KR20040015128A - 크론병 항체 결합성 펩티드 및 크론병의 검사 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 크론병의 진단에 유용한 검사 시약, 또한 크론병의 감염의 유무를 간편하고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 검사 시약은, 하기 (a) 또는 (b)의 크론병 항체 결합성 펩티드를 유효 성분으로 한다: (a) 배열 번호 1~4로 표시되는 아미노산 배열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 배열을 가지는 펩티드, (b) 상기 (a)에 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드. 또한, 본 발명의 크론병의 검사 방법은, 피험자의 생체 시료에 있어서의 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300), 또는 쌀 알레르겐을 인식하는 항체의 유무를 검출함으로써 행할 수 있다.

Description

크론병 항체 결합성 펩티드 및 크론병의 검사 방법{CROHN'S DISEASE ANTIBODY-BINDING PEPTIDE AND METHOD OF EXAMINING CROHN'S DISEASE}

크론병은, 면역학적 응답의 이상 상태에 기초한 국소의 염증성 상해로서 이해되고 있다. 종래, 이러한 크론병의 진단은, 임상적 증상, X선 조영, 내시경 검사 또는 병리학적 검사 등에 의해 종합적으로 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 방법은 판별하는데 경험과 숙련된 기술이 필요하고, 또한 환자에게 육체적 또는 정신적인 고통을 주는 결점이 있다. 이 때문에, 크론병을 간단하고 정밀하게 진단하기 위한 방법이 요구되고 있다.

크론병의 병인은 아직 불분명하지만, 식이성 항원과의 관련이 지적되고 있으며, 사실, 항 빵효모 항체(anti-baker's yeast antibody)나 항 돼지 아밀라아제 항체 등의 특정한 항체가 크론병 환자의 혈청 중에 특이적으로 증가되어 있는 것이보고되고 있다. 이러한 발견으로부터, 최근에는 크론병의 진단을 위해 크론병 환자에게서 특유하게 보여지는 항체, 예를 들면 항 빵효모 항체(마츠모토 T. 외,「염증성 장질환에 있어서의 혈청 항 빵효모 항체(anti-Saccharomyces cerevisiaeantibody) 측정의 의의」난치성 염증성 장관 장해 조사 연구반, 1998년 보고서; Main J, et al. BMJ, 1988 Oct 29, 297(6656) 1105-6; Barnes RM, et al. Int Arch Allergy Appl Immunol. 1990, 92(1): 9-15; Giaffer MH, et al. Gut. 1992 Aug, 33(8), 1071-5; Sendid B, et al. Clin Diagn Lab Immunol. 1996 Mar, 3(2), 219-26; Quinton JF, et al., Gut. 1998 Jun, 42(6) 788-91), 항 돼지 아밀라아제 항체(「크론병 환자 혈중 항 돼지 아밀라아제 항체-ELISA에 의한 연구」난치성 염증성 장관 장해 조사 연구반, 1998년 보고서, 특개평 11-190734호 공보), 항M. paratuberculosis유래 단백 항체(Suenaga K, et al. Dig Dis Sci., 1999, Jun, 44(6), 1202-7; Kreuzpaintner G, et al., Gut. 1995 Sep, 37(3), 361-6; Oudkerk Pool M, et al., J. Clin Pathol., 1995 Apr, 48(4), 346-50), 항 호중구 항체(Targan, S., et al., Gastroenterology, 96, A505, 1989), 항 소장 항체(Bagchi, S., et al: Clin. Exp. Immunol, 55, 44-48, 1984)를 검출함으로써 크론병을 진단하는 방법이 제안되어 있다.

한편, 쌀 알레르겐 단백질은, 쌀 알레르기 환자에 있어서 IgE의 주요 항원으로서 단리되었고, 유전자 및 아미노산 배열에 기초하여, 알파-아밀라아제/트립신 억제제(alpha-amylase/trypsin inhibitor)로 알려져 있다(Izumi H, et al. FEBS Lett. 1992 May, 18; 302(3), 213-6; Nakamura R, et al. Biosci BiotechnolBiochem. 1996 Aug, 60(8), 1215-21)). 상술한 바와 같이, 크론병에 특이적인 자기 항원으로서 빵효모나 돼지 아밀라아제 등의 식이성 항원과의 관련성이 지적되고 있지만, 상기 쌀 알레르겐 단백질과의 관련성에 대해서는 보고되어 있지 않다.

또한, 액포형 H⁺수송성 ATPase는, 세포 내막계(central vacuolar system)에 속하는 세포 기관에 존재하여 세포 기관의 내부를 산성으로 조정하는 H⁺펌프로서, 이것이 형성하는 산성 pH가 신경 전달 물질이나 이온의 농축, 단백질 분해 등, 막의 동적인 과정을 포함하는 많은 생명 현상과 밀접하게 결부되어 있음이 알려져 있다(생화학, 제65권, 제6호, 1993년 6월, 제413-436 페이지). 그러나, 그것의 생체 내에서의 상세한 기능은 충분히 해명되어 있지는 않다. 또한, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300(ZNF300))은, 징크 핑거 도메인을 가지는 것으로 보아 핵내에서 유전자의 발현 제어에 관여하고 있는 것으로 예측되지만, 아직 그 기능이 불분명한 단백질이다. 상기 인간 핵내 단백질에 관한 보고는 없으며, 유일하게, 그의 아미노산 배열 및 그의 유전자 배열이 데이터 베이스에 등록되어 있는 것에 불과하다(Gou D.-MET et al., Submitted(28-JUN-2001) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases).

이러한 단백질에 대해서는, 생체내에서의 기능이 해명되는 것에 의해 새로운 약제의 개발이나 의료에 응용될 수 있는 가능성이 기대되지만, 아직 그것을 시사하는 보고는 없으며, 또한 어느 것도 크론병과의 관련성에 대해서 보고된 예가 없다.

본 발명은, 크론병의 진단에 유용한 검사 시약 및 그의 유효 성분에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈액 등의 생체 시료를 피험 시료로 이용하여 간편하게 실시할 수 있는 크론병의 검사 방법에 관한 것이다.

도1은, 실시예1(2)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, 크론병 환자의 혈청에 대한 특이성으로부터 선택한 5개의 크론(CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5)에 대해서 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)에 대한 반응성을 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다.

도2는, CDＰ-1, CDＰ-2, CDＰ-3 및 CDＰ-4의 각 MAP 펩티드의 구조를 도시한도면이다.

도3은, 실시예2(1)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, 각 MAP 펩티드(CDP-1, CDP-2, CDP-3, CDP-4의 MAP 펩티드)에 대한 각종 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)의 반응성을 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다.

도4는, 실시예2(2)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, 혼합 항원 플레이트를 이용하고, 크론병(CD) 환자 혈청 550검체, 궤양성 대장염(UC) 환자 혈청 20검체, 건강한 사람의 혈청 120검체, 십이지장 궤양 환자 혈청 25검체 및 위궤양 환자 혈청 15검체에 대해서 혼합 MAP 펩티드에 대한 반응성을 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다.

도5는, 실시예2(3)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, 도A는, 혼합 MAP 펩티드에 대한 각종 혈청 검체(크론병(CD) 환자 혈청, 궤양성 대장염(UC) 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)의 반응성을 나타내는 도면이다. 도B 및 도C는, 혼합 MAP 펩티드 대신에 빵효모를 항원으로 하여, 빵효모에 대한 각종 혈청 검체(크론병(CD) 환자 혈청, 궤양성 대장염(UC) 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)의 반응성을 나타낸다(시판의 Anti-Saccharomyces cerevisiaeantibodies(ASCA) 검출 키트를 사용). 도B는 ASCA IgG 및 도C는 ASCA IgA를 사용.

도6은, 크론병 환자 특이 펩티드(크론병 항체 결합성 펩티드: CD1 펩티드, CD2 펩티드, CD3 펩티드, CD4 펩티드)와, 크론병과의 관련이 보고되고 있는 단백(CDX, pig pancreatic alpha amylase,M. paratuberculosisHSP65, humanHSP60,M. paratuberculosisp36)과의 아미노산 배열에 있어서 상동성을 도시한 도면이다. 한편, 도면 중에서 「:」은 아미노산이 일치하는 것을, 또한 「.」은 아미노산이 유사한 것을 나타낸다.

도7은, 단백 데이터 베이스로부터 상동성을 검색하여 수득한, 크론병 환자 특이 펩티드(크론병 항체 결합성 펩티드: CD1 펩티드, CD3 펩티드, CD4 펩티드)와 아미노산 배열에 있어서 상동성을 가지는 각종 생물(세균, 균류, 동물, 절지 동물, 식물, 해초류) 유래의 단백을 도시한 도면이다.

도8은, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E의 아미노산 배열과, CD1 펩티드의 동등물(CDＰ-1 펩티드, CDＰ-5 펩티드)의 아미노산 배열과의 상동성을 도시한 도면이다. 한편, 도면 중에서 「||」는 V-ATPase 서브 유닛 E의 아미노산 배열이, CDP-1 및 CDP-5 펩티드 둘 다 또는 어느 하나의 아미노산 배열과 일치하는 것을, 「|」은 V-ATPase 서브 유닛 E의 아미노산 배열이 CDP-1 및 CDP-5 펩티드 둘 다의 아미노산 배열과 유사하다는 것을 나타낸다. 또한, 「:」은 CDP-1과 CDP-5 펩티드의 아미노산이 일치하는 것을, 「.」은 CDP-1과 CDP-5 펩티드의 아미노산이 유사하다는 것을 나타낸다. 또한, 밑줄친 부분은 박테리오 파지 pVIII-단백질 유래의 아미노산 배열을 나타낸다.

도9는, VATE-201, CDP-1a 및 CDP-5a의 각 MAP 펩티드의 구조를 도시한 도면이다.

도10은, 실시예4의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, CDＰ-1a 펩티드, CDＰ-5a 펩티드 및 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E 유래의 펩티드(VATE-201 펩티드)에 대해서, 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)에 대한 반응성을 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다.

도11은, 실시예5의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, 크론병 환자의 혈청 검체 8번, 9번, 14번의 CDＰ-1a의 MAP 플레이트에 대한 반응성이 CDＰ-1a의 MAP 펩티드 항원(도A) 또는 VATE-201의 MAP 펩티드 항원(도B)에 의해 저해된 시험 결과를 나타낸다. 도면 중, -■-은 크론병 환자 혈청 8번, -●-은 크론병 환자 혈청 9번 및 -▲-은 크론병 환자 혈청 14번의 결과를 나타낸다.

도12는, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)의 아미노산 배열 및 그의 126∼138 위치의 아미노산 영역의 아미노산 배열을 가지는 Z300 펩티드의 위치 관계를 도시한 도면이다.

도13은, 실시예6(4)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, CDＰ3 펩티드(상단) 및 Z300 펩티드(하단)에 대해서, 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)의 반응성을 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다.

도14는, 실시예 6(5)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, 크론병 환자의 혈청 검체 2번, 7번, 8번의 CDＰ3의 MAP 플레이트에 대한 반응성이 CDＰ3의 MAP 펩티드 항원(도A) 또는 Z300의 MAP 펩티드 항원(도B)에 의해 저해된 시험 결과를 나타낸다. 도면 중, -■-은 크론병 환자 혈청 2번, -●-은 크론병 환자 혈청 7번 및 -▲-은 크론병 환자 혈청 8번의 결과를 나타낸다.

도15는, 쌀 알레르겐 단백질의 유전자 군(α-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 쌀 알레르겐(Rice allergen), 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5), 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice allergen RA5B precursor), 쌀 종자 알레르겐 RA14(Rice seed allergen RA14), 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor) 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2)에 대해서, 95∼110 위치의 아미노산 영역의 상동성을 비교한 도면이다.

도16은, 쌀 알레르겐 단백질(Rice seed allergen RA14)의 아미노산 배열 및 그의 99∼111 위치의 아미노산 영역의 아미노산 배열을 가지는 TO3965 펩티드의 위치 관계를 도시한 도면이다.

도17은, 실시예7(4)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, CDＰ4 펩티드(상단) 및 TO3965 펩티드(하단)에 대해서, 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)의 반응성을 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다.

도18은, 실시예7(5)의 결과를 도시한 도면이다. 구체적으로는, 크론병 환자의 혈청 검체 3번, 6번, 15번, 17번, 20번의 CDP4의 MAP 플레이트에 대한 반응성이 CDＰ4의 MAP 펩티드 항원(도A) 또는 TO3965의 MAP 펩티드 항원(도B)에 의해 저해된 시험 결과를 나타낸다. 도면 중, -■-은 크론병 환자 혈청 3번, -●-은 크론병 환자 혈청 6번, -▲-은 크론병 환자 혈청 15번, -◆-은 크론병 환자 혈청 17번 및 -□-은 크론병 환자 혈청 20번의 결과를 나타낸다.

본 발명은, 크론병의 감염 유무를 특이적으로 검출하는데 유용한 검사 시약 및 그의 유효 성분을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 피험자의 생체 시료를 대상으로 간편하게 실시할 수 있는 크론병 검사 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 특정한 펩티드가 크론병 환자 체내에 특유하게 존재하는 항체를 특이적으로 인식하여 결합하는 성질을 가짐을 발견하고, 이들 펩티드를 1종, 바람직하게는 2종 이상 조합하여 이용함으로써, 피험자에 대해 크론병의 감염 유무를 간단하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은, 상기 연구의 과정에서 크론병 환자 체내에는 액포형 H⁺수송성 ATPase(특히 그 서브 유닛 E), 쌀 알레르겐 단백질, 또는 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300(ZNF300))을 인식하는 항체가 특이적으로 존재하고 있음을 발견하였다. 그리고, 이들 단백질이 크론병에 있어서 특이적인 자기 항원으로 작용할 가능성을 확신하고, 피험자에 대해서 상기 항체의 유무를 검출함으로써, 크론병의 감염 유무를 정확하게 조사할 수 있음을 확신했다.

본 발명은 이러한 여러 사실에 근거해서 개발된 것이다.

첫번째로, 본 발명은 크론병 검사에 유효하게 이용할 수 있는 하기 (1)∼ (9)에 나타낸 크론병 항체 결합성 펩티드이다.

(1) 하기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(a) 배열번호 1∼4에 나타낸 아미노산 배열의 어느 하나로부터 선택된 아미노산 배열로 이루어진 펩티드,

(b) 상기 (a)에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드.

(2) (1)에 있어서, 상기(b)에 따른 펩티드가, 배열번호 1∼4 또는 배열번호 7에 나타낸 아미노산 배열 중 어느 하나를 일부에 포함하는 펩티드인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(3) (1)에 있어서, 배열번호 1에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가, 배열번호 5∼14에 나타낸 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(4) (1)에 있어서, 배열번호 1에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 적어도 LIAQQM의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 6∼226개의 펩티드인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(5) (1)에 있어서, 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 15∼19에 나타낸 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(6) (1)에 있어서, 배열번호 3에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 20∼32에 나타낸 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(7) (1)에 있어서, 배열번호 3에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 적어도 배열번호 51에 나타낸 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 7∼604개의 펩티드인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(8) (1)에 있어서, 배열번호 4에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 33∼48에 나타낸 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인 크론병 항체 결합성 펩티드.

(9) (1)에 있어서, 배열번호 4에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 적어도 L(V)GGIYXD(E)L(X는 임의인 아미노산 잔기)의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 8∼165개의 펩티드인 크론병 항체 결합성 펩티드.

또한, 본 발명의 크론병 항체 결합성 펩티드는, 1분자 중에, 상기 (1)∼(9)에 나타낸 각 펩티드의 아미노산 배열을 복수개 가지는 것이어도 좋다. 본 발명은이러한 형태의 펩티드로서, 하기 (10)∼(11)에 나타낸 분지상의 다항원성 펩티드(branched multiple antigenic peptides)를 제공한다.

(10) 분지쇄의 아미노산 배열로서, 하기

(a) 배열번호 1∼4에 나타낸 아미노산 배열의 어느 하나로부터 선택된 아미노산 배열로 이루어진 펩티드, 또는

(b) 상기 (a)에 나타낸 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 복수개 가지는 분지상의 항원성 펩티드.

(11) (10)에 있어서, (i) 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (ii) 배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (iii) 배열번호 3으로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, 및 (iv) 배열번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물 중, 적어도 2개의 군 중에서 선택된 2종 이상의 다른 크론병 항체 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 분지쇄에 가지는 분지상 다항원성 펩티드.

또한, 여기서 「동등물」이란, 각각 배열번호 1∼4에 따른 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드를 의미한다(하기의 (13)에 있어서도 같다).

두번째로, 본 발명은 크론병의 진단에 유효하게 이용할 수 있는 하기 (12)∼(15)에 나타낸 크론병의 검사 시약 및 그것을 포함하는 시약 키트이다.

(12) 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 따른 크론병 항체 결합성 펩티드; (10)에 따른 분지상 다항원성 펩티드; 및 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛, 및 16kDa 서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛과의 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개를 유효 성분으로서 포함하는 크론병의 검사 시약.

(13) (12)에 있어서, 상기 크론병 항체 결합성 펩티드가, (i) 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (ii) 배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (iii) 배열번호 3으로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물 및 (iv) 배열번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물 중 적어도 2개의 군 중에서 선택된 2종 이상의 다른 크론병 항체 결합성 펩티드이며, 분지상 다항원성 펩티드가 (11)에 따른 펩티드인 크론병의 검사 시약.

(14) (12) 또는 (13)에 따른 검사 시약을 크론병 항체 결합용 항원 물질로서 포함하는 크론병의 검사 시약 키트.

(15) (14)에 있어서, 항 인간 IgG 항체 및 (12) 또는 (13)에 따른 검사 시약, 및 필요에 따라서, 검체 희석액, 표지 물질, 지지체(고체상), 항 인간 IgG 항체 희석액, 효소 기질액 및 반응 정지액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개를 포함하는 크론병의 검사 시약 키트.

세번째로, 본 발명은 하기 (A)∼(C)에 나타낸 크론병의 검사 방법이다.

(A) 피험자의 생체 시료 중의 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase를 인식하는 항체의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.

상기 크론병의 검사 방법에는, 하기의 태양이 포함된다.

(A-1) (A)에 있어서, 상기 항체가 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E를 인식하는 항체인 크론병의 검사 방법.

(A-2) (A)에 있어서, 상기 항체가 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa 서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛과의 복합체를 인식하는 항체인 크론병의 검사 방법.

(A-3) (A)에 있어서, 상기 항체가 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E의 199∼212 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체인 크론병의 검사 방법.

(A-4) (A)~(A-3) 중 어느 하나에 있어서, LIAQQM의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물, 또는 상기 펩티드 또는 그의 동등물의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드를 항원 물질로 이용하고, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase를 인식하는 항체와의 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.

(A-5) (A-4)에 있어서, LIAQQM의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물이, LIAQQM의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 6∼227개로 이루어진 펩티드인 크론병의 검사 방법.

(A-6) (A-4)에 있어서, LIAQQM의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드의 동등물이, 배열번호 1 및 5∼14에 따른 각각의 아미노산 배열을 가지는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 크론병의 검사 방법.

(A-7) (A)~(A-3) 중 어느 하나에 있어서, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛, 및 16kDa 서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛과의 복합체에 의해 생성된 복합물을 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.

(B) 피험자의 생체 시료 중의 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)을 인식하는 항체의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.

상기 크론병의 검사 방법에는, 하기의 태양이 포함된다.

(B-1) (B)에 있어서, 상기 항체가 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)의 126∼138 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체인 크론병의 검사 방법.

(B-2) (B) 또는 (B-1)에 있어서, 배열번호 51에 따른 펩티드 또는 그의 동등물, 또는 상기 펩티드 또는 그의 동등물의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드를 항원으로서 사용하고, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)을 인식하는 항체와의 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.

(B-3) (B-2)에 있어서, 배열번호 51에 따른 펩티드 또는 그의 동등물이, 적어도 배열번호 51에 따른 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 7∼604개로 이루어진 펩티드인 크론병의 검사 방법.

(B-4) (B-2)에 있어서, 배열번호 51에 따른 펩티드의 동등물이, 배열번호 3, 21∼32로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 펩티드인 크론병의 검사 방법.

(C) 피험자의 생체 시료 중의 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.

(C-1) (C)에 있어서, 상기 쌀 알레르겐 단백질이 알파-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(alpha-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 것인 크론병의 검사 방법.

(C-2) (C) 또는 (C-1)에 있어서, 상기 쌀 알레르겐 단백질이, 쌀 알레르겐(Rice allergen), 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5), 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice allergen RA5B precursor), 쌀 종자 알레르겐 RA14(Riceseed allergen RA14), 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor) 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 한 종인 크론병의 검사 방법.

(C-3) (C)~(C-2) 중 어느 하나에 있어서, 상기 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체가, 쌀 종자 알레르겐 RA14(Rice seed allergen RA14)의 99∼111 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체인 크론병의 검사 방법.

(C-4) (C)~(C-3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체가, 알파-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(alpha-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)의 L(V)GGIYREL의 아미노산 배열을 가지는 아미노산 영역을 인식하는 항체인 크론병의 검사 방법.

(C-5) (C)~(C-4) 중 어느 하나에 있어서, L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기임)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물, 또는 상기 펩티드 또는 그의 동등물의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드를 항원 물질로서 이용하고, 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체와의 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.

(C-6) (C-5)에 있어서, L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기임)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물이, 적어도 L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기임)의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 8∼166개로 이루어진 펩티드인 크론병의 검사 방법.

(C-7) (C-5)에 있어서, L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기임)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드의 동등물이, 배열번호 4, 33∼48에 따른 아미노산 배열을 가지는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 크론병의 검사 방법.

또한, 본 발명에는, 하기의 발명이 포함된다.

(a) 상기 (1)∼(11) 중 어느 하나에 따른 펩티드의, 크론병 검사에 있어서 크론병 항체와 반응시키는 항원 물질로서의 용도.

(b) 상기 (1)∼(11) 중 어느 하나에 따른 펩티드의, 크론병의 검사 시약의 제조를 위한 용도.

이하, 본 명세서에 있어서 아미노산, 펩티드, 염기 배열, 핵산 등을 약칭한 표시는, IUPAC, IUB의 규정,「염기 배열 또는 아미노산 배열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 가이드 라인」(특허청편) 및 해당 분야에 있어서 관용되는 기호를 따른 것이다. 또한, 본 발명에서 말하는 펩티드에는, 아미노산의 수가 10개 이하인 올리고 펩티드 및 그 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리 펩티드가 모두 포함된다.

「크론병 항체」는, 크론병의 감염에 의해 생체 내에서 생성되는 크론병 특유의 항체이다. 본 발명에서는, 원인이 되는 항원 물질의 종류를 따로 묻지 않고, 또한 그것의 인식 여하에 관계없이, 크론병 환자에게서 특이적으로 인지되는 크론병 환자 특유의 항체를 널리 의미하는 것이다. 보다 상세하게는, 적어도 건강한 사람, 궤양성 대장염 환자, 기타 자기 면역 질환자, 십이지장 궤양 환자 및 위궤양환자와 크론병 환자를 비교한 경우에, 크론병 환자에게서 특이적으로 인지되는 항체를 의미한다. 한편, 크론병 항체는, 보통 크론병 환자의 혈액(혈청, 혈장), 오줌, 땀, 타액, 정액 및 척수액 등의 각종의 생체 시료 중에 포함된다.

발명의 실시를 위한 바람직한 형태

(1) 크론병 항체 결합성 펩티드

본 발명이 대상으로 하는「크론병 항체 결합성 펩티드」(이하, 단순히「CD 결합성 펩티드」라 칭함)란, 크론병 항체, 즉, 크론병 환자에게서 특이적으로 인지되는 크론병 특유의 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 펩티드를 의미한다.

본 발명의 CD 결합성 펩티드로서, 구체적으로는 배열번호 1∼4로 표시되는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 예시할 수 있다(배열번호 1: CD1 펩티드, 배열번호 2: CD2 펩티드, 배열번호 3: CD3 펩티드, 배열번호 4: CD4 펩티드). 이들 모두 크론병 항체에 대하여 특이적인 결합성을 가짐으로써 특징지어진다.

또한 본 발명의 펩티드에는, 상기 배열번호 1∼4로 표시되는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 이외에, 이들 각 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 포함된다. 본 발명에 있어서, 이들 펩티드를 배열번호 1~4로 표시되는 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 펩티드의 「동등물」이라 하는 경우도 있다.

여기서, 아미노산의「치환, 결실 또는 부가」의 정도 및 그것의 위치 등은, 변형된 펩티드가, 배열번호 1~4로 표시되는 아미노산 배열의 어느 하나로 이루어지는 펩티드(CD1 펩티드, CD2 펩티드, CD3 펩티드, CD4 펩티드)와 마찬가지로, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 특징을 갖춘 동등물이면 특별히 제한되지 않는다. 아미노산 배열의 변형(변이)은, 예를 들면 돌연변이나 번역 후의 수식 등에 의해 발생할 수도 있지만, 인위적으로 변형될 수도 있다. 한편, 아미노산 배열의 변형(변이) 방법은, 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, 위치 특이 돌연변이[Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382(1987); Methods in Enzymology 100, 468(1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441(1984); 속 생화학 실험 강좌1「유전자 연구법II」, 일본 생화학회편, p105(1986)]등의 유전자 공학적 수법, 또는 인산 트리에스테르법이나 인산 아미다이트법 등의 화학 합성 수단[J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); J. Am. Chem. Soc., 91, 3350 (1969); Science, 150, 178(1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859(1981); 동24, 245(1983)]등을 예시할 수 있다).

본 발명은, 이와 같은 변형이나 변이의 원인 및 수단 등을 막론하고, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 모든 변형 펩티드를 포함하는 것이다.

이러한 동등물은 디스플레이 파지 라이브러리(display phage libraries, 파지 디스플레이 라이브러리), 바람직하게는 랜덤 펩티드 디스플레이 파지 라이브러리(random peptide display phage libraries)를 이용한 스크리닝법을 이용하여 수득할 수 있다. 상기 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하는 스크리닝은 파지 디스플레이법이라 불리며, 종래부터 여러 세포 표면 리셉터와 특이적으로 결합하는리간드나, 여러 항체가 인식하는 에피토프를 동정하기 위해 사용되고 있는 공지의 방법이다. 이들 파지 디스플레이 라이브러리의 구축 방법 및 시험관(in-vitro) 스크리닝법에 대해서는, 스콧 및 스미스씨 등의 방법을 참조할 수 있다(Scott, J. M. and Smith, G. P., Science,249, 386-390(1990); Smith, G. P. and Scott, J. K., Methods in Enzymology,217, 228-257(1993)).

상기 라이브러리 중의 랜덤 펩티드 디스플레이 파지는, 크론병 항체에 특이적으로 결합하는 펩티드를 선별하여 동정하기 위해 스크리닝 대상으로 삼는 다수의 펩티드(올리고 펩티드 또는 폴리 펩티드)를 시험관에서 발현시키는데 이용된다. 또한, 이용되는 파지 라이브러리는, 보통 이러한 방법에 이용되는 공지의 파지 라이브러리 중 어느 것이어도 좋고, 예를 들면 파지의 코트 단백질 pIII 유전자에 랜덤 DNA가 삽입되어서, 파지 캡시드(capsid) 표면에 랜덤한 15개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 배열을 가지는 펩티드가 발현될 수 있도록 구축된 랜덤 펩티드 디스플레이 파지(섬유상 파지, filamentous phage)를 적합하게 예시할 수 있다(특개평 10-237098호 공보, 특개평 10-237099호 공보 및 이시가와, 타기, 세포 공학, 16(12) 1821-1828(1997), 특개 2000-253900호 공보).

상기 스크리닝 방법을 이용하여, 상기 CD1 펩티드(배열번호 1), CD2 펩티드(배열번호 2), CD3 펩티드(배열번호 3) 및 CD4 펩티드(배열번호 4)의 각각의 동등물을 취득하는 방법으로서, 구체적으로는 다음 방법을 들 수 있다:

우선, 파지미드 벡터(phagemid vector)에 랜덤한 DNA 배열을 삽입하고, 파지의 캡시드 표면에 상기 DNA 배열에 대응하는 랜덤한 아미노산 배열을 가지는 펩티드가 발현될 수 있도록 랜덤 펩티드 디스플레이 파지를 구축한다. 이것을, 미리 마이크로 플레이트 등의 고체상 표면에 항 인간 IgG 항체를 통하여 고정시킨 크론병 환자의 혈청 항체(IgG)와 반응시켜서, 상기 크론병 환자의 혈청 항체와 특이적으로 결합하는 파지를 회수한다(바이오 패닝, biopanning). 상기 파지미드 벡터에 삽입하는 랜덤 DNA 배열은, 동등물 취득의 대상이 되는 펩티드(CD1 펩티드, CD2 펩티드, CD3 펩티드 또는 CD4 펩티드)의 아미노산 배열의 적어도 1개의 아미노산을 결실, 치환 또는 부가함으로써 변형한 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열을 선택할 수 있다.

여기서, 마이크로 플레이트 등에 고정시키는 크론병 환자의 혈청 항체(IgG)로서는, 적어도 항원 결합 능력을 가지는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 크론병에 감염된 환자에게서 채취한 혈청이어도 좋고, 또한 상기 혈청을 단백질 A를 이용하여 정제한 정제 항체나, 황산 마그네슘 용액으로 침강 처리하는 것에 의해 얻을 수 있는 정제 항체이어도 좋다.

또한, 크론병 항체와 특이적으로 결합하는 파지의 회수는, 크론병 항체와 파지의 결합을 저해하는 능력을 가지는 물질을, 상기 고정화 항체에 적용함으로써 행할 수 있다. 즉, 마이크로 플레이트 상에 항 인간 IgG 항체를 통하여 고정화된 크론병 항체에 특이적으로 결합하고 있는 파지는, 상기 물질을 더함으로써 크론병 항체로부터 이탈되어 용출되므로 회수할 수 있다. 이러한 스크리닝을 수회, 바람직하게는 2∼3회 정도 반복함으로써, 크론병 항체와 특이적으로 결합하는 펩티드를 발현할 수 있는 파지를 선별할 수 있다.

여기서, 크론병 항체와 파지의 결합을 저해하는 능력을 가지는 물질로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 산성 용액이나 알칼리성 용액, 고농도의 염, 요소, 티오시안(thiocyanogen) 등을 들 수 있다.

이어서, 상기의 방법으로 수득한 파지를 대장균에 감염시켜서 대량 배양하고, 분리 및 정제하여, 크론병 항체와 특이적으로 결합하는 펩티드 발현 파지를 얻는다. 이렇게 해서 수득한 파지는, 항 파지 항체를 통하여 지지체(고상)에 고정화되고, 크론병 항체와 특이적으로 결합하는 파지를 스크리닝하는 조작에 제공된다. 이러한 스크리닝은, 구체적으로는, 상기 방법으로 수득한 파지를 임의의 지지체에 고정화한 항 파지 항체와 반응시켜서 고정화하고, 이 고정화한 파지에 대하여 크론병 환자의 혈청 및 대조 혈청으로서 건강한 사람의 혈청이나 궤양성 대장염 또는 그 밖의 자기 면역질환, 위궤양 또는 십이지장 궤양 등에 감염된 환자의 혈청을 반응시켜서, 그 반응성으로부터 크론병 환자의 혈청에 특이적으로 반응하는 파지를 선택함으로써 실시한다. 이어서, 선택한 파지로부터 DNA를 추출 단리하고, 그 염기 배열을 결정한 후, 그것을 기초로하여 아미노산 배열을 결정함으로써, 선택한 파지가 발현하는 펩티드, 즉 크론병 항체와 특이적으로 결합하는 CD1 펩티드, CD2 펩티드, CD3 펩티드, 또는 CD4 펩티드 각각의 동등물(CD 결합성 펩티드)을 동정하고, 수득할 수 있다.

한편, 상기 방법으로 추출 단리한 DNA의 배열 결정은 당업계에 공지된 방법으로 용이하게 행할 수 있고, 예를 들면, 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,74, 5463-5467(1977)]이나 막섬 길버트법[Method in Enzymology,65,499(1980)] 등을 들 수 있다. 이러한 염기 배열의 결정은, 시판중인 서열 분석기(sequencing kit) 등을 이용하여 용이하게 행할 수도 있다.

예를 들면, 상기의 방법으로 수득한 CD1 펩티드(배열번호 1)의 동등물로서는, 표1에 나타낸 CDP-1a 펩티드(배열번호 5), CDP-1 펩티드(배열번호 6), CD5 펩티드(배열번호 7), CDP-5a 펩티드(배열번호 8), CDP-5 펩티드(배열번호 9), VATE-201c 펩티드(배열번호 10), VATE-201 펩티드(배열번호 11), CD1s 펩티드(배열번호 12) 및 CDP-1s 펩티드(배열번호 13)를 예시할 수 있다. 한편, 표1에 나타낸 각 펩티드에 대해서, CD1 펩티드의 아미노산 배열과 공통되는 부분은 사각으로 둘러싸고, 또한 유사한 아미노산 잔기는 밑줄로 나타낸다(이하, 표2∼4에 있어서도 같다).

또한, CD2 펩티드(배열번호 2)의 동등물로서는, 표2에 나타낸 CDP-2 펩티드(배열번호 15), CD2s 펩티드(배열번호 16), CDP-2s 펩티드(배열번호 17), CD2s1 펩티드(배열번호 18) 및 CDP-2s1 펩티드(배열번호 19)를 예시할 수 있다.

또한, CD3 펩티드(배열번호 3)의 동등물로서는, 표3에 나타낸 CDP-3 펩티드(배열번호 20), CDP3 펩티드(배열번호 21), CDP3-1 펩티드(배열번호 22), CDP3-2 펩티드(배열번호 23), CDP3-3 펩티드(배열번호 24), CDP3-4 펩티드(배열번호 25), CDP3-5 펩티드(배열번호 26), CDP3-6 펩티드(배열번호 27), CDP3-8 펩티드(배열번호 28), CDP3-12 펩티드(배열번호 29), CDP3-14 펩티드(배열번호 30) 및 Z300 펩티드(배열번호 31)를 예시할 수 있다.

또한, CD4 펩티드(배열번호 4)의 동등물로서는, 표4에 나타낸 CDP-4 펩티드(배열번호 33), CDP4 펩티드(배열번호 34), CDP4-1 펩티드(배열번호 35), CDP4-2 펩티드(배열번호 36), CDP4-3 펩티드(배열번호 37), CDP4-4 펩티드(배열번호 38), CDP4-10 펩티드(배열번호 39), CDP4-13 펩티드(배열번호 40), CDP4-14 펩티드(배열번호 41) 및 TO3965 펩티드(배열번호 42)를 예시할 수 있다.

이들 CD 결합성 펩티드는, 그 아미노산 배열에 따라서, 일반적인 화학 합성법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법에는, 통상의 액상법 및 고상법에 의한 펩티드 합성법이 포함된다. 상기 펩티드 합성법은, 보다 자세하게는, 본 발명에서 제공하는 아미노산 배열 정보에 기초하여, 각 아미노산을 1개씩 차차 결합시켜 사슬을 연장시켜 가는 순차적 연장법(stepwise elongation method)과, 아미노산 수개로 이루어지는 프래그먼트를 미리 합성하고, 이어서 각 프래그먼트를 커플링 반응시키는 프래그먼트 축합법(fragment condensation method)을 포함한다. 본 발명에 있어서의 펩티드의 합성은 어느 것에 의해서도 가능하다.

상기 펩티드 합성에 이용되는 축합법도, 공지의 각종 방법을 따를 수 있다.구체적으로는, 예를 들면 아지드법(azide method), 혼합산 무수물법, DCC법, 활성 에스테르법, 산화 환원법, DPPA(디페닐포스포릴 아지드)법, DCC + 첨가물(1-히드록시벤조트리아졸, N-히드록시숙신아미드, N-히드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복시이미드(N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide) 등), 우드 워즈법(Woodward's method) 등을 예시할 수 있다. 이들 각 방법에 이용할 수 있는 용매도, 이러한 종류의 펩티드 축합 반응에 사용되는 것으로 잘 알려져 있는 일반적인 것으로부터 적당히 선택할 수 있다. 그 예로서는, 예를 들면 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO), 헥사포스포아미드, 다이옥산, 테트라 히드로푸란(THF), 아세트산 에틸 및 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다.

한편, 상기 펩티드 합성 반응시에 있어서, 반응에 관여하지 않는 아미노산 내지 펩티드에 있어서의 카르복실기는, 일반적으로는 에스테르화에 의해, 예를 들면 메틸에스테르, 에틸 에스테르, 제3급 부틸에스테르 등의 저급 알킬 에스테르, 또는, 예를 들면 벤질 에스테르, p-메톡시벤질 에스테르, p-니트로벤질 에스테르 등의 알랄킬 에스테르 등에 의해 보호될 수 있다. 또한, 측쇄에 관능기를 가지는 아미노산, 예를 들면 Tyr의 수산기는, 아세틸기, 벤질기, 벤질 옥시카르보닐기, 제3급 부틸기 등으로 보호되어도 좋지만, 반드시 이러한 보호를 할 필요는 없다. 또한, 예를 들면 Arg의 구아니디노(guanidino)기는, 니트로기, 토실(tosyl)기, 2-메톡시벤젠술포닐기, 메틸렌-2-술포닐기, 벤질옥시카르보닐기, 이소보닐옥시카르보닐기(isobornyloxycarbonyl), 아다만틸옥시카르보닐기(adamantyloxycarbonyl) 등의 적당한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 상기 보호기를 가지는 아미노산, 펩티드및 최종적으로 얻어지는 본 발명의 펩티드에 있어서 이들 보호기의 탈보호 반응도 역시, 관용되는 방법, 예를 들면 접촉 환원법이나, 액체 암모니아/나트륨, 불화수소, 브롬화수소, 염화수소, 트리플루오로 아세트산, 아세트산, 포름산, 메탄술폰산 등을 이용하는 방법 등에 따라서 실시할 수 있다.

이렇게 해서 수득한 본 발명의 CD 결합성 펩티드는, 통상의 방법에 따라서,예를 들면 이온교환수지, 분배 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 향류 분배법(countercurrent distribution) 등의 펩티드 화학 분야에서 범용되고 있는 방법에 따라서, 적당히 그것의 정제를 행할 수 있다.

또한, 본 발명에서 말하는 CD 결합성 펩티드에는, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 한, 상기 각종의 펩티드 뿐만 아니라 이들 펩티드의 아미노산 배열을 일부에 포함하는 올리고 펩티드나 폴리 펩티드도 포함된다.

이러한 폴리 펩티드로서는, 예를 들면, 배열번호 1, 배열번호 2, 배열번호 3, 배열번호 4, 배열번호 7, 배열번호 10, 배열번호 12, 배열번호 16, 배열번호 18, 배열번호 31, 또는 배열번호 42 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 일부에 가지는 폴리 펩티드를 들 수 있다. 또한, 상기 배열번호 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로서, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 아미노산 배열을 일부에 가지는 폴리 펩티드이어도 좋다.

일반적으로, 항원-항체 반응에 있어서 항체가 인식하는데 필요한 최소한의아미노산의 수는 4개라고 알려져 있다. 따라서, 항원성의 관점에서는, 4개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드인 한, 아미노산의 수는 특별히 제한되지 않는다. 제한되지는 않지만, 보통 4∼700개의 아미노산의 수를 예시할 수 있다. 또한, 후술하는 바와 같이, 1분자 중에 상기 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 분지쇄로서 복수개 가지는 분지상의 다항원성 펩티드를 제조할 경우에는, 상기 분지쇄의 아미노산의 수로서 9∼14개 범위를 적절하게 예시할 수 있다.

보다 구체적으로는, 적어도 배열번호 10으로 표시되는 아미노산 배열 중 LIAQQM의 아미노산 배열을 포함하는 폴리 펩티드를 예시할 수 있다. 배열번호 10으로 표시되는 아미노산 배열은, CD1 펩티드의 동등물인 VATE-201c 펩티드의 아미노산 배열이며, 상기 아미노산 배열(LIAQQM)을 일부에 포함하는 폴리 펩티드로서는, 배열번호 11의 아미노산 배열을 가지는 VATE-201 펩티드, 액포형 H⁺수송성 ATPase(이하,「V-ATPase」라고 칭함), 또는 그 서브 유닛 E를 들 수 있다. 한편, V-ATPase의 아미노산 배열의 서브 유닛 E의 아미노산 배열을 배열번호 14에 나타낸다.

V-ATPase는, 진핵 세포의 세포 내막계에 속하는 세포 기관(골지체, 리소좀, 분비 과립, 시냅스 소포, 효모의 액포 등)의 내부를 산성으로 유지하기 위해 기능하는 H⁺펌프이다. 상기 V-ATPase는, 서브 유닛 A, B, C, D, E 및 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa서브 유닛의 9개의 서브 유닛으로 구성되는 것으로 알려져 있다. 이들 각 서브 유닛의 1차 구조는 잘 알려져 있고,또한, 이들 서브 유닛으로 구성되는 V-ATPase의 구조도 추정되고 있다(생화학, 제 65권, 제 6호, 1993년 6월, 제 413-436페이지).

본 발명의 CD 결합성 펩티드에는, 이들 서브 유닛으로 구성되는 V-ATPase의 전체 배열을 가지는 폴리 펩티드(단백질) 및 크론병 항체와의 결합성을 가지는 한, V-ATPase의 단편(각 서브 유닛 및 각 서브 유닛의 단편을 포함한다)이 포함된다. 또한, 본 발명의 CD 결합성 펩티드에는, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외의 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛과의 복합체도 포함된다.

V-ATPase의 단편으로서는, 서브 유닛 E(33kDa 폴리 펩티드, 아미노산의 수 226개), 상기 서브 유닛 E 영역을 포함하는 폴리 펩티드(서브 유닛 E를 포함하는 각종 서브 유닛의 복합체를 포함한다), 상기 서브 유닛 E의 아미노산 배열의 202-208 영역을 포함하는 아미노산 수 7∼226개의 폴리 펩티드, 또는 서브 유닛 E의 아미노산 배열의 199-212 영역을 포함하는 아미노산 수 14∼226개의 폴리 펩티드를 들 수 있다. 또한, 이들 V-ATPase 및 그 단편(예를 들면, 서브 유닛 E를 포함하는 각종 서브 유닛의 복합체, 서브 유닛 E 또는 그 일부)은, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 한, 그 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형되어 있어도 좋다. 이들 변형 단백질은, 각각 V-ATPase 및 그 단편(예를 들면 서브 유닛 E)의 동등물로서 정의할 수 있다.

또한, CD 결합성 폴리 펩티드로서, 적어도 배열번호 51로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 폴리 펩티드를 예시할 수 있다. 배열번호 51로 표시되는 아미노산 배열은, CD3 펩티드의 동등물인 Z300 펩티드의 아미노산 배열(배열번호 31)에도 해당한다. 상기 아미노산 배열을 일부에 포함하는 폴리 펩티드로서는, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300; 이하,「인간 핵내 단백질(HZF300)」이라고 칭함)을 들 수 있다. 또한, 인간 핵내 단백질(HZF300)의 아미노산 배열을 배열번호 32에 나타낸다. 본 발명의 CD 결합성 펩티드에는, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 한, 배열번호 32로 표시되는 인간 핵내 단백질(HZF300)의 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형되어 있어도 좋다. 이러한 변형물로서는, 인간 핵내 단백질(HZF300)의 아미노산 배열의 129-135 영역을 포함하는 아미노산 수 7∼604개의 폴리 펩티드, 또는 인간 핵내 단백질(HZF300)의 아미노산 배열의 126-139 영역을 포함하는 아미노산 수 14∼604개의 폴리 펩티드를 들 수 있다. 이들 변형물은, 인간 핵내 단백질(HZF300)의 동등물로서 정의할 수 있다.

또한, CD 결합성의 폴리 펩티드로서, 적어도 L(V)GGIYXE(D)L(X는, 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열을 포함하는 폴리 펩티드를 예시할 수 있다. 상기 아미노산 배열을 일부에 포함하는 폴리 펩티드에는, 배열번호 4, 33∼42로 각각 표시되는 CD4 펩티드 및 그의 동등물이 모두 포함된다. 또한, 상기 아미노산 배열을 일부에 포함하는 폴리 펩티드로서, 이외에 쌀 알레르겐 단백질의 알파-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(alpha-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 쌀 종자 알레르겐 RA14을 들 수 있다. 또한, 쌀 종자 알레르겐 RA14의 아미노산 배열을 배열번호 46에 나타낸다.

본 발명의 CD 결합성 펩티드는, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 한, 쌀 종자 알레르겐 RA14(배열번호 46)의 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형되어 있어도 좋다. 이러한 변형물로서는, 쌀 종자 알레르겐 RA14의 아미노산 배열(배열번호 46)의 101-108 영역을 포함하는 아미노산 수 8∼165개의 폴리 펩티드, 또는 쌀 종자 알레르겐 RA14의 아미노산 배열의 99-111 영역을 포함하는 아미노산 수 13∼165개의 폴리 펩티드를 들 수 있다. 이들 변형물은, 쌀 종자 알레르겐 RA14의 동등물로서 정의할 수 있다.

또한 본 발명의 CD 결합성 펩티드에는, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 한, 배열번호 42로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형되어 있어도 좋은, 변형 아미노산 배열을 일부에 포함하는 폴리 펩티드도 포함된다. 이러한 폴리 펩티드로서는, 쌀 종자 알레르겐 RA14과 같이 알파-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(alpha-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 쌀 알레르겐(Rice allergen, 배열번호 43), 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5, 배열번호 44), 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice seed allergen RA5B precursor, 배열번호 45), 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor, 배열번호 47) 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2, 배열번호 48)을 들 수 있다. 한편, 이들 쌀 알레르겐 단백질도, 크론병 항체에 대하여 특이적 결합성을 가지는 한, 그 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형되어 있어도 좋다. 이러한 쌀 알레르겐 단백질의 동등물로서는, 예를 들면, 각 쌀 알레르겐 단백질의 95∼110 위치의 아미노산 영역에 위치하는 적어도 L(V)GGIYREL의 아미노산 배열(배열번호 49, 50)을 가지는 단백질을 들 수 있다. 구체적으로는 쌀 알레르겐(Rice allergen)의 아미노산 배열의 99-106 영역을 포함하는 아미노산 수 8∼157개의 폴리 펩티드, 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5)의 아미노산 배열의 99-106 영역을 포함하는 아미노산 수 8∼157개의 폴리펩티드, 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice allergen RA5B precursor)의 아미노산 배열의 102-109 영역을 포함하는 아미노산 수 8∼160개의 폴리펩티드, 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor)의 아미노산 배열의 102-109 영역을 포함하는 아미노산 수 8∼166개의 폴리펩티드 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2)의 아미노산 배열의 102-109 영역을 포함하는 아미노산 수 8∼166개의 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들 변형 단백질은, 각각 쌀 알레르겐(Rice allergen), 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5), 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice allergen RA5B precursor), 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor) 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2)의 동등물로서 정의할 수 있다.

이상, V-ATPase, 그 서브 유닛 E(배열번호 14) 및 이들의 동등물은 CD1 펩티드의 동등물로서, 인간 핵내 단백질(HZF300)(배열번호 32) 및 그의 동등물은 CD3 펩티드의 동등물로서, 및 알파-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(alpha-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 각종의 쌀 알레르겐 단백질(배열번호 43~48) 및 이들의 동등물은 CD4 펩티드의 동등물로서, 어느 것이나 본 발명의 CD 결합성 펩티드에 포함된다.

또한, 본 발명의 CD 결합성 펩티드는, 다항원성 펩티드(이하,「MAP 펩티드」또는「분지상 다항원성 펩티드」라고 칭함) 형태일 수도 있다. 이 MAP 펩티드는 기본 분자에, 예를 들면, 배열번호 1∼4로 표시되는 펩티드(CD1 펩티드∼CD4 펩티드) 또는 이들의 동등물의 아미노산 배열이 분지쇄로서 복수개, 분지상으로 결합한 형태로서 특징지어진다. 상기 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 가지는 분지쇄의 수로서는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 2∼16개, 보다 바람직하게는 4∼16개, 더욱 바람직하게는 8개를 예시할 수 있다.

MAP 형태를 가지는 본 발명의 CD 결합성 펩티드(분지상 다항원성 펩티드)의 바람직한 예로서는, 예를 들면 기본 분자(골격)로서 덴드리머(dendrimer) 구조를 가지는 것을 들 수 있다.

덴드리머란, 일반적으로 수지상(tree-like)의 형상으로부터 별 형상의 입체 구조를 가지는 구상 내지 기타 구조의 분자로서 알려져 있다. 이 분자는 또한, 복수개의 기능 기를 가지는 가지(반복 단위)를 포함하는 것으로 특징지어진다(예를 들면, 특표소 60-500295호 공보; 특개소63-99233호 공보; 특개평3-263431호 공보; 미국 특허 제4507466호 명세서; 미국 특허 제4568737호 명세서; Polymer Journal,17, p. 117(1985); Angewandte Chem. Int. Engl.,29, 138-175(1990); Macromolecures,25, p.3247(1992) 등 참조).

본 발명에 이용할 수 있는 덴드리머는, 개시 부분이 되는 핵구조, 이 개시핵에 결합된 반복 단위(가지)로 이루어진 내부층(세대) 및 각 가지에 결합해서 존재하는 기능기로 이루어진 겉표면을 가지는 것이라면, 특별히 제한되지 않는다. 이 덴드리머의 크기, 형태, 반응성 등은, 개시핵 부분, 세대수 및 각 세대에 이용되는 반복 단위를 적당히 선택함으로써 조절할 수 있고, 이러한 것에도 특별한 제한은 없다. 적당한 크기 등을 가지는 덴드리머의 제조는, 후술하는 통상의 방법을 따라 행할 수 있고, 또한 크기가 다른 덴드리머는, 이용되는 세대수를 늘리는 것에 의해 용이하게 수득할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4694064호 명세서 등 참조).

덴드리머 구조를 가지는 본 발명의 CD 결합성 펩티드(분지상 다항원성 펩티드)의 일예로서는, 예를 들면 질소 원자를 개시핵 부분으로 하고, 이 핵부분에 결합하는 -CH₂CH₂CONHCH₂CH₂- 구조로 이루어진 반복 단위(가지)를 가지는 덴드리머의 각 가지의 최외측 말단에 CD 결합성 펩티드의 특정 아미노산 배열을 복수개 결합시킨 것을 들 수 있다. 또 다른 일예로서는, 예를 들면 Lys, Arg, Glu, Asp 등의 아미노산 중 어느 하나를 개시 핵부분으로 하고 이 핵부분에 직접 결합하는 반복 단위로서 상기 언급한 바와 같은 각 아미노산을 이용하고, 마찬가지로 각 가지 말단에 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 결합시킨 것을 들 수 있다.

상기 질소 원자를 개시핵 부분으로 하는 덴드리머는, 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 그 구조물(덴드리머의 원료)은, 시판품에서 입수할 수도 있다(Polysciences, Inc., 400 Vally Road, Warrington, PA, 18976 U.S.A.). 아미노산을 개시핵 부분으로 하는 또다른 종류의 덴드리머는, 예를 들면, 상기 언급한 펩티드 합성법에 따라서 제조할 수 있다. 또한, 예를 들면 Fmoc8-Lys4-Lys2-Lys-β Ala-Alko 수지(와타나베 가가꾸 코교사 제) 등의 시판의 덴드리머 원료를 이용해서 제조할 수도 있다.

보다 구체적으로는, 상기 덴드리머 원료는, 다음과 같이 해서 제조할 수 있다. 즉, 고상 펩티드 합성용 수지에, 스페이서(spacer)를 통하여, 또는 통하지 않고, 2개의 아미노기를 동일하거나 상이한 보호기로 보호한 α,ω-디아미노산을 축합 반응시키고, 이어서 보호기를 제거하고, 또한 동일한 보호 α,ω-디아미노산으로 축합 반응 및 탈보호기 반응을 반복한다.

고체상 펩티드 합성용 수지로서는, 통상의 펩티드 합성에 일반적으로 사용되고 있는 것을 모두 사용할 수 있다. 그 예로서는, 예를 들면 폴리스티렌수지, 폴리아크릴아미드수지, 폴리스티렌 폴리에틸렌글리콜 수지 등의 말단에 클로로메틸기, 4-(히드록시메틸)페녹시기, 4-((α-2',4'-디메톡시페닐)-9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노메틸)페녹시기 등을 가지는 것을 들 수 있다. 스페이서로서는, 1 개 또는 복수개의 아미노산을 들 수 있다. 또한, α,ω-디아미노산으로서는, 리신, 오르니틴, 1,4-디아미노 부티르산, 1,3-디아미노 프로피온산 등을 들 수 있다.

보호기로서는, Boc기, Fmoc기, Z기 등을 들 수 있다. 기능기로서는, 아미노기, 카르복실기 및 수산기를 들 수 있다. 보호기의 제거 반응은, 상기 언급한 펩티드 합성법을 따라 행할 수 있다. 가지의 수는, 반복 단위의 축합과 보호기의 제거를 n회 되풀이함으로써 2n이 된다. 이러한 가지수로서, 구체적으로는 2~16의 범위의 것을 바람직한 것으로서 들 수 있다.

수득한 덴드리머 원료의 각 가지 말단의 기능기에, CD 결합성 펩티드의 특정 아미노산 배열을 결합시킴으로써, 원하는 MAP 형태의 본 발명의 펩티드(분지상 다항원성 펩티드)를 수득할 수 있다. 이러한 결합 반응은, 상기 언급한 펩티드 합성법을 따라 행할 수 있다.

MAP 형태의 본 발명의 펩티드(분지상 항원성 펩티드)는, 통상의 방법에 따라, 적당한 매트릭스, 예를 들면 세파크릴 S-300(Pharmacia사 제) 등의 수지를 이용한 크로마토그래피 조작 등으로 정제할 수 있다.

본 발명의 분지상 다항원성 펩티드에 있어서, 각 가지의 말단을 구성하는 아미노산 배열은 동일한 것일 필요는 없으며, 임의로 다른 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 조합시킨 것일 수도 있다. 다른 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열의 조합예로서는, 예를 들면, (i) CD1 펩티드 및 그의 동등물, (ii) CD2 펩티드 및 그의 동등물, (iii) CD3 펩티드 및 그의 동등물 및 (iv) CD4 펩티드 및 그의 동등물로 이루어진 4군 중, 적어도 2군, 바람직하게는 3군, 보다 바람직하게는 4군 중에서 선택된 다른 2종 이상, 바람직하게는 3종 이상, 보다 바람직하게는 4종 이상의 펩티드의 아미노산 배열의 조합을 예시할 수 있다. 이러한 복합형 분지상 다항원성 펩티드에 의하면, 개개의 피험자에 대해서 크론병 감염의 유무를 보다 높은 정확도로 검출할 수 있다.

본 발명의 CD 결합성 펩티드는, 크론병 환자에게 특이적으로 인지되는 크론병 특유의 항체(크론병 항체)를 선택적으로 인식해서 그것과 결합하는 성질을 가지는 것이다. 따라서, 본 발명의 CD 결합성 펩티드 및 그의 아미노산 배열을 포함하는 분지상 다항원성 펩티드는, 크론병의 감염의 유무, 즉, 크론병의 검사 및 진단에 유효하게 이용할 수 있다.

(2)크론병의 검사 시약 및 시약 키트

이상으로부터, 본 발명은 상기의 CD 결합성 펩티드 또는 그의 아미노산 배열을 포함하는 분지상 다항원성 펩티드를 유효 성분으로 하는 크론병의 검사 시약을 제공한다.

구체적으로는, 본 발명의 크론병 검사 시약은, 유효 성분으로서, 상기 언급한 (i) CD1 펩티드 또는 그의 동등물, (ii) CD2 펩티드 또는 그의 동등물, (iii) CD3 펩티드 또는 그의 동등물 및 (iv) CD4 펩티드 또는 그의 동등물로 이루어진 각종 CD 결합성 펩티드 중에서 선택된 적어도 1개의 펩티드, 또는 (i) CD1 펩티드 또는 그의 동등물, (ii) CD2 펩티드 또는 그의 동등물, (iii) CD3 펩티드 또는 그의 동등물, 및 (iv) CD4 펩티드 또는 그의 동등물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 펩티드의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 분지상으로 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드를 포함하는 것이다.

한편, 상기의 CD1 펩티드의 동등물에는, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외의 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛과의 복합체가 포함된다.

여기서 유효 성분으로 이용되는 이들 CD 결합성 펩티드 또는 분지상 다항원성 펩티드는, 크론병 항체에 대한 그 특이적 결합성을 이용하여, 피험자의 생체 시료 중에 존재할 수 있는 크론병 항체와 결합해서, 그것을 포착 또는 표지화하는 항원 물질로서의 역할을 담당하는 것이다.

크론병의 검사 시약의 유효 성분으로서, 상기의 CD 결합성 펩티드는 1종 단독으로 사용하여도 좋지만, 2종 이상을 임의로 조합시켜서 사용할 수도 있다. 정밀도(판정의 신뢰성) 향상의 점에서는 2종 이상을 조합시켜서 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 조합의 형태는 특별히 제한되어 있지 않지만, 바람직하게는 (i) CD1 펩티드 또는 그의 동등물(예를 들면, CDP-1a 펩티드, CDP-1 펩티드, CD5 펩티드, CDP-5a 펩티드, CDP-5 펩티드, VATE-201c 펩티드, VATE-201 펩티드, CD1s 펩티드, CDP-1s 펩티드, V-ATPase, 서브 유닛 E 또는 이들의 동등물), (ii) CD2 펩티드 또는 그의 동등물 (예를 들면, CDP-2 펩티드, CD2s 펩티드, CDP-2s 펩티드, CD2s1 펩티드, CDP-2s1 펩티드 또는 이들의 동등물), (iii) CD3 펩티드 또는 그의 동등물 (예를 들면, CDP-3 펩티드, CDP3 펩티드, CDP3-1 펩티드, CDP3-2 펩티드, CDP3-3 펩티드, CDP3-4 펩티드, CDP3-5 펩티드, CDP3-6 펩티드, CDP3-8 펩티드, CDP3-12 펩티드, CDP3-14 펩티드, Z300 펩티드, 인간 핵내 단백질(HZF300) 또는 이들의 동등물), 및 (iv) CD4 펩티드 또는 그의 동등물 (예를 들면, CDP-4 펩티드, CDP4 펩티드, CDP4-1 펩티드, CDP4-2 펩티드, CDP4-3 펩티드, CDP4-4 펩티드, CDP4-10 펩티드, CDP4-13 펩티드, CDP4-14 펩티드, TO3965 펩티드, 쌀 알레르겐(Rice allergen), 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5), 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice allergen RA5B precursor), 쌀 종자 알레르겐 RA14(Rice seed allergenRA14), 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor) 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2) 또는 이들의 동등물)의 각 군(i)∼(iv) 중, 적어도 2군, 바람직하게는 3군, 보다 바람직하게는 4군으로부터 임의로 선택된 2종 이상, 바람직하게는 3종 이상, 보다 바람직하게는 4종 이상의 펩티드를 조합시켜서 사용하는 형태이다.

본 발명의 크론병의 검사 시약이, 상기한 바와 같이 CD 결합성 펩티드를 2종 이상 함유하는 조성물의 형태일 경우, 각 CD 결합성 펩티드의 배합 비율은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 각 CD 결합성 펩티드를 서로 동등한 비율로 배합해도 좋고, 또한 크론병 항체에 대한 반응성(결합성)이 약한 펩티드 등을 포함할 경우에는 그것을 고려하여, 반응성이 약한 펩티드의 배합 비율이 많아지도록 배합할 수도 있다. 예를 들면, 제한되지 않지만, 유효 성분으로서, 상기 (i)군, (ii)군, (iii)군 및 (iv)군의 각각에 속하는 CD 결합성 펩티드로서, (i) CD1 펩티드, (ii) CD2 펩티드, (iii) CD3 펩티드 및 (iv) CD4 펩티드를 이용할 경우, 이들은 1 : 2 : 2 : 1의 비율로 이용할 수 있다.

또한, 크론병의 검사 시약의 유효 성분으로서, 상기의 분지상 다항원성 펩티드를 이용할 경우, 상기 다항원성 펩티드는 분지를 구성하는 아미노산 배열이 동일한 종류의 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열로 이루어진 것이어도 좋지만, 2종 이상의 다른 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 포함하는 것이어도 좋다. 후자의 경우, 이러한 분지로서 이용되는 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열의 편성의 형태도 특별히 제한되지 않지만, 상기 각 군 (i)∼(iv) 중, 적어도 2군, 바람직하게는3군, 보다 바람직하게는 4군으로부터 임의로 선택된 2종 이상, 바람직하게는 3종이상, 보다 바람직하게는 4종 이상의 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 조합시켜 분지쇄로서 사용하는 형태로 한다.

본 발명의 크론병의 검사 시약은 크론병 항체와 특이적으로 결합하는 항원 물질로서, 크론병 항체의 포착이나 표지화에 이용할 수 있다. 따라서, 이러한 목적을 벗어나지 않는 한, 상기 검사 시약은 유효 성분으로서 1종 또는 2종 이상의 CD 결합성 펩티드 또는 분지상 다항원성 펩티드만으로 이루어진 것이어도 좋고, 또한 다른 성분을 함유하는 것이어도 좋다. 또한, 크론병 항체의 표지에 사용하기 위해, 이들 CD 결합성 펩티드 또는 분지상 다항원성 펩티드는 임의의 표지 물질로 표지되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 표지에 이용되는 표지 물질로서는, 당업계에서 이용되는 통상의 표지 물질을 널리 이용할 수 있고, 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는³H나¹⁴C 등의 방사성 동위원소; 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제(POX), 마이크로퍼옥시다아제, 키모트립시노겐, 프로카르복시펩티다아제, 글리세르알데히드-3-인산탈수효소, 아밀라아제, 포스포릴라아제, D-나아제 및 P-나아제 등의 효소; 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)나 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(RITC)등의 형광 물질; 및 기타 1N-(2,2,6,6-테트라메틸-1-옥실-4-피페리딜-5N-(아스팔테이트)-2,4-디니트로벤젠(TOPA), 염료 졸, 금속 졸, 라텍스 입자 등을 예시할 수 있다. 한편, 상기 언급한 본 발명에 따른 CD 결합성 펩티드 또는 분지상 다항원성 펩티드에는 이들 표지화된 CD 결합성 펩티드도 포함된다.

일반적으로, 피험자의 생체 시료를 피험 시료로 하여, 크론병의 검사를 행하기 위해서는, CD 결합성 펩티드 또는 분지상 다항원성 펩티드를 유효 성분으로 하는 상기 검사 시약을 포함하는 시약 키트를 이용하는 것이 간편하다. 따라서 또한 본 발명은 크론병의 검사(진단)에 유효하게 이용할 수 있는 시약 키트를 제공한다.

본 발명의 크론병의 검사 시약 키트는, 상기 언급한 검사 시약을 크론병 항체와 결합시킬 목적으로 포함하는 것이면, 크론병 항체의 포착제로서 포함하거나, 또한 크론병 항체의 표지제로서 포함하여도 좋다. 한편, 상기의 검사 시약을 크론병 항체의 포착제로서 이용할 경우에는, 미리 임의의 지지체(고체상)에 고정화시킨 고정화물로서 이용할 수도 있다. 또한, 크론병 항체의 표지제로서 이용할 경우에는, 상기 언급한 바와 같이 임의의 표지 물질로 표지된 CD 결합성 펩티드 또는 다항원성 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 검사 시약 키트에 상기의 검사 시약과 조합되어 이용되는 다른 성분은, 크론병의 검사에 이용되는 면역학적 측정 방법의 종류나 채용되는 검출 수단에 따라서, 통상의 방법에 따라 적당히 선택해서 이용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 검사 시약 키트에는, CD 결합성 펩티드 또는 다항원성 펩티드를 유효 성분으로 하는 상기의 검출 시약 이외의 다른 성분으로서, 인간 IgG을 검출하기 위한 ２차 항체(예를 들면 항 인간IgG 항체)를 포함시킬 수 있다. 한편, 상기 항 인간IgG 항체는, 상기 언급한 표지 물질로 표지화되어 있어도 좋고, 또한 미리 임의의 지지체(고체상)에 고정화되어 있어도 좋다.

또한, 검사 시약 키트에는, 표지 물질에 따른 기질, 또는 표지 물질과 기질과의 반응을 검출하기 위한 검출 시약이 포함되어 있어도 좋고, 또한 측정의 실시의 편익을 위해 적당한 피험 시료 희석액, ２차 항체 희석액(예를 들면 항 인간IgG 항체 희석액), 표준 항체, 완충액, 세정액, 효소 기질액, 반응 정지액 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 상기의 검사 시약 또는 항 인간IgG 항체로서, 표지 또는 고정화되어 있지 않은 것을 사용할 경우에는, 검사 시약 키트 이외의 성분으로서, 지지체(고체상)나 표지 물질을 포함할 수도 있다.

다시 말해, 본 발명의 크론병의 검사 시약 키트는, 상기의 CD 결합성 펩티드 또는 분지상 다항원성 펩티드를 유효 성분으로 하는 검출 시약(고정화 또는/및 표지화되어 있어도 좋다)에, 고정화 또는/및 표지되어 있어도 좋은 항 인간IgG 항체, 표지 물질에 따른 기질, 항체 희석액, 표준 항체, 완충액, 세정액, 기질 용해액, 반응 정지액, 지지체(고체상) 및 표지 물질 중에서 임의로 선택된 적어도 하나를 조합시킨 크론병의 검사용 시약 세트이다. 간편성, 안전성, 감도 등의 관점에서,바람직하게는 효소를 표지 물질로서 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 점에서, 본 발명의 크론병의 검사 시약 키트는, 상기의 CD 결합성 펩티드 또는 분지상 다항원성 펩티드를 유효 성분으로 하는 검출 시약(고정화 또는/및 효소 표지화되어 있어도 좋다)에, 고정화 또는/및 효소 표지화되어 있어도 좋은 항 인간IgG 항체, 효소 기질, 항체 희석액, 표준 항체, 완충액, 세정액, 효소 기질 용해액, 효소 반응 정지액, 지지체(고체상) 및 효소 표지 물질 중에서 임의로 선택된 적어도 하나를 조합시킨 크론병 검사용 시약 세트일 수 있다. 한편, 효소 표지를 위한 효소 표지 물질로서는, 예를 들면, 상기에 더해서, 마이크로퍼옥시다아제, 키모트립시노겐,프로카르복시펩티다아제, 글리세르알데히드-3-인산탈수효소, 아밀라아제, 포스포릴라아제, D-나아제 및 P-나아제 등을 예시할 수 있다.

(3) 크론병의 검사 방법

또한, 본 발명은 크론병의 검사 방법을 제공한다. 상기 검사 방법은, 검사를 위한 피험 시료로서 피험자의 생체 시료를 이용하여, 개개의 피험자에 대해서 크론병의 감염 유무를 검출하는 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 크론병의 검사 방법은, 크론병 환자의 생체 시료에 특이적으로 존재하는 특정한 항체의 존재를 지표로 하여, 각각의 피험자에 대해서 크론병의 감염 유무를 검출하는 것이다.

여기서 피험 시료로서는, 피험자(인간)의 혈액(혈청, 혈장), 오줌, 땀, 타액, 정액 또는 척수액 등의 각종 생체 시료, 바람직하게는 혈청을 이용할 수 있다.

크론병의 검사 방법으로서, 하기 (3-1)∼(3-3)의 3가지 방법을 들 수 있다.

(3-1) 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 크론병 환자에게는 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase를 인식하는 항체가 특이적으로 존재하고 있다.

따라서, 본 발명의 크론병의 검사 방법으로서, 피험자의 생체 시료를 대상으로 하여, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase(V-ATPase)을 인식하는 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 들 수 있다. 상기의 검출 대상으로 하는 항체는, 바람직하게는 V-ATPase의 서브 유닛 E를 인식하는 항체이며, 보다 바람직하게는 V-ATPase의 서브 유닛 E의 199∼212 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체이다.

이러한 항체의 검출은, 항원-항체 반응을 이용한 종래 공지의 면역학적 측정방법을 이용해서 행할 수 있다. 구체적으로는 크론병의 감염이 의심되는 피험자로부터, 상기 각종의 생체 시료, 바람직하게는 혈청을 채취하고, 그 생체 시료와 상기 V-ATPase를 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질을 반응시켜서, 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출함으로써 실시할 수 있다.

여기에서 V-ATPase를 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질로서는, V-ATPase를 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 V-ATPase의 서브 유닛 E를 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것이며, 보다 바람직하게는 V-ATPase의 서브 유닛 E의 199∼212 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것이다. 이러한 성질을 가지는 것으로서, 구체적으로는 LIAQQM의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 및 그의 동등물을 들 수 있다. 여기서 동등물에는, 상기 아미노산 배열(LIAQQM)에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가에 의해 변형되어 이루어진 펩티드로서, 또한 V-ATPase의 서브 유닛 E를 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것이 포함된다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들면 배열 번호 1, 5∼15의 각각에 따른 아미노산 배열을 가지는 펩티드(CD1 펩티드, CDP-1a 펩티드, CDP-1 펩티드, CD5 펩티드, CDP-5a 펩티드, CDP-5 펩티드, VATE-201c 펩티드, VATE-201 펩티드, CD1s 펩티드, CDP-1s 펩티드, V-ATPase, V-ATPase의 서브 유닛 E)을 들 수 있다. 또한, 이들에 한정되지 않고, 예를 들면 상기 아미노산 배열(LIAQQM)을 가지는 아미노산의 수가 6∼226개, 바람직하게는 6∼14개인 폴리펩티드를 이용할 수도 있다.

또한 V-ATPase를 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질로서, V-ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛과의 복합체를 이용할 수도 있다. 또한, V-ATPase를 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질로서, 상기의 아미노산 배열(LIAQQM)로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 안에 복수개 포함하는 분지상 다항원성 펩티드를 이용할 수도 있다.

(3-2) 또한, 후술하는 실시예6에 나타내는 바와 같이, 크론병 환자에게는 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300(HZF300))을 인식하는 항체가 특이적으로 존재하고 있다. 따라서, 본 발명의 크론병의 검사 방법으로서, 피험자의 생체 시료를 대상으로 하여, 인간 핵내 단백질(HZF300)을 인식하는 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 들 수 있다. 상기의 검출 대상으로 하는 항체는, 바람직하게는 인간 핵내 단백질(HZF300)의 126∼138 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체이다.

이러한 항체의 검출은, 항원-항체 반응을 이용한 종래 공지의 면역학적 측정 방법을 이용해서 행할 수 있다. 구체적으로는 크론병의 감염이 의심되는 피험자로부터 상기 각종 생체 시료, 바람직하게는 혈청을 채취하고, 그 생체 시료와 상기 인간 핵내 단백질(HZF300)을 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질을 반응시켜 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출함으로써 실시할 수 있다.

여기서 상기 인간 핵내 단백질을 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질로서는, 상기 인간 핵내 단백질(HZF300)을 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 인간 핵내 단백질(HZF300)의 126∼138 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것이다. 이러한 성질을 가지는 것으로서, 구체적으로는 배열번호 51로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물을 들 수 있다. 여기서 동등물에는, 배열번호 51에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 부가되어서 이루어진 펩티드 또는 단백질이며, 또한 인간 핵내 단백질(HZF300)을 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것이 포함된다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들면 배열번호 3 및 20∼32의 각각에 따른 아미노산 배열을 가지는 펩티드(CD3 펩티드, CDP-3 펩티드, CDP3-1 펩티드, CDP3-2 펩티드, CDP3-3 펩티드, CDP3-4 펩티드, CDP3-5 펩티드, CDP3-6 펩티드, CDP3-8 펩티드, CDP3-12 펩티드, CDP3-14 펩티드, Z300 펩티드, 인간 핵내 단백질(HZF300))을 들 수 있다. 또한, 이에 한정되지 않고, 예를 들면 배열번호 51에 따른 아미노산 배열을 일부에 가지는 아미노산의 수가 7∼604개인 폴리 펩티드를 이용할 수도 있다.

또한, 인간 핵내 단백질(HZF300)을 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질로서, 상기의 배열번호 51에 따른 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 복수개 포함하는 분지상 다항원성 펩티드를 이용할 수도 있다.

(3-3) 또한, 후술하는 실시예7에 나타내는 바와 같이, 크론병 환자에게는 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체가 특이적으로 존재하고 있다.

따라서, 본 발명의 크론병의 검사 방법으로서, 피험자의 생체 시료를 대상으로 하여, 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 들 수 있다. 한편, 여기서 쌀 알레르겐 단백질로서는, α-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(α-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 것을 들 수 있고, 구체적으로는 쌀 알레르겐(Rice allergen, 158 aa), 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5, 157 aa), 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice allergen RA5B precursor, 160 aa), 쌀 종자 알레르겐 RA14(Rice seed allergen RA14, 165 aa), 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor, 166 aa) 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2, 166 aa)을 예시할 수 있다. 상기의 검출 대상으로 하는 항체는, 바람직하게는 이들 각종 쌀 알레르겐 단백질의 95∼110 위치의 아미노산 영역에 위치하는 적어도 L(또는 V)GGIYREL의 아미노산 배열을 인식하는 항체이다.

이들 항체의 검출은, 항원-항체 반응을 이용한 종래 공지의 면역학적 측정 방법을 이용해서 행할 수 있다. 구체적으로는 크론병의 감염이 의심되는 피험자로부터, 상기 각종 생체 시료, 바람직하게는 혈청을 채취하고, 그 생체 시료와 상기 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질을 반응시켜서, 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출함으로써 실시할 수 있다.

여기서 상기 인간 핵내 단백질을 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질로서는, 상기 쌀 알레르겐 단백질의 유전자 군(α-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 단백질을 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 각종 쌀 알레르겐 단백질의 95∼110 위치의 아미노산 영역에 위치하는 적어도 L(또는 V)GGIYREL의 아미노산 배열(배열번호 49, 50)을 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것이다.

이러한 성질을 가지는 것으로서, 구체적으로는 L(V)GGIYXD(E)L(X는, 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물을 들 수 있다. 여기서 동등물에는, 상기 L(V)GGIYXD(E)L(X는, 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 부가되어 이루어진 펩티드이며, 또한 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것이 포함된다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들면 배열번호 4 및 33∼48의 각각에 따른 아미노산 배열을 가진 펩티드(CD4 펩티드, CDP-4 펩티드, CDP4-1 펩티드, CDP4-2 펩티드, CDP4-3 펩티드, CDP4-4 펩티드, CDP4-10 펩티드, CDP4-13 펩티드, CDP4-14 펩티드, TO3965 펩티드, 쌀 알레르겐, 쌀 종자 알레르겐 RA5, 쌀 알레르겐 RA5B 전구체, 쌀 종자 알레르겐 RA14, 쌀 알레르겐 RA14B 전구체 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2)을 들 수 있다. 또한, 이러한 것에 한정되지 않고, L(V)GGIYXD(E)L(X는, 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열을 가지는 아미노산의 수가 8∼166개, 바람직하게는 아미노산의 수가 8∼14개인 폴리 펩티드를 이용할 수도 있다.

또한, 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체에 결합성을 가지는 항원 물질로서, 상기의 L(V)GGIYXD(E)L(X는, 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 복수개 포함하는 분지상 다항원성 펩티드를 이용할 수도 있다.

이러한 항원 물질과 크론병 환자에 있어서의 특유한 항체와의 반응에 의해 생성되는 항원-항체 복합물을 검출하는 방법에 관해서는, 특별히 제한되는 것은 아니고, 관용의 방법을 널리 이용할 수 있다. 구체적으로는, 항원 물질로서 상기의 각종 CD 결합성 펩티드, 또는 그것을 포함하는 분지상 다항원성 펩티드를 이용하는 각종의 면역 측정법을 적절하게 예시할 수 있다. 예를 들면, 인간 혈청을 피험 시료로 하는 고상화 샌드위치법을 예로 하면, 목적 항체는, 예를 들면 이하의 방법으로 측정할 수 있다.

우선, 항원 물질로서 이용하는 상기 펩티드를 고상화시켜 두고(이하, 이것을 편의상 「고상화 펩티드」라 함), 이에 피험 시료로서의 생체 시료(예를 들면, 혈청 검체)를 첨가한다. 그 결과, 고상화 펩티드와 피험 시료 중의 크론병 환자 특유의 항체와의 사이에서 항원-항체 반응이 일어나고, 피험 시료 중에 존재하는 목적 항체는 고상화 펩티드에 결합된다. 이어서 결합된 목적 항체의 유무 및 그 항체량(역량)을 인간 항체(IgG)검출 시약을 이용하여 검출함으로써, 피험 시료 중, 즉 피험자의 생체 시료(혈청 등) 중에 존재하는 목적 항체를 검출하여 정량할 수 있다.

또한, 상기에 있어서, 인간 항체(IgG)검출 시약을 미리 고상화하고, 이에 피험 시료를 첨가해서 생체 시료 중의 목적 항체를 포착시키고, 이어서 이것에 상기 항원 물질을 첨가하여, 목적 항체에 결합시킴으로써, 피험 시료 중에 존재하는 목적으로 하는 크론병 환자 특유의 항체를 검출하고, 그 항체량(역량)을 측정할 수도 있다. 또한, 목적 항체에 결합한 항원 물질에 더욱 상기 항원 물질의 특이 항체를결합시킴으로써, 상기 특이 항체를 지표로 하여 크론병 환자 특유의 항체를 검출할 수 있고, 그 항체량(역량)을 측정할 수도 있다. 이러한 측정법에 있어서의 각종 수단의 선택이나 그들의 변형 등은 모두 당업자가 잘 아는 바이며, 본 발명에 있어서 그들 각 수법을 모두 채용할 수 있다[「임상검사법제요」, 카네하라출판, 1995년 등 참조].

여기서, 크론병 항체를 검출하기 위한 인간 항체(IgG)검출 시약은, 특별히 제한되는 것이 아니라 일반적으로 사용되고 있는 각종 시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, 바람직하게는 인간IgG에 특이적으로 결합하는 항 인간IgG 항체 등을 사용할 수 있다. 이들은 시판품으로부터 입수할 수 있지만, 통상의 방법에 따라서 조제할 수도 있다.

또한, 이들의 인간 항체(IgG) 검출 시약을 지표로 하여 목적으로 하는 항체를 검출할 경우에는, 상기 인간 항체(IgG) 검출 시약은 표지되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 표지에 이용되는 표지 물질로서는, 구체적으로는³H나¹⁴C 등의 방사성 동위원소, 알카리포스파타아제나 퍼옥시다아제(POX) 등의 효소, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)나 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 및 기타 1N-(2,2,6,6-테트라메틸-1-옥실-4-피페리딜)-5N-(아스팔테이트)-2,4-디니트로벤젠(TOPA), 염료 졸, 금속 졸, 라텍스 입자 등이 예시된다. 한편, 이들 표지 물질로 표지된 검출 시약을 이용한 면역 측정법은, 각각 방사 면역 측정법(radioimmunoassay), 효소 면역 측정법(enzyme immunoassay), 형광 물질 면역 측정법(fluoroimmunoassay), 스핀 면역 측정법(spin immunoassay), 플로우-스루 면역 측정법(flow-through immunoassay) 및 이뮤노크로마토엣세이(immunochromatoassay)라 칭한다.

본 발명에 있어서는, 간편성, 안전성, 감도 등의 관점에서, 바람직하게는 효소를 표지 물질로서 이용하는 효소 면역 측정법이 이용된다. 효소 표지를 위한 효소 표지 물질로서는, 예를 들면, 상기에 더해서, 마이크로퍼옥시다아제, 키모트립시노겐, 프로카르복시펩티다아제, 글리세르알데히드-3-인산탈수 효소, 아밀라아제, 포스포릴라아제, D-나아제 및 P-나아제 등을 예시할 수 있다. 한편, 이들 표지 물질에 의한 표지 방법은, 자체 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다(「단클론 항체」이와사키타쯔오 외 저, 고단샤 사이언티픽, 1984; 「효소면역 측정법」 제2판, 이시카와 에이지 외 저, 의학서원, 1982년 등).

또한, 항원 물질(CD 결합성 펩티드 또는 그것의 아미노산 배열을 포함하는 분지상 다항원성 펩티드)을 지표로 하여 목적 항체를 검출하여 측정하는 경우에는, 항원 물질로서 표지된 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 항원 물질의 표지도, 상기 항 인간IgG 항체의 표지와 같이, 통상의 방법에 따라서 임의의 표지 물질을 이용하여 행할 수 있다.

또한, 상기 측정 방법에 있어서, 고상법을 이용하는 경우, 목적 항체를 포착하기 위한 목적으로 미리 항원 물질 또는 항 인간IgG 항체를 지지체(고체상)에 고정화하여 이용해도 좋다. 여기서 지지체로서는 불용성, 불활성 담체이면 특별히 제한되지 않으며, 통상 사용되는 것이 널리 이용된다. 예를 들면, 유리, 셀룰로오스 분말, 세파덱스, 세파로오스, 폴리스티렌, 여과지, 카르복시메틸셀룰로오스, 이온교환 수지, 덱스트란, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 나일론, 유리 비즈, 비단, 폴리아민-메틸비닐에테르 말레인산공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레인산 공중합체 등의 여러가지 소재로 이루어진 스틱, 비즈, 마이크로 플레이트, 시험관 등을 널리 이용할 수 있다.

항원 물질 또는 항 인간IgG 항체의 고체상으로의 고정화 방법에 대해서도 특별한 제한은 없고, 물리적 결합 및 화학적 결합 어느 쪽도 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 공유 결합법으로서 디아조법, 펩티드법(산 아미드 유도체, 카르복실클로라이드 수지법, 카르보디이미드 수지법, 무수 말레인산 유도체법, 이소시아네이트 유도체법, 브롬화시안 활성화 다당체법, 셀룰로오스 카르보네이트 유도체법, 축합 시약을 사용하는 방법 등), 알킬화법, 가교 시약에 의한 담체 결합법(가교 시약으로서 글루타르알데히드, 헥사메틸렌 이소시아네이트 등을 이용), Ugi 반응에 의한 담체 결합법 등의 화학적 반응; 또는 이온 교환 수지와 같은 담체를 이용한 이온 결합법; 유리 비즈 등의 다공성 유리를 담체로서 이용하는 물리적 흡착법 등을 예시할 수 있다.

상기의 측정계에 사용되는 용매로서는 반응에 악영향을 주지 않는 것이면, 일반적으로 사용되는 어느 것도 이용할 수 있다. 구체적으로는 구연산 완충액, 인산 완충액, 트리스염산 완충액, 아세트산 완충액 등의 pH가 약 5∼9정도의 완충액이 예시된다.

면역 반응(항원-항체 반응)의 조건도 특별한 제한은 없고, 일반적으로 이러한 종류의 측정법에서 이용되는 통상의 조건이 채용된다. 일반적으로는 45℃ 이하, 바람직하게는 약 4∼40℃ 정도의 온도 조건하에 1∼40시간 정도를 소요하여 반응을 수행할 수 있다. 항원-항체 반응에 의해 생성되는 항원-항체 복합물의 측정은 사용하는 표지 물질의 종류에 따라 관용의 방법으로 수행할 수 있다.

예를 들면, 표지 물질로서 효소를 이용하는 경우, 상기 효소의 활성을 측정 함으로써 수행할 수 있다. 효소 활성의 측정은 사용하는 효소의 종류에 따라 공지의 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들면, 표지 효소로서 퍼옥시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 ABTSJ 2,2'-아지노비스(3'에틸벤조티아졸린술폰산)을 이용하고, 또한 알칼리포스파타제를 이용하는 경우에는 기질로서 p-니트로페닐포스페이트를 이용하여 각각 배양하고, 각 기질의 분해를 분광 광도계 등을 이용하여 측정하는 방법 등을 들 수 있다(「효소 면역 측정법」 제2판, 이시카와 에지 외 저, 의학서원, 1982년 등 참고). 또한, 상기 효소 표지 대신에 방사성 동위 원소나 형광물질에 의한 표지체를 이용하는 경우에도 자체 공지의 방법에 따라 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위하여 실시예를 든다. 그러나 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예1크론병 항체 결합성 펩티드의 선별 및 동정

(1) 파지 디스플레이 라이브러리의 조제

프랑코 씨 등에 의해 보고된 방법(Franco Felici., et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310(1991))에 약간의 변경을 가하여, 파지 디스플레이 라이브러리를 제작했다(1.0×10E8 클론). 상기 파지 디스플레이 라이브러리는 구체적으로는 NNK(N은 A, C, G, T 중 어느 것을 나타내고, K는 G 또는 T를 나타냄)가 9회 반복된 배열을 포함하는 DNA가 유전자 공학적으로 삽입된 섬유상 파지로서, 또한 주요 캡시드 단백질 pVⅢ 유전자의 N 말단 부분에 9 잔기의 랜덤한 아미노산으로 이루어진 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입되어서 파지 캡시드의 표면에 랜덤한 9 잔기의 아미노산 배열을 갖는 펩티드를 발현하도록 구축된 것이다.

(2) 크론병 항체 결합성 펩티드(CD 결합성 펩티드)의 선택

(i) 혈청 항체의 고정화

항체로서 혈청 항체를 이용했다. 혈청으로서 크론병 환자의 혈청 20검체 및 대조 혈청 검체로서 궤양성 대장염 환자의 혈청 20검체 및 건강한 사람의 혈청 20검체를 이용했다.

다음과 같이 하여 혈청 중의 항체(IgG)를 마그네틱 비즈에 고정시켰다. 먼저, 마그네틱 비즈(Dynabeads M-450 Tosyl-activated)에 0.1M 붕산 완충액으로 200㎍/ml 농도로 조제한 항 인간IgG (Fc) 특이적 항체(Biodesign)를 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응 후, 상기 마그네틱 비즈를 0.1％의 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 (D)-PBS(둘베코(Dulbecco's)식 인산 완충액)로 세정하고, 0.1%의 BSA를 함유하는 0.2M 트리스(2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올) (Tris-HCl)를 이용하여 블록킹을 행한 후, 0.1％의 BSA를 함유하는 (D)-PBS를 이용하여 블록킹을 행하여, 항 인간IgG(Fc) 특이 항체 고상화 마그네틱 비즈를 제조했다.

다음으로 상기 항 인간IgG(Fc) 특이 항체 고상화 마그네틱 비즈에, 크론병 환자의 혈청 20검체에서 랜덤으로 선택한 3인의 혈청 샘플 2종류(CDG1 및 CDG2) 및 건강한 사람의 혈청 20검체에서 랜덤으로 선택한 5인의 혈청 샘플을 각각 첨가하고, 하룻밤 반응시켜서 항 인간IgG(Fc) 특이 항체를 통하여 표면에 각 혈청 IgG(건강한 사람의 혈청 IgG 또는 크론병 환자의 혈청 IgG)을 고정화한 마그네틱 비즈를 제작했다.

(ii) CD 결합성 펩티드 디스플레이 파지의 선별(바이오 패닝)

건강한 사람의 혈청 IgG을 고정화한 마그네틱 비즈에, 약 1×10¹¹의 파지 라이브러리(M13 파지의 pVⅢ 영역에 랜덤 9 아미노산을 디스플레이한 라이브러리)를첨가해서 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, 결합되지 않은 파지를 크론병 환자의 혈청 IgG을 고정화한 마그네틱 비즈에 첨가하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응 후, 비즈를 0.1％ BSA를 포함하는 (D)-PBS를 이용하여 세정하고, 용출 완충액(1mg/ml의 BSA를 함유하는 0.1M 염산을 글리신으로 pH 2.2로 조정)을 이용하여, 비즈에 결합된 파지를 용출했다. 수득한 용출 파지를 1M 트리스를 이용하여 중화하고, 중화된 파지를 대장균 JM109에 감염시켜, 이를 150㎍/ml 앰피실린 및 1% 글루코오스를 포함하는 LB 한천배지에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, 증식한 배지 상의 대장균을 전부 긁어모아, 헬퍼 파지(helper phage, Ml3KO7)를 감염시켜, IPTG(이소프로필-β-D(-)－티오갈락토피라노시드) 및 가나마이신을 첨가한 후, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 배양액을 원심 분리하여 불용물을 제거하고, 이 중에 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 염화나트륨 용액을 첨가하고, 수차례 교반한 후, 다시 원심 분리하여 펠렛을 회수하고, 0.02% 아지드화 나트륨(sodium azide)을 포함하는 (D)-PBS로 용해하고, 농축 파지 용액을 수득하였다.

이렇게 해서 수득한 파지 용액을 이용하여 상기와 같은 바이오 패닝을 2회 더 반복했다. 3번째의 바이오 패닝에서 수득한 파지 용액을 대장균 JM109에 감염시켜, 이를 150㎍/ml 앰피실린 및 1% 글루코오스를 포함하는 LB 한천배지에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 배지 상에 형성된 단 콜로니(haploid colonies)의 대장균을 긁어모아, 150㎍/ml의 앰피실린을 포함하는 LB 액체배지를 이용하여 37℃에서 3시간 진탕 배양한 후, 헬퍼 파지(Ml3KO7)를 감염시켜, IPTG 및 카나마이신을 첨가한 후, 37℃에서 하룻밤 배양했다.

이상과 같이 하여 CD 결합성 펩티드 디스플레이 파지를 단클론화했다.

(iii) 파지 ELISA

상기에서 단클론화한 CD 결합성 펩티드 디스플레이 파지에 대해서, 상기의 바이오 패닝에서 이용한 건강한 사람의 혈청 풀(serum pool) 및 크론병 환자 혈청 풀((i)참조)을 이용하여 파지 ELISA를 행하였다.

ELISA에 있어서, 우선 항 파지 항체(Pharmacia사 제)를 96-구멍판(96-well microtiter plate)에 고정화시켰다. 상기 고정화는 구체적으로는, (D)-PBS로 1㎍/ml 농도로 조제한 항 파지 항체(Pharmacia사 제) 용액 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 세정하고, 300㎕의 블록킹 용액(1％BSA, 5% 소르비톨을 포함하는 (D)-PBS)을 첨가하여 4℃에서 하룻밤 정치하는 것으로 행하였다.

1차 반응은 파지 ELISA 완충액(1％ BSA, 0.05％ Tween 20, 10％ 정상 염소(goat) 혈청을 포함하는 (D)-PBS) 90㎕에 상기(ii)에서 조제한 파지 배양액을 10㎕ 첨가하고, 그것을 상기 항 파지 항체를 고정화시킨 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 반응시키는 것으로 행하였다. 1차 반응 종료 후, 4회 세정하고, ２차반응을 행하였다. ２차 반응은 파지 ELISA 완충액 100㎕에 혈청 1㎕(건강한 사람 혈청 또는 크론병 환자 혈청)을 첨가하고, 그것을 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 반응시키는 것으로 행하였다. 이어서 ２차 반응 종료 후, 4회 세정하고, ３차 반응을 행하였다. ３차 반응은 파지 ELISA 완충액으로 40,000배 희석한 HRP(horseradish peroxidase) 표지 항 인간IgG(Fc) 특이적 항체(20ng/ml) 100㎕를 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 반응시키는 것으로 행하였다. ３차 반응 종료후, 세정하고, 발색 반응을 행하였다. 발색은 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액을 첨가하여, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 정지액(1N 황산)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응을 정지시킨 플레이트를 플레이트 리더(plate reader)로 흡광도(OD450nm)를 측정하고, 혈청 항체와의 반응성을 조사했다.

상기 결과를 기초로 하여, 건강한 사람의 혈청 항체와는 반응하지 않고 크론병 환자의 혈청 항체에만 반응성을 나타내는 파지 클론을 선택했다. 이어서, 선택한 파지 클론에 대해서, 상기 방법과 동일하게 하여 크론병 환자 혈청 20검체, 궤양성 대장염 환자 혈청 20검체 및 건강한 사람의 혈청 20검체 각각에 대하여 ELISA를 수행하고, 그 반응성으로부터 크론병 환자 혈청에 특이성이 높은 5개의 크론(CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5)을 선택했다. 선택한 5개의 크론에 대해서 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)에 대한 반응성(ELISA)을 측정하여, 본 결과를 도1에 도시한다.

(3) CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열의 결정

상기 각 파지 ELISA로 선택한 5개의 크론(CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5)의 아미노산 배열의 결정을 행하였다. 먼저, 상기에서 선택한 파지 클론으로부터 DNA를 추출했다. 구체적으로는, 파지 크론을 대장균 JM109에 감염시켜, 앰피실린을 포함하는 LB 한천배지에 도포하고, 하룻밤 배양하여 배지 상에 형성된 콜로니를 긁어 모아, 2ml의 앰피실린 포함하는 LB 액체배지에서 하룻밤 진탕 배양하고, 키아프레프 DNA 추출 키트(Qiaprep DNA extraction kit, Qiagen사 제)를 이용해서 플라스미드 DNA를 추출했다.

파지 DNA의 염기 배열의 결정은 디데옥시법(Proc. Natl. Acad. Sci., USA.,74, 5463-5467(1977))으로 아멀샴사 제의 싸이클 서열 분석 키트(Amersham's Cycle Sequencing Kit, Amersham Pharmacia Biotech, Code; 2438)를 이용하여, 키트의 사용 설명서에 따라 실시했다. DNA 배열은 팔마시아사 제의 DNA 서열 분석기(Pharmacia's DNA sequencer, ALF DNA Sequencer)를 이용하여 서열 분석을 행하였다.

수득한 염기 배열로부터 결정된 각 크론(CD-1, CD-2, CD-3, CD-4, CD-5)의 아미노산 배열을 1문자 표기하여 표5에 나타낸다.

상기 표 중에서, 각 펩티드의 N 말단 및 C 말단 영역에 위치하는 각각의 AEGEL 및 ADPA 또는 GDPA는 파지 벡터의 랜덤 펩티드의 양 말단에 위치하는 아미노산 배열에서 유래한 것이다.

CD-5 크론을 제외한 CD-1, CD-2, CD-3 및 CD-4 크론에 대해서, 상기 파지 벡터 유래의 아미노산 배열을 포함하는 18 아미노산을 분지상 다항원성 펩티드(MAP 펩티드)의 형태로 합성하고, 이하의 실험에 사용했다. 구체적으로는 시판의 Fmoc8-Lys4-Lys-2-βAla-Alko(와타나베 카가쿠 코교 사 제)를 이용하여 하기의 아미노산 배열을 가지는 펩티드를 펩티드 ATC-357 펩티드 합성 장치(peptide synthesizer, Advanced ChemTech사 제)로 합성했다.

CDP-1: AEGELGLLAQQMDYADPA (배열번호 6)

CDP-2: AEGELYRWLPPSSAGDPA (배열번호 15)

CDP-3: AEGELRQSDGQYQMGDPA (배열번호 20)

CDP-4: AEGELGGIYQDLVSGDPA (배열번호 33)

본 합성법에 의해, 각 분지상 다항원성 펩티드(MAP 펩티드)는 1분자 중에 CD 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 분지상으로 8개 소유하게 된다(도2).

실시예 2CD 결합성 펩티드의 혈청 검체에 대한 반응성

(1) 각각의 분지상 다항원성 펩티드(MAP 펩티드)를 항원으로 한 ELISA

실시예1에서 수득한 각 MAP 펩티드(CDP-1, CDP-2, CDP-3 및 CDP-4의 MAP 펩티드: 도3 참조)를 항원 펩티드로 이용하여, ELISA로 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람의 혈청)에 대한 반응성을 조사했다.

먼저, 각 MAP 펩티드를 96-구멍판에 고정화시켰다. 구체적으로는, 고정화는 각 MAP 펩티드를 바이칼보네이트 완충액(50ｍＭ, pH 9.6)으로 1㎍/ml 농도로 조제하여 MAP용액을 조제하고, 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하여, 4℃에서 하룻밤정치한 후 세정하고, 300㎕의 카제인 용액(0.1％ 카제인 및 1% TritonX-lOO을 포함하는 (D)-PBS)을 첨가하여 다시 4℃에서 하룻밤 정치하는 것으로 행하였다.

(i) 각 MAP 펩티드를 고정화한 MAP 플레이트를 이용하여 크론병 환자 혈청 20검체, 궤양성 대장염 환자 혈청 20검체 및 건강한 사람의 혈청 48검체의 각 MAP 펩티드에 대한 반응성을 ELISA로 확인했다.

구체적으로는, 먼저 1차 반응으로서 카제인 용액 100㎕에 혈청 항체 1㎕를 첨가한 총량을 MAP 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 그것을 37℃에서 1시간 반응시켰다. 1차 반응 종료 후, 4회 세정하고, 이 웰 중에 카제인 용액으로 20,000배 희석한 HRP 표지 항 인간IgG(Fc) 특이적 항체를 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켜 ２차 반응을 수행했다. ２차 반응 종료 후, 4회 세정하고 발색 반응을 행하였다. 검출은, lOO㎕의 TMB 용액을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, lOO㎕의 TMB 정지 용액(1N 황산)을 첨가하는 것에 의해 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 OD450nm의 흡광도를 측정하여, 각 혈청에 대해서 각 MAP 플레이트에 대한 반응성을 조사했다. 결과를 도3에 나타낸다. 도3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 4종류의 MAP 펩티드(CDP-1, CDP-2, CDP-3 및 CDP-4의 MAP 펩티드)는 모두 궤양성 대장염 환자의 혈청이나 건강한 사람의 혈청과는 대부분 반응하지 않고, 크론병 환자의 혈청에 대하여 2∼4할의 비율로 반응성을 나타냈다. 또한, 도3으로부터 알 수 있는 바와 같이 각 MAP 펩티드들의 크론병 환자의 혈청에 대한 반응성은 각 MAP 펩티드들 간에 서로 각각 다르며, 공통성은 인정되지 않았다. 이러한 점에서 이러한 4종류의 펩티드는 크론병 환자에 특이적으로 반응하는 각각 다른 유형의 펩티드로 판단되었다.

(ii) 다음으로 다수의 혈청 검체(크론병 환자 혈청 96검체, 궤양성 대장염 환자 혈청 20검체 및 건강한 사람 혈청 48검체)을 이용하여, 상기 각 MAP 펩티드(CDP-1, CDP- 2, CDP-3 및 CDP-4의 MAP 펩티드)의 반응성을 상기(i)의 방법과 동일하게 행하여 조사하고, 크론병 환자 혈청에 대한 상기 펩티드의 특이성을 평가했다. 결과를 표6에 나타낸다.

표6에 나타낸 바와 같이, 건강한 사람의 혈청 48검체의 평균OD값 + 5SD를 컷오프값이라고 했을 경우, 크론병 환자 혈청 96검체에 대한 양성율은 CDP-1 펩티드가 31.3%, CDP-2 펩티드가 27.1%, CDP-3 펩티드가 51.0% 및 CDP-4 펩티드가 31.3%이었다. 또한, 건강한 사람 및 궤양성 대장염 환자의 혈청에 대한 위양성율은 어느 쪽의 펩티드도 5% 이하였다. 이로부터 이들의 각 펩티드(CDP-1 펩티드, CDP-2 펩티드, CDP-3 펩티드 및 CDP-4 펩티드)는 크론병 환자가 갖는 특유한 항체(크론병 항체)에 특이적으로 결합하고, 이것을 이용함으로써 크론병의 감염 유무를 정밀하게 진단할 수 있을 것으로 생각된다.

(2) 혼합 MAP 펩티드를 항원으로 한 ELISA

실시예1에서 조제한 MAP 펩티드(CDP-1, CDP-2, CDP-3 및 CDP-4의 MAP 펩티드)를 혼합하여 혼합 MAP 펩티드를 조제하고, 이를 항원으로 이용하여, ELISA에 의해 다종류의 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청, 십이지장 궤양 환자 혈청, 위궤양 환자 혈청 및 건강한 사람 혈청)에 대한 반응성을 조사했다.

한편, 검출에 사용하는 항원 플레이트는 CDP-1의 MAP 펩티드 및 CDP-4의 MAP 펩티드가 각각 1.5㎍/ml, CDP-2의 MAP 펩티드 및 CDP-3의 MAP 펩티드가 각각 3㎍/ml이 되도록 조제하고, 이들을 등량 혼합한 것을 (1)에 따른 MAP 플레이트의 조제와 동일하게 하여 96-구멍판에 고정화시켜 조제했다.

(i) 상기 혼합 항원 플레이트를 이용하여 크론병 환자 혈청 550검체, 궤양성 대장염 환자 혈청 20검체, 건강한 사람 혈청 120검체, 십이지장 궤양 환자 혈청 25검체 및 위궤양 환자 혈청 15검체에 대해서 혼합 MAP 펩티드에 대한 반응성을 ELISA에 의해 확인했다. 한편, ELISA는 ２차 반응에 사용하는 HRP 표지 항 인간IgG(Fc) 특이적 항체로서, 카제인 용액(0.1％ 카제인 및 1% TritonX-lO0을 포함하는 (D)-PBS)으로 10,000배 희석한 것을 사용하는 것 이외에는, 상기 (1)의 (i)에 따른 방법과 동일하게 행하였다. 결과를 도4 및 표7에 나타낸다.

도4 및 표7로부터 알 수 있는 바와 같이, 건강한 사람의 혈청 120검체의 평균 단위값 + 3SD를 컷오프값으로 했을 경우, 크론병 환자 혈청에 대한 양성율은 67.1%(369/550)이며, 위양성율은 궤양성 대장염 환자의 혈청에 대해서 5%(1/20), 건강한 사람 혈청에 대해서 1.7%(2/120), 십이지장 궤양 환자 혈청 및 위궤양 환자 혈청에 대해서는 0%(O/25, 0/15)였다.

이 결과와 (1)의 결과를 비교하는 것에 의해, 각 크론병 항체 결합성 펩티드(CDP-1 펩티드, CDP-2 펩티드, CDP-3 펩티드 및 CDP-4 펩티드)를 단독으로 사용하는 것 보다, 이들을 조합하여 이용하는 것이 크론병 특유의 항체에 대한 특이성을 향상시키고, 크론병의 감염의 유무를 높은 정밀도로 진단할 수 있도록 한다고 생각된다.

(3) 혼합 MAP 펩티드와 빵효모를 항원으로 한 ELISA와의 비교

상기 (2)와 동일하게 하여, 실시예1에서 조제한 MAP 펩티드(CDP-1, CDP-2, CDP-3 및 CDP-4의 MAP 펩티드)을 혼합해서 이를 항원으로서 이용하고, ELISA에 의해 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람 혈청)에 대한 반응성을 조사했다. 또한, 크론병과의 관련이 지적되는 빵효모(Saccharomyces cerevisiae)(Gut 1998, 42, pp. 788-791, Gastroenterology 1999, 116, pp.1001-1003, Am J Gastroenterol 2001, 96 pp.730-734)에 대해서도 마찬가지로, 상기 각 혈청 검체에 대한 반응성을 조사하고, 양자의 크론병 진단에 있어서의 유용성을 비교했다. 한편, 항원 플레이트로 사용하는 혼합 MAP 플레이트는, CDP-1의 MAP 펩티드 및 CDP-4의 MAP 펩티드가 각각 1.5㎍/ml, CDP-2의 MAP 펩티드 및 CDP-3의 MAP 펩티드가 각각 3㎍/ml이 되도록 조제하고, 이들을 등량 혼합한 것을 (1)에 따른 MAP 플레이트의 조제와 동일하게 하여 96-구멍판에 고정화시킴으로써 조제했다. 또한, 빵효모에 대한 반응성은 시판의 측정 키트인 항-빵효모 항체 검출 키트(Anti-Saccharomyces cerevisiaeantibodies detection kits(ASCA) IgG 검출 키트 및 ASCA IgA 검출 키트, 사용 항원: 빵효모 세포막의 글리코만난, Medizyme사 제)를 이용하여 측정했다.

(i) 혼합 MAP 플레이트를 이용하여 크론병 환자 혈청 96예, 궤양성 대장염 환자 혈청 20예 및 건강한 사람 혈청 48예에 대해서 혼합 MAP에 대한 반응성을 ELISA에 의해 확인했다. 한편, ELISA는 상기(2)의 (i)에 따른 방법과 동일하게 수행했다.

(ii) 또한, 빵효모에 대한 반응성은 측정 키트의 조작 설명서에 따라 행하였다. 결과를 도5에 나타낸다. 도5A에 나타낸 바와 같이, 항원으로서 혼합 MAP 펩티드를 이용한 ELISA에서는 건강한 사람의 혈청 48검체의 평균 단위값 + 3SD를 컷오프 값으로 하고, 도5B 및 도5C에 나타낸 바와 같이, 항원으로서 ASCA IgG 및 ASCA IgA의 측정 키트를 이용한 ELISA에서는 조작 설명서에 따라 결합 인덱스(binding index)=1.0을 컷오프 값으로 하여 양성율과 위양성율을 산출했다. 양성율과 위양성율의 결과를 표8에 나타낸다.

이들 결과로부터, 각각의 MAP 펩티드를 조합하여 혼합 MAP 펩티드로 이용함으로써, 크론병 항체의 인식 항원으로서 지적되는 빵효모보다도 크론병 항체가 특이적으로 인식할 수 있고, 높은 정밀도로 크론병의 감염의 유무를 검출할 수 있다고 생각된다.

실시예 3CD 결합성 펩티드의 상동성 해석

수득한 MAP 펩티드(CDP-1∼CDP-4의 MAP 펩티드)에 대해서, 크론병과의 관련성이 보고된 단백[CDX(홍역 관련 항원, measles related antigen)<Gut 2000 Feb; 46(2): 163-9>, 돼지 췌장 α-아밀라아제<Annual report of the research committee of inflammatory bowel disease. Japan: The ministry of health and welfare of Japan, 1999: 98-100>,M. paratuberculosisHSP65(horseradish peroxidase 65)<Clin Diagn Lab Immunol. 1995 Nov; 2(6): 657-64>, 인간 HSP60<Digestion. 1997; 58(5): 469-75>,M. paratuberculosisp36<Curr Microbiol. 1999 Aug; 39(2): 115-9>]과의 아미노산 배열에 있어서의 상동성을 DNASIS 소프트(히타치 제작소)를 이용하여 해석했다. 결과를 도6에 나타낸다. 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 각각의 단백에 있어서 약한 상동성이 인정되었으나, 그다지 높은 상동성은 인정되지 않았다.

다음으로, 이들의 아미노산 배열에 대해서, FASTA 프로그램(Genome Net 사이트 사용)을 이용하여, 크론병 항체 결합성 펩티드와 아미노산 배열에 있어서 상동성을 갖는 단백을 단백 데이터 베이스에서 검색했다. 검색은 Z-score가 130 이상인, 상동성이 높은 단백만이 추출되도록 행하였다. 결과를 도7에 나타낸다. 도7로부터 알 수 있는 바와 같이, CD1 펩티드, CD3 펩티드 및 CD4 펩티드에 관해서는 크론병과의 관련이 보고되는 효모나 마이코박테리움(mycobacterium)의 단백 뿐만 아니라, 크론병과의 관련성이 인정되지 않은 병원성 미생물이나 음식물(Zea myze 등)의 단백 등, 세균, 동물 및 식물 등의 대부분의 종류에 걸쳐 상동성을 갖는 단백을 볼 수 있었다.

실시예 4

실시예1에 있어서, 파지 ELISA로 수득한 각종 혈청에 대한 반응성(도1) 및 아미노산 배열의 유사성(표2)으로부터, CD-1 및 CD-5 크론의 아미노산 배열을 갖는 각각의 펩티드(CDP-1 펩티드(배열번호 6) 및 CDP-5 펩티드(배열번호 9))는 동일 항체를 인식하는 것으로 생각된다. 또한, 상기 CDP-1 펩티드와 CDP-5 펩티드는 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase(V-ATPase)의 서브 유닛 E의 199-212 영역에 위치하는 펩티드(VATE-201펩티드: 배열번호 11)와 아미노산 배열 상의 상동성을 갖는다(도8).

따라서, 하기에 나타낸 펩티드(CDP-1a 펩티드, CDP-5a 펩티드, VATE-201 펩티드)를 상기 실시예1의 (3)에 따른 방법과 동일하게 하여 MAP의 형태로 합성하고(도9), 실시예2의 (1) 방법에 따라, 각 MAP 펩티드의 각 혈청 검체(크론병 환자 혈청, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람 혈청)에 대한 반응성을 ELISA에 의해 조사했다.

CDP-1a : AEGELGLLAQQMDYADP （배열번호 5)

CDP-5a : AEGELRLVGQQVMQGDP （배열번호 8)

VATE-210 ： RLDLIAQQMMPEVR (배열번호 11)

혈청 검체로서 크론병 환자의 혈청 20검체 및 비교 혈청 검체로서 궤양성 대장염 환자의 혈청 20검체 및 건강한 사람의 혈청 20검체를 이용했다. 결과를 도10에 나타낸다. 도10으로부터 알 수 있는 바와 같이, CDP-1a 펩티드, CDP-5a 펩티드 및 VATE-201 펩티드는 서로 동일한 ELISA 반응성을 나타냈다.

실시예 5VATE-201 펩티드에 의한 항원-항체 반응의 저해 시험

실시예4에서 수득한 VATE-201의 반응성을 확인하기 위해, VATE-201 펩티드를 이용하여 CDP-1a 펩티드와 크론병 항체의 항원-항체 반응의 저해 시험을 행하였다. 혈청 항체 시료로서, 각 MAP 펩티드(CDP-1a 펩티드, CDP-5a 펩티드, VATE-201 펩티드)에 강한 반응성을 보인 크론병 환자의 혈청 8번, 9번 및 14번(도11 참조)을 이용했다.

구체적으로는, 항원 플레이트로서 CDP-1a의 MAP 펩티드(도10)를 플레이트에 고정화시킨 MAP 플레이트를 이용하여(실시예2의 (1)참조), 이것에 VATE-201의 MAP 펩티드(반응 저해 물질)를 100㎍/mL의 농도로 포함하는 카제인 용액(0.1％ 카제인 및 1% TritonX-lOO을 포함하는 (D)-PBS) 100㎕에 혈청 검체 1㎕을 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 용액의 총량을 첨가하고, 실시예2의 (1)과 동일하게 하여 ELISA를 수행했다. 한편, 비교 실험으로서 상기 반응 저해 물질로서 VATE-201의 MAP 펩티드를 대신해서 CDP-1a의 MAP 펩티드를 이용하여 ELISA를 수행했다. 결과를 도11에 나타낸다.

도11의 Ｂ에 도시한 바와 같이, 반응계에 VATE-201의 MAP 펩티드를 첨가함으로써, CDP-1a의 MAP 플레이트에 대한 크론병 환자의 각 혈청 검체(8번, 9번, 14번)의 반응성이 모두 저해되었다. 또한, 상기 CDP-1a의 MAP 펩티드를 대신해서 CDP-5a의 MAP 펩티드를 이용하여 동일하게 수행한 시험에 있어서도 동일한 결과가 얻어졌다(결과 나타내지 않음).

이상, 실시예4 및 5의 결과로부터 VATE-201 펩티드 및 CDP-1a 펩티드 및 CDP-5a 펩티드는 모두 크론병 환자의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체를 인식하는 것을 알 수 있었다. 또한, VATE-201 펩티드와의 아미노산 배열의 유사성 및 혈청 항체와의 반응성의 공통성으로부터, CDP-1a 펩티드 및 CDP-5a 펩티드를 비롯한 본 발명의 CD1 펩티드 및 그의 동등물은 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase(V-ATPase)의 서브 유닛 E를 모방한 것이라고 생각된다.

즉, 상기 실시예의 결과는 크론병 환자에게는 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase서브 유닛 E에 대한 항체가 특이적으로 존재하는 것을 나타내는 것이다. 이것으로부터 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase, 특히 그 서브 유닛 E를 인식하는 항체를 지표로 함으로써 개개의 피험자에 대해서 크론병의 감염의 유무를 진단할 수 있을 것으로 생각된다.

실시예 6CD3 펩티드 및 그의 동등물의 모방 단백질 탐색 및 그 평가

실시예5의 결과로부터, CD1 펩티드 및 그의 동등물은 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase(V-ATPase)의 서브 유닛 E를 모방한 것임을 알 수 있었다. 따라서, 동일한방법으로 CD3 펩티드 및 그의 동등물의 모방 단백질을 탐색하고, 크론병 항체에 대한 반응성에 대해서 평가했다.

(1) MAP 펩티드의 조제

CDP3 펩티드의 변형물로서 CDP3 펩티드(배열번호 21)의 아미노산 배열을 기본으로 각각 1아미노산 잔기를 알라닌으로 치환한 14종류의 펩티드를 제조했다(표9). 또한, CDP3-1에 대해서는 첫번째의 아미노산이 알라닌이므로 세린으로 치환했다. 다음으로 이들 15종류의 펩티드에 대해서 실시예1의 (3) 방법에 따라 각각 1분자당 8개의 펩티드를 갖는 MAP 펩티드를 제조했다(1 아미노산 치환 MAP 펩티드).

(2) CDP3 에피토프 배열의 결정

CDP 펩티드의 아미노산 배열에 있어서, 크론병 항체와의 특이적 반응성에 필요한 배열을 결정하기 위해, 상기에서 조제한 1 아미노산 치환 MAP 펩티드를 반응 저해 물질로서 이용하여, 하기의 반응 저해 시험을 수행했다. 반응 혈청 항체 시료로서, 실시예2에서 CDP-3 펩티드에 강한 반응성을 나타낸 크론병 환자의 혈청 2번, 7번 및 8번을 이용했다(도3 참조).

구체적으로는, 항원 플레이트로서 CDP3의 MAP 펩티드를 플레이트에 고정화시킨 MAP 플레이트(실시예2의 (1)참조)를 이용해서 3단계의 반응에 따라 행하였다. 1차 반응은 크론병 환자 혈청을, 1 아미노산 치환 MAP을 각각 100㎍/mL 농도로 포함하는 검체 희석액(0.5M 식염, 1.5% 카제인, 2% 정상 염소 혈청, 0.2％ Tween20을 포함하는 0.1M 트리스 완충액)으로 100배 희석한 후, 25℃에서 1시간 반응시키는것으로 행하였다. 2차 반응은 1차 반응액 100㎕을 MAP 플레이트의 웰에 첨가한 후, 25℃에서 1시간 반응시키고, 3회 세정하는 것으로 행하였다. 3차 반응은 효소 표지 항체 희석 용액(0.14M 식염, 0.5％ BSA, 5% 정상 염소 혈청, 0.05％ Tween20을 포함하는 트리스 완충액)으로 5,000배 희석한 HRP 표지 항 인간IgG(Fc) 특이적 항체 100㎕을 상기 플레이트에 첨가하고, 25℃에서 1시간 반응시킨 후, 3회 세정하는 것으로 행하였다. 검출은 실시예2의 (1)에 따라, 1 아미노산 치환 MAP 펩티드에 의한 반응 저해 활성을 측정했다. 결과를 표9에 나타낸다.

이 결과, 크론병 환자 혈청 2번에 있어서, 반응 저해 물질로서 CDP3-7,CDP3-9, CDP3-10, CDP3-11 및 CDP3-13의 각 MAP 펩티드를 이용한 경우, 크론병 환자의 혈청과 CDP3 펩티드와의 반응에 대한 저해 활성이 50% 이하였다. 또한, 크론병 환자 혈청 7번 및 8번에 있어서, 반응 저해 물질로서 CDP3-7, CDP3-9 및 CDP3- 11의 각 MAP 펩티드를 이용한 경우, 크론병 환자 혈청과 CDP3 펩티드와의 반응에 대한 저해 활성이 50% 이하였다. 이상의 결과로부터, CDP3의 아미노산 배열에 있어서 크론병 항체와의 반응(항체 인식)에 필요한 배열은 QXDGQXQ(X는, 동일하거나 상이하며, 임의의 아미노산 잔기)(배열번호 51)인 것으로 판단되었다.

(3) CDP3 펩티드 모방 단백질의 탐색

상기의 판단으로부터, 크론병 항체의 인식에 중요하다고 생각되는 아미노산 배열(QXDGQXQ(X는, 동일하거나 상이하며, 임의의 아미노산))을 이용하여 단백질 데이터 베이스와의 상동성 해석을 수행했다. 그 결과, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300(HZF300))의 129∼135 위치의 아미노산 영역과 상동성이 있음이 확인되었다(도12).

따라서, 인간 핵내 단백질(HZF300)이 CDP3 펩티드의 모방 단백질인 것을 확인하기 위해, 126∼138 위치의 아미노산 영역의 아미노산 배열을 갖는 펩티드(Z300펩티드)를 MAP 펩티드의 형태로 조제하고, 크론병 환자 혈청 20예, 궤양성 대장염 환자 혈청 20예 및 건강한 사람 혈청 20예를 이용하여 MAP 항원 ELISA를 행하였다.

(4) MAP 항원 ELISA

먼저, 인간 혈청을 검체 희석액(상기 언급함)으로 101배 희석하고, 100㎕를 MAP 플레이트의 웰에 첨가한 후, 실시예6의 (2)의 2차 반응 이후의 조작에 준하여측정하여, MAP 펩티드와 각종의 혈청 항체와의 반응성을 조사했다. 결과를 도13에 나타낸다. 그 결과, CDP3 펩티드에 강한 반응성을 나타내는 크론병 환자 혈청 2, 7 및 8번은 Z300 펩티드에 대하여 동일한 반응성을 나타냈다. 한편, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람 혈청에 대하여 Z300 펩티드는 명확한 반응성을 나타내지 않았다.

(5) 항원-항체 반응의 저해 시험

Z300 펩티드의 크론병 항체에 대한 반응성을 확인하기 위해, Z300 펩티드를 이용해서 CDP3 펩티드와 크론병 항체와의 항원-항체 반응의 저해 시험을 수행했다.혈청 항체 시료로서 CDP3 펩티드에 강한 반응성을 나타낸 크론병 환자의 혈청 2번, 7번 및 8번을 이용했다.

구체적으로는, 항원 플레이트로서 CDP3의 MAP 펩티드를 플레이트에 고정화시킨 MAP 플레이트를 이용하고(실시예2의 (1)참조), 이것에 Z300의 MAP 펩티드(반응 저해 물질)를 100㎍/mL의 농도로 포함하는 검체 희석액(상기 언급함) 100㎕에 혈청 검체 1㎕을 첨가하여 25℃에서 1시간 반응시킨 용액의 총량을 첨가하고, 실시예6의 (2)과 동일하게 하여 ELISA를 행하였다. 한편, 비교 실험으로서 상기 반응 저해 물질로서 Z300의 MAP 펩티드를 대신해서 CDP3의 MAP 펩티드를 이용하여 동일하게 ELISA를 행하였다. 결과를 도14에 나타낸다.

도14의 B에 도시한 바와 같이, 반응계에 Z300의 MAP 펩티드를 첨가하는 것에 의해 CDP3의 MAP 플레이트에 대한 크론병 환자의 각 혈청 검체(2번, 7번, 8번)의 반응성이 모두 저해되었다.

상기의 결과로부터, Z300 펩티드 및 CDP3 펩티드는 모두 크론병 환자의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체를 인식함을 알 수 있다. 또한, Z300 펩티드와의 아미노산 배열의 유사성 및 혈청 항체와의 반응성의 공통성으로부터 본 발명의 CD3펩티드 및 그의 동등물은 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)을 모방한 것이라고 생각된다.

즉, 상기 실시예의 결과는, 크론병 환자에게는 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)에 대한 항체가 특이적으로 존재함을 나타내는 것이다. 이것으로부터, 인간 핵내 단백질(Zinc finger protein 300)을 인식하는 항체를 지표로 함으로써, 개개의 피험자에 대해서 크론병의 감염 유무를 진단할 수 있을 것으로 생각된다.

실시예 7CD4 펩티드 및 그의 동등물의 모방 단백질의 탐색 및 그 평가

다음으로, CD4 펩티드 및 그의 동등물의 모방 단백질을 탐색하고, 그것의 크론병 항체에 대한 반응성에 대해서 평가했다.

(1) MAP 펩티드의 조제

CDP4 펩티드의 변형물로서 CDP4 펩티드(배열번호 33)의 아미노산 배열을 기본으로 각각 1 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환한 15종류의 펩티드를 제조했다(표10). 한편, CDP4-1에 대해서는 첫번째의 아미노산이 알라닌이므로, 세린으로 치환했다. 다음으로 이들 14종류의 펩티드에 대해서, 실시예1의 (3) 방법에 따라 각각 1분자당 8개의 펩티드를 갖는 MAP 펩티드를 제조했다(1 아미노산 치환 MAP 펩티드).

(2) CDP4 에피토프 배열의 결정

CDP 펩티드의 아미노산 배열에 있어서, 크론병 항체와의 특이적 반응성에 필요한 배열을 결정하기 위해, 상기에서 제조한 1 아미노산 치환 MAP 펩티드를 반응 저해 물질로서 이용하고, 실시예6의 (2)와 동일하게 하여 반응 저해 시험을 행하였다. 또한, 반응 혈청 항체 시료로서 실시예2에 있어서 CDP-4 펩티드에 강한 반응성을 나타낸 크론병 환자의 혈청 3번, 6번, 15번, 17번 및 20번을 이용했다(도3 참조). 결과를 표10에 나타낸다.

그 결과, 크론병 환자 혈청 3번, 6번, 15번, 17번 및 20번에 있어서, 반응 저해 물질로서 CDP4-7, CDP4-8, CDP4-9 및 CDP8-12의 각 MAP 펩티드를 이용한 경우, 크론병 환자 혈청과 CDP4 펩티드의 반응에 대한 저해 활성이 30% 이하였다. 또한, 크론병 환자 혈청 6번, 15번, 17번 및 20번에 있어서, 반응 저해 물질로서 CDP4-6의 MAP 펩티드를 이용한 경우, 크론병 환자 혈청과 CDP3 펩티드의 반응에 대한 저해 활성이 30% 이하였다. 더욱이 반응 저해 물질로서 CDP4-5 및 CDP4-11의 각 MAP 펩티드를 이용한 경우, 각각 크론병 환자 혈청 6번 및 15번에 있어서, 크론병 환자 혈청과 CDP4 펩티드의 반응에 대한 저해 활성이 30% 이하였다.

이상의 결과로부터, CDP4 펩티드의 아미노산 배열에 있어서 크론병 항체와의 반응(항체 인식)에 필요한 배열은 LGGIYXDL(X는, 임의의 아미노산 잔기)(배열번호 49)임이 판단되었다.

(3) CDP4 펩티드 모방 단백질의 탐색

상기의 판단을 기초로 하여, 크론병 항체의 인식에 중요하다고 생각되는 아미노산 배열(LGGIYXDL(X는, 임의의 아미노산))을 이용하여 단백질 데이터 베이스와의 상동성을 해석하였다. 그 결과, 쌀 알레르겐 단백질과 상동성이 있음이 확인되었다(도15). 도15에 나타낸 바와 같이, 쌀 알레르겐 단백질은 α-아밀라아제/트립신 억제제(α-amylase/trypsin inhibitor)이며, 유전자 군(gene family)을 형성하고 있다. 이러한 서로 높은 상동성을 갖는 α-아밀라아제/트립신 억제제(α-amylase/trypsin inhibitor)는 모두 크론병 항체와의 반응(항체 인식)에 중요하다고 생각되는 아미노산 배열 L(또는 V)GGIYXD(또는 E)L 영역(배열번호 49, 50)을 갖고 있다. 또, L과 V는 지방족 아미노산, D와 E는 산성 아미노산으로서 서로 유사한 아미노산이다.

따라서, 쌀 알레르겐 단백질이 CDP4 펩티드의 모방 단백질임을 확인하기 위해, 쌀 종자 알레르겐 RA14(도16)의 99∼111번째의 아미노산 영역의 아미노산 배열을 갖는 펩티드(TO3965 펩티드)를 MAP 펩티드의 형태로 조제하고, 크론병 환자 혈청 20예, 궤양성 대장염 환자 혈청 20예 및 건강한 사람 혈청 20예를 이용하여 MAP항원 ELISA를 행하였다.

(4) MAP 항원 ELISA

항원 플레이트로서 TO3965의 MAP 펩티드를 고정화시켜 조제한 MAP 항원 플레이트를 이용한 것 이외에는 실시예6의 (4)와 동일하게 하여 MAP 항원 ELISA를 행하였다. 결과를 도17에 나타낸다. 그 결과, CDP4 펩티드에 강한 반응성을 나타내는 크론병 환자 혈청 3, 6, 15, 17 및 20번은 TO3965 펩티드에 대하여도 동일한 반응성을 나타냈다. 한편, TO3965 펩티드는 CDP4 펩티드와 같이, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강한 사람 혈청에 대해서는 명확한 반응성을 나타내지 않았다.

(5) 항원-항체 반응의 저해 시험

TO3965 펩티드의 크론병 항체에 대한 반응성을 확인하기 위해, 실시예6의 (5)과 동일하게 하고, TO3965 펩티드를 이용하여 CDP4 펩티드와 크론병 항체의 항원-항체 반응의 저해 시험을 행하였다. 혈청 항체 시료로서는, CDP4 펩티드에 강한 반응성을 나타낸 크론병 환자의 혈청 3, 6, 15, 17 및 20번을 이용했다. 결과를 도18에 나타낸다.

도18에 도시한 바와 같이, 반응계에 TO3965의 MAP 펩티드를 첨가함으로써, CDP4의 MAP 플레이트에 대한 크론병 환자의 각 혈청 검체(3, 6, 15, 17 및 20번)의 반응성이 모두 저해되었다.

상기의 결과로부터 TO3965 펩티드 및 CDP4 펩티드는 모두 크론병 환자의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체를 인식함을 알 수 있었다. 또한, TO3965 펩티드와의 아미노산 배열의 유사성 및 혈청 항체와의 반응성의 공통성으로부터 본 발명의 CD4 펩티드 및 그의 동등물은 쌀 알레르겐 단백질(α-amylase/trypsin inhibitor gene family)을 모방하는 것이라고 생각된다.

즉, 상기 실시예의 결과는 크론병 환자에게는 쌀 알레르겐 단백질(α-amylase/trypsin inhibitor)에 대한 항체가 특이적으로 존재하고 있음을 나타내는 것이다. 이것으로부터, 쌀 알레르겐 단백질의 유전자 군(α-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)을 인식하는 항체를 지표로 하는 것에 의해, 개개의 피험자에 대해서 크론병의 감염의 유무를 진단할 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명에 의하면, 크론병 환자에 특유하게 존재하는 항체에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공할 수 있다. 이러한 본 발명의 펩티드는 크론병의 검사 시약으로서 유용하며, 이러한 펩티드 및 그것을 포함하는 검사 시약에 의하면, 크론병의 감염의 유무를 정확하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명은, 크론병 환자의 체내에는 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase, 특히 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E를 인식하는 항체, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)을 인식하는 항체, 쌀 알레르겐 단백질의 유전자 군(α-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)을 인식하는 항체가 특이적으로 존재한다는 새로운 사실을 제공한다. 그리고 이러한 사실에 근거하여, 본 발명은, 이들의 적어도 1개의 항체를 지표로 하여, 피험자의 생체 시료 중에서 그것의 존재를 검출하는 것으로 이루어지는 크론병의 검사 방법을 제공하는 것이다. 이러한 방법에 의하면, 개개의 피험자에 대해서, 생체 시료(예를 들면, 혈청 등)를 대상으로 하여 간편하고 또한 정밀하게 크론병의 감염의 유무를 진단할 수 있다.

Claims (38)

1. (a) 배열번호 1∼4로 표시되는 아미노산 배열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 배열로 이루어진 펩티드; 또는

   (b) 상기 (a)에 나타내어진 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드;

   중 어느 하나인 크론병 항체 결합성 펩티드.
2. 제1항에 있어서,

   상기 (b)에 따른 펩티드가, 배열번호 1∼4 또는 배열번호 7로 표시되는 아미노산 배열 중 어느 하나를 일부에 포함하는 펩티드인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
3. 제1항에 있어서,

   배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 5∼14로 표시되는 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
4. 제1항에 있어서,

   배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 10으로 표시되는 아미노산 배열 중에서 적어도 LIAQQM의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 6∼226개의 펩티드인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
5. 제1항에 있어서,

   배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 15∼19로 표시되는 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
6. 제1항에 있어서,

   배열번호 3으로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 20∼32로 표시되는 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
7. 제1항에 있어서,

   배열번호 3으로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가, 적어도 배열번호 51로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 7∼604개의 펩티드인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
8. 제1항에 있어서,

   배열번호 4로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 배열번호 33∼48로 표시되는 어느 하나의 아미노산 배열을 가지는 것인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
9. 제1항에 있어서,

   배열번호 4로 표시되는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드가 적어도 L(V)GGIYXD(E)L(X는, 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 8∼165개의 펩티드인

   크론병 항체 결합성 펩티드.
10. 분지쇄의 아미노산 배열로서,

    (a) 배열번호 1∼4로 표시되는 아미노산 배열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 배열로 이루어진 펩티드; 또는

    (b) 상기 (a)에 나타내어지는 아미노산 배열에서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 결합성을 가지는 펩티드;

    의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드.
11. 제10항에 있어서,

    (i) 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (ii) 배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (iii) 배열번호 3으로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물 및 (iv) 배열번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물 중, 적어도 2개의 군 중에서 선택된 2종 이상의 다른 크론병 항체 결합성 펩티드의 아미노산 배열을 분지쇄에 가지는

    분지상 다항원성 펩티드.
12. 제1항에 따른 크론병 항체 결합성 펩티드;

    제10항에 따른 분지상 다항원성 펩티드; 및

    인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa 서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛의 복합체;

    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개를 유효 성분으로서 함유하는 크론병의 검사 시약.
13. 제12항에 있어서,

    상기의 크론병 항체 결합성 펩티드가, (i) 배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (ii) 배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물, (iii) 배열번호 3으로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물 및 (iv) 배열번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 펩티드 및 그의 동등물 중, 적어도 2개의 군 중에서 선택된 2종 이상의 다른 크론병 항체 결합성 펩티드이며, 상기 분지상 다항원성 펩티드가 제11항에 따른 펩티드인

    크론병의 검사 시약.
14. 제12항에 따른 검사 시약을 크론병 항체 결합용 항원 물질로서 포함하는

    크론병의 검사 시약 키트.
15. 제14항에 있어서,

    항 인간IgG 항체 및 제12항에 따른 검사 시약, 및 필요에 따라서, 검체 희석액, 표지 물질, 지지체(고체상), 항 인간IgG 항체 희석액, 효소 기질액 및 반응 정지액으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개를 함유하는

    크론병의 검사 시약 키트.
16. 피험자의 생체 시료 중에서 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase를 인식하는 항체를 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.
17. 제16항에 있어서,

    상기 항체가 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E를 인식하는 항체인

    크론병의 검사 방법.
18. 제16항에 있어서,

    상기 항체가, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa 서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛의 복합체를 인식하는 항체인

    크론병의 검사 방법.
19. 제16항에 있어서,

    상기 항체가 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E의 199∼212 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체인

    크론병의 검사 방법.
20. 제16항에 있어서,

    LIAQQM의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물, 또는 이들 펩티드 또는 그의 동등물의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 분지상으로 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드를 항원 물질로서 이용하고, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase를 인식하는 항체와의 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출하는 단계를 포함하는

    크론병의 검사 방법.
21. 제20항에 있어서,

    LIAQQM의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물이, LIAQQM의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 6∼227개로 이루어진 펩티드인

    크론병의 검사 방법.
22. 제20항에 있어서,

    LIAQQM의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드의 동등물이, 배열번호 1, 5∼14에 따른 각각의 아미노산 배열을 가지는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인

    크론병의 검사 방법.
23. 제16항에 있어서,

    인간 액포형 H⁺수송성 ATPase의 서브 유닛 E와, 그 외 서브 유닛 A, 서브 유닛 B, 서브 유닛 C, 서브 유닛 D, 115kDa 서브 유닛, 39kDa 서브 유닛, 20kDa 서브 유닛 및 16kDa 서브 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서브 유닛의 복합체를 항원 물질로서 이용하고, 인간 액포형 H⁺수송성 ATPase를 인식하는 항체와의 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출하는 단계를 포함하는

    크론병의 검사 방법.
24. 피험자의 생체 시료 중의 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)을 인식하는 항체를 검출하는 단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.
25. 제24항에 있어서,

    상기 항체가 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)의 126∼138 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체인

    크론병의 검사 방법.
26. 제24항에 있어서,

    배열번호 51에 따른 아미노산 배열을 가지는 펩티드 또는 그의 동등물, 또는 이들의 펩티드 또는 그의 동등물의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 분지상으로 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드를 항원 물질로서 이용하고, 인간 핵내 단백질(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)을인식하는 항체와의 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출하는 단계를 포함하는

    크론병의 검사 방법.
27. 제26항에 있어서,

    배열번호 51에 따른 아미노산 배열을 가지는 펩티드 또는 그의 동등물이, 배열번호 51에 따른 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 7∼604개로 이루어진 펩티드인

    크론병의 검사 방법.
28. 제26항에 있어서,

    배열번호 51에 따른 아미노산 배열을 가지는 펩티드의 동등물이, 배열번호 3, 21∼32에 따른 각각의 아미노산 배열을 가지는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인

    크론병의 검사 방법.
29. 피험자의 생체 시료 중의, 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체를 검출하는단계를 포함하는 크론병의 검사 방법.
30. 제29항에 있어서,

    상기 쌀 알레르겐 단백질이 α-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(alpha-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)에 속하는 것인

    크론병의 검사 방법.
31. 제29항에 있어서,

    상기 쌀 알레르겐 단백질이, 쌀 알레르겐(Rice allergen), 쌀 종자 알레르겐 RA5(Rice seed allergen RA5), 쌀 알레르겐 RA5B 전구체(Rice allergen RA5B precursor), 쌀 종자 알레르겐 RA14(Rice seed allergen RA14), 쌀 알레르겐 RA14B 전구체(Rice allergen RA14B precursor) 및 쌀 종자 알레르겐 RAG2(Rice seed allergen RAG2)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인

    크론병의 검사 방법.
32. 제29항에 있어서,

    상기 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체가, 쌀 종자 알레르겐 RA14의99∼111 위치의 아미노산 영역을 인식하는 항체인

    크론병의 검사 방법.
33. 제29항에 있어서,

    상기 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체가, α-아밀라아제/트립신 억제제의 유전자 군(alpha-amylase/trypsin inhibitor의 gene family)의 L(V)GGIYREL의 아미노산 배열을 가지는 아미노산 영역을 인식하는 항체인

    크론병의 검사 방법.
34. 제29항에 있어서,

    L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물, 또는 이들의 펩티드 또는 그의 동등물의 아미노산 배열을, 동일 또는 상이한 것으로 1분자 중에 분지상으로 복수개 가지는 분지상 다항원성 펩티드를 항원 물질로서 이용하고, 쌀 알레르겐 단백질을 인식하는 항체와의 항원-항체 반응에 의해 생성되는 복합물을 검출하는 단계를 포함하는

    크론병의 검사 방법.
35. 제34항에 있어서,

    L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 그의 동등물이, L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열을 포함하는 아미노산 수 8∼166개로 이루어진 펩티드인

    크론병의 검사 방법.
36. 제34항에 있어서,

    L(V)GGIYXD(E)L(X는, 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기)의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드의 동등물이, 배열번호 4, 33∼48에 따른 아미노산 배열을 가지는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인

    크론병의 검사 방법.
37. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의, 크론병의 검사에 있어서 크론병 항체와 반응시키는 항원 물질로서의 용도.
38. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 따른 펩티드의, 크론병의 검사 시약의 제조를 위한 용도.