CN116162134A - 一种多肽或多肽组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种多肽或多肽组合物，本发明所述的多肽或多肽组合物包含翻译后修饰多肽及其对应的未修饰多肽，可以用于检测自身抗体，诊断自身免疫疾病。

Description

一种多肽或多肽组合物
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种多肽或多肽组合物。
技术背景
自身抗体是一种由免疫系统产生的针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。自身抗体可通过直接及间接作用导致自身免疫疾病，其一，自身抗体与表达于靶器官的功能性自身抗原结合，从而直接抑制或诱导其功能；其二，自身抗体诱导的免疫复合物通过FcγR激活炎性介质(细胞因子)或补体系统，间接导致系统性或局部组织损伤。从人体内产生自身抗体到表现出典型的临床症状之前可能需要几个月甚至几年的时间，例如，在SLE、RA等疾病中均可以在发病前数年检测到自身抗体，因此，通过检测自身抗体可以起到疾病早期预警作用，对高危人群进行早期干预阻止患者发展至具有典型临床表现的疾病阶段。其中有一些抗体对疾病显示高度的特异性，可以作为自身免疫疾病的早期诊断的重要标志物，例如，目前临床用于检测SLE的自身抗体包括抗Sm抗体和抗双链DNA抗体等；用于RA诊断的类风湿因子和抗瓜氨酸抗体等。总之，自身抗体参与了自身免疫性疾病的发生，并且自身抗体有助于自身免疫性疾病的早期诊断、临床分型及预后。
除了人体内一些特定的蛋白质，自身抗体还可以靶向翻译后修饰，如乙酰化、氨基甲酰化、瓜氨酸化、糖基化、甲基化、氧化和磷酸化等。因此，对靶向翻译后修饰的自身抗体的检测分析引起了用于转化研究的兴趣，并且这类自身抗体在疾病早期诊断中具有作为生物标志物的潜力。研究发现，与自身免疫发生最为密切相关的翻译后修饰是脱氨基作用，是指从天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)和精氨酸(R)中去除胺基，其中最显著的脱氨基类型是瓜氨酸化，即肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)酶将精氨酸残基转化为瓜氨酸。靶向瓜氨酸化自身抗原的自身抗体存在于约70％的类风湿性关节炎(RA)和其他自身免疫性疾病中，如1型糖尿病(T1D)、系统性红斑狼疮(SLE)、溃疡性结肠炎、多发性硬化(MS)和阿尔茨海默病等。目前，临床上已经开发了不同的抗瓜氨酸化抗体检测试剂盒来诊断类风湿关节炎，不幸的是，有三分之一的类风湿性关节炎患者未被检测到，迫切需要发现了更多新的翻译后修饰标志物，来应对这一挑战。
发明内容
本申请设计一种多肽芯片，所述的多肽芯片包含翻译后修饰多肽及其对应的未修饰多肽。所述的多肽芯片可以用于自身抗体的检测，从而诊断或评估类风湿关节炎，或，筛选鉴定新的类风湿关节炎的诊断标志物。
本发明的第一方面，提供了一种多肽或多肽组合物。
优选的，所述的多肽组合物包含经修饰的多肽，和/或，未经修饰的多肽。
所述的经修饰的多肽包括但不限于瓜氨酸修饰、糖基化修饰(优选为Tn型糖基化修饰)、乙酰化修饰、a-D-Glc-修饰、磷酸化修饰或生物素修饰(优选C端的生物素修饰)中的一种或两种以上修饰的多肽。
优选的，所述的多肽或多肽组合物包括但不限于SEQ ID NO：1-304所示氨基酸序列中的一种或两种以上。
优选的，所述的多肽或多肽组合物包括但不限于SEQ ID NO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、
181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295或297中的一种或两种以上。
优选的，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：48。
优选的，所述的多肽或多肽组合物还包括但不限于SEQ ID NO：2、3、6、7、10、11、14、15、18、19、22、23、26、27、30、31、34、35、38、39、42、43、46、47、50、51、54、55、58、59、62、63、66、67、70、71、74、75、78、79、82、83、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、
120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、
150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、
180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、299、300、301、302、303或304中的一种或两种以上。
优选的，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：256。
优选的，所述的多肽或多肽组合物包括下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：272、250、270、67、66、294、174、88、186、182、256、238、35、280、120、6、42、214、274、156、196、278、188、144、268、128、39、244、54、96、124、246、30、98、176、282、55、18、108、180、78、118、38、200、152、132、190、106、27、110、130、146、208、202、224、142、136、83、26、28、59、
112、222、226、158、204、50、242、254、198、82、86、230、266、23、62、284、94、51、126、210、172、150或63中的一种或两种以上；
B)SEQ ID NO：12、36、84、28、44、72、48或60中的一种或两种以上；
C)SEQ ID NO：28、40或48中的一种或两种以上；
D)SEQ ID NO：27、46、112、94、158、198、194、38或240中的一种或两种以上；
E)SEQ ID NO：48；和/或，
F)SEQ ID NO：256。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、
115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、
145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、
175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ IDNO：2、3、6、7、10、11、14、15、18、19、22、23、26、27、30、31、34、35、38、39、42、43、46、47、50、51、54、55、58、59、62、63、66、67、70、71、74、75、78、79、82、83、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、299、300、301、302、303和304。在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：272、250、270、67、66、294、174、88、186、182、256、238、35、280、120、6、42、214、274、156、196、278、188、144、268、128、39、244、54、96、124、246、30、98、176、282、55、18、108、180、78、118、38、200、152、132、190、106、27、110、130、146、208、202、224、142、136、83、26、28、59、112、222、226、158、204、50、242、254、198、82、86、230、266、23、62、284、94、51、126、210、172、150和63。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：12、36、84、28、44、72、48和60。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：28、40和48。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：27、46、112、94、158、198、194、38和240。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：272、250、270、67、66、294、174、88、186、182、256、238、35、280、120、6、42、214、274、156、196、278、188、144、268、128、39、244、54、96、124、246、30、98、176、282、55、18、108、180、78、118、38、200、152、132、190、106、27、110、130、146、208、202、224、142、136、83、26、28、59、112、222、226、158、204、50、242、254、198、82、86、230、266、23、62、284、94、51、126、210、172、150、63、12、36、84、28、44、72、48和60。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：28、40、48、27、46、12、94、158、198、194、38和240。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：272、250、270、67、66、294、174、88、186、182、256、238、35、280、120、6、42、214、274、156、196、278、188、144、268、128、39、244、54、96、124、246、30、98、176、282、55、18、108、180、78、118、38、200、152、132、190、106、27、110、130、146、208、202、224、142、136、83、26、28、59、112、222、226、158、204、50、242、254、198、82、86、230、266、23、62、284、94、51、126、210、172、150、63、12、36、84、28、44、72、48、60、28、40、48、27、46、12、94、158、198、194、38和240。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：256。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：48。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：48和256。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括表3所示的氨基酸序列，或，所述的多肽或多肽组合物的氨基酸序列如表3所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括表4所示的氨基酸序列，或，所述的多肽或多肽组合物的氨基酸序列如表4所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括表3和表4所示的氨基酸序列，或，所述的多肽或多肽组合物的氨基酸序列如表3和表4所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括表1所示的氨基酸序列，或，所述的多肽或多肽组合物的氨基酸序列如表1所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：1-304。
优选的，所述的多肽或多肽组合物能够结合自身抗体。进一步优选的，所述的多肽或多肽组合物能够结合患自身免疫疾病的个体体内的自身抗体。
进一步优选的，所述的自身抗体包括但不限于IgG、IgA和/或IgM。
更优选的，所述的自身抗体包括但不限于IgG和/或IgA。
进一步优选的，所述的自身免疫疾病包括但不限于类风湿关节炎。
进一步优选的，所述的个体可以为人或非人动物，例如非人哺乳动物。
优选的，所述的多肽或多肽组合物可以作为自身免疫疾病的诊断标志物。例如检测多肽或多肽组合物的有无或含量可以评价自身免疫疾病，又例如检测与多肽或多肽组合物结合的自身抗体的有无或含量可以评价自身免疫疾病。
其中，所述的评价可以为自身免疫疾病的早期预警，临床诊断，临床分型或预后评估。
优选的，所述的多肽或多肽组合物可以通过现有技术的任何方式进行获得，例如化学合成等。
本发明的第二方面，提供了一种自身免疫疾病的早期预警，临床诊断，临床分型或预后评估的标志物。
所述的标志物包含上述的多肽或多肽组合物。
所述的自身免疫疾病可以为类风湿关节炎。
本发明的第三方面，提供了一种编码上述多肽或多肽组合物中各氨基酸序列的核酸。
本发明的第四方面，提供了一种包含上述核酸的载体。
本发明的第五方面，提供了一种包含上述载体的细胞。
本发明的第六方面，提供了一种检测自身抗体的方法。
优选的，所述的方法包括使用上述的多肽或多肽组合物。
优选的，所述的自身抗体包括但不限于IgG、IgA和/或IgM。
进一步优选的，所述的自身抗体包括但不限于IgG和/或IgA。
所述的方法包括将上述多肽或多肽组合物与待检测样品接触，检测多肽或多肽组合物与自身抗体结合的复合物。
所述的待检测的样品可以为血清。
本发明的第七方面，提供了一种上述的多肽或多肽组合物在制备诊断自身免疫疾病的产品中的应用。
优选的，所述的自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎。
优选的，所述的产品包括但不限于多肽芯片、试剂盒、诊断试剂和/或免疫检测试纸等等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的产品为多肽芯片。
本发明的第八方面，提供了一种多肽芯片。
优选的，所述的多肽芯片包含上述的多肽或多肽组合物、上述的核酸、上述的包含核酸的载体和/或上述的细胞。
所述的多肽或多肽组合物中的多肽包含生物素标记。
优选的，所述的多肽芯片还包含基片。
进一步优选的，所述的基片选自玻璃、硅片、陶瓷、云母、金属、塑料或高聚物膜。
更优选的，所述的基片选自玻璃、硅片或陶瓷。
优选的，所述的基片为经醛基修饰的基片。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的基片为
Figure BDA0004024691630000051
高分子三维基片D。
本发明的第九方面，提供了一种上述的多肽芯片的制备方法。
优选的，所述的制备方法包括：
A)合成上述的多肽或多肽组合物；
B)将步骤A)中合成的多肽或多肽组合物点样在基片上。
优选的，所述的多肽或多肽组合物包被在所述的基片上。
优选的，所述步骤A)中还包含将所述的多肽或多肽组合物进行生物素标记，然后与链霉亲和素、缓冲液(优选为PBS缓冲液)、甘油混匀震荡1h的步骤。
优选的，步骤B)中所述的点样包括使用飞行喷墨式点样仪。
优选的，步骤B)中所述的基片选自玻璃、硅片、陶瓷、云母、金属、塑料或高聚物膜。
进一步优选的，所述的基片选自玻璃、硅片或陶瓷；
优选的，所述的基片为经醛基修饰的基片。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的基片为
Figure BDA0004024691630000052
高分子三维基片D。
本发明的第十方面，提供了一种试剂盒。
优选的，所述的试剂盒中包含上述的多肽或多肽组合物、上述的核酸、上述的包含核酸的载体、上述的细胞和/或上述的多肽芯片。
本发明的第十一方面，提供了一种上述多肽或多肽组合物、上述的核酸、上述的包含核酸的载体、上述的细胞、上述的多肽芯片和/或上述的试剂盒在诊断自身免疫疾病中的应用，或，在筛选鉴定新的自身免疫性疾病诊断标志物中的应用。
优选的，所述的自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“非人哺乳动物”可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。
本发明的有益效果：
1)本申请所述的多肽或多肽组合物可以用于检测自身免疫疾病(特别是类风湿关节炎)患者体内的经翻译后修饰的自身抗体；
2)使用本申请所述的多肽或多肽组合物可以检测出临床上使用抗CCP抗体检测为阴性的类风湿关节炎患者。
附图说明：
图1：多肽芯片设计示意图；
图2：多肽芯片检测血清样本的流程图；
图3：α-CCP+_RA的芯片检测结果图像，以及代表性差异多肽X_110-1的血清检测结果(右图)，其中，HC表示健康组(左图)，α-CCP+_RA表示抗环瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎患者组(中间图)，Ratio表示翻译后修饰肽和对应未修饰肽荧光信号的比值；
图4：α-CCP-_RA的芯片检测结果图像，以及代表性差异多肽X_012-3的血清检测结果(右图)，其中，HC表示健康组(左图)，α-CCP-_RA表示抗环瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎患者组(中间图)，Ratio表示翻译后修饰和对应未修饰肽荧光信号的比值；图5：使用多肽X_110-1(右图)检测α-CCP+_RA和使用多肽X_012-3(左图)检测α-CCP-_RA的特异性和敏感性；其中，α-CCP+_RA表示抗环瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎患者组；α-CCP-_RA表示抗环瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎患者组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中用到的试剂或仪器：
1、主要试剂
1)聚乙二醇6000(Polyethylene glycol-6000,PEG6000)，购自MerckMillipore公司；
2)磷酸盐缓冲液(PBS，PH＝7.4)：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH 7.4(自配)；
3)PBST：0.05％ Tween 20加到1×PBS(自配)；
4)脱脂奶粉(Skim Milk)，购自BD公司；
5)Cy3-Donkey anti-human IgG(H+L)antibody，购自Jackson Immuno Research。
2、主要仪器
1)定制微阵列玻片孵育盒，玻片盒；
2)封板膜，封口膜；
3)滤膜(
Figure BDA0004024691630000061
32mm Syringe Filters with 0.45μm/>
Figure BDA0004024691630000062
Membrane)，购自Pall公司；
4)96孔板和384孔板，购自康宁公司；
5)
Figure BDA0004024691630000063
高分子三维基片D，购自北京博奥生物有限公司；
6)温度控制和混匀器(MixMate)购自eppendorf公司；
7)恒温混匀仪，购自上海净信实业发展有限公司；
8)微型台式真空泵；
9)振荡仪(MS Rocking Shaker)，购自major science公司；
10)MS摇摆器；
11)台式离心机(Centrifuge 5810R)，购自eppendorf公司；
12)GenePix
Figure BDA0004024691630000064
4300A微阵列扫描仪，购自Molecular devices公司；
13)飞行喷墨式点样仪，购自ARRAYJET公司。
实施例1：多肽的合成
1、翻译后修饰及对应未修饰多肽的序列见表1；
2、每条多肽合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：
1)称取0.3g树脂放入玻璃反应器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀30分钟；
2)抽掉DCM，加入氨基酸序列中第一个氨基酸0.6g，加入0.6gDIEA(二异丙基乙胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DCM，氮气鼓泡反应60分钟，抽掉反应液，加入DMF、MEOH(甲醇)洗涤三次；
3)反应器中加入氨基酸序列中第二个氨基酸0.6g，加入HBTH(1-羟基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及DIEA，氮气鼓泡反应30分钟，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量脱帽液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；
4)依步骤3)，依次加入序列中的氨基酸；
5)树脂氮气吹干后，反应柱中取下。移至10mL离心管，加入6mL切割液(95％TFA(三氟乙酸)，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；
6)滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗后即得粗产物；
7)多肽纯化，高效液相色谱将粗品提纯至90％；
8)多肽冻干，纯化后液体放入冻干机进行浓缩，冻干成白色粉末。
表1
Figure BDA0004024691630000071
/>
Figure BDA0004024691630000081
/>
Figure BDA0004024691630000091
/>
Figure BDA0004024691630000101
/>
Figure BDA0004024691630000111
/>
Figure BDA0004024691630000121
/>
Figure BDA0004024691630000131
/>
Figure BDA0004024691630000141
其中，[Cit]表示瓜氨酸修饰，Ace-表示乙酰化修饰，
Figure BDA0004024691630000142
-D-Glc-表示/>
Figure BDA0004024691630000143
-D-Glc-型糖基化修饰，Tn-glycosylation表示Tn型糖基化修饰；PO3H2表示磷酸化修饰，另外，在具体使用的过程中，每条多肽序列后可以连接一个赖氨酸K和Biotin。
实施例2：多肽芯片的制备
1)多肽芯片的设计(见图1)：对304个探针(见表1)在微阵列上的排列分布进行规划设计，微阵列上还包括2个阳性对照(CCP2)和6个阴性对照(Buffer，链霉亲和素，牛血清白蛋白BSA各两个)，每个探针设置两个重复(纵向)，，最终在微阵列上呈现624个斑点(26×24)。
其中，每条多肽的C端有生物素标记，PBS和牛血清白蛋白用作阴性对照。
2)多肽芯片制备：在制备微阵列之前，所有的多肽原料都需要配置成一定浓度的点样溶液，将多肽稀释浓度至0.5mg/ml，在96孔板配置完成后，充分混匀，然后转移至384孔板中，每孔30μl，并使用封板膜将384孔板封闭，将384孔板放入落地离心机中，3000g离心2分钟，除去多余的气泡。最后，使用的飞行喷墨式点样仪(ARRAYJET)将制备的点样溶液分别点制在
Figure BDA0004024691630000144
高分子三维基片D(北京博奥生物有限公司)表面上，制备完成后密封保存在-20℃冰箱备用。
其中，点样溶液包含将生物素标记的多肽(500μg/mL)、链霉亲和素、PBS缓冲液、甘油(30％)；配置完成后，混匀震荡1小时。
实施例3：多肽芯片在筛选类风湿性关节炎候选标志物中的应用
1、样本信息
共收集临床血清样本122例，包含30例健康人样本、30例CCP阳性类风湿关节炎患者样本、30例CCP阴性类风湿关节炎患者样本、16例系统性硬化症患者样本和16例系统性红斑狼疮患者样本。临床样本信息如表2所示，其中，HC：健康组，α-CCP+_RA：抗环瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎患者，α-CCP-_RA：抗环瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎患者，SS：系统性硬化症，SLE：系统性红斑狼疮。
表2：临床样本信息
Figure BDA0004024691630000151
2、实验方法：
检测步骤(见图2)
1)血清准备：血清样本于10,000g离心2分钟，然后用5％脱脂奶粉进行稀释(1：100)，终体积为400μL，备用；
2)固定：将多肽放置到定制芯片孵育盒中，操作时要注意避免触碰到微阵列中的斑点；
3)封闭：沿着每张微阵列右下角加入400μL 5％脱脂奶粉，放置摇摆器上，室温封闭0.5小时；
4)清洗：使用真空泵吸去蛋白质微阵列上的脱脂奶粉，加入400μLPBST溶液清洗三次，每次10分钟；
5)加入血清样本：将稀释后备用的血清样本分别加入每张蛋白质微阵列，放置摇摆器上孵育1小时；
6)清洗：使用400μL PBST溶液清洗三次，每次10分钟；
7)加入二抗：将浓度为1mg/mL的Cy3-Donkey anti-human IgG(H+L)antibody用5％脱脂奶粉进行稀释至2μg/ml，终体积为400μL，加入到蛋白质微阵列，放置摇摆器上避光孵育0.5小时；
8)清洗：使用400μL PBST溶液清洗三次，每次10分钟；再用纯净水清洗两次，每次2分钟；
9)干燥：吸去多余的液体，取出多肽芯片，2000g离心2分钟，除去表面残留的液体，保持干燥；
10)扫描：使用
Figure BDA0004024691630000152
4300A微阵列扫描仪(Molecular devices)扫描蛋白质微阵列，根据加入的荧光二抗，选择扫描的波长为532nm；
11)提取数据：使用GenePix Pro7 software(Molecular Devices)对芯片上的每个斑点进行位置校准，准确量化每个检测指标的荧光信号强度，获取每个斑点对应的荧光信号强度中位值，并计算两个重复点的荧光信号强度的平均值。
3、实验数据处理
将芯片上的0.1百分位数的荧光信号被作为背景，将每条探针荧光信号强度的平均值比背景值进行标准化，比值记为原始信号，再进一步计算每一条发生翻译后修饰多肽与对应未修饰肽的荧光信号的比值，通过非参数秩和检验分析，筛选健康组与疾病组具有统计意义的差异多肽，并作图。
4、利用抗CCP2抗体检测试剂盒，将类风湿关节炎患者分为抗环瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎患者和抗环瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎患者，进行下一步实验。
5、检测结果
使用多肽芯片(由实施例2制备)筛选类风湿性关节炎候选标志物的结果见表3-4和图3-5，在抗环瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎患者中筛选到91个有统计学差异的多肽候选标志物(表3)，以X_110-1为例，HC组(健康组)和α-CCP+_RA(抗环瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎患者组)的血清检测结果如图3所示，利用X_110-1诊断抗环瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎的特异性和敏感度分别是0.90和0.87，AUC为0.891，如图5右图所示；在抗环瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎患者中筛选到12个有统计学差异的多肽候选标志物(表4)，以X_012-3为例，HC组和α-CCP-_RA(抗环瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎患者组)的血清检测结果如图4所示，利用X_012-3诊断抗环瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎的特异性和敏感度分别是0.90和0.33，AUC为0.741，如图5左图所示。
表3：抗瓜氨酸抗体阳性类风湿关节炎患者的多肽候选标志物(p<0.05)
Figure BDA0004024691630000161
/>
Figure BDA0004024691630000171
/>
Figure BDA0004024691630000181
/>
Figure BDA0004024691630000191
表4：抗瓜氨酸抗体阴性类风湿关节炎患者的多肽候选标志物(p<0.05)
Figure BDA0004024691630000192
/>
Figure BDA0004024691630000201
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种多肽或多肽组合物，其特征在于，所述的多肽或多肽组合物包含SEQ IDNO：1-304所示氨基酸序列中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的多肽或多肽组合物，其特征在于，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295或297中的一种或两种以上；
优选的，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：48。
3.根据权利要求1或2所述的多肽或多肽组合物，其特征在于，所述的多肽或多肽组合物还包括SEQ ID NO：2、3、6、7、10、11、14、15、18、19、22、23、26、27、30、31、34、35、38、39、42、43、46、47、50、51、54、55、58、59、62、63、66、67、70、71、74、75、78、79、82、83、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、299、300、301、302、303或304中的一种或两种以上；
优选的，所述的多肽或多肽组合物包括SEQ ID NO：256。
4.根据权利要求1-3任一所述的多肽或多肽组合物，其特征在于，所述的多肽或多肽组合物包括下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：272、250、270、67、66、294、174、88、186、182、256、238、35、280、120、6、42、214、274、156、196、278、188、144、268、128、39、244、54、96、124、246、30、98、176、282、55、18、108、180、78、118、38、200、152、132、190、106、27、110、130、146、208、202、224、142、136、83、26、28、59、112、222、226、158、204、50、242、254、198、82、86、230、266、23、62、284、94、51、126、210、172、150或63中的一种或两种以上；
B)SEQ ID NO：12、36、84、28、44、72、48或60中的一种或两种以上；
C)SEQ ID NO：28、40或48中的一种或两种以上；
D)SEQ ID NO：27、46、112、94、158、198、194、38或240中的一种或两种以上；
E)SEQ ID NO：48；和/或，
F)SEQ ID NO：256。
5.一种检测自身抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括使用权利要求1-4任一所述的多肽或多肽组合物，
优选的，所述的自身抗体包含IgG、IgA和/或IgM，
进一步优选的，所述的自身抗体包含IgG和/或IgA。
6.一种权利要求1-4任一所述的多肽或多肽组合物在制备诊断自身免疫疾病的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫疾病包括类风湿关节炎。
8.一种多肽芯片或试剂盒，其特征在于，所述的多肽芯片或试剂盒包含权利要求1-4任一所述的多肽或多肽组合物。
9.根据权利要求8所述的多肽芯片或试剂盒，其特征在于，所述的多肽芯片或试剂盒还包含基片，所述的基片选自玻璃、硅片、陶瓷、云母、金属、塑料或高聚物膜，
优选的，所述的基片选自玻璃、硅片或陶瓷；
进一步优选的，所述的基片为
Figure FDA0004024691620000021
高分子三维基片D。
10.一种权利要求8或9所述的多肽芯片或试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
A)合成权利要求1-4任一所述的多肽或多肽组合物；
B)将步骤A)中合成的多肽或多肽组合物点样在基片上；
优选的，所述的多肽或多肽组合物包被在所述的基片上；
优选的，所述的基片选自玻璃、硅片、陶瓷、云母、金属、塑料或高聚物膜，
进一步优选的，所述的基片选自玻璃、硅片或陶瓷；
更优选的，所述的基片为
Figure FDA0004024691620000022
高分子三维基片D。/>
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108948153A (zh) * 2018-05-22 2018-12-07 北京蛋白质组研究中心 一种瓜氨酸修饰肽抗原组合及其应用
CN108948154A (zh) * 2018-05-22 2018-12-07 北京蛋白质组研究中心 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN108948174A (zh) * 2018-05-22 2018-12-07 北京蛋白质组研究中心 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN111868073A (zh) * 2019-05-31 2020-10-30 广州市雷德生物科技有限公司 一种类风湿关节炎相关的特异性多肽及其应用
CN112574284A (zh) * 2020-12-29 2021-03-30 珠海碳云智能科技有限公司 多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用
CN115260296A (zh) * 2022-06-30 2022-11-01 中国人民解放军空军军医大学 基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108948153A (zh) * 2018-05-22 2018-12-07 北京蛋白质组研究中心 一种瓜氨酸修饰肽抗原组合及其应用
CN108948154A (zh) * 2018-05-22 2018-12-07 北京蛋白质组研究中心 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN108948174A (zh) * 2018-05-22 2018-12-07 北京蛋白质组研究中心 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN111868073A (zh) * 2019-05-31 2020-10-30 广州市雷德生物科技有限公司 一种类风湿关节炎相关的特异性多肽及其应用
CN112574284A (zh) * 2020-12-29 2021-03-30 珠海碳云智能科技有限公司 多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用
CN115260296A (zh) * 2022-06-30 2022-11-01 中国人民解放军空军军医大学 基于自身免疫病特异性多肽、特异性抗体及应用

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