KR102379144B1 - SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단 정보의 제공방법 - Google Patents
SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단 정보의 제공방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102379144B1 KR102379144B1 KR1020200127304A KR20200127304A KR102379144B1 KR 102379144 B1 KR102379144 B1 KR 102379144B1 KR 1020200127304 A KR1020200127304 A KR 1020200127304A KR 20200127304 A KR20200127304 A KR 20200127304A KR 102379144 B1 KR102379144 B1 KR 102379144B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cov
- sars
- rna
- gene
- seq
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
- C12Q2535/101—Sanger sequencing method, i.e. oligonucleotide sequencing using primer elongation and dideoxynucleotides as chain terminators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/16—Assays for determining copy number or wherein the copy number is of special importance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
- C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 진단을 위한 표준물질, 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2) 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 디지털 PCR용 프라이머 및 프로브 세트와 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(RT-dPCR)을 이용한, 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2) 진단을 위한 표준물질 이의 제조방법 및 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질은 SARS-CoV-2의 S 유전자를 제외한 유전자 발현 부위(coding region)을 포함하며, 전체 약90% 이상 유전체를 포함하고 있다. 또한 k=95% 신뢰성의 병간 균질도가 확인되었고, 안정성 또한 확인되어, 코로나19 바이러스 진단 및 진단키트의 위양성(가짜양성) 판정을 줄이고 신뢰성을 높이는 장점이 있다.
Description
본 발명은 코로나19바이러스 (SARS-CoV-2) 진단을 위한 표준물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
2019년 12월에 중국 후베이성 우한시에서 바이러스 폐렴 양상의 원인미상 폐렴이 무리 지어 발생하기 시작하였다. 상기 폐렴의 원인이 신종 코로나바이러스(Severe aute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)로 밝혀졌고, 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 이를 코로나 19 바이러스(corona virus disease 2019, COVID-19)로 명명하였다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스로 지정된, 코로나19 바이러스, SARS-CoV-2는 외피 바이러스로, 30kb의 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 게놈으로, SARS-CoV-2는 함께 베타 코로나 바이러스 속에 속한다. SARS-CoV-2는 양성 single-stranded RNA, 4종류의 주요 구조 단백질(S-spike, E-envelope, M-membrane, N-nucleocapsid)와 16종류의 비구조 단백질 (NSP 1-16), 5 내지 8 종류의 보조 단백질로 구성되어 있다.
상기 SARS-CoV-2의 전파를 차단하려는 노력에도 불구하고 중국 전 지역으로 감염이 확산되었을 뿐만 아니라 태국, 일본, 한국, 싱가포르, 홍콩 등 주변 아시아국가로 퍼져 나갔다. 또한 중국과 경제적 교류가 많은 이탈리아를 통해 유럽으로, 다시 전세계로 급격히 전파되었다. 우한에서 발생한 원인미상 폐렴의 원인이 새로운 코로나바이러스로 확인된 후 채 3개월이 되기도 전인 3월 11일에 약 114개국으로 감염이 확산되었으며 4,000명 이상이 사망하였다. 이와 같이 코로나19 바이러스가 확산됨에 따라, 코로나19 바이러스 대한 고속 진단은 전염원, 제어 전염병 발생 상황 전파를 차단하는 중요한 수단이고, 상기 코로나19 코로나 바이러스 진단 조사의 정확성 요구는 더 높아지고 있다.
하지만 현재 사용되는 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2) 진단 검사는 진단시약의 "프라이머" 물질이 코로나19 바이러스의 특이 DNA에 결합, 이를 증폭시키는 핵산증폭검사 또는 실시간 유전자 증폭검사(RT-PCR) 방식인데 진단키트마다 기준값이 달라 양성 판정이 다르게 나오는 문제가 있다. 그러므로 코로나19 바이러스의 정확하고 정량적인 분석을 위해서는 무엇보다 분석에 사용하는 표준물질, 기준값, 정량분석 방법이 중요하다.
“표준물질(reference material, RM)”이란 측정기기의 교정, 측정방법의 평가, 물질 참값의 부여에 있어 널리 사용되는 물질로서, 하나 이상의 명시된 특성에 관하여 충분히 균질하고 안정된 물질과 표준물질(Standard material) 및 검증된 표준원액을 포함하는 것을 의미한다. 특히 표준물질은 분석 측정의 정확성과 정밀도를 유지하기 위해 반드시 필요할 뿐만 아니라 특히 기기를 검증하고 보정할 때 부정확한 결과를 방지하는데 중요하다.
상기와 같이, 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2) 진단 또는 검출하는 방법에는 증폭시키는 핵산증폭검사 또는 실시간 유전자 증폭검사(RT-PCR) 방식이 사용되고 있다. 하지만 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2)를 검출하고 정량하는데 필수적인 표준물질이 거의 실용화되지 못하고 있어, 상기 표준물질 개발이 시급하다. 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2)의 양성대조군 등이 현재 시판되고 있는 검출 키트에 포함되어 있지만, 대부분 SARS-CoV-2의 10% 이내의 유전자 특정부위가 플라스미드로 제시되는 것 일뿐, 실제 시료에서 검출되는 SARS-CoV-2와 동일한 크기를 가지고, SARS-CoV-2의 RNA유전자 또는 유전체를 90% 이상 포함하며, 실제 시료와 유사한 조건을 가지는 표준물질은 현재까지 알려진 바가 없다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 SARS-CoV2의 민감도와 정확성을 높이기 위하여, 디지털 PCR(dPCR)용 프라이머와 프로브 세트, 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Digital PCR. RT-dPCR)을 이용하여, 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) RNA 표준물질 및 이의 제조방법을 발명하였다. 또한 이를 이용하여, 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단을 위한 정확하고 신뢰성 있는 정보의 제공방법을 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 여부 진단을 위한 안정성 및 균질성이 우수한 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 이용한 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 목적은 본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 이용한 특정 유전자 정량을 이용한 핵산 증폭 검사(Nucleic acid amplification test)에 대한 정보를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 코로나19 바이러스 SARS-CoV-2의 동등 서열을 지닌 RNA의 존재 유무를 판별: 병원체, 돌연변이 RNA 관련 시험 및 진단을 위한 정보를 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위해서 본 발명은
SARS-CoV-2의 RNA시료를 역전사하여 cDNA를 제조한 다음, 상기 cDNA를 이용하여 PCR을 수행하여, 주형 DNA를 준비하는 단계;
Sanger sequencing 또는 NGS 염기서열 분석방법으로 상기 주형 DNA 서열을 확인하는 단계;
상기 서열이 확인된 주형 DNA를 RNA 중합효소와 T7 프로모터를 사용하여, 시험관내 전사(In vitro) 방법으로 RNA(In vitro transcription RNA, IVT RNA)를 제조 및 정제 하는 단계;
표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA와 상기 IVT RNA를 혼합하여 RNA 혼합물을 제조 하는 단계;및
상기 RNA 혼합물의 특정 유전자를 정량 하여 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질를 제조하는 단계;
를 포함하는 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 특정 유전자의 정량은, 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(RT-dPCR)로 수행하는 것이며, 상기 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응은,
수십만개의 작은 미세액적으로 PCR 반응 용액을 분활구획하고, 상기 RNA 혼합물을 cDNA 역전사하는 단계;
상기 역전사된 cDNA를 주형으로 디지털 PCR용 프라이머와 프로브 세트 존재 하에, 중합효소 연쇄반응(PCR)시켜, 상기 cDNA가 증폭하여, 상기 RNA 혼합물에 포함된 유전자를 가진 cDNA가 존재하는 구획이 형광을 나타내는 단계;및
상기 구획별로 형광값을 디지털로 나눠 읽어, 상기 RNA 혼합물질에 포함된 특정 유전자 RNA 복제 개수를 계산하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 특정 유전자의 정량은 상기 특정 유전자에 대한 복제 개수 농도(Copy number concentration)로 정량되며, 상기 농도는 하기 식 1에 의해 도출되는 것이다.
[식 1]
상기 식 1에서,
C는 PCR 반응 에서 복제개수 농도(1μL 당 복제개수) Npositive: 양성 구획 복제 개수, Ntotal:전제 반응 구획 복제 개수 Vp: nL 당 구획 량, D: 부피(용량)로 준비된 PCR 혼합 측정 용액으로부터의 희석 배수
본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 특정 유전자는 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6, NSP7, NSP8, NSP9. NSP10, NSP11, NSP12(RdRP), NSP13, NSP14, NSP15, NSP16, ORF3a, E, M, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, N 및 ORF10 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상이다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 프라이머와 프로브 세트는
1) 서열번호 1(정방향)과 서열번호 2(역방향)의 프라이머; 및 서열번호 3의 프로브 세트; 및
2) 서열번호 4(정방향)와 서열번호 5(역방향)의 프라이머; 및 서열번호 6의 프로브 세트;를 포함한다.
상기 1)의 프라이머와 프로브 세트 및 상기 2)의 프라이머와 프로브는 세트는 각각 NSP3 유전자 일부 또는 전체 부위와 NSP6 내지 NSP11 유전자 일부 또는 전체 부위를 측정하며, 상기 NSP6 내지 NSP11 유전자 부위는 NSP6, NSP7, NSP8, NSP9, NSP10 및 NSP11 유전자가 연속적으로 연결된 서열의 유전자부위이다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질로 태그되며,
상기 5' 말단 형광 물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로 6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고,
상기 3' 말단 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ1 (black hole quencher 1) 및 BHQ3 (black hole quencher 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이다.
본 발명은 상기 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조 방법으로 제조된 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 제공한다.
본 발명은 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(RT-dPCR)으로 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 감염 여부 진단 제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른, SARS-CoV-2 감염 여부 진단 제공방법에 있어서, 상기 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질과
디지털 PCR용 프라이머 및 프로브 세트, dNTP, 역전사효소(Reverse transcriptase)를 포함하는 PCR 반응액으로부터 수십 만개 미세액적(droplet)을 생성하는 단계;
상기 생성된 미세액적에서 특정 유전자 서열 대해 역전사로 cDNA를 합성 한 후 증폭하는 단계; 및
상기 특정 유전자를 정량하는 단계;를
포함하는, SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 있어서, 상기 특정 유전자는 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6, NSP7, NSP8, NSP9. NSP10, NSP11, NSP12(RdRP), NSP13, NSP14, NSP15, NSP16, ORF3a, E, M, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, N 및 ORF10 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 있어, 상기 디지털 PCR용 프라이머 및 프로브 세트는
1) 서열번호 1(정방향)과 서열번호 2(역방향)의 프라이머; 및 서열번호 3의 프로브 세트; 및
2) 서열번호 4(정방향)와 서열번호 5(역방향)의 프라이머; 및 서열번호 6의 프로브 세트;를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 있어, 상기 1)의 프라이머 및 프로브 세트 및 상기 2)의 프라이머 및 프로브는 세트는 각각 NSP3 유전자 일부 또는 전체 부위와 NSP6 내지 NSP11 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량한다. 상기 NPS6 내지 NSP11 유전자 부위는 NSP6, NSP7, NSP8, NSP9, NSP10 및 NSP11 유전자가 연속적으로 연결된 서열의 유전자부위이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 있어, 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질로 태그되며,
상기 5' 말단 형광 물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로 6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고,
상기 3' 말단 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ1 (black hole quencher 1) 및 BHQ3 (black hole quencher 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법에 있어, 상기 특정 유전자의 정량은, 상기 특정 유전자에 대한 복제 개수 농도(Copy number concentration)로 정량되며, 상기 농도는 하기 식 1에 의해 도출된다.
[식 1]
상기 식 1에서,
C는 PCR 반응 에서 복제개수 농도(1μL 당 복제개수) Npositive: 양성 구획 복제 개수, Ntotal: 전제 반응 구획 복제 개수 Vp: nL 당 구획 량, D: 부피(용량)로 준비된 PCR 혼합 측정 용액으로부터의 희석 배수
또한 본 발명은
1) 서열번호 1(정방향)과 서열번호 2(역방향)의 프라이머 세트; 및
2) 서열번호 4(정방향)와 서열번호 5(역방향)의 프라이머 세트;를 포함하는, SARS-CoV-2 표준물질 합성용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 SARS-CoV-2 표준물질 합성용 조성물에 있어, 상기 1)의 프라이머 세트 및 상기 2)의 프라이머 세트는 각각 NSP3 유전자 부위와 NSP6 내지 NSP11 유전자 부위를 증폭하며, 상기 NPS6 내지 NSP11 유전자 부위는 NSP6, NSP7, NSP8, NSP9, NSP10 및 NSP11 유전자가 연속적으로 연결된 서열의 유전자부위이다.
본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조 방법은 다양한 실험조건 또는 진단키트에서 본 발명의 코로나19바이러스 (SARS-CoV-2)감염여부 진단 하기 위한, 코로나19바이러스(SARS-CoV-2)의 표준화된 정량값을 제공 할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조 방법은 SARS-CoV-2의 진단키트에서 정확성을 유지하고 부정확한 결과를 방지하는데 활용될 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질은 코로나 19 바이러스 불확실성을 최소화하고, 진단 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질은 안정성 및 균질성이 우수하여 당분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공하는 방법은 높은 정확도와 신뢰성을 가지고 있어, 상기 코로나19바이러스 관리 및 진단에 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공하는 방법은 유전자의 절대 정량이 가능하여, 코로나 19 바이러스 존재 유무뿐만 아니라, 개수까지 정확하게 추산하여, 진단키트에 있어, 위양성이나, 위음성 등의 판정 불확실성을 최소화 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응 (RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 N 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 안정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응 (RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 RdRP 부위와 유전자 NSP3 부위에 대한 안정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 NSP6-11 부위에 대한 안정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 RdRP 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 N 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 NSP6-11부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 NSP3 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 E 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응 (RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 RdRP 부위와 유전자 NSP3 부위에 대한 안정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 NSP6-11 부위에 대한 안정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 RdRP 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 N 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 NSP6-11부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 NSP3 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 반응(RT-dPCR)을 사용하여, 유전자 E 부위를 복제 개수 농도(copy number concentration)로 정량하여, 병간 균질도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
코로나19바이러스(SARS-CoV-2)는 약 30kb 길이의 단일 가닥 RNA를 가지는, RNA를 유전체를 이용하는 RNA 바이러스이다. 즉, SARS-CoV-2는 DNA가 아닌 RNA 유전자를 지니는 바이러스로, 상기 바이러스를 더 정확하고 재현성 있게 검출하기 위해서는, 기준으로 삼을 수 있고, 실제 시료와 유사한 RNA 표준물질이 필요하다. 표준물질은 실험 결과의 확실성을 위해, 실험 결과에 항상 활성을 가지는 양성대조물질이기도 하다. 상기 표준물질 또는 양성대조물질은 상기 코로나19 바이러스(SARS-CoV-2)와 같은 병원체 검사의 정밀성, 정확성 및 재현성 보장에 있어 반드시 필요하다. 하지만 현재 SARS-CoV-2와 동일한 크기를 가지고, SARS-CoV-2의 RNA유전자 또는 유전체를 90% 이상 포함하고, 실제 시료와 유사한 조건을 가지는 표준물질은 현재까지 알려진 바가 없다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은
SARS-CoV-2의 RNA시료를 역전사하여 cDNA를 제조한 다음, 상기 cDNA를 이용하여 PCR을 수행하여, 주형 DNA를 준비하는 단계;
Sanger sequencing 또는 NGS 염기서열 분석방법으로 상기 주형 DNA 서열을 확인하는 단계;
상기 서열이 확인된 주형 DNA를 RNA 중합효소와 T7 프로모터를 사용하여, 시험관내 전사(In vitro) 방법으로 RNA(In vitro transcription RNA, IVT RNA)를 제조 및 정제 하는 단계;
표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA와 상기 IVT RNA를 혼합하여 RNA 혼합물을 제조 하는 단계;및
상기 RNA 혼합물의 특정 유전자를 정량 하여 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질를 제조하는 단계;
를 포함하는 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(RT-dPCR)으로 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
상기 SARS-CoV-2 감염 여부 진단 제공방법은,
SARS-CoV-2의 RNA 표준물질과
디지털 PCR용 프라이머 및 프로브 세트, dNTP, 역전사효소(Reverse transcriptase)를 포함하는 PCR 반응액으로부터 수십 만개 미세액적(droplet)을 생성하는 단계;
상기 생성된 미세액적에서 특정 유전자 서열을 역전사하여 cDNA를 합성 한 후 증폭하는 단계; 및
상기 특정 유전자를 정량하는 단계;를 포함한다.
상기 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조 방법과 SARS-CoV-2 감염 여부 진단 정보 제공 방법에 있어, 특정 유전자 정량은, 디지털 PCR용 프라이머와 프로브 세트를 이용한, 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응에 의해 수행된다.
본 발명 및 명세서에 있어서, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 즉, 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및DNA, DNA 폴리머라제 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성을 개시할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말하는 것이다.
본 발명 및 명세서에 있어서, "프로브(probe)"란 DNA또는 RNA의 특정 염기 서열에 상보적인 절편 또는 단편으로, 방사선 원소 또는 형광으로 표지된 말단 염기를 지니는 DNA 또는 RNA 절편을 의미한다. 대개 100-1000 bp 정도 길이로 다양하며 분자생물학 영역에서 DNA 혹은 RNA 샘플 내의 특정 뉴클레오티드 서열을 찾기 위한 상보적인 서열을 갖는다. Probe는 타겟 유전자와의 상보적인 결합을 통해 단일 가닥의 DNA 혹은 RNA 속에서 찾고자 하는 유전자 서열을 확인하는 데 이용된다.
본 발명 및 명세서에 있어서, "디지털 PCR(Digital polymerase chain reaction, Digital PCR)" 이란, 핵산을 탐지하고 정량하는 새로운 접근법으로서 기존 qPCR에 비해 정확한 정량 분석과 표적 핵산 분자의 고감도 탐지가 가능하다. 기존의 qPCR의결과 분석 방식이 아날로그 방식인 점에 반해, 결과 형광 신호가 "0" 또는 "1"의 값을 가져 분석 방식이 디지털 방식인 디지털 PCR 방법은 대용량 시료의 분석, 한번에 다양한 시료의 검사 그리고 다양한 검사 항목을 한 번에 수행할 수 있는 장점이 있다. 디지털 PCR 기술은 DNA 시료를 표준 곡선이 필요 없는 단일 분자 계수법을 적용하여 절대정량이 가능한 기술로서, 하나의 웰 당 하나의 미세액적(droplet)에 대한 PCR 반응으로 보다 정확한 절대 정량을 수행할 수 있는 장점이 있다.
더욱 구체적으로는 상기 디지털 PCR은 주형 DNA, 프라이머와 프로브(primer-probe), Taq polymerase, dNTP, 버퍼 등을 넣어 만든 PCR 반응혼합액과 droplet generator oil (미세액적 생성 오일)이 cartridge (카트리지) 안에서 만나 PCR 반응혼합액이 약 0.8 nL의 작은 방울인 수십만 개의 미세액적(droplet)으로 나누어진다. PCR은 각 미세액적 안에서 수행되며, 주형 내 특정 유전자 염기서열과 프라이머가 결합하면서 증폭된다. 증폭되는 과정에서 형광물질이 달린 프로브가 끼어 들어가 미세액적이 형광을 배출하면 1로 읽고 형광이 나오지 않으면 0으로 읽는다. 상기 디지털 PCR를 이용한 DNA의 복제 개수 농도 값의 정확도는 유세포분석기와 동위원소 질량분석법과의 비교에서도 증명되었다.
상기 디지털 PCR은 QX200(BioRad사, 미국)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명 및 명세서에 있어서, "역전사 디지털 중합효소연쇄반응(reverse transcription (RT) digital PCR, RT-dPCR"은 RNA와 특정 유전자의 염기서열에 대한 primer-probe(프라이머-프로브), dNTP, reverse transcriptase 등을 넣고 partitioning (미세액적, dpoplet으로 분할 구획) 후, reverse transcription(역전사)을 통해 cDNA 합성하여 상기 디지털 PCR(digital PCR)을 수행하는 방법으로 특정 염기서열 또는 특정 유전자의 염기서열에 대한 cDNA를 합성하여 증폭하는 것이다. 미세액적(droplet)을 만들 때 RNA가 들어가게 되고 오일 미세액적 안에서 합성된 cDNA가 증폭되어 형광 신호가 나타난다. 상기의 분활 구획은 민감한 측정을 가능하게 한다. 또한 상기 분활 구획에서 모든 핵산의 증폭과 분석을 수행할 수 있어, 표적 물질의 오염과 증폭 생산물의 오염에 대한 위양성 방지가 가능하며, 안정적인 결과를 낼 수 있다.
상기 역전사 디지털 중합효소연쇄반응은 cDNA 합성과 PCR 반응을 한번에 수행할 수 있는 단단계 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(One step reverse transcription digital PCR)으로 수행되었다. 본 발명에서는 상기 특정 유전자 정량을 상기 단단계 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(One step reverse transcription digital PCR, one step RT-dPCR)으로 PCR plate 당 3회 반복하는 방법과 상기 one step RT-dPCR을 수행 후 다시 정량 PCR(Quantiative Reverse transcription, one step RT-qPCR, 단단계 역전사 실시간 정량 중합효소연쇄반응)으로 PCR plate 당 3회 반복 방법으로 측정하였다. 즉, 상기 one step RT-dPCR(단단계 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응)을 측정하여 기준값으로 하고, 상기, one step RT-qPCR을 측정하여 정보값으로 하였다. 상기 기준값은 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질에 포함되어 있는, 특정 유전자 염기서열의 복제 개수 농도 또는 특정 유전자에 대한 복제개수농도이며, 상기 정보값은 단기 RT-qPCR(단단계 역전사 실시간 정량 중합효소 연쇄반응)방법으로 측정하였을 때 나온 Threshold cycle 값이며, 대략 24 내지 30(cycle)이다. 이와 같이 본 발명은 기준값과 정보값을 제공하여, SARS-CoV-2의 진단의 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법으로 유용하다. 또한 상기 특정 유전자 정량은 상기 특정 유전자의 일부 또는 전체 부위 정량이 포함된다. 또한 본 발명 및 명세서에 기준값인, 특정 유전자 염기서열의 복제 개수 농도와 특정 유전자에 대한 복제개수농도는 동일한 의미로, 특정 유전자 절대 정량이 본 발명의 기준값이다.
본 발명과 명세서에 있어, "특정 유전자"는 코로나19 바이러스주인, Wuhan-Hu-1 바이러스주의 공개된 유전자 염기서열(Genbank: MN908947)을 참조서열로 하였고, 상기 참조염기서열의 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6, NSP7, NSP8, NSP9. NSP10, NSP11, NSP12(RdRP), NSP13, NSP14, NSP15, NSP16, ORF3a, E, M, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8 N 및 ORF10 유전자로 이루어진 군의 하나 또는 둘 이상의 유전자를 의미한다. 상기 특정 유전자는 발현에 관여하지 않는 S 유전자를 제외한 SARS-CoV-2의 90% 이상의 유전자를 포함한다. 상기 특정 유전자는 하기 표 2의 염기서열을 갖는다. 본 발명과 참조서열은 NSP3의 유전자의 염기서열에서 5062번 서열 G가 T, NSP4의 유전자의 염기서열에서 8792번 서열 C가 T, E 내지 ORF10 유전자 염기서열에서 28144번 서열 T가 C 인 점에서 상이하다.
본 발명의 특정 유전자 정량은, 상기 특정 유전자에 대한 복제 개수 농도로 정량되며, 상기 농도는 하기 식 1에 의해 도출된다.
[식 1]
상기 식 1에서,
C는 PCR 반응에서 복제개수 농도(1μL 당 복제개수) Npositive: 양성 구획 복제 개수, Ntotal: 전제 반응 구획 복제 개수 Vp: nL 당 구획 량, D: 부피(용량)로 준비된 PCR 혼합 측정 용액으로부터의 희석 배수
상기 식은 Vp 값의 불확도를 반영하여 기준 값인 복제 개수 농도를 제시한다. 또한 어떠한 경우에라도 상기 C 값이 ~1.6인 경우에 불확도가 가장 낮다. 본 발명은 상기 식을 통해 도출된 특정 유전자 절대 정량이 본 발명의 기준값이다. 상기 특정 유전자 절대 정량은 검체 안의 코로나19바이러스 존재 유무뿐 만 아니라, 개수까지 정확하게 추산할 수 있어, 상기 코로나19바이러스 진단에 있어, 위양성이나 위음성 등 판정 불확실성을 최소화할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조 방법에 있어, 상기 Sanger sequencing 또는 NGS 염기서열 분석 방법은 Sequel, MinION, MiSeq, GS FLX, SOLiD, Ion Torrent, HiSeq, BGISEQ sequencing system, GeneReader NGS System, solid-state nanopore-based DNA sequencing, GenoCare Sequencer, GENIUS, Hyb & Seq sequencing 및 iSeq 100으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법이며, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 Sequel(Pacbio사, Pacbio RSII), MINion (Oxford Nanopore Technology사), Miseq (Illumina사) 방법에서 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있다.
상기 NGS 염기서열 분석 방법은 수백 개 이상의 유전자를 정확하게 검사 할 수 있는 장점이 있다. 또한 30kb 이상의 코로나 바이러스와 같은, long fragment target 등의 염기서열 분석이 빠르게 분석이 가능하다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 제공한다.
본 발명에서 용어 "표준물질(Reference Material, RM)"은 측정이나 명목 특성의 시험 · 검사에 사용할 목적으로 하나 이상의 명시된 특성에 관하여 충분히 균질하고 안정된 물질을 말하며, 검증된 표준원액을 포함하는 것으로, 상기 표준물질은 장기간 보존 가능성과 그 자체의 안정성 (stability) 및 균질성(Homogeneity)이 보장되어야 한다. 본 발명에서는 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 제조하는 방법의 단계에서, 시험관내 전사(In vitro) 방법으로 제조된 RNA(In vitro transcription RNA, IVT RNA), 상기 IVT RNA와 표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA 혼합하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준 물질은 상기와 같이, 상기 IVT RNA와 표준물질 매트릭스(matrix)인, 인간 혈액세포주 유래 RNA 로 구성된다. 상기 구성일 경우 타겟 또는 특정 유전자의 RNA 분해를 막아, 안정성을 유지 시킬 수 있으며, 실제 진단 시 사용되는 시료의 형태와 유사한 조건이 된다.
상기 시험관내 전사는 주형 DNA와 RNA 중합효소, dNTP를 넣어주면 주형 DNA 서열과 상보적인 RNA를 세포 밖인 시험관 내에서 합성한다. RNA 중합효소는 T7, T3 또는 SP6 RNA 중합효소를 사용할 수 있다. 본 발명의 시험관내 전사(In vitro) 방법으로 제조된 RNA는 상기 특정 유전자 또는 RNA 혼합물에 포함된 유전자 앞에 T7 프로모터 염기서열 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')이 포함되어 있다. 상기 T7 프로모터는 전사의 활성이 높고, 원하는 유전자를 선택적으로 발현할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 표준물질 제조방법에서, 또한 상기 RNA 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수도 있으나 제한되지 않는다.
본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질은 코로나 19 바이러스, SARS-CoV-2에서 발현에 관여하지 않는 S 유전자를 제외한 SARS-CoV-2의 90% 이상의 유전자를 포함한다. 현재까지 개발된 SARS-CoV-2의 표준물질은 E, N 유전자 등 SARS-CoV-2의 10% 유전자만 포함되어 있으나, 본 발명은 90% 이상의 발현과 관계된 유전자를 포함하고 있어, SARS-CoV-2의 진단 키트에서 위양성을 줄이고, 정확성을 높일 수 있다.
본 발명의 디지털 PCR과, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응은 디지털 PCR용 프라이머 및 프로브 세트 존재하에 수행되며, 상기 디지털 PCR용 프라이머 및 프로브 세트는
1) 서열번호 1(정방향)과 서열번호 2(역방향)의 프라이머; 및 서열번호 3의 프로브 세트; 및
2) 서열번호 4(정방향)와 서열번호 5(역방향)의 프라이머; 및 서열번호 6의 프로브 세트;를 포함한다.
상기 1)의 프라이머 및 프로브 세트 및 상기 2)의 프라이머 및 프로브는 세트는 각각 NSP3 유전자 일부 또는 전체 부위와 NSP6 내지 NSP11 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량한다. 상기 NSP(Non-structural protein, 비구조 단백질)유전자는 SARS-CoV-2에서 전사와 복제의 중요한 요소로, 면역체계회피기전에 관여하는 것으로 알려졌다. SARS-CoV-2, 코로나 19 바이러스의 복제 및 전사는 Replication /transcription complex(RTC, 복제/ 전사 복합체)에서 이루어지는데, 상기 NSP 유전자를 주성분으로 하고, 상기 NSP3가 상기 RTC, 복제/전사 복합체에 포함된다. 또한 상기 NSP3 유전자는 바이러스 활성에 중요한 유전자이다.
상기 NSP 6 내지 NSP11 유전자 부위는 SARS-CoV-2, 코로나 19 바이러스의 복제와 독성에 관여하며, 상기 유전자 부위에서 돌연변이 존재가 있는 것으로 알려졌다. 그러므로 상기 부위는 SARS-CoV-2의 돌연변이와 관련하여 주요 유전자부위로 진단에서 있어 중요한 유전자 부위이다. 또한 상기 NSP 6 내지 NSP11 유전자 부위는 바이러스 발현 및 SARS-CoV-2의 병원성과 관련한 유전자 부위로 알려졌다.
이와 같이, 상기 NSP3 유전자 일부 또는 전체 부위와 NSP6 내지 NSP11 유전자 일부 또는 전체 부위는 바이러스 증식 과정, 발현 및 돌연변이 등과 관련하여 주요한 유전자 부위이다. 종래의 SARS-CoV-2의 표준물질 및 상기 표준물질의 정량방법은 SARS-CoV-2의 유전자 중 E, N, 의 유전자를 주요 유전자로 포함하고, 정량 하였지만, 상기 NSP 유전자 부위는 SARS-CoV-2의 전체 유전자 중 60 % 이상을 차지하고 상기와 같이 바이러스 증식, 돌연변이 발현 등에 관계된 유전자 부위여서, 상기 유전자 정량은 SARS-CoV-2의 감염 여부 진단에 있어, 위양성 결과를 줄일 수 있고, 민감성을 향상 시킬 수 있다.
또한 본 발명은
1) 서열번호 1(정방향)과 서열번호 2(역방향)의 프라이머 세트; 및
2) 서열번호 4(정방향)와 서열번호 5(역방향)의 프라이머 세트;를 포함하는, SARS-CoV-2 표준물질 합성용 조성물을 제공한다.
1)의 프라이머 세트 및 상기 2)의 프라이머 세트는 각각 NSP3 유전자 부위와 NSP6 내지 NSP11 유전자 부위를 증폭하며, 상기 NPS6 내지 NSP11 유전자 부위는 NSP6, NSP7, NSP8, NSP9, NSP10 및 NSP11 유전자가 연속적으로 연결된 서열의 유전자부위를 의미한다. 상기 유전자부위는 SARS-CoV-2의 복제, 전사, 바이러스 활성에 관여하는 부위이자, SARS-CoV-2의 전체 유전자 중 60 % 이상을 차지하는 유전자 부위로, 상기 프라이머 세트를 포함하여 SARS-CoV-2의 90% 이상의 유전자를 합성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: DNA 주형의 준비
SARS-CoV-2 바이러스의 시료의, RNA로부터 QIAmp viral RNA minikit (Qiagen)를 사용하여, RNA를 추출한 다음, Random hexamer와 Superscrip III First-Strand Synthesis SuperMix(Cat No. 18080400)를 이용하여 Reverse Transcript 반응을 수행하였다. 1μl RNA (conc. 50 ng/ul), 0.5ul random hexamer (5＇ -NNNNNN-3 ＇50ng/ul), 1μl 10mM dNTP mix, 최종 볼륨이 8μl가 되도록 DEPC water를 0.2μl PCR tube에 넣고 가볍게 혼합하였고, 65℃에서 5분간 incubation 한 후 ice에서 최소 1분 이상 식히고 가볍게 centrifugation한 후, 얼음에 tube를 꽂고 10μl 2X first-strand reaction mix, 2μl Superscript III enzyme mix를 넣은 후 가볍게 혼합하였다. Thermal cycler를 이용하여 25℃에서 10분간 incubation 한 후 50℃에서 70분 역전사를 진행한 뒤, 85℃에서 5분간 두어 효소의 불활성화를 진행하였다. 1μl RNase H를 첨가한 후 37℃에서 20분간 incubation하였고, RT 반응을 최적화하기 위하여 다양한 RNA template(50ng, 1ug), random hexamer(1ul, 0.5ul, 0.1ul) 및 RT reaction time(50, 70, 90min) 조건에서 최적화하였다. 그 다음, 50 ℃ < Tm < 60 ℃인 하기 표 1의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 세트를 사용하여, PCR을 수행하여 DNA 주형을 준비하였다.
| 유전자 | 이름 | 염기서열(5‘-> 3’) |
| N | N1-F (정방향) 프라이머, 서열번호 7 | GACCCCAAAATCAGCGAAAT |
| N1-R (역방향) 프라이머, 서열번호 8 | TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG | |
| N1-P 프로브, 서열번호 9 | ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC | |
| N2-F (정방향) 프라이머, 서열번호 10 | TTACAAACATTGGCCGCAAA | |
| N2-R (역방향) 프라이머, 서열번호 11 | GCGCGACATTCCGAAGAA | |
| N2-P 프로브, 서열번호 12 | ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG | |
| E | E1-F (정방향) 프라이머, 서열번호 13 | ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT |
| E1-R (역방향) 프라이머, 서열번호 14 | TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG | |
| E1-P 프로브, 서열번호 15 | ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC | |
| RdRp | RdRp-F(정방향) 프라이머, 서열번호 16 | GGTAACTGGTATGATTTCG |
| RdRp-R (역방향) 프라이머, 서열번호 17 | CTGGTCAAGGTTAATATAGG | |
| RdRp-P 프로브, 서열번호 18 | TCATACAAACCACGCCAGG | |
| NSP3 | NSP3-F (정방향) 프라이머, 서열번호 1 | TGCAACTGCAGAAGCTGAAC |
| NSP3-R (역방향) 프라이머, 서열번호 2 | GCCGAGCTGCTGAAATAAAA | |
| NSP3-P 프로브, 서열번호 3 | ATGTACTGAAGTCAGAGGACGCG | |
| NSP9 | NSP9-F (정방향) 프라이머,서열번호 4 | ACTGCTTGCACTGATGACAA |
| NSP9-R (역방향) 프라이머, 서열번호 5 | GCCCATTTCAAATCCTGTAA | |
| NSP9-P 프로브, 서열번호 6 | CACAACAAAGGGAGGTAGGTTTG |
실시예 2: 주형 DNA의 정량 및 염기서열 확인
주형 DNA는 형광광도계(Fluorometer, 예를들어 Quantus) 또는 분광 광도계(Spectrophotometer, 예를 들어 Nanodrop)로 정량하였다. 주형 DNA의 염기서열은 Sanger sequencing 및 NGS 염기서열 분석방법을 의뢰하여 확인하였다. NGS 염기서열 분석 방법으로는 Sequel(Pacbio사, Pacbio RSII), MINion (Oxford Nanopore Technology사), Miseq (Illumina사) 방법을 사용하여 분석하였다. 분석한 결과, 하기 표 2의 유전자 서열을 모두 확인하였다. 즉, 발현에 관여하지 않는 S(surface glycoprotein) 유전자를 제외한 SARS-CoV-2의 90% 이상의 유전자 서열을 모두 확인하였다.
| 유전자 기호 | 단백질 | 시작 | 끝 |
| NSP1 | leader protein | 266 | 2719 |
| NSP2 | nsp2 | ||
| NSP3 | PLpro | 2720 | 8554 |
| NSP4 | nsp4 | 8555 | 10972 |
| NSP5 | 3CLpro | ||
| NSP6 | nsp6 | 10973 | 13480 |
| NSP7 | nsp7 | ||
| NSP8 | nsp8 | ||
| NSP9 | nsp9 | ||
| NSP10 | nsp10 | ||
| NSP11 | nsp12 | ||
| NSP12(RdRp) | RdRp | 13442 | 16237 |
| NSP13 | Helicase | 16238 | 18040 |
| NSP14 | 3'-to-5' exonuclease | 18041 | 19620 |
| NSP15 | endoRNase | 19621 | 20658 |
| NSP16 | 2'-O-ribose methyltransferase | 20659 | 21552 |
| ORF3a | ORF3a protein | 25393 | 26220 |
| E | envelope protein | 26125 | 29560 |
| M | membrane glycoprotein | ||
| ORF6 | ORF6 protein | ||
| ORF7a | ORF7a protein | ||
| ORF7b | ORF7b protein | ||
| ORF8 | ORF8 protein | ||
| N | nucleocapsid phosphoprotein | ||
| ORF10 | ORF10 protein |
실시예 3: 주형 DNA를 이용한 시험관내 전사(In vitro transcription RNA, IVT) RNA 합성
주형 DNA 1 μg을 IVT 키트 시약과 섞은 후 37 ℃ 온도에서 2 시간 반응시켜, IVT RNA를 합성하였다. 상기 IVT 키트 시약는 DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, RNA 중합효소(T7, T3, 또는 SP6), rNTPs(ATP, CTP, GTP, UTP), T7 reaction components 및 Enzyme MIX 등이 포함된다.
실시예 4: Total RNA 정량 및 사이즈 확인 및 정제
전사반응을 모두 마친 RNA는 적절히 희석하여 RNA 측정용 Bioanalyzer를 이용하여 크기와 농도를 확인하였다.
상기 Bioanalyzer에서 나온 RNA 산물의 농도를 확인하고 주형 DNA와 같은 크기의 RNA인지 확인 한 다음, 상기 IVT 반응에 사용하였던 시약, 주형 DNA 및 효소를 제거함으로써, RNA 정제를 진행하였다. 상기 정제된 RNA에 RNA storage solution (RNA 보관 용액)을 넣고 측정에 사용하고 나머지는 -70 ℃에 보관하였다.
실시예 5: 표준물질 matrix 준비
표준물질 Matrix로, RNA의 분해를 막고, 실제 진단시 사용되는 시료의 형태와 유사한 조건이 되도록 첨가할 human RNA를 제조하였다. 인간 혈액 세포주인 Jurkat 세포를 배양하고 계수하여 세포를 준비한 다음, RNA분리 키트(RNeasy Mini Kit)를 이용하여 설명서에 나온 절차로 인간 혈액 세포주 RNA를 분리 및 정제하였다.
실시예 6: 분주
상기 실시예3에서 제조된 IVT RNA를 인간 혈액 세포주 RNA를 넣은 RNA 보관 용액에 희석하고 충분히 vortexer(교반기)를 이용하여 잘 섞은 후 4 ℃에서 충분히 회전(rotating) 하여 균질화하여, 분주하였다.
실시예 7: 측정 및 분석
RNA 표준물질을 희석하여 하여 2kb 기준 정도의 RNA를 준비하였다. 상기 RNA 표준물질을 순차적으로 희석한 다음, RT dPCR(역전사 디지털 중합효소연쇄반응) 수행하였다. 그 다음 PCR 혼합물을 제조하였다. 그 다음 Supermix, Revese transcriptase, DTT primer, probem, RNA, 및 Nuclease-free DW 를 포함하는 PCR 혼합물을 제조하 였다. 상기 PCR 혼합물에 포함된 디지털용 PCR 프라이머와 프로브 세트 정보는 상기 표 1과 같다.
RNA 시료와 시약을 섞은 반응 혼합물이 만들어 지면 vortexer (교반기)를 이용해 잘 섞어주고, 원심분리기로 혼합물을 가라앉힌 후, 실온(25℃)에서 DG8 cartridge holder에 DG8 droplet generator cartridge (오일, 미세액적 생성 카트리지)를 넣고 고정하였다. 반응 혼합물 20μL와 Droplet generation oil for probe(프로브용 미세액적) 70μL를 DG8 droplet generator cartridge(오일, 미세액적 생성 카트리지)에 순서대로 분주하였다. 미세액적 생성을 위해 QX200 droplet generator에 옮겨 약 2분간 초록색 불빛이 켜질 때까지 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 후, 만들어진 샘플을 96-well PCR plate에 옮긴다. Foil sealer(밀봉용 호일)로 PCR plate를 덮고, plate sealer(플레이트 밀봉기)를 이용해 180 ℃에서 plate를 sealing(밀봉)한 후 ABI thermo cycler에 넣고 PCR을, Reverse transcription 48℃ 60min, Enzyme activation 95℃ 60min, Denaturation 95℃ 30s, Annealing/extension 60 1min, Droplet stabilization 98℃ 의 1min, PCR 조건으로 수행하였다.
삭제
그 다음 하기 [표 5] 조건과 같이, 단단계 역전사 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(one step RT-qPCR)을 측정하여 참고값으로 활용하였다.
삭제
| Cycling step | Temperature, ℃ | Time | Number of cycles |
| UNG incubation | 25 | 2 min | 1 |
| RT incubation | 55 | 10 min | 1 |
| Enzyme activation | 94 | 3 min | 1 |
| Denaturation | 94 | 15 s | 45 |
| Annealing/Amplification | 60 | 30 s |
데이터 분석은 수행된 PCR 형광값의 threshold(기준)를 결정하여 positive (양성)와 negative(음성)를 나누었다. 이 때 negative sample(RNA를 넣지 않은)의 형광값이 negative(음성)의 수준으로, 상기 양성과 음성을 나누었다.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
실시예 10: 표준물질의 안정도 확인
표준물질의 안정성에 대해 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 방법(Reverse transcription digital PCR)으로 측정하여 확인하였다. 측정 유전자로, N, RdRP, NSP3, NSP6-11 유전자 부위에 대해, 상기 유전자에 대한 복제개수농도(특정 유전자 염기서열을 지닌 RNA copy number concentration, RNA 복제 개수 농도) 또는 Cq value 값으로, 확인하였했을 때, 안정도가 도 1 내지 도 3과 같이 유지됨을 확인하였다.
실시예 11: 표준물질의 균질성 확인
10개 이상의 무작위로 취해진 샘플에 대해 본 발명의 발명의 특정 유전자에 대한 복제개수농도(특정 유전자 염기서열을 지닌 RNA copy number concentration, RNA 복제 개수 농도)를, 역전사 디지털 중합효소연쇄반응 방법(Reverse transcription digital PCR)으로 측정하여 확인하였다. 측정 유전자로, 다섯 개의 유전자 부위 (RdRP, N, E, nsp3, nsp6-11)에 대해 정량했을 때, 병간 균질도는 3.31 - 4.33 %로 정도로 균질하였다. 또 다른 10개의 무작위로 취해진 샘플에 대해 균질성을 확인한 결과, 도 4 내지 도 8과, 하기 [표 7]과 같이 신뢰성이 k=95% 신뢰성이 있음을 확인하였다.
| 측정 유전자 |
기준값 (copy number/μL) |
병간 균질도 (%) |
확장불확도 (copy number/μL) |
k (95% 신뢰의 수준) |
| RdRP | 7.2 × 106 | 3.3 | 1.1 × 106 | 2.3 |
| N | 7.3 × 106 | 3.5 | 1.1 × 106 | 2.3 |
| E | 7.7 × 106 | 3.9 | 1.2 × 106 | 2.2 |
| nsp3 | 6.3 × 106 | 4.0 | 0.97 × 106 | 2.2 |
| nsp6-11 | 13 × 106 | 4.4 | 2.1 × 106 | 2.2 |
상기와 같이, 본 발명의 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질은 95% 신뢰의 수준에서 안정성과 균질도가 입증되었다.
이상과 같이, 본 발명에서는 특정한 사항들과 한정된 실시예에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명한 실시예에 국한되어 한정되어서는 아니되며, 후술하는 청구범위 뿐 만 아니라, 이 청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명의 사상 범주에 속한다고 할 것이다.
<110> KRISS
<120> SARS-CoV-2 RNA Reference material and Method for providing the
information for diagnosis of infection of SARS-CoV-2 using the
same
<130> P20071230776
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSP3-F
<400> 1
tgcaactgca gaagctgaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSP3-R
<400> 2
gccgagctgc tgaaataaaa 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSP3-P
<400> 3
atgtactgaa gtcagaggac gcg 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSP9-F
<400> 4
actgcttgca ctgatgacaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSP9-R
<400> 5
gcccatttca aatcctgtaa 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSP9-P
<400> 6
cacaacaaag ggaggtaggt ttg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N1-F
<400> 7
gaccccaaaa tcagcgaaat 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N1-R
<400> 8
tctggttact gccagttgaa tctg 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N1-P
<400> 9
accccgcatt acgtttggtg gacc 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N2-F
<400> 10
ttacaaacat tggccgcaaa 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N2-R
<400> 11
gcgcgacatt ccgaagaa 18
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N2-P
<400> 12
acaatttgcc cccagcgctt cag 23
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E1-F
<400> 13
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E1-R
<400> 14
tctggttact gccagttgaa tctg 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E1-P
<400> 15
accccgcatt acgtttggtg gacc 24
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RdRp-F
<400> 16
ggtaactggt atgatttcg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RdRp-R
<400> 17
ctggtcaagg ttaatatagg 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RdRp-P
<400> 18
tcatacaaac cacgccagg 19
Claims (21)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- SARS-CoV-2 특정 유전자를 단단계 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(one step RT-dPCR)으로 정량하고, 인간 혈액세포주 유래 RNA를 혼합하여, SARS-CoV-2의 RNA 표준물질을 제조하는 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조방법으로써,
상기 특정 유전자는 SARS-CoV-2의 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6, NSP7, NSP8, NSP9. NSP10, NSP11, NSP12(RdRP), NSP13, NSP14, NSP15, NSP16, ORF3a, E, M, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, N 및 ORF10 유전자를 포함하며,
상기 단단계 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응(one step RT-dPCR)은 디지털 PCR용 프라이머와 프로브 세트 존재하에 수행되며,
상기 디지털 PCR용 프라이머와 프로브 세트는
1) NSP3 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량하기 위한 서열번호 1(정방향)과 서열번호 2(역방향) 의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브 세트; 및
2) NSP6 내지 NSP11 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량하기 위한 서열번호 4 (정방향)와 서열번호 5(역방향)의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브 세트;를 포함하는, SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조방법. - 삭제
- 제 5항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형 광물질로 태그되며,
상기 5' 말단 형광 물질은 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein), 헥사클로로 6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클 로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX 및 Cy5(cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고,
상기 3' 말단 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민(6- carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ1(black hole quencher 1) 및 BHQ3(black hole quencher 3)로 구성된 군으로부 터 선택되는 어느 하나의 형광물질인, SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조방법. - 삭제
- 제5항에 있어서, 상기 NSP6 내지 NSP11 유전자 부위는 NSP6, NSP7, NSP8, NSP9, NSP10 및 NSP11 유전자가 연속적으로 연결된 서열의 유전자부위인, SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 제조방법.
- 삭제
- SARS-CoV-2 유전체(Genbank:MN908947)의 특정 유전자 염기서열인 266번 내지 2719 번 염기서열, 2720 번 내지 8554 번 염기서열 , 8555번 내지 10972번 염기서열, 10973 번 내지 13480번 염기서열, 13442 번 내지 16237 번 서열, 16238 번 내지 18040번 염기서열, 18041번 내지 19620번 염기서열, 및 19621번 내지 30658번의 염기서열을 포함하는 RNA 및 인간 혈액세포주 유래 RNA를 포함하는 RNA 혼합물인, SARS-CoV-2의 RNA 표준물질과 단단계 역전사 디지털 중합효소 연쇄반응으로 기준값을 제공하고, 단단계 역전사 실시간 정량 중합효소 연쇄반응으로 정보값을 제공하는 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법으로,
1) 상기 SARS-CoV-2 유전체의 NSP3 유전자를 정량하는 서열번호 1(정방향)과 서열번호 2(역방향)의 디지털 PCR용 프라이머; 및 서열번호 3의 디지털 PCR용 프로브 세트; 및
2) 상기 SARS-CoV-2 유전체의 NSP6 내지 NSP11 유전자 일부 또는 전체 부위를 정량하는 서열번호 4(정방향)와 서열번호 5(역방향)의 디지털 PCR용 프라이머; 및 서열번호 6의 디지털 PCR용 프로브 세트; dNTP, 역전사효소(Reverse transcriptase)를 포함하는 PCR 반응액으로부터 수십 만개 미세액적(droplet)을 생성하는 단계;
상기 생성된 미세액적에서 상기 NSP3 유전자 및 NSP9 유전자의 서열을 역전사하여 cDNA를 합성 한 후 증폭하는 단계; 및
상기 유전자를 정량하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위한 정보 제공방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200127304A KR102379144B1 (ko) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단 정보의 제공방법 |
| PCT/KR2021/013296 WO2022071737A1 (ko) | 2020-09-29 | 2021-09-29 | Sars-cov-2의 rna 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(sars-cov-2) 감염 진단 정보의 제공방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200127304A KR102379144B1 (ko) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단 정보의 제공방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102379144B1 true KR102379144B1 (ko) | 2022-03-28 |
Family
ID=80950543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200127304A KR102379144B1 (ko) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단 정보의 제공방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102379144B1 (ko) |
| WO (1) | WO2022071737A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024072122A1 (ko) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | (주)옵토레인 | 디지털 실시간 pcr 분석 방법 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007523629A (ja) * | 2003-04-26 | 2007-08-23 | アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド | コロナウィルスを同定するための方法 |
| WO2009019612A2 (en) * | 2007-08-03 | 2009-02-12 | Institut Pasteur | Lentiviral gene transfer vectors and their medicinal applications |
| KR20190048034A (ko) * | 2017-10-30 | 2019-05-09 | 한국표준과학연구원 | 안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도 |
-
2020
- 2020-09-29 KR KR1020200127304A patent/KR102379144B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-09-29 WO PCT/KR2021/013296 patent/WO2022071737A1/ko active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007523629A (ja) * | 2003-04-26 | 2007-08-23 | アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド | コロナウィルスを同定するための方法 |
| WO2009019612A2 (en) * | 2007-08-03 | 2009-02-12 | Institut Pasteur | Lentiviral gene transfer vectors and their medicinal applications |
| KR20190048034A (ko) * | 2017-10-30 | 2019-05-09 | 한국표준과학연구원 | 안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| BIORXIV PREPRINT DOI: HTTPS://DOI.ORG/10.1101/2020.07.03.186304; (JULY 3, 2020) * |
| CELL, VOL. 181, P. 914_921, MAY 14, 2020 * |
| CHINESE MEDICAL JOURNAL ;MARCH 14, 2020, P.30_56, [DOI:10.1097/CM9.0000000000000722] * |
| EMERGING INFECTIOUS DISEASES, VOL. 26, NO. 8, P.1654_1665, AUGUST 2020 * |
| JOURNAL OF VIROLOGY, SEPT. 2004, VOL. 78, NO. 18,P. 9977-9986 * |
| PLOS ONE, SEPTEMBER 2013, VOL. 8, ISSUE 9, E75296 [DOI:10.1371/JOURNAL.PONE.0075296] * |
| 이엠디(메디컴) 인터넷 기사 [HTTPS://WWW.MDON.CO.KR/MOBILE/ARTICLE.HTML?NO=28495] * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024072122A1 (ko) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | (주)옵토레인 | 디지털 실시간 pcr 분석 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022071737A1 (ko) | 2022-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111500771B (zh) | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒 | |
| CN108676920B (zh) | 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法 | |
| CN111321249A (zh) | 一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法 | |
| ES2795677T3 (es) | Método, aparato y producto de programa informático para calibración | |
| CN112553373A (zh) | 用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法 | |
| US20230193410A1 (en) | Identification of nsp1 gene as target of sars-cov-2 real-time rt-pcr using nanopore whole genome sequencing | |
| CN111334614A (zh) | 一种采用RT-qPCR技术检测新型冠状病毒的方法 | |
| CN111349720A (zh) | 用于检测呼吸道感染病毒的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 | |
| CN111206121A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒orflab和S基因的试剂盒 | |
| CN112239794B (zh) | 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 | |
| WO2022025823A1 (en) | Methods and kits for detecting and sequencing rna viruses | |
| CN112739833A (zh) | 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 | |
| KR102379144B1 (ko) | SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단 정보의 제공방법 | |
| CN113652505A (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
| CN114958984A (zh) | 一种定量测定样本中核酸含量的方法 | |
| CN112831597A (zh) | 用于非洲猪瘟病毒基因鉴别检验的实时荧光pcr扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒 | |
| CN110241264B (zh) | 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 | |
| CN111690772A (zh) | 一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用 | |
| Cho et al. | Development and Characterization of Synthetic Norovirus RNA for Use in Molecular Detection Methods | |
| CN110714097A (zh) | 一种同时检测a、b、c三组轮状病毒的方法 | |
| JP2011078389A (ja) | サポウイルスｒｎａの検出方法および検出試薬 | |
| CN111575403A (zh) | 一种检测rna病毒核酸的高通量数字pcr试剂盒及检测方法 | |
| KR102395969B1 (ko) | 코로나바이러스의 검출을 위한 루프-매개 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN114277184B (zh) | 一种人冠状病毒HCoV-HKU1的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| EP3021118B1 (en) | Method for identifying species using molecular weights of nucleic acid cleavage fragments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |