CN105063136A - 一种利用嗜松青霉转化甜菊糖制备杜尔可苷a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用嗜松青霉转化甜菊糖制备杜尔可苷A的方法是将嗜松青霉接种到固体或液体培养基中进行发酵产酶，用菌或酶液转化莱鲍迪苷C或含有莱鲍迪苷C的混合甜菊糖苷，得到杜尔可苷A。本发明利用嗜松青霉将莱鲍迪苷C高效转化为杜尔可苷A，为稀有糖苷杜尔可苷A的制备提供了新的方法与途径。所用嗜松青霉液体发酵或固体发酵工艺成熟、其酶为胞外酶，酶使用方便，提取成本低。本发明不仅使RC得到充分利用，适宜条件下的转化率可接近100％，同时得到价值更高的稀有糖苷杜尔可苷A。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备杜尔可苷A(DA)的新方法，特别是用嗜松青霉发酵产生的菌或酶转化RC为DA的方法。属于天然产物的生物转化领域。
背景技术
甜菊糖苷是从甜菊叶中提取的高倍天然甜味剂，因其安全、低热等特点，被誉为“最佳天然甜味剂”、“第三糖源”。中国是目前世界上最大的甜菊糖生产国和出口国。甜菊糖苷不仅广泛应用于食品行业，在医药行业也倍受青睐。甜菊糖苷的生物活性广泛，主要有降血压、调节血糖、抗菌抗炎等活性(朱焕铃,刘景彬,谢印芝.甜菊糖苷的性质及在食品中的应用[J].食品研究与开发,2011,11:189-192；SiddPurkayastha,GeorgePughJr.,BarryLynch,AshleyRoberts,DavidKwokd,StanleyM.TarkaJr.InvitrometabolismofrebaudiosideB,D,andMunderanaerobicconditions:ComparisonwithrebaudiosideA[J].RegulatoryToxicologyandPharmacology,2014,68:259–268.)。
甜菊糖苷的通用结构式为：
表1甜菊糖苷主要成分与结构
表2甜菊叶中不同糖苷的含量、甜度比较
从甜叶菊中提取得到甜菊糖含多种成分：甜菊苷、莱鲍迪苷(Rebaudioside)A、B、C、D、E、F、甜茶苷及杜尔可苷A(DulcosideA，简称DA)。由表1中各甜菊糖苷的结构可见，莱鲍迪苷C的C13位的β-1,2糖苷键选择性水解断裂可以产生杜尔可苷A。而从表2(陈秋实.甜菊苷的研究概况[J].中国药师,2007,10(6):598-599；杨远志,庞明利,杨海军.天然甜味剂甜菊糖中国市场应用处于导入期[N].中国食品报,2009-11-24)中数据可见：甜叶菊中甜菊苷占总苷量的46-48％，莱鲍迪苷A占总苷量的20-30％，莱鲍迪苷C占总苷量的4-7％。杜尔可苷A、甜茶苷，莱鲍迪苷B、D、E在甜叶菊中含量稀少，难以直接从甜叶菊中获得大量的这些成分。这些稀有糖苷由于原料中含量少、提取成本高等方面的限制，是量少而价高的产品。研究表明甜茶苷、甜菊双糖苷等是备受关注的有着潜在药用价值的品种(陈育如,姜中玉,刘虎.一种由甜菊糖苷制备甜茶苷的方法[P]:中国,ZL200910035921.0.2010-5-5；陈育如,刘虎,姜中玉等.一种生物转化甜菊糖中甜菊苷为甜菊双糖苷的方法[P]:中国,CN201010170786.3.2010-10-13)。
甜菊糖的苷元甜菊醇分子具有对映贝壳杉烯型四环二萜骨架结构，具有独特的生理活性(LiJ，ZhangDY，WuXM.Synthesisandbiologicalevaluationofnovelexomethylenecyclopentanonetetracyclicditerpenoidsasantitumoragents[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2011,21(1):130-132；汪吴林,石浩.异斯特维醇衍生物的应用研究进展[J].浙江化工,2014,10:7-11)。杜尔可苷A水解掉去除鼠李糖基后，其产物是甜茶苷。甜茶苷具有降脂、降血糖、止咳、镇静、抗过敏、抗疲劳、增强免疫力等功能(谢莹,陈全斌,罗达伟等.高纯度甜茶苷抗疲劳及免疫调节功能研究[J].时珍国医国药,2010,21(6):1421-1422)。作为稀有甜菊糖苷类，因受原料供应的限制，目前杜尔可苷A的研究极少(MasaruKobayashi,ShujiHorikawa,IsoldeH.Degrandi,JunkoUeno,HiroshiMitsuhashi.DulcosidesAandB,newditerpeneglycosidesfromSteviarebaudiana.Phytochemistry,1977,16(9):1045-1048)。
本课题组在甜菊糖的分离纯化和生物转化方面进行了系列研究(陈育如,玄燕,赵乙萱等.巴氏微杆菌XJ及应用该菌制备甜菊醇的方法[P]:中国,ZL201110159563.1.2011-10-19；陈育如,姜中玉,玄燕,张玉千,夏文静.黄杆菌胞内酶提取和快速转化甜菊糖为甜茶苷的方法[P]:中国,ZL201010569609.2.2011-5-18；陈育如,刘虎,姜中玉等.一种生物转化甜菊糖中甜菊苷为甜菊双糖苷的方法[P]:中国,CN201010170786.3.2010-10-13；陈育如,姜中玉,刘虎.一种由甜菊糖苷制备甜茶苷的方法[P]:中国,ZL200910035921.0.2010-5-5)，本发明是在前期工作基础上的深入研究。
嗜松青霉应用广泛，本发明用的典型菌株(CGMCCNo.63664)筛选方法见文献(孙欢，纤维素热解产物及甜叶菊的微生物转化研究[D]，南京师范大学硕士论文，2014)，嗜松青霉可用于转化内醚糖(陈育如,孙欢,赵乙萱,刘军利,卫民.一株嗜松青霉及其应用[P]:中国,ZL201210467779.9.2013-2-13.)，、产木聚糖酶(HongyingCai,PengjunShi,YingguoBai,HuoqingHuang,TiezhengYuan,PeilongYang,HuiyingLuo,KunMeng,BinYao.Anovelthermoacidophilicfamily10xylanasefromPenicilliumpinophilumC1[J].ProcessBiochemistry:2011,46,2341–2346.)，产β-甘露糖苷酶(HongyingCai,PengjunShi,HuiyingLuo,YingguoBai,HuoqingHuang,PeilongYang,BinYao.Acidicβ-mannanasefromPenicilliumpinophilumC1:Cloning,characterizationandassessmentofitspotentialforanimalfeedapplication[J].JournalofBioscienceandBioengineering:2011,112(6),551–557.)及产β-1,4葡萄糖苷酶(Ah-ReumJoo,MarimuthuJeya,Kyoung-MiLee,Kyoung-MinLee,Hee-JungMoon,Yeong-SukKim,Jung-KulLee.Productionandcharacterizationofβ-1,4-glucosidasefromastrainofPenicilliumpinophilum[J].ProcessBiochemistry:2010,45,851–858.)等。另外，嗜松青霉还可用于促进石榴生长及营养吸收(AshisMaity,R.K.Pal,RamChandra,N.V.Singh.Penicilliumpinophilum-Anovelmicroorganismfornutrientmanagementinpomegranate(PunicagranatumL.)[J].ScientiaHorticulturae:2014,169,111–117)；防治线虫，促进番茄等易感线虫的植物生长(谭可菲,段玉玺,陈立杰,王媛媛,陈增齐.根结线虫生防菌SneF8发酵代谢产物稳定性研究[J].江苏农业科学,2009,03:121-123.)、降解磷源促进马尾松的生长(乔欢,吴小芹,王早.一株嗜松青霉JP-NJ4的解磷特性[J].微生物学通报,2014,09:1741-1748)。利用嗜松青霉也可产油和产黄酮类物质(叶思特,郭丽琼,刘晓蓉,陈晓阳,林俊芳.产油微生物的筛选[J].华南农业大学学报,2012,03:384-387；刘紫英.产黄酮成分的绶草内生真菌的鉴定[J].菌物学报,2011,01:133-137)。因此，嗜松青霉是一种多功能的菌株。
本课题组曾用高产β-葡萄糖苷酶的棘孢曲霉转化RC，结果表明其将RC不是转化为DA而是成为甜菊醇(马迎迎,陈育如,张伟娜,孙欢等.棘孢曲霉转化甜菊糖为甜菊醇及纯化莱鲍迪苷A[J].微生物学报,2014,01:62-68.)。本发明发现，嗜松青霉对RC转化DA有特异性，可实现DA的高转化量制备。
发明内容
为了解决现有DA制备的不足，本发明旨在提供一种利用液体或固体培养得到的嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)的菌液或酶液特异性转化莱鲍迪苷C生成杜尔可苷A(DA)。本发明有助于DA产量的大量生产，为DA的开发与应用提供保障。转化DA的原料莱鲍迪苷C具有一定的后苦味(王德骥.再论甜菊糖苷的甜度、甜味和苦涩后味的成因机理[J].食品工业科技,2010,05:417-420)，用其制备DA等其他稀有糖苷可使RC物料得到充分利用。
本发明公开了嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)在制备杜尔可苷A中的应用。
本发明所述的嗜松青霉可从土壤、水体、空气中筛选，也可从ATCC\CGMCC\CICC\CFCC\CCTCC\ACCC等菌种保藏机构购买，其典型菌株为嗜松青霉CGMCCNo.6366(已在中国专利ZL201210467779.9中公开)。
本发明还提供了一种制备杜尔可苷A的方法，是将嗜松青霉接种到固体或液体培养基中进行发酵产酶，用菌或酶液转化莱鲍迪苷C或含有莱鲍迪苷C的混合甜菊糖苷，得到杜尔可苷A。
例如，可以是：将嗜松青霉接种到固体培养基中，培养至长满菌丝或孢子，提取固体曲得到酶液；加入莱鲍迪苷C或含有莱鲍迪苷C的甜菊糖苷于酶液中，静态或动态转化得到杜尔可苷A。
也可以是：将嗜松青霉接种到液体培养基中得到酶液；加入莱鲍迪苷C或含有莱鲍迪苷C的甜菊糖苷于酶液中，静态或动态转化得到杜尔可苷A。
本发明所述的方法中，转化体系的温度为5℃-70℃，最好是40℃-50℃。
当转化的底物是含有莱鲍迪苷C(RC)的混合甜菊糖苷时，转化顺序是先转化甜菊苷(SS)为甜茶苷(RS)，后转化莱鲍迪苷C为DA。
当转化的底物是含有莱鲍迪苷C(RC)的混合甜菊糖苷时,其特征是转化体系中的莱鲍迪苷A(RA)不被转化。
本发明利用嗜松青霉将莱鲍迪苷C高效转化为杜尔可苷A，为稀有糖苷杜尔可苷A的制备提供了新的方法与途径。所用嗜松青霉液体发酵或固体发酵工艺成熟、其酶为胞外酶，酶使用方便，提取成本低。本发明不仅使RC得到充分利用，适宜条件下的转化率可接近100％，同时得到价值更高的稀有糖苷杜尔可苷A。
附图说明
图1莱鲍迪苷C(RC)的HPLC分析。
图2转化液的HPLC分析。
图3转化产物杜尔可苷A的质谱分析。
图4嗜松青霉酶液转化混合甜菊糖苷的HPLC分析。
具体实施方式
实施例中所用的菌株仅为举例说明，不是对本发明内容的限制。
实施例1：
常规固体曲培养基(麦麸培养基)10kg，灭菌冷却后接入嗜松青霉(CGMCCNo.6366)种子液，在30度培养4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物RC5kg(其HPLC分析见图1)，45℃转化48小时。转化液中含产物DA4.1kg(转化液的HPLC分析见图2，DA质谱分析见图3)。
实施例2：
与实施例1基本相同，区别是此处用常规液体PDA培养基(土豆、葡萄糖培养基)发酵嗜松青霉96小时，发酵液80L过滤去除菌体的酶液转化底物RC5kg。45℃转化48小时,转化液中含产物DA3.8kg。
实施例3：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(CGMCCNo.63664)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物混合甜菊糖苷5kg(含5％RC)，45℃水浴中转化48小时。转化液中含产物DA0.2kg(转化液HPLC分析见图4)，RA的量基本不变。
实施例4：
与实施例3基本相同，区别是此处用的是常规的PDA液体培养基用于培养嗜松青霉,转化底物是含RC20％的混合甜菊糖。
实施例5：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(CGMCCNo.6366)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物RC5kg，5℃水浴中转化106小时。转化液中含产物DA2.3kg。
实施例6：
与实施例5基本相同，区别是此处用的是常规的液体培养基培养嗜松青霉，发酵后发酵液或菌体或去除菌体的酶液进行转化。
实施例7：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(CGMCCNo.63664)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物混合甜菊糖苷5kg(含5％RC)，5℃水浴中转化106小时。转化液中含产物DA0.11kg，RA的量基本不变。
实施例8：
与实施例7基本相同，区别是此处用的是常规的液体培养基培养嗜松青霉，发酵后发酵液或菌体或去除菌体的酶液进行转化。
实施例9：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(CGMCCNo.6366)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物RC5kg，70℃水浴中转化30小时。转化液中含产物DA2.45kg。
实施例10：
与实施例9基本相同，区别是此处用的是常规的液体培养基培养嗜松青霉，发酵后发酵液或菌体或去除菌体的酶液进行转化的。
实施例11：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(CGMCCNo.63664)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物混合甜菊糖苷5kg(含5％RC)，70℃水浴中转化30小时。转化液中含产物DA0.12kg，RA的量基本不变。
实施例12：
与实施例11基本相同，区别是此处用的是常规的液体培养基培养嗜松青霉，发酵后发酵液或菌体或去除菌体的酶液进行转化的。
实施例13：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(筛自土壤，NO.006)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物RC5kg，45℃水浴中转化48小时。转化液中含产物DA3.45kg。
实施例14：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(筛自堆肥，NO.007)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物混合甜菊糖苷5kg(含50％RC)，45℃水浴中转化48小时。转化液中含产物DA1.4kg，其中的RA量基本不变。
实施例15：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(筛自空气，NO.0011)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物RC5kg，45℃水浴中转化48小时。转化液中含产物DA2.9kg。
实施例16：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(筛自空气，NO.0011)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物混合甜菊糖苷5kg(含5％RC)，45℃水浴中转化48小时。转化液中含产物DA0.11kg，其中的RA量基本不变。
实施例17：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(筛自水体，NO.0015)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物RC5kg，45℃水浴中转化48小时。转化液中含产物DA3.1kg。
实施例18：
常规固体曲培养基10kg在30度发酵嗜松青霉(筛自水体，NO.0015)4天，得到的固体曲加水100L浸提1小时得到嗜松青霉酶液，加入底物混合甜菊糖苷5kg(含30％RC)，60℃转化48小时。转化液中含产物DA0.84kg，其中的RA量基本不变。
Claims (7)
1.嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)在制备杜尔可苷A中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述嗜松青霉是嗜松青霉CGMCCNO.6366。
3.一种制备杜尔可苷A的方法，其特征是：将嗜松青霉接种到固体或液体培养基中进行发酵产酶，用菌或酶液转化莱鲍迪苷C或含有莱鲍迪苷C的混合甜菊糖苷，得到杜尔可苷A。
4.根据权利要求3所述方法，其特征是：将嗜松青霉接种到固体培养基中，培养至长满菌丝或孢子，提取固体曲得到酶液；加入莱鲍迪苷C或含有莱鲍迪苷C的甜菊糖苷于酶液中，静态或动态转化得到杜尔可苷A。
5.根据权利要求3所述方法，其特征是：将嗜松青霉接种到液体培养基中得到菌液或酶液；加入莱鲍迪苷C或含有莱鲍迪苷C的甜菊糖苷于菌液或酶液中，静态或动态转化得到杜尔可苷A。
6.根据权利要求3所述方法，其特征是：转化体系的温度为5℃-70℃。
7.根据权利要求6所述方法，其特征是：转化体系的温度为40℃-50℃。
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