CN115260296A - 基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用，多肽至少选自以下所述氨基酸序列中的一种多肽：CarSP‑1：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDETRNV；CarSP‑2：FLCPWRAEGGQCcarPS；CarSP‑3：AEGGQCcarPSLLFDLR；CarSP‑4：CcarPSLLFDLRDETRNV和CarSP‑5：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDCTRNV,cys4&cys23bridge；鉴于自身免疫病对人类健康和生活治疗的威胁，本发明将对自身免疫病的诊治具有广阔的应用前景。

Description

基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用。
背景技术
近年来，各种自身免疫病(Autoimmune diseases)的发病人数都在上升，自身免疫病的医疗费用和疾病状态会给社会和家庭造成沉重的负担。人们迫切需要可用于自身免疫病诊断和治疗的技术手段或方法。当前，以预测医学、预防医学与个体化医疗为核心的3P医学已成为保证好提高人类健康水平的重要方向，自身免疫病特异性自身抗原及自身抗体的发现与应用是自身免疫病患者实现3P医学的重要关键。
强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是自身免疫病的一种。发病主要表现为中轴关节(骶髂关节、脊柱旁软组织、脊柱骨突及外周关节)的炎性反应及结构破坏，并可伴发关节外表现。临床主要表现为腰、背、颈、臀、髋部疼痛以及关节肿痛，严重者可发生脊柱畸形和关节强直。强直性脊柱炎在我国的患病率约为0.1％-0.3％，其中男性多于女性。强直性脊柱炎根据累及器官组织不同，疾病表现形式多样，诊断(尤其是早期诊断)存在一定难度。疾病相关特异性分子主要为HLA-B27，目前尚缺乏其他高特异性临床检测指标及治疗靶点。除强直性脊柱炎外，其他脊柱关节病如未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎等，以及自身免疫病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎等同样需要自身抗原、自身抗体相关的诊断治疗的靶点。
随着生物技术的快速发展，质谱技术、多肽合成技术、抗体制备技术、ELISA技术的应用，大大加快了新型自身抗原及自身抗体的发现与应用。其技术基础大都是通过质谱及生化技术筛选出自身免疫病相关自身抗原；利用多肽合成技术、抗体制备技术及多种免疫学技术验证自身抗原的抗原性及特异性，并制备抗原特异性抗体；利用ELISA 技术等再进一步检测及证实患者抗原相关的自身抗体。基于自身免疫病修饰抗原肽、特异性抗体的发现与应用，对于建立自身免疫病预警筛查、早期诊断、定性诊断和疾病治疗等具有重要作用。
与强直性脊柱炎相似，针对类风湿关节炎，已有文献报道了类风湿关节炎血清抗体能够识别瓜氨酸化抗原，并且已开发出抗瓜氨酸修饰多肽的自身抗体(ACPA)。在类风湿关节炎的分类标准中，血清中ACPA阳性被纳入诊断标准。作为类风湿关节炎的血清也异性标志物，抗瓜氨酸修饰多肽的自身抗体的出现也增加了对类风湿关节炎发病机制的理解。强直性脊柱炎目前尚未有已知报道的特异性自身抗原，同时无相应的自身抗体鉴定及检测手段。
整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽是强直性脊柱炎患者特异性产生的自身抗原，该肽是用质谱方法筛选获得的带有全新修饰形式(半胱氨酸羧基乙基修饰)的特异性修饰多肽，并通过多种体内外生物化学方法、免疫学方法验证，对其修饰形式及抗原性进行确证。整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽特异性出现于强直性脊柱炎患者外周血，有助于揭示强直性脊柱炎的发病机制及对疾病的特征进行分组，同时，相应自身抗体在强直性脊柱炎中的作用不可忽视。
抗整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽自身抗体是强直性脊柱炎外周血血浆中产生的自身抗体，可与整合素-羧基乙基修饰肽抗原结合。抗整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽自身抗体检测试剂盒，用于强直性脊柱炎诊断。临床检测结果表明，抗整合素(ITA2B) -羧基乙基修饰肽自身抗体在强直性脊柱炎患者中的阳性率约高于健康对照者。
目前，临床强直性脊柱炎主要结合临床表现、影像学及实验室检查进行诊断。其中实验室诊断主要包括血常规、血沉、生化、HLA-B27及C反应蛋白等免疫学检查，尚无强直性脊柱炎特异性抗原-抗体相关检查诊断和治疗手段。疾病特异性自身抗原-自身抗体筛查检测，对揭示强直性脊柱炎的发病机制、按照疾病特征进行分组及基于特异性自身抗原-自身抗体开展治疗有重要的意义，也为脊柱关节病(包括强直性脊柱炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎等)，以及其他自身免疫病 (如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎等)的临床诊断及治疗提供了广阔应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用，本发明筛选并比较了5个自身免疫病特异性修饰抗原肽；由该抗修饰原肽免疫动物制备得到的抗修饰多克隆抗体具有特异性强、纯度高的特点；其中改造后修饰肽能够特异性检出强直性脊柱炎患者血浆中抗修饰抗体。
基于上述目的，本发明的方案具体包括：
基于自身免疫病特异性多肽，至少选自以下所述氨基酸序列中的一种多肽：
CarSP-1：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDETRNV；
CarSP-2：FLCPWRAEGGQCcarPS；
CarSP-3：AEGGQCcarPSLLFDLR；
CarSP-4：CcarPSLLFDLRDETRNV和
CarSP-5：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDCTRNV,cys4&cys23 bridge；
其中：
Car为羧基乙基化修饰，Ccar为羧基乙基化半胱氨酸；Cys4&Cys23 bridge为CarSP-5 肽段中第4位和第23位半胱氨酸形成二硫键。
可选的，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列的全部或部分。
可选的，所述的多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％的同一性程度的序列；
或者与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸；
或者为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的差异包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的序列或至少一个N-/C-末端延伸。
一种特异性抗体，所述的抗体由本发明任一所述的基于自身免疫病特异性多肽为抗原免疫得到。
可选的，以本发明任一所述的基于自身免疫病特异性多肽为免疫原，免疫动物制备而成；所述的抗体结合整合素-半胱氨酸羧基乙基修饰位点，与整合素未修饰位点不结合。
可选的，所述抗体采用以下方法制备得到：
本发明任一所述的基于自身免疫病特异性多肽与完全弗氏佐剂混合免疫小鼠/兔，隔周再用所述抗原肽与弗氏不完全佐剂混合加强免疫小鼠/兔，加强免疫四次，于末次免疫后10天采集小鼠血液，离心取血清，进行修饰位点特异性亲和纯化后，获得特异性抗体。
本发明所述的基于自身免疫病特异性多肽用于制备诊断、预防和/或治疗自身免疫病药物中的应用。
可选的，自身免疫病主要为脊柱关节炎/病，包括强直性脊柱炎、中轴型/外周型脊柱关节炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎和幼年脊柱关节炎；以及其他自身免疫病，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎。
可选的，所述的应用包括但不限于基于多肽的检测试剂盒、诊断试剂、蛋白芯片和免疫检测试纸中的一种或组合。
本发明任一所述的特异性抗体用于制备诊断、预防和/或治疗自身免疫病药物中的应用，包括但不限于基于特异性抗体的试剂盒、诊断试剂、蛋白芯片和免疫检测试纸中的一种或组合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过质谱技术对自身免疫病外周血特异性修饰肽段进行了筛选，获得了高反应原性的修饰抗原序列，进一步对筛选出的相关肽段进行HLA结合能力分析，并获得修饰肽段免疫动物后特异性抗体，该抗体具有特异性强，纯度高的特点。上述修饰抗原肽、特异性抗体可用于自身免疫病主要包括脊柱关节病(强直性脊柱炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎等)，以及其他自身免疫病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎等)的临床诊断及治疗。鉴于自身免疫病对人类健康和生活治疗的威胁，本发明将具有广阔的应用前景。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞特异性表达修饰多肽CarSP-3：AEGGQCcarPSLLFDLR二级质谱图谱；
图2强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞特异性表达修饰多肽与健康对照者外周血单个核细胞表达多肽水平差异；
图3荧光偏振技术检测参与HLA-DR呈递的最佳抗原肽；
图4特异性抗体免疫斑点实验。特异性抗体结合修饰后抗原肽，与未修饰肽段不发生抗原抗体反应；
图5多肽CarSP-5结构示意图。改造后肽段具有二级结构，特异性展示修饰表位的抗原肽；
图6特异性兔多克隆抗体与改造后多肽特异性结合检测结果；其中A是阳性抗体与抗原肽结合方案示意图，即改造后ITA2B-羧基乙基修饰肽CarSP-5包被96孔板，加入不同浓度特异性多克隆抗体，并与HRP标记抗体反应后进行ELISA检测读值；B是特异性抗体与抗原肽结合特异性检测结果；
图7强直性脊柱炎抗整合素-羧基乙基修饰抗体检测试剂盒与未改造未修饰肽段、未改造修饰肽段作为抗原检出能力比较。其中A是线性未修饰肽段(SP-1)、线型修饰肽段(CarSP-1)及改造后修饰环肽(CarSP-5)三种抗原检测抗修饰抗体能力比较；B 是线性未修饰肽段(SP-1)、线型修饰肽段(CarSP-1)及改造后修饰环肽(CarSP-5)三种抗原检测抗未修饰抗体能力比较；
图8强直性脊柱炎(AS)患者血浆与健康对照者(HC)血浆抗ITA2B-羧基乙基修饰自身抗体检测结果；其中A是血浆抗体与抗原肽结合方案示意图，即改造后ITA2B- 羧基乙基修饰肽(CarSP-5)包被96孔板，加入不同样本血浆，并与HRP标记抗体反应后进行检测读值；B是血浆样本与抗原肽结合特异性检测ELISA结果；*为p<0.05；
图9为实施例7的临床ELISA检测结果；
图10为实施例8的免疫反应流式检测结果。
具体实施方式
以下所述所列实施举例仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种组合、更改和变化。凡在本发明的要求和原则之内，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
本发明是基于在整合素中发现新的半胱氨酸羧基乙基化位点的多肽。
本发明所指的“肽”是指两个以上氨基酸以肽键结合的线性氨基酸链。多肽中的氨基酸可以修饰，删除，增加或替代。多肽可以用常规技术合成。如，多肽可通过人工合成得到。
这里说的“羧基乙基”是指羧基乙基基团替代某分子(如半胱氨酸)中的一个氢原子。如，半胱氨酸羧基乙基化后变成羧基乙基化半胱氨酸。
本发明通过质谱技术对自身免疫病外周血特异性修饰肽段进行了筛选，获得了自身免疫病的高反应原性修饰抗原序列，进一步对筛选出的相关肽段进行HLA结合能力分析鉴定，筛选出的修饰抗原肽能够结合HLA-DR分子参与抗原提呈，并诱导产生相关CD4+T 细胞免疫应答。用获得修饰肽段免疫动物后制备特异性抗体，该抗体具有特异性强，稳定性好、简单通用的特性，能够特异性结合改造前后的修饰抗原肽序列。上述修饰抗原肽及其产生的特异性抗体可用于自身免疫病主要包括脊柱关节炎/病(强直性脊柱炎、中轴型/外周型脊柱关节炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎、幼年脊柱关节炎等)，以及其他自身免疫病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎等)的临床诊疗。鉴于自身免疫病对人类健康和生活治疗的威胁，本发明将对自身免疫病的诊治具有广阔的应用前景。
本发明提供自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及其用途，本发明筛选并比较了5个自身免疫病特异性修饰抗原肽；由该抗修饰原肽免疫动物制备得到的抗修饰多克隆抗体具有特异性强、纯度高的特点；其中改造后修饰肽能够特异性检出强直性脊柱炎患者血浆中抗修饰抗体。
具体包括：CarSP-1：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDETRNV(SEQ ID No.1)； CarSP-2：FLCPWRAEGGQCcarPS(SEQ ID No.3)；
CarSP-3：AEGGQCcarPSLLFDLR(SEQ ID No.5)；
CarSP-4：CcarPSLLFDLRDETRNV(SEQ ID No.7)；
CarSP-5：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDCTRNV,cys4&cys23 bridge(SEQ ID No.9)；
其中，Ccar为羧基乙基化半胱氨酸，Cys4&Cys23 bridge为CarSP-5肽段中第4位和第23位半胱氨酸形成二硫键。
上述列出的五条多肽中，其中CarSP-3为体外合成多肽，旨在模拟体内检测获得的多肽C72SP(SEQ ID NO：6)：AEGGQC+72.02PSLLFDLR。C72SP为强直性脊柱炎患者体内出现的特异性多肽，其特征是在多肽的6位半胱氨酸为发生72.02的质量偏移，具体原因未知。
多肽CarSP-1、CarSP-2和CarSP-4：将体外合成多肽CarSP-3两端(即-NH3，-COOH)延伸后获得CarSP-1多肽序列。为了进一步比较CarSP-1序列中的关键差异位点，结合多肽免疫原性的特征分析，将CarSP-1分别截短为多肽CarSP-2和CarSP-4。
多肽CarSP-5：为了优化上述合成多肽(CarSP-1、CarSP-2、CarSP-3、CarSP-4)并暴露残基增强功能应用，进一步将CarSP-1多肽进行位点突变(13位半胱氨酸为羧基乙基化半胱氨酸)和空间结构改造(第4位和第23位的半胱氨酸形成二硫键)，获得CarSP-5，实验结果显示，通过增效设计的多肽CarSP-5的自身抗体检测效能和特异性显著增强。
多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO：5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性程度的序列；
或者与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸；
或者为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的差异包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的序列或至少一个N-/C-末端延伸。
一般的，认为具有高度近似或一致的氨基酸序列认为有相似的蛋白质/多肽功能；同时，不同物种来源的蛋白质多肽序列存在同源性差异/氨基酸组成序列相似，但其基本结构功能相对一致。针对上述多肽，在不同物种间，如人和小鼠，序列差异超过25％，但该蛋白的基本功能相似。因此提出上述的位点改变或优化，还能保持甚至增强原有多肽的类似效果。
上述列举的5条多肽中，关键的结构功能位点为Ccar所代表的羧基乙基化半胱氨酸，该位点在不同物种中高度保守，针对该位点的特异性抗体也验证了该位点修饰前后与抗体结合能力具有显著差异。认为在上述多肽中，Ccar所代表的羧基乙基化半胱氨酸是关键功能氨基酸差异位点，因此，在保证该功能残基位点及其周围序列不发生变更的前提下，与其相似的多肽序列具有相同或相似的功能。
本发明所述的基于自身免疫病特异性多肽及特异性抗体用于制备诊断、预防和/或治疗自身免疫病药物中的应用。由于实施体内的预防和治疗效果需大样本临床研究完成，目前暂无法提供，但我们认为从体外的数据从一定程度上提示体内类似的生物学效应，体外的结果支持多肽及特异性抗体用于制备诊断、预防和/或治疗自身免疫病药物中的应用。由于，本发明所述的基于自身免疫病特异性多肽及特异性抗体在疾病诊断方面的效果，将影响疾病的分型和相应治疗手段，因此具有诊疗方面的应用价值。
可选的，自身免疫病主要为脊柱关节炎/病，包括强直性脊柱炎、中轴型/外周型脊柱关节炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎和幼年脊柱关节炎等；以及其他自身免疫病，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎等。脊椎关节炎包括一组相互关联的疾病(强直性脊柱炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎和葡萄膜炎等)，其中强直性脊柱炎是原型，且其发病机制、诊断及治疗在这一组病中是有代表性的，因此可以推至目前所列举的自身免疫病类型。
应用包括但不限于基于多肽的检测试剂盒、诊断试剂、蛋白芯片和免疫检测试纸中的一种或组合。
本发明任一所述的特异性抗体用于制备诊断、预防和/或治疗自身免疫病药物中的应用，包括但不限于基于特异性抗体的试剂盒、诊断试剂、蛋白芯片和免疫检测试纸中的一种或组合。
本发明提供的修饰多肽，是特异性存在于自身免疫病患者体内。该多肽对于自身免疫病患者有免疫原性，能被患者HLA分子提呈至免疫细胞引起自身免疫反应。本发明以质谱筛查发现强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞特异性表达修饰多肽CarSP-3，其中Ccar为羧基乙基化修饰半胱氨酸。经过分析验证，发现了多肽的延伸序列CarSP-1具有抗原性。本发明进一步根据抗原肽与HLA结合偏好，将CarSP-1分为CarSP-2、CarSP-3 及CarSP-4并比较与HLA亲和性，确定其潜在的抗原表位。
本发明将CarSP-2所示的抗原肽与完全弗氏佐剂混合免疫小鼠，隔周再用所述抗原肽与弗氏不完全佐剂混合加强免疫小鼠，加强免疫四次，于末次免疫后10天采集小鼠血液，离心取血清，进行修饰位点特异性亲和纯化后，获得多克隆抗体。抗体特异性结合整合素-半胱氨酸羧基乙基修饰位点，与整合素未修饰位点不结合。
为了特异性检测自身免疫病患者体内产生抗整合素96位羧基乙基化半胱氨酸相关肽段的自身抗体，本发明设计并改造了整合素96位羧基乙基化半胱氨酸肽段作为特异性抗原CarSP-5，对样本中抗体进行检测。改造后的修饰抗原肽段CarSP-5能够特异性与抗羧基乙基修饰肽段抗体发生抗原抗体特异性反应，不与相应未修饰抗体交叉反应。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做具体说明。
实施例1：强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞特异性表达修饰多肽质谱检测
1.实验材料
1.1样本来源
血浆样本(血浆样本收集相关临床检测均由中国人民解放军空军军医大学西京医院风湿免疫科完成)
本课题研究共使用12份外周血样本，包括：
7份来自强直性脊柱炎确诊患者的外周血，年龄中位数(范围)岁：35(24-55)；
5份健康人外周血，年龄中位数(范围)岁：47(42-52)；
所有外周血由中国人民解放军空军军医大学西京医院风湿免疫科自2015年至2016年收集，所有疾病外周血均来自强直性脊柱炎确诊患者。
1.2试剂材料
BCA试剂盒(Pierce，Thermo Scientific，德国)
蛋白酶抑制剂(罗氏，瑞士)
磷酸酶抑制剂(罗氏，瑞士)
DL-二硫苏糖醇(DTT，Sigma-Aldrich，美国)
胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，美国)
ZipTip C18离心柱(Millipore，美国)
2.实验方法
质谱LC-MS/MS样品制备人外周血单个核细胞样品来自7名强直性脊柱炎患者和 5个健康对照者，通过RIPA裂解分离的总蛋白，与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂一起在冰上放置1小时。离心细胞裂解物，并收集上清液，并通过BCA试剂盒测定，并保存在-80℃下直至进一步使用。为了在蛋白质制备过程中保留天然蛋白质残基的生化特性，蛋白质分离过程中省略了可能会修饰蛋白质的试剂，例如，碘乙酰胺(IAA)和尿素。用胰蛋白酶消化200μg细胞裂解物。样品用碳酸氢铵透析，用DL-二硫苏糖醇还原。胰蛋白酶在37℃下消化24小时，ZipTip C18离心柱(Millipore，美国)用于纯化肽。脱盐的肽在SpeedVac中干燥，并保存在-80℃下直至进一步使用。
质谱分析高压液相色谱法(HPLC)分离混合的肽。主要步骤：首先将2％CH3CN，98％H2O，NH3H2O设置为A相以调节pH值为10.0，将98％CH3CN，2％H2O设置为B 相。将200μg混合肽溶解在80μL A相中，样品进样量为80微升。根据其亲水性，在 C18柱上分离混合的肽溶液。流动相梯度设置为：0-3分钟。为了分离，将流动相梯度设置为：0-3分钟，100％相A，3-5分钟，100％-70％A，5-45分钟，70％-30％A，45-55 分钟，30-5％A，55-60分钟，5％A，始终保持0.7mL/min。UV检测器设置为214nm。根据样品分离的色谱图，在约5分钟时使用1.5mL，每管收集1分钟。最后，收集了 55种成分，并按收集时间的顺序收集了55种成分，编号为1至55，并在SpeedVac中真空干燥。使用乙炔水混合物(50％乙炔，50％水)溶解55个组分并将它们合并为10 个组分，即将1，11，21、31、41和51合并为组分1，依此类推，然后获得组分1至10。将最终获得的10个组分在SpeedVac中真空干燥，并储存在-80℃进行后续的质谱分析。在配备有长C18色谱柱(
Figure BDA0003722733090000101
3μm颗粒)的EASY-nLC 1000 系统(ThermoScientific)上通过液相色谱法对提取和脱盐的肽进行肽分离。使用90分钟线性梯度(含0.1％甲酸的5-35％乙腈)对样品进行分级分离。MS和MS/MS光谱是通过LTQ-OrbitrapElite质谱仪(Thermo Scientific)以数据依赖的方式获得的，其中，每次完整的MS扫描均获得20个最强峰的MS/MS碎片。
使用Proteome Discover中的SEQUEST(参见Yates，2015)针对人类蛋白质数据库搜索二级质谱光谱。胰蛋白酶(完全裂解)被指定为裂解酶，最多允许两个缺失的裂解。搜索二级质谱图，前体质量的最大允许偏差为10ppm，碎片质量的最大允许偏差为0.6 Da。选择包括蛋氨酸在内的各种氨基酸残基的氧化作为动态修饰，错误发现率(FDR) 为1％。每个样品以相同的方法重复三次。
3.结果
修饰多肽CarSP-3(AEGGQCcarPSLLFDLR)(SEQ ID No.2)的二级质谱图来自强直性脊柱炎患者的外周血单个核细胞(图1)。修饰多肽仅出现在强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞中，并未在健康对照者外周血单个核细胞中检测出(图2)。
实施例2：HLA-DR呈递最佳抗原肽筛选
1.实验材料
凝胶过滤柱(PD10；GE Healthcare)
酶标仪Infinite F200(Tecan)
SP-1、CarSP-1、SP-2、CarSP-2、SP-3、CarSP-3、SP-4、CarSP-4及FAM偶联肽段 SP-6(杭州中肽生化有限公司)
2.实验方法
将FAM标记的来源于EB病毒EBNA1蛋白的改造多肽SP-6(SEQ ID No.6：KGGGAEGLRALLARSHVER)肽偶联荧光标志物FAM后，与HLA-DR预结合。通过 FAM-SP-6(1μM)与HLA-DR(500nM)，在37℃的柠檬酸钠缓冲液(150mM氯化钠， 50mM柠檬酸钠缓冲液，pH 5.2)中，孵育3小时。然后用凝胶过滤柱除去未结合的肽。
将竞争肽添加到HLA-DR/FAM-SP-6复合物中(96孔板中100μL体系添加)。竞争肽包括：CarSP-1、CarSP-2、CarSP-3、CarSP-4、SP-1： VFLCPWRAEGGQCPSLLFDLRDETRNV(SEQ IDNo.7)、SP-2：FLCPWRAEGGQCPS (SEQ ID No.8)、SP-3：AEGGQCPSLLFDLR(SEQ ID No.9)、SP-4：CPSLLFDLRDETRNV(SEQ ID No.10)，以及已知能与HLA-DR较强结合的阳性对照肽段SP-PC：PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID No.11)。使用酶标仪Infinite F200(Tecan) 在25℃下读取FAM的荧光偏振(FP)值。
3.实验结果
为了确定用于HLA-DR呈递的最佳肽，将自身免疫病特异性抗原相关多肽SP-1、CarSP-1、SP-2、CarSP-2、SP-3、CarSP-3、SP-4、CarSP-4竞争阳性对照肽SP-PC。修饰肽段CarSP-1、CarSP-2、CarSP-3及CarSP-4均能与HLA-DR结合，具有抗原性。其中CarSP-2与HLA-DR结合能力最强且显著强于阳性对照组，提示CarSP-2为实验组中抗原性最强的片段(图3)。
实施例3：修饰肽段特异性兔多克隆抗体制备
1.实验材料
CarSP-2-KLH、CarSP-2-BSA及SP-2-BSA(杭州中肽生化有限公司)
CNBR ACTIVATED SEPHAROSE 4B填料(GE)
鳌合缓冲液：0.1M NaHCO3 pH8.3添加0.5M NaCl(天津科密欧)
封闭缓冲液：0.1M Tris-HCl pH8.0(天津科密欧)
平衡缓冲液：0.01M pH 7.4PBS(上海百赛生物海利克斯)
洗脱缓冲液：0.05M Gly-HCl pH 2.5(天津科密欧)
2.实验方法
将ITA2B半胱氨酸-2-羧乙基化肽CarSP-2与KLH偶联，将CarSP-2所示的抗原肽与完全弗氏佐剂混合免疫小鼠，隔周再用所述抗原肽与弗氏不完全佐剂混合加强免疫小鼠，加强免疫四次，于末次免疫后10天采集小鼠血液，离心取血清，进行修饰位点特异性亲和纯化后，获得多克隆抗体进行纯化。
称取CNBr-4B 4g干粉，按照CNBr-4B说明书步骤活化琼脂糖颗粒。使用鳌合缓冲液稀释修饰肽段CarSP-2-BSA及非修饰肽段SP-2-BSA至5mg/ml浓度，将蛋白稀释液以5mg/10ml溶胶比例加入活化溶胶中，4℃振荡过夜，鳌合缓冲液漂洗溶胶2-3次，加入3倍体积封闭缓冲液4℃振荡2小时，分别装柱。
取兔血清硫酸铵沉淀混合液200ml，8000rpm离心30min弃上清，0.01M pH 7.4PBS缓冲液溶解沉淀蛋白，0.22um滤器过滤待用。安装SP-2-BSA纯化胶柱，按照平衡-上样-平衡-洗脱-平衡的步骤，重复进行蛋白溶液预纯化，收集蛋白溶液穿过液至洗脱峰值低于10mAU。安装CarSP-2-BSA纯化胶柱，平衡缓冲液平衡10倍柱体积，以3ml/min 速率上样，上样完成后平衡缓冲液平衡至基线，以1ml/min速率洗脱缓冲液洗脱，快速使用3M Tris-HCl缓冲液中和至洗脱液pH至7.0，10kDa超滤管浓缩并更换缓冲液至 0.01M PBS pH7.4。
3.实验结果
修饰抗原肽CarSP-1(见附图4)能够特异性与抗羧基乙基修饰肽段抗体发生抗原抗体特异性反应，不与相应未修饰抗体交叉反应。
实施例4：改造后整合素ITA2B-羧基乙基修饰肽CarSP-5与特异性抗体结合检测
1.实验材料
抗整合素-羧基乙基修饰抗体检测试剂，包括：
1)包被用修饰抗原肽；该修饰肽来自于改造后整合素ITA2B-羧基乙基修饰肽CarSP-5(图5)；
2)样品稀释液1瓶250mL，其为含10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
3)检测抗体工作液1瓶3mL，其含有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的抗兔免疫球蛋白抗体(Thermo Scientific)；
4)洗涤液(20×)1瓶50mL，其为含1％吐温-20的PH7.4的20×磷酸盐缓冲液；
5)特异性抗修饰抗原兔多克隆抗体200ng。
2.实验方法
使用前，所有试剂充分混匀，缓冲液平衡至室温。修饰抗原肽10μg/mL包被96孔酶标板，贴上封板膜4℃过夜孵育。将预包被的酶标板用洗涤液洗3次，每次1分钟，在吸水滤纸上拍干。用样品稀释液稀释阳性抗体，终浓度为1μg/mL，并对比稀释6个浓度：1μg/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1ng/mL。每种浓度的阳性抗体吸取100μl加入到上述修饰抗原包被孔中(每种浓度做4个复孔)，0ng/mL为阴性对照，混匀后贴上封板膜室温孵育4h。300μL每孔加入1×洗涤液孵育1min后，于滤纸上扣尽液体，重复3次。100μL/孔加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白G抗体，混匀后贴上封板膜室温孵育1h。300μL每孔加入1×洗涤液孵育1min 后，于滤纸上扣尽液体，重复3次。100μL每孔加入TMB(Biolegend)，室温避光温育5-30min。显色完成后，每孔迅速加入100μL Stop solution(Biolegend)终止反应。终止后10min内，用检测波450nm读值。
3.实验结果
阳性抗体能够特异性与预包被改造后修饰抗原结合，实现ELISA检测后显色。该结果提示阳性抗体与抗原特异性结合特异性高、反应性好，结果见附图6。
实施例5：线性未修饰肽段SP-1、线性修饰肽CarSP-1及环状修饰肽CarSP-5与抗修饰特异性抗体及抗未修饰抗体结合能力比较
1.实验材料
抗整合素抗体检测试剂，包括：
1)包被用修饰抗原肽；该修饰肽来自于改造后整合素ITA2B-羧基乙基修饰肽CarSP-5(图5)；
2)样品稀释液1瓶250mL，其为含10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
3)检测抗体工作液1瓶3mL，其含有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的抗兔免疫球蛋白抗体(Thermo Scientific)；
4)洗涤液(20×)1瓶50mL，其为含1％吐温-20的PH7.4的20×磷酸盐缓冲液；
5)抗整合素96位半胱氨酸修饰肽段CarSP-2特异性兔多克隆抗体；
6)抗整合素96位半胱氨酸未修饰肽段SP-2抗体；
7)线性未修饰肽段SP-1(VFLCPWRAEGGQCPSLLFDLRDETRNV)
8)线性修饰肽段CarSP-1(VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDETRNV)
9)改造后修饰环肽CarSP-5(VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDCTRNV,cys4&cys23 二硫键连接)
2.实验方法
使用前，所有试剂充分混匀，缓冲液平衡至室温。分别以线性未修饰肽段、线型修饰肽段及改造后修饰环肽10μg/mL包被96孔酶标板，贴上封板膜4℃过夜孵育。
将预包被的酶标板用洗涤液洗3次，每次1分钟，在吸水滤纸上拍干。用样品稀释液稀释抗修饰抗体(阳性抗体)及抗未修饰抗体，终浓度为1μg/mL，并对比稀释6 个浓度：100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1ng/mL。每种浓度的阳性抗体吸取100μL加入到上述修饰抗原包被孔中(每种浓度做4个复孔)，0ng/mL 为阴性对照，混匀后贴上封板膜室温孵育4h。
300μL每孔加入1×洗涤液孵育1min后，于滤纸上扣尽液体，重复3次。100μL/ 孔加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白G抗体，混匀后贴上封板膜室温孵育1h。300μL每孔加入1×洗涤液孵育1min后，于滤纸上扣尽液体，重复3次。100 μL每孔加入TMB(Biolegend)，室温避光温育5-30min。显色完成后，每孔迅速加入 100μL Stop solution(Biolegend)终止反应。终止后10min内，用检测波450nm读值。
3.实验结果
检测结果提示改造后的修饰环肽作为预包被抗原，与线性修饰及未修饰肽段比较，不仅能够高效结合抗整合素-羧乙基化抗体，同时与抗整合素未修饰抗体的交叉反应较弱(见图7)。试验证实本发明用于强直性脊柱炎辅助诊断或鉴别诊断的强直性脊柱炎抗整合素-羧基乙基修饰抗体检测试剂盒能够高效并特异性的检出体内外抗整合素-羧基乙基修饰抗体。
实施例6
用于强直性脊柱炎辅助诊断或鉴别诊断的ITA2B-羧基乙基修饰抗体检测试剂盒在强直性脊柱炎患者及健康对照者血浆中表达具体实验过程如下：
1.实验材料
1.1本课题研究共使用166份血浆，包括：
126份来自强直性脊柱炎确诊患者的血浆，年龄中位数(范围)岁：30(14-68)；
40份健康人血浆，年龄中位数(范围)岁：45(25-68)；
所有血浆由中国人民解放军空军军医大学西京医院风湿免疫科自2015年至2020年收集，所有疾病血浆均来自强直性脊柱炎确诊患者。
1.2抗整合素-羧基乙基修饰抗体检测试剂，包括：
1)包被用修饰抗原肽；该修饰肽来自于改造后整合素ITA2B-羧基乙基修饰肽CarSP-5；
2)样品稀释液1瓶250mL，其为含10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
3)检测抗体工作液1瓶12mL，其含有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的抗人免疫球蛋白抗体(Thermo Scientific)；
4)检测抗体工作液1瓶3mL，其含有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的抗兔免疫球蛋白抗体(Thermo Scientific)；
5)洗涤液(20×)1瓶50mL，其为含1％吐温-20的PH7.4的20×磷酸盐缓冲液；
6)特异性抗修饰抗原兔多克隆抗体200ng。
2.实验方法
使用前，所有试剂充分混匀，缓冲液平衡至室温；修饰抗原肽10μg/mL包被96孔酶标板，贴上封板膜4℃过夜孵育；设定空白对照组、标准品组及实验组；100μL每孔加入稀释后的标准品及样品稀释液10倍样品：126例强直性脊柱炎患者血浆(AS)及 40例健康对照着血浆(HC)至样品孔，设置复孔，混匀后贴上封板膜室温孵育4h；300 μL每孔加入1×洗涤液孵育1min后，于滤纸上扣尽液体，重复3次；100μL/孔加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白G抗体(阳性对照组加入辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白G抗体)，混匀后贴上封板膜室温孵育1h；300μL每孔加入1×洗涤液孵育1min后，于滤纸上扣尽液体，重复3次；100μL每孔加入TMB(Biolegend)，室温避光温育5-30min；显色完成后，每孔迅速加入100μL Stop solution(Biolegend) 终止反应。终止后10min内，用检测波450nm读值。
3.实验结果
临床ELISA检测结果表明，抗整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽自身抗体在强直性脊柱炎患者中显著高于对照组，阳性率约为10％，在健康对照者的阳性率为0％(见附图8)。其中，在HLA-DR4阳性(与自身免疫性疾病高度相关HLA分型)患者中，抗整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽自身抗体阳性率约50％。
自身面和异性疾病患者体内自身抗体的检出，受患者HLA分型、疾病治疗状态和疾病活动度等影响。在上述未筛选人群中，整体的患者阳性率仅为10％，目前已有证据表明在HLA-DR4阳性(与自身免疫性疾病高度相关HLA分型)患者中，抗整合素(ITA2B) -羧基乙基修饰肽自身抗体阳性率约50％。该比例与疾病类型及发生发展相联系，有临床指导意义和诊疗价值。也就是说，应用权利要求提到的一组合成多肽及其衍生序列检测或诊治强直性脊柱炎患者，当筛选阳性率为10％应该是比较理想的。
实施例7：
用于类风湿关节炎和系统性红斑狼疮辅助诊断或鉴别诊断的ITA2B-羧基乙基修饰抗体检测试剂盒在类风湿关节炎和系统性红斑狼疮血浆中表达具体实验过程如下：
1.实验材料
1.1本课题研究共使用71份血浆，包括：
31份来自类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者的血浆；
25份来自系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者的血浆
15份健康人(healthy control,HC)血浆；
所有血浆由中国人民解放军空军军医大学西京医院风湿免疫科自2015年至2020年收集，所有疾病血浆均来自类风湿关节炎和系统性红斑狼疮确诊患者。
1.2抗整合素-羧基乙基修饰抗体检测试剂，包括：
1)包被用修饰抗原肽；该修饰肽来自于改造后整合素ITA2B-羧基乙基修饰肽CarSP-5；
2)样品稀释液1瓶250mL，其为含10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
3)检测抗体工作液1瓶12mL，其含有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的抗人免疫球蛋白抗体(Thermo Scientific)；
4)检测抗体工作液1瓶3mL，其含有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的抗兔免疫球蛋白抗体(Thermo Scientific)；
5)洗涤液(20×)1瓶50mL，其为含1％吐温-20的PH7.4的20×磷酸盐缓冲液；
6)特异性抗修饰抗原兔多克隆抗体200ng。
2.实验方法
使用前，所有试剂充分混匀，缓冲液平衡至室温；修饰抗原肽10μg/mL包被96 孔酶标板，贴上封板膜4℃过夜孵育；设定空白对照组、标准品组及实验组；100μL每孔加入稀释后的标准品及样品稀释液10倍样品，设置复孔，混匀后贴上封板膜室温孵育4h；300μL每孔加入1×洗涤液孵育1min后，于滤纸上扣尽液体，重复3次；100μ L/孔加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白G抗体(阳性对照组加入辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白G抗体)，混匀后贴上封板膜室温孵育1h；300μL 每孔加入1×洗涤液孵育1min后，于滤纸上扣尽液体，重复3次；100μL每孔加入 TMB(Biolegend)，室温避光温育5-30min；显色完成后，每孔迅速加入100μL Stop solution(Biolegend)终止反应。终止后10min内，用检测波450nm读值。
3.实验结果
临床ELISA检测结果表明，抗整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽自身抗体在类风湿关节炎和系统性红斑狼疮患者中显著高于对照组，阳性率约大于10％，在健康对照者的阳性率为0％(见附图9)。其中，在HLA-DR4阳性(与自身免疫性疾病高度相关HLA 分型)患者中，抗整合素(ITA2B)-羧基乙基修饰肽自身抗体阳性率约50％。
实施例8：特异性抗体减弱CarSP-1肽引起免疫反应流式检测
1.实验材料
AIM
Figure BDA0003722733090000161
cell culture media(Gibco公司)
Recombinant human GM-CSF(Biolegend公司)
Recombinant human IL-4(Biolegend公司)
Recombinant human TNF-α(Biolegend公司)
Recombinant human IL-6(Biolegend公司)
Recombinant human IL-1β(Biolegend公司)
2.实验方法
通过淋巴细胞分离液从外周血中分离出PBMC后，将细胞重悬于AIM-V培养基中。将PBMC(3x106/mL)添加到六孔板中，转移到37℃5％CO2培养箱中，并贴壁2小时。2小时后，轻轻摇动六孔板并轻敲以悬浮非贴壁和半贴壁细胞。悬浮液主要是淋巴细胞(冷冻保存的非贴壁细胞以备后用)。在37℃和5％的条件下，将未成熟DC (iDC)培养基添加到贴壁细胞中(添加到最终浓度为800U/mL的GM-CSF和500 U/mL的IL-4到AIM-V培养基中)二氧化碳培养箱。在iDC培养的第6天，加入等体积的成熟DC培养基(AIM-V培养基加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF、1000 U/mL的IL-4和10ng/mL TNF-α、10ng/mL IL-1β、320ng/mL IL-6、2μg/mLPGE2) 加到肽(CarSP-1)中，最终浓度为10μg/mL。分组分别加入终浓度为1μg/mL的对照IgG或特异性抗体。原始条件培养基与成熟DC培养基的比例为1:1。将细胞培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中16-18h，iDCs成熟为mDCs。
培养2小时后，收集非贴壁细胞(淋巴细胞)，将1640细胞培养基(含10％FBS、10ng/mL IL-7、单克隆抗体)加入到37℃，在5％CO2细胞培养箱中培养15h。在T细胞培养15小时后，对T细胞和mDCs进行计数，以用于mDCs和T细胞的共培养。mDC：T细胞＝1:10。96孔板中T细胞的数量为1x105/孔。培养基采用 1640培养基。加入终浓度为10ng/mL、10％FBS和1％青霉素/链霉素的IL-7。将剩余的mDC细胞分别冷冻用于二次共培养。共培养3天后，用终浓度为10ng/mL的IL-7、 10％FBS、1％青霉素/链霉素和50U/mL IL-2替换1640培养基。共培养10d后，复苏 mDC细胞；根据T细胞和mDC细胞计数共培养mDC和T细胞，mDC:T细胞＝1:10，1640培养基中加入10％FBS。在这些组中，FACS检测组加入了封闭剂Brefeldin A溶液(1000X)和Monensin溶液(1000X)。
T细胞和mDC细胞共培养6小时后，分别收集细胞，500g，离心5min，弃上清，转至1.5ml EP管，PBS洗一次，300g，离心5min，加入100ul PBS和2ul流式抗体 (CD3,CD4,CD8)，进行胞外染色30min；加入1ml PBS 500g，离心5min，弃上清，加破膜剂250ul，20min后，加500ul洗液洗一次，300g离心5min，弃上清，加入100ul 洗液，4℃过夜；第二天直接加入2ul流式抗体(APC-TNF-α，APC-IFN-γ)进行胞内染色，30min后，加入500ul PBS洗一次，300g离心5min，弃上清，加入200ul PBS转入流式管，流式上机检测。
3.实验结果
结合图10的免疫反应流式检测提示，特异性抗体能够减弱CarSP-1肽引起的抗原提呈反应和自身CD4和CD8 T淋巴细胞相关免疫应答。在加入特异性抗体后，其应答标志因子—肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)和干扰素(Interferon，IFN) 显著降低，提示特异性抗体减弱CarSP-1肽引起免疫反应，有潜在的治疗效果。
综上所述，本发明通过强直性脊柱炎患者质谱筛查，获得了特异性表达的修饰抗原肽序列。进一步对筛选出的修饰抗原肽进行免疫原性鉴定，筛选的修饰抗原肽能够结合HLA-DR分子参与抗原提呈。基于修饰抗原肽段免疫动物后特异性抗体，该抗体具有特异性强，纯度高的特点。该修饰抗原肽及特异性抗体在脊柱关节病(包括强直性脊柱炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎等)及其他自身免疫病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎等)的早期诊断、疾病分型和靶向药物的研发等方面，本发明将具有广阔的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
核苷酸序列表电子文件
<110>中国人民解放军空军军医大学
<120>基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用
<160>6
<210>1
<211>27
<212>PRT
<213> SYNTHESIS
<220>合成多肽的13位半胱氨酸为羧基乙基化半胱氨酸，CarSP-1
<400>
Val Phe Leu Cys Pro Trp Arg Ala Glu Gly Gly Gln Cys Pro Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Asp Leu Arg Asp Glu Thr Arg Asn Val
16 20 25
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213> SYNTHESIS
<220> 合成多肽的12位半胱氨酸为羧基乙基化半胱氨酸，CarSP-2
<400>
Phe Leu Cys Pro Trp Arg Ala Glu Gly Gly Gln Cys Pro Ser
1 5 10
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213> SYNTHESIS
<220> 合成多肽的6位半胱氨酸为羧基乙基化半胱氨酸，CarSP-3
<400>
Ala Glu Gly Gly Gln Cys Pro Ser Leu Leu Phe Asp Leu Arg
1 5 10
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213> SYNTHESIS
<220> 合成多肽的1位半胱氨酸为羧基乙基化半胱氨酸，CarSP-4
<400>
Cys Pro Ser Leu Leu Phe Asp Leu Arg Asp Glu Thr Arg Asn Val
1 5 10 15
<210>5
<211>27
<212>PRT
<213> SYNTHESIS
<220> 合成多肽的13位半胱氨酸为羧基乙基化半胱氨酸，第4位和第23位的半胱氨酸形成二硫键；CarSP-5
<400>
Val Phe Leu Cys Pro Trp Arg Ala Glu Gly Gly Gln Cys Pro Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Asp Leu Arg Asp Cys Thr Arg Asn Val
16 20 25
<210>6
<211>14
<212>PRT
<213> Human
<220> 患者来源多肽的6位半胱氨酸为发生72.02的质量偏移，C72SP
<400>
Ala Glu Gly Gly Gln Cys Pro Ser Leu Leu Phe Asp Leu Arg
1 5 10

Claims (10)

1.基于自身免疫病特异性多肽，其特征在于，至少选自以下所述氨基酸序列中的一种多肽：
CarSP-1：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDETRNV；
CarSP-2：FLCPWRAEGGQCcarPS；
CarSP-3：AEGGQCcarPSLLFDLR；
CarSP-4：CcarPSLLFDLRDETRNV和
CarSP-5：VFLCPWRAEGGQCcarPSLLFDLRDCTRNV,cys4&cys23 bridge；
其中：
Car为羧基乙基化修饰，Ccar为羧基乙基化半胱氨酸；Cys4&Cys23 bridge为CarSP-5肽段中第4位和第23位半胱氨酸形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的基于自身免疫病特异性多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列的全部或部分。
3.根据权利要求1所述的基于自身免疫病特异性多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性程度的序列；
或者与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸；
或者为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的变体，其中所述变体与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的差异包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的序列或至少一个N-/C-末端延伸。
4.一种特异性抗体，其特征在于，所述的抗体由权利要求1-3任一所述的基于自身免疫病特异性多肽为抗原免疫得到。
5.根据权利要求4所述的特异性抗体，其特征在于，以权利要求1-3任一所述的基于自身免疫病特异性多肽为免疫原，免疫动物制备而成；
所述的抗体结合整合素-半胱氨酸羧基乙基修饰位点，与整合素未修饰位点不结合。
6.根据权利要求4所述的特异性抗体，其特征在于，所述抗体采用以下方法制备得到：
权利要求1-3任一所述的基于自身免疫病特异性多肽与完全弗氏佐剂混合免疫小鼠/兔，隔周再用所述抗原肽与弗氏不完全佐剂混合加强免疫小鼠/兔，加强免疫四次，于末次免疫后10天采集小鼠血液，离心取血清，进行修饰位点特异性亲和纯化后，获得特异性抗体。
7.权利要求1-3任一所述的基于自身免疫病特异性多肽用于制备诊断、预防和/或治疗自身免疫病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，自身免疫病主要为脊柱关节炎/病，包括强直性脊柱炎、中轴型/外周型脊柱关节炎、未分化脊柱关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、葡萄膜炎和幼年脊柱关节炎；以及其他自身免疫病，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肌炎和血管炎。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用包括但不限于基于多肽的检测试剂盒、诊断试剂、蛋白芯片和免疫检测试纸中的一种或组合。
10.权利要求4-6任一所述的特异性抗体用于制备诊断、预防和/或治疗自身免疫病药物中的应用，包括但不限于基于特异性抗体的试剂盒、诊断试剂、蛋白芯片和免疫检测试纸中的一种或组合。
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