CN111735943A - 一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明提供的试剂盒在胶体金二联卡的分析膜上同时设置检测非洲猪瘟病毒抗原和抗体的检测线，并优选非洲猪瘟病毒P30蛋白做抗体的检测，非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体做抗原的检测，配合使用配套的样品稀释液，可以一步法操作同时检测猪全血中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体和P72蛋白抗原。

Description

一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒 及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域中的抗原和抗体检测领域，具体涉及一种能够同步检测猪血中 非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(Africa swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africa swine fevervirus，ASFV) 引起的家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性的疾病。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情， 该病已在全球数十个国家流行。经基因进化树分析发现该毒株属于基因II型，与Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支。

目前尚无有效的疫苗来预防非洲猪瘟病毒，只能通过“检疫-淘汰”的模式进行生物防护。 现有对非洲猪瘟的检测分两种，一种是病原检测；另外一种是抗体检测。

病原的检测有两种方法，一种是分子生物学的方法，检测病毒的核酸；另外一种是免疫 学方法，检测病毒的蛋白抗原。分子生物学方法主要是各种PCR的方法，包括荧光PCR、等 温介导的PCR等模式。PCR的方法灵敏度高，特异性好，但是需要专门的仪器(各种PCR仪)、专业的实验人员以及专门的实验室。有时会因为气溶胶的污染导致全部待测样品假阳性结果的出现。免疫学的方法主要是指基于抗原抗体反应的胶体金方法，该法灵敏度低于PCR 方法，但是对于人员、操作环境和仪器设备都没有要求，特别适合于现场或基层使用，尤其 是不具备实验条件的单位。因此，免疫学方法和分子生物学方法各自有适合的使用环境。

非洲猪瘟病毒抗体的检测只能采用免疫学方法实现，不能用分子生物学方法。抗体是抗 原免疫后或者病毒感染后的产物，一般3-7天开始产生，30天前后达到峰值。感染非洲猪瘟 病毒的猪也会产生抗体。感染非洲猪瘟病毒而没有死亡，能够存活下来的猪，人们称之为“耐 过猪”。这种耐过猪检测病原包括各种PCR方法检测非洲猪瘟病毒核酸或胶体金检测病毒蛋 白，一般都为阴性，但是检测抗体却会呈现阳性。现有研究(P.L.Eblé等，Transmission of African Swine Fever Virus via carrier(survivor)pigs doesoccur，Veterinary Microbiology，2019年10月 第237期)表明临床健康的带毒康复猪(“耐过猪”)也可以引发非瘟急性感染，造成非瘟 病毒在猪群中持续存在。这种耐过猪也应该逐步淘汰，避免进一步散毒的风险。因此，有研 究者建议猪场应该筛选“双阴性”的猪保留和养殖，所谓双阴性指的是病原和抗体同时阴性。 临床常用的抗体检测方法是胶体金抗体试纸条或ELISA试剂盒，如前所述，各自有自己适合 的使用环境。非洲猪瘟抗体ELISA试剂盒适合相对专业的实验室；胶体金方法更适合现场和 基层使用。

非洲猪瘟病毒是一种烈性、高度接触性的传染病，减少猪间的交叉感染是防护的重要手 段。如果一次采血，同时检测非洲猪瘟病原和非洲猪瘟抗体，对于非洲猪瘟的预防将有重大 的帮助意义。但是，目前还未见能够同时检测非洲猪瘟病毒病原(核酸或蛋白抗原)和非洲 猪瘟病毒抗体的产品。另外，传统方法检测抗体都是检测血清中的抗体，需要采血、分离血 清，容易形成气溶胶，增加了生物风险。另一方面，不能直接检测全血，还需配备血清分离 装备，现场检测操作不方便。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种能够同步检测猪 血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒，其包括：

胶体金二联卡，其由胶体金试纸条制成，其中所述胶体金试纸条的分析膜上设置有两条 检测线T1和T2以及一条质控线C，在所述胶体金二联卡上对应于检测线和质控线的位置设 置有观察窗，在对应于胶体金试纸条的样品垫的位置开设加样孔；

其中所述两条检测线T1和T2中，一条由非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体制成，另 一条优选由非洲猪瘟病毒P30蛋白制成；

所述猪血为猪的全血。

上述试剂盒还包括：针对猪全血的样品稀释液，其配方为：TRIS(CAS：77-86-1)6g，酪蛋白钠盐(CAS：9005-46-3)5g，PVP(CAS：9003-39-8)5g，TWEEN20(CAS：9005-64-5) 10ml，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4。

上述非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体包括但不限于非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆 抗体2H11和2E7。

上述非洲猪瘟病毒P30蛋白包括但不限于如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示 的氨基酸序列的蛋白。

上述试剂盒还包括使用说明，其包括以下步骤：

1)对一份猪血样本用样品稀释液进行稀释，作为待检样品；

2)将待检样品加入胶体金二联卡的加样孔中，计时10-20分钟后观察胶体金二联卡的观 察窗中质控线C以及两条检测线T1和T2是否有条带出现；

3)结果分析：

若质控线C有条带出现即为实验有效；否则实验无效应重新检测；

在质控线C有条带出现的情况下：

若检测线T1有条带出现，检测线T2无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白 抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阴性；

若检测线T1无条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白 抗体阴性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1有条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白 抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1和T2均无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体和非洲猪瘟 病毒P72蛋白抗原均为阴性。

上述步骤1)中进行稀释的倍数为10-15倍；步骤2)中加入加样孔中的待检样品的量为 50μl-100μl。

上述试剂盒包括以下组成：

胶体金二联卡，共计20张，分别单独包装；

样品稀释液，共计20瓶，630μl/瓶；和

使用说明，其包括：

(1)一份70μl猪血用630μl样品稀释液进行稀释，作为待检样品；

(2)取稀释后的70μl待检样品加入胶体金二联卡的加样孔中，计时10-20分钟后观察 胶体金二联卡的观察窗中质控线C以及两条检测线T1和T2是否有条带出现；

(3)结果分析：如上述步骤3)提及。

基于免疫学方法对猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体同步检测的蛋白组合也属于本发明的 内容，该蛋白组合包括用作抗原检测的非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体，和用作抗体检 测的非洲猪瘟病毒P30蛋白。

本发明另一方面提供了猪全血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的非疾病诊断目的的同步检测 方法，其包括用上述的试剂盒针对猪血全血样本(无需分离血清)进行检测，根据两条检测 线T1和T2以及质控线C是否有条带出现的情况得出检测结果。

上述方法包括以下步骤：

(A)对一份猪血样本用样品稀释液进行稀释，作为待检样品；其中稀释的倍数为10-15 倍；

(B)将待检样品加入胶体金二联卡的加样孔中，加入的量为50μl-100μl，计时10-20分 钟后观察胶体金二联卡的观察窗中质控线C以及两条检测线T1和T2是否有条带出现；

(C)结果分析：

若质控线C有条带出现即为实验有效；否则实验无效应重新检测；

在质控线C有条带出现的情况下：

若检测线T1有条带出现，检测线T2无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白 抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阴性；

若检测线T1无条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白 抗体阴性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1有条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白 抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1和T2均无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体和非洲猪瘟 病毒P72蛋白抗原均为阴性。

基于以上技术方案提供的能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒和检测 方法，通过选择确定合适的蛋白，在胶体金二联卡的分析膜上制成能够同步检测非洲猪瘟病 毒抗原和抗体的检测线，并配合使用与该胶体金二联卡配套的适于对猪血全血样本检测的样 品稀释液，不仅可以实现对猪全血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的同步检测，还无需进行血清 分离等操作。与现有技术相比，具有以下有益效果：

1)利用与胶体金二联卡匹配的样品稀释液对猪全血进行稀释，可以对猪全血直接检测， 不必分离血清，降低生物风险，也方便现场操作；

2)一次检测同时获得两个结果，检测线分别由非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体和优 选的P30重组蛋白包被，能够同步检测获得猪血中非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原和非洲猪瘟病 毒P30蛋白抗体的阴阳性状态；

3)目测判断结果，不必专业的仪器设备；

4)操作简单，不必专业人员即可操作，尤其是适合现场、基层或生猪调运临场快检使用。

5)针对猪全血的检测，能在制备猪血液制品及血液来源制品时对血源安全进行监控。例 如：猪饲料中一般含有以猪血为原料的蛋白组分，如猪血中含有非洲猪瘟病毒则可能会造成 新的传染。除此之外，细胞培养基中加入的转铁蛋白一般都是以猪血为原料提取的，对作为 原料的猪血进行全血检测，可以保证提取的转铁蛋白安全可靠。

附图说明

图1是表达P30重组蛋白的重组质粒pET28ɑ-P30图谱；

图2是P30重组蛋白核酸序列的测序图谱；

图3是非洲猪瘟病毒P30重组蛋白电泳照片；

图4是检测非洲猪瘟病毒抗原和抗体的胶体金二联卡组装示意图，其中A为正面图；B 为组装顺序图；C为层析方向；

图5是胶体金二联卡结果判断方式示意图，其中C为质控线；T1为P30抗体的检测线；T2为P72抗原的检测线；S为加样孔；

图6是非洲猪瘟病毒P54重组蛋白电泳照片。

具体实施方式

本发明旨在提供一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和非洲猪瘟病毒抗体的试剂 盒及检测方法，以实现猪全血样本中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的一步操作同时检测。

为了实现上述目的，本发明人首先利用免疫学的基本原理和胶体金免疫层析技术制备了 具有两条检测线的胶体金二联卡，然而，针对同一种病毒的抗原和抗体的同时检测，在两条 检测线上分别包被不同的蛋白时，可能由于蛋白本身各种理化性质的差异存在相互之间的干 扰和影响，而不能够实现抗原抗体联合检测，因此选择合适的检测线标记蛋白至关重要。针 对非洲猪瘟病毒的抗原和抗体的同时检测，本发明人在一系列由非洲猪瘟病毒基因编码的蛋 白(包括P12、P17、P72、P14、CD2V、P30、PE248R、P54等)筛选试验过程中，偶然间 发现P72蛋白(以P72蛋白的单克隆抗体标记检测线用于检测P72蛋白)和P30蛋白(以P30 蛋白标记检测线用于检测P30蛋白抗体)的组合能够实现同步检测猪全血样本中的非洲猪瘟 病毒抗原(P72蛋白抗原)和抗体(P30蛋白抗体)的目的，并基于此开发出了本发明提供的 能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和非洲猪瘟病毒抗体的试剂盒及检测方法。

通过以下具体实施例详细说明本发明。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公 开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广 泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过 程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1：非洲猪瘟病毒P30蛋白的重组表达

非洲猪瘟病毒P30蛋白是由非洲猪瘟病毒基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:1所示，在GeneBank中的登录号为ACJ61575.1。该实施例目的在于高效表达制 备该非洲猪瘟病毒P30蛋白(以下称为P30重组蛋白)，以用于以下实施例中作为胶体金二 联卡上检测线标记蛋白，具体包括以下步骤：

1.1、重组菌的构建及鉴定

从数据库中检索获得非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码基因(GenBank：EU874316.1)，并 对其进行密码子优化，以使其高效表达，该步骤委托中美泰和生物技术(北京)有限公司通 过化学合成法进行合成目的基因，并将合成的目的基因通过Nco I和Xho l酶切位点插入 pET28a载体中，并在3’端插入终止密码子。在载体序列和目的基因序列中插入G4S连接序 列以避免载体序列对目的基因的表达蛋白(即目标蛋白P30重组蛋白)免疫原性的影响，构 建获得一重组质粒，命名为pET28a-P30，如图1所示，示出了该重组质粒的图谱。将最终构 建的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得表达目标蛋白的阳性菌株 pET28a-P30-BL21(DE3)株。将阳性菌株pET28a-P30-BL21(DE3)株委托中美泰和生物技 术(北京)有限公司进行核苷酸序列测定，核酸序列鉴定报告见图2，其中A和B幅为F向 测序结果，C和D幅为R向测序结果，证明获得测序正确的表达目标蛋白P30重组蛋白的阳 性菌株，置于-70℃冰箱中保存备用。经测序，目标蛋白P30重组蛋白的氨基酸序列如序列表 中SEQ ID NO:2所示。

1.2、重组蛋白的表达及鉴定

1)菌种活化：从-70℃冰箱中取出阳性菌种，室温融化，按0.1％的比例接种含100μg/ml 卡那霉素的LB培养基中，置30℃空气摇床、以160r/min振荡培养过夜。

2)诱导前培养：将活化后的菌种按0.1％的比例接种含100μg/ml卡那霉素的LB培养基 中，置37℃空气摇床、以160r/min振荡培养2小时。

3)诱导：向步骤2)中的LB培养基中加1mol/L的IPTG至终浓度为1mmol/L，置37℃空气摇床、以160r/min振荡培养4小时。

4)离心收集菌体：收集步骤3诱导培养后的菌液，在2～8℃下、以10000r/min离心10 分钟，收集菌体沉淀，置-20℃以下保存。

5)包涵体的提取

5.1)取步骤4)收集的菌体沉淀5g置250ml三角瓶中，用100ml Tris-HCl(25mmol/L， pH值8.0)溶液重悬，然后加溶菌酶100mg，制成1mg/ml溶菌酶菌悬液，置磁力搅拌器上，以10000r/min搅拌10分钟。

5.2)将步骤5.1)的三角瓶置冰浴中进行超声破碎，超声破碎仪功率为150W，工作3秒， 间隔7秒，共超声破碎20分钟。

5.3)将步骤5.2)的三角瓶中的悬液在2～8℃下，以12000r/min离心20分钟，弃上清， 沉淀用含1mol/L NaCl的Tris-HCl(25mmol/L，pH值8.0)溶液洗1次，再用Tris-HCl(25mmol/L， pH值8.0)溶液洗2次，50ml/次，每次离心同上，收集沉淀。

5.4)沉淀用100ml含8mol/L脲和1％巯基乙醇的Tris-HCl(25mmol/L，pH值8.0)溶液 重悬，在2～8℃下，以12000r/min离心20分钟，取上清。

6)柱层析纯化

6.1)树脂的预处理：将Ni-Sepharose树脂装入树脂柱中，先用10倍树脂体积的双蒸水 洗3次，再用10倍树脂体积的含8mol/L脲和1％巯基乙醇的Tris-HCl(25mmol/L，pH值8.0) 溶液洗至紫外层析仪(仪器灵敏度0.5、纸速1.5cm/小时)显示为基线。

6.2)上样：取上述步骤5.4)收集的上清，上样至树脂柱中。

6.3)除杂：用含6mol/L脲和1％巯基乙醇的Tris-HCl(25mmol/L，pH值8.0)溶液洗脱 树脂柱至紫外层析仪显示为基线。用含6mol/L脲、1％巯基乙醇和25mmol/L咪唑的Tris-HCl (25mmol/L，pH值8.0)溶液洗出杂蛋白峰。

6.4)洗脱：用含6mol/L脲、1％巯基乙醇和250mmol/L咪唑的Tris-HCl(25mmol/L，pH 值8.0)溶液洗脱，收集洗脱峰。

7)Sephadex G-50柱脱盐

7.1)树脂的预处理：将Sephadex G-50树脂装入树脂柱中，用含0.1％SDS的Tris-HCl (25mmol/L，pH值8.0)溶液洗至紫外层析仪(仪器灵敏度0.5、纸速1.5cm/小时)显示为基线。

7.2)上样：取步骤6.4)收集的洗脱峰，上样至Sephadex G-50树脂柱中，上样体积不超 过柱体积的20％，用含0.1％SDS的Tris-HCl(25mmol/L，pH值8.0)溶液洗脱，收集第一峰 至离心管中，即为纯化的P30重组蛋白。

8)重组蛋白浓度和纯度测定

8.1)SDS-PAGE检测蛋白纯度：取纯化的P30重组蛋白20μl，与5×SDS凝胶加样缓冲液按1:4的比例混匀，100℃金属浴10分钟，轻微离心，备用。取处理后的样品10μl及蛋白 分子量Marker进行12％SDS-PAGE电泳试验，并用软件BandScan 5.0对凝胶图像进行分析， 得到蛋白电泳纯度为94.2％，其中重组蛋白的SDS-PAGE电泳图像如图3所示，其中右侧泳 道为Marker，左侧泳道为P30重组蛋白的纯化液。

8.2)BCA方法测定蛋白浓度：取7.2)步骤中的纯化的P30重组蛋白，对10mM PBS pH7.2-7.4分步透析不低于1万倍。采用常规PCR方法进行蛋白浓度测定，得到纯化的P30重组蛋白的浓度为1.8mg/ml。用10mM PBS pH 7.2-7.4的溶液稀释成1.0mg/ml，分装，1mg/支， -20℃保存备用。

实施例2：能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒

该实施例组合以下两种检测获得能够同时检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂 盒：以上述实施例1制备获得的P30重组蛋白双抗原夹心法检测非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体， 和以非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原。其中 试剂盒的构建基于胶体金免疫层析技术，即该试剂盒主要包括由玻璃纤维膜样品垫、结合物 释放垫、吸水垫、分析膜(硝酸纤维素膜(NC膜))组成的胶体金试纸条制成的测试卡(命 名为胶体金二联卡)，其中硝酸纤维素膜上设有两条检测线(T1和T2)和一条质控线(C 线)，该两条检测线上分别标记用于以上两种检测的蛋白。

2.1、胶体金试纸条和胶体金二联卡的制备

2.1.1、包被硝酸纤维素膜(NC膜)

用浓度为1-5mg/mL的兔抗鼠IgG抗体(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线C； 用浓度为0.5-2.5mg/mL的非洲猪瘟病毒P30重组蛋白(实施例1获得)包被检测线T1；用浓度为1-5mg/mL的非洲猪瘟病毒P72单克隆抗体2H11(购自杭州贤至生物科技有限公司)包被检测线T2。具体操作为：用上海金标生物科技有限公司生产的XYZ三维划膜喷金仪分别将兔抗鼠IgG抗体、P30重组蛋白和P72单克隆抗体2H11分别喷于300mm长、20mm宽 的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的质控线C、检测线T1和检测线T2，自上而下依次为C、 T1和T2(自上而下依次为C、T2和T1也能够实现本发明的目的)。相邻两线之间的间距为 0.3-0.5cm，通常选择0.4cm。37℃干燥1小时后备用。

2.1.2、结合物释放垫的制备

1)用胶体金标记非洲猪瘟病毒P30重组蛋白，具体操作为：在磁力搅拌下，向三角瓶中 加入145mL纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液5mL，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液7mL，煮沸5分钟。冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入10μl 0.2M 碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μl抗原，混匀后静置30min。加入10μl 20％BSA溶液， 平衡5min。加入10μl 20％PEG20000溶液，平衡30min；用离心机10000rpm，离心10min， 去上清液。加入100μl金标复溶液(含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1Triton X100、 0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。

2)按照以上相同的操作步骤用胶体金标记非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体2E7(购 自杭州贤至生物科技有限公司)。

3)胶体金标记物混合液制备：将以上两种胶体金标记物按照1:1-1:4的比例混匀。

4)制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，将步骤3)中的胶体金按照 8μl/cm的速度喷膜，37℃下放置2小时干燥，备用。

2.1.3、制备胶体金试纸条和胶体金二联卡

如图4所示，为胶体金试纸条的结构示意图，根据图4中A幅可知，该胶体金试纸条包 括：PVC背板7、吸水垫1、硝酸纤维素膜2、结合物释放垫3、样品垫4，其中在硝酸纤维 素膜2上设置有两条检测线(T1检测线6和T2检测线8)和一条质控线C(图4中标号5 表示)，在制备该胶体金试纸条时，如图4中B幅所示，在PVC背板7上先粘贴硝酸纤维素 膜2，在靠近硝酸纤维素膜2质控线C的一端粘贴吸水垫1，在靠近检测线T2的一端粘贴结 合物释放垫3和样品垫4，制成胶体金大板，然后可按所需大小进行切割，得到用于能够同 时检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的胶体金试纸条，加干燥剂后密封保存。

将上述步骤制备的胶体金试纸条装入塑料卡中，可以制成测试卡(即胶体金二联卡)， 并在胶体金二联卡上对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观 测窗。每张胶体金二联卡加上1袋干燥剂用铝箔袋密封。

2.2、样品稀释液

实施例针对猪全血样本检测，由于猪血比较粘稠，并且为了实现猪全血检测的目的，检 测前需对猪血进行稀释，发明人优化了针对猪血全血样本进行稀释的样品稀释液，使其可以 降低猪全血中的血细胞的量以适宜与上述步骤2.1制备的胶体金二联卡配合使用，使待检样 品液流在胶体金二联卡上顺畅流动而不会导致堵塞。因此该实施例提供的试剂盒还包括样品 稀释液，其中样品稀释液配方为：TRIS(CAS：77-86-1)6g，酪蛋白钠盐(CAS：9005-46-3) 5g，PVP(CAS：9003-39-8)5g，TWEEN20(CAS：9005-64-5)10ml，双蒸水定溶至1000mL， 测定pH值为7.2-7.4。该优化的样品稀释液能与上述步骤2.1制备的胶体金二联卡配套使用， 且在针对猪全血中非洲猪瘟病毒抗原检测时，特异性好，灵敏度高，可以满足非洲猪瘟病毒 抗原检测的高灵敏度要求。

综上所述，该实施例提供的试剂盒包括：

胶体金二联卡，其为单独包装，每张胶体金二联卡加上1袋干燥剂用铝箔袋密封，在每 个试剂盒中可以包括多张胶体金二联卡，例如20张。其中在胶体金二联卡的硝酸纤维素膜上 的两条检测线分别被P30蛋白(例如非洲猪瘟病毒自然状态下由其基因编码的P30蛋白或实 施例1制备的P30重组蛋白)和P72蛋白的单克隆抗体(例如非洲猪瘟病毒P72单克隆抗体 2H11)包被。

样品稀释液，其也为单独包装，每瓶可含有630μl样品稀释液(配方为：TRIS(CAS：77-86-1)6g，酪蛋白钠盐(CAS：9005-46-3)5g，PVP(CAS：9003-39-8)5g，TWEEN20 (CAS：9005-64-5)10ml，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4)，每个试剂盒中可 包括多瓶样品稀释液，例如20瓶。

2.3、试剂盒的使用说明

该实施例提供的试剂盒的使用说明包括：

1)对一份猪血样本用样品稀释液进行稀释(例如一份70μl猪血用630μl样品稀释液进 行1:10比例稀释)，作为待检样品；

3)取出足够数量的胶体金二联卡，打开铝箔袋包装，按照样品顺序编号；

4)依次向胶体金二联卡加样孔中加入待检样品(例如70μl)，计时10-20分钟；

5)目测观察胶体金二联卡的两条检测线(T1和T2)和一条质控线(C)是否有条带出现，判断待检样品中非洲猪瘟病毒抗原及抗体的阴阳性。

如图5所示，示出了胶体金二联卡结果的分析：首先观察质控线C，若质控线C有条带 出现即为实验结果有效，否则实验结果无效，需重新检测。在质控线C有条带出现的情况下， 再观察检测线T1和T2，若检测线T1和T2均有条带出现(图5中A幅)，则为非洲猪瘟病 毒P30蛋白抗体和P72蛋白抗原阳性；若检测线T1有条带出现，而检测线T2没有条带出现 (图5中B幅)，则为非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体阳性，P72蛋白抗原阴性；若检测线T1 没有条带出现，而检测线T2有条带出现(图5中C幅)，则为非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体 阴性，P72蛋白抗原阳性；若检测线T1和T2均没有条带出现(图5中D幅)，则为非洲猪 瘟病毒P30蛋白抗体阴性，P72蛋白抗原阴性。

综上，该实施例提供的试剂盒还可包括上述步骤2.3的使用说明。

2.4、试剂盒的现场使用

2.4.1、该实验为使用该实施例提供的试剂盒(本试剂盒)对某猪场拟外购能繁母猪50头 进行非洲猪瘟病毒抗原和抗体检测。检验员现场通过猪耳采集全血50份，应用本试剂盒检测， 结果发现非洲猪瘟病毒抗原阳性0头；非洲猪瘟病毒抗体阳性5头。分析非洲猪瘟抗体阳性 猪为耐过猪，由于耐过猪依然存在散毒风险，因此放弃采购这5头猪，只采购其余的45头猪。

2.4.2、该实验为使用该实施例提供的试剂盒(本试剂盒)对另一猪场存栏母猪100头进 行非洲猪瘟病毒抗原和抗体检测。检验员发现某一栋舍猪存在不吃食、体温升高等现象，怀 疑感染非洲猪瘟病毒。检验员对该栋舍猪全部采集耳血，应用本试剂盒检测，发现非洲猪瘟 病毒抗原阳性5头，抗体阳性3头；对于阳性猪全部淘汰。对临近栋舍同样采血检验，及时 淘汰阳性猪。最终，通过这种“定点拔牙”模式，存活70％以上的猪。

实施例3：抗原和抗体检测方法比对

3.1、非洲猪瘟病原检测方法比对

该实验利用上述实施例2提供的试剂盒与现有的用于非洲猪瘟病原检测的荧光PCR试剂 进行比较，以对本发明提供的试剂盒的检测非洲猪瘟病毒抗原的灵敏度和特异性进行说明， 具体包括以下步骤：

3.1.1、待测样品：收集怀疑非洲猪瘟发病猪(来源于河北某猪场)血液样品20份；健康 猪血液样品20份。

3.1.2、分别以上述实施例2提供的试剂盒和唐山怡安生物工程有限公司生产的非洲猪瘟 荧光PCR试剂对以上40份待测样品进行检测，其中该荧光PCR方法作为参考方法。

两种方法的检测结果如下表1所示，可见两种检测方法总符合率达到90％，说明本发明 提供的试剂盒用于检测非洲猪瘟病原时具有很高的灵敏度和特异性。

表1：非洲猪瘟病原检测方法比对

阴性符合率＝20/21*100％＝95.2％；

阳性符合率＝16/19*100％＝84.2％；

总符合率＝(20+16)/40*100％＝90％。

3.2、非洲猪瘟抗体检测方法比对

该实验利用上述实施例2提供的试剂盒与现有的用于非洲猪瘟抗体检测的ELISA方法进 行比较，以对本发明提供的试剂盒的检测非洲猪瘟病毒抗体的灵敏度和特异性进行说明，具 体包括以下步骤：

3.2.1、待测样品：收集疑似耐过猪血液样品26份；健康猪血液样品20份。

3.2.2、以西班牙进口非洲猪瘟抗体ELISA试剂盒作为参考方法，应用本发明提供的试剂 盒同时对上述46份待测样品进行检测。

两种检测方法的结果如下表2所示，可见两种检测方法总符合率达到97.8％，说明本发 明提供的试剂盒用于检测非洲猪瘟病毒抗体具有很高的灵敏度和特异性，与ELISA结果相当。

表2：非洲猪瘟抗体检测方法比对

阴性符合率＝19/19*100％＝100％；

阳性符合率＝26/27*100％＝96.3％；

总符合率＝(19+26)/46*100％＝97.8％。

综上所述，不论是检测非洲猪瘟病毒抗原还是检测非洲猪瘟病毒抗体，本发明提供的试 剂盒(本试剂盒)与参考方法的符合率都很高，且本试剂盒可以一步实现非洲猪瘟病毒抗原 和抗体的联合检测，大大简化了检测的步骤和时间。在检测过程中，本试剂盒针对的非洲猪 瘟病毒抗原为P72蛋白；针对的非洲猪瘟病毒抗体为P30蛋白的抗体，两种蛋白相互独立、 不冲突，不会产生干扰和影响。

另外，与现有的用于非洲猪瘟病毒抗原检测的荧光PCR试剂以及用于非洲猪瘟病毒抗体 检测的ELISA试剂盒相比，本试剂盒还具有以下表3所示的优势。

表3：相对于荧光PCR试剂和抗体检测ELISA试剂盒，本试剂盒的特点

比较例：应用非洲猪瘟病毒P54重组蛋白和P72蛋白单克隆抗体一步法同时检测非洲猪 瘟病毒抗原和抗体(作为本发明提供的试剂盒的对比试剂盒)

该比较例如实施例2所示，组合以下两种检测对非洲猪瘟病毒的抗原和抗体进行一步法 同时检测：以非洲猪瘟病毒P54重组蛋白双抗原夹心法检测非洲猪瘟P54抗体和以非洲猪瘟 病毒P72蛋白单克隆抗体双抗体夹心法检测非洲猪瘟P72蛋白抗原。具体包括以下步骤：

4.1、按照实施例1所述的方法制备非洲猪瘟病毒P54重组蛋白，其中目的基因合成和最 终构建的重组质粒的测序均有中美泰和生物技术(北京)有限公司完成，经测序，P54重组 蛋白氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

4.2、按照实施例1所述的方法，对非洲猪瘟病毒P54重组蛋白进行诱导表达纯化，最终 获得的非洲猪瘟病毒P54重组蛋白经SDS-PAGE法鉴定的纯度为94.2％，浓度为2.4mg/ml， 同样用10mM PBS pH 7.2-7.4稀释成1.0mg/ml，分装小份，-20℃保存备用。其中P54重组蛋 白的SDS-PAGE电泳照片如图6所示，其中最左侧一列为Marker的标记，最右侧泳道为Marker，中间两泳道为P54重组蛋白的纯化液。

4.3、按照实施例2中2.1的方法制备胶体金试纸条和胶体金二联卡，不同之处仅在于胶 体金试纸条上硝酸纤维素膜的检测线T1使用上述步骤4.2获得的非洲猪瘟病毒P54重组蛋白 进行标记。

4.4、按照实施例2中2.2的方法配制稀释液。

4.5、按照实施例2中2.3的操作步骤利用本比较例提供的对比试剂盒分别对实施例3中 3.1的40份待测样品和3.2的46份待测样品进行检测，并分别与现有的荧光PCR方法和抗体 ELISA检测方法进行比对，具体为：

4.5.1、非洲猪瘟病原检测方法比对

与唐山怡安生物工程有限公司生产的非洲猪瘟荧光PCR试剂作为参考方法检测非洲猪瘟 病毒抗原。结果如下表4所示，可见两种检测方法总符合率依然达到90％，说明该对比试剂 盒用于检测非洲猪瘟病原也具有很高的灵敏度和特异性。检测非洲猪瘟病毒抗原主要是针对 P72蛋白位点，本对比试剂盒中所用的P72单克隆抗体及工艺参数没有发生变化，因此在检 测非洲猪瘟病毒抗原方面与实施例3中3.1的结果一致。

表4：非洲猪瘟病原检测方法比对

阴性符合率＝20/21*100％＝95.2％；

阳性符合率＝16/19*100％＝84.2％；

总符合率＝(20+16)/40*100％＝90％。

4.5.2、非洲猪瘟抗体检测方法比对

以西班牙进口非洲猪瘟抗体ELISA试剂盒作为参考方法检测非洲猪瘟病毒抗体。结果见 下表5所示，可见两种检测方法总符合率仅仅达到73.9％，表明在胶体金二联卡这种模式下， 用P54重组蛋白进行非洲猪瘟病毒抗体检测是不可靠的。而实施例3中总符合率高达97.8％， 在两个实验中区别之处仅在于用于抗体检测的重组蛋白，实施例3(即本发明提供的试剂盒) 中是P30重组蛋白，本对比例(即对比试剂盒)中是P54重组蛋白，表明采用不同的蛋白检 测非洲猪瘟病毒抗体，检测结果与西班牙进口非洲猪瘟抗体ELISA试剂盒的阴性符合率、阳 性符合率和总符合率存在显著差异。从两种方法的符合率上看，显然P30重组蛋白效果更佳。

表5：非洲猪瘟抗体检测方法比对

阴性符合率＝7/19*100％＝36.8％；

阳性符合率＝27/27*100％＝100％；

总符合率＝(7+27)/46*100％＝73.9％。

综上结果分析，一方面，由于P30和P54两种重组蛋白在分子量、亲水性/疏水性、空间 构象等方面存在差异，正是这些差异导致了基于这两种蛋白的抗体检测结果存在差异。另一 方面，由于非洲猪瘟病毒抗原检测的检测要求有很高的灵敏度以便能够保证不会出现病毒抗 原漏检，若要满足这个前提，应用不同的蛋白检测抗体会受到工艺参数的限制。如前所述的 实施例3和对比例，分别应用P30或P54蛋白组合P72实现抗原抗体联合检测，在抗原检测 无显著差异前提下，P30和P54在抗体检测应用中与参考方法相比出现较大的差异和波动。 这就证明了不同蛋白(重组抗原和单克隆抗体)在相同的检测体系下组合使用时，确实会存 在相互干扰和影响，造成其中一种蛋白的不适用。综上所述，不同的蛋白因其各种理化性质 的差异，未必适合组合使用实现抗原抗体联合检测，本发明使用P30和P72的组合是优选的 结果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

北京标驰泽惠生物科技有限公司

中国热带农业科学院科技信息研究所

哈尔滨蓝驰生物科技有限公司

<120> 一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Lys

<210> 2

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Ile Ser Phe Tyr Leu Thr Tyr Ile

195 200

<210> 3

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr

20 25 30

Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu

50 55 60

Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu

65 70 75 80

Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala

85 90 95

Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala

100 105 110

Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met

115 120 125

Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala

130 135 140

His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser

145 150 155 160

Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr

165 170 175

His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

180

Claims (10)

1.一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒，其包括：

胶体金二联卡，其由胶体金试纸条制成，其中所述胶体金试纸条的分析膜上设置有两条检测线T1和T2以及一条质控线C，在所述胶体金二联卡上对应于检测线和质控线的位置设置有观察窗，在对应于胶体金试纸条的样品垫的位置开设加样孔；

其中所述两条检测线T1和T2中，一条由非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体制成，另一条优选由非洲猪瘟病毒P30蛋白制成；

所述猪血为猪的全血。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

针对猪全血的样品稀释液，其配方为：TRIS(CAS：77-86-1)6g，酪蛋白钠盐(CAS：9005-46-3)5g，PVP(CAS：9003-39-8)5g，TWEEN20(CAS：9005-64-5)10ml，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.4。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体包括但不限于非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体2H11和2E7。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白包括但不限于如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括使用说明，其包括以下步骤：

1)对一份猪血样本用样品稀释液进行稀释，作为待检样品；

2)将待检样品加入胶体金二联卡的加样孔中，计时10-20分钟后观察胶体金二联卡的观察窗中质控线C以及两条检测线T1和T2是否有条带出现；

3)结果分析：

若质控线C有条带出现即为实验有效；否则实验无效应重新检测；

在质控线C有条带出现的情况下：

若检测线T1有条带出现，检测线T2无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阴性；

若检测线T1无条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体阴性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1有条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1和T2均无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体和非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原均为阴性。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤1)中进行稀释的倍数为10-15倍；步骤2)中加入加样孔中的待检样品的量为50μl-100μl。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组成：

胶体金二联卡，共计20张，分别单独包装；

样品稀释液，共计20瓶，630μl/瓶；和

使用说明，其包括：

(1)一份70μl猪血用630μl样品稀释液进行稀释，作为待检样品；

(2)取稀释后的70μl待检样品加入胶体金二联卡的加样孔中，计时10-20分钟后观察胶体金二联卡的观察窗中质控线C以及两条检测线T1和T2是否有条带出现；

(3)结果分析：如权利要求5中步骤3)提及。

8.基于免疫学方法对猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体同步检测的蛋白组合，包括用作抗原检测的非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体，和用作抗体检测的非洲猪瘟病毒P30蛋白。

9.非洲猪瘟病毒抗原和抗体的非疾病诊断目的的同步检测方法，其特征在于，用权利要求1至7中任一项所述的试剂盒针对猪血全血样本(无需分离血清)进行检测，根据两条检测线T1和T2以及质控线C是否有条带出现的情况得出检测结果。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(A)对一份猪血样本用样品稀释液进行稀释，作为待检样品；其中稀释的倍数为10-15倍；

(B)将待检样品加入胶体金二联卡的加样孔中，加入的量为50μl-100μl，计时10-20分钟后观察胶体金二联卡的观察窗中质控线C以及两条检测线T1和T2是否有条带出现；

(C)结果分析：

若质控线C有条带出现即为实验有效；否则实验无效应重新检测；

在质控线C有条带出现的情况下：

若检测线T1有条带出现，检测线T2无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阴性；

若检测线T1无条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体阴性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1有条带出现，检测线T2有条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体阳性，非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原阳性；

若检测线T1和T2均无条带出现，则待检样品中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体和非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原均为阴性。

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