CN114381423A - 一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法。该方法包括：将胶原冻干材料分别放入含有小室的多孔板的单孔里，将正常成纤维细胞悬液滴到胶原冻干材料上，孵育，多孔板的上室种植瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入培养液培养，使得正常成纤维细胞向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化。该方法构建简单，成本低，材料来源容易，构建得到的瘢痕疙瘩模型良好，对临床研究工作具有重要意义。

Description

一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学的技术领域，特别涉及一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法。

背景技术

瘢痕疙瘩是皮肤自发地或者是创伤愈合过程失调后产生的病理性瘢痕。它们的特征是成纤维细胞的异常增殖和胶原过度沉积。临床上表现为超过原伤口界限的、持续的、渐进性的向周围正常皮肤组织呈侵袭样生长，不断破坏周围正常的皮肤附属器。临床统计学数据发现，其好发于胸骨前、肩背部、双下颌部等张力较大的部位，同时耳垂部瘢痕疙瘩也较为常见，而且瘢痕疙瘩的发生也以黄色人种和黑色人种多见。由于缺乏研究瘢痕疙瘩的良好的模型，所以瘢痕疙瘩形成和发展机制的研究也受到一定程度的限制，进而导致临床上缺乏有效地的治疗手段和方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法，以填补现有技术的空白。

本发明提供一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法，包括：

将胶原冻干材料分别放入含有小室的多孔板的单孔里，将正常成纤维细胞悬液滴到胶原冻干材料上，孵育，多孔板的上室种植瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入培养液培养，使得正常成纤维细胞向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化，得到瘢痕疙瘩模型。

优选地，所述多孔板为六孔板。

优选地，所述正常成纤维细胞悬液是将正常成纤维细胞先消化离心，按照0.5×10⁶-1×10⁶个/ml重悬获得。

优选地，所述正常成纤维细胞悬液滴加量为0.2-0.4微升/mm³。

优选地，所述正常成纤维细胞按照(2-4)×10²个/mm³滴到胶原冻干材料。

优选地，所述将正常成纤维细胞悬液滴到胶原冻干材料后滴加培养液，让材料保持湿润。

优选地，所述孵育时间为3-4h。

优选地，所述瘢痕疙瘩成纤维细胞按照0.5×10⁵-1×10⁵种植到多孔板中的上室内。

优选地，所述多孔板的上室和下室之间可透膜的孔径大小要求上层细胞不能穿过。

优选地，所述培养液为含10％FBS、10万U/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养液。

优选地，所述培养时间根据材料大小确定。

优选地，所述培养后的材料胶原冻干材料更换至空白多孔板中继续培养。

本发明通过将瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞共培养之后，正常皮肤成纤维细胞开始具有瘢痕疙瘩成纤维细胞的特性，即正常皮肤成纤维细胞开始向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化。本发明在体外通过三维共培养的方式构建瘢痕疙瘩，这对基础和临床研究工作具有重大的意义。

目前还没有一种简单方便的可用于基础研究的瘢痕疙瘩模型，现有的最常用的是直接利用瘢痕疙瘩组织块进行研究，但是由于瘢痕疙瘩的个体差异性和复杂性，所使用的瘢痕疙瘩组织块中所含瘢痕疙瘩成纤维细胞的数量有限，培养时间较久，不仅重复性差，且不利于储存和再利用。而本发明通过构建取得的瘢痕疙瘩模型，一是填补了瘢痕疙瘩模型的空缺，二是可重复性增强，这为技术人员对瘢痕疙瘩的基础研究提供了强有力的基础。

有益效果

本发明体外瘢痕疙瘩模型构建简单，重复性强，方便制作、储存和运输，成本低，材料来源容易，构建得到的瘢痕疙瘩模型良好，对临床研究工作具有重要意义。

附图说明

图1为本发明体外构建瘢痕疙瘩模型的共培养体系示意图，其中A为六孔板小室示意图，B为单孔示意图，1为transwell小室，2为上室，3为下室，4为单细胞层，5为可透膜，灰色代表培养基。

图2为本发明的瘢痕疙瘩成纤维细胞诱导正常成纤维细胞向其转化的基因检测图。分别检测了胶原1(COL1)、胶原3(COL3)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、转录生长因子β1(TGF-β1)、转录生长因子β3(TGF-β3)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、白介素-6(IL-6)和血管内皮生长因子(VEGF)。

图3为本发明空白对照组(CTRL)、阴性对照组(UP-NF)、实验组(UP-KF)划痕处理48小时后，在同一观察点处显微镜拍照记录细胞生长情况图。

图4为本发明空白对照组(CTRL)、阴性对照组(UP-NF)、实验组(UP-KF)细胞凋亡率图，其中A为流式检测图，B为流式检测结果统计图。

图5为本发明对照组(UP-NF)和实验组(UP-KF)的HE染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明对于试剂其实没有特别的要求，常规使用的都可以。本发明实施例所使用的是：

高糖DMEM培养基 Gibco,Gland Island,NY,美国

胎牛血清(FBS) Hyclone,美国

青、链霉素溶液 Gibco,Gland Island,NY,美国

本发明实施例将瘢痕疙瘩成纤维细胞记为KF，正常成纤维细胞细胞记为NF。

实施例1

1、瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的来源：

本实施例所使用的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织源于手术切除，瘢痕疙瘩患者的年龄均在25到60岁之间，正常皮肤组织来源于儿童包皮环切术后。

2、成纤维细胞的获取：

将获得的瘢痕疙瘩标本用氯霉素冲洗3遍，然后用PBS缓冲液振荡洗涤3遍，以去除血渍及其他组织碎片；无菌条件下用刀片切去表皮，用手术剪去除皮下脂肪组织；正常皮肤组织使用中性蛋白酶浸泡过夜，去掉表皮，保留真皮组织。将得到的各组真皮部分剪至1×1mm²大小，PBS振荡洗涤1遍后加入0.2％的I型胶原酶，37℃恒温振荡消化，2～4h后收获真皮层细胞。消化产物以200目尼龙筛过滤后，细胞悬液1500rpm离心5min，弃上清。加入PBS振荡混匀，1500rpm离心5min，弃上清；取少量细胞，加入台盼兰(Trypan Blue)溶液进行拒染试验，用血球记数板进行活细胞计数。

3、瘢痕疙瘩细胞计数：

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数；将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片待用。取5μl细胞悬液，加入45μl台盼兰(Trypan Blue)溶液进行拒染试验，用吸管吸取稀释后的细胞悬液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。多余培养液可用滤纸吸去。细胞计数公式为：细胞数/ml＝4个小方格细胞总数/4×10000×稀释倍数。

4、细胞原代培养

将以上的细胞悬液按每10cm培养皿接种0.1×10⁶个细胞密度接种，加入10ml含10％FBS、10万U/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养液，5％CO₂、饱和湿度、37℃恒温孵育，视细胞生长情况每隔2－3天换液一次。

5、细胞传代培养

镜下观察细胞80％左右融合后，吸出培养液，加入PBS 10ml清洗2次；吸去PBS后加入0.25％胰蛋白酶1.5ml，在显微镜下观察；待胞质回缩、细胞透亮、细胞间隙变大时，立即加入含10％FBS的DMEM培养液3ml终止消化；用移液枪轻轻吹打尚未与皿底分离的细胞，并用细胞刮除器轻轻将细胞从培养皿上刮下，将细胞悬液收集到离心管中，1500rpm离心5min后弃上清液；沉淀细胞用DMEM培养液重悬，定容至10ml；仍按每100mm培养皿接种0.1×10⁶个细胞密度接种，37℃恒温、混合气体(5％CO2和95％O2)环境中继续培养。

6、细胞基因检测

本实验检测所使用的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常成纤维细胞细胞均为第1-3代，实验分为三组，一组为空白对照组(CTRL)，六孔板中没有小室；第二组为实验对照组(UP-NF)，六孔板中以及小室内种植正常成纤维细胞细胞；第三组为实验组(UP-KF)，小室内为瘢痕疙瘩成纤维细胞，六孔板中为正常成纤维细胞细胞。将上述获得的正常成纤维细胞细胞按照上述实验分组：3x10⁵个/孔种植到六孔板，10⁵个/孔种植到上室；将瘢痕疙瘩成纤维细胞按照10⁵个/孔种植到六孔板中的上室内(实验使用的六孔板和小室如图1所示)，培养液含10％FBS、10万U/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养液。

将上述体系共培养2天后，取六孔板中的“正常成纤维细胞细胞”进行检测：

①细胞总RNA抽提

吸去培养液，4℃PBS洗涤两次，加入Trizol 0.5-1ml，冰浴10min；收集液体至1.5ml离心管中，加入氯仿400μl，充分振荡15s-1min，冰浴15min；4℃、12000rpm离心15min；小心将上清液移入另一清洁离心管中，加入等体积的异丙醇，温和颠倒混匀，冰浴10min；4℃、12000rpm离心10min；小心弃上清，加入含0.01％DEPC的75％乙醇1ml洗涤；4℃、7500rpm离心5min；小心弃上清，室温风干5min后，加入0.01％DEPC水20μl溶解RNA；核酸分析仪检测OD260/OD280比值，确定浓度和纯度，-80℃保存备用。

②逆转录反应(RT)

配制20μl反应体系：25mM MgCl2 4μl，5×逆转录缓冲液4μl，10mM dNTP 2μl，40U/μl RNase抑制剂0.5μl，5U/μl AMV逆转录酶0.5μl，200ng/μl Oligo dT-Adaptor Primer 1μl，2μg，加无RNase水至20μl。反应条件：30℃10min，42℃60min，99℃5min，5℃5min。反应产物cDNA置-20℃保存。

③引物序列

④聚合酶链式反应(PCR)

PCR反应体系为：ddH2O 7μl，MIX 10μl，cDNA 1μl，前引物1μl，后引物1μl，反应条件为95℃5min、95℃30s、62℃30s、72℃45s、72℃10min为一个循环，共40个循环。反应产物若不及时电泳则置-20℃保存。实验重复三次。图2表明：现NF经KF诱导后，基因表达开始KF转化的现象。如图所示，CTRL为空白对照组，UP-NF为阴性对照组，UP-KF为实验组，经KF诱导后，NF的TGF-β1、COL1、COL3、MMP2、MMP13、TIMP1、IL-6和VEGF的表达均匀升高，而这些基因在KF的表达也是升高的。另外，KF中表达降低的TGF-β3在诱导后的NF中表达也明显下降。因此，NF经KF诱导后发生了那些改变，仍需要继续检测。

7、划痕实验

按照上述分组种植细胞，待六孔板中细胞长成单层即弃去培养液，用1000微升的枪头在六孔板每孔中央划出一划痕，洗涤三次去除死细胞后显微镜下拍照。处理48小时后，在同一观察点处显微镜拍照记录细胞生长情况，实验重复三个细胞样本。利用Image Pro-Plus 6.0软件测量每孔多个点划痕间距，取均值。如图3所示，经KF诱导48小时后，UP-KF组所显示的NF迁移能力增加，迁移速率大约是对照组的3倍左右。这些实验均在提示KF在诱导NF向其转化。

8、细胞凋亡实验

按照上述分组种植细胞，培养48小时后，收集六孔板中的正常成纤维细胞细胞，加入1ml预冷的PBS重悬,洗涤一次，4℃下1500r/min离心弃上清，再分别加入500μl的BindingBuffer悬浮细胞，加入Annexin V-FITC10μl室温避光反应10min，再加入Propidium Iodide10μl，室温避光反应10min后，冰浴阻止反应。上机FCM分析细胞凋亡率。凋亡二维点图可分为四个象限，左上象限为死亡细胞，左下象限为活细胞；右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。实验结果如图4，可知UP-KF组的NF死亡率明显下降，这一结果也提示我们诱导后的NF生长旺盛，增殖能力可能同样增强。这些实验也在提示我们KF在诱导NF向其转化。

9、体外构建瘢痕疙瘩

基于以上基础，利用瘢痕疙瘩成纤维细胞诱导正常成纤维细胞细胞向其转化的特性，进行体外构建瘢痕疙瘩。利用胶原冻干材料作为支架材料，将正常成纤维细胞细胞作为种子细胞，如上将实验分为两组，具体实验过程如下：

对照组：随机选取六块材料放到空白六孔板里；实验组：同样将六块材料放到六孔板里。接下来准备细胞：正常成纤维细胞先消化离心，按照10⁶个/ml重悬，将10微升悬液滴到实验对照组和实验组的材料上，10微升/块，滴完细胞以后，可以加滴一点培养液，让材料保持湿润，这样孵育3-4小时；然后按照上述所述，每组六孔板的上室分别种植正常成纤维细胞细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入1ml培养液(高糖DMEM培养基,含10％FBS、10万U/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养液)培养。10天后每组取出三块样本固定包埋并染色。剩余材料更换至空白六孔板中继续培养4天，后取材包埋、染色。图5结果显示无论是共培养的第10天还是去除诱导条件，实验组(UP-KF)的胶原纤维相比对照组的明显增加，同时也更加紊乱，这也从另一个方面证明本发明的构建是可行的。目前该实验的不足之处：由于材料脱片严重，HE染色中未见到明显的细胞。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院

<120> 一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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ggcggccagg gctccgaccc 20

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Claims (9)

1.一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法，包括：

将胶原冻干材料分别放入含有小室的多孔板的单孔里，将正常成纤维细胞细胞悬液滴到胶原冻干材料上，孵育，多孔板的上室种植瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入培养液培养，使得正常成纤维细胞向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化，得到瘢痕疙瘩模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常成纤维细胞悬液是将正常成纤维细胞先消化离心，按照0.5×10⁶-1×10⁶个/ml重悬获得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常成纤维细胞悬液滴加量为0.2-0.4微升/mm³。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常成纤维细胞按照(2-4)×10²个/mm³滴到胶原冻干材料；将正常成纤维细胞悬液滴到胶原冻干材料孵育后滴加培养液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育时间为3-4h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述瘢痕疙瘩成纤维细胞按照0.5×10⁵-1×10⁵个/孔种植到多孔板中的上室内。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多孔板的上室和下室之间可透膜的孔径大小要求上层细胞不能穿过。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液为含10％FBS、10万U/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养后的材料胶原冻干材料更换至空白多孔板中继续培养。

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