CN102220274A

CN102220274A - 巴氏微杆菌xj及应用该菌制备甜菊醇的方法

Info

Publication number: CN102220274A
Application number: CN2011101595631A
Authority: CN
Inventors: 陈育如; 玄燕; 赵乙萱; 刘润薇
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-06-15
Also published as: CN102220274B

Abstract

本发明涉及一种巴氏微杆菌（Microbacterium barkeri）XJ菌株及其应用。所说的巴氏微杆菌XJ，保藏编号为CCTCC NO：M2011182。该菌株可用于制备甜菊醇，具体为将甜菊糖苷或悬钩子苷制成菌培养液或酶转化液，加入适量菌或酶后，在适当装液量、转化温度、pH、时间等条件下，甜菊糖苷或悬钩子苷被转化为甜菊醇，转化液经分离纯化得到高纯度的甜菊醇。本发明提供了一种高效制备甜菊醇的方法。

Description

巴氏微杆菌XJ及应用该菌制备甜菊醇的方法

技术领域

本发明涉及一种制备甜菊醇的新方法，特别是微生物或酶转化甜菊糖苷或悬钩子苷获得甜菊醇的方法。属于药物原料生产应用领域。

背景技术

甜菊糖苷为白色、无嗅的粉末，微溶于乙醇，对热、酸、碱稳定，室温下的溶解度超过40%(王一凡, 任岱, 周风贤等. 甜菊糖食品中营养成分的研究. 中国现代医学杂志, 1997, 7(3): 63-64）。

甜菊糖苷是八种双萜糖甙的混合物，结构通式见表1，R1和R2位可连接不同种类和数量的单糖构成不同成分，其八种成分分别为：甜菊苷（甙，以下苷与甙同义）、甜菊醇双糖甙(steviolbioside)、莱鲍迪甙A (rebaudioside A，RA)、莱鲍迪甙B (rebaudioside B，RB)、莱鲍迪甙C (rebaudioside C，RC)、莱鲍迪甙D (rebaudioside D，RD)、莱鲍迪甙E (rebaudioside E，RE)、杜尔可甙A (dulcoside A，Dul - A)。其不同种类的糖苷在甜度和味质上存在较大的差异。其中以RA口感最好，其甜度为蔗糖的300倍，且甜味纯正无后味，是非常理想的天然甜味剂。而SS的甜度为蔗糖的200倍并带有一定的后苦味道，且呈味比蔗糖慢。SS和RA是甜菊叶中主要甜菊糖苷成分，约占总甜菊糖含量的90%（曹强译, 甜菊糖的特征与有效利用. 杭州食品科技, 1993, 29 (2): 8-11.）。

甜叶悬钩子苷(又名甜茶，Rubusoside)，也称为甜菊二(双）糖苷（甙），是我国南方蔷薇科(Rosaceae)植物悬钩子（甜茶）抽提出来的一种贝壳杉烯双萜苷，分子式C₃₂H₅₀0₁₃，分子量642。甜叶悬钩子苷呈淡黄色或白色粉末，味甜。悬钩子苷在该植物叶子中的含量较高(>5％)，但在植物果实中的含量甚微。悬钩子苷的化学结构与甜菊苷十分相似，结构上仅相差一个葡萄糖基。用巨大芽孢杆菌(Bacillus Megaterium)产生的环糊精葡萄糖基转移酶对悬钩子苷进行改性处理，其甜度能得到改进。我国广西一带有将甜叶悬钩子的叶加工成甜茶饮用，当地居民还有将此植物叶的水浸出液与米粉一起混合制作糕点。悬钩子苷的糖苷配基是甜菊醇(13-羟基异贝壳杉烯酸)，悬钩子苷可经本发明选育的菌转化得到甜菊醇。

甜菊醇(Steviol)为甜菊苷的苷元，分子具有对映-贝壳杉烯型四环二萜骨架结构，而对映-贝壳杉烯型二萜类化合物大多具有广泛的生理活性，如清热解毒，抗菌消炎，抗肿瘤等作用(Fuji K, Node M, Ito N, et al，Terpenoids. L. Antitumor activity of diterpenoids from Rabdosia shikokiana var occidentalis. Chem. Pharm. Bull., 1985, 33(3): 1038-1042）。甜菊醇与甜菊糖苷有类似的作用，即抗高血糖等功能，因为它们能够促进胰岛素分泌。甜菊醇生物活性与赤霉素也有相似之处, 与赤霉素的形成有关，可促进赤霉素的生物合成(Kyowa Hakka Kogyo Co Ltd.Jpn Kokai Tokyo Koho,80,120,794)。甜菊醇对种子的发芽和芽的生长均有促进作用, 这与赤霉素的生理功效相似。Bearder等发现甜菊醇在赤霉菌突变体BI-41a的作用下,转变为赤霉素GA₁, HA₁₉等(JohnR, Bearder J, Colin M W. Phytochemistry, 1975, 14(8):1741)。甜菊醇和赤霉素在植物体内的生物合成过程中有相同的前体, 即贝壳杉烯和贝壳杉烯酸, 故它们是同源的。所以, 甜菊醇对植物生长的促进作用可能是通过转化为赤霉素而实现, 以赤霉素的生理机能表现出来(柏正武，刘秀芳，徐汉生. 甜叶醇衍生物的合成及其生物活性. 应用化学. 1993, 10(4):35-38)。

甜菊醇在酸性条件下不稳定，易发生重排从而变成其同分异构体异甜菊醇，所以不能通过甜菊苷酸水解的方法制备。

20世纪80年代Ogawa等报道了甜菊醇的化学合成方法。甜菊醇可由甜菊苷stevioside 经高碘酸钠或四醋酸铅氧化再经碱水解得到,此法需要价高的高碘酸钠或含重金属的四醋酸铅, 得到的甜菊醇产率也很低，且需经过多次重结晶才能得到较纯的产物(Ogawa T, Nozaki M, Matsui M. Total synthesis stevioside. Tetrahedron, 1980, 36(18): 2641-2648）。用蜗牛酶加甲苯处理甜菊糖苷可得到甜菊醇，蜗牛酶在降解甜菊糖苷时以内切方式作用于1-4 糖苷键，反应在48h达到完全，经分离纯化可得到甜菊醇（刘铸晋, 周文华, 高峰,等. 甜叶悬钩子叶的甜味成分研究. 植物学通报, 1983, 01: 33-37）,但蜗牛酶来源有限且价格较高，使用的甲苯为有毒有机溶剂。

Oliveira 等人将甜菊糖置于含有赤霉菌Gibberella fujikuroi 的培养基中,经48h（室温)或者pH4.0, 7天（室温）处理，可得到甜菊醇(Heleno de Oliveira, Bras, Ferreira da Trindade, Jose Luiz. Production of hydroxystevio and its application as a plant growth regulator: Brazil, 2004006278[P].2006-08-22.)。甜菊醇还可通过动物包括人类肠道中的微生物(无使用巴氏微杆菌的报道）处理得到(Hutapea et al., 1997; Koyama et al.,2003a,b; Gardana et al., 2003; Geuns et al., 2003)。R.E. Wingard等在研究肠道中SS和RA的吸收与降解中发现SS能够在2d内转化为甜菊醇，而RA需要6d( R.E. Wingard, Jr, J.P. Brown, F.E. Enderlin, J.A. Dale, R. L. Hale and C.T. Seitz. Intestinal degradation and absorption of the glycosidic sweeteners stevioside and rebaudioside A 1 Experientia 36 (1980), Birkhuser Verlag, Basel (Schweiz))。Koyama等研究表明人体肠道中的微生物作用在0.2mg/ml 和10 mg/ml的甜菊糖的混合物24h，在人体中的降解率分别低于85% and 55%.

本发明所使用的微生物巴氏微杆菌XJ在24h内可将3.2mg/mL浓度的95%SS转化为甜菊醇（同时，其中RA的转化率>21%），30小时可将100%SS转化。

本发明用筛选的巴氏微杆菌对原料的转化效率高（90%-100%），反应条件温和（常温），操作简便（巴氏微杆菌极易培养），成本低（可使用低成本的混合底物），可得到高纯度的甜菊醇产品(98%-99%)。该方法可以解决制备甜菊醇时效率不高或需用到有毒化学品或重金属或试剂昂贵的问题，可拓展甜叶菊、甜菊苷或悬钩子苷的用途，高效地得到甜菊醇产品。

发明内容

本发明旨在提供一种巴氏微杆菌XJ及利用该菌制备甜菊醇的方法。

本发明所述的巴氏微杆菌（Microbacterium barkeri）XJ菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 2011182。

本发明所说的制备甜菊醇的方法，是将巴氏微杆菌XJ接到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中，进行生物转化；得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜菊醇；

或者是：

将巴氏微杆菌XJ的菌粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜菊醇；

或者是：

将从巴氏微杆菌XJ中得到的转化酶液或酶粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜菊醇。

上述方法中所说的甜菊醇糖苷是甜菊苷(甙)、斯替维伯苷(甙)、莱鲍迪苷(甙)A、莱鲍迪苷(甙)B、莱鲍迪苷(甙)C、莱鲍迪苷(甙)D、莱鲍迪苷(甙)E、杜尔可苷(甙)A中的任意一种或它们的混合物。

上述方法中所说的悬钩子苷是来自于甜茶或悬钩子植物的提取物。

上述方法中所说的转化底物是甜菊浸提液或悬钩子苷或由甜菊糖苷不同组份或与悬钩子苷等配制的转化底物。底物浓度可为0.01~30%（W/W），优选0.05~10%（W/W），最好为0.5~5%（W/W）。

上述方法中转化体系中接菌量为转化底物体积的0.1~20%，优选5~15%（V/V），最好8~12%（V/V）；或者加入菌粉量为底物重量的0.01%~10%，或者加入的酶量为底物重量的0.01%~10%.

上述方法中转化时间为12~144 h，优选24~72 h；转化温度为25~40℃，优选28~37℃；转化体系的pH值为3.5~7.5。

本发明将甜菊糖或悬钩子苷制成转化液，接入相应的菌液或菌粉或酶粉，在适当的温度和pH下转化，即可获得甜菊醇转化液，经除杂和分离纯化后获得高纯度的甜菊醇产品。或者取一定量的甜菊叶或甜茶，按一定的固液比用水充分浸提后，过滤得到甜菊浸提液或甜茶浸提液，接入微生物后转化到得甜菊醇溶液，再经分离纯化即可得到高纯度的甜菊醇。

将选育的巴氏微杆菌按常规的液体或固体发酵培养后接入含甜菊糖（15%）（W/W）的体系中，接菌量为0.5~10%（V/V），培养12-144 h。1%（W/W）甜菊糖苷溶液HPLC图见图1，转化完全的的HPLC如图2所示。

本发明的优点：

将来源丰富、成分复杂的甜菊糖或悬钩子苷原料经巴氏微杆菌转化后得到高纯度的甜菊醇。

附图说明

图1：1%甜菊糖苷溶液转化前的HPLC图。

图2：1%甜菊糖苷溶液经微生物转化完全后的HPLC图。

具体实施方式

从江苏省植物中经富集培养分离得到2株菌，分别对甜菊糖转化液进行转化，转化条件如实施例1所述。HPLC方法检测转化效果，选择转化效果好的一株作为研究菌株，命名为XJ。

该菌在37℃温箱中培养一天可长出菌落，菌落形态为白色湿润，圆形凸起，边缘齐整，直径2-5mm。光镜下观察为短杆状，单生或呈双杆状，形体微小，革兰氏阳性。经16 S rDNA序列测定及进化树构建得出该菌为微杆菌属中的巴氏微杆菌。

该菌株于2011年5月24日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：武汉大学；保藏菌株分类命名为：巴氏微杆菌（Microbacterium barkeri）XJ，保藏编号为CCTCC NO：M 2011182。

巴氏微杆菌培养条件简单，斜面保藏培养基为常用肉汤培养基，通过产酶培养可直接用于转化。

巴氏微杆菌粉或酶粉的制备：使用常规的液体或固体发酵培养和酶的分离方法即可得到菌粉或酶粉。

例如，菌粉的制备包括菌的发酵培养、发酵液的分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥。将巴氏微杆菌产酶发酵的酶液经冷冻后在真空度1~5pa条件下真空干燥30 h即可得到酶粉。

本发明所用的材料即转化底物：甜菊糖苷、悬钩子苷可从长沙光明食品化工公司购买，也可用通常的提取方法从甜叶菊或悬钩子叶中制备。

本发明结合具体的实验和数据为本发明进一步说明，举例是为说明本发明的过程而非仅限于实施例。以下实施例中所说的菌液、菌粉、酶粉或酶液均指巴氏微杆菌CCTCC M 2011182的菌液、菌粉、酶粉或酶液。

实施例1：

配制1%（W/W）、pH 7.5甜菊糖苷转化底物（甜菊糖苷：水=1：:99（W/W），配制方法下同），接入1%（V/V）巴氏微杆菌液，37℃，220 r/min动态培养3天。培养结束后，5000 rpm离心去除菌体，上清液经絮凝沉淀除杂、大孔树脂吸附分离、洗脱液结晶纯化获得高纯度的甜菊醇，纯度约为95%，甜菊糖的转化率为90%。

实施例2：

500 mL转化瓶装1%（W/W）、pH6.5甜菊糖苷底物，加10%（W/W）酶液，37℃转化2天。结束后分离纯化得到纯度约为95%的甜菊醇。

实施例3：

500 mL转化瓶装5%（W/W）、pH 7.0甜菊糖苷转化底物，加5%（V/V）菌液，35℃培养3天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例4：

500 mL转化瓶装0.05% （W/W）、pH 5.5甜菊糖苷底物，加1%（W/W）菌粉，30℃培养24h。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例5：

500 mL转化瓶装0.5%（W/W）、pH 7.5甜菊糖苷底物，加0.01%（W/W）酶粉，30℃转化4天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例6：

500 mL转化瓶15% （W/W）、pH 6.0甜菊糖苷转化底物，加0.6%（W/W）菌粉，32℃培养2天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例7：

500 mL转化瓶装20%（W/W）、pH 5.0甜菊糖苷转化底物，加20%（V/V）菌液，32℃培养5天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例8：

500 mL转化瓶装30%（W/W）、pH 5.0甜菊糖苷转化底物液，加0.1%（V/V）菌液，28℃培养6天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例9：

在500 mL三角瓶中装0.01% （W/W）、pH 3.5甜菊糖苷底物，加0.01%（W/W）菌粉，30℃培养4天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例10：

在500L的工业反应器中加10%（W/W）、pH 7.0甜菊糖苷转化底物，加15%（V/V）菌液，32℃培养3天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例11：

在1500L的工业反应器中加 1.5%（W/W）、pH 7.5甜菊糖苷转化底物，加10%（W/W）菌粉，30℃培养3天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例12：

在100L的工业反应器中加 1%、pH 6.0（W/W）甜菊糖苷转化液，加10%（V/V）菌液，37℃培养2天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例13：

800 mL转化瓶装200 mL 10%（W/W）、pH 5.5甜菊糖苷转化液，加8%（V/V）菌液，30℃培养5天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。

实施例14：

与实施例1基本相同，所不同的是底物是悬钩子苷转化液。

实施例15：

与实施例2基本相同，所不同的是底物是悬钩子苷转化液。

实施例16：

与实施例3基本相同，所不同的是底物是悬钩子苷转化液。

实施例17：

与实施例4基本相同，所不同的是底物是悬钩子苷转化液。

实施例18：

与实施例1基本相同，所不同的是用酶粉转化。

实施例19：

与实施例1基本相同，所不同的是用酶液转化。

实施例20：

与实施例1基本相同，所不同的是用菌液与酶液协同转化。

实施例21：

与实施例2基本相同，所不同的是底物悬钩子苷来自悬钩子叶自行提取。

实施例22：

与实施例3基本相同，所不同的是底物是悬钩子苷来自甜菊糖转化而得。

Claims

1. 一种巴氏微杆菌（Microbacterium barkeri）XJ菌株，其特征在于，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2011182。

2.一种制备甜菊醇的方法，是：

将巴氏微杆菌XJ接种到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中，进行生物转化；得到的转化液经分离除杂处理后，得到甜菊醇；

或者是：

将巴氏微杆菌XJ的菌粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到甜菊醇；

或者是：

将从巴氏微杆菌XJ中得到的酶液或酶粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到甜菊醇。

3.根据权利要求2所述的制备甜菊醇的方法，其特征在于，所说的甜菊糖苷是甜菊苷，斯替维伯苷，莱鲍迪苷A，莱鲍迪苷B，莱鲍迪苷C，莱鲍迪苷D，莱鲍迪苷E，杜尔可苷A中的任意一种或它们的混合物。

4.根据权利要求2所述的制备甜菊醇的方法，其特征在于，其中的转化底物是甜菊浸提液，或由甜菊糖苷或悬钩子苷配制的转化液。

5.根据权利要求2所述的制备甜菊醇的方法，其特征在于，转化底物中甜菊糖苷的浓度为0.01~50%（W/W）。

6.根据权利要求2所述的备甜菊醇的方法，其特征在于，甜菊糖苷的浓度为0.05~10%（W/W）。

7.根据权利要求2所述的制备甜菊醇的方法，其特征在于，转化底物中悬钩子苷的浓度为0.01~50%（W/W）。

8.根据权利要求2所述的制备甜菊醇的方法，其特征在于，悬钩子苷的浓度为0.05~10%（W/W）。

9.根据权利要求2所述的制备甜菊醇的方法，其特征在于，转化体系中接菌量为转化底物体积的0.1~20%；或者加入菌粉量为底物重量的0.01%~10%；或者加入的酶量为底物重量的0.01%~10%。

10.根据权利要求2所述的制备甜菊醇的方法，其特征在于，转化时间为12~144 h，转化温度为25~40℃，转化体系的pH值为3.5-7.5。