MXPA06002559A - Sistema de seleccion que contiene marcador de seleccion sin resistencia a antibioticos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un sistema de seleccion libre de genes de resistencia a antibioticos, el cual se basa en el uso de un gen araD como un marcador de seleccion llevado en un vector el cual es insertado en una cepa bacteriana deficiente en el gen araD. El gen araD de E. coli codifica la L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa. Tambien se refiere a un metodo para seleccionar las celulas transformadas con un plasmido, el cual contiene el gen araD. El marcador de seleccion sin antibioticos hace que el sistema sea adecuado para elaborar productos terapeuticos. El gen araD no es esencial para el crecimiento del hospedante pero su manipulacion afecta el crecimiento bajo ciertas condiciones selectivas. La supresion del gen araD conduce a la acumulacion de una sustancia que es toxica para el hospedante pero no para los humanos. El gen araD es relativamente pequeno y por lo tanto se puede construir un plasmido pequeno, el cual requiere menos energia para la replicacion y conduce a una velocidad de crecimiento y rendimiento incrementados.

Description

SISTEMA DE SELECCION QUE CONTIENE MARCADOR DE SELECCION SIN RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS Campo de la invención La presente invención se refiere a un sistema de selección novedoso, el cual está basado en el uso de un gen araD, una forma mutada de un gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección y al uso de una cepa bacteriana deficiente en el gen araD. La presente invención se refiere además a vectores novedosos que contienen un gen araD, una forma mutada de un gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo y a cepas bacterianas novedosas que son deficientes en el gen araD. La presente invención se refiere adicionalmente a un método para seleccionar las células transformadas con un plásmido, el cual contiene el gen de interés. Antecedentes de la invención Un requerimiento esencial para la ingeniería genética, efectiva de bacterias y otras células propagadas en cultivos celulares es la capacidad para seleccionar las células con una alteración genotípica, específica. La estrategia de selección más común en la tecnología de ADN recombinante es incluir un marcador de selección en el vector de clonación o plásmido. Un marcador de selección puede ser un REF: 170787 gen clonado o una secuencia de ADN, el cual permite la separación de las células hospederas que contienen el marcador de selección de aquellas que no lo contienen. El marcador de selección junto con un medio de selección adecuado mantiene el vector de clonación en las células . De otra manera, puesto que la replicación de plásmidos es una carga energética para el hospedante bacteriano, en un cultivo creciente las bacterias, la cuales han perdido el plásmido, tendrían una ventaja de crecimiento sobre las células con el plásmido. Para la mayoría de propósitos, un gen de resistencia a antibióticos es un marcador de selección utilizado comúnmente. Sin embargo, para la producción de agentes terapéuticos, recombinantes, donde el objetivo es generar un producto, tal como una vacuna de ADN, con alto rendimiento para la administración en pacientes, el uso de genes de resistencia a antibióticos presenta problemas: la diseminación de agentes patógenos resistentes a antibióticos es un problema serio en todo el mundo [Levy, S. B . , J. Antimicrob. Chemother. 49 (2002) 25-30] . Por lo tanto, los genes de resistencia a antibióticos no pueden tener un uso extensivo en la industria farmacéutica, y por ejemplo, de acuerdo con las regulaciones de la U.S. Food and Drug Administración, los genes de resistencia a antibióticos no están permitidos en vacunas de ADN experimentales que entran en la tercera fase.

Alternativamente, los sistemas de selección libres de antibióticos han sido sugeridos. Estos sistemas de selección libres de antibióticos incluyen sistemas de toxinas bacterianas- antitoxinas [Engelberg-Kulka, H. y Glaser, G . , Annu Rev Microbiol 53 (1999) 43-70] , genes responsables de la resistencia contra metales pesados, tal como telurio, [Silver, S. and Phung, L. . , Annu Rev Microbiol 50 (1996) 753-789], y sistemas en los cuales el plásmido codifica un gen que complementa la auxotrofia del hospedante [Wang, M.D. y colaboradores, J. Bacterial. 169 (1987) 5610-5614]. La solicitud de patente norteamericana 2000/0014476 Al describe generalmente, inter alia, el uso de un marcador de selección sin antibióticos, el cual puede ser un gen cuyo producto es necesario para el metabolismo de la célula bajo ciertas condiciones de cultivo, tal como un gen de catabolismo, el cual hace posible que la célula asimile una cierta sustancia que está presente en el medio de cultivo (una fuente especifica de carbono o nitrógeno) etcétera. Se proporcionan ejemplos no específicos de estos genes adecuados. Este planteamiento no es aplicable necesariamente para la producción comercial, puesto que la supresión de un componente esencial, tal como un aminoácido o una fuente de carbono, del medio de crecimiento reduce el rendimiento, lo cual no es deseable. Adicionalmente, la manipulación del medio de crecimiento en términos de omisión de un nutriente esencial puede incrementar considerablemente el costo del medio de crecimiento, puesto que las mezclas de nutrientes comercialmente disponibles deben ser reemplazadas por nutrientes individuales . Para propósitos terapéuticos comerciales, seria ventajoso utilizar un gen, el cual no sea esencial para el crecimiento del hospedante pero cuya manipulación aún afecte el crecimiento en circunstancias seleccionadas .

Adicionalmente, en vista del uso terapéutico, sería ventajoso utilizar un gen, cuya supresión conduzca a la acumulación de compuestos, los cuales son tóxicos para la célula hospedante pero no son tóxicos para los mamíferos, inclusive los humanos. También sería ventajoso utilizar genes más pequeños, lo cual a su vez permitiría la construcción de plásmidos más pequeños para los cuales el consumo de energía para la replicación es más pequeño y de esta manera se mejora la velocidad de crecimiento del cultivo bacteriano y el rendimiento de plásmidos . Breve descripción de la invención El objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibióticos, el cual evite los problemas de los sistemas de selección descritos previamente para el uso en la producción de productos terapéuticos, recombinantes . Otro objetivo de la invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibiótico, el cual pueda utilizarse de manera segura en la elaboración de productos terapéuticos, recomb nantes en términos de la seguridad del ambiente y del paciente. Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibióticos, el cual pueda utilizarse con mayor rentabilidad en la elaboración de productos terapéuticos, recombinantes utilizando medios de crecimiento estándar. Un objetivo aún adicional de la invención es proporcionar un nuevo sistema de selección libre de antibióticos, el cual proporcione una velocidad de crecimiento incrementada y un rendimiento mejorado. Todavía otro objetivo de la presente invención es proporcionar un vector novedoso que contenga un marcador de selección, el cual no sea tóxico para el ambiente y para los humanos y el cual tenga la capacidad de mantenimiento a largo plazo en el hospedante. Todavía otro objetivo de la presente invención es proporcionar una nueva célula hospedante que contenga un defecto genético, que no sea peligroso para el ambiente. Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la selección de células que llevan un gen de interés para la elaboración de productos terapéuticos, recombinantes.

Se descubrió sorprendentemente que los objetivos de la presente invención se alcanzan por medio del uso del gen araD, una forma mutada de un gen aráD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección y el uso de un hospedante bacteriano, específico que es deficiente en el gen araO. Por consiguiente, la presente invención proporciona un sistema de selección novedoso que comprende una célula bacteriana deficiente en un gen aráD en la cual un vector que lleva un gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo se ha adicionado como un marcador de selección. Una modalidad de la presente invención se refiere a un sistema de selección en donde el gen araD es el gen araD o la L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (EC 5.1.3.4) . Otra modalidad de la presente invención se refiere a un sistema de selección en donde a el gen araD es mutado. La presente invención proporciona además vectores novedosos, los cuales contienen un gen araD, una forma mutada de un gen araD, una secuencia complementada del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo, como un marcador de selección. La presente invención proporciona además nuevas cepas bacterianas, las cuales son deficientes en el gen araD. La presente invención proporciona además un método para seleccionar las células transformadas con un plásmido, el cual contiene 1) el gen araD, una forma mutada de un gen aráD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección y 2) el gen de interés, el método comprende insertar el plásmido en la célula hospedante deficiente en el gen araD y el crecimiento de las células en un medio de crecimiento que contiene arabinosa. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra el uso de arabinosa como una fuente de carbono por las células de E. coli (Lin, 1987) . La figura 2 muestra el mapa de S6wtdlEGFP. Las secuencias de codificación para el marcador de resistencia a dlEGFP, E2 y kanamicina aminoglicósido-3 ' -0-fosfotransferasa (Kana) son indicadas por flechas. Las características adicionales son indicadas por cuadros sólidos: 10E2BS -- diez sitios de enlace de E2 de BPV con alta afinidad; CMV-tk --promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano y secuencia líder del gen Th de HSV; intron -- intron del gen de beta-globina de conejo con los sitios optimizados SD y SA; tkpa -- señal de poliadenilación del gen Tk de HSV; RSV LTR --repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous; bgh pA --señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento de bovino; pUCori -- origen de replicación bacteriano derivado del plásmido pUC18.

La figura 3 muestra el mapa de S6wtdlEGFP.Ka.na/araDl . Las secuencias de codificación para el marcador de resistencia a dlEGFP, E2, kanamicina aminoglicósido-3 ' -0-fosfotransferasa (kana) y L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (araD) son indicadas por flechas. Las características adicionales son indicadas por cuadros sólidos: 10E2BS -- diez sitios de enlace de E2 de BPV con alta afinidad; CMV-tk -- promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano y secuencia líder del gen Th de HSV; intron -- intron del gen de beta-globina de conejo con los sitios optimizados SD y SA; tkpa señal de poliadenilación del gen Tk de HSV; RSV LTR -- repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous; bgh pA -- señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento de bovino; pUCori -- origen de replicación bacteriano derivado del plásmido pUC18. La figura 4 muestra el mapa de S6wtdlEGFPKana./araD2.

Las secuencias de codificación para el marcador de resistencia a dlEGFP, E2, kanamicina aminoglicósido-3 ' -O-fosfotransferasa (kana) y L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (araD) son indicadas por flechas. Las características adicionales son indicadas por cuadros sólidos: 10E2BS -- diez sitios de enlace de E2 de BPV con alta afinidad; CMV-tk -- promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano y secuencia líder del gen Th de HSV; intron -- intron del gen de beta-globina de conejo con los sitios optimizados SD y SA; tkpa -- señal de poliadenilación del gen Tk de HSV; RSV LTR -- repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous ; bgh pA -- señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento de bovino; pUCori -- origen de replicación bacteriano derivado del plásmido pUC18. La figura 5 muestra el mapa de S6wtdlEGFP/araDl . Las secuencias de codificación para dlEGPP, E2 y L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (araD) son indicadas por flechas. Las características adicionales son indicadas por cuadros sólidos: 10E2BS -- diez sitios de enlace de E2 de BPV con alta afinidad; CMV-tk -- promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano y secuencia líder del gen Th de HSV; intron -- intron del gen de beta-globina de conejo con los sitios optimizados SD y SA; tkpa -- señal de poliadenilación del gen Tk de HSV; RSV LTR -- repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous; bgh pA -- señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento de bovino pUCori -- origen de replicación bacteriano derivado del plásmido pUC18. La figura 6 muestra el mapa de S6wtdlEGFP/araD2. Las secuencias de codificación son para dlEGFP, E2 y L-ribulosa-5-fosf to-4-epimerasa (araD) son indicadas por flechas. Las características adicionales son indicadas por cuadros sólidos: 10E2BS -- diez sitios de enlace de E2 de BPV con alta afinidad; CMV-tk -- promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano y secuencia líder del gen Th de HSV; intron -- intron del gen de beta-globina de conejo con los sitios optimizados SD y SA; tkpa -- señal de poliadenilación del gen Tk de HSV; RSV LTR repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous; bgh pA -- señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento de bovino; pUCori -- origen de replicacion bacteriano derivado del plásmido pUC18. Las figuras 7A y 7B muestran el análisis electroforético del ADN de plásmido de S6wtdlEGFP/araDl (7A) y S6 tdlEGFP/araD2 (7B) extraídos de la cepa de E. coli AGldeltaaraD desarrollada en diferentes medios . La figura 8 muestra el análisis de patrón de restricción para el ADN de plásmido de S6wtdlEGFP/araDl y S6wtdlEGFP/araD2 extraídos de la cepa de E. coli AGldeltaaraD. La figura 9 muestra el análisis electroforético de S6wtdlEGFP/araD2 en un ensayo de estabilidad. Las figuras 10A y 10B muestran el análisis de patrón de restricción para S6wtdlEGFP/araD2 en un ensayo de estabilidad. La figura 11 muestra los parámetros de crecimiento de la fermentación alimentada por lotes de AGlAaraD S6 tdlEGFP/araD2 medidos y registrados durante la fermentación. Las abreviaciones son como sigue: sPump = velocidad de alimentación; p02 = concentración de oxígeno; Temp. - temperatura de crecimiento; mys = velocidad de crecimiento deseada; OD = densidad óptica a 600 nm. La figura 12 muestra el esquema de lisis y purificación de AGlAaraD S6wtdlEGFP/araD2.

La figura 13 muestra la secuencia del sitio de araD del clon #13. La figura 14 muestra el mapa del plásmido p3hC. La figura 15 muestra el mapa del plásmido paraDMgB. La figura 16 muestra el mapa del plásmido p3ax-aDlhCG. La figura 17 muestra el mapa del plásmido p3araD2hCG. La figura 18 muestra los resultados del análisis de sensibilidad a L-arabinosa de cepas de E. coli con el gen araD alterado . La figura 19 muestra los resultados del análisis de sensibilidad a L-arabinosa en el medio M9 y de extracto de levadura con diferentes concentraciones de glucosa y arabinosa. La figura 20 muestra el mapa del plásmido p2 MG C #11. La figura 21 muestra el mapa del plásmido paraD MG C #145. La figura 22 muestra el fragmento genómico de E. coli que contiene el gen sgbE. La figura 23 muestra el fragmento genómico de E. coli que contiene el gen ulaF . Descripción Detallada de la Invención La presente invención se basa en un esfuerzo por descubrir un sistema de selección libre de antibióticos, alternativo, el cual podría utilizarse en la elaboración de productos terapéuticos, recombinantes para administrarse in vivo, especialmente en la producción de vacunas de ADN. Se descubrió sorprendentemente que el gen araD involucrado en la via de fosfato de pentosa de organismos tanto procarióticos como eucarióticos , tales como mamíferos e inclusive humanos, puede utilizarse exitosamente como un marcador de selección en una célula hospedante auxotrófica para el plásmido. El uso de la auxotrofí tiene la ventaja de no involucrar el uso o la generación de sustancias tóxicas que podrían contaminar posteriormente la preparación del plásmido. Se ha construido un sistema de selección eficiente en base a los genes araD/araC [Ariza, . R. y colaboradores, Carcinogenesis 14 (1993) 303-305] . Sin embargo, este sistema de selección se ha utilizado en estudios sobre los mecanismos de mutagénesis pero no se ha utilizado anteriormente como un marcador de selección para el mantenimiento de plásmidos. Ariza y colaboradores utilizaron una cepa donde el gen araC contiene un codón de terminación y el gen araD es inactivado. Un producto del gen supF, el cual codifica un ARNt supresor, se introdujo en el plásmido. En presencia del ARNt supresor activo, el producto enzimáticamente activo de araC se produjo causando la detención del crecimiento celular (debido a que araD estaba inactivo) . Este sistema permite estudiar la supresión de mutaciones por el ARNt de supF : en caso que supF sea inactivado por medio de la mutación, las células pueden crecer en arabinosa. Por lo tanto, este sistema de selección se basa en el gen araC y no en el gen aráD. El gen aráD no fue introducido en un plásmido, ni fue el sistema diseñado o caracterizado para propósitos de producción de plasmidos. El gen aráD codifica una enzima que es responsable de la epimerización de ribulosas-fosfato a xilulosa-5-fosfato (Figura 1) y por lo tanto permite el uso de arabinosa en la via de fosfato de pentosa [Engelsberg, E. y colaboradores, J. Bacteriol, 84: (1962) 137-146]. Si el gen araD es inactivado, el ribulosa-5 -fosfato se acumula en la célula bacteriana conduciendo a la detención del crecimiento . Si la copia cromosómica del gen araD es inactivada en la célula hospedante y se inserta una copia intacta del gen araD, una forma mutada del gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo en el plásmido, la ventaja de crecimiento de las células que contienen plásmidos en el medio que contiene L-arabinosa se logra como resultado de dos efectos. Primero, las células que contienen plásmidos pueden utilizar arabinosa como una fuente de carbono y segundo, el ribulosa-5-fosfato tóxico no se acumul . Esto permite el uso de medios de crecimiento ricos que están complementados con arabinosa. En los medios ricos, las células de ?. coli crecen rápido y el rendimiento de plásmidos es alto. Los componentes estándar, económicos de los medios de crecimiento bacteriano, tal como extracto de levadura, pueden utilizarse como una fuente de aminoácidos. Las trazas de ribulosa-5-fosfato que podrían contaminar teóricamente la preparación de plásmidos no son un problema, cuando la preparación es administrada in vivo, ya que el ribulosa-5-fosfato puede ser metabolizado eficientemente por células humanas y no es tóxico. El uso de la forma mutada del gen araD ofrece ventajas particulares. Los sistemas de selección de la invención que comprenden una célula bacteriana deficiente en el gen araD en la cual existe un vector que lleva una forma mutada del gen araD como un marcador de selección producen una concentración óptima del producto del gen araD L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa para proporcionar un crecimiento rápido, desinhibido de las bacterias. Se obtienen ventajas similares por medio del uso de sistemas de selección que contienen un vector que lleva un gen araD intacto pero que comprende supresiones o mutaciones en otra parte en el sitio del gen araD . El sistema de selección de la invención comprende 1) un vector que lleva un gen araD, una forma mutada del gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección y 2) una cepa bacteriana, específica que es deficiente en el gen araD en la cual se ha adicionado el vector. Cuando el hospedante especifico que es deficiente en el gen araD es cultivado en presencia de arabinosa, las únicas células supervivientes son aquellas que contienen el vector, el cual contiene un gen araD, una forma mutada del gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo. En el sistema de selección de la invención se puede emplear cualquier vector de expresión utilizado comúnmente en la elaboración de productos terapéuticos, con lo cual el gen araD, una forma mutada del gen araD, una secuencia complementada del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo es insertado en el vector utilizando métodos conocidos generalmente en el campo. En el presente contexto, el gen araD comprende preferiblemente la secuencia identificada por la SEC ID No. 1, por la SEC ID NO. 19 o una secuencia hidrolizable con las mismas. Sin embargo, también está contemplado cualquier gen araD aplicable. En el presente contexto, el término "un fragmento catalíticamente activo del gen araD" es cualquier fragmento del gen que codifica un polipéptido o una proteína con capacidad de epimerización del L-ribulosa-5-fosfato a D-xilulosa-5-fosfato . En una modalidad específica de la invención, el gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo es insertado en el vector con capacidad de mantenimiento a largo plazo y con lo cual es capaz de proporcionar una expresión estable del (los) antígeno (s) deseado (s) . En otra modalidad específica de la invención, una forma mutada de un gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo se inserta en el vector con capacidad de mantenimiento a largo plazo y con lo cual con capacidad para proporcionar una expresión estable del (los) antígeno (s) deseado (s) . En una modalidad específicamente preferida de la invención, el vector utilizado es un vector de expresión que comprende : a) una secuencia de ADN que codifica una proteína de fijación nuclear unida operativamente a un promotor heterólogo, la proteína de fijación nuclear que comprende (i) un dominio de enlace de ADN que se enlaza a una secuencia de ADN específica y (ii) un dominio funcional que se enlaza a un componente nuclear o un equivalente funcional del mismo; y b) una secuencia de ADN multimerizada que forma un sitio de enlace para la proteína de fijación nuclear, en donde el vector carece de un origen de replicación de virus de papiloma, y c) un gen araD, una forma mutada de un gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo.

Estos vectores han sido descritos en detalle en la solicitud de patente internacional WO02/090558, la cual es incorporada en este documento a manera de referencia. Más preferiblemente, el vector utilizado en el método de selección de la presente invención es un vector de expresión que comprende: a) la proteina E2 del Virus de Papiloma Bovino tipo 1 (BPV) y b) múltiples sitios de enlace de la proteína E2 de BPV incorporados en el vector como un cúmulo, donde los sitios pueden ser como estructuras de cabeza-cola o pueden incluirse en el vector por medio de la colocación separada, en donde el vector carece de un origen de replicación de virus de papiloma, y c) el gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un fragmento catalíticamente activo del mismo. En el sistema de selección de la invención podría utilizarse en principio cualquier hospedante conocido que sea deficiente en el gen araD y adecuado para el uso en la elaboración de productos terapéuticos. En la presente conexión, el término "deficiente" representa un hospedante, en el cual el gen araD es ya sea totalmente suprimido o inactivado por medio del cualquier método conocido. En una modalidad preferida de la invención, se utiliza una cepa de Escherichia coli, de preferencia las cepas de E. coli cornercialmente disponibles DH5alfa-Tl, AGI o J 109, de las cuales el gen araD ha sido suprimido con métodos generalmente conocidos, tales como aquellos descritos posteriormente en los ejemplos. En otra modalidad preferida de la invención, una cepa de E. coli, preferiblemente la cepa de E. coli DH5alfa-Tl, AGI o JM109, en las cuales se han realizado supresiones combinadas para la depleción de otros genes que codifican proteínas con actividad de L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa . Alternativamente, se pueden utilizar las cepas de E. coli cornercialmente disponibles, preferiblemente las cepas de E. coli DH5alfa-Tl7 AGI o JM109, en las cuales el gen araD y/u otros genes que codifican proteínas con actividad de L-ribulosa~5-fosfato-4-epimerasa han sido inactivados por medio de cualquier método conocido. En el método para la selección de células que llevan un gen de interés para la elaboración de productos terapéuticos, recombinantes , el gen de interés es insertado en células hospederas deficientes en él gen araD y/u otros genes que codifican proteínas con actividad de L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa utilizando un método bien conocido en el campo y las células son cultivadas en un medio de crecimiento que contiene arabinosa en condiciones y medios de cultivo adecuados para el hospedante en cuestión. Se puede utilizar cualquier medio de crecimiento adecuado para el cultivo de células de E. coli. Para la producción comercial, el medio de crecimiento será optimizado naturalmente en términos del rendimiento. Los ejemplos de medios de crecimiento adecuados son los medios de crecimiento comercialmente disponibles, tales como M9 y LB (disponibles de varios fabricantes, tales como Fermentas, Lituania) . La cantidad de arabinosa adicionada en el medio de crecimiento no es crítica pero la arabinosa debe estar presente naturalmente en una cantidad que sea suficiente para el periodo de cultivo total . Se ha descubierto que una cantidad tan insignificante como 0.1% es suficiente para la selección. Típicamente, la arabinosa se adiciona al medio en una cantidad de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 2.0%, de preferencia en una cantidad de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 1.0%, más preferiblemente de 0.2% a aproximadamente 0.5%. Sin embargo, el efecto de la L-arabinosa se observa en concentraciones tan bajas como 0.01% y la L-arabinosa puede adicionarse hasta un 5% en el medio de crecimiento. En una modalidad especial, donde se utiliza la L-arabinosa como un agente de selección y como una fuente de carbono limitada, 0.2% de L-arabinosa es una cantidad adecuada para adicionarse en el medio de crecimiento. El sistema de selección de la invención es adecuado para el uso en cualquier sistema de expresión. Es especialmente adecuado para el uso en la expresión de productos terapéuticos, recombinantes, tales como vacunas de ADN, propuestos para el uso in vivo, puesto que se evitan los problemas asociados con el uso de genes de resistencia a antibióticos. De igual manera, el sistema de selección de la invención es adecuado para el uso en la producción de proteínas recombinantes . La posible contaminación de arabinosa en el producto final resultante del proceso de preparación es incongruente, puesto que la arabinosa es un azúcar comestible que está contenido en alimentos naturales y como un aditivo y de esta manera no es tóxica para mamíferos, inclusive humanos. Adicionalmente , el gen araD es de un tamaño más pequeño que los genes de resistencia a antibióticos utilizados comúnmente contra, por ejemplo, ampicilina y tetraciclina y de un tamaño similar a los genes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol . Esto da una ventaja adicional, puesto que permite la construcción de plásmidos pequeños para los cuales es más pequeño el consumo de energía para la replicación que para los plásmidos grandes . Con lo cual se incrementa tanto la velocidad de crecimiento del cultivo bacteriano como el rendimiento de plásmidos. La presente invención puede ser mejor entendida por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, los cuales se proporcionan como una ilustración de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan a fin de ilustrar más completamente las modalidades preferidas de la invención. Sin embargo, de ninguna manera deben considerarse como limitantes del amplio alcance de la invención. Ej emplo 1 Clonación de plásmidos de selección de araD Para clonar las construcciones de selección de araD se utilizó el plásmido S6wtdlEGFP (figura 2) . Este tiene un origen de replicacion de pMBl y un marcador de resistencia a kanamicina como elementos funcionales de la cadena principal del plásmido. La resistencia a kanamicina en este plásmido es conferida por un gen que se deriva del transposon de E. coli Tn903. El gen araD fue amplificado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) del cromosoma de E. coli DH5 de acuerdo con un procedimiento estándar. El producto de la PCR fue clonado en plásmidos seleccionados en dos orientaciones diferentes con los pares de cebadores s6araDLl + s6araDRl o s6araDLl + s6araDRl, generando los productos denominados araDl y araD2, respectivamente: s6araDL1 : CGCCATGGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTA ATG CG GTAGTTTAG C ACG AAG G AGTC AACATG (SEC ID NO. 2); s6araDR1 : CGCCATGGACTAGTAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCT GTCATTACTG CCCGTAATATG C (SEC ID NO. 3); s6araDL2: CGCCATGGACTAGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAG CTTTAATGCGGTAGTTTAGCACGAAGGAGTCAACATG (SEC ID NO. 4); s6araDR2: CGCCATGGAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCAT- TACTGCCCGTAATATGC (SEC ID NO. 5); Los cebadores se diseñaron de manera que el promotor P2 del plásmido pB 322 (utilizado para conducir el gen de resistencia a tetraciclina en pBR322) y la secuencia de terminación del operon trp de E. coli se adicionaron durante la PCR a la dirección 5' y la dirección 3' de la secuencia de codificación de araD, respectivamente. Los productos de la PCR de 814 y 815 pb fueron clonados en el vector pUC18 linealizado con Hincll (Fermentas, Lituania) y las secuencias correctas fueron verificadas por medio de la secuenciación utilizando los cebadores de secuenciación universales 13F22: GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA (SEC ID NO. 6) y M13R24: GAGCGGATAACAATTTCACACAGG (SEC ID NO. 7) y cebadores específicos para araD araD F311 : CCAACTCACGGGCTGCTCTATC (SEC ID NO. 8), araD F614: AATGCCGAAGATGGGGTGCATAAC (SEC ID NO. 9), araD R700: TAACTGCGGCGCTAACTGAC (SEC ID NO. 10), y araD R421 : GGTTGCTGGAATCGACTGAC (SEC ID NO. 11 ).

Las mutaciones en las secuencias amplificadas se repararon por medio de la recombinación de diferentes clones. Para clonar el gen araD en S6wtdlEGFP, el vector fue linealizado por medio de la digestión parcial con la enzima de restricción Pagl (posición 4761) (Fermentas, Lituania) y las terminaciones 5' del ADN fueron desfosforiladas con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIAP; Fermentas, Lituania) . Los fragmentos araDl y araD2 fueron recortados de pUC18 con Ncol (Fermentas, Lituania) y fueron ligados a S6wtdlEGFP/Pagl . Ambas mezclas de ligadura fueron trasformadas en células competentes de E. col! DH5 y se colocaron sobre platos que contenían el medio LB que contenia 50 µg/ml de kanamicina y se incubaron a 37 °C durante toda la noche. Las colonias se analizaron primero con la PCR de colonias, después de lo cual el ADN se aisló y se digirió con diferentes enzimas de restricción. La clonación dio por resultado los plásmidos S6wtdlEGFP^ana/araDl, S6wtdlEGFP7eana/araD2 , los cuales se muestran en las figuras 3 y 4. Para remover el gen marcador de resistencia a kanamicina de los plásmidos S6wtdlEGFPJcar¡a/a:raDl, S6wtdlEGFPkazia/araD2 se digirieron con la endonucleasa de restricción Bcul (Fermentas, Lituania) y el fragmento de vector de 6473 pb fue auto-ligado. Las mezclas de ligadura se trasformaron en una cepa de E. coli AGI AaraD (véase ejemplo 3) y se colocaron sobre platos que contenían medios M9 complementados con L-arabinosa 2% y se incubaron a 37°C durante 36 horas. Las colonias primero se analizaron con la PCR de colonias, después de lo cual el ADN se aisló y se digirió con diferentes enzimas de restricción. La clonación dio por resultado los plásmidos S6wtdlEGFP/araDl, S6wtdlEGFP/araD2 , respectivamente, los cuales se muestran en las figuras 5 y 6. Las colonias bacterianas que contenían los plásmidos S6wtdlEGFP/araDl y S6wtdlEGFP/araD2 se desarrollaron en dos medios diferentes: LB complementado con L-arabinosa 2.5% y M9 complementado con L-arabinosa 0.2% a 37°C con agitación vigorosa. Las células se recolectaron y el ADN de plásmido se extrajo de la célula utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) y se analizaron por medio de la electroforesis de gel de agarosa (figuras 7? y 7B, respectivamente) . Las muestras de ADN de plásmido de los cultivos en los medios LB y M9 se analizaron por medio de la electroforesis de gel de agarosa antes y después de la digestión con la endonucleasa de restricción Pagl (Fermentas, Lituania) , (figura 8) . Los tamaños pronosticados de los fragmentos obtenidos en la digestión con Pagl fueron 3954 y 2519 pb para S6wtdlEGFP/araDl y 4315 y 2157 pb para S6wtdlEGFP/araD2. El ADN lambda digerido con Eco911 (M15 en la figura 8C) y el ADN lambda digerido con EcoRl/ HindIII (Fermentas, Lituania) (M3 en la figura 8C) se utilizaron como marcadores de peso molecular. Todos los clones bacterianos, analizados contuvieron el plásmido correcto en el análisis de enzimas de restricción, pero el rendimiento de ADN fue muy bajo cuando los plásmidos se desarrollaron en los medios LB. Dos de los clones bacterianos analizados de cuatro de clones S6 tdlEGFP/araD2 (#13 y #14 en la figura 8B) tuvieron una velocidad de crecimiento más alta cuando se desarrollaron en medios M9 complementados con L-arabinosa 0.2% (figuras 7 y 8) , lo cual dio por resultado un rendimiento de plásmido más alto por cultivo. Se realizaron análisis adicionales de estos dos clones con crecimiento mejorado. Estos dos plásmidos tuvieron la misma estructura que los otros plásmidos como se juzgó por medio del análisis de restricción. Los plásmidos se extrajeron de las bacterias y se caracterizaron adicionalmente por la secuenciación del sitio del gen araD. La secuencia del sitio del gen araD del clon #13 (SEC ID NO. 18; SEC ID NO. 19) indicó que la secuencia de codificación del gen araD lleva un codón de detención en lugar de un codón para Glutamina en la posición 8 de la L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa. Esta mutación resultó del reemplazo de Citidina en el codón 8 de la L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (secuencia de codificación de araD) (5'-CAG-3') con la Timidina, dando por resultado un codón de detención (5'-TAG-3')- El plásmido que llevaba esta mutación en el gen araD proporcionó de manera efectiva la capacidad de crecimiento en el medio selectivo en presencia de L-arabinosa a través de la secuencia de codificación que contiene el codón de detención. Se ha demostrado que el codón de detención UAG es leído por completo de manera efectiva por los ribosomas de Escherichia coli, cuando este codón de detención está al principio de la secuencia de codificación [para referencia, véase la revisión Murgola, E. J. , Annu. Rev. Genet. 19 (1985) 57-80] . Sin ser limitado por alguna teoría, se creó la hipótesis que el alto rendimiento del plásmido, el cual es una indicación del crecimiento desinhibido, rápido de las bacterias, requiere una concentración óptima del producto del gen araD, L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa . El análisis de la secuencia del sitio de araD del clon #14 indicó que la secuencia de codificación de araD es perfecta como se pronosticó. Sin embargo, se observaron los reordenamientos de secuencia cerca del promotor de araD que cubre los sitios de enlace de la proteína E2 (véase la figura 13, SEC ID NO. 18) . Estos datos sugirieron adicionalmente que estos reordenamientos cerca del promotor podrían dar por resultado la desregulación de la actividad del promotor, por lo tanto el nivel del producto de araD. Ejemplo 2 Clonación de plásmidos de selección de araD mutados Para la clonación de construcciones de selección de aráD mutados, el plásmido p3hCG (figura 14) que llevaba resistencia a kanamicina [gen (neo) de marcador de resistencia a kanamicina derivado del transposon Tn5] fue escindido con las endonucleasas de restricción Bcul y HindIII, los extremos fueron rellenados utilizando el fragmento Kleno (Fermentas, Lituania) y el fragmento con el tamaño de 4647 pb se purificó del gel después de la electroforesis de gel de agarosa. El origen de replicación pMBl y la secuencia de araD que lleva la mutación C a T, lo cual da por resultado un codón de detención en la posición 8 de la secuencia de codificación del gen araD, se dividió del plásmido paraDMgB (figura 15) con las endonucleasas de restricción Bcul y Eco521, los extremos fueron rellenados utilizando el fragmento Klenow (Fermentas, Lituania) y las terminaciones 5' de ADN fueron desfosforiladas con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIAP; Fermentas, Lituania) . El fragmento con el tamaño de 1532 pb fue purificado del gel después de la electroforesis de gel de agarosa y ligado con el fragmento de 4647 pb obtenido anteriormente. La cepa de Escherichia coli AGI deficiente en el gen araD se transformó con esta mezcla de ligadura y se colocó sobre placas de agar que contenían el medio - selectivo M9 con extracto de levadura 0.5%, L-arabinosa 2% y 25 µg/ml de kanamicina. Las colonias fueron inspeccionadas 24 horas después de la colocación en placas y mostraron que el tamaño de las colonias era uniforme. Los plásmidos se extrajeron de las bacterias y se caracterizaron adicionalmente por medio de la secuenciación del sitio del gen araD. La clonación dio por resultado los plásmidos p3araDlhCG y p3araD2hCG, los cuales se muestran en las figuras 16 y 17, respectivamente. De acuerdo con el análisis de secuencias, las bacterias contuvieron plásmidos no reordenados con la mutación C a T en el codón 8 (p3araDlhCG; figura 16; p3araD2hCG, figura 17) . Cuando se repitió este experimento con la secuencia de tipo no cultivado y las placas transformadas fueron inspeccionadas 24 horas después de la transformación, el resultado fue diferente. Se observaron dos tipos de colonias: primero, colonias de gran tamaño y colonias pequeñas, las cuales tuvieron un crecimiento retardado. El análisis de secuencias de estos plásmidos indicó que la secuencia de codificación del gen araD lleva un codón de detención en lugar de un codón para glutamina (plásmido #3A, a_raD2) o la mutación había ocurrido en la secuencia Shine-Dalgarno en el sitio de enlace ribosomático (AGGAG fue remplazado por AGTAG) (plásmido #2A, araD2) . El plásmido #7 (araDl) tuvo la secuencia correcta en todas las regiones del sitio del gen araD, sin embargo, las bacterias crecieron muy lentamente y dieron por resultado un rendimiento de plásmidos 10 veces más bajo cuando se desarrollaron en medios líquidos. Ejemplo 3 Construcción de cepas de Escheríchia coli AaraD sensibles a arabinosa. Tres cepas de E. coli, DH5alfa TI, AGI y JM109, se utilizaron para construir mutantes de AaraD. El gen araD en el genoma de E. coli fue alterado utilizando el método descrito por Datsenko y Wanner [PNAS 97 (2000) 6640-6645] . Este método explota un sistema de recombinación de fagos ? Red. En resumen, la estrategia de este sistema es reemplazar una secuencia cromosómica por un gen de resistencia a antibióticos seleccionable que es generado por medio de la PCR utilizando cebadores con extensiones de homología. Esto se realiza por medio de la recombinación mediada por Red en estas homologías flanqueadoras . Para la transformación de pKD46 (Datsenko y Wanner, supra) que codifica el sistema de recombinación de fagos X, E. coli, las células se hicieron químicamente competentes utilizando las soluciones RFl y RF2 : RFl 100 mi RF2 100 mi Las células se desarrollaron en 2 mi del medio LB a ODsoo 0.2-0.5. El cultivo fue centrifugado y la pelotilla fue resuspendida en 1 mi de RF1. La mezcla se mantuvo sobre hielo durante 10 minutos y se centrifugó. La pelotilla se suspendió en 100 µ? de RF2 y la suspensión se mantuvo sobre hielo durante 30-45 minutos. Se adicionaron aproximadamente 50 ng de pKD43 y las células se mantuvieron sobre hielo durante 30 minutos adicionales seguido por un golpe de calor de 5 minutos a 37 °C. Después de la incubación durante 10 minutos sobre hielo, se adicionaron 900 µ? del medio SOB a las células trasformadas y la mezcla se incubó a 37 °C durante una hora. Las células se colocaron en placas en el medio LB que contenía ampicilina (100 g/ml) . Las colonias se recolectaron de las placas de transformación y se desarrollaron en 2 mi del mismo medio a OD60o de aproximadamente 1 y se realizaron soluciones madre de glicerol (2 mi de cultivo + 0.6 mi de glicerol 50%) . Las soluciones madre se almacenaron a -80°C. Para la alteración del gen araD, se generó un producto de la PCR lineal que contiene un gen de resistencia a kanamicina. El plásmido pKD13 (Datsenko y anner, PNAS vol . 97, no 12, Junio de 2000) se utilizó como la plantilla de la PCR. Los cebadores utilizados fueron ara(prl) y ara(pr4): ara(pii) 5'-CTCAAACGCCCAGGTATTAGAAGCCAACCTGGCGCTGCC- AAAACACGTGTAG GCTGGAGCTGCTTC 3' (SEC ID NO. 12) ara(pr4) 5'-GGTTTGATCACAAAGACGCCGCGCTCGCGATCAACGGCGC- ATTCCGGGGAT CCGTCGACC 3' (SEC ID NO. 13) Estos cebadores tienen las secuencias complementarias con pKD13 para la hibridación en la PCR y con el gen araD para la recombinación homologa. La mezcla de recombinación de la PCR fue como sigue : amortiguador nativo PFU (5 µ?) , d TP 10 mM (5 µ?) , cebador ara(prl) 10 µ? (1 µ?) , cebador ara(pr4) 10 µ? (1 µ?) , pKD13 100 ng (2 µ?) , DMSO (4 µ?) , PFU 2.5 U (1 µ?) y agua mQ para completar 50 µ? . El procedimiento de la PCR fue como sigue : desnaturalización 45 s, 96°C, hibridación 45 s, 50°C, síntesis 2 minutos 30 s, 72°C, 25 ciclos. El producto obtenido de la PCR fue 1.4 kb. Se realizaron simultáneamente cinco reacciones; el ADN se purificó del gel de agarosa 2% utilizando el equipo de purificación Ultrapure (MoBio Laboratorios Inc.) y se diluyó con 60 µ? de agua. El ADN se concentró con la precipitación de etanol y se disolvió en 5 µ? de agua. La concentración final fue 0.6 µ^/µ?. Se utilizó una alícuota de 1.5 µ? en una electroporación. El producto de la PCR fue electroporado en células de E. coli DHSalfa TI pKD46, AGI pkD46 (Datsenko y Wanner, supra) , y JM109 pKD46. Primero, 200 mi del medio YENB que contenía 10 mM de L-arabinosa para la inducción del sistema de recombinación y 100 /g/ml de ampicilina se inocularon con un cultivo durante toda la noche de células de E. coli DH5alfa TI pKD46, AGI pkD46, y JM109 pKD46. Los cultivos se desarrollaron a 30°C a ODSOO 0.8 (DH5alfa TI y JM109) y 0.6 (AGI) . Las bacterias se recolectaron por medio de la centrifugación a 4,000 g durante 10 minutos a 4°C, se lavaron dos veces con 20 mi de agua estéril y una vez con 20 mi de agua estéril que contenía glicerol 10%. Las células se suspendieron en 300 µ? de agua que contenía glicerol 10%. 40 µ\ de células competentes se utilizaron en una electroporacion. La electroporacion se realizó con un generador de impulsos de E. coli BioRadMR utilizando cubetas de 0.2 cm y 2.5 kV. El producto purificado de la PCR (1.5 µ?) se adicionó a las células competentes, se mantuvo sobre hielo durante 1 minuto e inmediatamente después de la electroporacion, se adicionaron 2 mi del medio caliente SOB a las células y la mezcla se incubó a 37 °C durante 1 hora. Las células se colocaron en placas sobre el medio LB que contenía kanamicina (25 jUl/ml) . 100 pg del plasmido grande resistente a kanamicina (GTU-multiHIV C-clade) se utilizaron como un control positivo, no se adicionó plasmido al control negativo. La eficiencia de transformación fue 10e para AGI y 107 para JM109 para el control positivo. ?G? hubo colonias en la placa de control negativo, se obtuvieron 215 colonias en la placa de JM109+producto de la PCR, 70 colonias en la placa de AGl+producto de la PCR y 50 colonias en la placa de DH5alfa Tl+producto de la PCR. Ejemplo 4 Prueba de las cepas de E. coli DH5alfa Ti AaraD, AGlAaraD y JM109AaraD Las colonias obtenidas de la electroporación descritas en el ejemplo 2 se sometieron a prueba por la presencia del gen de resistencia a kanamicina por medio de la PCR de colonias utilizando los cebadores araVlisF (5' CGGCACGAAGGAGTCAACAT 3'; SEC ID NO. 14) y araVlisR (5' TGATAGAGCAGCCGGTGAGT 3'; SEC ID NO. 15) los cuales contienen sitios de hibridación en el gen araD cerca del sitio de inserción. Se esperaba un producto de la PCR de 272 pb de las cepas de E. coli DH5alfa TI, AGI y JM109 sin la inserción en el gen araD y un producto de 1545 pb, si el producto de la PCR había sido insertado en el gen araD. Tres colonias de DH5alfa TI AaraD, nueve colonias de AGlAaraD y 14 colonias de JM109AaraD de las 15 colonias se supervisaron y cada una proporcionó el producto de 1545 pb. Por lo tanto, se concluyó que estas cepas contuvieron la inserción del gen de resistencia a kanamicina. Para confirmar la inserción del gen de kanamicina, se utilizó otra PCR de colonias utilizando los cebadores kanaSF (5 ' TCAGATCCTTGGCGGCAAGA3 ' ; SEC ID NO. 16) y araVR (5 ' TGTAATCGACGCCGGAAGGT3 ' SEC ID NO. 17). Estos cebadores dan por resultado un producto de 435 pb, si el gen de resistencia a kanamicina ha sido insertado en el gen raD . Seis colonias de las cepas AGlAaraD y JM109AaraD y tres colonias de las cepas DH5alfa TI ÁaraD se sometieron a prueba y todas proporcionaron el producto correcto. Seis colonias de AGlAaraD y JM109AaraD y tres colonias de DHBalfa TI AaraD se colocaron sobre el medio LB que contenía 25 jug/ml de kanamicina y se incubaron a 37°C durante toda la noche para eliminar el plásmido pKD46, el cual tenía un origen de replicación sensible a la temperatura. Las células se sometieron a prueba por la sensibilidad a ampicilina al colocarlas en placas de réplica sobre el medio LB y el medio LB que contenía ampicilina. Ninguna creció sobre el medio que contenía ampicilina y se concluyó que las bacterias ya no contenían el plásmido pKD46. La sensibilidad a arabinosa se sometió a prueba en las cepas producidas AGlAaraD y JM109AaraD . Una colonia de AGlAaraD y una colonia de JM109AaraD se inocularon cada una en 2 mi de LB. Los cultivos se desarrollaron durante 8 horas, se diluyeron 1:100 en el medio M9 que contenía glicerol 0.2%, 25 ¿g/ml de kanamicina, tiamina 0.01% (prolina 0.05% para JM109AaraD) y diferentes concentraciones de L-arabinosa se adicionaron en el medio de crecimiento. Los cultivos se desarrollaron durante toda la noche a 37 °C en una incubadora de agitación y se midió la OD6oo (tabla 1) .

Tabla 1. Prueba de sensibilidad a arabinosa % de L-arabinosa AGlAaraD OD6oo JM109AaraD OD60o 0 3.2 1.9 0.1 0.03 0.03 0.2 0.030 0.026 0.5 0.030 0.020 1 0.024 0.025 2 0.017 0.021 Como se puede observar a partir de la tabla 1, una cantidad tan insignificante como 0.1% de L-arabinosa es suficiente para inhibir el crecimiento de las cepas AaraD de la invención. La sensibilidad a arabinosa se sometió a prueba adicionalmente en AGlAaraD, DHSalfa TI AaraD y JMIOSAaraD como antes pero utilizando concentraciones más bajas de L-arabinosa. Los resultados se proporcionan en la figura 18. Como se puede observar en la figura 18, una cantidad tan insignificante como 0.0005% de L-arabinosa es suficiente para inhibir el crecimiento de las cepas AaraD de la invención. Adicionalmente, la sensibilidad a L-arabinosa se sometió a prueba en el medio M9 y de extracto de levadura con diferentes concentraciones de glucosa y arabinosa (glucosa 0.2%, arabinosa 0.2%, arabinosa 2%) . Los cultivos se incubaron a 37 °C en una incubadora con agitación durante toda la noche. Entonces, la ODSOo se midió para cuantificar la densidad celular. Los resultados se proporcionan en la figura 19. Ambas concentraciones de arabinosa (0.2% y 2%) inhibieron el crecimiento de las cepas AaraD de la invención. Sin embargo, el crecimiento de las cepas con el gen aráD intacto no fue inhibido. Adicionalmente, el rendimiento de ADN de plasmido de las cepas AaraD se sometió a prueba. El plasmido S6wtdlEGFP/araD2 preparado en el ejemplo 1 se trasformó en las cepas AGlAaraD y JM109AaraD. Las células competentes se prepararon con las soluciones RF1 y F2 como se describe en el ej emplo 3. Las colonias de las placas de transformación se inocularon en 2 mi del medio M9 que contenía extracto de levadura 0.5% y 25 g/ro de kanamicina + tiamina 0.01% + L-arabinosa (2% y 0.2%) . Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 17 horas. Entonces, la OD6oo se midió para cuantificar la densidad celular y el ADM de plásmido fue extraído con el equipo Qiagen Miniprep. El coeficiente 2.8 (ODS00/ml) se utilizó para el aislamiento mini-preparativo para obtener resultados comparables. Los resultados se muestran en la tabla 2. La concentración de ADM se midió con un espectrofotómetro como OD a 260 nm. Para el análisis microscópico se aplicó una gota de producto bacteriano sobre un portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos. El cultivo se inspeccionó visualmente a un aumento de lOOx con un objetivo en inmersión en aceite. Tabla 2. Rendimiento de ADN de plásmido de las cepas AaraD Cepa L-arabinosa OD60, Conc. de ADN Rendimiento de ADN Apariencia (%) de Plásmido de plásmido (µ9 por en el (µ?/µ?) mi de cultivo) microscopio AG1 AaraD 2 7.6 0.039 5.3 sin filamentos AG1 AaraD 0.2 5.8 0.057 5.9 sin filamentos JM109AaraD 2 4.9 0.043 3.8 muy pocos filamentos JM109AaraD 0.2 4.3 0.038 2.9 muy pocos filamentos DH5ccT1 AaraD 6.6 0.017 3.5 sin filamentos DH5ocT1 AaraD 0.2 6.4 0.016 3.4 sin filamentos De acuerdo con estos resultados, es suficiente 0.2% de L-arabinosa para obtener el número de copias de plásmido al mismo nivel como con 2% de arabinosa. Para este plásmido AGlAaraD parece ser mejor, debido a que el rendimiento de plásmido es algo más alto y las densidades celulares también. Ejemplo 5 Generación de una cepa de Escherichia coli con mutaciones adicionales dentro de los genes que codifican potencialmente la L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa El cromosoma de E. coli contiene dos secuencias de codificación adicionales para las L-ribulosa-5-fosf to-4-epimerasas en diferentes operones. Los genes ulaF y sgbE de la vía de degradación de L-ascorbato codifican los genes con actividad de epimerasa ( en Shan Yew, Jhon A. Gerlt, J. Bacteriol. 184 (2002) 302-306. A fin de incrementar la exactitud de la selección y de evitar o separar los posibles mecanismos de adaptación de las cepas de E. coli debido a otros genes con actividad de epimerasa, se alteraron las secuencias de codificación de los genes UlaF y SgbE en el genoma de E. coli. Estos mecanismos de adaptación podrían ocurrir en la producción de plásmidos a largo plazo bajo condiciones adecuadas . Los genes UlaF y SgbE en las cepas de E. coli DH5alfaTlAaraD y AGlAaraD fueron alterados utilizando el sistema de recombinación de fagos ? Red como se describe en el ejemplo 3. Primero, el gen de resistencia a kanamicina en las cepas de E. coli AGlAaraD y DH5aTlAaraD se eliminó. El plásmido de expresión de FLP recombinasa pKD20 (Datsenko y Wanner, supra) es resistente a ampicilina y sensible a la temperatura. Los imitantes resistentes a kanamicina se trasformaron con pCP20 (el gen resistente a kanamicina es flanqueado por FRT) y transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C (48 horas) , después de lo cual las mismas colonias se purificaron de manera no selectiva a 42 °C (24 horas dos veces) . Entonces se sometieron a prueba por la pérdida de resistencia a kanamicina y ampicilina. La inactivación del gen cromosómico UlaF (SEC ID NO. 20) por medio del sistema de recombinación de fagos ? Red se realizó utilizando los cebadores ulaFylem y ulaFalum: ulaFylem CAGCAGGTATTTGAAGCCAACATGGAGCTGCCGCGCTACG- GGCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEC ID NO. 21) ulaFalum AAACGGCTGCGGAATTAGACCAGTTATCTCCCGAGGAAGGAAA TTAATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEC ID NO.22) Se observaron muchas colonias en ambas placas de transformación. Quince colonias obtenidas de la electroporación se sometieron a prueba por la presencia del gen de resistencia a kanamicina por medio de la PCR de colonias utilizando los cebadores ulaFvalisR y ulaFvalisF: ulaFvalisR AAACGGCTGCGGAATTAGACC (SEC ID NO. 23) ulaFvalisF GCCGTACCTGATTGAGATGTGGAG (SEC ID NO. 24) Estos cebadores contienen sitios de hibridación en el gen UlaF cerca del sitio de inserción. Se esperaba un producto de la PCR DE 864 pb de las cepas de E. coli DH5alfaTlAaraD y AGl araD sin inserción en el gen UlaF y un producto de 1527 pb, si el producto de la PCR había sido insertado en el gen UlaF. Para confirmar la inserción del gen de kanamicina se realizó otra PCR de colonias utilizando los cebadores ulaFvalisR (SEC ID NO 23) y kanaSF (SEC ID NO 16) .

Estos cebadores dan por resultado un producto de 428 pb, si el gen de resistencia a kanamicina ha sido insertado en el gen UlaF . Cuatro colonias de las cepas AGlAaraDÁulaP y DH5alfaTlAaraDAulaF se sometieron a prueba y todas tuvieron el producto correcto. Una colonia de cada cepa se utilizó adicionalraente . La eliminación del gen de resistencia a kanamicina en las cepas de E. coli AGlAaraDAulaF y DH5alfaTlAaraDÁulaF se realizó como se describiera anteriormente. La inactivación del gen cromosómico sgbE (SEC ID NO. 25) por medio del sistema de recombinación de fagos ? Red se realizó como se describe en el ejemplo 3. Los cebadores utilizados fueron sgbEalum y sgbEylem: sgbEalum CGTTACAGCAAGGAACATATCAATTCGTAGTGCCGGGGCGATG AAGAATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEC ID NO. 26) sgbEylem GCAGGAGGCTGGATTTATATGTTAGAGCAACTGAAAGCCG- ACGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEC ID NO. 27) Se observaron muchas colonias en ambas placas de transformación. Quince colonias obtenidas de la electroporación se sometieron a prueba por la presencia del gen de resistencia a kanamicina por medio de la PCR de colonias utilizando los cebadores sgbEvalisR y sgbEvalisF: sgbEvalisR CGGCGTTACAGCAAGGAACATATC (SEC ID NO.28) sgbEvalisF ATTGAAGCGCGTATGCAGGAGG (SEC ID NO.29) Se esperada un producto de la PCR de 792 pb de las cepas de E. coli DH5alfa lAaraOAulaFAsgbE y AGlAaraOAulaFAsgbE sin inserción en SgbE y un producto de 1413 pb, si el producto de la PCR habia sido insertado en el gen SgbE. Para confirmar la inserción del gen de kanamicina, se realizó otra PCR de colonias utilizando los cebadores sgbEvalisR (SEC ID NO. 28) y kanaSF (SEC ID NO. 16) : Quince colonias de ambas cepas se sometieron a prueba y cuatro proporcionaron el producto correcto. La sensibilidad a arabinosa se sometió a prueba en las cepas de E. coli DH5alfaTlAaraDAulaFAsgjbE y AGlAaraDÁuJaFÁsgjE producidas y comparadas con aquellas de las cepas de E. coli DH5alfaHAaraD y AGlAaraD. Una colonia de cada cepa se inoculó en 2 mi del medio M9 que contenia extracto de levadura 0.5%, 25 µ^/ta? de kanamicina, 0.2% de glucosa únicamente o L-arabinosa 0.2% o 2%, respectivamente. Los resultados se muestran en la tabla 3. Tabla 3. Prueba de sensibilidad a arabinosa Cepa OD600 Glc OD600 GIC+ OD600 Glc+ L-arabinosaO.2% L-arabinosa 2% AG1 AaraD 7.3 0.82 0.26 DH5alfaT1 7.7 0.95 0.35 AaraD AGlAaraD 8.3 0.82 0.35 AulaFAsgbE DH5aifaT1 7.5 0.75 0.28 AaraDAulaF AsgbE Como se puede observar a partir de la tabla 3, no hubo diferencias esenciales en la sensibilidad a arabinosa en las cepas de la invención. De manera similar, cuando el rendimiento de ADN de plásmido de las cepas AaraD y AaraDAulaFAsgbE se sometió a prueba como se describe en el ejemplo 3 (no se muestran los resultados) , no se descubrieron diferencias entre las cepas de E. coli AGlAaraD y AGlAaraDAulaFAsg E o DH5alfaTlAaraD y DH5alfaTlAaraDAulaFAsgjbE . Ejemplo 6 Estabilidad de S6wtdlEGFP/araD2 Una característica importante del vector de vacunación es la estabilidad durante la propagación en células bacterianas . Para someter a prueba la estabilidad de S6wtdlEGFP/araD2 en bacterias, el plásmido se trasformó en cepas E. coli AGlAaraD y JM109AaraD preparadas en el ejemplo 3 y la incolumnidad del vector fue seguida por el análisis de ADN de plásmido durante cuatro generaciones . El plásmido S6wtdlEGFP/araD2 se mezcló con las células competentes de E. coli AGlAaraD y JM109AaraD y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Subsecuentemente, la suspensión celular se sujetó a un golpe térmico durante 3 minutos a 37 °C seguido por un enfriamiento rápido sobre hielo. Se adicionó un mililitro del medio LB a la muestra y la mezcla se incubó durante 45 minutos a 37°C con agitación vigorosa.

Finalmente, una porción de las células se colocó sobre platos con medio M9 que contenían extracto de levadura 0.5%, L-arabinosa 2% y 25 //g/ml de kanamicina. Al siguiente día, las células de una colonia se transfirieron al nuevo plato que contenía el mismo medio. Este procedimiento se repitió hasta que se habían desarrollado cuatro pasajes de bacterias. Dos colonias de cada pasaje de ambas cepas bacterianas se utilizaron para inocular 2 mi del medio M9 que contenía extracto de levadura 0.5%, L-arabinosa 2% y 25 /g/ml de kanamicina incubado durante toda la noche a 37 °C con agitación vigorosa. Las células se recolectaron y el ADN de pl smido se extrajo de las bacterias utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) . Las muestra de ADN de plásmido antes (figura 9) y después de la digestión con la endonucleasa de restricción HindIII (figura 10) (Fermentas, Lituania) se analizaron por medio de la electroforesis de gel de agarosa en comparación con el ADN de S6wtdlEGFP/araD2 original utilizada para la transformación (como control en las figuras 9 y 10) . El ADN lambda digerido con EcoRI/HindIII (Fermentas, Lituania) se utilizó como un marcador de peso molecular (M3 en la figura 10) . Las muestras se digirieron con HindIII como se muestra en la figura 10A para la cepa de E. coli AGlAaraD y en la figura 10B para la cepa de E. coli JM109AaraD, se observaron patrones idénticos para el ADN de plásmido de S6wtdlEGFP/araD2 original. Los tamaños pronosticados de los fragmentos resultantes de la digestión con HindIII son 3274, 1688 y 1510 pb . Se puede concluir que el vector de vacunación S6wtdlEGFP/araD2 es estable cuando se propaga en cepas de E. coli AGIAaraD y JM109AaraD. Ejemplo 7 Comparación de un sistema de selección de antibióticos con el sistema de selección de L-arabinosa de la invención En la comparación de un sistema de selección de antibióticos con el sistema de selección de L-arabinosa de la invención, se utilizaron los siguientes medios de crecimiento. Para AGI de E. coli que lleva el plásmido p2 MG C #11: Medio 1: Medio M9 más extracto de levadura 0.5%, glucosa 0.2% y 25 /¿g/ml de kanamicina (medio selectivo); Medio 2: Medio M9 más extracto de levadura 0.5% y glucosa 0.2% (medio no selectivo); Medio 3: Medio M9 más extracto de levadura 0.5%, L-arabinosa 0.2% y 25 /g/ml de kanamicina; (medio selectivo); y Medio 4: Medio M9 más extracto de levadura 0.5% y L-arabinosa 0.2% (medio no selectivo). Para GlAaraD de E. coli que lleva el plásmido paraD MG C #145: Medio 5: Medio M9 más extracto de levadura 0.5%, L-arabinosa 0.2% y 25 µg/ml de kanamicina (medio selectivo); y Medio 6: Medio M9 más extracto de levadura 0.5%, glucosa 0.2% y 25 µg/ml de kanamicina (medio no selectivo). Los plásmidos p2 MG C #11 (figura 20) y paraD MG C #145 (figura 21) se transformaron en AGI de E. coli y en AGlAaraD de E. coli que lleva una mutación C a T en el codón 8. Las colonias bacterianas, transformadas se desarrollaron a 37°C durante toda la noche en una incubadora. A la mañana siguiente, las colonias se inocularon en los medios líquidos ya sea selectivos o no selectivos como se indicara anteriormente. Los cultivos inoculados se desarrollaron en un agitador en 2 mi del medio respectivo hasta que alcanzaron la fase estacionaria y la densidad de los cultivos se midió a ODgoo- El plásmido se extrajo de los cultivos y el rendimiento de ADN de plásmido se determinó por medio de la medición del ADN de plásmido a 260 nm. El rendimiento de plásmido se calculó en base a que 50 µ< produce una densidad óptica de 1 a 260 nm. Entonces, una alícuota de 20 µ? de los cultivos estacionarios se inoculó en un medio fresco (dilución de 100 veces) y los cultivos se desarrollaron hasta la fase estacionaria (8-12 horas) . La densidad de los cultivos se midió a OD6oo/ el plásmido se extrajo y el rendimiento se determinó y, nuevamente, una alícuota se inoculó en 2 µ? del medio líquido. Este procedimiento se repitió 7 veces (preparaciones 1 a 7) . Los resultados del experimento se proporcionan en la tabla 5 a continuación. Tabla 5. Comparación de un sistema de selección de antibióticos con el sistema de selección de L-arabinosa de la invención Se puede concluir a partir de estos datos que un plásmido que lleva el gen de resistencia a kanamicina y que confiere a E. coli la resistencia en presencia de kanamicina se pierde en los pasos consecutivos de dilución/crecimiento del cultivo bajo condiciones no selectivas asi como también bajo condiciones selectivas. El rendimiento del plásmido de 1 mi de cultivo cae 3 veces bajo las condiciones selectivas y 10 veces bajo las condiciones no selectivas en el séptimo periodo de dilución (preparaciones l/l contra 1/7 y 2/1 contra 2/7, respectivamente, en la tabla 5) . El mismo resultado básico se obtiene cuando la fuente de carbono para ?. coli que lleva un plásmido con resistencia a kanamicina es L-arabinosa en lugar de glucosa (preparaciones 3/1 contra 3/7 y 4/1 contra 4/7, respectivamente, en la tabla 5) . Sin embargo, cuando el sistema de selección de araD de la invención se utiliza en el plásmido, el rendimiento de ADN de plásmido es alto bajo las condiciones tanto selectivas (preparación 5/1 contra 5/7 en la tabla 5) como no selectivas (preparación 6/1 contra 6/7 en la tabla 5) . Bajo condiciones tanto selectivas como no selectivas , el rendimiento de ADN de plásmido cayó sobre 7 generaciones aproximadamente 20%. Esto indica claramente que los plásmidos que llevan el sistema de selección de araD de la invención son mucho más estables y se desarrollan eficientemente bajo condiciones selectivas así como también no selectivas . Ejemplo 8 Fermentación alimentada por lotes de AGlAaraD S6 tdlEGFP/araD2 El sistema de selección basado en el gen araD también se sometió a prueba en la fermentación alimentada por lotes con el propósito de la producción de bacterias que contenían plásmidos . Una colonia individual se recolectó de la placa de AGlAaraD SSwtdlEGFP/araD2 y se inoculó en 250 mi del medio M9 que contenía extracto de levadura 0.5%, L-arabinosa 0.2% y 25 g/ml de kanamicina y se incubó durante toda la noche a 37°C con agitación vigorosa. Después de 18 horas, la OD600 del inoculo fue 6.4. Se adicionaron ISO mi del inoculo al fermentador que contenía 5 1 de medio de inicio de fermentador (8 g/1 de H2P04; 10 g/1 de NaCl; 5 g/1 de N¾C1; 5 g/1 de extracto de levadura; 2 g/1 de L-arabinosa; 2 g/1 de MgS04, 25 mg/1 de kanamicina y 0.1 g/1 de tiamina; pH 6.7 con NH4OH) . Después de 5.5 horas de crecimiento, la alimentación automática se inició con la velocidad de crecimiento dada de 0.15 h"1 (permite un crecimiento limitado por la fuente de carbono) con el medio de alimentación del fermentador (300 g/1 de L-arabinosa; 150 g/1 de extracto de levadura; 50 mg/1 de kanamicina; 0.2 g/1 de tiamina). La velocidad de alimentación fue controlada por computadora de acuerdo con la formula F (t) donde myS es la velocidad de crecimiento deseada, Sin es la cantidad de fuente de carbono adicionada en el punto de tiempo y Sf es la concentración de fuente de carbono en el medio de alimentación. El crecimiento fue seguido por la medición de la OD60o y se tomaron muestras para el ADN de plásmido. Los datos registrados durante la fermentación son representados en la figura 11. La fermentación se terminó cuando se consumió 1 1 del medio de alimentación. La OD6oo final fue 45. La masa bacteriana se recolectó por medio de la centrifugación y se lavo una vez con 2 1 de amortiguador STE. El rendimiento de la biomasa bacteriana fue 410 g en peso húmedo. Los datos para el contenido de ADN de plásmido se muestran en la tabla 6. Tabla 6. Rendimiento de ADN de plásmido durante la fermentación de AGlAaraD S6 tdlEGFP/araD2 Tiempo OD, 600 Conc. de ADN de Rendimiento de ADN de plásmido {µ 1 ) plásmido (/¿g por mi de cultivo) Inoculo 6.4 0.04 4.6 4 horas 3.1 0.02 1.1 21 horas 28 0.1 50 24 horas 37 0.13 87 29 horas 45 0.14 113 Los datos en la tabla 6 indican que el sistema de selección de L-arabinosa funciona muy bien a altas densidades celulares. Esto es probablemente debido a que más copias de plásmido en la célula bacteriana proporcionan una ventaja en las condiciones de limitación de L-arabinosa al hacer posible que la bacteria utilice azúcar más rápidamente. Ejemplo 9 Purificación de AGlAaraD S6wtdlEGFP/araD2 La purificación de AGlAaraD S6wtdlEGFP/araD2 se realizó como se muestra (figura 12) : a) Preparación de la alimentación El lisado claro se preparó de acuerdo con Qiagen's Plasmid Purificaticn Handbook, excepto que no se utilizó ARNasa. 200 g de la pasta de células de E. coli se resuspendieron en 2000 mi de amortiguador de resuspensión y después se utilizaron volúmenes iguales de P2 y P3 para la lisis y la neutralización. Los restos de células se removieron por medio de la centrifugación a 6000 g durante 30 minutos a 4°C. El lisado claro se vertió a través de una toalla de papel, 1/10 de Tritón X-114 10% (Sigma) se adicionó y la solución se dejó sobre hielo durante 1 hora. (Se ha mostrado que Tritón X-114 reduce de manera efectiva el nivel de endotoxinas en la proteina, Liu y colaboradores, Clinical Biochemistry, 1997) . Después de una hora, los ácidos nucleicos se precipitaron con 0.6 volúmenes de isopropanol frío. El sobrenadante se decantó y el producto precipitado se almacenó durante toda la noche a -20 °C. b) Purificación de ADN de plásmido La purificación de ADN de plásmido se realizó de acuerdo con el proceso de purificación de plásmidos superenrollados de tres pasos de Amersham Pharmacia, donde se adoptaron algunas modificaciones. Paso 1. El producto precipitado se disolvió nuevamente en 1500 mi de TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM; pH 8.0) y se cargaron para la remoción de AEM y el intercambio de amortiguador en Eepharose 6 FF™1 (Amersham Pharmacia) , equilibrado previamente con el amortiguador A--(NH4)2S04 2M, Tris-CL 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5 Paso 2. El volumen vacío se dirigió a la columna PlasmidSelect"11 (Amersham Pharmacia) (equilibrada con el amortiguador A) y después del lavado y la elución con el amortiguador B2 (NaCl 1.6 M, ( H4)2S04 2M, Tris-Cl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5), se capturó el ADN de plásmido superenrollado. Paso 3. El plásmido eluido se diluyó con cinco volúmenes de agua deshionizada, destilada y se cargó a SOU CE 30QMR (Amersham Pharmacia) equilibrada con el amortiguador Cl (NaCl 0.4 M, Tris-Cl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5). Después del lavado, el plásmido purificado se eluyó con el amortiguador C2 (NaCl 1 M, Tris-Cl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5) y el pico de elución se recolectó. El tamaño de fracción fue 150 mi y contuvo 100 mg del plásmido S6wtdlEGFP/araD2 (<10 EU/mg) libre de endotoxinas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un sistema de selección, caracterizado porque comprende una célula bacteriana deficiente en un gen araD en la cual un vector que lleva un gen araD o un fragmento catalíticamente activo del mismo ha sido adicionado como un marcador de selección. 2. Un sistema de selección de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen araD es el gen L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (EC 5.1.3.4.). 3. Un sistema de selección de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el gen araD del vector es mutado. 4. Un sistema de selección de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la mutación introduce un codón de detención en la posición 8 del gen araD. 5. Un sistema de selección de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula bacteriana es una célula de Escherichia coli. 6. Un sistema de selección de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la cepa de E. coli es una cepa de E. coli JM109. 7. Un sistema de selección de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la cepa de E. coli es una cepa de E. coli DH5 alfa-Tl. 8. Un sistema de selección de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la cepa de E. coli es una cepa de E. coli AGI. 9. Un sistema de selección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado porque la cepa de E. coli es deficiente en el gen araD. 10. Un sistema de selección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado porque la cepa de E. coli es deficiente en el gen araD y el gen ula . 11. Un sistema de selección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado porque la cepa de E. coli es deficiente en el gen araD y el gen sgbE. 12. Un sistema de selección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado porque la cepa de E. coli es deficiente en el gen araD, el gen ulaF y el gen sgb . 13. Un vector, caracterizado porque comprende un gen araD mutado con un codón de detención en la posición 8 o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección. 14. Un vector de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el vector es un vector de expresión que comprende : (a) una secuencia de ADN que codifica una proteina de fijación nuclear unida operativamente a un promotor heterólogo, la proteína de fijación nuclear que comprende (i) un dominio de enlace de ADN que se enlaza a una secuencia de ADN específica y (ii) un dominio funcional que se enlaza a un componente nuclear o un equivalente funcional del mismo; y b) una secuencia de ADN multimerizada que forma un sitio de enlace para la proteína de fijación nuclear, en donde el vector carece de un origen de replicacion de virus de papiloma, c) el gen araD mutado o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección. 15. Un vector de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el vector es un vector de expresión que comprende : a) una secuencia de ADN que codifica una proteína de fijación nuclear unida operativamente a un promotor heterólogo, en donde la proteína de fijación nuclear es la proteína E2 del virus de papiloma bovino tipo 1 (BPV) , y b) una secuencia de ADN multimerizada que forma un sitio de enlace para la proteína de fijación nuclear es de múltiples sitios de enlace de la proteína E2 de BPV incorporados en el vector como un cúmulo, donde los sitios pueden ser como estructuras de cabeza-cola o pueden incluirse en el vector por medio de la colocación separada, en donde el vector carece de un origen de replicación de virus de papiloma, y c) el gen araD mutado o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección. 16. Un vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende adicionalmente una supresión en la secuencia de ADN multimerizada . 17. Un vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende adicionalmente una mutación en la secuencia S ine-Dalgarno . 18. Un sistema de selección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque comprende un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17. 19. El uso de un vector que comprende un gen araD, una forma mutada de un gen araD o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección en un sistema de selección. 20. El uso de un vector de conformidad con la reivindicación 19 en un sistema de selección, en donde el vector es un vector de expresión que comprende: (a) una secuencia de ADN que codifica una proteína de fijación nuclear unida operativamente a un promotor heterólogo, la proteina de fijación nuclear que comprende (i) un dominio de enlace de ADN que se enlaza a una secuencia de ADN específica y (ii) un dominio funcional que se enlaza a un componente nuclear o un equivalente funcional del mismo; y b) una secuencia de ADN multimerizada que forma un sitio de enlace para la proteína de fijación nuclear, en donde el vector carece de un origen de replicación de virus de papiloma, y c) el gen araD, una forma mutada de un gen araD o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección. 21. El uso de un vector de conformidad con la reivindicación 20 en un sistema de selección, en donde el vector es un vector de expresión que comprende: a) una secuencia de ADN que codifica una proteína de fijación nuclear unida operativamente a un promotor heterólogo, en donde la proteína de fijación nuclear es la proteína E2 del virus de papiloma bovino tipo 1 (BPV) , y b) una secuencia de ADN multimerizada que forma un sitio de enlace para la proteína de fijación nuclear es de múltiples sitios de enlace de la proteína E2 de BPV incorporados en el vector como un cúmulo, donde los sitios pueden ser como estructuras de cabeza-cola o pueden incluirse en el vector por medio de la colocación separada, en donde el vector carece de un origen de replicación de virus de papiloma, y c) el gen araD, una forma mutada de un gen araD, una secuencia complementaria del mismo o un • fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección. 22. El uso de un vector de conformidad con la reivindicación 21 en un sistema de selección, en donde el vector comprende adicionalmente una supresión en la secuencia de ADN multimerizada. 23. El uso de un vector de conformidad con la reivindicación 21 en un sistema de selección, en donde el vector comprende adicionalmente una mutación en la secuencia Shine-Dalgarno . 2 . El uso de un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-23 en un sistema de selección de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12. 25. La cepa de E. coli DH5alfa-Tl, caracterizada porque es deficiente en el gen araD y el gen uláF. 26. La cepa de E. coli DH5alfa-Tl, caracterizada porque es deficiente en el gen araD y el gen sgbE. 27. La cepa de E. coli DH5alfa-Tl, caracterizada porque es deficiente en el gen araD, el gen ulaF y el gen sgbE . 28. La cepa de E. coli AGI, caracterizada porque es deficiente en el gen araD y el gen ulaF . 29. La cepa de E. coli AGI, caracterizada porque es deficiente en el gen araD y el gen sgbE. 30. La cepa de ?. coli AGI, caracterizada porque es deficiente en el gen araD, el gen ulaF y el gen sgbE. 31. La cepa de E. coli JM109, caracterizada porque es deficiente en el gen araD y el gen ulaF. 32. La cepa de E. coli JM109, caracterizada porque es deficiente en el gen araD y el gen sgbE. 33. La cepa de E. coli JM109, caracterizada porque es deficiente en el gen araD, el gen ulaF y el gen sgbE. 34. El uso de la cepa de E. coli DH5alfa-Tl deficiente en el gen araD y el gen ulaF en un sistema de selección. 35. El uso de la cepa de E. coli DH5alfa-Tl deficiente en el gen araD y el gen sgbE en un sistema de selección. 36. El uso de la cepa de E. coli DH5alfa-Tl deficiente en el gen araD, el gen ulaF y el gen sgbE en un sistema de selección. 37. El uso de la cepa de E. coli AGI deficiente en el gen araD y el gen ulaF en un sistema de selección. 38. El uso de la cepa de E. coli AGI deficiente en el gen araD y el gen sgbE en un sistema de selección. 39. El uso de la cepa de E. coli AGI deficiente en el gen araD, el gen ulaF y el gen sgbE en un sistema de selección . 40. El uso de la cepa de E. coli JM109 deficiente en el gen araD y el gen ulaF en un sistema de selección. 41. El uso de la cepa de E. coli JM109 deficiente en el gen araD y el gen sgbE en un sistema de selección. 42. El uso de la cepa de E. coli JM109 deficiente en el gen araD, el gen ulaF y el gen sgbE en un sistema de selección. 43. Un ' método para seleccionar las células transformadas con un plásmido que contiene un gen araD o un fragmento catalíticamente activo del mismo como un marcador de selección y el gen de interés, el método está caracterizado porque comprende insertar el plásmido en la célula hospedante deficiente en el gen araD y el crecimiento de las células en un medio de crecimiento que contiene arabinosa. 44. Un método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el gen araO es el gen L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (EC 5.1.3.4.). 45. Un método de conformidad con la reivindicación 43 o 44, caracterizado porque el gen araD es mutado. 46. Un método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la mutación introduce un codón de detención en la posición 8 del gen araD.