RU2646807C1 - Способ выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли - Google Patents
Способ выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646807C1 RU2646807C1 RU2017128342A RU2017128342A RU2646807C1 RU 2646807 C1 RU2646807 C1 RU 2646807C1 RU 2017128342 A RU2017128342 A RU 2017128342A RU 2017128342 A RU2017128342 A RU 2017128342A RU 2646807 C1 RU2646807 C1 RU 2646807C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tnf
- igg
- igg1
- subclasses
- igg2
- Prior art date
Links
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 title claims abstract description 72
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 38
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 abstract 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 7
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 4
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 4
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000028557 immunoglobulin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009323 immunoglobulin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа выделения подклассов иммуноглобулина G (IgG) аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF), заключающегося в получении общей фракции IgG аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein G Sepharose с последующей нейтрализацией, объединением и диализом IgG, очистке полученной фракции IgG от примеси TNF. При этом выделение подклассов IgG производят из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, после получения фракции IgG осуществляют ее очистку от примеси TNF ультрафильтрацией с использованием центрифужных фильтров, затем проводят этап выделения антител IgG3 и получения смеси IgG1, IgG2, IgG4 аффинной хроматографией; затем выделяют антитела IgG1 многократной негативной аффинной хроматографией с последующим объединением и диализом, затем выделяют антитела IgG2 многократной негативной аффинной хроматографией с последующим объединением и диализом, затем проводят очистку антител IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 негативной аффинной хроматографией, после чего проводят выделение специфических аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 аффинной хроматографией с последующей нейтрализацией, объединением и диализом. Изобретение обеспечивает получение чистых фракций аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3. 1 пр., 1 табл.
Description
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к фактору некроза опухоли (TNF) из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения.
Аутоантитела к цитокинам присутствуют как у здоровых индивидов, так и у больных различными нозологиями. Наличие различных антицитокиновых аутоантител в норме свидетельствует о том, что они участвуют в поддержании гомеостаза, стабилизируя воспаление и предотвращая повреждение тканей [Nielsen С.Н., Bendtzen К. Immunoregulation by naturally occurring and disease-associated autoantibodies: binding to cytokines and their role in regulation of T-cell responses. // Adv Exp Med Biol. - 2012. - V. 750. - P. 116-32].
В основном исследование содержания аутоантител к цитокинам проводится при измерении содержания общего иммуноглобулина G (IgG), специфичного к определенным молекулам, однако не менее важным является и содержание отдельных подклассов антицитокиновых аутоантител. Кроме того, существуют различия в свойствах каждого из подклассов антител класса IgG [Vidarsson G., Dekkers G., Rispens T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. // Front Immunol. - 2014. - V. 20. - N. 5. - Р. 520]. В ряде работ [Sennikov S.V., Golikova E.A., Kireev F.D., Lopatnikova J.A. Purification of human immunoglobulin G autoantibodies to tumor necrosis factor using affinity chromatography and magnetic separation. // J Immunol Methods. - 2013. - V. 390. - N. 1-2. - P. 92-8. Golikova E.A., Lopatnikova J.A., Kovalevskaya-Kucheryavenko T.V., Nepomnyashih V.M., Sennikov S.V. Levels of TNF, TNF autoantibodies and soluble TNF receptors in patients with bronchial asthma. // J Asthma. - 2013. - V. 50. - N. 7. - P. 705-11. Lopatnikova J.A., Golikova E.A., Shkaruba N.S., Sizikov A.E., Sennikov S.V. Analysis of the levels of tumour necrosis factor (TNF), autoantibodies to TNF, and soluble TNF receptors in patients with rheumatoid arthritis. // Scand J Rheumatol. - 2013. - V. 42. - N. 6. - P. 429-32] показаны изменения в распределении подклассов IgG аутоантител к TNF при ревматоидном артрите и бронхиальной астме.
Авторами обнаружено увеличение содержания аутоантител подклассов IgG2, IgG3 и IgG4 к TNF в сыворотках крови больных ревматоидным артритом и бронхиальной астмой в стадии обострения по сравнению со здоровыми индивидами, а также показано снижение содержания аутоантител подклассов IgG2 и IgG4 при ответе на терапию у больных ревматоидным артритом и снижение содержания аутоантител подклассов IgG2 и IgG4 и повышение уровня аутоантител подкласса IgG1 у больных бронхиальной астмой при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению заболевания [Lopatnikova J.A., Golikova Е.А., Shkaruba N.S., Sizikov А.Е., Sennikov S.V. Analysis of the levels of tumour necrosis factor (TNF), autoantibodies to TNF, and soluble TNF receptors in patients with rheumatoid arthritis. // Scand J Rheumatol. - 2013. - V. 42. - N. 6. - P. 429-32. Golikova E.A., Lopatnikova J.A., Kovalevskaya-Kucheryavenko T.V., Nepomnyashih V.M., Sennikov S.V. Levels of TNF, TNF autoantibodies and soluble TNF receptors in patients with bronchial asthma. // J Asthma. - 2013. - V. 50. - N. 7. - P. 705-11]. Полученные данные свидетельствуют, что различные подклассы IgG могут участвовать в патогенезе и, вероятно, обладают разной активностью в отношении медиатора. Для получения экспериментальных подтверждений этого необходимо изучить влияние подклассов аутоантител к TNF на реализацию его биологических эффектов. Существуют разные подходы к оценке биологических эффектов аутоантител к цитокинам. В большинстве исследований проводится оценка влияния кратных разведений сывороток больных различными нозологиями на биологическую активность цитокинов. Однако такой подход не позволяет дифференцировать эффекты аутоантител и растворимых рецепторов к цитокинам.
В литературе приводится достаточное количество отработанных протоколов выделения IgG человека из сыворотки крови, однако сведения о подходах к разделению IgG на подклассы в литературе крайне скудны. Все подклассы обладают высокой аффинностью к Protein G, поэтому использование аффинной колонки с данным сорбентом позволяет выделить все четыре подкласса IgG. При этом аффинность связывания с Protein А у разных подклассов IgG различается. Все подклассы, кроме IgG3, связываются с Protein А с высокой аффинностью. Вследствие низкой аффинности IgG3 к Protein А возможно отделить его от трех других подклассов [Kronvall G., Williams R.C. Jr. Differences in anti-protein A activity among subgroups. // J Immunol. - 1969. - V. 103. - N. 6. - P. 1405-10. Sviatenko O.V., Gorbatiuk O.B., Vasylchenko O.A. Application of immunoglobulin-binding proteins A, G, L in the affinity chromatography. // Biotechnologia Acta. - 2014. - V. 7. - N. 2. - Р. 34-45].
Разделение IgG1, IgG2 и IgG4 может проводиться с учетом их различной аффинности к Protein А с использованием градиента рН в процессе хроматографии. Однако полное их разделение невозможно вследствие перекрывания интервалов рН диссоциации комплексов различных подклассов иммуноглобулинов с Protein A [Nikolayenko I.V., Galkin O.Yu., Grabchenko N.I., Spivak M.Ya. Preparation of highly purified human IgG, IgM, and IgA for immunization and immunoanalysis // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2005. - V. 2. - P. 3-11. Leblebici P., Leblebici M.E., Ferreira-da-Silva F., Rodrigues A.E., Pais L.S. Separation of human immunoglobulin G subclasses on a protein A monolith column. // J Chromatography В Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2014. - V. 962. - P. 89-93]. В других работах для выделения чистых фракций подклассов IgG использовались сорбенты, полученные при связывании подкласс-специфических моноклональных антител с сефарозой [Bird P., Lowe J., Stokes R.P., Bird A.G., Ling N.R., Jefferis R. The separation of human serum IgG into subclass fractions by immunoaffinity chromatography and assessment of specific antibody activity. // J Immunol Methods. - 1984. - V. 71. - N. 1. - P. 97-105]. В работе Bird et al. использование позитивной и негативной хроматографии позволило выделить отдельные подклассы IgG из поликлонального IgG с содержанием примеси других подклассов менее 1%. Несмотря на то что в литературе описано получение препаратов IgG антицитокиновых аутоантител, к настоящему времени не предложено подходов к препаративному выделению подклассов IgG специфических аутоантител к цитокинам.
Таким образом, данные литературы об изменении содержания подклассов аутоантител к цитокинам при патогенетических состояниях свидетельствуют о возможных различиях в их биологических функциях. При этом в литературе последних лет не представлено работ, связанных с получением отдельных подклассов IgG человека аутоантител к цитокинам. Поэтому представлялось актуальным разработать современный методический подход для получения фракций подклассов аутоантител к TNF из препарата иммуноглобулина, включающий гель-фильтрацию, позитивную и негативную аффинную хроматографию и ультрафильтрацию по молекулярной массе для получения фракций подклассов аутоантител к TNF из препарата иммуноглобулина.
Известен способ разделения подклассов IgG путем жидкостной хроматографии с использованием в качестве твердой фазы пористого геля с пределом исключения выше молекулярной массы иммуноглобулина G и, в качестве подвижной фазы, буферного раствора со специфической ионной силой. В данном подходе применяется пористый гель, предпочтительно неорганической природы, со средним объемом частиц менее 50 мкм, несущий гидрофильные группы, такие как гидроксильные, и буферные растворы с ионной силой от 0.1 до 2.0 М, предпочтительно от 0.1 М до 1.0 М. Подход основан на различиях в гидрофобном взаимодействии геля и подклассов IgG в процессе жидкостной хроматографии, которые обусловливаются разным аминокислотным составом γ-цепей, определяющих принадлежность к соответствующему подклассу. В данном случае нет необходимости изменения рН элюирующего буфера, что обусловливает отсутствие влияния агрессивной среды рН на биологическую активность выделяемых антител (JPS6419024, А61К 39/395, 1989).
Недостатком данного способа является ограниченность его использования выделением подклассов IgG мыши. Кроме того, не указывается степень чистоты полученных фракций различных подклассов.
Наиболее близким к заявляемому является способ выделения фракций аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF) из сыворотки крови человека с использованием комплекса процедур аффинной хроматографии, проводят выделение антител класса IgG с использованием аффинного сорбента Protein G Sepharose, после проведения элюции, полученные фракции аутоантител нейтрализуют, объединяют и диализуют, далее фракции аутоантител наносят на колонку со связанным с TNF аффинным сорбентом, после проведения элюции полученные фракции аутоантител к TNF нейтрализуют, объединяют и диализуют, после этого проводят их магнитную сепарацию с использованием магнитных частиц, причем магнитные частицы, покрытые стрептавидином, со-инкубируют с мечеными биотином поликлональными антителами к TNF и полученный комплекс инкубируют с фракциями аутоантител к TNF, затем собирают надосадочную жидкость, содержащую очищенные фракции аутоантител (RU 2501008, G01N 33/00, 2013).
В описанном способе аутоантитела класса IgG к TNF выделяют из сыворотки крови человека с использованием комплекса хроматографических процедур и процедуры магнитной сепарации. Используются следующие хроматографические сорбенты: Bio-Gel Р6 DG (Bio-Rad, США), Protein G Sepharose Fast Flow (GE Life Sciences, Швеция) и Affi-Gel 15 (Bio-Rad, США), связанный с TNF. Магнитную сепарацию проводят с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином, и поликлональных антител к TNF, меченых биотином.
Однако данным способом можно получить общую фракцию класса IgG аутоантител к TNF, включающую все четыре подкласса: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Для оценки биологической активности аутоантител к TNF, относящихся к конкретному подклассу IgG, требуется выделение отдельных подклассов IgG.
Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа выделения аутоантител подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 к иммунорегуляторному цитокину TNF.
Поставленная задача решается тем, что в способе выделения подклассов иммуноглобулина G (IgG) аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF), заключающемся в получении общей фракции IgG аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein G Sepharose с последующей нейтрализацией, объединением и диализом IgG, очистке полученной фракции IgG от примеси TNF, выделение подклассов IgG производят из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, после получения фракции IgG осуществляют ее очистку от примеси TNF ультрафильтрацией с использованием центрифужных фильтров, затем проводят этап выделения антител IgG3 и получения смеси IgG1, IgG2, IgG4 аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein A Sepharose, причем после выделения IgG3 проводят элюцию смеси IgG1, IgG2, IgG4 цитратным буфером с рН 3.0, с последующей нейтрализацией, объединением и диализом; затем выделяют антитела IgG1 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG2 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем выделяют антитела IgG2 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG1 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем проводят очистку антител IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG4 Sepharose, после чего проводят выделение специфических аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 аффинной хроматографией с использованием сорбента Affi Gel 15-TNF с последующей нейтрализацией, объединением и диализом.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.
Для переноса иммуноглобулинов препарата «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения» в рабочий буфер используют колонку с сорбентом Bio-Gel Р6 DG. Далее для выделения антител класса IgG белки, собранные с колонки с сорбентом Bio-Gel Р6 DG, наносят на колонку с аффинным сорбентом Protein G Sepharose 4 Fast Flow. При проведении элюции полученные фракции аутоантител нейтрализуют, объединяют и диализуют. Далее проводят очистку фракции общего IgG от аутоантигенов методом ультрафильтрации на центрифужных фильтрах Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices. После ультрафильтрации фракции IgG нейтрализуют, объединяют и диализуют. Для выделения IgG3 фракцию общего IgG наносят на колонку HiTrap Protein A HP 1 ml, содержащую аффинный сорбент Protein A Sepharose High Performance. Несвязавшуюся фракцию, которая представляет собой очищенный IgG3, собирают и проводят элюцию связавшейся фракции, содержащей IgG1, IgG2 и IgG4. При проведении элюции полученные фракции нейтрализуют, объединяют и диализуют. Элюат с колонки HiTrap Protein A HP 1 ml используют для дальнейшего разделения подклассов IgG. Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG1 используют колонку с анти-IgG2-Sepharose 4В аффинным сорбентом. Несвязавшуюся фракцию собирают. Процедуру хроматографии повторяют 7-кратно. Полученные фракции объединяют. Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG2 используют колонку с анти-IgG1-Sepharose 4 В аффинным сорбентом. Несвязавшуюся фракцию собирают. Процедуру хроматографии повторяют 7-кратно. Полученные фракции объединяют. Для очистки иммуноглобулинов подклассов IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 используют колонку с анти-IgG4-Sepharose 4 В аффинным сорбентом. Несвязавшуюся фракцию собирают, полученные фракции объединяют. Для выделения специфических аутоантител к TNF фракции подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 наносят на колонку с сорбентом Affi Gel 15-TNF. При проведении элюции полученные фракции аутоантител нейтрализуют, объединяют и диализуют.
Принципиальным отличием разработанного способа является выделение фракций аутоантител к TNF подклассов, относящихся к отдельным подклассам IgG1, IgG2 и IgG3, что позволит оценить их индивидуальную биологическую активность. Другим принципиальным отличием является использование процедуры ультрафильтрации для очистки фракции IgG от примеси TNF, для которой не требуются специфические антитела к медиатору. Для удаления контаминирующего цитокина была проведена очистка фракции общего IgG от аутоантигенов с молекулярной массой менее 100 kDa [Watanabe М., Uchida К., Nakagaki К., Kanazawa Н., Trapnell B.C., Hoshino Y., Kagamu H., Yoshizawa H., Keicho N., Goto H., Nakata K. Anti-cytokine autoantibodies are ubiquitous in healthy individuals. // FEBS Lett. - 2007. - V. 581. - N. 10. - Р. 2017-21]. Таким образом, все аутоантигены, как и TNF, проходили через мембрану и оказывались в фильтрате, а сверху мембраны оставалась фракция чистого IgG, не содержащего примесей аутоантигенов. По результатам иммуноферментного анализа до проведения ультрафильтрации содержание примеси TNF во фракции общего IgG составляло до 80 пг/мл, в то время как после ультрафильтрации было показано отсутствие примеси TNF.
Предлагаемое изобретение позволяет выделить чистые фракции аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, очищенные от примеси самого TNF, в связи с чем полученные фракции могут быть использованы в различных биологических тестах, предполагающих использование аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3.
Техническим результатом изобретения является получение чистых фракций аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3.
Изобретение осуществляется следующим образом.
В качестве источника человеческого IgG используется фармацевтический препарат «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения» (Микроген, Россия). Перенос иммуноглобулинов препарата в соответствующий буферный раствор, необходимый для дальнейших процедур аффинной очистки антител, осуществляется с помощью колонки с Bio-Gel Р6 DG (Bio-Rad, США). Фракции с Bio-Gel Р6 DG наносятся на колонку с аффинным сорбентом Protein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, США). Хроматографические процедуры проводятся в соответствии с инструкцией производителя. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0,15 М NaCl (рН 2.5), буфер для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 20 mM PBS, содержащий 0.1% Triton Х-100 (рН 7.4). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют до физиологических значений рН 1М Tris-HCl (рН 9.0). Выделенные фракции IgG объединяют и диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4).
Для ультрафильтрации диализованные антитела IgG смешивают с буфером 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5) в соотношении 1:9, инкубируют в течение 30 минут и вносят в центрифужный фильтр Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices (Merck Millipore, Ирландия) для ультрафильтрации. Центрифугирование проводят при 6.000 G. Фракции IgG, не прошедшие через мембрану центрифужного фильтра, объединяют и диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4). Определение примеси TNF во фракции IgG до и после проведения ультрафильтрации проводили методом иммуноферментного анализа с использованием набора «альфа-ФНО - ИФА - Бест» (Вектор-Бест, Россия).
Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG3 фракцию IgG наносят на колонку HiTrap Protein A HP 1 ml (GE Life Sciences, Швеция), содержащую аффинный сорбент Protein A Sepharose High Performance. Хроматографические процедуры проводятся в соответствии с инструкцией производителя. Собирают несвязавшуюся фракцию, которая представляет собой очищенный IgG3, и после падения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшейся фракции, которая содержит IgG1, IgG2 и IgG4. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 0.1 М PBS (рН 7.5), буфер для элюции - 0.1 М цитратный буфер (рН 3.0). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют титрованием 1М Tris-HCl (рН 9.0) до физиологических значений рН. После сбора элюированной фракции с колонки удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Элюированную фракцию антител диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4).
Для выделения IgG1 и IgG2 используют подкласс-специфичные моноклональные антитела, очищенные из следующих клонов: 2С11 (анти-IgG1), 52G1 (анти-IgG2) и 5С7 (анти-IgG4) (Биалекса, Россия). Связывание антител с аффинным сорбентом CNBr-activated Sepharose 4 В (GE Life Sciences, Швеция) и хроматографические процедуры проводят согласно инструкции производителя. Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG1 элюированную фракцию после хроматографии на колонке HiTrap Protein A HP 1 ml наносят на колонку с приготовленным аффинным сорбентом анти-IgG2-Sepharose 4В. Собирают несвязавшуюся фракцию и после снижения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшихся иммуноглобулинов, после чего удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Собранную несвязавшуюся фракцию вновь наносят на колонку с анти-IgG2-Sepharose 4В аффинным сорбентом и повторяют еще шесть аналогичных циклов хроматографии. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 M Gly-HCl/0.15 M NaCl (рН 2.5), буферы для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 0.1 М Tris-HCl/0.5 М NaCl, (рН 8.5) и 0.1 М натрия ацетат/0.5 М NaCl (рН 4.5).
Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG2 элюированную фракцию после хроматографии на колонке HiTrap Protein A HP 1 ml наносят на колонку с приготовленным аффинным сорбентом анти-IgG1-Sepharose 4 В. Собирают несвязавшуюся фракцию и после снижения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшихся иммуноглобулинов, после чего удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Собранную несвязавшуюся фракцию вновь наносят на колонку с анти-IgG1-Sepharose 4В аффинным сорбентом и повторяют еще шесть аналогичных циклов хроматографии. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5), буферы для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 0.1 М Tris-HCl/0.5 М NaCl, (рН 8.5) и 0.1 М натрия ацетат/0.5 М NaCl (рН 4.5).
Для очистки иммуноглобулинов подклассов IgGl и IgG2 от примеси IgG4 несвязавшиеся фракции после хроматографии на колонках с анти-IgG2-Sepharose 4В и анти-IgG1-Sepharose 4В аффинными сорбентами, соответственно, наносят на колонку с анти-IgG4-Sepharose 4В аффинным сорбентом. Собирают несвязавшуюся фракцию и после снижения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшихся иммуноглобулинов, после чего удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5), буферы для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 0.1 М Tris-HCl/0.5 М NaCl, (рН 8.5) и 0.1 М натрия ацетат/0.5 М NaCl (рН 4.5).
Порядок использования аффинных колонок для выделения подклассов IgG показан в таблице 1.
Определение количества выделенных подклассов IgG и подтверждение отсутствия примеси других подклассов проведено методом иммуноферментного анализа с использованием набора «Подклассы IgG - ИФА - БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия). Из 3,3 мг IgG было получено 43 мкг IgG1, из 10,8 мг IgG - 3 мкг IgG2, из 10 мг IgG - 58 мкг IgG3.
Связывание TNF с аффинным сорбентом Affi-Gel 15 (Bio-Rad, США) проводят согласно инструкции производителя. Для выделения аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 фракции выделенных подклассов IgG наносят на колонку с приготовленным сорбентом Affi-Gel 15-TNF. После снижения оптической плотности до нулевого значения удаляют неспецифически связавшиеся компоненты, затем промывают колонку рабочим буферным раствором и проводят элюцию связавшихся антител. После сбора целевой фракции колонку снова промывают рабочим буферным раствором. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5), буфер для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 1М гуанидин-HCl (рН 7.4). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют титрованием 1М Tris-HCl (рН 9.0) до физиологических значений рН. Выделенные фракции антител диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4). Содержание подклассов IgG во фракции аутоантител к TNF оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием набора «Подклассы IgG - ИФА - БЕСТ». Содержание соответствующих подклассов во фракциях анти-TNF антител составило: IgG1 - 500 нг/мл, IgG2 - 100 нг/мл, IgG3 - 150 нг/мл.
Фракции аутоантител к иммунорегуляторному цитокину TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 выделены из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения. Отсутствие примеси TNF во фракциях аутоантител подтверждено методом иммуноферментного анализа.
Использование колонок с сорбентами Bio-Gel Р6 DG, Protein G Sepharose Fast Flow, Protein A Sepharose High Performance, анти-IgG2-Sepharose 4B, анти-IgGI-Sepharose 4B, анти-IgG4-Sepharose 4B, и Affi-Gel 15, связанного с TNF, и процедуры очистки с использованием ультрафильтрации является эффективным способом получения фракций аутоантител к иммунорегуляторному цитокину TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, что подтверждается тестами на чистоту фракций. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ выделения аутоантител подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 к иммунорегуляторному цитокину TNF, который может быть использован для выделения антител этих подклассов к другим цитокинам.
Claims (1)
- Способ выделения подклассов иммуноглобулина G (IgG) аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF), заключающийся в получении общей фракции IgG аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein G Sepharose с последующей нейтрализацией, объединением и диализом IgG, очистке полученной фракции IgG от примеси TNF, отличающийся тем, что выделение подклассов IgG производят из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, после получения фракции IgG осуществляют ее очистку от примеси TNF ультрафильтрацией с использованием центрифужных фильтров, затем проводят этап выделения антител IgG3 и получения смеси IgG1, IgG2, IgG4 аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein A Sepharose, причем после выделения IgG3 проводят элюцию смеси IgG1, IgG2, IgG4 цитратным буфером с pH 3.0, с последующей нейтрализацией, объединением и диализом; затем выделяют антитела IgG1 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG2 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем выделяют антитела IgG2 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG1 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем проводят очистку антител IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG4 Sepharose, после чего проводят выделение специфических аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 аффинной хроматографией с использованием сорбента Affi Gel 15-TNF с последующей нейтрализацией, объединением и диализом.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017128342A RU2646807C1 (ru) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Способ выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017128342A RU2646807C1 (ru) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Способ выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2646807C1 true RU2646807C1 (ru) | 2018-03-07 |
Family
ID=61568708
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017128342A RU2646807C1 (ru) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Способ выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2646807C1 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100267934A1 (en) * | 2007-05-31 | 2010-10-21 | Genmab A/S | Stable igg4 antibodies |
-
2017
- 2017-08-08 RU RU2017128342A patent/RU2646807C1/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100267934A1 (en) * | 2007-05-31 | 2010-10-21 | Genmab A/S | Stable igg4 antibodies |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LOPATNIKOVA JA., et al., Analysis of the levels of tumour necrosis factor (TNF), autoantibodies to TNF, and soluble TNF receptors in patients with rheumatoid arthritis.Scand J Rheumatol. 2013;42(6):429-32. doi: 10.3109/03009742.2013.794471. Epub 2013 Aug 28. * |
LOPATNIKOVA JA., et al., Analysis of the levels of tumour necrosis factor (TNF), autoantibodies to TNF, and soluble TNF receptors in patients with rheumatoid arthritis.Scand J Rheumatol. 2013;42(6):429-32. doi: 10.3109/03009742.2013.794471. Epub 2013 Aug 28. SENNIKOV SV., et al., Purification of human immunoglobulin G autoantibodies to tumor necrosis factor using affinity chromatography and magnetic separation.J Immunol Methods. 2013 Apr 30;390(1-2):92-8. doi: 10.1016/j.jim.2013.01.012. Epub 2013 Feb 4. HORSFALL AC., et al., Purification of human autoantibodies from cross-linked antigen immunosorbents.J Immunol Methods. 1987 Nov 23;104(1-2):43-9. ROSENAU BJ., et al., Autoantibodies to tumor necrosis factor in patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus.J Rheumatol. 2009 Apr;36(4):753-6. doi: 10.3899/jrheum.080587. Epub 2009 Feb 27. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2737731T3 (es) | Medios de cromatografía de afinidad para la eliminación de anticuerpos anti-A y/o anti-B | |
AU760668B2 (en) | Immunoadsorber for use in sepsis therapy | |
JP2009536944A (ja) | 炎症性腸疾患を治療するための方法及び手段 | |
WO2008089756A2 (de) | Verfahren zum nachweis von antikörpern aus körperflüssigkeiten durch eine immunreaktion mit glykoprotein 2 (gp2) aus zymogenen granula des pankreas zur differentialdiagnose von entzündlichen darmerkrankungen und chronischer pankreatitis | |
Li et al. | Cartilage-binding antibodies initiate joint inflammation and promote chronic erosive arthritis | |
US10076600B2 (en) | Targeted apheresis for the treatment of rheumatoid arthritis and immune disorders | |
RU2646807C1 (ru) | Способ выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли | |
Lezhnina et al. | Application of extracorporeal apheresis in treatment of COVID-19: A rapid review | |
Sheng et al. | In vivo adsorption of autoantibodies in myasthenia gravis using Nanodisc-incorporated acetylcholine receptor | |
Deng et al. | High mobility group box-1 contributes to anti-myeloperoxidase antibody-induced glomerular endothelial cell injury through a moesin-dependent route | |
Aotsuka et al. | Analysis of negatively charged dye-binding antibodies reactive with double-stranded DNA and heparan sulfate in serum from patients with rheumatic diseases. | |
Christensson et al. | Serum sFAS levels are elevated in ANCA-positive vasculitis compared with other autoimmune diseases | |
Božič et al. | Influence of degraded phosphatidylserine on binding of antiphospholipid antibodies | |
US5219728A (en) | Soluble forms of low affinity fc gamma receptors, process for their identification and dosage, a corresponding dosage kit, and applications | |
JP2005164597A (ja) | 自己抗原のスクリーニング法 | |
CN104628847A (zh) | 一种人IgG4型抗体及其制备方法与应用 | |
OKAWA‐TAKATSUJI et al. | Enhanced synthesis of cytokines by peripheral blood monocytes cultured in the presence of autoantibodies against U1‐ribonucleoprotein and/or negatively charged molecules: implication in the pathogenesis of pulmonary hypertension in mixed connective tissue disease (MCTD) | |
Kireev et al. | Production of pure fractions of immunoglobulin G subclass autoantibodies against tumor necrosis factor | |
RU2622005C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ-IgG К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ | |
WO2020155208A1 (zh) | 一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途 | |
Zeinab et al. | Selective adsorption of antiphospholipid and anti-dsDNA autoantibodies on histidine based pseudobioaffinity adsorbent from sera of patients with systemic lupus erythematosus (SLE) | |
Liang et al. | Characterization of chronic relapsing antibody mediated arthritis in mice with a mutation in Ncf1 causing reduced oxidative burst | |
Magorivska et al. | Blood serum immunoglobulins of patients with multiple myeloma are capable of hydrolysing histone H1 | |
RU2501008C1 (ru) | СПОСОБ АФФИННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ КЛАССА IgG К ИММУНОРЕГУЛЯТОРНОМУ ЦИТОКИНУ TNF | |
JP4477874B2 (ja) | IL−1Raの生成を刺激する抗体 |