CN102807994A

CN102807994A - 一种制备浆细胞的方法及其得到的浆细胞

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Publication number: CN102807994A
Application number: CN2012102628586A
Authority: CN
Inventors: 江小霞; 毛宁
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2032-07-26
Also published as: CN102807994B

Abstract

本发明公开了一种制备浆细胞的方法及其得到的浆细胞。本发明提供了一种用B细胞制备浆细胞的方法，依次包括如下步骤：（1）干扰离体的B细胞中MYSM1基因的表达；所述MYSM1基因为编码序列表的序列1所示蛋白质的基因；（2）采用脂多糖(Lipopolysaccharide)诱导细胞分化为浆细胞。采用本发明提供的方法制备浆细胞具有如下显著优点：（1）得到的浆细胞纯度高、数量多、分泌抗体能力强；（2）诱导时间短、操作简单、方便实用。本发明建立了稳定的高效分泌抗体的浆细胞的制备方法，为浆细胞及其抗体的研究和应用奠定了基础。

Description

一种制备浆细胞的方法及其得到的浆细胞

技术领域

本发明涉及一种制备浆细胞的方法及其得到的浆细胞。

背景技术

成熟B细胞接受抗原刺激后，在抗原递呈细胞和辅助性T细胞的辅助下成为活化的B细胞，进而分化为浆细胞，合成并分泌各类免疫球蛋白。

浆细胞及其分泌的抗体在保护性免疫、肿瘤和自身免疫性疾病的发生发展中发挥重要的作用。

目前，多从小鼠脾脏分离B细胞并用LPS体外刺激获得浆细胞，具有如下局限性：所需时间长，诱导过程中细胞死亡较多，生成的浆细胞分泌抗体能力一般。虽然可通过干扰抑制浆细胞分化的转录因子的表达来促进浆细胞分化，但并不能同时提高浆细胞的抗体分泌能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备浆细胞的方法及其得到的浆细胞。

本发明提供了一种用B细胞制备浆细胞的方法，依次包括如下步骤：

（1）干扰离体的B细胞中MYSM1基因的表达；所述MYSM1基因为编码序列表的序列1所示蛋白质的基因；

（2）采用脂多糖(Lipopolysaccharide)诱导细胞分化为浆细胞。

所述MYSM1基因具体可为序列表的序列2所示的DNA分子或序列表的序列3所示的DNA分子。

所述步骤（1）中，所述“干扰B细胞中MYSM1基因的表达”的实现方式如下:在所述离体的B细胞中导入抑制所述MYSM1基因表达的物质。

所述“抑制所述MYSM1基因表达的物质”具体可为表达针对所述MYSM1基因的shRNA的重组慢病毒。

所述“在所述离体的B细胞中导入抑制所述MYSM1基因表达的物质”的实现方式具体如下：将所述重组慢病毒与所述离体的B细胞共培养。

所述重组慢病毒的制备方法可包括如下步骤：将重组质粒甲、质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2.G共转染哺乳动物细胞，培养细胞后得到重组慢病毒；所述重组质粒甲为含有DNA片段甲的质粒；所述DNA片段甲编码的RNA为具有沉默所述MYSM1基因的功能的shRNA。

所述DNA片段甲具体可如序列表的序列4所示。

所述重组质粒甲具体可为质粒pLKO.1-shmMysm1。

所述哺乳动物细胞具体可为293T/17细胞。

所述重组慢病毒具体可为LV-shmMysm1病毒。

所述LV-shmMysm1病毒的制备方法具体如下：培养293T/17细胞，待细胞达到85%融合时转染混合物甲，培养60-72小时后收取上清，即为LV-shmMysm1病毒液。

所述混合物甲的制备方法具体如下：将质粒pLKO.1-shmMysm1、质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev、质粒pMD2.G混合。

所述混合物甲的制备方法具体如下：将质粒pLKO.1-shmMysm1、质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev、质粒pMD2.G与转染试剂PEI混合。

所述质粒pLKO.1-shmMysm1即为Sigma公司Cat.No.TRCN0000085873的质粒产品。

所述混合物甲的制备方法具体如下：将质粒pLKO.1-shmMysm1 10ug、质粒pMDLg/pRRE 5ug、质粒pRSV-Rev 2.5ug、质粒pMD2.G 3ug与转染试剂PEI 80ug混合。

所述步骤（1）中，所述重组慢病毒的感染剂量具体可为MOI=5。

所述步骤（1）中，进行所述共培养时，还可加入辅助病毒感染的试剂，如Polybrene。所述Polybrene的加入量可为达到8ug/ml的浓度。

所述步骤（1）中，所述共培养的时间具体可为6小时。

所述步骤（1）中，所述共培养的温度具体可为37℃。

所述步骤（2）中，所述诱导细胞分化的时间可为2-4天。

所述步骤（2）中，所述诱导细胞分化的初始时刻，所述脂多糖的浓度具体可为20ug/ml。

所述离体的B细胞具体可为细胞表面标志物B220为阳性的细胞。

所述离体的B细胞可为离体的小鼠B细胞，如离体的C57BL/6小鼠B细胞。

所述离体的B细胞的制备方法具体如下：取离体的小鼠脾脏，分离单个核细胞，然后收集细胞表面标志物B220为阳性的细胞，即为离体的B细胞。

所述浆细胞具体可为细胞表面标志物CD138为阳性的细胞。

采用本发明提供的方法制备浆细胞具有如下显著优点：（1）得到的浆细胞纯度高、数量多、分泌抗体能力强；（2）诱导时间短、操作简单、方便实用。本发明建立了稳定的高效分泌抗体的浆细胞的制备方法，为浆细胞及其抗体的研究和应用奠定了基础。

附图说明

图1为质粒pLKO.1-shmMysm1和质粒pLKO.1-puro eGFP shRNA的结构示意图；当shRNA为针对MYSM1基因的shRNA的编码序列时，为质粒pLKO.1-shmMysm1；当shRNA为针对eGFP基因的shRNA的编码序列时，为质粒pLKO.1-puroe GFP shRNA。

图2为实施例1中的流式细胞图。

图3为实施例1中实验组和对照组浆细胞生产抗体的能力比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。MOI(multiplicity of infection，感染复数)，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。MYSM1基因编码的蛋白如序列表的序列1所示，MYSM1基因如序列表的序列2或序列表的序列3所示。

用于实施例的小鼠品种为C57BL/6小鼠，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK-（军）-2007-004。

LV-shmMysm1病毒：将293T/17细胞（又称HEK293T/17细胞；

Number：CRL-11268^TM）接种于10cm培养皿，待细胞达到85%融合时转染混合物甲，培养60-72小时后收取上清，即为LV-shmMysm1病毒液（可以干扰MYSM1基因表达）。混合物甲的制备方法：将质粒pLKO.1-shmMysm1(Sigma，Cat.No.TRCN0000085873，产品说明中有具体描述；http://www.broadinstitute.org/rnai/public/clone/details?cloneId=TRCN0000085873网页中也具有相关描述，结构示意图见图1)10ug、质粒pMDLg/pRRE(慢病毒包装质粒；Addgene，Cat.No.12251)5ug、质粒pRSV-Rev(慢病毒包装质粒；Addgene，Cat.No.12253)2.5ug、质粒pMD2.G(信封质粒；Addgene，Cat.No.12259)3ug与转染试剂PEI（polyethylenimine；Polysciences Inc公司，Cat.No.23966）80ug混合。质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2.G都是制备慢病毒的质粒，质粒pLKO.1-shmMysm1为表达MYSM1基因的shRNA的质粒，将上述四个质粒共同转染细胞后，得到表达针对MYSM1基因的shRNA的重组慢病毒。

LV-GFP病毒：将293T/17细胞（又称HEK293T/17细胞；

Number：CRL-11268^TM）接种于10cm培养皿，待细胞达到85%融合时转染混合物乙，培养60-72小时后收取上清，即为LV-GFP病毒液（可以干扰GFP基因表达）。混合物乙的制备方法：将质粒pLKO.1-puroeGFP shRNA(Sigma，Cat.No.SHC005V，产品说明中有具体描述；结构示意图见图1)10ug、质粒pMDLg/pRRE(慢病毒包装质粒；Addgene，Cat.No.12251)5ug、质粒pRSV-Rev(慢病毒包装质粒；Addgene，Cat.No.12253)2.5ug、质粒pMD2.G((信封质粒；Addgene，Cat.No.12259)3ug与转染试剂PEI（polyethylenimine；Polysciences Inc公司，Cat.No.23966）80ug混合。质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2.G都是制备慢病毒的质粒，质粒pLKO.1-puro eGFP shRNA为表达eGFP基因的shRNA的质粒，将上述四个质粒共同转染细胞后，得到表达针对eGFP基因的shRNA的重组慢病毒。

Polybrene（辅助病毒感染的助转剂）：Santa Cruz公司，Cat.No.sc-134220。胎牛血清：Hyclone公司。LPS（英文全称为Lipopolysaccharide,中文名称为脂多糖）：Sigma公司，货号为L4391-1MG。APC-B220抗体：eBioscience公司，Cat.No.17-0452-82。PE-CD138抗体：BD公司，Cat.No.553714。

实施例1、制备浆细胞和浆细胞的性能验证

1、取小鼠脾脏，剪碎，研磨后，用Ficoll密度梯度离心法（采用的Ficoll的密度是1.073g/ml）分离单个核细胞，然后用Mini MACS B220细胞免疫磁珠分选系统（德国Miltenyi公司，Cat.No.130-049-501）分离细胞表面标志物B220为阳性的B细胞（B220+B细胞）。

2、将步骤1得到的B220+B细胞悬于RPMI1640培养基中，得到2×10⁵个细胞/ml的细胞悬液。

3、将步骤1的细胞悬液接种至24孔板，每孔接种1ml，然后分成两组（每组5个复孔），分别进行如下平行处理：

实验组：加入LV-shmMysm1病毒液（MOI=5）和polybrene（使其浓度达到8ug/ml），然后1200g离心90min；

对照组：加入LV-GFP病毒液（MOI=5）和polybrene（使其浓度达到8ug/ml），然后1200g离心90min。

将实验组和对照组37℃孵育6小时。

4、完成步骤3后，每孔加入胎牛血清（使其体积比达到10%），然后每孔加入LPS（使其浓度达到20ug/ml），于培养箱诱导培养2天或4天。

5、完成步骤4后，收集细胞，每2×10⁵个细胞加入1个EP管，用PBS缓冲液洗两遍后加入APC-B220和PE-CD138抗体，4℃避光反应30分钟，然后用PBS缓冲液洗两次，然后进行流式细胞术检测。

流式细胞图见图2。第2天，实验组中浆细胞占总细胞的比率达到21%，对照组中浆细胞占总细胞的比率为5.95%，实验组是对照组的3-4倍。第4天，实验组中浆细胞占总细胞的比率达到49.4%，对照组中浆细胞占总细胞的比率为24.1%。结果表明，采用LV-shmMysm1病毒干扰MYSM1基因表达后，缩短了诱导浆细胞的时间并提高了获得浆细胞的效率，浆细胞占总细胞的比率显著升高。

6、收集步骤4中培养4天的细胞，用CD138细胞免疫磁珠分选系统（德国Miltenyi公司，Cat.No.130-092-530）分离细胞表面标志物CD138为阳性的细胞（CD138+细胞），即浆细胞。

7、将步骤6得到的浆细胞悬于含10%（体积比）胎牛血清的RPMI1640培养基中，得到1×10⁵细胞/ml的细胞悬液。

8、将步骤7的细胞悬液接种至96孔板，每孔接种0.1ml，37℃孵育36小时，然后收集上清液。

9、采用ELISA试剂盒检测步骤8得到的上清液中的IgM水平和IgG水平。

用于检测IgM水平的试剂盒如下（按试剂盒说明进行操作）：Mouse IgM ELISAReady-SET-Go(eBioscience公司，Cat.No.88-50470)。

用于检测IgG水平的试剂盒如下（按试剂盒说明进行操作）：Mouse IgG total ELISAReady-SET-Go(eBioscience公司，Cat.No.88-50400)。

结果见图3（三次试验，每次试验3个复孔的平均值）。对于同样数量的浆细胞来说，实验组分泌IgM和IgG的能力是对照组的3-4倍或4-5倍。结果表明，采用LV-shmMysm1病毒干扰MYSM1基因表达后，浆细胞分泌抗体的能力显著增强。

Claims

1.一种用B细胞制备浆细胞的方法，依次包括如下步骤：

（2）采用脂多糖诱导细胞分化为浆细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“干扰B细胞中MYSM1基因的表达”的实现方式如下：在所述离体的B细胞中导入抑制所述MYSM1基因表达的物质。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述“抑制所述MYSM1基因表达的物质”为表达针对所述MYSM1基因的shRNA的重组慢病毒。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述“在所述离体的B细胞中导入抑制所述MYSM1基因表达的物质”的实现方式如下：将所述重组慢病毒与所述离体的B细胞共培养。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述重组慢病毒的制备方法包括如下步骤：将重组质粒甲、质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2.G共转染哺乳动物细胞，培养细胞后得到重组慢病毒；所述重组质粒甲为含有DNA片段甲的质粒；所述DNA片段甲编码的RNA为具有沉默所述MYSM1基因的功能的shRNA。

6.如权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于：所述重组慢病毒的感染剂量为MOI=5。

7.如权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：进行所述共培养时，加入辅助病毒感染的试剂。

8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述诱导细胞分化的时间为2-4天。

9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述离体的B细胞为离体的小鼠B细胞。

10.权利要求1至9中任一所述方法制备得到的浆细胞。