JP2003503020A - バイオテクノロジーの適用のための迅速に増殖する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規の迅速に増殖する微生物、および核酸分子のクローニングまたはサブクローニングにおけるそれらの使用方法を提供する。本発明の迅速に増殖する微生物は、分子生物学において代表的に使用される微生物よりも迅速にコロニーを形成し、そして従って、分子生物学において広範囲に使用されるインビトロでのクローニング方法における顕著な改善を提供する。本発明はまた、本発明の方法において使用されるキットおよび組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本願は、バイオテクノロジーの分野に関し、そして特に、クローニングおよび
タンパク質発現の分野に関する。

【０００２】 （関連技術） 進行中のバイオテクノロジー革命を支持する基本的なプロセスは、ＤＮＡ分子
のさらなる分析または使用のための、ＤＮＡ分子のクローニングである。ＤＮＡ
分子のクローニングは、何年もの間にわたって当該分野で行われている。代表的
なクローニングプロトコールは、所望されるＤＮＡ分子を同定すること、ＤＮＡ
分子、ベクター、および適切なリガーゼ酵素の混合物中でＤＮＡ分子とベクター
とを連結することによって組換えベクターの集団を調製すること、コンピテント
な微生物中に組換えベクターの集団を形質転換すること、コロニーの形成を可能
にするために十分な時間にわたり微生物を増殖させること、ベクター中に正確に
連結された所望のＤＮＡ分子をおそらく含む微生物のコロニーを選択すること、
組換えベクターを単離するために、それぞれの選択されたコロニーの十分な量を
増殖させること、ベクターが所望されるＤＮＡ分子を含むことを確認するために
単離したベクターを分析すること、そして次いで、引き続き必要とされるいかな
る操作をも実施するために、正確な組換えベクターを含む微生物の十分な量を増
殖させることを包含する。種々のクローニング手順の詳細については、読者は、
特に、本明細書中で参考として援用されている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｅｒｂｏｒ、ＮＹを参照し得る。

【０００３】 このような上記に概説されている代表的なクローニングプロトコールは、微生
物の増殖工程を含む、少なくとも３つの工程を包含する。これらの増殖工程は、
一般的には、１２〜１６時間を必要とし、そして通常は一晩のインキュベーショ
ンとして行われるので、ＤＮＡフラグメントのクローニングを含む実験の律速工
程は、微生物の増殖を必要とする工程である。基本的なクローニングの実施につ
いての多くのバリエーションが存在するが、実質的に全てのクローニング方法が
、微生物への目的のＤＮＡ分子の挿入、およびその微生物の増殖を必要とし、そ
して従って、実質的に全てのクローニング方法論の速度は、クローニングのため
に使用される微生物の増殖速度によって制限される。

【０００４】 ほとんどのクローニングの適用について、選択される微生物は、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。多数のＥ．ｃｏｌｉの株が公知
であるが、ほとんどのクローニングの適用は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の１つ
または別の誘導体を使用する。これらの誘導体は、上記で考察した緩徐な増殖速
度に悩まされている。他の公知のＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株
（ＡＴＣＣ９６３７）が、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２と比較した場合には迅速に増殖
するが、しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗの野生型株および他の迅速に増殖する株は、
いくつかの理由のためにバイオテクノロジーの適用には適切ではない。第１に、
その微生物の遺伝学が、クローニングの適用に必要とされる詳細なレベルまで決
定されていない、従って、当業者は、微生物をバイオテクノロジーの適用に適切
であるようにさせる、多数の遺伝子の適切な改変を微生物のゲノムが含むかどう
かが分からない。例えば、微生物は、一般的には、プラスミド多量体の形成を導
くｒｅｃＡ⁺であり、そしてこれは、微生物を、プラスミドの単離を含む適用に
はあまり適切ではないようにさせる。微生物は、代表的には、多数のプロテアー
ゼ遺伝子を含み、そして過剰発現されたタンパク質を分解し得、それによって所
望されるタンパク質産物の収量を減少させる。微生物は代表的には、α相補を許
容しないｌａｃオペロンを含み、従って、組換えベクターの同定がより困難であ
る。さらに、多くの微生物は、クローニングの適用に必須のプラスミド単離工程
を複雑にする、内因性プラスミドを含む。最後に、微生物は、外因性のプラスミ
ドの分解を引き起こし得る、ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含み得る。

【０００５】 多数のバイオテクノロジーの適用について、適用の開発における重要な工程は
、ＤＮＡの１つ以上のフラグメントをクローニングすることを含む。バイオテク
ノロジー産業の発展におけるクローニングの中心的な役割を考慮すると、クロー
ニングのプロセスを加速する試薬の必要性が、長期にわたって当該分野に存在し
ている。特に、所望の遺伝子型、および迅速な増殖速度を有し、そしてクローニ
ングプロセスを加速するために使用され得る微生物についての必要性が当該分野
において存在している。本発明は、この長期間にわたって残されている必要性を
満たす。

【０００６】 （発明の簡単な要旨） 本発明は、バイオテクノロジーの適用に現在使用されている微生物と比較して
、迅速な増殖速度によって特徴付けられる、バイオテクノロジーの適用のための
微生物を提供する。詳細には、本発明は、好ましくは内因性プラスミドを欠失し
ており、従ってクローニングの適用に適切である、迅速に増殖する微生物を提供
する。本発明の微生物は、クローニングの適用において現在使用されている微生
物よりも早くコロニーを形成するので、本発明は、所望される核酸分子のクロー
ニングにおける改善を提供し、それによってより迅速な組換えベクターおよび目
的のクローンの同定および単離を可能にする。

【０００７】 従って、本発明は、迅速に増殖する微生物を使用するクローニング方法を提供
する。この方法は、組換えベクターの集団を構築すること、組換えベクターの集
団を用いて、迅速に増殖し得るコンピテントな微生物を形質転換すること、目的
の１つ以上の組換えベクターを含有している形質転換された微生物を選択するこ
と、および／または形質転換された微生物から目的の１つ以上の組換えベクター
を単離することを伴なう。１つの実施形態においては、迅速に増殖する微生物は
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物である。別の実施形態においては、迅速に
増殖する微生物はＥ．ｃｏｌｉである。さらなる実施形態においては、迅速に増
殖する微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株である。好ましい実施形態においては、迅
速に増殖する微生物は内因性プラスミドを欠失する、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株である
。他の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、ＢＲＬ３７８１
、ＢＲＬ３７８４、およびそれらのｒｅｃＡ^-誘導体からなる群より選択される
。本発明のクローニング方法は、必要に応じて、微生物の増殖速度を増大させる
ために、形質転換された微生物を、上昇した温度（例えば、３７℃より高い温度
）で増殖させる工程を包含する。好ましい実施形態においては、形質転換された
微生物を、約４２℃で増殖させ得る。

【０００８】 本発明は、以下の工程を包含する、タンパク質またはペプチドを産生する方法
を提供する：目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を含有する組
換えベクターを構築する工程；迅速に増殖し得るコンピテントな微生物中にベク
ターを形質転換する工程；および形質転換された微生物に上記のタンパク質また
はペプチドを産生させるような条件下で、この形質転換された微生物を培養する
工程。好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ属の微生物である。別の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する
微生物はＥ．ｃｏｌｉである。別の好ましい実施形態においては、迅速に増殖す
る微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株である。他の実施形態は、ｌｏｎプロテアーゼ
を欠失している微生物を含む。いくつかの好ましい実施形態においては、微生物
は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）をコードする遺伝子を保有する。他
の好ましい実施形態においては、Ｔ７ ＲＮＡＰ遺伝子は、塩誘導性プロモータ
ーの制御下にある。別の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は
、内因性プラスミドを含まない。

【０００９】 本発明はまた、以下の工程を包含する、クローニングのための微生物を産生す
る方法を含む：内因性プラスミドを含有している迅速に増殖する微生物を得る工
程；および微生物の内因性プラスミドを取り除く（ｃｕｒｉｎｇ）工程。好まし
い実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の
微生物である。別の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物はＥ．
ｃｏｌｉである。別の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株である。本発明の関連する局面においては、以下を含むがこ
れらに限定されない、任意の所望される改変または変異が、本発明の微生物にお
いて作製され得る：ｒｅｃＡ１／ｒｅｃＡ１３またはｒｅｃＡの欠失のようなｒ
ｅｃＡ^-遺伝子型、ｌａｃＸ７４ ｌａｃＺΔＭ１５、または他のｌａｃＺの欠
失のようなα相補を可能にするｌａｃＺ^-遺伝子型、Δｌｏｎおよび／もしくは
ｏｍｐＴ^-のようなプロテアーゼ欠損遺伝子型、ｅｎｄＡ１のようなエンドヌク
レアーゼマイナス遺伝子型、Ｆ’エピソームを含むことによってＭ１３ファージ
感染に適切な遺伝子型、ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^-、ｍ_k ⁺）のような制限ネガティブ改
変ポジティブ遺伝子型、ｈｓｄＳ２０（ｒ_B ^-、ｍ_B ^-）のような制限ネガティブ改
変ネガティブ遺伝子型、ｍｃｒＡおよび／もしくはｍｃｒＢおよび／もしくはｍ
ｒｒのようなメチラーゼ欠損遺伝子型、ｄｅｏＲのような大きなプラスミドの取
り込みに適切な遺伝子型、ｓｕｐＥおよび／もしくはｓｕｐＦのようなサプレッ
サー変異を含有している遺伝子型。他の適切な改変が、当業者に公知であり、そ
してこのような改変は、本発明の範囲内であると考えられる。

【００１０】 本発明は、以下の工程を包含する、迅速に増殖し得るコンピテントな微生物を
形質転換する方法を提供する：組換えベクターを得る工程；および迅速に増殖す
る微生物に組換えベクターを取りこませる条件下で、この組換えベクターと本発
明のコンピテントな微生物を接触させる工程。好ましい実施形態においては、迅
速に増殖する微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物である。別の好まし
い実施形態においては、迅速に増殖する微生物はＥ．ｃｏｌｉである。別の好ま
しい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株である
。別の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、内因性ベクター
を欠失するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である。本発明の方法は、必要に応じて、微生物
の増殖速度を増大させるために、形質転換された微生物を、上昇した温度（例え
ば、３７℃より高い温度）で増殖させる工程を包含する。好ましい実施形態にお
いては、形質転換された微生物は、約４２℃で増殖させ得る。

【００１１】 本発明はまた、少なくとも１つの容器を収容し、かつ保持するように区画化さ
れている、キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）または入れ物（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）
を備えるキットをみ、ここでは、容器は、迅速に増殖する微生物を含む。キット
は、必要に応じて、クローニングに適切なベクターをさらに備える。好ましい実
施形態においては、キットは、組換えクローニングに適切なベクターを備え得る
。好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、コンピテントであり
得る。いくつかの好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、化学
的コンピテントであり得る。他の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する
微生物は、電気的コンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）であり得
る。いくつかの好ましい実施形態においては、本発明のキットは、制限酵素、リ
ガーゼ、および／またはポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、酵素を備
え得る。他の好ましい実施形態においては、本発明のキットは、組換えクローニ
ングのための組換えタンパク質を備え得る。本発明のキットはまた、本発明の方
法を実行するための指示書またはプロトコールを備え得る。

【００１２】 本発明は、迅速に増殖する微生物を含む組成物を包含する。好ましい実施形態
においては、迅速に増殖する微生物は、コンピテントな微生物であり得る。いく
つかの好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、化学的コンピテ
ントであり得る。他の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、
電気的コンピテントであり得る。本発明の組成物は、必要に応じて、緩衝液また
は緩衝化塩、１つ以上のＤＮＡフラグメント、１つ以上のベクター、１つ以上の
組換えベクター、１つ以上の組換えタンパク質、および１つ以上のリガーゼから
選択される少なくとも１つの成分を含有する。好ましい実施形態においては、本
発明の組成物は、グリセロール溶液中の迅速に増殖する微生物を含み得る。他の
好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、緩衝液中の迅速に増殖する微
生物を含み得る。好ましい実施形態においては、本発明の微生物は、コンピテン
ス（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）緩衝液中であり得る。他の好ましい実施形態におい
ては、本発明の組成物は、凍結乾燥した迅速に増殖する微生物を含み得る。

【００１３】 本発明は、以下の工程を包含する、コンピテントな迅速に増殖する微生物を作
製する方法を含む：迅速に増殖する微生物を得る工程；迅速に増殖する微生物を
増殖させる工程；およびコンピテントにするように、迅速に増殖する微生物を処
理する工程。本発明のいくつかの実施形態においては、微生物を処理する工程は
、塩化カルシウムを含有している溶液と微生物を接触させることを包含し得る。
他の実施形態においては、処理工程は、微生物を水と接触させることを包含し得
る。本発明の実施形態は、迅速に増殖する微生物の内因性プラスミドを取り除く
工程を包含し得る。好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物はＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物である。別の好ましい実施形態においては、迅速
に増殖する微生物はＥ．ｃｏｌｉである。別の好ましい実施形態においては、迅
速に増殖する微生物はＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である。

【００１４】 （発明の詳細な説明） （定義） 以下の記載においては、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語が、
広範囲にわたって利用される。このような用語に対して与えられる範囲を含む、
明細書および特許請求の範囲の明確であり、かつ、より一貫した理解を提供する
ために、以下の定義が提供される。

【００１５】 コンピテントな細胞またはコンピテントな微生物は、本明細書中で使用される
場合は、外因性のＤＮＡ分子を取り込みそして確立する能力を有している細胞ま
たは微生物をいう。コンピテントな細胞として、化学的な手段によってコンピテ
ントにされた細胞（すなわち、化学的コンピテント細胞）ならびに、低イオン強
度の緩衝液中への懸濁によってエレクトロポレーションについてコンピテントに
された細胞（すなわち、電気的コンピテント細胞）が挙げられるが、これらに限
定されない。

【００１６】 発現ベクターは、本明細書中で使用される場合は、宿主細胞中への形質転換ま
たはトランスフェクションの後に、その中にクローン化されている遺伝子または
遺伝子の一部の発現を増強し得るベクターをいう。クローン化された遺伝子は、
通常は、プロモーター配列のような特定の制御配列の制御下に配置される（すな
わち、作動可能に連結される）。このようなプロモーターとして、ファージλＰ _L プロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモータ
ー、Ｔ７プロモーター、およびバキュロウイルスポリへドロンプロモーターが挙
げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターが当業者に公知で
ある。

【００１７】 遺伝子は、本明細書中で使用される場合は、細胞中で転写されるヌクレオチド
の配列をいう。この用語は、タンパク質および／またはペプチドをコードする配
列、ならびにこのようなタンパク質またはペプチドをコードしない他の配列を含
む。タンパク質をコードしない遺伝子の例として、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどが挙
げられるが、これらに限定されない。遺伝子は、遺伝子の転写を制御するための
プロモーター配列を含む。遺伝子はまた、転写の量またはタイミングを調節する
他のＤＮＡ配列エレメントを含み得る。このような配列エレメントは、エンハン
サーなどを含むことが理解されるが、これに限定されない。

【００１８】 細胞または微生物は、本明細書中で使用される場合、遺伝子操作され得る微生
物を含み、そしてこの用語は、用語「宿主細胞」および「宿主細胞株」と互いに
互換的に使用され得る。グラム陰性およびグラム陽性の両方の原核生物細胞が、
本発明に従って使用され得る。本発明に従って使用され得る代表的な原核生物宿
主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（特に、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．（特に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰ．ｓｙｒｉｎｇ
ａｅ）、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（特に、Ｓ．ｔｙｐｈｉまたは
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の属の微生物のような微生物が挙げられるが、こ
れらに限定されない。もちろん、多くの適切な株が存在し、そしてそれぞれの宿
主細胞種の血清型が本明細書中に記載され、それらの全てが本発明に従って使用
され得ることが理解される。Ｅ．ｃｏｌｉが宿主細胞として好ましく、そして特
に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株に由来するＥ．ｃｏｌｉ株が好ましい。

【００１９】 本明細書中で使用される場合は、特定の微生物の「誘導体」は、特定の微生物
から直接または間接的に得られた遺伝物質を含有している、子孫または他のレシ
ピエント微生物である。このような誘導体微生物は、例えば、特定の微生物から
遺伝物質を除去し、そして続いて別の微生物（すなわち、子孫または他のレシピ
エント微生物）中に任意の従来の方法（形質転換、結合体化、エレクトロポレー
ション、形質導入などを含むが、これらに限定されない）によってその遺伝物質
を導入することによって、形成され得る。誘導体は、微生物のゲノム中に１つ以
上の変異を導入することによって形成され得る。変異は、微生物のゲノム中への
挿入であり得る。あるいは、変異は、微生物のゲノムからの１つ以上の塩基の欠
失であり得る。いくつかの例においては、変異は、微生物のゲノム中の１つ以上
の塩基の変更であり得る。さらに、１つの微生物は、それが親の微生物のゲノム
を含むが、親の染色体外の核酸分子を含まない場合には、親の微生物の誘導体で
ある。従って、内因性ベクターを親株から取り除くことによって産生された株は
、親株の誘導体である。本発明の微生物中に取りこまれ得る変異または他の遺伝
的な変更の例として、以下を作製する変異または変更が挙げられるが、これらに
限定されない：ｒｅｃＡ１／ｒｅｃＡ１３またはｒｅｃＡの欠失のようなｒｅｃ
Ａ^-遺伝子型、ｌａｃＸ７４ ｌａｃＺΔＭ１５または他のｌａｃＺ欠失のよう
なα相補を可能にするｌａｃＺ^-遺伝子型、Δｌｏｎおよび／もしくはｏｍｐＴ^{^} のようなプロテアーゼ欠損遺伝子型、ｅｎｄＡ１のようなエンドヌクレアーゼマ
イナス遺伝子型、Ｆ’エピソームを含むことによってＭ１３ファージ感染に適切
な遺伝子型、ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^-、ｍ_k ⁺）のような制限ネガティブ改変ポジティ
ブ遺伝子型、ｈｓｄＳ２０（ｒ_B ^-、ｍ_B ^-）のような制限ネガティブ改変ネガティ
ブ遺伝子型、ｍｃｒＡおよび／もしくはｍｃｒＢおよび／もしくはｍｒｒのよう
なメチラーゼ欠損遺伝子型、ｄｅｏＲのような大きなプラスミドの取り込みに適
切な遺伝子型、ｓｕｐＥおよび／もしくはｓｕｐＦのようなサプレッサー変異を
含有している遺伝子型。他の適切な改変が当業者に公知であり、そしてこのよう
な改変は、本発明の範囲内であると考えられる。

【００２０】 挿入物（単数または複数）は、本明細書中で使用される場合は、１つ以上の所
望される核酸セグメントをいう。

【００２１】 単離することは、本明細書中で使用される場合は、所望される材料、成分、ま
たは組成物を、単離されている材料、成分、または組成物の一部ではない他の材
料、混入物などから少なくとも部分的に分離することを意味する。例えば、「組
換えベクターを単離すること」は、細胞、組織、器官、または生物体中で結合し
得る他の核酸分子（例えば、大きな核酸分子）の少なくとも一部を除去するため
のような方法において、組換えベクターを含有している細胞、組織、器官、また
は生物体を処理することを意味する。しかし、当業者に明らかであるように、単
離された組換えベクターを含有している溶液は、１つ以上の緩衝塩および／また
は溶媒（例えば、水またはアセトン、エタノール、メタノールなどのような有機
溶媒）を含み得、そしてなおも核酸分子はその出発物質に関して「単離された」
核酸分子と考えられ得る。

【００２２】 プラスミドは、本明細書中で使用される場合は、安定な染色体外の遺伝的なエ
レメントをいう。

【００２３】 プロモーターは、本明細書中で使用される場合は、別のＤＮＡ配列からの転写
を制御するＤＮＡ配列をいう。プロモーターは、一般的には、遺伝子の５’領域
として記載されており、そしてこれは開始コドンに対して近位に習慣的に配置さ
れている。隣接するＤＮＡセグメントの転写は、プロモーター領域で開始される
。抑制可能なプロモーターの転写速度は、抑制剤に応答して減少させられる。誘
導性のプロモーターの転写速度は、誘導剤に応答して増大する。構成性のプロモ
ーターの転写速度は、特別には調節されないが、これは、一般的な代謝条件の影
響下で変化し得る。

【００２４】 迅速に増殖する微生物は、本明細書中で使用される場合は、分子生物学的な適
用において代表的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２に由来する株よりも迅速
に増殖する微生物をいう。迅速に増殖する微生物は、迅速には増殖しない微生物
よりも早く個々の細胞から規定された大きさのコロニーを生じる。一般的には、
迅速に増殖する微生物は、参照微生物の増殖速度よりも５％、１０％、２５％、
５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％大きい増殖速度のような、増大
した増殖速度を有する。増殖速度におけるより大きな増大が、比較される微生物
に依存して含まれ得る。好ましい参照株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＡＴＣ
Ｃ３３６２５）のような株である。他の適切な参照株として、ＤＨ５αおよびＤ
Ｈ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
、ならびにクローニングの適用において慣用的に使用されている任意の他の株が
挙げられる。本発明はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ、より詳細には、本明細書中に記
載される特定のＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株と比較した場合に、５％、１０％、２５％、
５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％大きい増殖速度のような増大し
た増殖速度を有する任意の微生物を意図する。以下に示す例においては、本発明
の迅速に増殖する微生物は、ある抗生物質に対する耐性を付与するプラスミドで
の形質転換の後で、その抗生物質を含有しているＬＢプレート上で１ｍｍの直径
のコロニーに増殖するために必要である時間の比較によって、同定された。

【００２５】 本発明の迅速に増殖する微生物はまた、参照株の倍加時間に対する、推定の迅
速に増殖する微生物の倍加時間の比較によっても同定され得る。本発明の迅速に
増殖する微生物は、公知の株よりも早い倍加時間を有する。当業者は、標準的な
技術を使用して微生物の倍加時間を決定し得る。

【００２６】 微生物が迅速に増殖する微生物であるかどうかを決定することにおいては、増
殖速度が、好ましくは、同じまたは同様の遺伝子型を有している参照株に対して
比較される。例えば、ｒｅｃＡ^-である推定の迅速に増殖する微生物は、ｒｅｃ
Ａ^-の参照株に対して比較されるべきである。当業者には、ｒｅｃＡ^-微生物が同
等なｒｅｃＡ⁺微生物よりも遅い増殖速度を有し得ることが明らかである。

【００２７】 組換え微生物は、本明細書中で使用される場合は、組換えベクター、クローニ
ングベクター、または任意のＤＮＡ分子中に所望されるクローン化された遺伝子
を含有している任意の微生物をいう。用語「組換え微生物」はまた、宿主染色体
またはゲノム上に所望される遺伝子を含むように遺伝子操作されている宿主細胞
を含むことを意味する。

【００２８】 組換えベクターは、本明細書中で使用される場合は、ベクターに対して内因性
ではないＤＮＡのフラグメントを含有している任意のベクターを含む。

【００２９】 ベクターは、本明細書中で使用される場合は、挿入物に対して有用な生物学的
または生化学的特性を提供する、核酸分子（好ましくは、ＤＮＡ）をいう。例と
して、プラスミド、ファージ、ウイルス、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメ
ア、トランスポゾン、およびインビトロまたは宿主細胞中で複製が可能であるか
または複製されるか、あるいは宿主細胞中の所望の位置に所望される核酸セグメ
ントを移動させる他の配列が挙げられる。ベクターは、配列がベクターの必須の
生物学的な機能を損なうことなく決定可能な様式で切断され得、そしてその中に
核酸フラグメントがその複製およびクローニングをもたらすようにスプライシン
グされ得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得る。ベクター
はさらに、プライマー部位（例えば、ＰＣＲのため）、転写および／または翻訳
の開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーな
どを提供し得る。明らかに、相同組換え、転座、または制限酵素（例えば、ＰＣ
ＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号（その
全体が本明細書中で参考として援用されている））、Ｔ：Ａクローニングなどで
あるが、これに限定されない）の使用を必要としない所望される核酸フラグメン
トを挿入する方法もまた、本発明に従って使用されるクローニングベクター中に
フラグメントをクローン化するために適用され得る。クローニングベクターはさ
らに、クローニングベクターで形質転換される細胞の同定における使用に適切な
１つ以上の選択マーカーを含み得る。

【００３０】 本発明は、本明細書中で参考として特に援用されている、米国特許第５，８８
８，７３２号に開示されているような、組換えクローニングに適切なベクターを
用いて使用され得る。この目的のためのベクターは、１つ以上の操作された認識
部位を含み得る。組換えクローニングに適切なベクターは、直線状であり得るか
または環状であり得る。直線状である場合は、ベクターは、少なくとも１つの組
換え部位によって分離されたＤＮＡセグメントを含み得る。環状である場合には
、ベクターは、少なくとも２つの組換え部位によって分けられたＤＮＡセグメン
トを含み得る。１つの実施形態においては、ベクターは第１のＤＮＡセグメント
および第２のＤＮＡセグメントを含み得る。ここでは、第１または第２のセグメ
ントは、選択マーカーを含み得る。他の実施形態においては、ベクターは、第１
のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含み得、第１または第２の
セグメントは、毒性の遺伝子を含む。他の実施形態においては、ベクターは、第
１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントを含み得、第１または第２
のＤＮＡセグメントは少なくとも１つの選択マーカーの不活性なフラグメントを
含む。ここでは、選択マーカーのフラグメントは、選択マーカーの別の不活性な
フラグメントと、第１または第２の組換え部位を交差させて組換えられた場合に
、機能的な選択マーカーを再構成し得る。

【００３１】 本発明に従うと、任意のベクターが使用され得る。詳細には、当該分野で公知
でありそして市販されるベクター（およびその改変体または誘導体）が、本発明
に従って使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏ
ｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、
およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから得ることができる。このような
ベクターは、目的の核酸分子のクローニングまたはサブクローニングのために使
用され得、従って、挿入物、核酸フラグメント、または遺伝子を含んでいる組換
えベクターもまた、本発明に従って使用され得る。特定の目的のベクターの一般
的なクラスとして、原核生物および／または真核生物のクローニングベクター、
発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイブリッドベク
ター、種々の宿主における使用のためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、
組換えクローニング転写ベクター、大きな挿入物を受容するためのベクター（酵
母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、およびＰ１人工染色体（
ＰＡＣ））などが挙げられる。目的の他のベクターとして、ウイルス起源のベク
ター（Ｍ１３ベクター、細菌のファージλベクター、バキュロウイルスベクター
、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、高、低、および
調節可能なコピー数のベクター、単一の宿主と組合せた使用に適合可能なレプリ
コンを有するベクター（例えば、ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）、およ
び真核生物のエピソーム複製ベクター（例えば、ｐＣＤＭ８）が挙げられる。本
発明によって意図されるベクターとして、挿入されたかまたはさらなる核酸フラ
グメントまたは配列を含有しているベクター（例えば、組換えベクター）、なら
びに本明細書中に記載されている任意のベクターの誘導体または改変体が挙げら
れる。

【００３２】 本発明に従って有用な発現ベクターとして、染色体、エピソーム、およびウイ
ルスに由来するベクター（例えば、細菌のプラスミドまたはバクテリオファージ
に由来するベクター、およびそれらの組合せによって誘導されるベクター（例え
ば、コスミドおよびファージミド））が挙げられ、そして好ましくは、少なくと
も１つの選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリ
ン耐性遺伝子）および１つ以上のプロモーター（たとえば、ファージλＰ_Lプロ
モーター、および／またはＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモ
ーター、Ｔ７プロモーター、およびバキュロウイルスのポリへドロンプロモータ
ー）を含む。他の適切なプロモーターが当業者に公知である。

【００３３】 本発明における使用に好ましいベクターの中には、以下が含まれる：Ｑｉａｇ
ｅｎから入手可能な、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅから入手可能な、ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター
、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、
ｐＮＨ４６Ａ；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから入手可能な、ｐｃＤＮＡ３；Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａから入手可能な、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥ
Ｔ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐ
ＲＩＴ５；ならびにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可
能な、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、およびｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１。他の適
切なベクターが、当業者に容易に明らかである。

【００３４】 本明細書中で使用される組換えＤＮＡ技術、ならびに分子および細胞生物学の
分野で使用される他の用語が、適用可能な分野の当業者によって一般的に理解さ
れる。

【００３５】 本発明は、当該分野で現在使用されている微生物よりも迅速な増殖速度によっ
て特徴付けられるバイオテクノロジーの適用のための新規の微生物を提供する。
グラム陰性およびグラム陽性の両方の原核生物細胞が使用され得る。本発明の微
生物は、当業者に公知の微生物の任意の属の微生物であり得る。微生物の好まし
い特徴は、迅速な増殖速度、および外部から適用されたＤＮＡで形質転換され、
そしてそれを維持する能力、特に、組換えベクターで形質転換されそしてそれを
維持する能力である。好ましい実施形態においては、本発明に従って使用され得
る宿主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）、
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ
．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（特に、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（特に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰ．ｓｙｒｉ
ｎｇａｅ）、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（特に、Ｓ．ｔｙｐｈｉま
たはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）属の微生物のような微生物が挙げられるが、
これらに限定されない。好ましい実施形態においては、本発明の微生物は、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物である。他の好ましい実施形態においては、本発
明の微生物はＥ．ｃｏｌｉ種の微生物である。好ましい実施形態においては、本
発明の微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株の微生物である。別の好ましい実施形態に
おいては、本発明は、内因性ベクターを含まないＥ．ｃｏｌｉ Ｗの誘導体を含
む。他の好ましい実施形態においては、本発明の微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ、
Ｂ、またはＣ株であり得る。

【００３６】 本発明の微生物は、公知の細菌株に対する比較によって同定され得る。一般的
には、比較は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２の１つまたは別の
誘導体に対して行われ得る。参照株として役立ち得る周知の株は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）である。他の適切な参照株として、特に本
明細書中に記載されているＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられる。従って、本発明は、本
発明のＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株と比較した場合に、同じ速度またはより早い速度で増
殖する任意の微生物を意図する。このような比較は、コロニーを形成するまでの
時間および／または倍加時間を含む、当業者に公知の任意の手段によって行われ
得る。

【００３７】 本発明の微生物は、好ましくは、それらが比較され得る株よりも迅速にコロニ
ーを形成する。詳細には、本発明の微生物は、先行技術の微生物よりも抗生物質
耐性遺伝子を含有しているベクターでの形質転換後に、抗生物質耐性コロニーを
より迅速に形成する。本発明の微生物を同定するために、可能性のある候補の微
生物と参照株とが、並行して、適切な固体のプレート（好ましくは、当業者に公
知の寒天培地プレート）上で拡げられる。適切な固体のプレートの選択および調
製は、当業者の能力の範囲内である。適切なプレートは、アメリカンタイプカル
チャーコレクションによって推奨されている培地、または候補の微生物の培養に
適切な他の培地を使用して、調製され得る。あるいは、液体培地中での倍加時間
の比較が、使用され得る。

【００３８】 プレートは、必要に応じて、抗生物質を含み得る。例えば、コンピテントな参
照株が、コンピテントな推定の迅速に増殖する微生物に対して比較される。両方
の微生物が、形質転換体に対して抗生物質耐性を付与するベクターで形質転換さ
れ得る。形質転換後、２つの微生物が、並行して抗生物質プレート上で拡げられ
得、そして適切な温度でインキュベートされ得る。特定の直径の抗生物質耐性コ
ロニーを出現するまでの時間が、決定され得る。本発明の迅速に増殖する微生物
は、クローニング適用のために現在使用される微生物よりも迅速に特定の大きさ
の抗生物質耐性コロニーを形成する。プレートは、同じ温度でインキュベートさ
れ、そして特定の大きさのコロニーを形成するまでの時間が決定される。以下の
実施例においては、１ｍｍの直径の大きさのコロニーが使用された；しかし、任
意の大きさが選択され得、そして使用され得る。参照生物よりも早い速度で特定
された大きさに達する微生物が、迅速に増殖する生物と考えられる。

【００３９】 本発明はまた、本発明の迅速に増殖する微生物を使用するクローニング方法を
含む。所望の挿入物を含有している組換えベクターの集団が、当該分野で公知の
技術を使用して構築され得る。例えば、目的のＤＮＡが、フラグメントを生成す
るように１つ以上の制限酵素を用いて消化され得る。フラグメントは、アガロー
スゲル上で精製され得る。ベクターは、適切な制限酵素での消化によって調製さ
れ得る。ベクターはさらに、アルカリホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼのＫ
ｌｅｎｏｗフラグメントのような他の酵素で処理され得、そしてゲルで精製され
得る。ＤＮＡフラグメントは、組換えベクターの集団を生成するように適切なリ
ガーゼ酵素を使用してベクター中に連結される。

【００４０】 組換えベクターの集団を産生するための他の方法が使用され得る。例えば、組
換えベクターの集団は、組換えクローニングによって産生され得る。第１および
第２の組換え部位が隣接している目的のＤＮＡを含有している挿入物のドナー分
子が、調製される。ここでは、第１および第２の組換え部位は、互いには組み換
わらない。挿入物のドナー分子は、第３および第４の組換え部位を含有している
ベクタードナー分子と接触させられる。ここでは、第３および第４の組換え部位
は互いには組み換わらない。挿入物のドナー／ベクターのドナーの混合物がさら
に、第１の組換え部位と第３の組換え部位との間、および／または第２の組換え
部位と第４の組換え部位との間での組換えを触媒し得る１つ以上の部位特異的な
組換えタンパク質と接触させられ、それによって組換えが生じることを可能にし
、そして組換えベクターの集団を作製する。

【００４１】 一旦構築されると、組換えベクターの集団は、コンピテントな、迅速に増殖す
る微生物中に、当業者に公知の微生物中へのベクターの導入のための多くの技術
のうちの任意の１つを使用して導入される。形質転換された微生物が増殖させら
れ、そして組換え微生物（すなわち、ベクターを含有している微生物）が選択さ
れる。１つの実施形態においては、微生物の遺伝子型は、α補完によるスクリー
ニングに適切であり、そして選択工程は、β−ガラクトシダーゼの色素生成性基
質（例えば、Ｘ−ｇａｌ）を含有している固体のプレート上での青色／白色スク
リーニングの使用を含み得る。ベクターが組換え微生物から単離され、そして目
的のＤＮＡの存在について分析される。

【００４２】 本発明はまた、本発明の迅速に増殖する微生物を利用する所望されるタンパク
質またはペプチドを産生する方法を含む。この方法は、所望されるタンパク質を
コードする遺伝子を含有している組換えベクターを構築する工程、ベクターをコ
ンピテントな迅速に増殖し得る微生物中に形質転換する工程、および形質転換さ
れた微生物が所望のタンパク質を産生する条件下でこの形質転換された微生物を
培養する工程を包含する。組換えベクターは、上記の方法論を使用して構築され
得る。１つの実施形態においては、組換えベクターは、所望されるタンパク質を
コードする遺伝子からの転写を制御するための誘導性のプロモーターを含む。他
の好ましい実施形態においては、微生物のゲノムは、誘導性のプロモーターの制
御下にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含む。他の好ましい実施形態におい
ては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を制御するプロモーターは、増殖培地に
対する塩の添加によって誘導可能である。好ましい実施形態においては、迅速に
増殖する微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物である。他の好ましい実
施形態においては、迅速に増殖する微生物はＥ．ｃｏｌｉである。他の好ましい
実施形態においては、迅速に増殖する微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株である。別
の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は内因性プラスミドを含
まない。他の好ましい実施形態においては、微生物の遺伝子型は、プロテアーゼ
および／またはリボヌクレアーゼをコードする１つ以上の遺伝子を不活化するよ
うに変更されている。１つのこのような好ましい実施形態においては、迅速に増
殖する微生物は、機能的なｌｏｎプロテアーゼおよび／または機能的なｏｍｐＴ
プロテアーゼを含まない。他の好ましい実施形態においては、本発明の迅速に増
殖する微生物は、機能的なｒｎａＥ遺伝子および／または機能的なｒｎａＩ遺伝
子を含まない。他の好ましい実施形態においては、微生物は、機能的なｌｏｎプ
ロテアーゼおよび／または機能的なｏｍｐＴプロテアーゼを含まず、そしてｒｎ
ａＥ遺伝子および／またはｒｎａＩ遺伝子によってコードされる機能的なリボヌ
クレアーゼを含まない。

【００４３】 本発明はまた、少なくとも１つの容器を収容し、かつ保持するように区画化さ
れている、キャリアまたは入れ物を備えたキットを包含する。ここでは、容器は
迅速に増殖する微生物を含む。キットは、必要に応じてさらに、クローニングに
適切なベクターを含む。好ましい実施形態においては、キットは、組換えクロー
ニングに適切なベクターを含み得る。必要に応じて、本発明のキットは、クロー
ニングに有用な酵素を含み得る。好ましい実施形態においては、キットは、１つ
以上の組換えタンパク質を含み得る。好ましい実施形態においては、迅速に増殖
する微生物はコンピテントであり得る。いくつかの好ましい実施形態においては
、迅速に増殖する微生物は化学的コンピテントであり得る。他の好ましい実施形
態においては、迅速に増殖する微生物は電気的コンピテントであり得る。

【００４４】 本発明は、迅速に増殖する微生物を含有している組成物を含む。好ましい実施
形態においては、迅速に増殖する微生物は、コンピテントな微生物であり得る。
いくつかの好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は化学的コンピ
テントであり得る。他の好ましい実施形態においては、迅速に増殖する微生物は
、電気的コンピテントであり得る。本発明の組成物は、必要に応じて、緩衝液ま
たは緩衝化塩、１つ以上のＤＮＡフラグメント、１つ以上のベクター、１つ以上
の組換えベクター、１つ以上の組換えタンパク質、および１つ以上のリガーゼか
ら選択される少なくとも１つの成分を含有し得る。好ましい実施形態においては
、本発明の組成物は、グリセロール溶液中に迅速に増殖する微生物を含み得る。
他の好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、緩衝液中に迅速に増殖す
る微生物を含み得る。好ましい実施形態においては、本発明の微生物は、コンピ
テンス緩衝液中に存在し得る。他の好ましい実施形態においては、本発明の組成
物は、凍結乾燥された迅速に増殖する微生物を含み得る。

【００４５】 本明細書中に記載されている方法および適用に対する他の適切な改変および適
応が明らかであり、そして本発明の範囲またはその任意の実施形態を逸脱するこ
となく行われ得ることが、関連する分野の当業者に容易に明らかである。本明細
書中で本発明は詳細に記載されているが、本発明は、上記の実施例を参照してよ
り明確に理解される。上記の実施例は、本発明の説明の目的のためにのみ本明細
書中に含まれ、そして本発明を限定することは意図されない。

【００４６】 （実施例１） （株の構築） 全ての株（表１に列挙する）を、バクテリオファージＰ１によって媒介される
形質導入（特に本明細書中で参考として援用されている、Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｍｉ
ｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１
９７２）を通じて構築した。Ｐ１形質導入技術を用いる使用に適切なＴｎ１０挿
入物を含有しているＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎから入手することができる。この作業の親株は、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手したＡＴＣＣ９６３
７と命名されたＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株であった。受容させた単離物は、バクテリオ
ファージＰ１に対して耐性であった。従って、ＡＴＣＣ９６３７を、バクテリオ
ファージＰ１Ｃｍｔｓでの感染によってＰ１感受性の表現型に転換させた。Ｐ１
Ｃｍｔｓは、温度感受性のリプレッサーを含みそしてクロラムフェニコール耐性
遺伝子を含む、バクテリーファージＰ１誘導体である。このバクテリオファージ
は３０℃でＰ１溶原菌を形成するが、より高い温度（＞３７℃）では細胞溶解性
の増殖をする。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ＡＴＣＣ９６３７をバクテリーファージＰ１
Ｃｍｔｓと混合し、そしてクロラムフェニコール耐性コロニー（これは、ＰａＣ
ｍ溶原菌である）を３０℃でＬＢクロラムフェニコールプレート上で選択した。
クロラムフェニコール耐性株を、４２℃で生存しているコロニーの選択によって
Ｐ１溶原菌を取り除いた。生存しているコロニーは、ここでは、クロラムフェニ
コール感受性である。次いで、ＡＴＣＣ９６３７（ＢＲＬ３２３４）のＰ１感受
性の誘導体を、全ての続く作業に使用した。

【００４７】 （実施例２） （Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ｅｎｄＡ^-の構築） ＢＲＬ３２３４のコンピテントな細胞を、特に本明細書中で参考として援用さ
れている、米国特許第４，９８１，７９７号に記載されている、Ｈａｎａｈａｎ
の方法（Ｄｏｕｇ Ｈａｎａｈａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６、５５７、
１９８３）の改変によって調製した。コンピテントな細胞を、ｐＣＭ３０１プラ
スミドＤＮＡ（Ｔｕｃｋｅｒら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３８（１）：１９１−２
０１）で形質転換した。このプラスミドは、複製について温度感受性である。形
質転換体を、３０℃でアンピシリンプレート上で選択した。ｐＣＭ３０１プラス
ミドのＢＲＬ３２３４への導入によって、以下に記載するようなｅｎｄＡ^-誘導
体の同定を補助した。

【００４８】 バクテリオファージＰ１ｖｉｒを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＢ２上で増殖させた。こ
の株は、ｎｕｐＧ：：Ｔｎ１０トランスポゾンに連結されたｅｎｄＡ^-変異を含
む。ＤＢ３．２上で増殖させたＰ１溶解物を、ＢＲＬ３２３４／ｐＣＭ３０１を
感染させるために使用し、テトラサイクリン耐性について選択した。次いで、ｔ
ｅｔ^rコロニーを、ミニプレップＤＮＡの調製後に、形質導入体がｐＣＭ３０１
ＤＮＡを分解する能力を決定することによって、連結されたｅｎｄＡ^-変異に
ついてスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを分解するこれらの形質導入体は
ｅｎｄＡ⁺であり、そしてｐＣＭ３０１プラスミドＤＮＡを分解しない形質導入
体は、ｅｎｄＡ^-であった。テトラサイクリン耐性である、ＢＲＬ３２３４／ｐ
ＣＭ３０１のｅｎｄＡ^-誘導体を、ＢＲＬ３５７３と命名した。ｐＣＭ３０１を
欠失しているＢＲＬ３５７３の誘導体を、４２℃でＬＢプレート上にＢＲＬ３５
７３を画線し、そしてアンピシリン感受性についてコロニーをスクリーニングす
ることによって選択した。

【００４９】 ＢＲＬ３５７３のアンピシリン感受性の誘導体を、ＢＲＬ３５７４と命名した
。ｎｕｐＧ：：Ｔｎ１０トランスポゾンを、フザリン酸を含有しているＬＢプレ
ートを使用してＢＲＬ３５７４から取り除いた（Ｓｔａｎｌｅｙ Ｍａｌｏｙお
よびＷｉｌｌｉａｍ Ｎｕｎｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：１１１０、
１９８１）。ＢＲＬ３５７４の１つのテトラサイクリン感受性誘導体を、ＢＲＬ
３５８０と命名した。ＢＲＬ３５８０は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ｅｎｄＡ^-である
。

【００５０】 （実施例３） （ＢＲＬ３５８２ ｒｅｃＡ^- Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗの構築） Ｐ１Ｃｍ溶解物を、ＢＲＬ３２２９上で増殖させた。ＢＲＬ３２２９は、ｒｅ
ｃＡ中の欠失変異に対して連結されたＴｎ１０トランスポゾンを含む。Ｐ１溶解
物を、ＢＲＬ３５８０を形質導入するために使用し、そしてテトラサイクリン耐
性形質導入体を、２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有しているＬＢプレー
ト上で３０℃で選択した。形質導入体を、ＬＢテトラサイクリンプレート上で一
旦再精製し、次いで４μｇ／ｍＬのニトロフラントインを含有しているＬＢプレ
ート上でニトロフラントインに対する感受性または耐性についてスクリーニング
した。ｒｅｃＡ⁺株はニトロフラントインに対して耐性であるが、ｒｅｃＡ^―株
は、ニトロフラントインに対して感受性である（Ｓ ＪｅｎｋｉｎｓおよびＰ．
Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｊ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２５：１２１４、１９７６）。
ＢＲＬ３５８０の１つのテトラサイクリン耐性のニトロフラントイン感受性誘導
体を、ＢＲＬ３５８２と命名した。

【００５１】 （実施例４） （天然のプラスミドを欠失している、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ誘導体の単離） ＡＴＣＣ９６３７およびＡＴＣＣ９６３７に由来する全ての株（ＢＲＬ３５８
０まででありそしてＢＲＬ３５８０を含む）は、２つのプラスミドを含む。小さ
い方のプラスミドは約５．５ｋｂであり、そして大きい方のプラスミドは＞５０
ｋｂである。５．５ｋｂのプラスミドを、Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ（Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によってＡＴＣＣ９６３７から調製した。このプ
ラスミドの制限地図を、図１に提供する。

【００５２】 制限地図は、アンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子を導入するために使
用され得るクリーニング部位を提供した。アンピシリン耐性遺伝子を、プラスミ
ドｐＴｒｃＮ２、ｐＰｒｏＥＸ−１誘導体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）から単離した。アンピシリン耐性遺伝子の供給
源は重要ではない。以下のプロトコールでｐＰｒｏＥＸ−１を用いて作業し、そ
してこのプロトコールは、アンピシリン耐性遺伝子の供給源として使用したプラ
スミドに依存して当業者によって改変され得る。１μｇのプラスミドｐＴｒｃＮ
２を、ＢｓｐＨ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、そし
て末端をＫｌｅｎｏｗ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）で埋め
た。アンピシリン耐性遺伝子を含有している１００８ｂｐのＤＮＡフラグメント
を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。５．５ｋｂのプラスミドを、Ｓ
ｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、次いで温度感受
性のアルカリホスファターゼであるＴｓＡＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ）で処理した。ＤＮＡを混合し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）で処理し、そしてコンピテントなＭＥ Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）中に形質転換し
た。アンピシリン耐性コロニーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有して
いるＬＢプレート上で選択した。いくつかのアンピシリン耐性コロニーを、一晩
の培養において増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、そしてアガロース
ゲル上での電気泳動によって分析した。全てのアンピシリン耐性クローンが、６
．５ｋｂの分子量のプラスミドを有することを見出した。プラスミドを含有して
いるＤＨ１０Ｂ細胞（Ｗａｍｐと命名した）を、ＢＲＬ３７０９と命名した。

【００５３】 Ｗａｍｐプラスミドを、ＢＲＬ３５８０（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ｅｎｄＡ^-）の
コンピテントな細胞中に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。ＢＲ
Ｌ３５８０、ならびに５個のアンピシリン耐性の形質転換換体を、１００μｇ／
ｍＬのアンピシリンを含有しているＬＢ培地中で３７℃で増殖させ、そしてプラ
スミドＤＮＡを単離し、そしてアガロースゲル電気泳動によって分析した。ＢＲ
Ｌ３５８０に由来するプラスミドＤＮＡは、５．５ｋｂの分子量を有したが、ア
ンピシリン耐性形質転換体は、６．５ｋｂの分子量のプラスミドＤＮＡを有した
。このことは、アンピシリン耐性遺伝子の約１ｋｂが、５．５ｋｂのプラスミド
中に導入されて６．５ｋｂのプラスミドを生じたことを示す。さらに、アンピシ
リン耐性遺伝子を含有している６．５ｋｂのプラスミドが、５．５ｋｂのプラス
ミドと置き換わった。両方のプラスミドが同じ複製起点を含んでいたので、この
ことは予想された結果である。６．５ｋｂのＷａｍｐプラスミドを含有している
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ誘導体を、ＢＲＬ３７１１と命名した。ＢＲＬ３５８０および
ＢＲＬ３７１１の両方ともがまた、より大きな分子量（＞５０ｋｂ）のプラスミ
ドを含んだ。

【００５４】 （実施例５） （６．５ｋｂのＷａｍｐプラスミドを取り除いたＢＲＬ３７１１） ＢＲＬ３７１１を、ＳＤＳを含有しているＬＢブロス中での増殖によって、Ｗ
ａｍｐプラスミドを取り除いた。ＳＤＳは、Ｅ．ｃｏｌｉ株からプラスミドを取
り除くために使用される化合物として、文献において周知である（Ａ．Ｂｈａｒ
ａｔｈｉおよびＨ．Ｐｏｌａｓａ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，
８４：３７、１９９１、Ｓｕｓａｎａ Ｒｏｓｏｓ，Ａｌｄｏ Ｃａｌｚｏｌａ
ｒｉ，Ｊｏｓｅ Ｌａ Ｔｏｒｒｅ，Ｎｏｒａ Ｇｈｉｔｔｏｎｉ、ならびに、
Ｃｅｓａｒ Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １５５：４０２、１９
８３）。ＢＲＬ３７１１を、１０％のＳＤＳを含有しているＬＢブロス中で３０
℃で増殖させた。培養物が定常期に到達した後、培養物を、第２回目のサイクル
のために新しいＬＢ＋１０％のＳＤＳ中に１：１０００に希釈した。第２回目の
サイクルの後、生存している細胞を３０℃でＬＢプレート上にプレートし、そし
てコロニーをアンピシリンに対する感受性についてスクリーニングした。１つの
単離物をＢＲＬ３７１８と命名し、これがアンピシリンに対して感受性であるこ
とを見出した。このことは、６．５ｋｂのプラスミドが取り除かれたことを示す
。ＢＲＬ３７１１およびＢＲＬ３７１８に由来するミニプレップＤＮＡによって
、ＢＲＬ３７１１が小さい方のプラスミドおよび大きい方のプラスミドの両方を
有するが、ＢＲＬ３７１８は大きい方のプラスミドだけを有することを確認した
。

【００５５】 （実施例６） （抗生物質耐性遺伝子を含有している大きい方のプラスミドの誘導体の調製） 大きい方のプラスミドを欠失しているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ誘導体を単離するため
に、抗生物質耐性遺伝子を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによるＧ
ｅｎｏｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓを使用して大きい方のプラスミド中
に導入した。大きい方のプラスミドを、標準的なアルカリ−ＳＤＳ溶解手順を使
用してＢＲＬ３７８１から単離した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈｅｒｂｏｒ ＮＹ．）。Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｉｍｉｍｇ Ｓｙｓｔ
ｅｍを、製造業者によって提供される説明書に従って使用した。

【００５６】 約８０ｎｇの標的プラスミドＤＮＡを、２０μＬの反応系で２０ｎｇのドナー
プラスミドＤＮＡと混合した。１つのドナープラスミドであるｐＧＳＰ１は、カ
ナマイシン（Ｋｍ）に対する耐性を付与する遺伝子を提供する。第２のドナープ
ラスミドであるｐＧＳＰ２は、クロラムフェニコール（Ｃｍ）に対する耐性を付
与する遺伝子を提供する。最終的な反応物を水中に１：１０に希釈し、そしてＥ
Ｍａｘ ＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に
エレクトロポレーションした。２０μＬの細胞を１μＬの希釈した反応物と混合
し、そして細胞−ＤＮＡの混合物を４２０Ｖ、４０００Ω、２．４ｋＶ、１６０
００ｋＶ／ｃｍで電気泳動した。１０μＬを１ｍＬのＳＯＣ中に３７℃で１時間
発現させた。１００μＬの発現混合物を、ｐＧＰＳ１反応については１０μｇ／
ｍＬのカナマイシンを含有しているＬＢプレート、またはｐＧＰＳ２反応につい
ては１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有しているＬＢプレートの
いずれかにプレートした。それぞれの反応物から８個の形質転換体を分析した。
全部の１６個のコロニーに由来するプラスミドＤＮＡが、ＢＲＬ３７１８から単
離したプラスミドＤＮＡとほぼ同じ位置に、アガロースゲル上に移動した高分子
量のプラスミドを有した。さらに、プラスミドＤＮＡのいくつかを、再度ＥＭａ
ｘ ＤＨ１０Ｂ細胞中にエレクトロポレーションし、そしてＤＨ１０Ｂ細胞に対
してカナマイシンまたはクロラムフェニコールのいずれかに対する耐性を付与す
ることを示した。このことによって、カナマイシンまたはクロラムフェニコール
のいずれかに対する耐性を付与する遺伝子が、ＢＲＬ３７１８に由来する高分子
量のプラスミド中に導入されていると結論付けた。カナマイシンに対する耐性を
付与する高分子量のプラスミドを含有しているＤＨ１０Ｂ細胞を、ＢＲＬ３７２
６と命名した。クロラムフェニコールに対する耐性を付与する高分子量のプラス
ミドを含有しているＤＨ１０Ｂ細胞を、ＢＲＬ３７２７と命名した。

【００５７】 （実施例７） （欠失プラスミドの構築） ＢＲＬ３７２６株（高ＭＷのプラスミド＋Ｋｍ^rマーカーを含有しているＤＨ
１０Ｂ）に由来するプラスミドＤＮＡを調製した。２つの別々の反応において、
１μｇのプラスミドＤＮＡを、０．５および０．１ユニットの制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で、３７℃で１５分間
、部分的に消化した。反応物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタ
ノールで沈殿させた。それぞれの反応物からのＤＮＡを、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して連結させ、そしてコ
ンピテントなＭＥ ＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ）中に形質転換した。コロニーを、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有して
いるＬＢプレート上で３７℃で選択した。化学的コンピテントな細胞を使用した
。なぜなら、これらは、電気的コンピテント細胞ほど高分子量のプラスミドＤＮ
Ａを効率良く取りこまないからである。

【００５８】 １０個のカナマイシン耐性（０．１Ｕの反応による）コロニーに由来するプラ
スミドＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動によって分析した。欠失プラスミドＤ
ＮＡの大きさは、約４．５〜１５ｋｂの範囲であり、そしてプラスミドを欠失１
〜欠失１０と命名した。これらのプラスミドを含有しているＤＨ５α細胞を、Ｂ
ＲＬ３７４０−１〜ＢＲＬ３７４０−１０と命名した。

【００５９】 （実施例８） （高分子量のプラスミドＤＮＡを取り除いたＢＲＬ３７１８） ＢＲＬ３７１８の化学的コンピテント細胞を、米国特許第４，９８１，７９７
号に従って改変された、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８
３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６、５５７）の改変によって調製した。ＢＲＬ
３７１８の化学的コンピテント細胞を、ＢＲＬ３７４０−１（欠失１、約８ｋｂ
）およびＢＲＬ３７４０−３（欠失３、約１０ｋｂ）から単離したプラスミドＤ
ＮＡで形質転換し、そしてカナマイシン耐性コロニーを、２０μｇ／ｍＬのカナ
マイシンを含有しているＬＢプレート上で３７℃で選択した。それぞれの形質転
換体に由来する４個のコロニーを、単一のコロニー単離のために２０μｇ／ｍＬ
のカナマイシンを含有しているＬＢプレート上に３７℃で画線した。プラスミド
ＤＮＡを、４個の単一のコロニー単離物から単離し、そしてアガロースゲル電気
泳動によって分析した。

【００６０】 高分子量のプラスミドＤＮＡは、ＢＲＬ３７１８から調製したミニプレップＤ
ＮＡ中で容易に明らかであった。しかし、カナマイシン耐性形質転換体から調製
したプラスミドＤＮＡは、高分子量のプラスミドＤＮＡの存在を示さなかった。
むしろ、ＢＲＬ−３７４０−１（約８ｋｂ）およびＢＲＬ−３７４０−３（約１
０ｋｂ）に特有の分子量を有するプラスミドＤＮＡを容易に見ることができた。
これにより、ＢＲＬ３７１８への欠失１および欠失３プラスミドＤＮＡの形質転
換によって、欠失１および欠失３のＤＮＡでの、高分子量のプラスミドＤＮＡ（
＞５０ｋｂ）の置換が生じたと結論付けた。これは、予想される結果であった。
なぜなら、高分子量のプラスミドＤＮＡ、欠失１プラスミドＤＮＡ、および欠失
３プラスミドＤＮＡは全て、同じ複製起点を共有するからである。欠失１および
欠失３プラスミドＤＮＡを含有しているＢＲＬ３７１８誘導体を、ＢＲＬ３７４
１およびＢＲＬ３７４２とそれぞれ命名した。

【００６１】 （実施例９） （Ｋｍ^rプラスミドを取り除いたＢＲＬ３７４１および３７４２） ＢＲＬ３７４１およびＢＲＬ３７４２を、１０％のＳＤＳを含有しているＬＢ
ブロス中で一晩、３０℃で増殖させた。培養物を、１０％のＳＤＳを含有してい
るＬＢブロス中に１：１０００に希釈し、そして再び３０℃でインキュベートし
た。３０℃での２回のサイクル後、これらの培養物の希釈物（１：１０⁴および
１：１０⁶）を、ＬＢプレート上に塗布し、３０℃でインキュベートし、そして
カナマイシンに対する感受性についてスクリーニングした。ＢＲＬ３７４１につ
いては、１５／５０のコロニーがカナマイシンに対して感受性であり、一方、Ｂ
ＲＬ３７４２に由来する９／５０のコロニーが、カナマイシンに対して感受性で
あった。ＢＲＬ３７４１の２個のカナマイシン感受性誘導体およびＢＲＬ３７４
２の２個のカナマイシン感受性誘導体に由来するプラスミドＤＮＡを単離し、そ
してアガロースゲル電気泳動によって分析した。欠失プラスミドに対応するプラ
スミドＤＮＡはゲル上では観察されなかった。欠失１プラスミドを取り除いたＢ
ＲＬ３７４１誘導体を、ＢＲＬ３７５６と命名した。欠失３プラスミドを取り除
いたＢＲＬ３７４２誘導体を、ＢＲＬ３７５７と命名した。

【００６２】 （実施例１０） （ＢＲＬ３７５６およびＢＲＬ３７５７のコンピテントな細胞） ＢＲＬ３７４１、ＢＲＬ３７４２、ＢＲＬ３７５６、およびＢＲＬ３７５７の
化学的コンピテント細胞を、米国特許第４，９８１，７９７号に従って改変され
た、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６、５５７）に従って調製した。ＢＲＬ３７４１およびＢＲＬ３７
４２を、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有しているＬＢプレート上に画線し
、そしてプレートを２８℃で２０時間インキュベートした。ＢＲＬ３７５６（１
）、ＢＲＬ３７５６（２）、ＢＲＬ３７５７（１）、およびＢＲＬ３７５６（２
）を、ＬＢプレート上に画線し、そしてプレートを２８℃で２０時間インキュベ
ートした。それぞれの株の５〜６個のコロニーを１ｍＬのＳＯＢ培地（Ｄ．Ｈａ
ｎａｈａｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７、１９８３）中に採取した
。０．９ｍＬの細胞を、５００ｍＬのバッフルを取り付けた（ｂａｆｆｌｅｄ）
振盪フラスコ中の６０ｍＬのＳＯＢ培地中に接種した。フラスコを２５０ｒｐｍ
の２８℃のインキュベーター中に配置した。５５０ｎｍでのＤＯが０．２５〜０
．３３に到達したときに、細胞を回収した。それぞれの株の５０ｍＬの細胞を遠
心分離し（４℃）、そして細胞を、４ｍＬの冷却したＣＣＭＢ８０緩衝液中に再
懸濁した（特に本明細書中で参考として援用されている、Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ、
Ｊ．ＪｅｓｓｅｅおよびＦ．Ｂｌｏｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ２０４：６３、１９９１）。細胞を、２０分間氷上に静置させた。２
２０μＬをＮＵＮＣバイアル中に配置し、そして細胞をドライアイスエタノール
浴中で凍結させた。細胞を−７０℃で保存した。

【００６３】 （実施例１１） （アンピシリン耐性コロニーになるまでの時間の評価） コンピテントな細胞（ＡＴＣＣ９６３７、ＢＲＬ３７１８、ＢＲＬ３７４１、
ＢＲＬ３７４２、ＢＲＬ３７５６，およびＢＲＬ３７５７）のバイアルを、２０
分間氷上で融解させた。１００μＬの細胞を、ｐＵＣ１９（１０ｐｇ／μＬを５
μＬ＝５０ｐｇ）と冷却したＦａｌｃｏｎ２０５９チューブ中で混合した。細胞
を、１５分間氷上に静置させた。細胞を４５秒間４２℃で熱ショックを与え、続
いて２分間氷上でインキュベートした。０．９ｍＬの室温のＳＯＣをそれぞれの
チューブに添加し、そしてチューブを３７℃（２５０ｒｐｍ）で３０分間振盪さ
せた。発現混合物のアリコートを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有して
いるＬＢプレート上にプレートし、そしてプレートを４２℃または３７℃のいず
れかでインキュベートした。１ｍｍのコロニーが出現するまでの時間を表２に示
す。３７℃では、１ｍｍの大きさのアンピシリン耐性コロニーになるには７．８
時間から８．２時間の間を必要とし、そして５．５ｋｂのプラスミドおよび＞５
０ｋｂのプラスミドの両方を含有している株（ＡＴＣＣ９６３７）、＞５０ｋｂ
のプラスミドのみを含有している株（ＢＲＬ３７１８）、小さい方のカナマイシ
ン耐性プラスミドを含有している株（ＢＲＬ３７４１および３７４２）、または
プラスミドを含有していない株（ＢＲＥ３７５６および３７５７）の間で、時間
に有意差は存在しなかった。実際、４２℃では、１ｍｍの大きさのコロニーにな
るためには、試験した全ての株について７．７時間を必要とした。このことによ
って、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ中でのプラスミド存在または非存在は、形質転換後にコ
ロニーが出現するまでの時間には有意な影響を与えないと結論付けた。

【００６４】 （実施例１２） （ＢＲＬ３７３４の構築） ＢＲＬ３７１８の電気的コンピテント細胞を、Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第２０４巻、６３頁（１９９１）に記載さ
れているプロトコールの改変に従って調製した。ＢＲＬ３７２７単離物である４ ₆ に由来するＤＮＡを、ＢＲＬ３７１８にプラスミドを導入するために使用した
。２０μＬの細胞を１μＬのＤＮＡと混合し、そして細胞−ＤＮＡ混合物を、２
５０Ｖ、２０００Ω、１．４４ｋＶ、９．６ｋＶ／ｃｍで、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒでエレクトロポレーションした。
１０μＬを、１ｍＬのＳＯＣで６０分間３７℃で発現させ、そして発現させたも
のを１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有しているＬＢプレート上
にプレートした。２４時間後、コロニーを再度精製し、そして分析した。ミニプ
レップＤＮＡは、ＢＲＬ３７１８中に見出されるプラスミドとほぼ同じ大きさの
分子量を有するプラスミドを含んだ。クロラムフェニコール耐性の高分子量のプ
ラスミドを含有しているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株を、ＢＲＬ３７３４と命名した。

【００６５】 （実施例１３） （高分子量のプラスミドＤＮＡを取り除いたＢＲＬ３７３４） ＢＲＬ３７３４の化学的コンピテント細胞を、米国特許第４，９８１，７９７
号に従って改変した、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８３
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６、５５７）に従って調製した。ＢＲＬ３７３４
の化学的コンピテント細胞を、ＢＲＬ３７４０−１（欠失１、約８ｋｂ）および
ＢＲＬ３７４０−３（欠失３、約１０ｋｂ）から単離したプラスミドＤＮＡで形
質転換し、そしてカナマイシン耐性コロニーを、２０μｇ／ｍＬのカナマイシン
を含有しているＬＢプレート上で３７℃で選択した。それぞれの形質転換体に由
来する４個のコロニーを、単一のコロニー単離のために２０μｇ／ｍＬのカナマ
イシンを含有しているＬＢプレート上に３７℃で画線した。プラスミドＤＮＡを
、４個の単一のコロニー単離物から単離し、そしてアガロースゲル電気泳動によ
って分析した。高分子量のプラスミドＤＮＡは、ＢＲＬ３７３４から調製したミ
ニプレップＤＮＡ中で容易に明らかであった。しかし、カナマイシン耐性形質転
換体から調製したプラスミドＤＮＡは、高分子量のプラスミドＤＮＡの存在を示
さなかった。むしろ、ＢＲＬ−３７４０−１（約８ｋｂ）およびＢＲＬ−３７４
０−３（約１０ｋｂ）に特有の分子量を有するプラスミドＤＮＡを容易に見るこ
とができた。さらに、欠失１および欠失３プラスミドを含有しているＢＲＬ３７
３４を、所望のプラスミドＤＮＡの存在または非存在を確認するために、Ｋｍ
２０μｇ／ｍＬを含有しているＬＢプレートおよびＣｍ １２．５ｍｇ／ｍＬを
含有しているＬＢプレート上で単一のコロニーの単離のために画線した。ＬＢ＋
Ｃｍ １２．５μｇ／ｍＬのプレート上では増殖は観察されなかったが、単一の
コロニー単離物の形成が、Ｋｍ ２０μｇ／ｍＬのプレート上で観察された。こ
れにより、ＢＲＬ３７３４への欠失１および欠失３プラスミドＤＮＡの形質転換
によって、欠失１および欠失３のＤＮＡでの、高分子量のプラスミドＤＮＡ（＞
５０ｋｂ）の置換が生じたと結論付けた。これは、予想される結果であった。な
ぜなら、高分子量のプラスミドＤＮＡ、欠失１プラスミドＤＮＡ、および欠失３
プラスミドＤＮＡは全て、同じ複製起点を共有するからである。欠失１および欠
失３プラスミドＤＮＡを含有しているＢＲＬ３７３４誘導体を、ＢＲＬ３７４５
およびＢＲＬ３７４６とそれぞれ命名した。

【００６６】 （実施例１４） （Ｋｍ^rプラスミドを取り除いたＢＲＬ３７４５および３７４６） ＢＲＬ３７４５およびＢＲＬ３７４６を、１０％のＳＤＳを含有しているＬＢ
培地中で一晩、３０℃で増殖させた。培養物を、１０％のＳＤＳを含有している
ＬＢ培地中に１：１０００に希釈し、そして再び３０℃でインキュベートした。
３０℃での２回のサイクル後、これらの培養物の希釈物（１：１０⁶）を、ＬＢ
プレート上に塗布し、３０℃でインキュベートし、そしてカナマイシンに対する
感受性についてスクリーニングした。ＢＲＬ３７４５については、２２／１００
のコロニーがカナマイシンに対して感受性であり、一方、ＢＲＬ３７４２に由来
する１／１００のコロニーが、カナマイシンに対して感受性であった。３個のＢ
ＲＬ３７４５のカナマイシン感受性誘導体および１個のＢＲＬ３７４６のカナマ
イシン感受性誘導体に由来するプラスミドＤＮＡを単離し、そしてアガロースゲ
ル電気泳動によって分析した。

【００６７】 欠失１および欠失３プラスミドに対応するプラスミドＤＮＡは、除去後にはゲ
ル上では観察されなかった。欠失１プラスミドを取り除いたＢＲＬ３７４５誘導
体を、ＢＲＬ３７６２と命名した。欠失３プラスミドを取り除いたＢＲＬ３７４
６誘導体を、ＢＲＬ３７６３と命名した。

【００６８】 （実施例１５） （ＢＲＬ３７６２およびＢＲＬ３７６３のコンピテント細胞） ＢＲＬ３７４５、ＢＲＬ３７４６、ＢＲＬ３７６２、およびＢＲＬ３７６３の
コンピテント細胞を、米国特許第４，９８１，７９７号に従って改変された、Ｈ
ａｎａｈａｎの方法に従って化学的に調製した（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８
３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７）。ＢＲＬ３７４５およびＢＲＬ３
７４６を、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有しているＬＢプレート上にスト
リーク（ｓｔｒｅａｋ）し、そしてプレートを２８℃で２０時間インキュベート
した。ＢＲＬ３７６２（１）、ＢＲＬ３７６２（２）、およびＢＲＬ３７６３（
１）を、ＬＢプレート上にストリークし、そしてプレートを２８℃で２０時間イ
ンキュベートした。それぞれの株に由来する５〜６個のコロニーを１ｍＬのＳＯ
Ｂ培地（Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６６：５５７、１９
８３）中に採取した。０．９ｍＬの細胞を、５００ｍＬの激しく振盪させたフラ
スコ中の６０ｍＬのＳＯＢ培地中に接種した。フラスコを２５０ｒｐｍの２８℃
のインキュベーター中に配置した。５５０ｎｍでのＯＤが０．２５〜０．３３に
到達した時に、細胞を回収した。それぞれの株の５０ｍＬの細胞を遠心分離し（
４℃）、そして細胞を、４ｍＬの冷却したＣＣＭＢ８０緩衝液中に再懸濁した（
Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ．ＪｅｓｓｅｅおよびＦ．Ｂｌｏｏｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０４：６３、１９９１）。細胞を、２０分間
氷上に静置させた。２２０μＬをＮＵＮＣバイアル中に配置し、そして細胞をド
ライアイスエタノール浴中で凍結させた。細胞を−７０℃で保存した。

【００６９】 （実施例１６） （アンピシリン耐性コロニーに対する時間の評価） コンピテント細胞（ＡＴＣＣ９６３７、ＢＲＬ３７３４、ＢＲＬ３７４５、Ｂ
ＲＬ３７４６、ＢＲＬ３７６２、およびＢＲＬ３７６３）の１つのバイアルを、
２０分間氷上で融解させた。１００μＬの細胞をｐＵＣ１９（５μＬの１０ｐｇ
／μＬ＝５０ｐｇ）と、冷却したＦａｌｃｏｎ２０５９チューブ中で混合した。
細胞を、１５分間氷上に静置させた。細胞を４５秒間４２℃で熱ショックを与え
、続いて２分間氷上でインキュベートした。０．９ｍＬの室温のＳＯＣをそれぞ
れのチューブに添加し、そしてチューブを３７℃で３０分間振盪（２５０ｒｐｍ
）させた。発現混合物のアリコートを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有
しているＬＢプレート上にプレートし、そしてプレートを４２℃または３７℃の
いずれかでインキュベートした。１ｍｍのコロニーが出現するまでの時間を表３
に示す。３７℃では、１ｍｍのサイズのアンピシリン耐性コロニーになるには８
時間を必要とし、そして５．５ｋｂのプラスミドおよび５０ｋｂよりも大きなプ
ラスミドの両方を含有している株（ＡＴＣＣ９６３７）、５０ｋｂよりも大きな
プラスミドのみを含有している株（ＢＲＬ３７３４）、小さい方のカナマイシン
耐性プラスミドを含有している株（ＢＲＬ３７４５および３７４６）、またはプ
ラスミドを含有していない株（ＢＲＬ３７６２および３７６３）の間で時間には
有意な差異は存在しなかった。４２℃では、１ｍｍのサイズのコロニーになるた
めには、試験した全ての株について７．３時間を必要とした。このことによって
、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ中でのプラスミド存在または非存在は、形質転換後にコロニ
ーが出現するまでの時間には有意な影響を与えないと結論付けた。さらに、表３
および４のデータは、４２℃でのＬＢアンピシリンプレートのインキュベーショ
ンが、３７℃でインキュベートしたプレートよりも約０．５時間早いアンピシリ
ン耐性コロニーの出現を生じることを示す。

【００７０】 （実施例１７） （野生型のＥ．ｃｏｌｉ ＷとＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２との比較） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの株である、ＡＴＣＣ９６３７（Ｗ）、Ｂ
ＲＬ３５８２（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ｅｎｄＡ^― ｓｒｌ：：Ｔｎ１０ ｒｅｃＡ
１３９８）、およびＡＴＣＣ３３６２５（ＭＭ２９４）のコンピテント細胞を
、米国特許第４，９８１，７９７号に従って改変された、Ｈａｎａｈａｎの方法
に従って調製した（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１６６、５５７）。コンピテント細胞を、ＣＣＭＢ８０緩衝液（Ｈａｎａｈａｎ
，Ｄ、Ｊｅｓｓｅｅ，Ｊ．，およびＢｌｏｏｍ，Ｆ．Ｒ．、１９９１、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０４，６３）を使用して調製した。最
大効率の（Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｓｙ）ＤＨ５αのコンピテント細胞を、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した。

【００７１】 コンピテント細胞を、２０分間氷上で融解させた。１００μＬの細胞をｐＵＣ
１９または５０ｐｇのｐＢＲ３２２ ＤＮＡを用いて形質転換した。細胞−ＤＮ
Ａ混合物を３０分間氷上に静置させ、そして次いで、４５秒間４２℃で熱ショッ
クを与えた。次いで、チューブを２分間氷上に置いた。０．９ｍＬのＳＯＣ（Ｈ
ａｎａｈａｎ、１９８３）をそれぞれのチューブに添加し、次いでチューブを３
７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪させた。適切な希釈物を、１００μｇ／ｍＬ
のアンピシリンを含有しているＬＢプレート上に広げ、そしてプレートを３７℃
でインキュベートした。１ｍｍのコロニーが出現するまでの時間単位での時間を
測定し、そして表４に示す。ＡＴＣＣ９６３７は、別のｒｅｃＡ⁺株であるＡＴ
ＣＣ３３６２５のついての約１０時間と比較して、８〜８．５時間でコロニーを
生じた。ｒｅｃＡ^-株もまた、比較した。ＢＲＬ３３６２５は、ＤＨ５αについ
ての１６時間と比較して、約１０時間でコロニーを生じた。

【００７２】 （実施例１８） （上昇させた温度での形質転換した微生物の増殖） 先の実施例に記載されるプロトコールを使用して、上昇させた温度での増殖の
影響を分析した。４２℃でのＬＢアンピシリンプレート上での形質転換した微生
物のインキュベーションによっては、３７℃でインキュベートしたプレートと比
較して０．５〜１時間早いコロニーの出現が生じた。Ｃｉｒｃｌｅ Ｇｒｏｗ（
Ｂｉｏ１０１）によって作製され、そして１００μｇ／ｍＬでのアンピシリンを
含有しているプレート上への細胞のプレーティングによって、１００μｇ／ｍＬ
でアンピシリンを含有しているＬＢプレート上でのコロニーの出現と比較して、
０．５〜１時間早いコロニーの出現が生じた。従って、上昇させた温度の使用お
よび／または富化させた増殖培地の使用は、本発明の微生物の増大した増殖速度
を促進し得る。

【００７３】 （実施例１９） （プラスミドを取り除いたＥ．ｃｏｌｉ Ｗの誘導体の調製） プラスミドを取り除いたＥ．ｃｏｌｉ Ｗの単離物（例えば、ＢＲＬ３７６２
、ＢＲＬ３７６３、ＢＲＬ３７５６、またはＢＲＬ３７５７）を、バイオテクノ
ロジーの適用のために所望される遺伝子型を有している誘導体を構築するために
使用する。上記のＰ１形質導入技術を使用して、１つ以上の有用な遺伝子の変更
を有している株を調製する。有用な遺伝子の改変として、以下が挙げられる：ｒ
ｅｃＡ１／ｒｅｃＡ１３またはｒｅｃＡの欠失のようなｒｅｃＡ^-遺伝子型、ｌ
ａｃＸ７４ ｌａｃＺΔＭ１５、または他のｌａｃＺ欠失のようなα相補を可能
にするｌａｃＺ^-遺伝子型、Δｌｏｎおよび／もしくはｏｍｐＴ^-のようなプロテ
アーゼ欠損遺伝子型、ｅｎｄＡ１のようなエンドヌクレアーゼマイナスの遺伝子
型、Ｆ’エピソームを含むことによるＭ１３ファージ感染に適切な遺伝子型、ｈ
ｓｄＲ１７（ｒ_k ^-、ｍ_k ⁺）のような制限ネガティブ改変ポジティブ遺伝子型、ｈ
ｓｄＳ２０（ｒ_B ^-、ｍ_B ^-）のような制限ネガティブ改変ネガティブ遺伝子型、ｍ
ｃｒＡおよび／もしくはｍｃｒＢおよび／もしくはｍｒｒのようなメチラーゼ欠
損遺伝子型、ｄｅｏＲのような大きなプラスミドの取り込みのために適切な遺伝
子型、ｓｕｐＥおよび／もしくはｓｕｐＦのようなサプレッサー変異を含有して
いる遺伝子型。他の適切な改変が、当業者に公知であり、そしてこのような改変
は、本発明の範囲内であると考えられる。

【００７４】 好ましい実施形態においては、本発明の迅速に増殖する微生物は、α相補を可
能にする改変されたｌａｃオペロンを含む。α相補を支持するために、ゲノムの
β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮ末端領域に欠失を導入することが必要である。
最初に、ｌａｃＸ７４変異を、Ｔｎ１０挿入物に対して連結されたｌａｃＸ７４
変異を含むＢＲＬ３７５９について調製した溶解物を用いるＰ１形質導入によっ
て、ＢＲＬ３７５６およびＢＲＬ３７５７に導入した。ｌａｃＸ７４挿入物を含
有している株は、Ｔｎ１０挿入の結果としてテトラサイクリン耐性である。株を
テトラサイクリンを含有しているプレート上で選択し、そして得られた株を、Ｂ
ＲＬ３７６０（ＢＲＬ３７５６に由来する）およびＢＲＬ３７６１（ＢＲＬ３７
５７に由来する）と命名した。株を、フザリン酸の存在下での増殖によってＴｎ
１０挿入物を取り除き、そして得られたｌａｃＸ７４変異を含有しているテトラ
サイクリン感受性株を、ＢＲＬ３７６６およびＢＲＬ７６９と命名した。これら
の株を、上記に開示されているようなＨａｎａｈａｎの改変された方法を使用し
てコンピテントにし、次いでβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のαフラグメントを含
有しているプラスミドで形質転換した。プラスミドを含有している株を、ｔｒｐ
遺伝子中のＴｎ１０挿入物に連結させたφ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５欠失変異を保
有しているＥ．ｃｏｌｉ株に対して調製した溶解物を使用して形質導入した。ｔ
ｒｐ遺伝子の挿入の結果として、この変異を保有している株は増殖培地中でトリ
プトファンを必要とする。テトラサイクリン耐性株を選択し、そしてＢＲＬ３７
７６（ＢＲＬ３７５６からＢＲＬ３７６０を経由してＢＲＬ３７６６までの株に
由来する）およびＢＲＬ３７７８（ＢＲＬ３７５７からＢＲＬ３７６１を経由し
てＢＲＬ３７６９までの株に由来する）と命名した。これらの株は、ｌａｃＸ７
４ φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ｔｒｐ：：Ｔｎ１０である。野生型のｔｒｐ遺
伝子を回復させるために、株ＢＲＬ３７７６およびＢＲＬ３７７８を、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５αに対して調製したＰ１溶解物を用いて形質導入し、そしてトリプ
トファンを含まない最少培地上で選択した。これらの株は、αフラグメントを含
有しているプラスミドを自発的に取り除き、そして最終的にα相補株であるＢＲ
Ｌ３７８１（ＢＲＬ３７７６に由来する）およびＢＲＬ３７８４（ＢＲＬ３７７
８に由来する）を単離した。これらの株は、ｌａｃＸ７４ φ８０ｄｌａｃＺΔ
Ｍ１５である。ＢＲＬ３７８１およびＢＲＬ３７８４を、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（ＮＲＲＬ、１８１５、Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ
、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、６１０６４）に１９９９年６月１７日に寄
託した。寄託は、ブダペスト条約のもとで行った。ＢＲＬ３７８１には、登録番
号ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ−３０１４３号が与えられ、そしてＢＲＬ３７８４には登
録番号ＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｂ−３０１４４が与えられている。

【００７５】 当業者は、本発明の迅速に増殖する微生物のゲノムに対する他の改変が、上記
の技術を使用して可能であることを理解する。Ｔｎ１０挿入物に対して連結され
た所望される変異を含有しているＥ．ｃｏｌｉは、当業者に周知である供給源か
ら容易に入手可能である。所望される変異は、Ｐ１形質導入を使用して迅速に増
殖する微生物のゲノム中に挿入され得、次いでＴｎ１０がフザリン酸の存在下で
の増殖によって取り除かれ得る。

【００７６】 好ましい実施形態においては、本発明の迅速に増殖する微生物は、誘導性のＴ
７ポリメラーゼ遺伝子を保有する。好ましい実施形態においては、Ｔ７ポリメラ
ーゼ遺伝子は、特に本明細書中で参考として援用されている、Ｂｈａｎｄａｒｉ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７９（１３）：４４０３−４４０６、１
９９７によって記載されているような塩誘導性のプロモーターの制御下にある。
Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は、ｐｒｏＵ遺伝子座の塩誘導性のプロモーターの制御
下にあり得る。あるいは、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は、他の塩誘導性のプロモー
ターの制御下にあり得る。他の適切な誘導性のプロモーターとして、ｌａｃプロ
モーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ならびに当業者に公知の
任意の他の誘導性のプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターの選択およ
び所定のプロモーターの制御下にＴ７ポリメラーゼを保有している株の構築は、
十分に当業者の能力の範囲内である。必要に応じて、誘導性のＴ７ポリメラーゼ
遺伝子を含有している実施形態は、１つ以上のプロテアーゼ遺伝子における変異
、および１つ以上のリボヌクレアーゼ遺伝子における変異を含み得る。このよう
な変異は、上記の方法を使用してゲノム中に挿入され得る。

【００７７】 （実施例２０） （迅速に増殖する微生物の同定） 他の微生物を、迅速に増殖する株を同定するためにスクリーニングする。スク
リーニングする単離物を、適切な固体の培地上にプレートし、そして定義したコ
ロニーのサイズにまで増殖させる。定義したコロニーのサイズに到達するまでの
時間を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋまたは本明細書中に記載する他の株が同じコロニーの
サイズに到達するまでに要する時間に対して比較する。スクリーニングする微生
物として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ、そしてより
詳細には、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｃ、Ｗ，およびＫ株）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、
Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．（特に、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＢ．ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
（特に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、ならびにＳ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（特に、Ｓ．ｔｙｐｈｉまたはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）の属の微生物のような微生物が挙げられるが、これらに限定されない
。抗生物質耐性を与えるプラスミドが微生物内に形質転換されて、上記の技術を
使用してスクリーニングされる。形質転換した微生物を、次いで、抗生物質を含
有している固体の培地上にプレートし、次いで定義されたサイズのコロニーが観
察されるまで適切な温度でインキュベートする。

【００７８】 （実施例２１） （迅速に増殖する微生物を使用するクローニング） 上記で同定した迅速に増殖する微生物を、ＤＮＡフラグメントをクローン化す
るために使用し得る。所望される配列を有しているＤＮＡ挿入物を含有している
組換えベクターの集団を、上記のように構築する。ベクターは、抗生物質耐性遺
伝子をコードするＤＮＡ配列を含み得、そして／または１つ以上のマーカー遺伝
子を含み得る。組換えベクターの集団を、任意の従来技術によってコンピテント
にされた迅速に増殖する微生物中に形質転換する。例えば、微生物を、上記で議
論したＨａｎａｈａｎの技術を使用して化学的な手段によってコンピテントにす
る。あるいは、微生物を、増殖培地を回収し、そして微生物を低イオン強度の培
地中に置くことによってエレクトロポレーションについてコンピテントにする。
微生物が外部から適用されたＤＮＡ（および特に組換えプラスミド）を取りこむ
ことを可能にするコンピテント微生物を作製するための任意の方法が、本発明の
実施に適切である。

【００７９】 コンピテント微生物を、コンピテント微生物中への組換えベクターの取り込み
を生じるために適切な条件下で組換えベクターの集団のいくつかまたは全てと接
触させる。適切な条件として、熱ショックが挙げられ得る。例えば、細胞と組換
えベクターの集団との混合物を、４２℃で４５秒間加熱する。あるいは、適切な
条件として、微生物と組換えベクターとの混合物を電場に供することが挙げられ
得る。

【００８０】 組換えベクターが微生物によって取り込まれた後、微生物は、抗生物質耐性遺
伝子の発現を可能にするために十分な時間にわたり増殖させられる。任意のこの
ような時間の後、組換えベクターを含有している微生物を、適切な抗生物質を含
有しているプレート上に広げ、そしてコロニーが可視になるまでインキュベート
する。好ましい実施形態においては、プレートを、約４時間から約１６時間の間
インキュベートする。他の好ましい実施形態においては、プレートを、約４時間
から約８時間の間インキュベートし、そして他の好ましい実施形態においては、
プレートを約４時間から約６時間の間インキュベートする。好ましい実施形態に
おいては、インキュベーション工程を、組換えプラスミドを含有している微生物
が３７℃で増殖するよりも迅速にそれが増殖する３７℃よりも高い温度で行う。
別の好ましい実施形態においては、インキュベーション工程を、４２℃で行う。

【００８１】 コロニーが可視になった後、コロニーのいくつかまたは全てを、液体培地中で
増殖させるために選択する。選択プロセスは、任意の従来の手段によるものであ
り得る。好ましい実施形態においては、微生物およびベクターはα相補が可能で
あり、そして選択は、ＩＰＴＧの存在下でのＸ−ｇａｌプレート上での青色／白
色スクリーニングによるものである。他の好ましい実施形態においては、選択は
、ベクター上に存在するマーカー遺伝子の存在または非存在を検出することによ
るものである。適切なマーカー遺伝子として、ルシフェラーゼをコードする遺伝
子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、お
よびβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定さ
れない。

【００８２】 選択したコロニーを、分析のために適切な組換え微生物の量を産生するために
十分な時間の間、液体培地中で増殖させる。組換えベクターを微生物から単離す
る。好ましい実施形態においては、液体培地中での増殖時間は、約２時間から約
１６時間である。他の好ましい実施形態においては、液体培地中での増殖時間は
、約２時間から約８時間であり、そして他の好ましい実施形態においては、液体
培地中での増殖時間は、約２時間から約４時間である。

【００８３】 組換えベクターを、任意の従来の手段によって単離する。好ましい実施形態に
おいては、組換えベクターを、アルカリ溶解「ミニプレップ」技術によって単離
する。必要に応じて、単離には、カラム精製工程を使用し得る。単離したベクタ
ーを、例えば、１つ以上の制限酵素での事前のプラスミドの消化を伴うかまたは
それを伴わないプラスミドのアガロースゲル電気泳動による、任意の従来技術に
よって分析する。他の適切な技術として、プラスミドの配列決定が挙げられる。
プラスミドのＤＮＡ配列を決定するための技術が、当業者に周知である。

【００８４】 本発明は、理解を明確にする目的のための説明および実施例の方法によって本
明細書中でいくらか詳細に完全に記載されているが、同じものが、本発明または
その任意の特異的な実施形態の範囲を逸脱することなく、広範でありそして同等
の範囲の条件、処方物、および他のパラメーター内で本発明を改変しそして変更
することによって行われ得ることが、当業者に明らかである。そしてこのような
改変または変更が、添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図されることが
、当業者に明らかである。

【００８５】 本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願が、本発明が関
係する当業者のレベルの指標であり、そしてそれらのそれぞれの刊行物、特許、
または特許出願が本明細書中で詳細かつ個々に参考として援用される場合と同じ
程度まで、本明細書中で参考として援用される。

【００８６】 （表１：実験において使用された株の一覧表）

【００８７】

【表１】 （表２：ｐＵＣ１９ＤＮＡを用いた形質転換後のアンピシリン耐性コロニーに
対する時間単位における時間）

【００８８】

【表２】 （表３：ｐＵＣ１９ＤＮＡを用いた形質転換後のアンピシリン耐性コロニーに
対する時間単位における時間）

【００８９】

【表３】 （表４：ｐＵＣ１９ＤＮＡを用いた形質転換後のアンピシリン耐性コロニーに
対する時間単位における時間）

【００９０】

【表４】

【００９１】

【表５】

【００９２】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＡＴＣＣ９６３７の５．５ｋｂのプラスミドの制限地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リン， ジェイ−ジュ アメリカ合衆国 メリーランド 20854， ポトマック， キャンドルライト コー ト ４ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA02 DA06 GA11 HA01 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26 AB01 AC02 BA02 CA24 CA44

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 内因性プラスミドを欠失している、迅速に増殖する微生物。
2. 【請求項２】 前記迅速に増殖する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の
   微生物である、請求項１に記載の微生物。
3. 【請求項３】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２
   に記載の微生物。
4. 【請求項４】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である、請
   求項３に記載の微生物。
5. 【請求項５】 前記迅速に増殖する微生物が、ＢＲＬ３７８１、ＢＲＬ３７
   ８４、およびそれらのｒｅｃＡ^-誘導体からなる群より選択される、請求項４に
   記載に微生物。
6. 【請求項６】 クローニング方法であって、以下の工程： 組換えベクターの集団を構築する工程； 該組換えベクターで、迅速に増殖し得るコンピテントな微生物を形質転換する
   工程；および 該組換えベクターを含有している形質転換された微生物を選択する工程 を包含する、方法。
7. 【請求項７】 前記迅速に増殖する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の
   微生物である、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項７
   に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である、請
   求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記迅速に増殖する微生物が内因性ベクターを含まない、
    請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記形質転換された微生物から前記組換えベクターを単離
    する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記形質転換された微生物を、３７℃より高い温度で増殖
    させる工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記温度が約４２℃である、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記形質転換された微生物を、約４２℃で増殖させる工程
    をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
15. 【請求項１５】 タンパク質またはペプチドを産生する方法であって、以下
    の工程： タンパク質またはペプチドタンパク質をコードする遺伝子を含有している組換
    えベクターを構築する工程； 該ベクターを、迅速に増殖し得るコンピテントな微生物中に形質転換する工程
    ；および 該形質転換された微生物に該タンパク質またはペプチドを産生させる条件下で
    、該形質転換された微生物を培養する工程 を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 前記迅速に増殖する微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の
    微生物である、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項
    １６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である、
    請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記迅速に増殖する微生物が内因性プラスミドを含まない
    、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 クローニングのための微生物を産生する方法であって、以
    下の工程： 内因性プラスミドを有している迅速に増殖する微生物を得る工程；および 該微生物の内因性プラスミドを取り除く工程 を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 前記微生物がＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である、請求項２０に記
    載の方法。
22. 【請求項２２】 迅速に増殖する微生物を形質転換する方法であって、以下
    の工程： 迅速に増殖し得るコンピテントな微生物を得る工程；および 該微生物に１つ以上のベクターを取りこませる条件下で、該１つ以上のベクタ
    ーの存在下において、該コンピテントな微生物をインキュベートする工程 を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 前記迅速に増殖する微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の
    微生物である、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項
    ２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である、
    請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記迅速に増殖する微生物が内因性プラスミドを含まない
    、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 迅速に増殖する微生物を含有している容器を備える、クロ
    ーニング用キット。
28. 【請求項２８】 １つ以上のベクターをさらに備える、請求項２７に記載の
    キット。
29. 【請求項２９】 前記キットが、１つ以上の制限酵素、１つ以上のリガーゼ
    酵素、および１つ以上のポリメラーゼ、から選択される少なくとも１つの成分を
    さらに備える、請求項２８に記載のキット。
30. 【請求項３０】 組換えタンパク質を含有している容器をさらに備える、請
    求項２９に記載のキット。
31. 【請求項３１】 前記迅速に増殖する微生物がコンピテントである、請求項
    ２７に記載のキット。
32. 【請求項３２】 前記迅速に増殖する微生物が化学的コンピテントである、
    請求項３１に記載のキット。
33. 【請求項３３】 前記迅速に増殖する微生物が電気的コンピテントである、
    請求項３１に記載のキット。
34. 【請求項３４】 迅速に増殖する微生物を含有している、組成物。
35. 【請求項３５】 グリセロール溶液およびコンピテンス緩衝液からなる群よ
    り選択される成分をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
36. 【請求項３６】 １つ以上のＤＮＡフラグメント、１つ以上のリガーゼ酵素
    、１つ以上のベクター、１つ以上の緩衝化塩、および１つ以上の組換えタンパク
    質、から選択される少なくとも１つの成分をさらに含有している、請求項３４に
    記載の組成物。
37. 【請求項３７】 コンピテントな迅速に増殖する微生物を作製する方法であ
    って、以下の工程： 迅速に増殖する微生物を得る工程；および 該迅速に増殖する微生物をコンピテントにするように、該迅速に増殖する微生
    物を処理する工程 を包含する、方法。
38. 【請求項３８】 前記迅速に増殖する微生物の内因性ベクターを取り除く工
    程をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記迅速に増殖する微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の
    微生物である、請求項３７に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項
    ３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記迅速に増殖する微生物がＥ．ｃｏｌｉ Ｗ株である、
    請求項４０に記載の方法。