最小修饰在软琼脂检测中达到所需的性能，并在保留相应野生型序列的高比例免疫原表位方面也具有良好表现。

因此，在一个特别优选的实施方案中，与野生型相比，在编码的蛋白质中仅存在以下修饰：

(i)在E6蛋白中：通过减少或废除由野生型E6中包含的PDZ结构域介导的相互作用的修饰；和

a.在HPV16的E6蛋白中：L117X1；

b.在HPV18的E6蛋白中：L112X1；

c.在MfPV3的E6蛋白中：L110X1；

和

(ii)在E7蛋白中：

a.在HPV16的E7蛋白中：C24X2,L67X3和C91X4；

b.在HPV18的E7蛋白中：C27X2,L74X3和C98X4；

c.在MfPV3的E7蛋白中：C24X2,L71X3和C95X4；

其中X1至X4独立地是与它们取代的相应氨基酸不同的蛋白原氨基酸。

一般而言，可以使用图9中所示的多重序列比对来确定来自给定第一乳头瘤病毒物种的在E2、E6或E7蛋白中位置分别对应于来自给定第二乳头瘤病毒物种的在E2、E6或E7蛋白中的位置。对应的位置是一个在另一个的顶部。换句话说，考虑到不同HPV毒株之间的高度保守性，特别是使用所述多重序列比对，相应位置的确定是直接的，可以将来自任何其他乳头瘤病毒毒株的序列添加到所述多重序列比对中而无需进一步的麻烦。这种校准可以用熟练人员熟知的计算机程序来准备，最好是使用CLC Main Workbench8.0.1版(QIAGEN,Aarhus,Denmark)使用默认设置(very accurate；gap open cost 10.0；gap extensioncost 1.0,end gap cost:as any other)。

优选地，但不是必须地，所述核酸还包含编码HPV 16E7中的D21X5和C58X6、HPV18E7中的D24X5和C65X6以及MfPV 3E7中的D21X5和C62X6的一个或两个突变，其中X5和X6独立地是与它们取代的相应氨基酸不同的蛋白原性氨基酸。

就具体修改而言，优选(i)X1选自Q、Y和N，并且优选为Q；(ii)X2选自G、A、V、L和I，并且优选为G；(iii)X3选自R、K和H，并且优选为R；(iv)X4选自A、G、V、L和I，并且优选为A；(v)X5选自G、A、V、L和I，并且优选为G；(vi)X6选自G、A、V、L和I，并且优选为G；和/或(vii)所述减少或消除由PDZ结构域介导的相互作用的修饰是缺失1至10个C-末端氨基酸，优选从C-末端开始计数，更优选HPV 16E6中的ΔETQL、HPV 18E6中的ΔETQL和MfPV 3E6中的ΔETEV；或所述修饰是具有10个、优选4个C-末端氨基酸的1、2、3或4个点突变。

符号“Δ”是本领域建立的，并且在该实施方案的上下文中，是指四个指定的C-末端残基的缺失。

在进一步优选的实施方案中，所述多聚蛋白中Cys残基的总数是偶数。如何实现这一点并没有特别的限制。优选不导致一个或多个免疫原性表位丢失的实施方式。在不希望被特定理论束缚的情况下，设想偶数个Cys残基增加抗原产量。为了进一步解释，抗原在与不变链融合时(关于不变链的详细信息，请参阅下文)指向分泌途径。在内质网(ER)中，伴侣蛋白(如与游离半胱氨酸结合的蛋白质二硫化物异构酶)可以检测到游离Cys，这反过来可能导致内质网应激反应，然后导致蛋白质合成减少或停止，从而限制抗原的表达。

在一个特别优选的实施方案中，如果所述Cys残基的总数不是偶数，

(i)一个序列编码

a.具有C300 X7突变的HPV 16E2；

b.具有C301 X7突变的HPV 18E2；或

c.具有C297 X7突变的MfPV 3E2

作为编码E2的序列包含在所述核酸中，其中X7是除C以外的蛋白原氨基酸，优选选自A、S、G、M、T、Y、Q、N、V、L、I、F、W、H、K、R、Q、N和P，更优选A；

(ii)或者在所述核酸中插入编码Cys的密码子。

在进一步优选的实施方案中，所述核酸还包含至少一种编码遗传佐剂，优选T细胞佐剂MHC-II相关不变链的核酸序列。所述不变链在下文中也缩写为“li”。T细胞佐剂MHC-II相关不变链已成功地用作遗传佐剂(即，由核酸编码的佐剂，所述核酸任选地还包含编码针对其产生免疫应答的抗原的核酸序列)，参见例如公开的国际专利申请WO 2007/062656、WO2010/057501和WO 2018/172259。就所述不变链来源的物种而言，优选脊椎动物，包括硬骨鱼不变链(参见，例如WO 2020/079234)、鲨鱼不变链(例如，参见，WO 2015/082922)和哺乳动物、优选人类不变链；参见上述三个WO文献。特别优选的是人类不变链。

根据本发明可以使用的其他遗传佐剂是热休克蛋白、钙网织蛋白和C4b。

由于协同效应，所述不变链的存在带来出乎意料的性能。特别地，上述致癌蛋白E6和E7的修饰与li的组合将致癌性降低到出乎意料的程度。在不希望受特定理论约束的情况下，这被认为是li提供的技术效应的结果：E6和E7本身输出，并且在不存在主要位于细胞核中的融合LI的情况下，输出到细胞质中，在细胞质中致癌潜力不能展开或仅在较小程度上展开。

在特别优选的实施方案中，所述不变链(i)存在一次并且在编码第一个E蛋白的序列之前；或(ii)存在两次，一个拷贝在编码第一E蛋白的序列之前，第二拷贝在编码E6的序列之前或在一定程度上在编码E2的序列之前。该实施方案涉及示例性或优选的构建体，其中所述不变链在本发明的核酸内的特定放置适用。虽然这些示例性实施方案已被简化为实践(参见本文所附的实施例)，但本发明不限于此。术语“第一E蛋白”是指由本发明的核酸编码的融合蛋白中的选自E1、E6和E7以及E2(如果存在)的最N端蛋白。优选E1是第一E蛋白。

作为所述遗传佐剂的替代或补充，可以使用本领域已知的佐剂。这样的佐剂包括细胞因子、粘附分子、趋化因子、CCR 1/5激动剂、MIP-1α、危险信号、LPS及其衍生物如脂质A和脂质A衍生物，以及TLR激动剂。

在进一步优选的实施方案中，所述核酸是(i)DNA；(ii)质粒；或(iii)RNA，优选mRNA。mRNA疫苗正在研发中，一些疫苗已获得市场批准，如Biontech/辉瑞公司的Comirnaty和莫德纳治疗公司的mRNA-1273。鉴于其固有的不稳定性，RNAs可以进行化学修饰以增强其稳定性；参见例如Hu等人中对siRNA所描述的修饰，信号转导和靶向治疗2020，5:101以及以上进一步公开的修饰。mRNA疫苗通常包括翻译起始点的Kozak序列、开放阅读框末端的翻译终止密码子和3'-非翻译区的多聚腺苷化位点。

在优选实施方案中，所述DNA和所述质粒包含启动子，优选在真核细胞中活性的启动子。所述启动子包括CMV启动子，优选具有HTLV-1增强子元件、UbC启动子、EF1alpha启动子和SV40启动子。

在一个优选的实施方案中，所述质粒包含细菌复制来源，例如pUC ori，更优选还包含选择标记，例如抗生素抗性基因，例如卡那霉素抗性基因。

在进一步优选的实施方案中，所述核酸，特别是所述DNA，包含包括Tet操作子的未翻译的5’末端。在已知的Tet-Off和Tet-On系统中，优先考虑Tet-Off，因为关闭开关将是产生细胞的组成部分，而不是病毒产物的组成部分。优选的Tet操作位点显示在SEQ ID NO:105中。本发明所采用的Tet系统是被称为T-REx系统的系统。

在T-REx系统中，我们所关注的基因由一个上游CMV启动子和两个四环素操作子2(TetO2)位点的拷贝组成。在没有四环素的情况下，TetR同源二聚体与每个TetO2序列的高亲和力结合抑制所关注基因的表达。在本发明中，对生产细胞株进行修饰以表达Tet阻遏物TetR。四环素的引入导致每个TetR同型二聚体上有一个四环素结合，然后从TetO2释放TetR同型二聚体。TetO2与TetR同源二聚体的解结合导致所关注基因的解抑制。参见，比如，海伦·w和贝伦斯。Tn10编码的四环素耐药的表达机制，《中华微生物学杂志》1994；48:345-69；W Hillen,C Gatz,L Altschmied,K Schollmeier,I Meier。Tn10编码的四环素抗性基因表达的控制调节反应的平衡和动力学研究，分子生物学杂志，1983年9月25日；169(3):707-21；Kathleen Postle,Toai T.Nguyen,Kevin P.Bertrand。TN10四环素耐药决定簇阻遏基因的核苷酸序列。核酸研究，第12卷，第12期，1984年6月25日，第4849-4863页；FengYao、TorThomas Winkler、Michael Lu、Carl Eriksson和Elof Eriksson。四环素阻遏物，tetR，而不是tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物，调节哺乳动物细胞中的诱导基因表达，人类基因治疗。1998年9月，1939 -1950年。

在一个优选的实施方案中，所述核酸包含至少一个编码自切割肽或在继续翻译时使核糖体不形成肽键的肽的核酸序列，其中编码所述肽的所述核酸序列优选(i)在至少一个编码遗传佐剂的核酸序列之前；或(ii)位于两个编码乳头瘤病毒蛋白的核酸序列之间并与之相邻。

考虑到要呈递最大数量的免疫原性表位，不优选将编码自切割肽的所述核酸序列插入编码本发明抗原之一的核酸序列中。

优选的肽序列在本文中被称为“p2a”。

根据本发明的特别优选的核酸是编码以下多蛋白的那些：

li-E1E2E6E7

li-E1E2-p2a-li-E6E7

E1E2E6E7

li-E1E6E7-p2a-li-E2

li-E1E6E7

编码这些构建体的核酸序列，其中编码的蛋白质是或基于MfPV3蛋白质，按相同顺序为：SEQ ID NO:25、27、29、31和33，相应的多聚蛋白序列分别显示在SEQ ID NO:26、28、30、32和34中。

编码这些构建体的核酸序列(其中编码的蛋白质是或基于HPV 16蛋白质)以相同的顺序为：SEQ ID NO：35、37、39、41和43，并且相应的多聚蛋白序列分别显示在SEQ ID NO：36、38、40、42和44中。

编码这些构建体的核酸序列(其中编码的蛋白质是或基于HPV 18蛋白质)以相同的顺序为：SEQ ID NO：45、47、49、51和53，并且相应的多聚蛋白序列分别显示在SEQ ID NO：46、48、50、52和54中。

SEQ ID NO：100至104都涉及HPV 18 li-E1 E6 E7，更具体地如下：HPV 18 li-E1E6 E7核酸序列(SEQ ID NO：100)、HPV 18 li-E1 E6 E7蛋白序列(SEQ ID NO：101)、插入各种病毒载体的HPV 18 li-E1 E6 E7有效载荷(SEQ ID NO：102至104)。

值得注意的是，在E抗原相邻的程度上，它们优选由短而灵活的接头分离，优选GS(见下文)。li和邻近抗原之间的连接不需要，但也不排除。连接p2a到任何相邻序列的接头，无论是抗原还是li，都不是必需的，但也不排除。

在又一优选实施方案中，所述乳头状瘤病毒为灵长类乳头状瘤病毒、优选人类乳头状瘤病毒(HPV)，例如HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV6和HPV11、更优选HPV16或HPV18、或猕猴乳头状瘤病毒、优选MfPV3。尤其首选HPV16。HPV16之实验证据可在实施例4中找到。

在又一优选实施方案中，在一个、多个或所有实例中，通过编码为长度为10个或更少氨基酸(例如2个、3个、4个或5个氨基酸)的柔性接头的序列连接邻近的核酸序列，所述柔性接头视需要包含Cys残基，其中GS和GCS为优选接头。优选地，所述接头仅存在于邻近抗原之间；又参见如上文所述的本发明的最优选核酸的讨论。

在上述披露的首选实施例的背景下，最好将包含Cys残基的接头(如GCS)视为需要在本发明的多聚蛋白中具有偶数个Cys残基。换句话说，虽然像GCS这样含有Cys的接头通常是有用的，但在本发明的核酸编码的多聚蛋白中本来会有奇数个Cys残基的情况下，考虑特别使用它。例如，可以使用GCS接头将E1和E6连接起来，例如在SEQ ID NO:100到104中。

在第二方面，本发明提供了包含前述权利要求中任一项所述的核酸的病毒载体。

在优选实施方案中，所述载体是DNA病毒载体，优选(i)腺病毒载体，其优选在腺病毒E1和E3编码序列方面存在缺陷，所述的载体更优选属于C、D或E类和/或是Ad19a/64、Ad5、具有纤维替代物的Ad5，例如Ad5F35、Ad26、Chimp63或chAdOx1；或(ii)痘病毒载体，优选MVA、MVA CR19、SCV、痘苗或鸡痘。

Ad5在Schiedner G,Hertel S,Kochanek S.Hum Gene Ther.中有描述。2000年10月10日；11(15):2105-16.doi:10.1089/104303400750001417。PMID:11044912。

Ad19a也被称为Ad64；例如，见Zhou X.，Robinson C.M.，Rajaiya J.，Dehghan S.，Seto D.，Jones M.S.，Dyer D.W.，Chodosh J.与流行性角结膜炎相关的人腺病毒19型分析及其重新分类为腺病毒64型，《眼科学研究视觉科学》，53(2012)，第2804-2811页。Ad19a也在Ruzsics Z,Wagner M,Osterlehner A,Cook J,Koszinowski U,Burgert HG.《病毒学杂志》，2006年8月；80(16):8100-13；80(16):8100-13中有描述.doi：10.1128/JVI.00687-06.PMID：16873266。

具有纤维替代的腺病毒描述于例如Shayakhmetov，D.M.；Papayannopoulou，T.；Stamatoyannopoulos，G.；Lieber，A.通过重靶向腺病毒载体将基因有效转移到人CD 34+细胞中《病毒学杂志》2000年。

Flickinger Jr JC,Singh J,Carlson R等人对Ad5F35进行了详细的描述。嵌合Ad5.F35载体规避抗腺病毒5型中和作用，对抗GUCY2C靶向抗肿瘤免疫"，癌症免疫治疗杂志，2020。这里显示Ad5和Ad5F35在原始小鼠中诱导了类似的免疫反应和肿瘤控制，而且在预先接触Ad5感染的小鼠中，Ad5F35比Ad5产生了更好的反应。此外，研究表明，与Ad5相比，具有针对Ad5F35的中和抗体的患者更少。因此，鉴于其优异的性能，特别优选Ad5F35。

用于各种病毒载体的根据本发明的特别优选的DNA有效载荷(插入物；包含抗原编码序列的序列)示于SEQ ID NO：55至99和102至104中。关于各个载体的具体特征的进一步信息，参见序列表中的各个注释。

生产具有插入物的腺病毒载体的方法是本领域已知的，并且描述于例如RuzsicsZ，Lemnitzer F,Thirion C.分子生物学方法2014；1089:143-58.doi：10.1007/978-1-62703-679-5_11。PMID：24132484。

MVA载体的序列可以在如下序列数据库中找到：

MVA序列：GenBank(版本244.0)登录号：U94848，版本号：U94848.1，发布日期2003年4月14日，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U94848.1；

MVA.CR19序列：GenBank(版本244.0)登录号：KY633487，版本号KY633487.1，发布日期2017年3月28日，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY633487.1；

为了产生或扩增所述载体，可以使用细胞株，优选真核细胞株，其中所述细胞株包含所述载体。合适的真核细胞株包括HEK293、PerC6、AGE1.CR.pIX(Jordan I,Vos A,Beilfuss S,Neubert A,Breul S，&Sandig V,2009。一种设计用于生产高度减毒病毒的禽细胞株。疫苗27,748-756https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2008.11.066.PMID 19071186)，HEK293 T-REx和AGE1.CR.pIX-T-REx(分别源自HEK293和AGE1.CR.pIX，已表达TetR)，A549和A549经工程处理以过表达腺病毒E1。如上所述，上述细胞株最好但不一定要经过改造以表达TetR。

MVA已经适应在禽类细胞中复制。因此，为了生产MVA，最好选择宿主细胞，比如初级鸡胚纤维母细胞(CEF)或源自鸭视网膜细胞的AGE1.CR.pIX。相对于初级细胞，AGE1.CR.pIX这样的免疫细胞株具有几个优点：细胞基质可以从本地存储的冷冻培养中恢复，因此对于供应限制具有韧性。免疫细胞株还可以在实际生产过程之前，通过细胞库的水平对其进行对冒险性因子的鉴定。此外，AGE1.CR.pIX细胞株(而不是初级材料)在不含动物来源组分的培养基中悬浮增殖。这种性质允许用于不同属的痘病毒的高效和可扩展的补料分批生产工艺(Jordan I,Northoff S,Thiele M,Hartmann S,Horn D,K,BernhardtH,Oehmke S,von Horsten H,Rebeski D,Hinr ichsen L,Zelnik V,Muel ler W，&SandigV,2011。一种化学定义的高度减毒痘病毒生产工艺。生物制品39,50-58https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2010.11.005.PMID 21237672)。

牛痘病毒成熟为具有一层或三层膜的感染性颗粒，而不需要出芽。这种复杂的感染循环的一个结果是，大多数野生型病毒体保持与生产细胞结合，并且在培养上清液中只能测量到一小部分感染活性。该观察结果诱导了新菌株MVA-CR 19的开发(Jordan I，HornD，John K，&Sandig V，2013.一种改良安卡拉牛痘(MVA)的基因型，可促进化学成分确定的培养基中悬浮培养物的复制。病毒5，321-339.https://doi.org/10.3390/v5010321.PMID23337383)MVA-CR 19是一株具有独特基因型的MVA(Jordan I、Horn D、Thiele K、Haag L、Fiddeke K和Sandig V，2019。一种新载体菌株中缺失的缺失位点和菌斑纯化的改良安卡拉痘苗(MVA)的异常基因组稳定性。病毒学报.https://doi.org/10.1007/s12250-019- 00176-3. PMID 31833037)结构基因的点突变和线性基因组DNA左侧大部分反向末端重复序列(ITR)的重组对MVA-CR 19的表型有深远的影响。例如，与野生型相比，MVA-CR 19将更多数量的感染性颗粒释放到培养物上清液中，并复制到更高的感染性滴度。影响宿主免疫应答和感染周期的病毒因子在ITR中编码。MVA-CR 19中的重组事件改变了这些因子的表达模式(一些被删除，对于其他因子，基因剂量被复制)，对作为疫苗载体的效力和稳定性具有积极影响。

MVA-CR19从宿主细胞的潜在增强释放也可以在粘附细胞的CPE中看到：而野生型MVA倾向于诱导细胞融合和具有良好界限的斑块的合胞体，MVA-CR19的感染导致由大但松散堆积(未融合)的斑块组成的模式，这些斑块被分散在离原发斑块更远的距离处或定位在彗星中的分离的感染细胞包围。

重组MVA的产生和分离由于病毒基因组的大尺寸(178kb)而复杂。最常用的技术依赖于在感染的宿主细胞中用含有目的基因的穿梭质粒进行同源重组。重组病毒必须从没有插入物的大量污染亲本病毒的背景中分离和纯化。尽管MVA-CR19在生产和疫苗效果方面具有优势，但由于复制的范围较不受限制，它在纯化过程中可能会更加复杂。此外，对于野生型和MVA-CR19，如果新序列影响了感染周期，可能会发生对表达和维持转基因的选择。在这种情况下，可以利用一种细胞系，该细胞系具有恒定表达TetR的特性，以及一个含有tetO拷贝的表达单元，以在病毒产生和生产过程中最小化转基因的表达。

在第三方面，本发明提供由前述权利要求中任一项的核酸或载体编码的多蛋白或衍生自其的切割产物。

在提及切割产物的范围内，这些优选是由自切割序列的活性产生的切割产物，根据上面公开的优选实施方案，自切割序列可以存在于由本发明核酸编码的多聚蛋白中。应当理解，切割不影响由本发明核酸编码的蛋白质所呈现的表位的数量。因此，编码的多蛋白中的切割位点优选位于抗原序列之间。

在第四方面，本发明提供药物组合物，优选疫苗，其包含或由下述组成，(i)第一方面的核酸；(ii)第二方面的载体；(iii)第三方面的多聚蛋白或其切割产物；和/或(iv)用(i)的核酸或(ii)的载体转导的细胞，其中优选所述细胞是离体或体外细胞和/或树突状细胞或单核细胞。

关于第(iv)项，本领域已知可以用编码抗原的构建体转化细胞，从而获得具有针对与所述抗原相关的病症的预防或治疗性质的细胞群。在癌症领域的一个例子是Maeng等人的研究，发表在《临床肿瘤学杂志》37卷15期补充号(2019年5月20日)2639-2639页。优选使用的细胞是来自待治疗个体的自体细胞。对(iv)项特别优选是，如果使用载体的话，是Ad19a/64。

就施用途径而言，设想了肌内、皮下、皮内、阴道、直肠和/或粘膜施用，包括施用至生殖道粘膜。

制剂包括凝胶，特别是用于粘膜，优选阴道给药。

赋形剂、稀释剂和防腐剂是技术人员熟知的。

就剂量而言，对于腺病毒载体优选10⁹至10¹¹感染单位，对于痘病毒载体优选5×10⁶至5×10⁸感染单位。一般而言，考虑到本公开内容，可能的临床研究，并且在必要时考虑待接种个体的参数如体重、年龄、性别等，临床医生或制造商可以确定合适的剂量而无需进一步的麻烦。然而，经验告诉我们，在疫苗领域，通常有一个适合所有人的剂量或剂量方案。

在一个优选的实施方案中，所述载体、所述核酸、所述多蛋白或所述细胞是唯一的药物活性剂。

在替代的优选实施方案中，所述药物组合物包含两种或多种药物活性剂，其中第二药物活性剂选自(i)第一方面的第二核酸；(ii)第二方面的第二个载体；(iii)第三方面的第二多聚蛋白或切割产物；(iv)如上所定义的第二细胞；(v)基于蛋白质的疫苗，优选针对乳头状瘤病毒；和(vi)化疗药物，优选是顺铂。当本发明的疫苗与顺铂一起给药时，实施例证明了协同作用。

有已知的乳头瘤病毒疫苗是蛋白质或基于蛋白质的。根据上述(v)项，这种已知的疫苗可以与本发明的疫苗组合。值得注意的是，本发明也可以作为基于蛋白质的疫苗来实施，尽管不太优选；见上文第(iii)项。

用于与本发明的构建体(核酸、载体、多蛋白、细胞)一起进行组合治疗的其它药剂包括抗体，优选靶向免疫检查点的单克隆抗体，所述检查点优选为PD-1、PD-L1和CTLA-4。

一般而言，组合疗法的组分可以一起施用或以任何顺序分开施用，可能遵循不同的给药方案。

在一个特别优选的实施方案中，所述药物组合物包含两种药物活性剂，它们是(i)如上定义的腺病毒载体；和如上所定义的痘病毒载体，其中所述两种药物活性剂优选作为两种药物组合物来制备，所述药物组合物可以以任何顺序或同时给药，优选在包含所述腺病毒载体的所述药物组合物之后包含所述痘病毒载体的药物组合物，优选在经过至少4周之后。

该优选实施例定义了根据本发明的优选预充/增强方案。因此，优选的是，所述两种不同的载体以允许两次施用之间经过时间的方式施用。优选的时间跨度为至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或至少8周。所述时间跨度的优选上限为6周、7周、8周、3个月、4个月、5个月或6个月。

在第五方面，本发明提供了用于医学的前述权利要求中任一项的核酸、载体、多聚蛋白或细胞。

优选地，所述疫苗是治疗性疫苗。值得注意的是，根据本发明的全长抗原的组合提供了病毒的根除。因此，所述疫苗不仅具有预防应用，而且还是治疗剂。

在第六方面，本发明提供了前述权利要求中任一项的核酸、载体、多蛋白、细胞或疫苗，其用于治疗、改善或预防乳头状瘤病毒感染或乳头状瘤诱导的疾病，例如疣、恶性细胞改变或癌症的方法。感染和相关疾病可发生在各种部位，例如鼻-口、皮肤、生殖器(内和外)。一些最著名的乳头瘤病毒相关恶性肿瘤和癌症是低度鳞状上皮内病变(LSI L)、高度鳞状上皮内病变(HSI L)、鼻息肉病或乳头瘤病毒相关恶性病症，如宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和口咽部鳞状细胞癌(OPSCC)。

一般来说，可以理解这些疾病与乳头瘤病毒相关。经常涉及作为病原体的乳头瘤病毒株是本领域已知的，包括HPV 16、HPV 18、HPV 45、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 52、HPV58、HPV 6和HPV 11。例如，鼻息肉病可能由HPV6或HPV11感染引起。

下表1提供了与几种恶性和非恶性疾病相关的HPV毒株的概述。

在第七方面，本发明提供了刺激和/或扩增T细胞的体外或离体方法，所述方法包括使T细胞与本发明前述方面中任一项的核酸、载体或多聚蛋白体外或离体接触。

在一个优选的实施方案中，所述接触在抗原呈递细胞的存在下进行。这样的抗原呈递细胞优选是树突细胞、单核细胞、巨噬细胞或B淋巴细胞。抗原呈递细胞的存在使得扩增的T细胞是MHC限制性的。

首选是T细胞是体外的，即从个体或患者获取。设想将扩增后的T细胞重新置入同一患者或个体体内。这种扩增后的T细胞的再引入在本领域也被称为免疫治疗。

与之相关，本发明在又一方面提供T细胞，优选通过第七方面的方法获得的mhc限制性T细胞。

附图说明

图1：设想的MfPV3抗原变体的示意图。

MfPV3抗原被设计为融合蛋白，其包含E1、E2、E6和E7，或E1加E2和E6加E7融合蛋白，通过p2a肽连接，并分别与MHC-II不变链(II)融合。作为参考，E1,E2,E6和E7融合为单个开放阅读框，不包含Ii编码序列。根据氨基酸序列计算的kDa理论分子量。缩写:Ii:MHC-II相关不变链，GS:甘氨酸-丝氨酸接头，2a:p2a肽用于共翻译分离，Myc:Myc-tag序列用于抗体检测，kDa:kilo Dalton。

图2：MfPV3抗原的表达分析。

A.对HEK293T细胞裂解物进行Western blot分析，48小时后转染等摩尔数的pURVac DNA疫苗，该疫苗表达各种MfPV3抗原。使用抗myc(上图)和抗p2a-peptide(中图)抗体检测抗原。使用抗微管蛋白抗体监测微管蛋白水平作为加载对照(下图)。B.在转染pURVac DNA疫苗后48小时，对HEK293T细胞进行流式细胞术分析。使用抗myc抗体进行细胞内染色。图中显示了3次独立实验的平均荧光强度(MFI)。误差线表示均值的标准误差。C.H2Kb单独或与pURVac E1-SIINFEKL或Ii-E1-SIINFEKL共转染HEK293T细胞，48h后使用识别SIINFEKL-H2Kb复合物的抗体流式细胞术分析细胞表面的SIINFEKL-H2Kb。图中显示了6次独立实验的H2Kb-SIINFEKL阳性细胞百分比。误差线表示均值的标准误差。浅灰色条分别代表阴性和阳性对照。

图3：在杂交CD1小鼠中，各种pURVac DNA疫苗编码E1、E2、E6和E7所诱导的T细胞反应。

每组5只CD1小鼠在1周内接种4次，每次接种0.5μg编码所指示的MfPV3早期抗原的pURVac DNA。小鼠在最后一次免疫后7天被牺牲，脾脏被收集，使用ICS和流式细胞术测量CD8(顶部面板)和CD4(底部面板)T细胞对E1(A)和E2(B)的免疫反应。阴性对照组由用pURVac DNA疫苗免疫的所有小鼠组成，所述pURVac DNA疫苗编码未被用于体外再刺激的肽库覆盖的抗原。组间星号表示减去背景反应后反应水平的显著差异。每个符号代表一只小鼠；水平条代表中位数。参考样品(分别接种仅含有与Ii连接的单个抗原的pURVac DNA疫苗的小鼠)不包括在统计分析中(多重比较调整)。

图4：rAd穿梭MfPV3抗原构建体的表达分析

A.MfPV3抗原变体Ii-E1E6E7-p2a-Ii-E2和Ii-E1E6E7的示意图。MfPV3抗原被设计为融合蛋白，包括E1、E6和E7，并可选择地与MHC-II不变链(Ii)和E2相融合。从氨基酸序列计算的理论分子量(kDa)。B.用MOI为30的rAds转导48小时后A549细胞裂解物的Western印迹分析。用抗-myc(上图)和抗-p2 a-肽(中图)抗体检测抗原。作为上样对照，使用抗微管蛋白抗体监测微管蛋白水平(下图)。C.用表达各种MfPV3抗原的rAd以30的MOI转导48小时后A549细胞的流式细胞术分析。使用抗-myc抗体进行细胞内染色。将细胞与未感染细胞进行门控。图中显示了3次独立实验的平均荧光强度(MFI)。误差线表示均值的标准误差。

图5：用腺病毒载体免疫小鼠诱导有效的细胞免疫应答。

CD1小鼠(A和B)，或OF1小鼠(C和D)接种了编码各种MfPV3早期抗原的rAd疫苗(2×10⁷IFU)。小鼠在第14天被牺牲，脾脏被收集，利用ICS和流式细胞术测量对E1、E2、E6和E7的CD8和CD4 T细胞免疫应答。阴性对照组由用编码未被用于体外再刺激的肽库覆盖的抗原的rAd免疫的所有小鼠组成。每个符号代表一只小鼠；水平条代表中位数。阳性对照样品(接种仅含有与Ii相关抗原的rAd的小鼠)不包括在统计分析中(多重比较调整)。

图6：Ii对泛素化和降解的影响。

A-C将pURVac Ii-E1 E2 E6 E7、pURVac E1 E2 E6 E7或空质粒转染到HEK 293T细胞中。转染后24h，细胞用MG 132或DMSO处理6h作为对照。Myc标记的蛋白质被免疫沉淀，并使用抗泛素抗体(A)和抗myc抗体(B)通过蛋白质印迹进行分析。使用抗微管蛋白抗体作为上样对照监测微管蛋白水平(C)。D-E将pURVac Ii-E1-SIINFEKL、pURVac E1-SIINFEKL或空质粒转染入HEK 293T细胞中。转染后24h，用MG 132或DMSO处理细胞6h。使用抗myc抗体(D)和抗微管蛋白抗体(E)通过蛋白质印迹分析样品。图7：近交系小鼠的免疫应答和体内细胞毒性

用编码所指示的MfPV3早期抗原的rAd载体疫苗免疫Balb/C小鼠。接种后14天，通过ICS(A)或体内细胞毒性分析关于E1肽脉冲细胞的特异性杀伤的免疫应答(B)。每个符号代表一个鼠标。将两只未接种疫苗的小鼠作为阴性对照。(C)体内细胞毒性的代表图。

图8：锚定无关生长的特征。A.用抗E2、抗E6和抗E7抗体通过蛋白质印迹分析分析多克隆NIH-3T3细胞系的转基因表达。抗微管蛋白面板确认了均匀的负载。B软琼脂转化试验中的锚定独立菌落生长。显示了每个NIH-3T3细胞系的测定中菌落形成单位(CFU)的数量。所示为3个独立实验的3个技术复制品的SEM平均值。使用双侧参数化非配对t检验对各组进行比较。

图9：优选物种的E2,E6和E7蛋白的氨基酸序列比对。比对显示与本文所揭示的抗原序列(不含“wt”限定符)比对的优选乳头状瘤病毒物种的野生型(wt)氨基酸序列，所述优选乳头状瘤病毒具有根据本发明的优选修饰。首选的修饰用方框突出显示。

图10：上图：用MfPV 3Ii-E1 E2 E6 E7初免的Ad 19 a/64在初免后14天在NHP中诱导产生IFN的MfPV 3特异性T细胞，通过ELISpot测量。下图：Ad 19 a/64初免、MVA加强免疫接种MfPV 3Ii-E1 E2 E6 E7在加强免疫当天(初免后6周)和加强免疫后14天通过ICS和流式细胞术测量诱导NHP中产生IFN的MfPV 3特异性T细胞。

图11：接种疫苗的MfPV3感染雌性猕猴根据它们是否有已知的持续感染(红色)进行分层(蓝色)。如图1和表1所示，持续感染是指动物在筛查、再筛查和确认试验中均为MfPV3阳性。在参加疫苗试验之前只对子宫颈MfPV3存在进行过一次检测的动物被归类为未知持续期，并被选为对照组，因为在疫苗试验中没有优先考虑将未感染的对照组包括在内。如图3A所示，对动物进行免疫。每个点代表一种动物。图右侧的“ns”指的是根据MfPV3感染持续状态对动物进行的比较。图上方的星号是指所有接种动物在特定时间点(A和B)或针对特定抗原(C)的T细胞应答的比较，无论其MfPV 3感染持续状态如何。A：产生IFN-γ的PBMC的诱导，在肽刺激18-20小时后、免疫前和初次免疫后14天通过ELISpot测量。B：增强免疫前肽刺激12-16小时和增强免疫后14天，通过ICS和流式细胞术测量产生IFN-γ的CD8+T细胞。C：通过IFN-γ信号的几何平均荧光强度(MFI)测量CD8+T细胞的功能。条形图代表所有接种疫苗的动物的几何平均值，而不考虑其MfPV3感染持续性状态。

图12：NHPs子宫颈MfPV3病毒载量随时间的变化。Ad19a/64初始，MVA加强接种MfPV3 Ii-E1E2E6E7后，所有接种动物的感染均被清除，而PBS注射的阴性对照NHPs中，6只中有3只被自发清除。

图13：CD1小鼠(A-E)，如所示的不同杂交小鼠(F-I)或C57BL/6小鼠(J-P)被免疫接种了编码各种HPV16早期抗原的Ad疫苗(2×10⁷IFU)。老鼠在指定的时间点被牺牲，脾脏被收集，使用细胞内染色和流式细胞术测量针对E1、E2、E6和E7的CD8+和CD4+T细胞免疫应答。每个符号代表一个小鼠，条形图代表几何平均值。对于两只E7-反应小鼠(E)，显示了CD44+IFN-γ+细胞群和TNF-α+和IFN-γ+CD8+CD44+细胞群。

图14：将1x10⁶ C3细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的侧腹部，小鼠在第2天和第20天分别在同一侧的肿瘤区域接受Ad19a/64和Ad5载体疫苗的肌肉注射。肿瘤生长(A和B)和存活率(C)。带有圆圈的粉色曲线代表治疗疫苗组。带有方块的灰色线表示阴性对照接种的小鼠。绿色箭头表示接种时间。

图15：1x10⁶ C3细胞被皮下注射到C57BL/6小鼠的侧腹部，而小鼠在分别于第10天和第24天在与肿瘤同侧的部位接受Ad19a/64-和Ad5-载体疫苗的肌肉注射。对肿瘤生长均值及SEM(A)，个体小鼠的肿瘤生长情况(B)和存活率(C)进行评估。在图D-F中，所有小鼠还在第10、17和24天额外接受顺铂治疗(绿色菱形)。

小鼠接受治疗疫苗或仅接受阴性对照疫苗的肿瘤在肿瘤超过1000mm3或试验结束时(第42天)被收集，然后通过免疫组织化学方法检测CD8+细胞。G：每平方毫米肿瘤中CD8+斑点的总数。H：肿瘤核心区与边缘区每平方毫米肿瘤中CD8+斑点的比率。I：代表性的免疫组织化学染色图像，分别为接种疫苗(左)或阴性对照接种疫苗(右)小鼠的肿瘤。图片显示了肿瘤的边缘(图片的左下方)和部分核心(图片的右上方)。

J：小鼠在指定的时间点被牺牲，肿瘤被收集，形成的肿瘤和免疫细胞混合单细胞悬液在没有额外HPV16肽的情况下孵育5小时。通过细胞内染色和流式细胞术检测产生IFN-γ的CD8+T细胞。K：在指定的时间点处死小鼠，收获脾脏，并使用细胞内染色和流式细胞术测量E1和E7肽刺激后的CD8+T细胞免疫应答。L和M：顺铂处理和阴性对照疫苗治疗性疫苗接种小鼠的IFN-γ平均荧光强度(L)和所有CD 8+CD 44+IFN-γ+脾细胞中TNF-α+的百分比(M)。N:在指定的时间点收集肿瘤，制备单细胞悬液，并通过表面染色和流式细胞术评估DCs的比例(CD11c+F4/80-CD8-CD4-CD45.2+TER119-活)。粉色圆圈代表治疗疫苗组。灰色方块代表接受阴性对照疫苗的小鼠。绿色箭头表示接种时间。绿色菱形表示顺铂注射的时间点。G-N：黑色条表示几何平均值。图A-F显示了来自两个独立实验的汇总数据。

图16：T1x10⁶ C3细胞被皮下注射到C57BL/6小鼠的侧腹部，小鼠分别在第10天和第24天在同一侧肿瘤注射Ad19a/64-和Ad5-载体疫苗。顺铂治疗在第10、17和24天通过腹腔注射给予。A：对于分别在第20、23和26天腹腔注射CD4-(绿色虚线，菱形标记)、或CD8-消融(蓝色，空心圆圈)或同种型对照抗体(粉色，圆圈)的小鼠，显示了均值肿瘤生长率及SEM。灰色曲线显示阴性对照疫苗接种的小鼠以供比较(请注意，这是与图4D中所示的相同数据，并来自两个独立实验的汇总)。绿色箭头表示接种时间。绿色菱形表示顺铂注射的时间点。B：显示了在小鼠Ii-E1E2E6E7(粉色圆圈)或阴性对照(灰色方块)疫苗接种后，肿瘤浸润CD4+CD8-CD45.2+TER119活细胞中的FoxP3表达情况，以及是否联合顺铂治疗。肿瘤浸润细胞在第24天(联合治疗组)或第30天(仅接种疫苗)进行了细胞内染色和流式细胞术分析。

图17：1x10⁶ C3细胞被皮下注射到C57BL/6小鼠侧腹部，小鼠分别在第10天和第24天在与肿瘤同侧肌肉注射Ad19 a/64-和Ad5-载体疫苗，或者在对侧腹部皮下注射基于肽的疫苗。顺铂治疗在第10、17和24天通过腹腔注射给予。A和B：显示了肽疫苗(蓝色，菱形标记)、Ii-E1E2E6E7*(粉色，圆圈)或阴性对照*(灰色，方块)小鼠的平均肿瘤生长率及SEM(A)和存活曲线(B)。*请注意，这是与图15D中所示的相同数据，并来自两个独立实验。绿色箭头表示接种时间。绿色菱形表示顺铂注射的时间点。C和D：使用细胞内染色和流式细胞术，在第22天测定了Ii-E1E2E6E7(粉色圆圈)或肽(蓝色菱形)疫苗接种小鼠血液中对E1(C)和E7(D)的CD8+T细胞反应(IFN-γ+CD44+CD8+CD4-B220-活细胞)。

图18：C57BL/6小鼠在下肢接种了编码HPV16 Ii-E1E2E6E7的rAd5或Ad5F35疫苗。两种疫苗均诱导了针对E1和E7的CD8+T细胞反应，其幅度和质量相似，表明Ad5F35在诱导疫苗特异性T细胞反应方面同样高效。

图19：rAd携带的HPV16和HPV18抗原构建的表达分析。

A.用MOI为100的rAds转导48小时后A549细胞裂解物的Western印迹分析。用抗HPV16-E2(左上图)和抗HPV 16-E6(左下图)、抗HPV 16-E7(右上图)抗体检测抗原。作为上样对照，使用抗微管蛋白抗体监测微管蛋白水平(右下图)。B.用MOI为100的rAds转导48小时后A549细胞裂解物的Western印迹分析。用抗HPV 18-E2(左上图)和抗HPV 18-E6(左下图)、抗HPV 18-E7(右上图)抗体检测抗原。作为上样对照，使用抗微管蛋白抗体监测微管蛋白水平(右下图)。

图20：MVA携带的MfPV3、HPV16和HPV18抗原构建的表达分析。

A.在用在DelIII基因座或TK基因座中含有MfPV 3抗原的重组MVA或MVA-CR 19以10的MOI转导后24小时，HEK 293T细胞裂解物的蛋白质印迹分析。检测抗原为抗myc抗体(上图)。作为上样对照，使用抗微管蛋白抗体监测微管蛋白水平(下图)。B.用在DelIII基因座中含有HPV 16 Ii-E1 E2 E6 E7的MVA-CR 19以1的MOI转导后24小时，AGE 1.CR-pIX细胞裂解物的蛋白质印迹分析。用抗HPV 16-E2(左上图)和抗HPV 16-E6(左下图)、抗HPV 16-E7(右上图)抗体检测抗原。作为上样对照，使用抗微管蛋白抗体监测微管蛋白水平(右下图)。C.用在DelIII基因座中含有HPV 18Ii-E1 E2E6 E7的MVA-CR 19以1的MOI转导后24小时，AGE 1.CR-pIX细胞裂解物的蛋白质印迹分析。用抗HPV 18-E2(左上图)和抗HPV 18-E6(左下图)、抗HPV 18-E7(右上图)抗体检测抗原。作为上样对照，使用抗微管蛋白抗体监测微管蛋白水平(右下图)。

具体实施方式

实施例1：本发明的结构及其性能

方法

抗原序列

部分抗原在Geneart/Thermo Fisher(雷根斯堡,德国)合成。基因优化算法用于最小化序列同源性并使序列适应人类密码子使用。使用标准分子生物学方法克隆所有构建体。简言之，根据制造商的说明书，用融合PCR、II型外切位点(BsaI-HF v2，New EnglandBiolabs，美国伊普斯维奇)或NEBuilder HIFIDNA组装试剂盒(New England Biolabs，美国伊普斯维奇)组装抗原。使用AgeI-HF和NotI-HF(New England Biolabs，美国伊普斯维奇)将构建体克隆到不同的质粒骨架中。序列的正确性经由Sanger测序进行验证。根据厂家的说明书，制备质粒，可用碱性裂解或商业可用的试剂盒(Plasmid Midi plus,EndoFreePlasmid Mega Kit,Qiagen,希尔登,德国)。抗原Ii-E1E2-p2a-Ii-E6E7(图1)的序列是通过连接Ii的氨基酸序列(NM_004355.3)和MfPV3(EF558839.2)的E1、E2、E6和E7而组装而成。在E2之后，插入了猪Teschovirus-1 2A序列(Liu,Z.等人，用于在多顺反子载体中克隆多个基因的2A肽的系统比较。Sci.Rep.2017年第7期)，然后是第二个Ii序列。E1通过GS连接肽与E2相连，E6通过GS连接肽与E7相连。将突变引入E6和E7以灭活致癌潜力：E6中的L110Q和C端ETEV的缺失；D24G，L71R，C95A；将C297A引入E2中以使DNA结合失活。通过GeneOptimizer算法优化编码该融合蛋白的序列并使其适应人类密码子的使用(Raab,D.，Graf,M.，Notka,F.，T.&Wagner,R.GeneOptimizer算法:在多参数DNA序列优化中使用滑动窗口方法来应对巨大的序列空间Syst.Synth.Biol.4,215–225,2010)由GeneArt/ThermoFisher(雷根斯堡,德国)合成并克隆到pDONR 221中。使用上述构建体作为模板，通过标准分子克隆技术构建其他构建体(图1)，并克隆到所需的质粒骨架中。根据制造商的说明书，使用EndoFree Plasmid Mega Kit(Qiagen，希尔登,德国)产生用于接种目的的DNA。

细胞系、转染和病毒感染

HEK293T细胞和A549细胞在含有10％胎牛血清(FCS)和1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)的Dulbecco's MEM(DMEM)培养基中生长和维持。9E10 mycl杂交瘤细胞在含有10％FCS、1％Pen/Strep和2mM谷氨酰胺(Pan)的RPMI培养基中培养。所有细胞系在37℃和5％CO2的非湿润培养箱中维持。

HEK293T细胞使用聚乙烯亚胺(PEI)法进行转染(Boussif,O.等人.一种用于基因和寡核苷酸转移到培养和体内细胞的多功能载体:聚乙烯亚胺Proc.Natl.Acad.Sci.92,7297LP–7301,1995)对于PEI转染，前一天在6孔板中播种4×10⁵个细胞。细胞使用2.5μg质粒(等摩尔量，用空载体充填)和7.5μg PEI在不加任何补充剂的DMEM中转染。6小时后，将培养基更换为含有10％FCS和1％Pen/Strep的DMEM。

亚临界密度的A549细胞在不含任何补充剂的DMEM中以MOI为30被Ad19a/64载体感染。感染后2小时，将培养基更换为含有10％FCS和1％Pen/Strep的DMEM。

腺病毒载体的生成

如前所述产生血清型Ad19a/64的E1/E3缺陷腺病毒载体(Ruzsics,Z.,Lemnitzer,F.&Thirion,C.利用细菌人工染色体(BAC)技术改造腺病毒基因组BT-腺病毒：方法和协议。在(eds.Chillón,M.&Bosch,A.)143–158页(Humana出版社,2014).doi:10.1007/978-1-62703-679-5_11)简而言之，我们将感兴趣基因(GOI)-(图1)克隆到CMV启动子控制下的穿梭载体pO6-19a-HCMV-MCS中。然后在大肠杆菌中通过flp-重组将CMV-GOI-SV40-pA 转移到BAC载体(Ruzsics,Z.等人,2014)中，该载体含有在E1/E3基因中删除的复制缺陷型Ad载体的基因组。纯化的BAC-DNA经PacI酶切后释放重组病毒DNA。将获得的线性DNA转染到上述所揭示的生产细胞系中用于病毒繁殖。重组病毒通过脱氧胆酸钠处理从细胞中释放。剩余的游离DNA通过DNaseI酶切，然后，通过CsCl梯度超离心纯化载体，随后通过PD10柱(GEHealthcare，美国芝加哥)缓冲液交换至10mM Hepes pH 8.0、2mM MgCl₂和4％蔗糖。使用RapidTiter方法，通过抗六邻体抗体(Novus，腺病毒抗体(8C4))免疫组织化学染色检测感染的生产细胞进行滴定。通过PCR扩增从纯化载体提取的DNA中的GOI来确认插入物的完整性。

抗体和抗体纯化

从杂交瘤细胞上清液中获得抗myc(9E10)的抗体。9E10 mycl杂交瘤细胞以每毫升5×10⁵个细胞的密度在RPMI培养基中播种，该培养基添加了1％FCS、1％Pen/Strep和2mM谷氨酰胺。接种后5天收获上清液，并通过HiTrap蛋白G柱(GE Healthcare，美国芝加哥)纯化抗体。用PBS洗涤柱后，用0.1M甘氨酸/HCl(pH 3.2)洗脱抗体，用0.025体积的1M Tris/HCl(pH 9)中和，并对PBS透析。

其他使用的抗体包括：鼠抗-p2a肽(3H4，1:2000，Merck，德国达姆斯塔特)，鼠抗微管蛋白(DM1α，1:1000，Santa Cruz，德国海德堡)，鼠抗泛素-生物素(eBioP4D1,1:1000,Invitrogen,美国卡尔斯巴德)，山羊抗鼠-HRP(115-036-003,1:5000,Jackson,美国西格罗夫)，山羊抗兔-HRP(P0448,1:2000,Dako,Santa Clara,美国),链霉亲和素-HRP(11089153001,1:5000,Roche,Basel,瑞士)，大鼠抗小鼠-PE(A85-1,1:100,BD,FranklinLakes,美国)。

蛋白质印迹分析

Western blot分析是根据之前的描述进行的(Kiener,R.等基于腺病毒19a/64的疫苗载体表现出广泛的细胞趋化性，并在体外有效地重新刺激HCMV特异性T细胞应答.Sci.Rep.8,1474,2018)。简而言之，感兴趣的细胞在含有蛋白酶抑制剂(Complete Mini,罗氏，巴塞尔，瑞士)的TDLB缓冲液中裂解(50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，0.1％SDS，1％Nonident P-40，0.5％脱氧胆酸钠)补充蛋白酶抑制剂(Complete Mini，罗氏，巴塞尔，瑞士)。通过Bradford方法(Protein Assay，BioRad，Feldkirchen，德国)测量上清液的总蛋白浓度。在还原条件下在SDS-PAGE上分离蛋白质，并在硝酸纤维素膜上印迹用于蛋白质印迹分析。用如上所列的一抗和二抗探测靶标。使用HRP标记的二抗和增强的化学发光底物或Femto ECL(Thermo Fisher，Waltham，美国)在Chemilux Pro装置(Intas，德国)中进行检测。对于上样对照，用针对微管蛋白的抗体重新探测膜。

细胞系的流式细胞术分析

使用标准方法进行抗原的细胞内染色(Kiener等人，2018年)。将细胞固定并用Cytofix/Cytoperm-缓冲(4％PFA，1％皂苷，在PBS中)渗透化。所有洗涤步骤均用Perm/洗涤缓冲液(含有0.1％皂苷的PBS)进行。用抗myc抗体(5μg/ml，在Perm/Wash缓冲液中稀释)和大鼠抗小鼠PE(在Perm/Wash缓冲液中1：100稀释)分别对细胞染色30分钟。

使用具有488nm激发和574/26nm发射滤光片的Attune NxT装置(Thermo Fisher，Waltham，美国)进行流式细胞术测定。在染色的模拟转染细胞上对细胞进行门控。使用Attune NxT软件进行数据评估。

泛素化分析

为了分析泛素化蛋白，转染后24小时，用10μM MG 132蛋白酶体抑制剂处理细胞6小时。然后，在PBS中收获细胞并洗涤两次。为了灭活去泛素化酶，将来自新鲜制备的储备溶液的20mM N-乙基马来酰亚胺加入TDLB裂解缓冲液中。如上所述产生裂解物。在免疫沉淀之前，将蛋白G磁珠(Thermo Fisher,Waltham,美国)加载10微克的pull down抗体。利用这些磁珠，在4℃下缓慢旋转过夜，从500μg细胞裂解液中免疫沉淀出目标蛋白。用PBS洗涤四次后，将SDS-PAGE缓冲液添加到磁珠中，然后在95℃加热10分钟。样品用于如上所述的蛋白质印迹分析。

动物和免疫接种

Balb/C和CD 1雌性小鼠获自Envigo(霍斯特,荷兰)，OF 1小鼠获自Charles River(法国)。所有动物均圈养在哥本哈根大学Panum研究所。所有实验在允许小鼠适应至少1周后开始。实验由国家动物实验检查局(许可证号2016-15-0201-01131)批准，并根据国家指南进行。

DNA免疫接种在皮内(i.d.)使用Helios Genegun System(BioRad，Feldkirchen，德国)将0.5g DNA包被在1.6μm金微载体(BioRad，Feldkirchen，德国)上。小鼠接受四次DNA免疫，每次间隔一周。一组在一个位点接受四种质粒的混合物，每种0.5μg。

用腺病毒载体进行的免疫接种是肌内(i.m.)用50μL PBS稀释的2×10⁷IFU Ad 19a/64。在注射Ad 19 a/64之前，用异氟烷麻醉小鼠。一组在一个部位接受四种Ad 19 a/64的混合物，每种2×10⁷IFU。

脾细胞流式细胞术

通过在HANK中收获器官，然后通过70μm细胞过滤器过滤，获得脾细胞的单细胞悬浮液。将细胞在含有或不含有1μg/mL相关肽的3μM莫能菌素中孵育5小时。将细胞针对以下表面标志物染色：APC-Cy 7或BV 421CD 8(53-6.7，1：200，BioLegend，圣地亚哥，美国)、PE-Cy 7CD 4(RM 4 -5，1：800，BD)、FITC CD 44(IM 7，1：100，BioLegend，圣地亚哥，美国)和PerCP-Cy 5.5B220(RA 3-6B2，1：200，BioLegend，圣地亚哥，美国)。表面染色后，用1％PFA固定细胞，0.5％皂苷渗透，并用APC IFN-γ(XMG1.2,1:100,BioLegend,圣地亚哥，美国)和PE TNF-α(MP6-XT22,1:100,BioLegend,圣地亚哥，美国)抗体进行细胞内染色。

使用的肽是覆盖整个Ii-E1 E2 E6 E7抗原的11个氨基酸重叠的16聚体。将这些肽段分别合并到5个不同的肽段池中，分别包含Ii、E1、E2、E6和E7肽段。肽获自KareBay，Town，中国。

在Fortessa 3(BD Biosciences，Franklin Lakes，USA)流式细胞仪上进行流式细胞术，并使用Flowjo V10软件进行数据分析。表位特异性CD 8+T细胞应答测量为B220-、CD8+或CD 4+、CD 44+、IFN-γ+细胞，并以每个器官的细胞总数表示。通过IFN-γ+CD 8+或CD4+群体中IFN-γ的MFI和双阳性细胞(表达IFN-γ和TNF)的分数来评价IFN-γ+应答的质量。

体内细胞毒性

该检测方法与之前描述的类似(Nielsen,K.N.，Steffensen,M.A.，Christensen,J.P.&Thomsen,A.R.腺病毒载体对CD8 T细胞的启动严重依赖于B7和树突状细胞，但仅部分依赖于CD28与CD8 T细胞的连接J.Immunol.193,1223–1232,2014)。简言之，将来自天然的Balb/C小鼠的脾细胞与MfPV3 E1、E2、E6或E7肽池或无肽在37℃、5％CO2、每种肽2.5μg/mL下孵育30分钟，随后用0.4或5μM CellTrace CFSE和0.2和2.5μM CellTrace Violet(CTV；ThermoFisher，Waltham，美国)的组合在37℃.5％CO2下染色10分钟。将脉冲和染色的脾细胞以1:1:1:1:1的比例混合，并将总共2.5×10⁷个细胞静脉注射到Ad19a/64接种的受体Balb/C小鼠中。5小时后，收获脾脏，并通过CFSE/CTV染色在Fortessa 3(BD Biosciences，Franklin Lakes，美国)流式细胞仪上鉴定靶细胞。使用以下方程式计算死亡率：

MHC-I上E1(SIINFEKL)表达的分析

使用PEI转染用2.5-3.5μg DNA转染HEK 293T细胞。转染后48小时，将细胞用PE抗H2KB-SIINFEKL(25-D1.16，1：160，Invitrogen，卡尔斯巴德,美国)染色，并在LSRII或Fortessa 3(BD Biosciences，富兰克林湖，美国)流式细胞仪上检测细胞表面上SIINFEKL-H2Kb呈现的存在，作为El呈现的代表。所有样品以生物学一式6份进行，并且实验重复至少两次。

离体免疫原性数据的图示和统计分析

未刺激的样品用作背景对照，并且在进行统计分析和图示之前，从相应动物的肽刺激的样品中减去它们的响应值。

使用GraphPad Prism 8软件(GraphPad Software，圣地亚哥，美国)进行统计分析。使用Mann-Whitney检验和Bonferroni校正进行多重比较，将减去背景的值用于比较各组。多重比较分析中不包括阳性对照组。

为了帮助直观呈现结果，我们基于未刺激背景样品的B220-、CD 8+、CD 44+、IFN-γ+计数的平均数应用了响应阈值。计数低于背景样本平均值+2×SD的所有样本均视为无响应，因此已将其手动调整为100值以进行图形显示。所有统计分析均基于未校正值进行。

仅对应答者(IFN-γ+计数>avg+2×未刺激样品的SD)进行双阳性分数(所有IFN-γ+中的％TNF+IFN-γ+)和IFN-γ+的MFI分析。

每个符号代表一个小鼠。条表示中值。显著性水平用*(p<0.05)、**(p<0.01)、*(p<0.005)标记。

结果

抗原的设计

为了产生能够消除非人灵长类动物中预先存在的乳头瘤病毒感染的治疗性疫苗，设计了包含与内在T细胞佐剂Ii连接的MfPV 3的E1、E2、E6和E7的抗原构建体。设想了八种不同的配置(图1)，以选择一种引起最有效和最广泛的反应，以进一步发展。虽然在第一复合抗原中顺序是Ii_E1E2E6E7，但在Ii_E6E7E1E2中E1/E2和E6/E7的顺序颠倒，以(i)测试抗原顺序的影响，和(ii)确定相对于Ii的定位对转基因表达水平的影响。在这两种情况下，所有蛋白质都以人工融合多肽的形式表达，而单个蛋白质被短而灵活的GS接头分开，以促进融合蛋白的稳定性和积累(Chen,X.，Zaro，J.L.&Shen，W.-C.融合蛋白接头：性质、设计与功能Adv.Drug Deliv.Rev.65,1357–1369,2013)并且Ii融合到N末端作为T细胞佐剂(Holst，P.J.等人抗原的MHC II类相关恒定链显著提高腺病毒疫苗诱导的细胞免疫J.Immunol.180,3339–3346,2008)作为评估Ii的T细胞佐剂效应的参考，设计了不含Ii的变体E1 E2 E6 E7。为了研究当与较短抗原融合时Ii佐剂效应是否更显著，通过Ii-E1 E2-p2a-Ii-E6 E7中的p2 a肽将E1 E2与E6 E7分开(Kim,J.H.等人.来自猪传染性胸膜炎病毒1的2A肽在人类细胞系、斑马鱼和小鼠中的高裂解效率。PLoS One 6,2011)通过使用不同的密码子来阻碍同源重组，使两个不变链之间的核苷酸序列同源性最小化。此外，四种病毒蛋白中的每一种都以Ii融合体的形式独立产生，以用作基准和参考。由于缺乏针对MfPV 3早期蛋白的抗体，所有构建体都被修饰为含有C-末端myc-标签。

由于E6和E7是高效力的癌蛋白，因此在疫苗的设定中仅应使用转化缺陷变体以确保安全性。基于与HPV 16的同源性，通过引入L110Q取代以阻止E6与E6BP结合并因此阻止肿瘤抑制因子p53的结合和降解来使癌蛋白E6失活(Liu,Y等。人乳头瘤病毒16型E6的多种功能促进乳腺上皮细胞的永生化73,7297-7307,1999)此外，C末端PDZ结构域被删除(ΔETEV)，以消除端粒酶和其他LxxLL蛋白的结合(Wieking,B.G.等人。非致癌性HPV 16E6/E7疫苗增强了对表达HPV的肿瘤的治疗。《癌症基因治疗》19,667–674,2013)通过引入取代C24G、L71R和C95A使E7失活，所述取代中心LxCxE基序以分别降低转化活性以及pRB结合、降低Mi2β结合和抑制二聚化(Wieking,2013；Edmonds,C.&Vousden,K.H.人乳头瘤病毒16型E7蛋白的点突变分析63,2650–2656,1989)E2的保守DNA结合结构域被C297A修饰以产生具有偶数个半胱氨酸的多蛋白并减少DNA结合。

对于初始的生物化学和免疫学表征，将构建体克隆到pURVac中，pURVac是DNA疫苗载体的衍生物，在各种NHP和临床试验中具有经证实的跟踪记录(Asbach，B.等人.用强效HIV-1DNA疫苗启动在痘病毒和蛋白质增强之前构建免疫应答的质量J.Virol.93,2019；Sarwar,U.N.等I期临床试验中编码埃博拉病毒和马尔堡病毒野生型糖蛋白的DNA疫苗的安全性和免疫原性J.Infect.Dis.211,549–557,2015；Joseph,S.等人.一项关于两种免疫接种方案中组合同源亚型C DNA、MVA和Env gp140蛋白/佐剂HIV疫苗的比较I期研究Front.Immunol.8,149,2017；Pantaleo,G.等，包含具有DNA或NYVAC载体的包膜蛋白的多价HIV疫苗的安全性和免疫原性(HVTN 096)：1b期、双盲、安慰剂对照试验。柳叶刀HIV 6，e737-e749，2019)其中抗原在人巨细胞病毒(CMV)启动子与人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)调节元件组合的控制下(Barouch，D.H.等，人T细胞白血病病毒1型调节元件增强了小鼠和非人灵长类动物中人免疫缺陷病毒1型DNA疫苗的免疫原性J.Virol.79，8828-8834，2005)和牛生长激素多聚腺苷酸终止子。

MfPV3抗原的生物化学和细胞生物学特性

最初，评估抗原构建体的表达特性。所有抗原均在HEK 293T细胞中表达，通过使用抗myc抗体的蛋白质印迹分析检测到预期大小的条带(图2A；图1)。未分离的Ii-E1E2-p2 a-Ii-E6 E7的较高分子量条带既不能在检测C-末端片段的抗-myc蛋白质印迹中检测到，也不能在检测N-末端片段的抗-p2 a蛋白质印迹中检测到。这提供了多蛋白在p2a位点完全分离的证据。在某些情况下，特别是对于具有高信号强度的蛋白质，可以观察到与计算值相比分子量更高或更低的条带。根据它们的大小，较高分子量的条带可能类似于不完全还原的蛋白质，这并不完全令人惊讶，因为Ii似乎形成半胱氨酸连接的三聚体(Fougeroux,C.，Turner,L.，Bojesen,A.M.，Lavstsen,T.&Holst,P.J.腺病毒疫苗接种后修饰MHC II类相关不变链诱导抗恶性疟原虫抗原抗体反应增加J.Immunol.202,2320–2331,2019)低分子量的条带可能类似于N-末端降解产物，据片段大小推测这些产物很可能在Ii内部被切割。部分降解是预期的，因为Ii将其某些连接的载体运输到内体室，那里会发生蛋白酶降解。

由于不同大小的蛋白质表现出不同的印迹条件，不能假定蛋白质印迹分析是定量的，因此信号强度可能不能反映真实的表达水平。因此，在用抗myc抗体进行细胞内染色后，通过流式细胞术定量蛋白质水平(图2B)。不同MfPV 3抗原的表达水平仅略有不同，除了Ii-E7，其与所有其他抗原相比表现出2至3倍的MFI值。

MHCI类限制性SIINFEKL表位由E1融合蛋白加工而成并在体外大量呈递于MHC-I分子上

据报道，牛乳头瘤病毒1型E1本身是一种不稳定的蛋白，在乳头瘤病毒感染的细胞中被泛素化并迅速降解(Malcles,M.-H.,Cueille,N.,Mechali,F.,Coux,O.&Bonne-Andrea,C.通过泛素-蛋白酶体途径调节牛乳头瘤病毒复制解旋酶e1.J.Virol.76,11350-11358,2002；Mechali,F.,Hsu,C.-Y.,Castro,A.,Lorca,T.&Bonne-Andrea,C.牛乳头瘤病毒复制型解旋酶E1是泛素连接酶APC的靶标J.Virol.78，2615-2619(2004)。组成型降解可能解释了为什么我们无法找到任何研究报告在HPV感染的细胞和组织中检测到E1在蛋白质水平上的表达，以及为什么E1对抗体的免疫原性较差(Ewaisha,R.，Panicker,G.，Maranian,P.，Unger,E.R.&Anderson,K.S.血清免疫分析用于早期检测宫颈疾病。诊疗学7,3814-3823,2017)然而，应该证实的是，尽管在天然HPV感染中免疫原性差，但E1衍生肽呈递在感染细胞上的MHC-I上，这是治疗性疫苗接种可靶向的先决条件。为了检测E1衍生肽的呈递，我们设计了编码MfPV 3E1的DNA构建体，其序列与最小H2-kb限制性OVA表位SIINFEKL一致(Dersh,D,Yewdell,J.W.&Wei,J.A SIINFEKL-Based系统测量MHC I类抗原呈递效率和动力学。方法生物化学，1988,109-122(2019).转染E1-SIINFEKL构建体后，使用H2-Kb-SIINFEKL特异性抗体评估MHC-I上的转基因呈递(图2C)。加工和呈递的SIINFEKL-肽可以在细胞表面的MHC-I上检测到，无论是当与Ii连接时还是当单独递送时。这支持选择E1作为相关抗原以包括在治疗性疫苗中，因为可以预期E1衍生的肽被呈递在感染细胞的表面上。

抗原构建体的DNA疫苗接种诱导针对MfPV3早期抗原的CD4+和CD8+T细胞应答

真皮内(i.d.)通过ICS和流式细胞术分析测量，对远系CD1小鼠的DNA免疫证实，所有编码E1和/或E2的pURVac DNA疫苗都诱导了E1和E2特异性IFN-γ+CD8+和CD4+T细胞(图3)。更详细地说，所有候选DNA疫苗都提供了与阳性对照相同的E1反应，而Ii-E2阳性对照有更高反应的趋势。在该远交系小鼠中，没有疫苗诱导针对E6或E7的应答，包括这两种抗原的阳性对照。重要的是，编码所有四种抗原作为多蛋白的所有疫苗产生的应答与单独编码抗原的四种疫苗的混合物(Ii-E1、Ii-E2、Ii-E6、Ii-E7)诱导的应答相当。这表明通过从单一pURVac DNA疫苗递送作为多蛋白的MfPV 3早期抗原总体上没有丧失免疫原性。总之，四种不同的编码多聚蛋白的DNA疫苗诱导T细胞应答，其显示关于E1和E2特异性IFN-γ+CD 8+和CD 4+T细胞的频率没有统计学差异。无论(i)Ii是否与E1E2E6E7融合，(Ii)多蛋白中早期抗原的顺序，以及(iii)使用p2a位点将Ii-E1E2与Ii-E6E7分离，都是这种情况。通过IFN-g的MFI和IFN-g+T细胞的TNF产生评估，所有疫苗的T细胞反应质量是可比较的。正如预期的那样，Ii在大多数小鼠中引起CD8反应，在一些小鼠中引起CD4反应，因为人类Ii在小鼠中是同种异体的。具有两个p2 a分开的Ii连接的抗原序列(Ii-E1 E2-p2 a-Ii-E6 E7)和Ii-E6 E7E1E2的疫苗似乎引起针对E1的略好的CD 4应答，这通过与阴性对照组的显著应答和显著差异来显示(图3A)。

腺病毒载体的表征

为了增加针对抗原的细胞免疫应答，随后将病毒载体用于抗原递送。来自血清型19a/64(rAd)的腺病毒载体已被证明是用于递送能够在食蟹猴中诱导高CD 8+T细胞应答的MfPV 3抗原的合适载体(Ragonnaud,E.等。复制缺陷的人腺病毒载体血清型19a/64:小鼠和雌性食蟹猴的免疫原性。疫苗36,6212-6222,2018年)产生一组精制的rAd载体，其包含一组经修饰的重组MfPV 3抗原。排除了Ii-E6 E7 E1 E2，因为它不优于其他多聚蛋白。当单独给药时，对E2的反应更高的趋势使我们推测E2单独与Ii连接并表达为单独的结构域是否有利。因此，设计了编码与E1、E6和E7连接的N-末端Ii(Ii-E1 E6 E7)而没有E2作为参考的疫苗，以及其中Ii-E1 E6 E7抗原通过自分离p2 a肽的Ii-E2融合物延伸的版本(Ii-E1 E6E7-p2 a-Ii-E2)。为了确认编码抗原的正确表达，用腺病毒转导的A549细胞进行蛋白质印迹分析。所有载体都容易表达抗原，其条带与在预期位置检测到的相应融合蛋白相似(图4A，图1和图2)。至于Ii-E1E22-p2a-Ii-E6E7，没有检测到Ii-E1E6E7-p2a-Ii-E2的更高分子量片段，这表明在p2a位点的完全分离也适用于腺病毒载体递送的抗原。使用流式细胞术对A549细胞中腺病毒递送的抗原进行定量比较，证实不同MfPV3抗原构建体的表达水平相似，但Ii-E7融合蛋白的表达较高(图4B)。总体情况与在HEK293T细胞中递送pURVac DNA疫苗载体后观察到的表达非常相似。

腺病毒载体介导远交系小鼠抗HPV早期抗原的细胞免疫应答

对离群CD1小鼠进行肌肉免疫实验证实，疫苗的Ad19a/64配方诱导了针对E1和E2抗原的CD8+和CD4+T细胞应答(图5A和B)。值得注意的是，包括Ii的疫苗显示出比不编码Ii的疫苗更高幅度应答的趋势(图5A和B：E1E2E6E7与其他疫苗相比)。对于某些疫苗配置，对于CD 4和CD 8T细胞应答都观察到Ii介导的应答增强的趋势，但与E1 E2 E6 E7相比，仅对于由Ii-E1 E2-p2 a-Ii-E6 E7诱导的E2特异性CD 8应答差异显著(图5B，上图)。这强调了Ii在腺病毒疫苗递送的背景下增强T细胞应答的能力。由于Ii-E1 E2 E6 E7抗原另外显示出比Ii-E1 E2-p2 a-Ii-E6 E7抗原更高的E1应答的趋势，进行了后续实验，然而，未能证明构建体之间抗原免疫原性等级的一致差异(数据未显示)。通过能够分泌IFN-γ和TNF的双阳性T细胞的分数和IFN-γ的MFI值评估，未检测到T细胞应答的质量差异。

除了对E1和E2的强烈T细胞反应(图5C和D)外，我们确实看到了对E6的固体CD4+T细胞反应(见图5D)。少数小鼠的CD8+T细胞也对E6产生反应，证实了我们的疫苗构建体的加工和免疫原性。由于只有少数小鼠具有CD8+T细胞反应，并且这些反应的幅度很低，因此可能会质疑这些反应是真实的还是仅仅由于高背景。图5C所示的代表性小鼠显示CD44+IFN-γ+群体表现为真正的反应。此外，大多数IFN-γ+细胞也产生TNF，证实了活化表型。

总的来说，疫苗的Ad 19 a/64递送有效地诱导针对所有四种测试的MfPV 3多蛋白抗原的T细胞，并且抗原的免疫原性通过包含Ii而增强。

Ii融合增强泛素化和蛋白酶体降解

Ii的T细胞佐剂效应的机制基础尚未完全阐明(Fougeroux等，2019)，但建议的作用机制之一是Ii的泛素化，导致蛋白酶体降解连接的抗原，从而增强MHC-I呈递(Esposito,I.等人，MHC II类不变链佐剂化的病毒载体疫苗增强人类T细胞应答。Sci.Transl.Med.12，(2020年)。为了研究这种机制是否也可以解释针对Ii连接的MfPV 3抗原的增强的CD 8+T细胞应答，在蛋白酶体抑制剂MG 132不存在或存在的情况下培养Ii-E1 E2 E6 E7-和E1 E2E6 E7-转染的细胞。免疫沉淀的myc标记的多肽的抗泛素蛋白质印迹分析显示，与没有Ii的E1 E2 E6 E7相比，Ii-E1 E2 E6 E7的泛素依赖性信号强度更高(图6A)。当MG132存在时，这种效果更加明显。Myc特异性信号证实了免疫沉淀(IP)程序的保真度，通过抗微管蛋白蛋白质印迹对IP上清液的分析显示，在IP程序中使用了相当量的细胞裂解物(图6B和C)。更高水平的泛素化通常与更快的降解有关。这可以通过分别在不存在或存在MG 132的情况下瞬时表达均与C末端SIINFEKL肽融合的Ii-E1和E1来示例性地证明(图6D和E)。在没有MG 132的情况下，几乎检测不到Ii-El-SIINFEKL，而当添加MG 132时，可以观察到显著的信号。较低分子量信号指示降解产物。没有观察到这种效果E1没有Ii，这表明Ii诱导加速蛋白酶体降解。

腺病毒递送诱导体内靶细胞的特异性杀伤

为了确保rAd递送的抗原诱导的细胞反应具有细胞毒性能力，我们免疫近交系Balb/C小鼠，14天后用肽脉冲预染色的同基因靶细胞攻击这些小鼠。疫苗诱导了针对E1的CD8+反应(图7A)，但在Balb/C小鼠中既没有针对其他抗原(数据未显示)，而针对E1、E2和E6的CD4反应升高。Ii再次证明了其作为佐剂的相关性，因为在该近交系小鼠模型中，不含Ii的疫苗没有产生任何可检测的E1特异性CD8+反应(图7A)。体内细胞毒性测定显示E1标记的细胞的特异性杀伤(图7B和C)，并且特异性杀伤能力的层级对应于IFN-γ+CD 8+E1特异性T细胞的数量。我们可以得出结论，设计的rAd疫苗诱导有效的细胞毒性反应，这支持了我们的假设，即这种疫苗设计将能够消除现有的MfPV 3感染。

实施例2：根据本发明修饰的E6和E7的致癌性质的评估

材料和方法

细胞系

NIH-3T3细胞和HEK293T细胞在含有10％胎牛血清(FCS)和1％Pen/Strep(PS)的DMEM培养基中，在37℃和5％CO2条件下培养。为防止成熟和分化，NIH-3T3细胞的密度保持在10％至70％之间。

VSV-G假型慢病毒载体的产生

通过使用限制性内切酶HPLI-HF和NotI-HF(NEB，美国伊普斯维奇)，将HPV 16抗原和HPV 16E6 wt克隆到pLV-MCS-IRES-Puro中，将HPV 16E7 wt和GFP分别克隆到pLV-MCS-IRES-Neo中。两种pLV载体均含有CMV启动子，随后是MCS、内部核糖体进入位点(IRES)和针对嘌呤霉素或新霉素的抗生素抗性基因。

将3.9×10⁶个HEK 293T细胞接种于T75烧瓶中。接种后24小时，将培养基更换为不含添加剂的DMEM，并使用PEI方法用3.75μg含有抗原的pLV和3.75μg慢病毒包装混合物(1：1：1；pMDL-Gag：pVSV-G：pREV)转染细胞(Boussif,O.,Lezoualc’h,F.,Zanta,M.A.,Mergny,M.D.,Scherman,D.,Demeneix,B.,&Behr,J.P.(1995))一种用于在培养和体内将基因和寡核苷酸转移到细胞中的通用载体：聚乙烯亚胺。《美国国家科学院院刊》，92(16)，7297LP-7301。https://doi.org/10.1073/pnas.92.16.7297)最终体积为9ml。转染后5小时，将含有10％FCS和1％PS的4ml DMEM加入烧瓶中。转染后48小时，以1000×g离心5分钟，收获慢病毒载体，上清液通过0.45μm注射器过滤器过滤，并在-80℃下储存在等分试样中。

NIH-3T3细胞的转导和抗生素筛选

将1×10⁵个NIH-3T3细胞接种于T25烧瓶中。接种后24小时，吸出培养基，并在10μg/ml聚凝胺(TR-1003-G，Sigma Aldrich，美国圣路易斯)存在下用2ml含有相应慢病毒载体的每种上清液转导细胞。6小时后，加入4ml含有10％FCS和1％PS的DMEM。72小时后，根据用于转导的慢病毒载体，通过lmg/ml G418(CP11.3，Roth，德国卡尔斯鲁厄)和/或2μg/ml嘌呤霉素(ant-pr-1，InVivoGen，美国圣地亚哥)选择转导的细胞。将细胞在抗生素选择下至少2周，直到所有未转导的细胞死亡。

抗体

使用以下抗体：抗E2(TVG-271，1:200，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany)、抗E6(GTX132686,1:2000,Biozol,Eching,Germany)、抗E7(NM2,1:200,SantaCruz Biotechnology,Heidelberg,Germany)，抗微管蛋白(DM 1α，1：1000，Santa CruzBiotechnology，Heidelberg，Germany)、山羊抗小鼠HRP(115-036-003，1：5000，Jackson，West Grove，USA)和山羊抗兔HRP(P0448，1：2000，Dako，Santa Clara，USA)。

蛋白质印迹分析

如前所述进行蛋白质印迹分析(Kiener,R.,Fleischmann,M.,Schwegler,C.,Ruzsics,Z.,Thirion,C.,S.,Asbach,B.,&Wagner,R.(2018))基于腺病毒19a/64的疫苗载体表现出广泛的细胞向性，并在体外有效地重新刺激HCMV特异性T细胞反应。《科学报告》，8(1)，1474。https://doi.org/10.1038/s41598-018-19874-1)。简言之，将感兴趣的细胞在补充有蛋白酶抑制剂(Complete Mini，Roche，Basel，Switzerland)的TDLB缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，0.1％SDS，1％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠)中裂解。上清液的总蛋白质浓度通过Bradford法(蛋白质测定，BioRad，Feldkirchen，德国)测量。在还原条件下在SDS-PAGE上分离蛋白质，并在硝酸纤维素膜上印迹用于蛋白质印迹分析。用如上所列的一抗和二抗探测靶标。使用HRP标记的二抗和增强的化学发光底物或Femto ECL(Thermo Fisher，Waltham，USA)在Chemilux Pro装置(Intas，/>Germany)中进行检测。对于上样对照，将膜剥离(剥离缓冲液(62.5mM Tris，2％SDS，0.1Mβ-巯基乙醇，pH6.6)，在50℃下30min)并用针对微管蛋白的抗体重新探测。

软琼脂转化试验

如前所述进行软琼脂转化试验(Borowicz,S.,Van Scoyk,M.,Avasarala,S.,Karuppusamy Rathinam,M.K.,Tauler,J.,Bikkavilli,R.K.,&Winn,R.A.(2014))。软琼脂菌落形成测定JoVE,92,e51998.https://doi.org/doi:10.3791/51998)进行了如下小修改。将含10％FCS、1％PS、3.7g/l NaHCO3、3.8g/l d-葡萄糖、0.5％低糖琼脂糖(6351.2,Roth,Karlsruhe，德国)、1mg/ml G418和/或2μg/ml嘌呤霉素的2ml DMEM(无酚红，低糖)(D2902,Sigma Aldrich,St.Louis,USA)分别在6孔板中填充，室温孵育至培养基凝固。将慢病毒转导的NIH-3T3多克隆细胞5×10³分别接种于37℃预热的含10％FCS、1％PS、3.7g/lNaHCO3、3.8g/l d-葡萄糖、0.35％低熔体琼脂糖、1mg/ml G418和/或2μg/ml嘌呤霉素的DMEM中，在预处理的6孔板上室温孵育至培养基凝固。将培养板在37℃和5％CO2下孵育21日。在此期间，用200μl的DMEM每周2次，并添加10％的FCS和1％的PS。21d后，每孔用100μl4％PFA固定，在室温下用0.005％结晶紫染色1h,10％甲醇(v/v)。照片是用阿尔法成像仪HP(Proteinsimple,San Jose,USA)拍摄的，光圈5.6，焦距2.88。用ImageJ进行菌落计数(Schindelin,J.,Arganda-Carreras,I.,Frise,E.,Kaynig,V.,Longair,M.,Pietzsch,T.,Preibisch,S.,Rueden,C.,Saalfeld,S.,Schmid,B.,Tinevez,J.-Y.,White,D.J.,Hartenstein,V.,Eliceiri,K.,Tomancak,P.,&Cardona,A.(2012).Fiji:一个用于生物图像分析的开放源平台。自然方法,9(7),676–682.https://doi.org/10.1038/nmeth.2019)采用GraphPad Prism 8软件(GraphPad software,San Diego,USA)进行统计学分析。组间比较采用双侧非配对t检验。每个符号代表一次复制，条形表示平均值和平均值的标准误差(SEM)。显著性水平用*(p<0.05)，**(p<0.005)，ns(不显著)标记。

结果

抗原表达不引起锚定非依赖性生长

锚定非依赖性生长是致癌作用的标志，因为转化的细胞能够独立于附着于固相而生长(Borowicz等人，2014)。最严格的转化测试之一是软琼脂转化试验，它表征了软琼脂中固相独立生长的特点。为此，用编码以下HPV 16抗原的VSV-G假型慢病毒载体转导NIH-3T3细胞：分别为Ii-E1 E2 E6 E7、Ii-E1 E2-p2 a-Ii-E6 E7、E1 E2 E6 E7、Ii-E2、Ii-E1 E6E7-p2 a-Ii-E2、Ii-E1 E6 E7、E6 wt和E7 wt(图1A)。为了对照目的，分别用编码GFP的VSV-G假型慢病毒载体和缺乏转基因的慢病毒载体转导NIH-3T3细胞。另外，通过用编码HPV 16-E6 wt和HPV 16-E7 wt的慢病毒载体转导产生一种多克隆NIH-3T3细胞系。

抗生素筛选后，通过蛋白质印迹分析验证多克隆NIH-3T3细胞系的转基因表达。对于所有细胞系，检测到正确大小的预期条带，除了Ii-E1 E6 E7-p2 a-Ii-E2(图8A)。由于该细胞系的产生在3次尝试中失败，因此将Ii-E1 E6 E7-p2 a-Ii-E2从进一步分析中排除。按照方法章节所述，将5×10³个细胞接种于软琼脂中。接种后3周，将平板染色，并用ImageJ计数集落。与阴性对照(GFP-和空载体转导的NIH-3T3细胞)相比，集落数量没有差异，除了E7wt-和E6wt+E7wt转导的细胞(图8B)在软琼脂中容易形成大量集落。总之，这证实了HPV16抗原的转化潜力的功能失活，因此抗原可以被认为是安全的。

实施例3：MfPV3Ii-E1E2E6E7在恒河猴中的免疫原性

材料和方法

细胞系、转染和病毒感染

将悬浮生长的AGE1.CR.pIX和AGE 1.CR.pIX-T-REx细胞维持在补充有2mM L-谷氨酰胺(Sigma)和重组胰岛素样生长因子(LONG-R³ IGF，50ng/mL终浓度，Sigma)的化学成分确定的CD-U6培养基(ProBioGen AG)中，并在8％CO2下以180rpm的振荡速度在定轨振荡器(Multitron Pro，Infors HT)中孵育。为了贴壁生长，将AGE1.CR.pIX和AGE 1.CR.pIX-T-REx细胞在补充有5％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培养基DMEM/F12中培养。将贴壁细胞系维持在37℃和8％C02的加湿培养箱中。

重组MVA载体的产生

如前所述产生重组MVA载体(Jordan,I.,Horn,D.,Thiele,K.,Haag,L.,Fiddeke,K.,Sandig,V.,Virol Sin.2020Apr；35(2):212–226.doi:10.1007/s12250-019-00176-3.)简而言之，我们将感兴趣基因(GOI)-(图1)克隆到穿梭载体SP-CR19III-tetO中，该载体适合将GOI整合到MVA E/l启动子控制下的MVA缺失位点III中。通过同源重组，在贴壁细胞AGE1.CR中获得了编码不同go基因的重组MVA。所述pIX-T-REx细胞，其通过利用Tet系统(上文s.)来防止GOI在重组MVA产生和增殖期间的不期望表达。因此，将接种于6孔板的单层培养物用MOI为0.05的MVA或MVA-cr19感染，并按照制造商的说明用Effectene转染试剂(Qiagen，德国)转染2μg单个穿梭载体。感染/转染后的培养物在感染/转染后的2-3天收获，经过超声处理后，用于在6孔板中细胞单层的感染。形成的斑块经PCR验证，然后进行迭代的斑块纯化程序，直到不再存在没有正确GOI表达基因组的MVA(通常在5-8轮的斑块纯化内)。

为了繁殖斑块纯化的MVA，使用小瓶Tweeter(设置为100％周期和90％振幅的20s，Hielscher，Germany)对细胞收获材料进行超声处理，并用MOI 0.05的单个重组MVA载体接种AGE1.CR.pIX-T-REx(在CD-U4和CD-VP4(Merck Millipore)的1:1混合物中以2x10⁶个细胞/ml的悬浮液生长)。最后，在感染后48小时至72小时采集MVA，并测定TCID50滴度。

动物

茂物农业大学(IACUC)灵长类研究中心(动物保护和使用委员会)批准了食蟹猴的伦理使用。根据结核、猿猴t细胞白血病病毒和猿猴反转录病毒阴性，以及宫颈MfPV3阳性，选择6～10岁、体重3～5kg的雌性食蟹猴为研究对象。接种前对入选动物进行驯化1个月。动物们被成群地饲养，每天两次用猴粮(泰国正大)喂养。

所有程序均由训练有素的兽医、动物技术员和护理员执行。在所有程序(如接种疫苗和采血、宫颈拭子)之前，用氯胺酮(10-15mg/kg)和甲苯噻嗪(0.5-1mg/kg)麻醉动物。在手术前后，猕猴的疼痛、痛苦、体温和体重都受到了监测。血液采集限于实验持续时间内允许的最大体积。该实验仍在进行中，但所有动物在研究结束时都被送回该群体，用于其他实验或育种计划。

从宫颈拭子中纯化DNA并通过qPCR检测MfPV3

简言之，使用小型宫颈细胞刷获得宫颈样品，并将其置于称为TEN缓冲液的防腐剂溶液中(Tris-HCl 10mM pH 7.5；EDTA 5mM，NaCl 50mM)。用DNA提取试剂盒(QIAmp DNA血液迷你试剂盒，Qiagen，希尔登,德国)从宫颈样品中提取DNA，并按照制造商的程序在100mL中洗脱。

MfPV 3阳性食蟹猴的选择和治疗性疫苗接种试验期间MfPV 3感染水平的检测在茂物大学(印度尼西亚)通过定量PCR(qPCR)用以下引物和探针组进行：5′FAM-aaatggtgcagtgggcatacgacc-3′BHQ 1、gggaaccacctgaatgata和ggcgcaatccttcacatatt。

接种疫苗

动物在第0天接种PBS或Ad19a/64载体的MfPV3 Ii-E1E2E6E7，在第42天接种MVA载体的MfPV3 Ii-E1E2E6E7。疫苗通过肌肉注射、直肠内注射和阴道内注射进行给予，每种途径接种2x10⁸感染单位(Ad19a/64)或细胞传染量50％(MVA)。

ELISpot

采用Ficoll-Paque(Sigma)法从血液中纯化每只接种疫苗的食蟹猴的外周血单个核细胞(PBMCs)。使用猴IFN-γELISPOTplus试剂盒(MABTECH，#3421M-4HST-2)检测新鲜纯化的pbmc在含有2mg/mL相关肽库的37℃和5％CO2孵育18-20小时后IFN-γ的产生。在IRIS仪器上读取斑点形成单位(SFU)，并使用ELISpot Big emphasis算法进行计数。在图形表示之前，先减去未刺激样本的背景反应。

NHP PBMC的流式细胞术

采用Ficoll-Paque(Sigma)法从血液中纯化每只接种疫苗的食蟹猴的外周血单个核细胞(PBMCs)。细胞在含或不含2μg/mL相关肽的20ug/uL brefeldin A中孵育5小时。细胞表面标记:APC-CD3(克隆SP34-2,BD biosciences)，PerCP/Cy5.5-CD4(克隆L200,BDbiosciences)，PE-CD8(克隆RPA-T8,BD biosciences)和可固定活性染料eFlour780(Thermofisher)染色。表面染色后，细胞在BDcytofix/Cytoperm中固定和通透，并使用FITC-IFN-γ(Clone MD-1,UCy-Tech)和PE/Cy7-TNF-α(Clone mAb11,BD biosciences)抗体进行细胞内染色。

使用的肽是覆盖整个Ii-E1 E2 E6 E7抗原的11个氨基酸重叠的16聚体。将肽合并到分别含有I1、E1、E2、E6和E7肽的5个单独的池中。肽获自KareBay，Town，China。

在FACS CANTO流式细胞仪上进行流式细胞术，并使用FlowJo V10软件进行数据分析。表位特异性CD 8+T细胞应答测量为活的CD 3+、CD 8+或CD 4+、IFN-γ+细胞。在绘图和分析之前减去背景(来自未刺激的样品)。所有低于0.01％的响应均被视为低于检测限，并手动调整至0.01以获得最佳视觉表示。

结果

通过ELISpot测量的初免疫苗接种后的应答

与PBS(假阴性/阴性对照)接种的动物相比，所有接种的动物对E1肽库反应强烈(图10)。在所有接种疫苗的动物中都有E2反应，尽管频率低于E1，在两只接种疫苗的小鼠中可见E6/E7反应。

这提供了Ii-E1 E2 E6 E7 Ad 19 a/64疫苗在猴中具有免疫原性的证据。

通过细胞内染色和流式细胞术测量加强接种后的应答

在加强之前检测到非常低的T细胞应答(图10，中间图)，但在MVA加强后9天，T细胞应答已被重新放大。与PBS对照相比，所有接种疫苗的猴均显示出针对至少一种疫苗抗原(包括E1)的强CD8和CD4应答，并且在许多接种疫苗的动物中也检测到针对E2和E7的CD8应答(图10，下图)。

除了证实病毒载体的MfPV 3 Ii-E1 E2 E6 E7疫苗在MfPV 3感染的猴中具有免疫原性之外，这还提供了疫苗可以治愈NHP中预先存在的MfPV 3感染的强烈指示。

所有接种动物中第56天MfPV3感染的清除

如图12中所见，与6只注射PBS的阴性对照动物中仅3只相比，在第42天(初免后6周)仅两只接种疫苗的动物具有可检测的MfPV3接种，并且所有接种疫苗的动物在第56天(加强后2周)清除了感染。请注意，疫苗组的1只动物和阴性对照组的1只动物在第0天未检出MfPV 3(每个符号代表1只动物)。然而，在第0日未检出感染的阴性对照动物在第42日可检出病毒血症，因此被视为感染，这意味着疫苗组和PBS组的清除率分别为5/5和3/6，因此p值＝0.18(Fisher精确检验)。

疫苗诱导的T细胞应答在具有持续MfPV3感染的动物中表现出功能性。

HPV特异性T细胞耗竭可发生在持续性HPV感染的人身上，其特征是功能丧失并最终消除抗原特异性T细胞。因此，重要的是，治疗性疫苗可以在持续存在感染的情况下诱导抗原特异性免疫反应。

用hAd 19 a/64 Ii-E1 E2 E6 E7初次免疫确实在所有接种的动物中诱导针对疫苗抗原的IFN-γ产生T细胞(图11A)。值得注意的是，在持续性MfPV 3感染的接种动物与HPV感染持续时间未知的动物之间未观察到差异。

在第42天用MVA载体的Ii-E1 E2 E6 E7免疫增强了针对E1和E2的CD 8+T细胞应答，而针对E6和E7的CD 8+T细胞应答似乎没有通过加强而增强(图11B)。

产生高水平效应细胞因子的能力是高功能和无衰竭的标志。对平均产生IFN-γ的CD8+T细胞所做的评估显示，E1特异性CD8+T细胞的IFN-γ水平显著高于E7(图11C)。这表明与E1特异性T细胞相比，E7特异性T细胞的耗竭可能更为普遍。

实施例4：具有HPV 16E1、E2、E6和E7抗原的不同构建体设计的性质和HPV 16 Ii-E1 E2 E6 E7的肿瘤保护功效

材料和方法：

动物、免疫接种、顺铂注射和肿瘤激发

C57BL/6和CD1小鼠分别来自Envigo(Horst，荷兰)、OF1小鼠来自Charles River(法国)和HSd-Ola小鼠来自Envigo(英国)。所有动物均为雌性，6～8周龄，饲养在哥本哈根大学(University of Copenhagen)帕纳姆研究所(Panum Institute)。在使小鼠适应至少1周后开始所有实验。实验获得了国家动物实验检查员(dyrefo)的批准。2016-15-0201-01131)，并按照国家指南执行。

肿瘤细胞系C3是通过用HPV16基因组和活化的ras癌基因转染小鼠胚胎细胞而建立的(Feltkamp等人，Eur J immunl 1993)。通过流式细胞术检测HPV16 E7的存在进行细胞系鉴定。在C57BL/6小鼠腰背部皮下注射1E+06C3肿瘤细胞(200uL PBS+0.2％BSA)，以评估体内抗肿瘤效果。每周3次测量肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积为:长度*宽度²*0.5236(Janik et al,Cancer Res 1975)。一旦肿瘤超过1000mm³或在指定的时间点，通过颈脱位处死动物。

对于已建立肿瘤的治疗(d10免疫接种)，基于治疗前小鼠的肿瘤大小将其分配至治疗组，以确保所有治疗组在治疗开始时的平均肿瘤大小相等。

用腺病毒载体在大腿肌肉内(i.m)进行免疫，与在50μL PBS中稀释2×10⁷IFU rAd的肿瘤注射部位相同，除图18之外，在图18中，小鼠在下肢进行了全身和皮肤混合免疫，使用2×10⁷IFU Ad5或Ad5F35在30uL PBS中。用SLP疫苗(HPV16 E743-77和HPV16 E641-65,Schafer)在肿瘤的对侧注射50μg的多肽。将冻干多肽溶于DMSO中至100mg/mL，再用PBS稀释至0.5mg/mL，制备SLP疫苗。将其与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich)以1∶1的比例乳化至0.25mg/mL的最终浓度，并向每只小鼠注射200uL的总体积。

顺铂(Sigma-Aldrich)溶于1mg/mL 0.9％氯化钠溶液中，3mg/kg小鼠体重腹腔注射，每周1次，共3次。

当肿瘤超过1000mm³、出现坏死伤口或小鼠活动性显著降低时，对小鼠实施安乐死。

脾脏、淋巴结、血液和瘤内免疫细胞的细胞内染色和流式细胞术分析

用器官收获法获得脾细胞和淋巴结单细胞悬液，用70μm细胞滤器过滤。收集后的肿瘤组织称重，并使用Miltenyi小鼠肿瘤分离试剂盒(型号130-096-730)和GentleMACSDissociator按照制造商的方案进行处理。在EDTA Microvette管(Sarstedt)中收集血液并使用ACK裂解缓冲液(Gibco)裂解红细胞。

用3个μM莫能菌素加或不加1个μg/mL相关肽(JPT HPV16 pepmix)孵育细胞5小时。对细胞进行表面标记染色(所有抗体均来自BioLegend,San Diego,美国，除非另有说明):APC-Cy7或BV421 CD8(53-6.7,1∶200,BD Biosciences,Franklin Lakes,美国)，PE-Cy7CD4(RM4-5,1∶800,BD Biosciences,Franklin Lakes,美国)，FITC CD44(IM7,1∶100)，PerCP-Cy5.5 B220(RA3-6B2,1∶200)，可固定活性染料eFluor^TM780(eBioscience)和BV510PD-1(29F.1A12,1:100)。细胞表面染色后，用1％PFA固定，0.5％皂苷渗透，用APC IFN-γ(XMG1.2,1:100)和PE TNF-α(MP6-XT22,1:100)抗体进行细胞内染色。在Fortessa 3或Fortessa X20(BD Biosciences,Franklin Lakes,美国)流式细胞仪上进行流式细胞术，使用FlowJo V10软件进行数据分析。HPV16特异性CD8+T细胞应答以B220-、CD8+或CD4+、CD44+、IFN-γ+细胞的形式测定，并以每个脾脏的细胞总数、每mL血液的细胞总数、每g肿瘤的细胞总数或群体的比例的形式呈现，如各自的图中所述。通过IFN-γ+CD8+和CD4+细胞中IFN-γ的MFI和双阳性细胞(同时表达IFN-γ和TNF-α)的比例来评价IFN-γ+反应的质量。

瘤内免疫细胞的谱系染色和流式细胞术分析

收集后的肿瘤组织称重，使用Miltenyi小鼠肿瘤分离试剂盒(cat no 130-096-730)和GentleMACSDissociator按照制造商的操作程序进行处理，并对表面标志物进行染色(均为1:100,BD Biosciences,Franklin Lakes,USA，如无特别说明):BV650 CD8(53-6.7)，PerCP/Cy5.5 CD4(RM4-5)，PE/Cy7 CD45.2(104)，APC F4/80(BM8,BioLegend,圣地亚哥，美国)，AF488 CD11c(N418,BioLegend,圣地亚哥，美国)，BV421 PD-L1(10F。9G2,biolegende，圣地亚哥，美国)，BV510 PD1(29F。1A12,BioLegend,圣地亚哥，美国)，AF700TER119(TER-119)和固定活性染料eFluor^TM780(1:1000,eBioscience)。表面染色后，使用eBioscience^TMFoxp3/转录因子染色缓冲液对细胞进行固定和通透性染色，并使用PE Foxp3(FJK-16s,1:100,Invitrogen)对细胞内进行染色。采用Fortessa 5(BD Biosciences,Franklin Lakes,USA)流式细胞仪进行流式细胞术检测，采用FlowJo V10软件进行数据分析。

免疫细胞耗竭

通过腹腔注射每只小鼠100微升PBS溶液中的0.25毫克抗小鼠CD4(GK1.5；#BE0003-1；BioXCell)和0.1毫克抗小鼠CD8(2.43；#BE0061；BioXCell)或0.1毫克大鼠IgG2b同种型对照(LTF-2；#BE0090；BioXCell)来进行CD4+和CD8+T细胞耗竭。在C3肿瘤激发后第20、23和26日给予消耗抗体。在第28日，使用BV421 CD8(53-6.7,1∶200,BD Biosciences,Franklin Lakes,美国)、PerCP/Cy5.5 CD4(RM4-5,1∶100,BD Biosciences,FranklinLakes,美国)、PE/Cy7 CD45.2(104,1∶100BD Biosciences,Franklin Lakes,美国)和可固定活性染料eFluor^TM780(1∶1000,eBioscience)对血液样本进行表面染色和流式细胞术验证耗用。采用Fortessa 3(BD Biosciences,Franklin Lakes,美国)流式细胞仪进行流式细胞术检测，采用FlowJo V10软件进行数据分析。

肿瘤组织的免疫组织化学染色

在处死时仔细获取肿瘤组织并固定在4％冷PFA(Alfa Aesar)中。约24小时后用70％乙醇交换固定剂。将固定的组织石蜡包埋，切片用PE和DAB(D4W2Z,1:60,pH＝9，细胞信号)染色。

采用Axio Scan对组织进行扫描。Z1(蔡司)和分析使用Zen 3.4软件(cut-offarea:10-180um2。截圆度:0.5-1.0)。

结果

Ad19a/64载体疫苗在远交系和近交系小鼠中均诱导了强大的CD8+和CD4+T细胞应答，该应答可被Ad5增强

用单剂Ad19a/64载体疫苗对远交系CD1小鼠进行肌内免疫证实了不同抗原构建体在体内的免疫原性，因为检测到了针对E1的CD8+T细胞应答(图13A)，并且测定了针对E1(图13B)和E2的CD4+应答(图13C)。

为了进一步增强免疫应答，应用异源初免-加强免疫，递送人Ad 5编码的Ii-E1 E2E6 E7作为加强疫苗。这增加了对E1的CD 8+T细胞应答(图13D与图13A相比)，并且也诱导了针对E7的一些应答(图13E)。针对E1和E2始终检测到CD 4+T细胞应答，针对E6和E7偶尔检测到CD 4+T细胞应答(数据未显示)。我们从未在CD 1小鼠中检测到对E2或E6的CD 8+T细胞应答，这可能反映了由于创始小鼠数量相当少而导致据称远系繁殖的CD 1小鼠模型中MHC多样性有限(Yalcin等人.2010)。因此，我们选择在Ad 19 a/64-Ad 5初免-加强方案中评估Ii-E1 E2 E6 E7疫苗在所选的独立衍生自CD 1的其他远交小鼠品系(OF 1和Hsd-Ola)中的作用(Yalcin等人.2010)。在这里，我们在至少一个小鼠品系中检测到疫苗诱导的针对所有4种抗原的CD8+应答(图13F-I)，以及针对E1、E2和E7的CD4+应答(数据未显示)。

最后，我们想确认C57 BL/6中的免疫原性，C57 BL/6是HPV 16治疗性疫苗领域的标准小鼠模型。对于所有抗原设计，我们发现了针对E1的应答性CD 8+T细胞(图13J)，并且还检测到E7特异性CD 8+T细胞(图13K)和针对E1的CD 4+应答(数据未显示)。Ii-E1 E2 E6E7比Ii-E1 E6 E7-p2 a-Ii-E2疫苗产生显著更强的E7应答，并且Ii-E1 E2 E6 E7似乎也比不编码Ii的疫苗产生更强的E7应答(p＝0.077)。当观察IFN-γ阳性细胞的积分平均荧光强度(iMFI)结合诱导的T细胞应答的幅度和质量时，进一步支持了Ii-E1 E2 E6 E7的这一优势(Shoostari等.2010)。在该分析中，与不编码Ii的疫苗和编码与p2 a-Ii直接连接的E7的疫苗相比，Ii-E1 E2 E6 E7显著增强了针对E7的应答(图13M)。此外，与非Ii疫苗相比，Ii-E1 E2 E6 E7的E1应答也有更高的趋势(图13L，p＝0.06)。我们没有检测到任何E2或E6特异性CD 8+T细胞应答，尽管先前报道了E6表位(aa 48-57，EVYDFAFRDL)(Peng等.2004)。这可能是由于免疫显性，因为先前仅描述了编码单独E6的疫苗对E6表位的应答，并且已经报道E6表位的免疫原性低于显性E7表位(aa 49 -57，RAHYNIVTF)(Feltkamp等人，1993)。

基于C57 BL/6小鼠中优异的CD 8+T细胞应答，以及远交小鼠模型中缺乏劣性和积极趋势，我们决定继续进行Ii-E1 E2 E6 E7抗原设计。

最后，我们证实，与单独的Ad19a/64启动相比，Ad19a/64启动后异源Ad5载体增强诱导了重新调用疫苗特异性反应，而Ad19a/六十四同源增强则没有(图13N-P)。包括不含抗原的Ad19a/64和Ad5载体的阴性对照组，以确认反应是疫苗特异性的。

在肿瘤接种后不久进行的Ad载体疫苗接种提供了单剂肿瘤控制和提高的存活率

C57BL/6小鼠注射同系C3肿瘤细胞，观察我们的HPV疫苗的治疗效果。C3细胞系是通过将HPV16基因组和活化的ras癌基因转染小鼠胚胎细胞建立的(Feltkamp等，1993)，肿瘤可以表达所有HPV16抗原(Schmitt和Pawlita等，2011)，而常用的TC-1肿瘤模型只包含HPV16 E6和E7(Lin等，1996)。值得一提的是，如Sluis等2015(参考他们的补充图1)所示，C3肿瘤细胞系通常生长较慢，并且比TC-1模型更具有治疗耐药性，这使得在C3模型中显示治疗效果更具挑战性。

在第一个实验中，在肿瘤攻击后2天，用编码Ii-E1 E2 E6 E7或不相关抗原(阴性抗原)的A19 a/64载体处理小鼠。在第20天，用含有相同抗原的Ad 5载体进行另一次处理以加强应答。Ii-E1 E2 E6 E7治疗显著降低肿瘤生长(图14A)，在10只小鼠中的3只中完全清除肿瘤(图14B)并且显著增加存活(图14C，在第41天3/10对10/10死亡)，表明该治疗对小肿瘤有效。

Ad载体疫苗对已建立的肿瘤提供单剂控制，并与顺铂联合治疗协同作用

在证实了用治疗性疫苗接种早期治疗C3肿瘤作为疫苗方案单一疗法具有良好效果后，我们继续研究对已建立的肿瘤的效力。一旦存在可触知的肿瘤(第10天)，用治疗性疫苗接种处理小鼠，其显示一些动物中肿瘤生长的减少(图15A和B)和存活率的显著增加(图15C)。顺铂是临床上HPV+癌症的标准治疗方法，此前已显示出与HPV靶向治疗疫苗的协同作用(Sluis等人，2015)。如Nejad等人先前所述，将治疗性疫苗接种与每周三次的顺铂注射相结合。与顺铂治疗和对照疫苗接种以及单独的治疗性疫苗注射相比，2016显著提高了肿瘤控制(图15D和E)和存活率(图15F)(数据未显示)。

肿瘤组织的免疫组织化学染色显示，治疗性疫苗接种显著增加了CD8+T细胞的数量(图15G和15I)，更重要的是，增加了这些CD8+T淋巴细胞向中心肿瘤实质的浸润水平(图15H和图15I)。与顺铂的共处理似乎对通过免疫组织化学观察到的CD8+T细胞的浸润没有任何明显的影响(数据未显示)。为了进一步研究所观察到的治疗效果的原因，我们在各个治疗组合的治疗效果刚刚开始发挥作用的时间点收获了肿瘤和淋巴器官。对于用疫苗和顺铂组合处理的小鼠，在第24天进行器官摘取(图15D)，对于用单独的疫苗处理的小鼠，在第30天进行器官摘取(图15A)。肿瘤浸润性CD 8+T细胞的分析显示，当在两个时间点与肿瘤细胞离体孵育时，接种疫苗的小鼠具有更多的产生IFN-γ的肿瘤反应性CD 8+T细胞(图15J)。观察脾脏应答，疫苗在这些荷瘤小鼠中特异性地诱导了E1和e7特异性CD8+t细胞应答(图15K)，这与之前分析的未受到肿瘤攻击的小鼠相对应(图13)。单独顺铂治疗(neg ctrl+顺铂，d24，图15K)似乎诱导了一些对抗hpv产生应答的CD8+T细胞，主要针对E7，在一些小鼠中针对E1，但每个细胞的IFN-γ水平(图15L)和产生IFN-γ的CD8+t细胞的数量(也能够产生TNF)明显低于Ii-E1E2E6E7治疗的小鼠(图15M)。

表面染色分析显示，顺铂治疗似乎对肿瘤中CD8+T细胞的数量没有影响，这支持了免疫组织化学的发现(数据未显示)，但治疗性疫苗在第24天和第30天均显著增加了肿瘤中抗原呈递CD11c阳性细胞的比例(图15N)。我们还观察到，在接受顺铂治疗的小鼠中，肿瘤中树突状细胞(DCs)水平有较高的趋势，这与Nejad等人2016年报告的情况类似，但这一差异也可以归因于分析分别在第24日和第30日进行。

肿瘤控制是由CD8+T细胞介导的

由于CD8+T细胞似乎与治疗性疫苗接种和肿瘤治疗效果相关，因此我们想确认CD8+T细胞是否实际上是主要的效应细胞类型。有可触及肿瘤的小鼠(第10日)接受治疗性疫苗和顺铂治疗，随后从第20日开始接受抗体细胞耗竭性抗体治疗，主要处理抗肿瘤应答的效应期。我们发现，CD8缺失完全消除了治疗性疫苗的抗肿瘤作用(图16A)。相反，我们观察到CD4+T细胞减少导致肿瘤控制增强的趋势(图16A)，这可能表明肿瘤微环境中的CD4+T细胞具有免疫抑制表型。事实上，我们发现肿瘤浸润的CD4+人群主要是FoxP3+亚型，这表明调节性T细胞(Tregs)的大量存在，并且治疗性疫苗使其增加(尽管仅在顺铂联合治疗的情况下显著)(图16B)。

与两种E6/E7合成长参比肽与顺铂组合相比，Ad-载体的Ii-E1 E2 E6 E7疫苗提供了增强的存活

之前的研究表明，通过不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant,IFA)配制的E7肽E7_43-77免疫对C3肿瘤有效(Sluis等2015；Nejad等2016；Sluis等2015；Zwaveling等2002)。该肽包括在C57BL/6小鼠中具有免疫优势的已确定的E7表位(Feltkamp等，1993)。E6³⁴中也报道了另一个表位，但其优势不那么明显。虽然之前发表的针对HPV+C3肿瘤的多肽疫苗研究仅包括E7_43-77肽，但我们选择在我们的疫苗比较中也包括E6_41-65肽。这两个肽也是复杂合成长肽疫苗(以临床开发名称ISA101命名)的一部分，该疫苗由覆盖整个HPV16 E6和E7的13个肽组成(Melief等人2020)，之所以选择这两个肽(i)是因为它们与近交系小鼠品系的相容性，以及(ii)出于参考目的(Sluis等人2015；Nejad等2016；Sluis等2015；Zwaveling等2002)。

当小鼠出现可触及的肿瘤时(第10天)，用顺铂和在IFA中形成的两种多肽或我们的AD-载体Ii-E1E2E6E7进行治疗性疫苗接种。与肽疫苗相比，Ii-E1E2E6E7疫苗更大程度地抑制了肿瘤生长(图17A)，并显著改善了患者生存期(图17B)。接种Ii-E1E2E6E7后检测到针对E1的CD8+T细胞应答，接种两种E6/E7肽后预计未检测到CD8+T细胞应答(图17C)。两种疫苗诱导了相似水平的E7特异性CD8+T细胞(图17D)，并且未检测到CD4+T细胞应答(文中未给出数据)。

用Ad 5 F35载体的HPV 16 Ii-E1 E2 E6 E7疫苗接种在小鼠中诱导与Ad 5相似数量和质量的CD 8+T细胞

为了证实Ad5F35是一个有用的替代Ad5作为加强载体，我们用Ad5或编码HPV16Ii-E1E2E6E7的Ad5F35载体2×10⁷IFU免疫近交系C57BL/6小鼠。免疫后14天，通过细胞内细胞因子染色和流式细胞术分析脾CD8+T细胞对HPV16 E1和E7的反应。

如图18所示，Ad5F35能够产生E1和E7反应性CD8+T细胞，其大小(图18A和B)和质量，通过IFN-γ信号强度(图18E和F)以及产生TNF-α和IFN-γ的能力(图18C和D)进行评估，与Ad5载体疫苗诱导的应答相似。这为Ad5F35在治疗性初免-加强免疫方案中替代Ad5提供了证据，且不影响治疗效果。

实施例5：本发明的另外的病毒载体及其表达控制

材料和方法

细胞系

HEK293T细胞和A549细胞在添加10％胎牛血清(FCS)和1％青霉素/链霉素(Pen/Strep)的DMEM中维持和生长。9E10 mycl杂交瘤细胞在添加10％FCS,1％Pen/Strep和2mM谷氨酰胺(Pan)的RPMI中培养。在未加湿的培养箱中将这些细胞系维持在37℃和5％CO2下。

附着AGE1.CR.pIX细胞在添加5％胎牛血清(FCS)的杜尔贝克改良Eagle培养基DMEM/F12中培养，并在未加湿的培养箱中维持在37℃和8％CO2的条件下。

以MOI为100的Ad19a/64载体在DMEM培养基中感染亚融合A549细胞。感染后2h，将培养基更换为含10％FCS和1％Pen/Strep的DMEM培养基。

以MOI为10的MVA和MVA-CR19载体在DMEM培养基中感染亚融合HEK293T细胞，不加任何添加剂。感染后2h，将培养基更换为含10％FCS和1％Pen/Strep的DMEM培养基。

以MOI为1的MVA和MVA-CR19载体在DMEM/F12培养基中感染亚融合AGE1.CR.pIX细胞，不加任何添加剂。感染后2h，将培养基更换为具有补充有5％FCS的DMEM/F12的DMEM。

腺病毒载体的产生

如前所述产生血清型Ad 19 a/64的E1/E3缺陷型腺病毒载体(Ruzsics,Z.,Lemnitzer,F.&Thirion,C.利用细菌人工染色体(BAC)技术改造腺病毒基因组.见于《腺病毒：方法与协议》(Chillón,M.&Bosch,A.编著),143–158页.Humana出版社.2014)doi:10.1007/978-1-62703-679-5_11)。简言之，将目标基因(GOI)-(图1)克隆到CMV启动子控制下的穿梭载体pO6-19a-HCMV-MCS中。将CMV-GOI-SV40-pA在E.coli中插入BAC载体(Ruzsics，Z.等人，2014)，其含有在E1/E3基因中缺失的复制缺陷型基于Ad的载体的基因组。通过PacI限制性酶切从纯化的BAC-DNA释放重组病毒DNA。将获得的线性DNA转染到上述生产细胞系中用于病毒增殖。重组病毒通过脱氧胆酸钠处理从细胞中释放。用DNase I酶切残余的游离DNA。然后，通过CsCl梯度超离心纯化载体，随后通过PD10柱(GE Healthcare，美国芝加哥)缓冲液交换至10mM Hepes pH 8.0、2mM MgCl2和4％蔗糖。使用RapidTiter方法进行滴定，通过用抗hexon抗体(Novus，腺病毒抗体(8C4))进行免疫组织化学染色来检测感染的生产细胞。通过从纯化载体提取的DNA中GOI的PCR扩增来确认插入物的完整性。

重组MVA载体的产生

如前所述产生重组MVA载体(Jordan,I.,Horn,D.,Thiele,K.,Haag,L.,Fiddeke,K.,Sandig,V.,Virol Sin.2020 4月；35(2):212–226.doi:10.1007/s12250-019-00176-3.)简言之，将目的基因(GOI)-(图1)克隆到穿梭载体SP-CR 19 III-tetO中，所述穿梭载体SP-CR 19 III-tetO适合于在MVA E/L-启动子的控制下将GOI整合到MVA的缺失位点III(DelIII)中，或克隆到穿梭载体LZAW1-tetO中，所述穿梭载体LZAW1-tetO适合于在MVASSP-启动子的控制下将GOI整合到MVA的胸苷激酶基因座(TK)中。编码不同GOIs的重组MVA通过在贴壁AGE 1.CR.pIX-T-REx细胞中同源重组产生，所述细胞通过利用Tet系统防止在重组MVA的产生和增殖期间GOI的不期望的表达(见上文)。因此，根据制造商的说明，用MOI为0.05的MVA或MVA-CR19感染接种在六孔板中的培养单层，并使用Effectene转染试剂(Qiagen，德国)用2μg单个穿梭载体转染。感染/转染后2-3天收获感染/转染的培养物，超声处理，并用于感染六孔板形式的细胞单层。通过PCR验证得到的斑块，并开始迭代斑块纯化程序，直到没有正确GOI表达盒的MVA不再存在(通常在5-8轮斑块纯化内)。

为了扩增空斑纯化的MVA，使用Vial Tweeter(设置为20秒的100％循环和90％振幅，Hielscher，德国)超声处理细胞收获材料，并将AGE 1.CR.pIX-T-REx(在CD-U4和CD-VP4(Merck-Millipore)的1：1混合物中以2×10⁶个细胞/ml悬浮生长)以MOI 0.05接种单个重组MVA载体。最后，在感染后48小时-72小时收获MVA，并测定TCID₅₀滴度。

抗体和抗体纯化

从杂交瘤细胞上清液中获得抗myc(9E10)的抗体。将9E10 mycl杂交瘤细胞以5×10⁵个细胞/ml接种于补充有1％FCS、1％Pen/Strep和2mM谷氨酰胺的RPMI中。接种后5天收获上清液，并通过HiTrap蛋白G柱(GE Healthcare，Chicago，美国)纯化抗体。用PBS洗涤柱后，用0.1M甘氨酸/HCl(pH 3.2)洗脱抗体，用0.025体积的1M Tris/HCl(pH 9)中和，并对PBS透析。

使用的其他抗体为：抗HPV 16-E2(TVG-271，1：200，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，德国)，抗HPV 16-E6(GTX 132686，1：2000，Biozol，Eching，德国)，抗HPV 16-E7(NM 2，1：200，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，德国)，抗HPV 18-E2(2E7，1：1000，Abcam，Cambridge，英国)，抗HPV 18-E6(C1 P5，1：200，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，德国)、抗HPV 18-E7(F-7，1：200，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，德国)、抗微管蛋白(DM 1α，1：1000，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，德国)、山羊抗小鼠HRP(115-036-003，1：5000，Jackson，West Grove，美国)和山羊抗兔HRP(P0448，1：2000，Dako，Santa Clara，美国)。

蛋白质印迹分析

如前所述进行蛋白质印迹分析(Kiener，R等基于腺病毒19a/64的疫苗载体表现出广泛的细胞嗜性，并在体外有效地重新刺激HCMV特异性T细胞反应Sci.Rep.8,1474,2018)简言之，在补充有蛋白酶抑制剂(Complete Mini，Roche，Basel，瑞士)的TDLB缓冲液(50mMTris，pH 8.0，150mM NaCl，0.1％SDS，1％Nonident P-40，0.5％脱氧胆酸钠)中裂解感兴趣的细胞。通过Bradford方法(Protein Assay，BioRad，Feldki rchen，德国)测量上清液的总蛋白浓度。在还原条件下在SDS-PAGE上分离蛋白质，并在硝酸纤维素膜上印迹用于蛋白质印迹分析。用如上所列的一抗和二抗探测靶标。使用HRP标记的二抗和增强的化学发光底物或Femto ECL(Thermo Fisher，Waltham，美国)在Chemi lux Pro装置(Intas，德国)中进行检测。对于上样对照，用针对微管蛋白的抗体重新探测膜。

结果

基于MfPV3抗原的初步结果，制备了包含HPV16和HPV18重组抗原的rAd载体。用腺病毒转导的A549细胞进行蛋白质印迹分析，以确定编码抗原的正确表达。所有载体都容易表达抗原，其条带类似于在预期位置用E2-、E6-和E7-定向抗体检测到的相应融合蛋白(HPV16抗原图19A，HPV18抗原图19B)。特别是对于HPV16抗原，可以观察到降解产物，由较低分子量条带指示。

将MfPV 3(Ii-E1 E2 E6 E7、E1 E2 E6 E7)、HPV 16和HPV 18(均为Ii-E1 E2 E6E7)的选定抗原克隆到穿梭载体中，以分别整合到MVA或MVA-CR 19的DelIII基因座或TK基因座中。所有载体都容易表达与myc导向抗体(MfPV3，图20a)或型特异性E2、E6和E7导向抗体在预期位置检测到的各自融合蛋白相似的条带的抗原(HPV16抗原图20B,HPV18抗原图20C)。尤其对于HPV16和HPV18抗原，可以观察到降解产物，表现为分子量较低的条带。

Claims

1.一种核酸，其包含编码乳头瘤病毒蛋白E1、E6和E7的核酸序列或由编码乳头瘤病毒蛋白E1、E6和E7的核酸序列组成；其中所述核酸分子编码单个多蛋白。

2.根据权利要求1所述的核酸，其进一步包含编码乳头瘤病毒蛋白E2的核酸序列或进一步由编码乳头瘤病毒蛋白E2的核酸序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中编码所述蛋白质的所述核酸的顺序是，从5'到3'，

(a)在E2存在的情况下

(i)E1,E2,E6,E7；或

(ii)E1,E6,E7,E2；

或

(b)E1,E6,E7.

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸，其包含编码乳头瘤病毒蛋白E6和/或E7的核酸序列或由编码乳头瘤病毒蛋白E6和/或E7的核酸序列组成，其中所述核酸序列与野生型对应物相比通过点突变和/或缺失而被修饰，其中所述点突变和/或缺失

(i)在软琼脂测定中消除菌落形成；和

(ii)所述经修饰的蛋白质E6和E7保持相应野生型蛋白质的预测表位的至少70％的预测高亲和力表位(IC50<50nM)和至少50％、至少55％或至少58％的预测低亲和力表位(50nM<IC50<5μM)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述乳头瘤病毒是灵长类乳头瘤病毒，优选人乳头瘤病毒(HPV)，例如HPV 16、HPV 18、HPV 45、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV52、HPV 58、HPV 6和HPV 11，更优选HPV 16或HPV 18，或猕猴乳头瘤病毒，优选MfPV 3。

6.根据权利要求4或5所述的核酸，其中与野生型相比，在所编码的蛋白质中仅存在以下修饰：

(iii)在E6中：减少或消除由野生型E6中包含的PDZ结构域介导的相互作用的修饰；和

a.在HPV16 E6中：L117X₁；

b.在HPV18 E6中：L112X₁；

c.在MfPV3 E6中：L110X₁；

和

(iv)在E7中：

a.在HPV16 E7中：C24X₂,L67X₃,和C91X₄；

b.在HPV18 E7中:C27X₂,L74X₃,和C98X₄；

c.在MfPV3 E7中:C24X₂,L71X₃,和C95X₄；

7.根据权利要求6所述的核酸，其中所述核酸还包含编码HPV 16 E7中的D21X₅和C58X₆、HPV 18 E7中的D24X₅和C65X₆以及MfPV 3 E7中的D21X₅和C62X₆的一个或两个突变，其中X₅和X₆独立地是与它们取代的相应氨基酸不同的蛋白原性氨基酸。

8.权利要求6或7的核酸，其中

(i)X1选自Q、Y和N，优选为Q；

(ii)X2选自G、A、V、L和I，优选为G；

(iii)X3选自R、K和H，优选为R；

(iv)X4选自A、G、V、L和I，并且优选为A；

(v)X5选自G、A、V、L和I，优选为G；

(vi)X6选自G、A、V、L和I，并且优选为G；和/或

(vii)所述减少或消除由PDZ结构域介导的相互作用的修饰是1至10个C末端氨基酸的缺失，优选从C末端开始计数，更优选HPV16 E6中的ΔETQL、HPV18 E6中ΔETQV和MfPV3 E6中ΔETEV；或者所述修饰是具有10个，优选四个C末端氨基酸的一个、两个、三个或四个点突变。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其中所述多聚蛋白中Cys残基的总数是偶数。

10.根据权利要求9所述的核酸，其中如果所述数目不是偶数，

(ii)序列编码

a.具有C300X₇突变的HPV16 E2；

b.具有C301 X₇突变的HPV 18 E2；或

c.具有C297X₇突变的MfPV3 E2

包含在所述核酸中作为编码E2的序列，其中X₇是除C以外的蛋白原氨基酸，优选选自A、S、G、M、T、Y、Q、N、V、L、I、F、W、H、K、R、Q、N和P，更优选A；

(iii)或者在所述核酸中插入编码Cys的密码子。

11.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含至少一个编码遗传佐剂、优选T细胞佐剂MHC-II相关不变链的核酸序列。

12.根据权利要求11的核酸，其中所述不变链

(i)存在一次并且在编码第一E蛋白的序列之前；或

(ii)存在两次，一个复制在编码第一E蛋白的序列之前，第二个复制在编码E6的序列之前，或者在存在的情况上，在编码E2的序列之前。

13.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸是

(i)DNA；

(ii)质粒；或

(iii)RNA，优选mRNA。

14.根据权利要求13(i)所述的核酸，其中所述核酸包含，包括Tet算子的未翻译的5’末端。

15.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含至少一种编码自切割肽的核酸序列，其中所述核酸序列编码自切割肽

(i)在至少一种编码遗传佐剂的核酸序列之前；或

(ii)位于编码乳头瘤病毒蛋白的两个核酸序列之间并与之相邻。

16.根据前述权利要求中任一项的核酸，其中相邻核酸序列在一个、多个或所有情况下通过编码长度为10个或更少氨基酸(如2、3、4或5个氨基酸)的柔性接头的序列连接，其中GS和GCS是优选的接头。

17.一种病毒载体，其包含前述权利要求中任一项所述的核酸。

18.根据权利要求17所述的病毒载体，其中所述载体是DNA病毒载体，优选

(i)腺病毒载体，优选在腺病毒E1和E3编码序列方面是缺陷的，所述载体更优选是Ad19a/64、Ad 5、具有纤维替代物的Ad 5，例如Ad 5F35、Ad 26、Chimp 63或chAdOx1；或

(ii)痘病毒载体，优选MVA、MVA-CR19、SCV、痘苗或鸡痘。

19.一种多聚蛋白，其由前述权利要求中任一项所述的核酸或载体或由其衍生的切割产物编码。

20.一种药物组合物，优选疫苗，其包含或由以下组成：

(i)根据权利要求1至16中任一项所述的核酸；

(ii)根据权利要求17或18的载体；

(iii)根据权利要求19的多聚蛋白或其切割产物；或

(iv)用(i)的核酸或(ii)的载体转导的细胞，其中优选所述细胞是离体或体外细胞和/或树突细胞或单核细胞。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述载体、所述核酸、所述多聚蛋白或所述细胞是唯一的药物活性剂。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含两种或多种药物活性剂，其中第二种药物活性剂选自

(i)根据权利要求1至16中任一项所述的第二核酸；

(ii)根据权利要求17或18所述的第二载体；

(iii)根据权利要求19所述的第二种多聚蛋白或切割产物；

(iv)根据权利要求20(iv)所述的第二细胞；

(v)基于蛋白质的疫苗，优选针对乳头状瘤病毒；和

(vi)化疗药物，优选顺铂。

23.根据权利要求22(ii)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含两种药学活性剂，所述两种药学活性剂是

(i)如权利要求18(i)所述的腺病毒载体；和

(ii)如权利要求18(ii)所定义的痘病毒载体，

其中所述两种药物活性剂优选地作为两种药物组合物被分配，其可以以任何顺序或同时施用，优选地在包含所述腺病毒载体的所述药物组合物之后，优选地在经过至少4周之后施用包含所述痘病毒载体的药物组合物。

24.根据前述权利要求中任一项所述的核酸、载体、多聚蛋白或细胞，其用于医学。

25.根据权利要求20所述的疫苗，其中所述疫苗是治疗性疫苗。

26.根据前述权利要求中任一项的核酸、载体、多聚蛋白、细胞或疫苗，其用于治疗或预防乳头状瘤病毒感染、低级鳞状上皮内病变(LSIL)、高级鳞状上皮内损伤(HSIL)、鼻息肉病或乳头状瘤毒体相关的恶性病症如宫颈癌症，头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和口咽鳞状细胞瘤(OPSCC)。

27.一种刺激和/或扩增T细胞的体外或离体方法，所述方法包括使T细胞与前述权利要求中任一项所述的核酸、载体或多聚蛋白体外或离体接触。