CN103013906A - 一种生物膜及其制备方法和应用 - Google Patents
一种生物膜及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103013906A CN103013906A CN2012103403109A CN201210340310A CN103013906A CN 103013906 A CN103013906 A CN 103013906A CN 2012103403109 A CN2012103403109 A CN 2012103403109A CN 201210340310 A CN201210340310 A CN 201210340310A CN 103013906 A CN103013906 A CN 103013906A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lymphocyte
- microbial film
- propagation
- cell
- avidin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title abstract 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 43
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 31
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 23
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims description 23
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 21
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 15
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 11
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 claims description 10
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 claims description 10
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 10
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 10
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 6
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000003526 lymphopoietic effect Effects 0.000 description 6
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 101000946850 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD86 Proteins 0.000 description 3
- 102100034924 T-lymphocyte activation antigen CD86 Human genes 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012786 cultivation procedure Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种分离的生物膜及其制备方法和应用；进一步的，本发明提供了一种利用该生物膜刺激T淋巴细胞增殖的方法及其应用；更进一步的，本发明提供了一种包含该生物膜的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其是细胞免疫领域，具体涉及一种激活T淋巴细胞并促进T淋巴细胞增殖的试剂及方法。该试剂及方法可应用于临床细胞免疫治疗，也可用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用的研究。
背景技术
T淋巴细胞是人体最重要的免疫细胞之一，由胸腺内的淋巴干细胞分化而来，成熟后迁移到外周血；按其功能可分为三个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T淋巴细胞的正常功能对于维护机体的健康及其重要，它们的缺陷和功能异常可导致包括自身免疫性疾病和肿瘤等在内的各种疾病。目前，免疫学研究包括各种对T淋巴细胞的基础和临床应用的研究日益深入且发展迅速，在人T细胞来源和数量受限的现实情况下，对T细胞的需求日益迫切。因此，有必要建立一个有效，方便的体外T细胞活化和增殖方法来获取大量具功能活性的T细胞以满足需求。
近年来，随着过继性细胞免疫治疗恶性肿瘤的迅速发展，对体外T细胞活化和增殖的科研和临床需求越来越大。众所周知，尽管包括手术，化疗和放疗等综合手段的应用对恶性肿瘤的治疗取得了一定的进步，但是，上述传统治疗手段对恶性肿瘤的疗效总体来说还很不理想。寻求各种新药物、新技术、新方法来治疗恶性肿瘤不仅势在必然，而且现代医学的进步也为新治疗手段的发展提供了可能。其中一个极具潜能并在近期取得突破性进展的手段就是过继性T细胞免疫治疗法。这种治疗手段是将分离得到的患者自身的各种T细胞，包括周围血效应性（CD8+或CD4+）T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），细胞毒淋巴细胞（CTL），自然杀伤细胞样T淋巴细胞（CIK）等，在体外通过各种手段如基因改造，肿瘤抗原刺激，细胞因子诱导等激活T细胞，再回输至患者体内以发挥其直接杀灭肿瘤细胞和激发抗肿瘤免疫反应等作用而达到治疗目的。也由于患者T细胞来源和数量受限，因此，建立一个有效的体外培养系统来活化和增殖上述各种T细胞，以满足过继性T细胞免疫治疗需求，是极为必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是常规淋巴细胞扩增方法得到的淋巴细胞细胞增殖倍数和细胞毒活性不够理想的问题，并针对该问题提供一种用于淋巴细胞活化及扩增的方法及试剂盒。
本发明第一方面提供了一种分离的生物膜，该生物膜可以用于装载生物活性分子。进一步地，该生物膜包含抗生物素蛋白Avidin。
本发明第二方面提供了生物膜的制备方法，是通过裂解能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞获得所述的生物膜。优选地，本发明所述的生物膜的制备方法，包含以下步骤：
1）获得能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞；
2）获得步骤1）所述细胞的细胞裂解液；
3）离心获得权利要求1所述的生物膜，并使其均质化。
优选地，所述均质化方法为超声波法。优选地，所述细胞为纤维母细胞。进一步优选地，所述生物膜制备方法包含以下步骤：
1）获得稳定表达抗生物素蛋白Avidin的纤维母细胞；
2）获得步骤1）所述纤维母细胞的细胞裂解/缓冲液，将裂解液置于冰上20分钟；
3）4°C条件下，720 G离心5分钟，取上清；
4）4°C条件下，将上清以10,000 G离心 5分钟，取上清；
5）4°C条件下，将上清以100,000 G离心60分钟，取沉淀；
6）向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，4°C条件下以100,000G将沉淀离心45分钟，取沉淀；
7）4°C条件下，将所得沉淀继续以100,000G离心 45分钟，取沉淀；
8）向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，用35%强度的超声波处理1分钟，使其均质化，获得所述的生物膜。
35%强度的超声波是指45 Watt，20 KHz的超声波（Q125超声波仪，美国Qsonica）。
本发明第三方面提供了一种刺激淋巴细胞增殖的方法，该方法包含以下步骤：
1）获得上述任一项所述的生物膜；
2）使生物膜与一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子形成复合物；
3）使生物膜-淋巴细胞增殖刺激因子复合物与淋巴细胞接触。
优选情况下，所述的刺激淋巴细胞增殖的方法还包括使淋巴细胞进一步与白细胞介素-2（IL-2）接触。优选情况下所述淋巴细胞为T淋巴细胞；所述淋巴细胞增殖刺激因子选自CD3抗体、CD86、4-1BBL中的一种或多种。
需要说明的是，本发明的生物膜可通过抗生物素蛋白Avidin与生物素偶联的各种生物活性分子结合，将生物活性分子转运到合适的位置，促进其发挥生物学功能。
本发明第四方面提供了上述所述的生物膜在刺激淋巴细胞增殖中的应用，优选地淋巴细胞为T淋巴细胞。T淋巴细胞包括CD3+淋巴细胞，CD4+淋巴细胞，CD8+淋巴细胞和Treg调节性T淋巴细胞。
本发明还提供了一种刺激淋巴细胞增殖的试剂盒，包含上述的生物膜或通过上述方法制备的生物膜。优选地，该试剂盒还包含一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子，进一步优选地，淋巴细胞增殖刺激因子为生物素偶联的淋巴细胞增殖刺激因子；进一步优选地，试剂盒还包含白细胞介素-2。在另一种优选情况下，所述淋巴细胞为T淋巴细胞；所述淋巴细胞增殖刺激因子选自CD3抗体、CD86、4-1BBL中的一种或多种。
有益效果
本发明提供的生物膜可以和悬浮培养的T淋巴细胞相互粘附，充分提高生物活性分子和T淋巴细胞相互作用的效应。此外，在细胞培养条件下，生物膜可以被有效地自然降解，对T淋巴细胞无任何不良副作用，并能最大程度简化T淋巴细胞活化和扩增的培养程序和步骤，避免了类似产品中需要清除用以吸附生物活性分子的磁珠而导致的额外步骤和污染机会。本发明提供的方法具有操作简便、高效地活化和增殖T细胞等特点；本发明提供的试剂盒具有成本低、易于规模化生产等突出优势，可用于淋巴细胞的基础研究及临床应用研究。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步描述：
图 1是通过流式细胞仪对T淋巴细胞表型进行检测的结果。
图2 是使用本发明提供的活化扩增试剂促进T淋巴细胞增殖的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种可以装载各种生物活性分子的生物膜材料，该生物膜材料具有细胞亲和力，可以和悬浮培养的T细胞相互粘附，从而能充分提高生物活性分子对T细胞的效应作用；该生物材料随后在自然培养条件下可被降解，对T细胞生长无任何毒副作用。
现有的一些刺激淋巴细胞增殖的方法是通过应用磁珠来装载生物活性分子；磁珠是非生物材料，与T 细胞缺乏亲和性，而且，在细胞培养中需要额外步骤清除磁珠。因此，与其相比较，本发明对体外T细胞的活化和增殖更加高效，操作更为简便。
首先通过全基因合成法获得人源化修饰后的Avidin cDNA序列，并将该序列通过常规PCR方法克隆至真核表达载体中；通过脂质体法转染，将重组表达载体转染至细胞中，并通过抗生素筛选获得稳定表达人源化的Avidin的细胞株。
下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、生物膜的制备
1、构建稳定表达人源化Avidin（抗生物素蛋白）的纤维母细胞株（Fibroblast－Avidin）
１）使用分子生物学方法获得人源化修饰后的Avidin cDNA（序列如GenBank:
AJ616762.1），并将其构建于pcDNA3.1载体上，重组后的载体命名为pcDNA-Avidin。pcDNA3.1载体购置于Invitrogen, 目录号为V790-20。具体过程如下：
A）委托苏州金唯智生物科技有限公司合成 Avidin 基因，该基因5’端具有Nhe I限制酶切的粘末端，3’端具有Xba I限制酶切的粘末端；
B）用Nhe I 和Xba I（New England Biolabs，Inc，Cat # R0131S 和R0145S）酶切pcDNA3.1 载体，回收及纯化酶切产物（Qiagen，Cat # 28704）；
C）通过T4DNA连接酶（Promega，Cat #
M1801）16°C过夜，将合成的Avidin基因连接于酶切后的载体上；
D）连接产物转化感受态细胞TOP10（Invitrogen，Cat # C4040-03），并获取阳性菌落克隆；
E）阳性菌落扩增培养提取质粒（Qiagen，Cat # 27104），并通过测序证实Avidin cDNA正确连接于pcDNA3.1中。
２）将pcDNA-Avidin重组载体转染到培养的纤维母细胞中，所述纤维母细胞（Dermal Fibroblasts）购置于ATCC，Cat# PCS-201-012。
具体步骤如下：
A）纤维母细胞置于含10%胎牛血清的1640培养液中进行常规细胞培养；
B）用Lipofectamine ™ 2000试剂（Invitrogen，Cat # 11668030）按试剂盒提供的实验体系及步骤将重组pcDNA-Avidin载体转染入纤维母细胞中。
３）通过新霉素（Sigma，Cat # N6386，400ug/ml）筛选14天，获得耐药的细胞克隆。
4）挑取细胞克隆，扩大培养后获得细胞裂解液，通过Western Bloting
（所用anti-Avidin抗体购自ABcam，Cat # ab7235）验证Avidin的表达；选取未定表达Avidin的纤维母细胞建立细胞株（稳定表达Avidin的纤维母细胞株命名为Fibroblast-Avidin）。
2、配制生物膜裂解/缓冲液 （50 ml）
蔗糖（终浓度250 mM）
4.28 g
1 M HEPES (PH 7.4, 终浓度20 mM)
1 ml
KCl （终浓度10 mM）
0.0373 g
1 M MgCl2 （终浓度1.5 mM)
75 μl
0.5 M EDTA (（终浓度1 mM）
100 μl
0.5 M EGTA (（终浓度1 mM）
100 μl
加双蒸水至
50 ml
使用前取10ml 生物膜裂解/缓冲液加入10 μl DTT (终浓度1 mM)和50 μl蛋白酶抑制剂混合液(以上均为Sigma产品）。
3、操作程序（所有离心操作均在4°C条件进行）
1）收集生长密度达80%的稳定表达Avidin的纤维母细胞（Fibroblast-Avidin）5×107，加入生物膜裂解/缓冲液2 ml。
2）用带25G针头的注射器将裂解细胞反复吹打10次，随后置冰上20分钟。
3）720 G离心5分钟，取上清。
4）将上清以10,000 G离心5分钟，取上清。
5）将上清再次以100,000 G离心1小时，取沉淀。
6）加入2 ml生物膜裂解/缓冲液，以100,000 G离心45分钟，取沉淀。
7）再次以100,000 G离心45分钟，取沉淀。
8）加入2 ml PBS，用35%强度（35%强度的超声波是指45 Watt，20 KHz的超声波（Q125超声波仪，美国Qsonica））的超声波处理1分钟，使其均质化后即为所需要的生物膜。
实施例2、生物膜与生物活性分子结合
生物分子
人重组 4-1BBL，Abnova，Cat#
P4065
人重组CD86，Sino
Biological Inc，Cat# 10699-H08H
人抗CD3抗体
[OKT3] - Azide free，Abcam, Cat#ab86883
试剂
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin, sigma, Cat#
21217
操作程序
1）按试剂说明书程序，分别标记Biotin于人重组 4-1BBL，人重组CD86，人抗CD3抗体。
2）将PBS洗涤标记后的各生物分子。
3）在上述制备的2ml生物膜中分别加入10ug标记后的 4-1BBL，CD86，CD3抗体。4ºC 孵育 30分钟。
实施例3、T淋巴细胞提取
1）在50 ml离心管中，配制2×EDTA溶液（用DPBS稀释），每管25ml。
2）获得的25 ml血液，将其加入到上述EDTA溶液中，混匀。
3）另取一只50 ml离心管，每管中均加入25 ml Ficoll溶液。
4）将稀释后的血液用移液管沿管壁缓慢叠加于Ficoll溶液上，保持两液面界面清晰。
5）将离心管盖拧紧，封严，避免污染。
6）离心：离心机型号和转头型号为Thermo，IEC
CL40R；CAT#11210926，400g离心30分钟，升速5档，降速0档。
7）离心后，管内液体分为三层，上层为稀释的血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为Ficoll，在中上层液面处有一白色云雾层狭窄带，即为富含淋巴细胞和单核细胞的单个核细胞（PBMCs）。
8）用酒精消毒离心管表面，用移液管轻缓地吸去大部分的上层血浆，收集血浆层和Ficoll交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMCs（勿过量吸取血浆层和下层的白细胞），移入一新的离心管中。
9）加入20 ml DPBS或无血清培养液，混匀后以200g离心10 分钟，弃去上清液。
10）用DPBS洗涤细胞两次，每次以500g离心10分钟，以洗去残留的Ficoll溶液。
11）对获得的细胞进行计数，用细胞培养液将细胞浓度调配成2×105细胞/ml。
DPBS配方（1L体系）
KCl
0.201
g
KH2PO4
0.204 g
NaCl
8 g
Na2HPO4·12H2O
4.257 g
用1L超纯水溶解。
实施例4、T淋巴细胞活化和增殖
用实施例2获得的结合有生物活性分子（CD3抗体，CD86分子，4-1BBL）的生物膜处理实施例3获得的T淋巴细胞，具体步骤如下：
1）计数T淋巴细胞后，将1×105 T淋巴细胞接种于100 ul 1640培养液中。
2）向培养液中加入20 ul 实施例2获得的结合有生物活性分子的生物膜和3.6 u
IL-2（终浓度为30u/ml，IL2购自（Cell Sciences，CAT#CRI100C），在37ºC，5% CO2培养箱内进行常规培养。
3）每48小时，半量更换培养液，并按表1中的比例补充IL-2。
4）以7天为一个周期，每周期计数T淋巴细胞的数量。
5）以7天为一个周期，按表1中的比例再次加入实施例2获得的结合有生物活性分子（CD3抗体，CD86分子，4-1BBL）的生物膜，用以再次刺激T淋巴细胞。
实施例5、T淋巴细胞表型检测
1）取实施例4活化和扩增后获得的T细胞2×105（以下简称活化扩增的T细胞），加入90 ul DPBS；按下列组合加入下列相应的抗体10 µl，避光孵育30分钟；所有的抗体均购自BD公司；
2×105阴性对照细胞（未加抗体）
2×105活化和扩增的T细胞
与CD3、4、8抗体孵育
2×105活化和扩增的T细胞
与CD25、127抗体孵育
2）孵育完成后，加入1 ml DPBS，1200
rpm 离心8分钟，洗涤，共两次。
3）加入200 ul DPBS，用于细胞流式分析。
4）将所获得的数据结果与用未经活化和扩增（培养前）的T淋巴细胞（但经过上述同样抗体孵育及处理方式）的结果进行比较。
实验结果如图1所示，外周血单个核细胞（PBMC）来源的T淋巴细胞在应用本发明的扩增试剂培养14天后，CD3+和CD8+ T淋巴细胞分别占92%和55%, 与培养前的44%和14%相比较均有显著提高。
实施例6、T淋巴细胞增殖检测
1）将需计数细胞吹打混匀，吸取10µl和0.4％的台盼兰等量混匀。
2）将染色后的细胞加入细胞计数板，显微镜下观察并计数，获取计数板内四大象限中活细胞（未染色的细胞）总和（n）。
3）按公式：n/4 *104 计算获得细胞数。
4）每个细胞培养周期（1周期=7天）后所得到的细胞数除以起始培养的细胞数即为细胞增殖倍数。
实验结果如图2所示，经过活化增殖试剂刺激的细胞在第一个培养周期（7天）后的增殖倍数为49倍，第二个培养周期（14天）后的增值倍数为143倍，远高于未经活化增殖试剂刺激的细胞的增殖倍数。
实施例7、T淋巴细胞增殖试剂盒组成
T淋巴细胞增殖试剂盒包含以下成分：
1）实施例1制备的生物膜
2）生物素偶联的CD3抗体
3）生物素偶联的CD86分子
4）生物素偶联的4-1BBL
5）白细胞介素-2
6）试剂盒使用说明书。
Claims (19)
1.一种分离的生物膜，其特征在于该生物膜可以用于装载生物活性分子。
2.权利要求1所述的生物膜，其特征在于该生物膜包含抗生物素蛋白Avidin。
3.权利要求1-2任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于通过裂解能够稳定表达重组抗生物素蛋白Avidin的细胞获得所述的生物膜。
4.权利要求3所述的生物膜的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
1）获得能够稳定表达抗生物素蛋白Avidin的细胞；
2）获得步骤1）所述细胞的细胞裂解液；
3）离心获得权利要求1-2任一项所述的生物膜，并使其均质化。
5.权利要求4所述的生物膜的制备方法，其特征在于所述均质化方法为超声波法。
6.权利要求2-5任一项所述的生物膜的制备方法，其特征在于所述细胞为纤维母细胞。
7.权利要求2所述的生物膜的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
1）获得稳定表达抗生物素蛋白Avidin的纤维母细胞；
2）向步骤1）所述纤维母细胞加入细胞裂解/缓冲液，将裂解液置于冰上20分钟；
3）4°C条件下，720 G离心5分钟，取上清；
4）4°C条件下，将上清以10,000 G离心 5分钟，取上清；
5）4°C条件下，将上清以100,000 G离心60分钟，取沉淀；
6）向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，4°C条件下以100,000G将沉淀离心45分钟，取沉淀；
7）4°C条件下，将所得沉淀继续以100,000G离心 45分钟，取沉淀；
8）向沉淀中加入细胞裂解/缓冲液，用35%强度即45 Watt， 20 KHz的超声波处理1分钟，使其均质化，获得权利要求1所述的生物膜。
8.一种刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于该方法包含以下步骤：
1）获得权利要求1-2任一项所述的生物膜；
2）使生物膜与一种或多种淋巴细胞刺激因子形成复合物；
3）使生物膜-淋巴细胞刺激因子复合物与淋巴细胞接触。
9.权利要求8所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于使淋巴细胞进一步与白细胞介素-2（IL-2）接触。
10.权利要求8或9任一项所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
11.权利要求10所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的方法，其特征在于所述淋巴细胞刺激因子选自CD3抗体、CD86、4-1BBL中的一种或多种。
12.权利要求1-2任一项所述的生物膜在刺激淋巴细胞活化和增殖中的应用。
13.权利要求12所述的应用，其特征在于所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
14.一种刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于包含权利要求1-2任一项所述的生物膜。
15.权利要求14所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于还包含一种或多种淋巴细胞增殖刺激因子。
16.权利要求15所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于所述淋巴细胞增殖刺激因子为生物素偶联的淋巴细胞增殖刺激因子。
17.权利要求14-16任一项所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于还包含白细胞介素-2。
18.权利要求14-17任一项所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
19.权利要求18所述的刺激淋巴细胞活化和增殖的试剂盒，其特征在于所述淋巴细胞增殖刺激因子选自CD3抗体、CD86、4-1BBL中的一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210340310.9A CN103013906B (zh) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | 一种生物膜及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210340310.9A CN103013906B (zh) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | 一种生物膜及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103013906A true CN103013906A (zh) | 2013-04-03 |
| CN103013906B CN103013906B (zh) | 2015-04-01 |
Family
ID=47963023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210340310.9A Active CN103013906B (zh) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | 一种生物膜及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103013906B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104922684A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-23 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 天然来源和/或自组装技术得到的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室及其制备方法和应用 |
| CN104997718A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-10-28 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为化妆品或化妆品载体的应用 |
| CN107794269A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-13 | 成都美杰赛尔生物科技有限公司 | 促进基因编辑t细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092394A2 (en) * | 2003-04-08 | 2004-10-28 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Fluid planar lipid layer-based membrane-anchored ligand system with specific binding pair members and methods of use thereof |
| CN1928081A (zh) * | 2006-09-28 | 2007-03-14 | 武汉益生泉生物科技开发有限责任公司 | 一种人造生物膜及制备方法 |
| CN101644711A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-10 | 中国科学技术大学 | 一种可再生的生物素结合蛋白分子层及其制备方法 |
| CN102128832A (zh) * | 2010-12-27 | 2011-07-20 | 江南大学 | 一种西瓜果斑病毒金标核酸试纸条及其制备和应用 |
-
2012
- 2012-09-14 CN CN201210340310.9A patent/CN103013906B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092394A2 (en) * | 2003-04-08 | 2004-10-28 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Fluid planar lipid layer-based membrane-anchored ligand system with specific binding pair members and methods of use thereof |
| CN1928081A (zh) * | 2006-09-28 | 2007-03-14 | 武汉益生泉生物科技开发有限责任公司 | 一种人造生物膜及制备方法 |
| CN101644711A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-10 | 中国科学技术大学 | 一种可再生的生物素结合蛋白分子层及其制备方法 |
| CN102128832A (zh) * | 2010-12-27 | 2011-07-20 | 江南大学 | 一种西瓜果斑病毒金标核酸试纸条及其制备和应用 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104922684A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-23 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 天然来源和/或自组装技术得到的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室及其制备方法和应用 |
| CN104997718A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-10-28 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为化妆品或化妆品载体的应用 |
| CN107794269A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-13 | 成都美杰赛尔生物科技有限公司 | 促进基因编辑t细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103013906B (zh) | 2015-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102268405B (zh) | 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基 | |
| CN105112370B (zh) | 一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用 | |
| CN103849599B (zh) | 一种高效扩增自体nk细胞的培养基及培养方法 | |
| CN105087487B (zh) | 一种高效扩增cik的方法 | |
| CN102321581B (zh) | 腹水肿瘤细胞致敏dc-cik的制备方法 | |
| CN105754941A (zh) | 一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法 | |
| CN105907719A (zh) | Anti ROBO1 CAR-T细胞及其制备和应用 | |
| CN102676453A (zh) | 一种nk和/或nkt细胞的培养方法 | |
| Glienke et al. | GMP-compliant manufacturing of TRUCKs: CAR T cells targeting GD2 and releasing inducible IL-18 | |
| CN104357394A (zh) | 一种自体外周血淋巴细胞dc-cik的培养方法 | |
| CN105316362A (zh) | 一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法 | |
| CN105378071A (zh) | 用于产生稳定转染细胞的方法和组合物 | |
| CN109234232A (zh) | 兔外周血b细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用 | |
| CN103013906B (zh) | 一种生物膜及其制备方法和应用 | |
| CN109957543A (zh) | 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法 | |
| CN106085957B (zh) | 一种微载体三维扩增并激活自然杀伤细胞的方法 | |
| CN104762261A (zh) | 一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法 | |
| CN107794269A (zh) | 促进基因编辑t细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用 | |
| Elsner et al. | 51Cr-release to monitor NK cell cytotoxicity | |
| CN100369934C (zh) | 抗人4-1bbl单克隆抗体制备及其应用 | |
| CN106119193B (zh) | 一种兼有nk细胞特质的抗原特异性t细胞的制备方法 | |
| CN105925526A (zh) | 一种增强cik细胞活性的方法与cik细胞及其制备方法和应用 | |
| CN106479973B (zh) | 一种体外iak免疫细胞培养方法 | |
| Qiu et al. | Improving the ex vivo expansion of human tumor-reactive CD8+ T cells by targeting toll-like receptors | |
| Heger et al. | XCR1 expression distinguishes human conventional dendritic cell type 1 with full effector functions from their immediate precursors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171023 Address after: 215123 room D101-104, No. 99, Suzhou Road, Suzhou Industrial Park, Jiangsu, China Patentee after: PERSONGEN BIOTHERAPEUTICS (SUZHOU) Co.,Ltd. Address before: 215123 B2 building, No. 99 benevolence Road, Jiangsu, Suzhou Co-patentee before: Huang Gangxiong Patentee before: PERSONGEN BIOTHERAPEUTICS (SUZHOU) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230526 Address after: Building B2, National Health Big Data Industrial Park, No. 99 Kongquetai Road, High tech Zone, Hefei City, Anhui Province, 230000 Patentee after: BOSHENG JIANKE CELL TECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: Room d101-104, 99 Ren'ai Road, Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu 215123 Patentee before: PERSONGEN BIOTHERAPEUTICS (SUZHOU) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |