CN105420336A - 一种利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-a的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法，具体是将微生物先预培养12～48？h后，再将铁冬青酸加入培养液中，在相同的条件下继续转化培养24～168？h，对培养液进行分离提纯得到毛冬青酸-A。本发明的方法为采用微生物转化法对铁冬青酸进行结构修饰提供了一个新思路，可以较大程度地改善其溶解性、生物利用度、活性；而且该方法以微生物代谢过程中产生的多种酶为生物催化剂，反应条件温和、工艺简单、转化效率较高、具有高度的专一性和选择性，分离纯化步骤简单，产物毛冬青酸-A的纯度可达98.0%以上，培养基价格低廉、来源广泛，菌种易于获得，易于工业化大规模生产。

Description

一种利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法

技术领域

本发明属于天然产物及微生物转化技术领域。更具体地，涉及一种利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法。

背景技术

铁冬青酸（Rotundicacid），为从冬青属植物铁冬青（IlexrotundaThunb.）中分离得到的乌苏烷型三萜皂苷类成分，在原植物中的含量高达5.0%（朱锦萍，杨宝，杨滔等.HPLC法同时测定救必应药材中4种成分的含量[J].中药新药与临床药理，2015，26(4):558-560.）。现代药理学研究表明其具有较好的抗肿瘤、降血脂、抗血栓、抗炎的活性，但是较差的溶解性和生物利用度却在一定程度上限制了其临床应用。因此，有必要对其进行适当的结构修饰，以期改善其溶解性和生物利用度，扩大其临床应用。

目前，仅有一篇文献报道了对其进行结构修饰，详细来说就是采用化学方法制备其氨基醇类、氨基酸类、酰氧类、酰腙类、双烯类、芳香胺类衍生物，结果表明所合成的大多数衍生物的溶解性、生物利用度、抗肿瘤活性均较铁冬青酸有显著的提高（赫玉芳.救必应酸的制备及其衍生物的设计、合成和抗肿瘤活性研究[D].吉林大学，2013）。但是上述制备方法的反应过程复杂、条件要求高、所用试剂毒性大、副产物较多、产率较低，实际应用中仍具有有很大的局限性。

微生物转化是指利用微生物代谢过程中产生的一系列酶对外源性的底物进行选择性结构修饰的过程，主要包括氧化、还原、水解、酯化、甲基化等反应。该方法具有较好的立体性和区域选择性，能够对非活性碳原子进行结构修饰，反应条件温和、成本低，转化产物的分离纯化过程相对简单，这些优点均是化学方法所不具备的。另外，某些微生物，特别是丝状真菌，具有与人类似的细胞色素P450酶系，这在一定程度上提示其可以模拟药物在体内的代谢转化过程。目前，已有较多文献报道采用丝状真菌对乌苏烷型的三萜类化合物进行结构修饰，结果原型物的生物利用度有较大程度的改善或是得到了一些活性较好的衍生物。

但是目前尚未见有采用微生物转化法对铁冬青酸进行结构修饰的研究和报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有铁冬青酸应用的局限及其结构改造技术的不足，提供一种利用微生物将铁冬青酸（Rotundicacid）转化为毛冬青酸-A（IlexolicacidA）的方法。该方法以微生物产生的多种酶为生物催化剂，条件温和、工艺简单、效率较高，具有高度的专一性和选择性，所得转化产物毛冬青酸-A的纯度在98.0%以上。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法，是将铁冬青酸加入微生物培养液中，经过转化培养得到毛冬青酸-A。

具体地，上述利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法是将微生物先预培养12～48h后，再将铁冬青酸加入培养液中，在相同的条件下继续转化培养，对培养液抽滤，滤渣用甲醇超声提取，合并回收滤液和提取液，得转化浸膏，再利用乙酸乙酯或正丁醇萃取后分离纯化得到毛冬青酸-A。

其中，优选地，所述微生物的菌种为总状共头霉AS3.264、总状共头霉AS3.25、短刺小克银汉霉AS3.910、短刺小克银汉霉AS3.970、短刺小克银汉霉AS3.153、刺孢小克银汉霉轮生变种AS3.2004或燕麦镰孢AS3.4594中的任意一种。

更优选地，所述微生物的菌种为总状共头霉AS3.264、短刺小克银汉霉AS3.910、短刺小克银汉霉AS3.970或短刺小克银汉霉AS3.153。

另外，更具体地，上述利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法包括如下步骤：

S1.活化菌种：将微生物菌种接种于斜面培养基上，于25～35℃条件下静置培养24～120h；

S2.制备种子培养液：将步骤S1中斜面培养基上的孢子接种至液体培养基中，于25～35℃、100～200rpm/min条件下恒温振荡培养12～48h，得到种子培养液；

S3.预培养：按照1～15%（优选5%）的接种量，将步骤S2的种子培养液接种至液体培养基中，于25～35℃、100～200rpm/min条件下恒温振荡预培养12～48h；

S4.转化培养：在步骤S3的预培养液中加入铁冬青酸溶液，使铁冬青酸在体系中的终浓度为0.05～0.50g/L，然后再于与步骤S3相同的培养条件下转化培养24～168h；

S5.步骤S4转化培养后的培养液经过抽滤提取回收得到转化浸膏；

S6.步骤S5的转化浸膏经过分离纯化得到转化产物。

上述获得的转化产物采用HR-ESI-TOF-MS和NMR法进行结构鉴定为毛冬青酸-A。

其中，优选地，步骤S5所述转化浸膏的获得方法为：步骤S4转化培养后的培养液经过抽滤，滤渣用1～3倍量（优选为2倍量）的甲醇超声提取1～4次（优选为3次），每次0.5～1.5h（优选为1h），合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏。

优选地，所述超声提取的条件为：功率为200～280W，频率为30～50kHz。

更优选地，所述超声提取的条件为：功率为240W，频率为40kHz。

优选地，步骤S6所述分离纯化的方法如下：利用乙酸乙酯或正丁醇对步骤S5的转化浸膏进行萃取，萃取物经反相柱色谱分离，依次用4～7倍柱体积的50%、60%、70%、80%的甲醇-水梯度洗脱，收集并回收60%甲醇-水洗脱部分，甲醇重结晶即得转化产物毛冬青酸-A。

优选地，所述反相柱色谱分离的色谱柱中装有250.0g反相硅胶或450.0g反相硅胶。

另外，优选地，当所述微生物为总状共头霉AS3.264或总状共头霉AS3.25时，步骤S1所述斜面培养基为综合PDA斜面培养基；当所述微生物为短刺小克银汉霉AS3.910、短刺小克银汉霉AS3.970、短刺小克银汉霉AS3.153、刺孢小克银汉霉轮生变种AS3.2004或燕麦镰孢AS3.4594时，步骤S1所述斜面培养基为PDA斜面培养基。

所述综合PDA斜面培养基的配方为：马铃薯200.0g切成小块，加蒸馏水煮沸30min后过滤，滤液用蒸馏水定容至1.0L，再加入蔗糖20.0g、琼脂20.0g、KH₂PO₄3.0g、维生素B1微量，充分加热溶解后分装于试管中，121℃灭菌30min，取出倾斜40°放置，冷却、凝固即得。

所述PDA斜面培养基的配方为：在上述综合PDA斜面培养基配方的基础上减去KH₂PO₄和维生素B1，充分加热溶解后分装于试管中，121℃灭菌30min，取出倾斜40°放置，冷却、凝固即得。

优选地，步骤S2或步骤S3所述液体培养基为PDA液体培养基。

所述PDA液体培养基的配方为：在上述PDA斜面培养基配方的基础上减去琼脂，121℃灭菌30min后冷却即得。

优选地，步骤S4所述铁冬青酸溶液的溶剂为无水乙醇、二甲基亚砜或丙酮等细胞毒性较小的有机溶剂中的一种或几种，且体系中有机溶剂的最终含量小于3.0%。

更优选地，步骤S4所述铁冬青酸溶液的溶剂为无水乙醇或二甲基亚砜，且体系中有机溶剂的最终含量小于1.0%。

另外，优选地，步骤S1中所述静置培养的条件为28℃静置培养96～120h。

优选地，步骤S2所述液体培养基为30mL。

优选地，步骤S3所述恒温振荡培养的条件为28～30℃、140～170rpm/min恒温振荡培养24h。

优选地，步骤S3所述恒温振荡预培养的条件为28～30℃、140～170rpm/min恒温振荡预培养24h。

优选地，步骤S4所述铁冬青酸在体系中的终浓度为0.10～0.20g/L。

优选地，步骤S4所述转化培养的时间为144～168h。

根据本发明上述制备方法获得的转化产物毛冬青酸-A的纯度可达到98.0%以上。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供了一种利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法，为采用微生物转化法对铁冬青酸进行结构修饰提供了一个新思路，而且可以较大程度地改善其溶解性、生物利用度、活性，同时还可以为后续体内过程的研究提供理论参考和代谢产物的对照品。

（2）本发明方法的转化过程中所选用的培养基价格低廉、来源广泛，菌种易于获得。

（3）本发明方法的转化反应具有高度的专一性和选择性，所利用的菌种能够产生铁冬青酸的C-21位羟基化化合物。

（4）本发明的方法反应条件温和、工艺简单、转化效率较高，直接采用反相色谱和重结晶法分离纯化转化产物，纯度可达98.0%以上，分离纯化步骤简单、产物纯度高、易于工业化生产。

附图说明

图1为利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的转化反应示意图。

图2为转化产物纯度分析的高效液相色谱图。

图3为转化产物的HR-ESI-TOF-MS图谱。

图4为转化产物的¹H-NMR（500MHz,C₅D₅N）图谱。

图5为转化产物的¹³C-NMR（125MHz,C₅D₅N）图谱。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1利用总状共头霉AS3.264将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A

1、具体转化过程如下：

（1）活化菌种：将冷冻保藏的总状共头霉AS3.264接种于18支综合PDA斜面培养基上，于28℃条件下静置培养96h；

（2）制备种子培养液：将步骤（1）中斜面培养基上的孢子分别接种至18个100mL规格的三角烧瓶中，每个三角烧瓶中装有30mLPDA液体培养基，然后于28℃、170rpm/min条件下恒温振荡培养24h得到种子培养液；

（3）转化培养：以5%的接种量将步骤（2）中的种子培养液接种至18个1000mL规格的三角烧瓶中，每个三角烧瓶中装有600mLPDA液体培养基。于28℃、170rpm/min条件下恒温振荡预培养24h后每瓶加入5.217mL铁冬青酸溶液（23.0mg/mL，无水乙醇溶解），使其在体系中的终浓度为0.20g/L；然后再于相同条件下转化培养144h后抽滤，滤渣用2倍量的甲醇超声提取3次，每次1.0h，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏29.0g；

（4）分离纯化：将上述转化浸膏分散于2.0L水中，用乙酸乙酯进行萃取（2.0L×4），萃取液减压回收得到浸膏16.0g。萃取浸膏经反相柱色谱分离（色谱柱中装有450.0g反相硅胶），依次用6倍柱体积的50%、60%、70%、80%的甲醇-水梯度洗脱，收集并回收60%甲醇-水洗脱部分，甲醇重结晶即得转化产物650.0mg，计算转化率为30.1%。采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定转化产物的纯度为99.0%（如附图2所示），色谱条件为：岛津LC-20A液相色谱仪；Kromasil100-5C₁₈色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相为乙腈-0.02%三氟乙酸水（30：70）；体积流量为1.0mL/min；柱温30℃，进样量为5μL，检测波长为210nm。

2、产物毛冬青酸-A的结构鉴定：无色针状结晶（甲醇），薄层检测10%硫酸乙醇显紫红色，HR-ESI-TOF-MSm/z503.3362[M-H]^-(calcdforC₃₀H₄₇O₆,503.3378)（如附图3所示）。¹H-NMR(500MHz,C₅D₅N)（如附图4所示）δ:5.67(1H,t,J=3.3Hz,H-12),4.46(1H,td,J=10.4,3.2Hz,H-21),4.21(1H,dd,J=16.9,7.5Hz,H-3),4.19(1H,d,J=10.1Hz,H-23α),3.74(1H,d,J=10.4Hz,H-23β),3.19(1H,s,H-18),2.84(1H,dd,J=12.4,3.5Hz,H-22α),2.38(1H,t,J=11.7Hz,H-22β),1.63(3H,d,J=6.5Hz,CH₃-30),1.70,1.55,1.16,1.08,1.01(each3H,s,CH₃×5);¹³C-NMR(125MHz,C₅D₅N)（如附图5所示）δ:180.5(C-28),140.4(C-13),128.7(C-12),75.2(C-19),73.8(C-3),68.2(C-23),67.7(C-21),54.8(C-18),50.9(C-20),49.4(C-17),48.9(C-5),48.4(C-22),48.1(C-9),43.2(C-4),42.5(C-14),40.7(C-8),39.1(C-1),37.5(C-10),33.6(C-7),29.8(C-15),28.7(C-29),27.9(C-2),27.5(C-16),24.9(C-27),24.4(C-11),19.0(C-6),17.6(C-26),16.3(C-25),13.4(C-24),11.7(C-30)。

实施例2利用短刺小克银汉霉AS3.910将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A

1、具体转化过程如下：

（1）活化菌种：将冷冻保藏的短刺小克银汉霉AS3.910接种于18支PDA斜面培养基上，于28℃条件下静置培养120h;

（2）制备种子培养液：将步骤（1）中斜面培养基上的孢子分别接种至18个100mL规格的三角烧瓶中，每个三角烧瓶中装有30mLPDA液体培养基，然后于28℃、170rpm/min条件下恒温振荡培养24h得到种子培养液；

（3）转化培养：以5%的接种量将步骤（2）中的种子培养液接种至18个1000mL规格的三角烧瓶中，每个三角烧瓶中装有600mLPDA液体培养基。于28℃、170rpm/min条件下恒温振荡预培养24h后每瓶加入2.609mL铁冬青酸溶液（23.0mg/mL，无水乙醇溶解），使其在体系中的终浓度为0.10g/L；然后再于相同条件下转化培养168h后抽滤，滤渣用2倍量的甲醇超声提取3次，每次1.0h，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏13.9g；

（4）分离纯化：将上述转化浸膏分散于1.0L水，用乙酸乙酯进行萃取（1.0L×4），萃取液减压回收得到浸膏7.3g。萃取浸膏经反相柱色谱分离（色谱柱中装有250.0g反相硅胶），依次用6倍柱体积的50%、60%、70%、80%的甲醇-水梯度洗脱，收集并回收60%甲醇-水洗脱部分，甲醇重结晶即得转化产物375.0mg，计算转化率为34.7%。采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定转化产物的纯度为99.0%，色谱条件同实施例1步骤（4）。

2、结构鉴定：同实施例1。

实施例3利用短刺小克银汉霉AS3.970将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A

1、具体转化过程如下：

（1）活化菌种：将冷冻保藏的短刺小克银汉霉AS3.970接种于18支PDA斜面培养基上，于28℃条件下静置培养120h;

（2）制备种子培养液：将步骤（1）中斜面培养基上的孢子分别接种至18个100mL规格的三角烧瓶中，每个三角烧瓶中装有30mLPDA液体培养基，然后于28℃、170rpm/min条件下恒温振荡培养24h得到种子培养液；

（3）转化培养：以5%的接种量将步骤（2）中的种子培养液接种至18个1000mL规格的三角烧瓶中，每个三角烧瓶中装有600mLPDA液体培养基。于28℃、170rpm/min条件下恒温振荡预培养24h后每瓶加入2.609mL铁冬青酸溶液（23.0mg/mL，无水乙醇溶解），使其在体系中的终浓度为0.10g/L；然后再于相同条件下转化培养168h后抽滤，滤渣用2倍量的甲醇超声提取3次，每次1.0h，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏11.7g；

（4）分离纯化：将上述转化浸膏分散于1.0L水中，用乙酸乙酯进行萃取（1.0L×4），萃取液减压回收得到浸膏7.1g。萃取浸膏经反相柱色谱分离（色谱柱中装有250.0g反相硅胶），依次用6倍柱体积的50%、60%、70%、80%的甲醇-水梯度洗脱，收集并回收60%甲醇-水洗脱部分，甲醇重结晶即得转化产物312.0mg，计算转化率为28.9%。采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定转化产物的纯度为99.0%，色谱条件同实施例1步骤（4）。

2、结构鉴定：同实施例1。

Claims (10)

1.一种利用微生物将铁冬青酸转化为毛冬青酸-A的方法，其特征在于，是将铁冬青酸加入微生物培养液中，经过转化培养得到毛冬青酸-A。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是将微生物先预培养12～48h后，再将铁冬青酸加入培养液中，在相同的条件下继续转化培养，对培养液抽滤，滤渣用甲醇超声提取，合并回收滤液和提取液，得转化浸膏，再利用乙酸乙酯或正丁醇萃取后分离纯化得到毛冬青酸-A。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.活化菌种：将微生物菌种接种于斜面培养基上，于25～35℃条件下静置培养24～120h；

S2.制备种子培养液：将步骤S1中斜面培养基上的孢子接种至液体培养基中，于25～35℃、100～200rpm/min条件下恒温振荡培养12～48h，得到种子培养液；

S3.预培养：按照1～15%（优选5%）的接种量，将步骤S2的种子培养液接种至液体培养基中，于25～35℃、100～200rpm/min条件下恒温振荡预培养12～48h；

S4.转化培养：在步骤S3的预培养液中加入铁冬青酸溶液，使铁冬青酸在体系中的终浓度为0.05～0.50g/L，然后再于与步骤S3相同的培养条件下转化培养24～168h；

S5.步骤S4转化培养后的培养液经过抽滤、提取、回收，得到转化浸膏；

S6.步骤S5的转化浸膏经过分离纯化得到转化产物毛冬青酸-A。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S5所述转化浸膏的获得方法为：步骤S4转化培养后的培养液经过抽滤，滤渣用1～3倍量的甲醇超声提取1～4次，每次0.5～1.5h，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S6所述分离纯化的方法如下：利用乙酸乙酯或正丁醇对步骤S5的转化浸膏进行萃取，萃取物经反相柱色谱分离，依次用4～7倍柱体积的50%、60%、70%、80%的甲醇-水梯度洗脱，收集并回收60%甲醇-水洗脱部分，甲醇重结晶即得转化产物毛冬青酸-A。

6.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述微生物的菌种为总状共头霉AS3.264、总状共头霉AS3.25、短刺小克银汉霉AS3.910、短刺小克银汉霉AS3.970、短刺小克银汉霉AS3.153、刺孢小克银汉霉轮生变种AS3.2004或燕麦镰孢AS3.4594中的任意一种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物的菌种为总状共头霉AS3.264、短刺小克银汉霉AS3.910、短刺小克银汉霉AS3.970或短刺小克银汉霉AS3.153。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述微生物为总状共头霉AS3.264或总状共头霉AS3.25时，步骤S1所述斜面培养基为综合PDA斜面培养基；当所述微生物为短刺小克银汉霉AS3.910、短刺小克银汉霉AS3.970、短刺小克银汉霉AS3.153、刺孢小克银汉霉轮生变种AS3.2004或燕麦镰孢AS3.4594时，步骤S1所述斜面培养基为PDA斜面培养基。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2或步骤S3所述液体培养基为PDA液体培养基。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S4所述铁冬青酸溶液的溶剂为无水乙醇、二甲基亚砜或丙酮中的一种或几种。