CN112574284A

CN112574284A - 多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112574284A
Application number: CN202011602781.3A
Authority: CN
Inventors: 程恳; 郭宝森; 刘颖; 郑汉城; 李丹妮; 贡卓琳; 勾洪磊; 孟星宇
Original assignee: Zhuhai Carbon Cloud Intelligent Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Carbon Cloud Diagnostic Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112574284B

Abstract

本发明提供了一种多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用。其中多肽能够特异性结合IA2A、GADA和IAA中的任意一种自身抗体；结合IA2A的多肽选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任意一条或多条；结合GADA的多肽选自SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20中的任意一条或多条；结合IAA的多肽选自SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：25中的任意一条或多条。上述多肽能够特异性地与自身抗体结合，应用时采用针对一种抗体的一条或多条多肽进行检测，或采用针对多个抗体的多条多肽进行检测，即可通过综合判断多条多肽的检测结果来判定自身抗体状况，因而检测准确性更高。

Description

多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及自身抗体检测产品领域，具体而言，涉及一种多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用。

背景技术

自身免疫病是一类由于免疫功能紊乱，机体产生针对自身抗原的病理性免疫应答，而引起组织、器官或系统损失的疾病。常见的病因有机体内出现自身抗原，免疫调节异常，存在交叉抗原和遗传因素等。临床表现复杂多变，且病变累及广泛。自身免疫病根据累及的范围主要分为器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病。器官特异性自身免疫病是指组织器官的病理损害和功能障碍，仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官，如慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等。系统性自身免疫病是由于抗原抗体复合物广泛沉积于血管壁等原因导致全身多器官损害的系统性自身免疫病。习惯上又被称之为胶原病或结缔组织病，主要是由于免疫损伤导致血管壁及间质的纤维素样坏死性炎症及随后产生多器官的胶原纤维增生所导致的。常见的系统性自身免疫病有：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血等。

目前临床医生对自身免疫病的诊断主要根据患者的临床表现，并结合检测血清或血浆中一种或多种高效价特异性抗体来确定。由于自身免疫病的潜伏期长，许多自身抗体检测可以在自身免疫病发生前2-3年即出现异常。因此自身抗体的检测对自身免疫病的早诊断，早预防，早发现，早治疗具有重要的意义。自身免疫病常用的检测方法众多，除传统的沉淀反应，凝集试验、补体结合试验以外，标记免疫测定，如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等已成为主要的免疫测定技术，免疫印迹法和快速斑点免疫结合试验也被广泛使用。

自身免疫病以自身免疫性糖尿病为例，如一型糖尿病(T1DM)和成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)，该类疾病主要是由于免疫系统功能失常，产生自身抗体，并选择性地攻击胰岛β细胞，从而最终需要胰岛素治疗。由于LADA患者的临床表现和代谢特性与二型糖尿病(T2DM)患者相似，短时间内不需要胰岛素治疗，使得这些患者在患病初期容易被误诊为T2DM，误诊率高达5-10％。理想情况下，新诊断为T2DM的患者应该进行血浆C肽和自身抗体筛查，以确保对自身抗体呈阳性的患者能够正确用药，并进行更密切的监测。但是出于价格、检测灵敏度和准确性等原因，目前相关检测很难得到广泛推广。

此外，LADA疾病进程中，自身抗体出现的阶段和类别存在个体差异，需要对不同抗体进行多次实验。通常认为GADA抗体是目前最敏感的T1DM和LADA的自身抗体标记物，不受疾病发病时的年龄影响。其他自身抗体一般与发病年龄负相关的，如IAA更容易出现在年轻的T1DM患者中，而IA2A和ZnT8 Ab则只存在于一小部分LADA患者中。同时也存在低滴度的GADA自身抗体，或单一胰岛细胞自身抗体呈阳性的LADA患者。更重要的是，目前发现一部分表型为T2D的患者表现出了自身免疫T细胞响应，却检测不到已知的自身抗体。说明这部分LADA患者可能存在目前未知的自身抗体。这些都对LADA患者体内自身抗体检测和LADA精准诊断带来不小的挑战。相比于传统的T1DM，自身免疫过程在LADA中的进展相对缓慢，治疗方案需要偏向于防止胰岛β细胞功能丧失与衰亡。

因此，针对上述临床检测需求，需要提供新的能够对自身抗体进行检测的产品。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用，以解决现有技术中难以准确检测特定的自身抗体的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种多肽，该多肽能够特异性结合自身抗体，自身抗体选自IA2A、GADA和IAA中的任意一种；其中，多肽特异性结合IA2A，多肽选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任意一条或多条；或者多肽特异性结合GADA，多肽选自SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20中的任意一条或多条；或者多肽特异性结合IAA，多肽选自SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：25中的任意一条或多条。

进一步地，上述多肽为修饰后的肽段；优选地，修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰；优选地，化学基团修饰为PEG修饰；优选地，PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰；优选地，PEG修饰的位点选自多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个；优选地，PEG修饰为分子量为500～40000的PEG修饰；优选地，氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；优选地，亲水性氨基酸修饰为在多肽的N端、C端或者NC两端添加1-4个亲水性氨基酸，更优选地，亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly；进一步优选地，1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser；优选地，半胱氨酸修饰为在多肽的如下任一位置添加半胱氨酸：N端、C端、NC两端或肽链中间；更优选地，在肽链中间添加半胱氨酸包括在肽链中间插入一个或多个半胱氨酸，或者一个或多个半胱氨酸以支链形式连接于肽链的中间。

根据本申请的第二个方面，提供了一种多肽产品，该多肽产品包括上述任一种多肽。

进一步地，该多肽产品还包括多肽稳定剂；优选地，多肽稳定剂包括150～180mMNaCl、100～140mM的聚赖氨酸盐酸盐及水；多肽产品为多肽芯片，且多肽芯片上的多肽上述多肽组成。

根据本申请的第三个方面，提供了一种多肽组合物，多肽组合物包括多条上述多肽。

根据本申请的第四个方面，提供了一种检测自身抗体的试剂，试剂包括上述多肽。

根据本申请的第五个方面，提供了一种检测自身抗体的试剂盒，试剂盒包括上述多肽。

进一步地，试剂盒包括检测芯片，多肽设置在检测芯片上，且检测芯片上的多肽由上述多肽组成。

根据本申请的第六个方面，提供了上述多肽在制备检测自身抗体的试剂盒中的应用。

根据本申请的第七个方面，提供了一种检测自身抗体的方法，该方法包括：将待测样本与多条上述多肽进行孵育，得到孵育产物；向孵育产物中加入荧光二抗；检测并统计多条多肽中荧光信号强度满足信号阈值的多肽的条数；若条数满足阳性多肽种类数量阈值，则判定待测样本中的自身抗体为阳性。

进一步地，信号阈值通过如下至少一种方式确定：1)检测一批阴性样本，以阴性样本的检测结果中多条多肽的荧光信号强度的最高值为基础确定，优选地，信号阈值即为最高值，或信号阈值为n1倍最高值，n1＞1；2)检测一批阳性样本，以阳性样本的检测结果中多条多肽的荧光信号强度的最低值为基础确定，优选地，信号阈值即为最低值，或信号阈值为n2倍最低值，n2＜1。

进一步地，信号阈值和阳性多肽种类数量阈值通过如下方式确定：检测阴性样本和阳性样本，基于阴性样本和阳性样本的检测结果中多条多肽的ROC工作曲线的约登指数和真阴性符合率来确定信号阈值和阳性多肽种类数量阈值；优选地，自身抗体为GADA，优选阳性多肽种类数量阈值为6；优选地，自身抗体为IAA，优选阳性多肽种类数量阈值为2；优选地，自身抗体为IA2A，优选阳性多肽种类数量阈值为5；优选地，将多肽相应特征的荧光信号强度转换为对数值进行计算和统计，更优选转换为log10值进行计算。

进一步地，多条多肽为检测一种自身抗体的多肽，或者多条多肽为检测两种或两种以上自身抗体的多肽，且检测每一种自身抗体的多肽为多条；优选地，当多条多肽为检测两种或两种以上自身抗体的多肽时，且每一种自身抗体均为同一疾病相关抗体时，则任意一种自身抗体被判定为阳性时，则进一步确定待测样本为疾病阳性；优选地，多条多肽设置在检测芯片上，且检测芯片上的多肽由多条上述多肽组成。

应用本发明的技术方案，本申请提供的多肽能够特异性地与自身抗体结合，应用时可以根据实际需要，选择采用针对一种抗体的一条或多条多肽进行检测，或者采用针对多个抗体的多条多肽进行检测，这样便于通过综合判断多条多肽的检测结果来判定自身抗体状况，因而检测准确性更高。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的实施例所提供的多肽芯片检测自身抗体的原理示意图；

图2示出了IA2A单纯抗体溶解于PBST中，信号强度分布随抗体浓度变化的结果图；

图3示出了IA2A对应的阳性多肽信号和阴性多肽信号随样本浓度变小而降低的变化图；

图4示出了本发明的实施例中LADA血清样本检测的结果分布。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

术语解释：

多肽芯片是一种基于衬底材料的芯片，芯片上包括预先设计数量、位置和序列的特征，一个特征是一簇序列相同的多肽，特征与特征之间的多肽序列往往是不一样的，这些特征组成一个高密度多肽阵列。

多肽芯片技术是基于多肽芯片的检测技术，其利用多肽芯片上的种类繁多的多肽与样本的接触，然后利用图像采集技术采集多肽芯片上各个特征信号(具体可表现为携带各个特征信号的荧光图像)，进而输出芯片中每个特征的信号强度，即多肽芯片检测结果数据。输出样本检测信号，基于多肽芯片检测结果数据输出的样本检测信号，可实现对与多肽芯片上的多肽结合的样本中的待测物的分析，样本的分析等。

ROC工作曲线：反映敏感性与特异性之间关系的曲线。横坐标X轴为1-特异性，也称为假阳性率，X轴越接近零准确率越高；纵坐标Y轴称为敏感度，也称为真阳性率，Y轴越大代表敏感度越好。根据曲线位置，把整个图划分为两部分，曲线下方部分的面积被称为AUC(Area Under Curve)，用来表示预测准确性，AUC值越高，表明预测准确率越高。曲线越接近左上角(X越小，Y越大)，预测准确率越高。

多肽芯片抗体检测技术是生物芯片行业较为前沿的技术，主要是基于多肽特异性捕获体液样本中抗体，从而实现高通量检测样本中的抗体。相比于传统的抗体检测方法，芯片检测技术可以一次实验检测多种抗体指标，样本用量少，分析检测速度快，检测方法更加安全环保，以及可实现先进的自动化和一体化。而相比于蛋白芯片抗体检测技术，多肽芯片的制作工艺更加稳定，所采集的数据也更加可靠准确，价格也更具优势。

比如，本申请中所使用的一种多肽芯片(HealtTell V13)，该多肽芯片上包含超过13万种已知序列的合成多肽，每条多肽含有5-13个氨基酸,多肽的氨基酸组合是一种无偏差的随机组合，遵照抗原-抗体竞争结合，以及氨基酸-氨基酸作用的免疫学原理来测量体液中游离抗体的整体水平。多肽芯片检测自身抗体的原理示意图如图1所示。

为了开发针对自身免疫病的相关检测产品，本申请以自身免疫性糖尿病相关的自身抗体(GADA，IAA和IA2A)为例，利用多肽芯片技术筛选出几种抗体对应的多肽。基于这些多肽在其他抗体及无关样本中的表现，以及多肽序列的科学性进行进一步筛选，从而得到准确性、稳定性及特异性高的多肽。并在LADA人群队列中进行了验证，检测结果明显优于国内市场上主流的IVD抗体检测试剂盒(ELISA方法)，表明筛选出的多肽能够以多肽芯片产品的形式实现抗体检测，从而可用于辅助临床疾病诊断。这些多肽或其组合可作为(检测自身抗体的)信号肽，用于检测患者血清样本中相应抗体的有无。在此基础上，申请人提出了本申请的技术方案。

在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种多肽，该多肽能够特异性结合自身抗体，其中自身抗体选自IA2A、GADA和IAA中的任意一种，多肽能够特异性地与自身抗体结合，从而能够用于检测待测样本中是否含有此类自身抗体，该多肽特异性结合IA2A，此多肽选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任意一条或多条；或者该多肽特异性结合GADA，具体选自SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20中的任意一条或多条；或者该多肽特异性结合IAA，具体选自SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：25中的任意一条或多条。上述多肽在检测相应的自身抗体时，可以采用其中一条进行检测，也可以采用多条。本申请优选采用多条进行检测。当多条进行检测时，可根据所检测的多肽中显示相应自身抗体阳性的多肽条数来进行综合判定。具体的判定阈值根据具体选择的多肽的类型、条数及组合的情况而合理设定。

为进一步提高某些多肽的亲和性，在一些优选的实施例中，上述多肽中的任一条或多条肽段为修饰后的多肽。具体的修饰可以是化学基团修饰，也可以是氨基酸修饰。优选化学基团修饰为PEG修饰，优选地，PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰((功能性官能团可以是-NHS、-OH、-Mal、-NH₂或-COOH，单官能团选自其中任意一种，双官能团选自其中任意两种)；优选地，PEG修饰的位点选自多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个；优选地，PEG修饰为分子量为500～40000的PEG修饰；优选地，氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰。优选地，氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；优选地，亲水性氨基酸修饰为在N端、C端或者NC两端添加1-4个亲水性氨基酸；优选地，亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly；优选地，1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser。

上述PEG修饰或亲水性氨基酸修饰能够增加多肽的亲水性。PEG修饰具有半衰期延长、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等优势。

在某些实施例中，为了更好地实现对多肽的定向偶联，上述多肽中的任一条或多条肽段可以为半胱氨酸修饰的肽段。具体地，包括但不限于在肽段的N端、C端或者NC两端添加，或者在肽段的肽链中间添加半胱氨酸。当在肽段的肽链中间添加半胱氨酸时，一个或多个半胱氨酸可以插入肽链中间(即插入两个氨基酸残基之间)，也可以将一个或多个半胱氨酸以支链形式连接于肽链的中间(即作为肽链中间的某个氨基酸的侧链)。

上述多肽可以作为检测相应自身抗体的检测试剂对目标自身抗体进行检测。因此，在一种优选的实施例中，提供了上述任一种或多种多肽在检测相应自身抗体中的应用。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种多肽产品，包括上述任一种多肽。上述多肽作为自身抗体的检测试剂，能够检测待测样本中是否含有自身抗体(即自身免疫性糖尿病相关的自身抗体IA2A、GADA和IAA)。该多肽产品可以是ELISA的检测试剂盒，也可以是多肽芯片，当是ELISA试剂盒时，上述一种或多种多肽通过包被于固相载体中的方式对目标自身抗体进行检测。当该多肽产品是多肽芯片时，以由上述多种多肽组成的多肽芯片的形式对相应自身抗体基线检测。

上述多肽产品作为检测试剂，为进一步提高其有效成分---多肽的稳定性，该多肽产品还包括多肽稳定剂。

在本申请一种优选的实施例中，上述多肽稳定剂包括150～180mM NaCl、100～140mM的聚赖氨酸盐酸盐及水。更优选地，多肽稳定剂包括153～158mM NaCl、110～130mM的聚赖氨酸盐酸盐及水；进一步优选地，多肽稳定剂包括154mM NaCl、126.4mM的聚赖氨酸盐酸盐及水。具体地，多肽稳定剂中，NaCl的浓度可以是150mM、151mM、152mM、153mM、154mM、155mM、156mM、157mM、158mM、159mM、160mM、161mM、162mM、163mM、164mM、165mM、166mM、167mM、168mM、169mM、170mM、171mM、172mM、173mM、174mM、175mM、176mM、177mM、178mM、179mM或180mM；聚赖氨酸盐酸盐的浓度可以是110mM、111mM、112mM、113mM、114mM、115mM、116mM、117mM、118mM、119mM、120mM、121mM、122mM、123mM、124mM、125mM、126mM、127mM、128mM、129mM、130mM、131mM、132mM、133mM、134mM、135mM、136mM、137mM、138mM、139mM或140mM。

在本申请一种优选的实施例中，上述多肽产品中多肽的浓度为3～10μM，优选为5～8μM，更优选为5μM。更具体地，可以是3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM。

在本申请一种优选的实施例中，如上述，该多肽产品为多肽芯片，且该多肽芯片上的多肽由上述任一种多肽组成。上述能够特异性结合自身抗体的多肽可以全部设置在该多肽芯片上，进而可实现一次检测多个样本或多种抗体，提高检测通量、效率的同时，还便于综合多个自身抗体的检测结果准确判断待测样本的自身抗体状况。

因此，在一种优选的实施例中，提供了上述任一种多肽产品在检测相应自身抗体中的应用。

在本申请第三典型的实施例中，提供了一种多肽组合物，该多肽组合物包括多条上述多肽。上述多肽以组合物的形式可以设置在芯片上用于检测，也可以以组合物的形式包被在固相载体中，采用ELLISA试剂盒类似的方式进行检测。

在一种优选的实施例中，还提供了上述任一种多肽组合物在检测相应自身抗体中的应用。

在本申请第四典型的实施例中，提供了一种检测自身抗体的试剂，该试剂包括上述任意一种或多种多肽。

在本申请第五典型的实施例中，提供了一种检测自身抗体的试剂盒，该试剂盒包括上述任意一种或多种多肽。优选地，该试剂盒包括检测芯片，多肽设置在检测芯片上。

上述任意一种或多种多肽在制备检测自身抗体的试剂盒中的应用。

在一种优选的实施例中，还提供了上述任一种试剂或试剂盒在检测相应自身抗体中的应用。

根据具体需要，可以制备成多种不同类型的检测试剂盒，具体试剂盒的形式不限，比如可以是ELLISA试剂盒，也可以是免疫荧光试剂盒或免疫胶体金试剂盒等。从方便检测及便于判断检测结果的角度考虑，试剂盒中的多肽优选设置为预包被多肽。优选地，预包被多肽包被于固相载体上；具体的预包被的固相载体根据需要合理设计。更优选，固相载体包括酶标板(多为聚苯乙烯材料的)、膜载体或微球；进一步优选地，膜载体包括硝酸纤维素膜(使用最广泛)、玻璃纤维素膜或尼龙膜，更进一步优选地，膜载体上还包被有阳性对照物，多肽-载体蛋白偶联物和阳性对照物按检测顺序在硝酸纤维素膜上依次设置。

根据试剂盒的具体检测方法的不同，试剂盒中具体的配套试剂也相应有所不同，但均可以根据已知试剂盒的配制方式进行组合配套试剂。优选地，上述试剂盒中还包括以下至少之一：(1)酶标二抗，更优选酶标二抗为HRP标记的二抗(对应于ELISA检测试剂盒)；(2)胶体金结合垫，胶体金结合垫上包被有胶体金标记的多肽和阳性对照物的特异性结合物(对应于免疫胶体金检测试剂盒)；(3)标记垫，标记垫上包被有荧光标记的微球，微球上负载有阳性对照物的特异性结合物(对应于免疫荧光检测试剂盒)。

上述免疫胶体金检测试剂盒和免疫荧光检测试剂盒检测相对更方便，只需要建立阳性对照的C线和检测样本的T线即可。阳性对照的C线处预包被的阳性对照物，只要是能够随着待测样本的血清层析过程携带过来的带有检测标记的特异性结合物结合即可，对具体的阳性对照物的具体多肽或抗体并无特殊限定。优选地，上述阳性对照物选自鼠免疫球蛋白、人免疫球蛋白、羊免疫球蛋白或兔免疫球蛋白，相应地，阳性对照物的特异性结合物选自抗鼠免疫球蛋白、抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白。

上述抗鼠免疫球蛋白根据免疫的对象的不同，可以是羊抗鼠的免疫球蛋白或兔抗鼠的免疫球蛋白，或者是其他可免疫的动物抗鼠的免疫球蛋白。同样地，抗人免疫球蛋白、抗羊免疫球蛋白或抗兔免疫球蛋白也可以根据免疫动物的不同，是不同物种来源的抗免疫球蛋白。上述免疫球蛋白可以是IgM、IgG、IgA、IgD或IgE中的任意一种。这些抗免疫球蛋白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

上述试剂盒中，根据所需要检测的样本数量的多少，所使用的酶标板的规格也有所不同，可以在12～384孔酶标板中合理选择。

在本申请第六典型的实施例中，提供了一种检测自身抗体的方法，该方法包括：将待测样本与多条多肽进行孵育，得到孵育产物；向孵育产物中加入荧光标记二抗；检测并统计荧光信号强度满足信号阈值的多肽的条数；若荧光信号强度满足信号阈值的多肽的条数满足阳性多肽种类数量阈值，则判定待测样本中的自身抗体为阳性。

通过采用前述的能够特异性结合相应自身抗体的多肽对待测样本进行检测，利用多条多肽可以一次性检测多个样本，和/或一次性检测多个自身抗体，综合多条多肽的检测结果，能够高效、快速、高通量、高灵敏度、高准确性地检测待测样本中是否含有相应的自身抗体。

上述信号阈值根据实际需要可以通过多种方式确定。在一些实施例中，通过检测一批阴性样本，以阴性样本的检测结果中多条多肽的信号值的最高值为基础确定，优选地，信号阈值即为最高值，或信号阈值为n1倍最高值，n1＞1，优选n1为1.1或1.2等等。在另一些实施例中，通过检测一批阳性样本，以阳性样本的检测结果中多条多肽的信号值的最低值为基础确定，优选地，信号阈值即为最低值，或信号阈值为n2倍最低值，n2＜1，优选n2为0.9或0.8等等。实际中，上述样本在检测时，均会进行重复检测，此时，可用重复检测获得的信号值的平均值或中值替换前述的信号值来执行。

在另一种优选的实施例中，上述信号阈值和阳性多肽种类数量阈值通过以下方法计算得到：基于阳性样本和阴性样本检测结果中多条多肽对应的工作特征曲线(ROC曲线)算法确定，即用构图法揭示敏感性(即真阳性率)和特异性(即真阴性率)的相互关系。通过设定多个不同的信号阈值和阳性多肽种类数量阈值，计算出一系列对应的敏感性和特异性，再以敏感性作为纵坐标，(1-特异性)作为横坐标绘制曲线。曲线下面积越大，则判断准确性越高。信号阈值和阳性多肽种类数量阈值一般会基于约登指数(约登指数＝敏感性+特异性-1)大，并且真阴性率高来综合确定。具体的阈值数值并无特别限制，可以根据实际情况进行选择，比如，选取约登指数排名第一、第二或第三等)，且真阴性符合率排名第一时对应的值作为信号阈值及阳性多肽种类数量阈值。

其中，将高于信号阈值(可通过质控后的背景噪音的最高信号确定，高于该背景噪音的最高信号的信号即视为有荧光信号)的荧光强度信号视为有荧光信号，否则视为无荧光信号；统计有荧光信号的多肽的条数，并将大于有荧光信号的多肽的条数作为阳性多肽种类数量阈值；优选地，自身抗体为GADA，优选阳性多肽种类数量阈值为6(意味着存在≥6条时即视为阳性)；优选地，自身抗体为IAA，优选阳性多肽种类数量阈值为2；优选地，自身抗体为IA2A，优选阳性多肽种类数量阈值为5；优选地，将多肽相应特征的荧光信号强度转换为对数值进行计算和统计，更优选转换为log10值进行计算。实际中，上述各样本在检测时，均会进行重复检测，因此，前述各荧光信号强度值(也即荧光信号值)可用重复检测获得的信号值的平均值或中值替换前述的信号值来执行。

上述多肽相应特征的信号强度进行log10转换的主要目的是用于优化数值分布，其仅是使信号强度值的具体数值趋于正态化的一种优选的方式，也可以采用其他的使数值趋于正态化的转换方式(比如，采用原始信号强度值取对数，比如取ln、log2、log20等)，或者采用基于log10的二次计算方式(比如log10的倒数)，再或者采用分位数转换或RankGuass等。

上述阳性多肽种类数量阈值的计算方法，以上述自身抗体GADA、IA2A和IAA为例说明如下：(1)选择肽段：从单纯抗体特异性结合多肽筛选实验中，选择结合荧光信号(此处以进行对数转换后的数值进行计算的，如以转换为log10后的数值计算)排名靠前的肽段中进行选择，比如，选择前10条肽段。(2)信号阈值：GADA和IA2A以0.1为有信号的阈值，IAA以0.3为有信号的阈值，依次判定10条肽段的具体信号数值是否高于相应的信号阈值，从而定义为多肽有无信号。(3)样本得分：在每个样本中，计算10条肽段中有信号的个数，即为该样本的得分。(4)样本判定：如果一个样本针对GADA的10条肽段中的不少于6条肽段中有信号(即得分≥6)，则该样本判定为阳性，同理，针对IA2A肽段中的不少于5条，针对IAA肽段中的不少于2条有信号，即判断样本为抗体阳性。此处的两种阈值中，主要基于阳性样本和阴性样本的检测结果中多条多肽的ROC工作曲线的约登指数(约登指数＝敏感性+特异性-1)和真阴性符合率来确定信号阈值和阳性多肽种类数量阈值，即采用约登指数排前第一数量，真阴性符合率排前第二数量时的信号值和阳性条数为相应的信号阈值和阳性多肽种类数量阈值。此次的第一数量和第二数量并无固定数值，选取约登指数较大(有可能排名是第二)，且真阴性符合率最高(比如排名第一)时对应的值作为阈值。

根据上述多肽具体针对的是一种还是多种自身抗体，多条多肽的具体组成也有所不同。若针对的是一种自身抗体，则多条多肽为特异性结合这一种自身抗体的多肽，比如若针对IA2A抗体，则上述多条多肽，优选选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的多条。若针对的是两种或两种以上自身抗体，则多条多肽为检测两种或两种以上自身抗体的多肽，且检测每一种自身抗体的多肽为多条；更优选包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：25所示的多肽。进一步优选地，多条多肽设置在检测芯片上，能够高通量、高灵敏度和高准确性检测待测样本中是否含有相应的自身抗体。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的有益效果。以下实施例以糖尿病相关自身抗体为例，使用HealTell公司的多肽芯片技术，V13芯片，详细介绍筛选出来的检测性多肽。

第一步：筛选抗体对应信号肽组合

1、通过抗体实验筛选稳定性高且特异性高的多肽

将糖尿病相关自身抗体(GADA，IAA和IA2A)分别溶解于磷酸盐缓冲溶液(PBST，含0.05％吐温20v/v的PBS)和血清样本中进行浓度梯度实验，旨在挖掘与这些抗体稳定结合的信号肽。

样本制备1：分别将三个抗体GADA(NBP2-79803，Novus)，IAA(NBP2-34738AF647，Novus)，IA2A(H00005798-M07，Novus)用PBST溶解至0.125，0.05，0.01，0.005，0.001，0.0005，0.0001，0.00005，0.00001，0.000005，0.000001μg/mL。使用这样大跨度的浓度梯度实验，旨在挖掘多肽信号强度随抗体浓度变化的规律，并确定适合筛选抗体对应信号肽的浓度范围。

样本制备2：此外，将三个抗体GADA(NBP2-79803，Novus)，IAA(NBP2-34738AF647，Novus)，IA2A(H00005798-M07，Novus)分别溶解于PBST和健康人抗体呈阴性的血清样本中，得到高和低两个浓度的抗体样本(GADA：50和100μg/mL，IAA：100和500μg/mL，IA2A：10和100μg/mL)。分别记为【低抗体浓度+PBST】、【高抗体浓度+PBST】、【低抗体浓度+血清】、【高抗体浓度+血清】。另准备【无抗体+PBST】和【无抗体+血清】样本作为参照。

表1.实验样本设计表

Note：(1)同一抗体的实验尽量安排在同一wafer芯片上实验；(2)不同分组尽量随机排布，同一样本的三个技术重复尽量不要出现在同一行，尽量随机排布所有样本。

样本稀释：用样本稀释液(含1％D-mannitol的PBST溶液)稀释1000倍，震荡混匀。

样本孵育：在有/无封闭液的条件下，依次加入上述样本(3个技术重复，随机排布)，空白对照(清洗液)，阳性对照和阴性对照(PBST)，恒温孵育，洗板。

二抗孵育：分别加入抗鼠二抗(4.5nM,A21422,Invitrogen)和抗人二抗(9nM,A21433,Invitrogen)，恒温孵育，洗板。

荧光成像检测：软件自动将荧光成像得到的图片转化为荧光强度数值，并输出一个包含样本及对应多肽荧光强度的数值矩阵。

具体实验流程如下：

一、芯片和cassette组装

1)将assay cassette清洗干净并进行干燥(MilliQ清洗后喷洒异丙醇，于生物安全柜内晾干)。

2)将轨道式振荡器跳至55±5rpm转速、20分钟对芯片进行水化。

3)对芯片进行组装和干燥。

二、实验前确认

1)样本质量确认

样本为血清样本，提前确认血清质量，如较混浊需考虑是否需要离心处理，并确认是否有融血现象，并记录在相应样品信息的备注中；

2)样本排布确认

样本排布需进行两次人工确认(一次加样前，一次加样后)，确保样本位置准确。

三、样本准备

1)样本制备

按照前述方法(样本制备1、样本制备2)制备样本。

2)样本稀释

将样本稀释液(含1％D-mannitol的PBST溶液)盛装在排枪储液槽。将步骤1)样本制备2所得样本稀释1000倍，使用单通道移液器对每一个样本(抗体/血清样本)进行浓度稀释；震荡混匀(振荡器设置600rpm震荡1min)得到最终的样本。

四、分别加入封闭液和样本

1)将封闭液(含0.1％casein和1％D-mannitol的PBST溶液)加至步骤一处理后的Cassette对应的孔位中，45μL//孔，然后放置于37℃烘箱中1小时。

2)根据样本上机的排布设计(避免实验中的3个技术重复连续排版)，使用单通道移液器将稀释后的样本加入96孔板中。

五、样品孵育

1)提前打开恒温混匀器，将温度稳定到37℃。

2)使用八道移液器吸取96孔稀释板内的90μL样本加入对应孔位的assaycassette，封膜；

3)将assay cassette至于恒温混匀器上孵育60min，每6min需将cassette振荡15s。

六、样本清洗

终止振荡，撕膜后放入洗板机，确认洗板机废液瓶中有足够容量，使用自动洗板机洗板(

微孔板磁力洗板机)。

七、二抗孵育

1)配制二抗稀释液(含0.75％Casein的PBST溶液)，用排枪吸取40uL/well二抗稀释液加入assay cassette，封膜；

2)将assay cassette至于恒温混匀器上孵育60min，每6min需将cassette振荡15s。

八、样本清洗

终止振荡，撕膜后放入洗板机，确认洗板机废液瓶有足够容量，使用自动洗板机洗板(

微孔板磁力洗板机)。

九、芯片拆卸

1)在生物安全柜中准备好操作区域，包括芯片离心机、低棉吸水垫、90％异丙醇喷壶、装有MilliQ的水盆，盆中含有芯片槽和手柄、装有MilliQ的水化盒、干净的芯片储存盒。小心的拿出assay cassette中的每块芯片，每次拿1块，将其放置在芯片槽上。

2)芯片干燥，装盒。

将芯片组装于imaging cassette中。

十、荧光成像

Imaging System使用机械臂将imaging cassette转移至条形码扫描的位置。待imaging cassette和芯片条形码扫描完成后，将imaging cassette转移至Image Xpress成像。系统通过Venus软件控制指导实验者进行成像操作，需要操作者设定曝光时间和imaging cassette数目。当成像开始时，操作者可以继续添加需要成像的imagingcassette。

成像过程通过Molecular Devices Image Xpress 4成像仪对每个array产生高分辨率的TIFF图像。Gridding Software从TIFF图像文件中提取特征强度数据。

当imaging cassette组装完成后，将cassette转移至cassette hotel。接下来将启动自动成像过程。

具体数据预处理流程如下：

1)提取特征的荧光强度数值，输出1个GPR5数据文件和1个corner images文件。其中，GPR5文件包含了一个样本的所有信息和所有特征的荧光强度信息。

2)从所有样本的GPR5数据文件中提取特征的荧光强度信息，生成原始荧光强度(FG，foreground)数据矩阵。然后对每个样本的数据分别进行对数转换得到LFG(log-transferred foreground)数据矩阵、进行z-score的标。准化处理获得NLFG(normalizedand log-transferred foreground)数据矩阵。该步骤还会生。成一个样本芯片信息文件，该文件包括了样本阵列位置、所用芯片编号等信息。

3)质控

通过Health Tell自带的质控方法对样本和系统进行质控，是合格的。

2.使用抗体实验的数值矩阵挖掘抗体对应的信号肽

大跨度的抗体浓度梯度实验，旨在挖掘多肽信号强度随抗体浓度变化的规律，并确定适合筛选抗体对应信号肽的浓度范围。

图2示出了IA2A单纯抗体溶解于PBST中，信号强度分布随抗体浓度变化的结果图。如图2所示，其中横坐标中抗体从左到右浓度逐渐变小。

表2.饱和多肽数目随GADA,IAA和IA2A抗体浓度变化而变化

注：上表中的NaN表示无饱和多肽。

根据样本制备1的样本的检测结果确定GADA、IAA和IA2A抗体较为适宜的浓度范围，其中GADA为021-0.001μg/mL，IAA为0.8-0.001μg/mL，IA2A为0.2-0.001μg/mL，从而在有/无封闭液，有/无抗体，高/低抗体浓度样本条件下，筛选稳定性高，特异性强的信号肽。

进一步比较在高低抗体浓度，有无血清背景及不同二抗条件下，即【低抗体浓度+PBST】、【高抗体浓度+PBST】、【低抗体浓度+血清】、【高抗体浓度+血清】样本的结果，根据多肽的信号强度和变化规律，筛选可靠的信号肽。

具体的数据处理方法如下：

(1)首先将多肽芯片技术平台产生的信号值进行Log10数值变换及数据标准化，从而增强样本之间的可比性。

(2)对同一样本的多个技术重复计算信号中位值，作为该样本的信号值，从而降低随机噪音和批次效应对信号的影响。

(3)将多肽按照信号强度从大到小来进行排序，挑选出排序高的一组多肽作为备选信号肽。

(4)确定信号肽在空白对照和阴性样本中的信号强度，排除因生产和实验环节引入的假阳性信号，从而筛选高特异性的信号肽，保证多肽信号的真实可靠性。

(5)分析在多个浓度实验条件下，多肽信号强度的变化情况，筛选出在各个浓度下稳定处于高强度和高排序的多肽，从而确保多肽的重复性和可靠性。一方面将每个浓度下的肽段信号进行排序，挑选出在各个浓度梯度条件下均处于靠前排序的肽段，避免在特定浓度下出现假阳性结果；另一方面，观察多肽信号在浓度梯度中信号强度的变化情况，筛选出那些随着浓度变化而变化的多肽信号，且这些信号强度始终高于背景信号的强度阈值。

如图3所示，IA2A对应的阳性多肽信号(即信号肽)和阴性多肽信号随样本浓度变小而降低。

结果：由此利用多肽芯片技术分别筛选出3个抗体对应的稳定性高、特异性强的信号肽。

表3.抗体对应信号肽的结果：

第二步：验证抗体对应信号肽组合的有效性

使用LADA人群队列样本(n＝77)对信号肽组合进行验证。该LADA人群队列中包含健康人(n＝26)和LADA患者(n＝51)，主要基于临床诊断数据(如血清中血糖和胰岛素的水平)由临床医生进行分组。

1.使用多肽芯片定性检测LADA人群血清样本中的抗体

血清样本在有/无封闭液的条件下，进行1000倍稀释上样，使用抗人二抗进行荧光成像。每个样本进行3个技术重复。

具体实验流程和具体数据预处理流程参见第一步中。

Note：(1)如需要用到不同wafer，确保不同wafer芯片上包含不同分组的样本；(2)在不同wafer的芯片中重复检测6例样本作为QC(3例control和3例LADA)，用于后期数据校正；(3)样本在芯片内尽量随机排布，三个技术重复不要出现在同一行，不同分组尽量可以随机分布，在实验同事操作适宜的情况下尽量随机排布所有样本。

2.利用血清实验的数值矩阵验证抗体对应的信号肽

首先对多肽芯片检测平台产生的信号值进行Log10数值变换及数据标准化。针对GADA，IAA和IA2A抗体，每一条信号肽的强度分别与0.1，0.3和0.1进行比较，如信号肽的荧光强度大于上述数值，则认为该条信号肽有信号，如信号肽的荧光强度小于上述数值，则认为该条信号肽无信号。统计这有信号的信号肽数目，如高于阈值(6，2和5条信号肽，对应GADA,IAA和IA2A抗体)即判定抗体检测呈阳性，反之则判定为阴性。基于这样的算法分别判定LADA人群中有多少例被判定为抗体阳性。

3.使用商用ELISA试剂盒检测LADA人群血清样本中的抗体

同时使用3种抗体的IVD商用ELISA抗体检测试剂盒检测同一批样本(京械注准20192400371，京械注准20172400099，京械注准20172400097，北京贝尔生物工程有限公司)，比对检测结果，确定信号肽组合的检测性能。

具体实验流程遵照试剂盒说明书。

4.多抗体联合检测抗体

按照3种抗体中的任意一种被检测为阳性，该样本即被判定为LADA阳性的规则，比较上述3种不同技术方法的检测结果。

5.结果

GADA抗体在使用ELISA和多肽芯片的准确率分别为39.0％和49.48％(其中阳性率为15.7％vs 25.5％，阴性率为84.6％vs 96.2％)，IAA抗体的准确率分别为37.7％和46.8％(其中阳性率为13.7％vs 19.6％，阴性率为84.6％vs 100％)，IA2A抗体的准确率分别为37.7％和53.2％(其中阳性率为5.9％vs 29.4％，阴性率为100％vs 100％)。

本发明中用到的验证队列是LADA人群队列。根据Immunology of DiabetesSociety(IDS)协会提出的LADA诊断标准，临床上胰岛相关自身抗体呈阳性是LADA诊断的重要标准之一，其中GADA，IAA和IA2A是LADA疾病最重要的自身抗体。然而，这些自身抗体在LADA患者血清中的出现存在个体差异，且每种抗体出现的时间不尽相同，抗体水平与临床特征等高度相关，如发病年龄，患病时间等。据报道，GADA在LADA患者中较为常见，约占总LADA患者的80.7％，单一自身抗体呈阳性的概率约为88.9％，而IA2A抗体只出现在少部分人群中，约占LADA患者的27.3％。由于受限于这几种抗体ELISA检测试剂盒的灵敏度，准确性低等问题，难以确定血清样本中抗体的真实结果，因此我们进一步比较了三种抗体联合检测的结果，即LADA组中3种抗体中至少有一种抗体被检测为阳性的概率。综合3种抗体联合检出的结果更具有比较不同技术性能的意义，和临床实际的应用价值。

结果如图4和下表所示，图4示出了LADA血清样本检测的结果分布，3种抗体(GADA，IAA，IA2A抗体)在使用商用ELISA试剂盒和多肽芯片的准确率分别为41.6％和84.4％(其中阳性率为19.6％vs 78.4％，阴性率为84.6％vs 96.2％)。

表4：

因此，基于LADA人群队列血清样本的检测数据结果，可以看到多肽芯片筛选得到的信号肽可以用于检测糖尿病相关的3种自身抗体，并且结果明显优于商用ELISA抗体检测试剂盒的检出结果，包含准确率，假阳性率，假阴性率，真阳性率和真阴性率。

第三步：信号肽组合的性能验证

1.实验设计及流程

(1)准确度

阴性参考品：取10例健康人的阴性血清样本，不含有待检测的3种抗体。

阳性参考品：将抗体加入阴性血清样本(n＝3)中，制备出含高、中、低4个浓度水平抗体呈阳性的血清样本，每种抗体共计12例抗体阳性血清样本。

使用3个批次的芯片，每例样本在每个批次芯片中各检测一次。计算正确检出率。

(2)最低检测限

参考品：将抗体加入阴性血清样本中制成抗体呈阳性的血清样本。用样本稀释液分别稀释10、100、500和1000倍，得到4个浓度梯度。根据实验操作流程，再将4个浓度梯度的样本分别稀释1000倍后上样。

使用3个批次的芯片，每例样本在每个批次芯片中各检测10次。要求10次检测结果中至少出现9次阳性所对应的最低浓度为最低检测限。

(3)交叉反应

取抗原相近或疾病症状相近的临床血清样本，共计144例。包含二型糖尿病(n＝80例)，系统性红斑狼疮(n＝18例)，干燥症(n＝10例)，非酒精脂肪肝(n＝11例)和非酒精脂肪肝炎(n＝25例)。

(4)精密度

参考品：将抗体加入阴性血清样本中制成抗体阳性的血清样本。

使用3个批次的芯片，每例样本在每个批次芯片中各检测3次。计算批次内和批次间的精密度(CV％)。

2.统计分析

数据分析使用软件python version 3.7.6，包括数据转换，数据标准化，数据分析等。

3.结果

信号肽组合在GADA，IAA和IA2A抗体检测的性能表现结果如下表：

表5：

以上结果是以糖尿病相关自身抗体为例，说明基于多肽芯片技术可以高准确地检测自身免疫病相关自身抗体。从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

-可以一次性检测多个LADA相关的自身抗体。

-检测技术的灵敏度高，特异性强，准确率高。

-样本用量少，50uL可以完成所有检测。

-实验方法更加环保且安全性高。

-相比于蛋白芯片，多肽芯片的成本低。

-可以实验自动化和一体化。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海碳云智能科技有限公司

<120> 多肽、其组合物、包含其的试剂盒及其应用

<130> PN145731SZTY

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> IA2A信号肽

<400> 1

Lys Ala Asp Ser Pro Ala Lys His Leu Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> IA2A信号肽

<400> 2

His Ser Ser Ala Pro His Phe Glu Asp

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> IA2A信号肽

<400> 3

Glu Asn Pro Lys Trp Gln Lys Gly

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> IA2A信号肽

<400> 4

Arg Asp Pro Lys Ala Phe Gly Pro Gly

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> IA2A信号肽

<400> 5

Trp Gly Ser Gly Lys Ala Asp Gly

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> IA2A信号肽

<400> 6

Pro Glu Asp Ala Gly Tyr Lys Trp Ser Asp

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<223> IA2A信号肽

<400> 7

Leu Ala Asp Arg Pro Arg Gly

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> IA2A信号肽

<400> 8

Tyr Ser Gly Ala Pro Gln Arg Ala Leu Ser Asp

1 5 10

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> IA2A信号肽

<400> 9

Ala Gly Phe Pro Lys Lys Asp Gly

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> IA2A信号肽

<400> 10

Val Gln Val Pro Asn Leu Glu Asn Gly

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> GADA信号肽

<400> 11

Trp Ser Gln Tyr His Glu Glu Asp

1 5

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> GADA信号肽

<400> 12

Asn His Val Glu Leu Ala Val Lys Val Glu

1 5 10

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(6)

<223> GADA信号肽

<400> 13

Asp Glu His Tyr Phe Gly

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> GADA信号肽

<400> 14

Leu Lys Trp Trp Gln His Leu Glu

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<223> GADA信号肽

<400> 15

Ser Asn Tyr Glu Tyr His Gly

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> GADA信号肽

<400> 16

Leu Phe Phe His Gln Lys Ser Gly

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> GADA信号肽

<400> 17

Asn Val Glu Leu Pro Gly His Glu Asp

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> GADA信号肽

<400> 18

Glu Arg Asn Lys His Asp Gly Leu Glu Asp

1 5 10

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> GADA信号肽

<400> 19

Trp Gly Ala Arg Trp Lys Ala Gly

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> GADA信号肽

<400> 20

Tyr Gly Trp Arg Gly Arg Lys Phe Glu

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> IAA信号肽

<400> 21

Leu Ser Phe Leu Asn Gln Arg Gly

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(7)

<223> IAA信号肽

<400> 22

Arg Ala Tyr Leu Asp Pro Gly

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(9)

<223> IAA信号肽

<400> 23

Arg Arg Tyr Leu Phe Gly Ser Glu Asp

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(8)

<223> IAA信号肽

<400> 24

Leu Ser Ser Leu Trp Gln Lys Gly

1 5

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<223> IAA信号肽

<400> 25

Arg Lys Arg Leu Phe Glu Gly Phe His Asp Gly

1 5 10

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽能够特异性结合自身抗体，所述自身抗体选自IA2A、GADA和IAA中的任意一种；

所述多肽特异性结合IA2A，所述多肽选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的任意一条或多条；或者

所述多肽特异性结合GADA，所述多肽选自SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20中的任意一条或多条；或者

所述多肽特异性结合IAA，所述多肽选自SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：25中的任意一条或多条。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为修饰后的肽段；

优选地，所述修饰为化学基团修饰或氨基酸修饰；

优选地，所述化学基团修饰为PEG修饰；

优选地，所述PEG修饰为直链PEG修饰、具有单官能团的PEG修饰或者具有双官能团的PEG修饰；

优选地，所述PEG修饰的位点选自所述多肽的N端、C端、Lys侧链和Cys侧链中的任意一个或多个；

优选地，所述PEG修饰为分子量为500～40000的PEG修饰；

优选地，所述氨基酸修饰为亲水性氨基酸修饰或半胱氨酸修饰；

优选地，所述亲水性氨基酸修饰为在所述多肽的N端、C端或者NC两端添加1-4个亲水性氨基酸，更优选地，所述亲水性氨基酸为Glu、Lys、Ser或Gly；进一步优选地，所述1-4个亲水性氨基酸选自如下任意一种：Glu-Glu、Lys-Lys或Ser-Gly-Ser；

优选地，所述半胱氨酸修饰为在所述多肽的如下任一位置添加半胱氨酸：N端、C端、NC两端或肽链中间；

更优选地，在所述肽链中间添加半胱氨酸包括在所述肽链中间插入一个或多个半胱氨酸，或者一个或多个半胱氨酸以支链形式连接于所述肽链的中间。

3.一种多肽产品，其特征在于，所述多肽产品包括权利要求1或2所述的多肽。

4.根据权利要求3所述的多肽产品，其特征在于，所述多肽产品还包括多肽稳定剂；

优选地，所述多肽稳定剂包括150～180mM NaCl、100～140mM的聚赖氨酸盐酸盐及水；

所述多肽产品为多肽芯片，且所述多肽芯片上的多肽由权利要求1或2所述的多肽组成。

5.一种多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物包括多条权利要求1或2所述的多肽。

6.一种检测自身抗体的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1或2所述的多肽。

7.一种检测自身抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的多肽。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测芯片，所述多肽设置在所述检测芯片上，且所述检测芯片上的多肽由权利要求1或2所述的多肽组成。

9.权利要求1或2所述的多肽在制备检测自身抗体的试剂盒中的应用。

10.一种检测自身抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：

将待测样本与多条权利要求1或2所述的多肽进行孵育，得到孵育产物；

向所述孵育产物中加入荧光二抗；

检测并统计多条所述多肽中荧光信号强度满足信号阈值的多肽的条数；

若所述条数满足阳性多肽种类数量阈值，则判定所述待测样本中的所述自身抗体为阳性。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述信号阈值通过如下至少一种方式确定：

1)检测一批阴性样本，以所述阴性样本的检测结果中多条所述多肽的荧光信号强度的最高值为基础确定，优选地，所述信号阈值即为所述最高值，或所述信号阈值为n1倍所述最高值，n1＞1；

2)检测一批阳性样本，以所述阳性样本的检测结果中多条所述多肽的荧光信号强度的最低值为基础确定，优选地，所述信号阈值即为所述最低值，或所述信号阈值为n2倍所述最低值，n2＜1。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述信号阈值和所述阳性多肽种类数量阈值通过如下方式确定：

检测阴性样本和阳性样本，基于所述阴性样本和所述阳性样本的检测结果中多条所述多肽的ROC工作曲线的约登指数和真阴性符合率来确定所述信号阈值和所述阳性多肽种类数量阈值；

优选地，所述自身抗体为GADA，优选所述阳性多肽种类数量阈值为6；

优选地，所述自身抗体为IAA，优选所述阳性多肽种类数量阈值为2；

优选地，所述自身抗体为IA2A，优选所述阳性多肽种类数量阈值为5；

优选地，将所述多肽相应特征的荧光信号强度转换为对数值进行计算和统计，更优选转换为log10值进行计算。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，多条所述多肽为检测一种所述自身抗体的多肽，或者

多条所述多肽为检测两种或两种以上自身抗体的多肽，且检测每一种所述自身抗体的多肽为多条；

优选地，当多条所述多肽为检测两种或两种以上自身抗体的多肽时，且每一种所述自身抗体均为同一疾病相关抗体时，则任意一种所述自身抗体被判定为阳性时，则进一步确定所述待测样本为阳性样本；

优选地，多条所述多肽设置在检测芯片上，且所述检测芯片上的多肽由多条权利要求1或2所述的多肽组成。