DE2514533A1

DE2514533A1 - Polysaccharidkomplexe und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2514533A1
Application number: DE19752514533
Authority: DE
Inventors: Akihiro Mizutani
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1975-03-03
Filing date: 1975-04-03
Publication date: 1976-09-16
Also published as: US4009264A

Description

Die Erfindung betrifft Komplexe von Polysacchariden oder deren Derivaten mit einem verringerten Glutathiongehalt, welche eine markante Verbesserung der Stabilität des reduzierten Glutathione gegenüber Autoxidation und eine Erhöhung der Fähigkeit des reduzierten Glutathions zur Bildung von Mercaptursäure und/oder Mercaptiden besitzen, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Komplexe und gleichfalls zur Anwendung dieser Komplexe.

Die Komplexe gemäss der Erfindung unterscheiden sich klar von reduzierten Glutathion und lediglich Gemischen aus reduzierten Glutathion und Polysacchariden oder deren Derivaten insofern, als diese Komplexe einerseits in der Literatur nicht beschrieben sind und andererseits eine klare Absorptionsspitze bei etwa 2500 cm im Infrarotabsorptionsspektrum des reduzierten Glutathions nicht mehr vorhanden ist.

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Die erfindungsgemässen Komplexe haben einen weiten Bereich der Anwendung auf Anwendungsgebieten wie Medizinen, Thiolgruppen-stabilisierenden Mitteln zum Schutz anderer thiolhaltiger Verbindungen gegenüber Autoxidation, Behandlungsmittel für Abfallwässer, die Schwermetalle und/oder aromatische Halogenverbindungen enthalten/und Mittel zum Einfangen und zur Zurückgewinnung von Schwermetallen·

Glutathion tritt in grossen Mengen in einer grossen Vielzahl von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen auf und ist eine physiologisch wichtige Substanz, da sie eine Wirkung auf der Basis der Oxidation-Reduktion-Reaktion der Thiolgruppen hat, so,wie es ist_/als Co-Enzym wirkt und gleichfalls beim Detoxikationsmechanismus infolge der Bildung von Mercaptursäure und/oder Mercaptiden teilnimmt.

Es wurde nunmehr intensiv an der Verbesserung der biochemischen Eigenschaften von reduzierten Glutathion, insbesondere an der Verbesserung der Stabilität von deren Thiolgruppen gegenüber Autoxidation und der Verbesserung deren Fähigkeit zur Bildung von Mercaptursäure und/oder Mercaptid gearbeitet. Dabei wurde nun gefunden, dass Komplexe durch Umsetzung des reduzierten Glutathions mit Polysacchariden oder deren Derivaten gebildet werden können und dass die erhaltenen Komplexe eine markante Verbesserung der Stabilität des reduzierten Glutathions gegenüber Autoxidation und eine Erhöhung der Fähigkeit zur Bildung von Mercaptursäure und/oder Mercaptid besitzen.

In der britischen Patentschrift 1 223 281 vom 24. Februar 1971 sind zwischen empfindlichen Biopolymeren, welche eine oder mehrere primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, wie Proteinen oder Peptiden, und Polymeren, welche eine oder mehrere Hydroxylgruppen oder primäre oder sekundäre Aminogruppen, wie Polysacchariden und deren Derivate enthalten, gebildete Komplexe beschrieben. In der Patent-

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schrift sind Enzyme, Antikörper, Proteine und/oder Peptidhormone, antigene Proteine, Aninopolysacciiaride und Nukleinsäuren als Beispiele für diese Biopolymeren angegeben und die Arbeitsbeispiele belegen Chymotrypsin, Insulin, Gamma-Globulin, Oxytocin und Glucoseoxidase. An keiner Stelle ist Jedoch in der Patentschrift die Anwendung von reduziertem Glutathion angegeben.

In dieser britischen Patentschrift ist weiterhin angegeben, dass durch Umsetzung unter alkalischen Bedingungen v*n"Biopolymeren und aktivierten Polymeren, die durch Behandlung der Biopolymeren mit einem Cyanogenhalogenid erhalten wurden, diese ohne Ausbruch der Peptidbindungen der Biopolymeren kombiniert werden können und es infolgedessen möglich ist, beispielsweise Enzyme an Polymere ohne irgendwelche wesentlichen Verluste der Enzymaktivität zu binden und einen Antikörper an das Polymere zu binden, ohne dass die Fähigkeit des Antikörpers zur Bindung seines Antigens verloren geht. Anders ausgedrückt, ist in dieser Patentschrift festgestellt, dass durch Bildung der vorstehenden Komplexe die Biopolymeren chemisch an Polysaccharide oder deren Derivate ohne irgendeinen wesentlichen Verlust der Aktivität oder Fähigkeit der Biopolymeren gebunden werden können.

In der britischen Patentschrift ist Jedoch lediglich angegeben, dass die chemische Bindung ohne irgendwelche wesentlichen Verluste der Aktivität oder Fähigkeit der Biopolymeren ausgeführt werden kann und in keiner Weise ist die Fähigkeit zur Verbesserung oder Erhöhung dieser Aktivität oder Fähigkeit vorbeschrieben oder nahegelegt und in Jeder Weise fehlt ein technisches Konzept zur Erzielung einer derartigen Verbesserung.

In der japanischen Patent-Veröffentlichung 2803V74-ist ein Verfahren zur Herstellung von Komplexen angegeben,

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welches in der Umsetzung von Polymeren mit Gruppen der Molekularformel -XH (worin -XH eine Hydroxylgruppe oder eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt), beispielsweise Copolymere von Dextran und Epichlorhydrin, mit Verbindungen mit einer oder mehreren Cyanatgruppen und anschliessende Umsetzung der erhaltenen aktiven Derivate der Polymeren mit organischen Verbindungen mit Gruppen der Molekularformel -YH (worin -YH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe bedeutet) zu ihrer kovalenten Bindung besteht.

Diese Japanischen Patentschrift gibt Proteine, Polypeptide, Peptide und Aminosäuren und deren Derivate, Enzyme, Antikörper, Proteine und/oder Peptidhormone, Antigenproteine, Allergene, Haptene und Polysaccharide mit Aminogruppen -YH als Beispiele für organische, Gruppen -YH enthaltende Verbindungen an. Spezifisch sind in der Patentausführung Insulinantikörper, Cystein, Glycylleucin und Glycylthyrocin angegeben. ^J

Auch in dieser Patentschrift ist reduziertes Glutathion als Biopolymeres nicht aufgeführt. In der Patentschrift ist lediglich angegeben, dass die Biopolymeren,beispiels- ^! weise Antikörper, chemisch an Polymere, beispielsweise vernetztes Dextran,ohne Verlust der Eigenschaften eines Anti- ^; körpers gebunden werden können. Es findet sich keinerlei Hinweis oder Vorschlag hinsichtlich der Möglichkeit und des technischen Konzeptes einer Verbesserung oder Erhöhung ' der Aktivität oder Fähigkeit der Antikörper.

In Acta. Chem. Scand., Band 25, Seite 1855 bis 1859» 1971 ist die Herstellung von ähnlichen Komplexen wie in der ^; vorstehenden britischen Patentschrift durch Umsetzung, von aktivierten mit einem Cyanogenhalogenid oder einem organischen Cyansäureester unter alkalischen Bedingungen behandelten Dextran angegeben. In dieser Literaturstelle ist angegeben, dass bei einem Komplex aus Dextran und Insulin die

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Aktivität des freien Insulins praktisch auf 1/36 verringert wird und ein Komplex aus Dextran und Ampicillin Aktivität besitzt, obwohl diese schwächer als diejenige des Ampicillins ist.

Im Hinblick auf die übliche Kenntnis, dass höchstens die Aktivität oder Fähigkeit der Biopolymeren praktisch nicht verloren geht und häufig wesentlich verringert wird, wurde nunmehr in überraschender Weise gefunden, dass reduziertes Glutathion, welches in keiner Weise in den bekannten Literaturstellen angegeben ist, Komplexe mit Polysacchariden und deren Derivaten bildet und dass diese Komplexe eine markante Verbesserung oder Erhöhung der Fähigkeit oder Eignung des reduzierten Glutathione zeigen. Es wurde in völlig überraschenderweise gefunden, dass in den Komplexen gemäss der Erfindung die Stabilität der Thügruppe (-SH) des reduzierten Glutathione gegenüber Autoxidation markant verbessert wird und die Fähigkeit des reduzierten Glutathione zur Bildung von Hercaptürsäure und/oder Hercaptid ansteigt.

Es wurde weiterhin gefunden, dass die Alkylester von Halogencarbonsäuren sowie Cyanogenhalogeniden und organischen Cyansäureestern als Aktiviermittel zur Erzielung der vorstehenden Komplexe verwendet werden können und dass die Reaktion zur Ausbildung der Komplexe vorzugsweise unter sauren Bedingungen bei einem pH-Wert von weniger als 7 ausgeführt wird.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht demzufolge in Kom^ plexen von Polysacchariden oder deren Derivaten mit reduziertem Glutathion.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung dieser Komplexe mit wesentlichen Vorteilen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Anwendung dieser Komplexe.

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Zahlreiche weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Im Infrarotabsorptionsspektrum des Komplexes gemäss der Erfindung ist eine klare Absorptionsspitze bei etwa 2300 cm~ , die im Spektrum des als Ausgangsmaterials dienenden reduzierten Glutathione zu sehen ist, nicht mehr vorhanden. In diesem Gesichtspunkt lassen sich die Komplexe , gemäss der Erfindung klar von sämtlichen des reduzierten Glutathione, aktivierten Polysacchariden oder deren Derivaten oder reinen Gemischen aus reduziertem Glutathion und Polysacchariden oder deren Derivaten unterscheiden.

Falls der erfindungsgemässe Komplex in einem Natriumphosphatpuffer (0,1m, pH 8,0) in Gegenwart von FeCl* (1,2 χ 10"^m) bei einer Temperatur von 40° C während 6 Stunden inkubiert wird, beträgt das verbleibende Verhältnis der aktiven SH-Gruppen mindestens 50 %. Auch in diesem Gesichtspunkt lassen sich die Komplexe gemäss der Erfindung klar von sämtlichen des reduzierten Glutathione, aktivierten Poly* sacchariden oder deren Derivaten oder alleinigen Gemischen _; aus reduzierten Glutathion und Polysacchariden oder deren Derivaten unterscheiden.

In Fig. 6 der beiliegenden Zeichnung ist das Infrarotabsorptionsspektrum des Komplexes aus reduziertem GIuta- i thion mit Dextran, das in Beispiel 1 erhalten wurde, ange- ι geben. Fig. 7 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum des \ zur Bildung des vorstehenden Komplexes eingesetzten redu- ι zierten Glutathions. Fig. 8 zeigt das Infrarotabsorptions- : Spektrum des zur Bildung des vorstehenden Komplexes einge- ; setzten aktivierten Dextrahs. Fig. 9 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum einer Gemisches lediglich aus dem vor- ; stehenden reduzierten Glutathion und dem aktivierten Dextran.

Es ergibt sich klar aus den Fig. 6 bis 9, dass in den ι Komplexen gemäss der Erfindung ein klarer Absorptionsgipfel

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(der durch einen Pfeil in Fig. 7 gezeigt ist) in der Gegend von 25OO cm" des reduzierten Glutathione vollständig verschwunden ist. Dieser Absorptionsgipfel ist klar im Fall des alleinigen Gemisches aus reduzierten Glutathion und dem aktivierten Dextran vorhanden. Es ergibt sich klar aus einem Vergleich der Fig. 8 mit der Fig. 6, dass der Komplex gemäss der Erfindung ein Infrarotabsorptionsspektrum klar unterschieden von dem des aktivierten Dextrans hat. Im Infrarotabsorptionsspektrum des Komplexes gemäss der Erfindung nach Fig. 6 wird ein einer a-1:6-Glucocidbindung bei etwa 760 cm"'' und 910 cm" zurückführbare Absorption beobachtet. In der Gegend von 3400 cm* ist eine breite Absorption auf der Basis von -OH zu sehen. Dies zeigt, dass der Komplex ein

Derivat des Dextrans ist. Andererseits ist der klare Ab-

-Ί

sorptionsgipfel bei etwa 2500 cm auf der Basis von reduzierten Glutathion verschwunden.

Fig. 10 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum des Komplexes gemäss der Erfindung, das in Beispiel 2 erhalten wurde, Fig. 11 zeigt das des in Beispiel 3 erhaltenen Komplexes, Fig. 12 zeigt das des in Beispiel 5 erhaltenen Komplexes, Fig. 13 zeigt das des in Beispiel 5 eingesetzten aktivierten Dextrans und Fig. 14 zeigt das eines alleinigen Gemisches aus aktiviertem Dextran und reduzierten Glutathion. Weiterhin zeigen die Fig. 15, 16, 17, 18, 19 und 20 die Infrarotabsorptionspektren der in den Beispielen 6, 7* 8, 9* 10 und 11 erhaltenen Komplexe. In diesen Infrarotabsorptionsspektrumskarten ist der klare Absorptionsgipfel bei etwa 25OO cm" des als Ausgangsmaterial dienenden reduzierten Glutathione vollständig verschwunden.

Aus den Karten der Fig. 6, 8, 12 und 14 lässt sich beispielsweise entnehmen, dass die Absorption bei etwa 1715 cm"'¹, die auf -CONH- eines mit Cyanogenbromid aktivierten Dextrans zurückzuführen ist, und eine Absorption bei

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etwa 1800 cm" , die auf eine mit Äthylchiorcarbonat aktivierte Carbonatgruppe des Dextrans zurückzuführen ist, im Infrarotabsorptionsspektrum des Komplexes derselben mit reduziertem Glutathion verringert sind.

Die Analyse der Aminosäuren des Komplexes gemäss der Erfindung zeigt, dass das Verhältnis von Glutaminsäure/ Cystein/Glycin etwa 1/1/1 beträgt, so dass bestätigt wird, dass Glutathion in den Komplexen gemäss der Erfindung vorliegt.

Die chemische Struktur der Komplexe gemäss der Erfindung liegt noch im Bereich der Abschätzung. Im Hinblick jedoch auf die Tatsache, dass die Struktur des beispielsweise in Beispiel 1 eingesetzten aktivierten Sextrans bereits in der Weise vorgeschlagen wurde, dass sie den folgenden Formeln I und II entspricht, und im Hinblick auf die Reaktivität von Zuckerimidocarbonat oder Zuckercarbonat wird die chemische Struktur des Komplexe gemäss der Erfindung entsprechend den

folgenden Formeln III bis V angenommen, angegeben hinsieht- j lieh Anhydroglucoseeinheiten des Dextrans;

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—CH.

HC

HIT

4P'

CH

O

(Formel I)

(Formel II)

-CH,

O-C-NH-GSH

It

-C-NH-GSH

(Formel III)

(Formel IV)

(Formel V)

bezeichnet reduziertes Glutathion)

Die Komplexe aus reduziertem Glutathion mit anderen Polysacchariden oder deren Derivaten dürften ähnliche Strukturen besitzen.

In den Komplexen aus Polysacchariden oder deren Derivaten mit reduziertem Glutathion gemäss der Erfindung ist die Stabilität der Thiolgruppe (-SH) des reduzierten Glutathione gegenüber Autoxidation markant verbessert. In diesem Gesichtspunkt lassen sich auch die Komplexe gemäss der Erfin-

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- ΪΟ -

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dung klar von reduzierten Glutathion oder alleinigen Gemischen aus Polysacchariden oder deren Derivaten und reduzierten Glutathion unterscheiden. Falls der Komplex gemäss der Erfindung mit einem Natriumphosphatpuffer (0,1m, pH
8,0) in Gegenwart von FeCl* (1,2 χ 10~^m) bei 40° C während 6 Stunden inkubiert wird, beträgt das verbleibende Verhältnis an aktivem SH-Gruppen mindestens 30 %% in zahlreichen Fällen mindestens 60 %, häufig mindestens etwa 70 % und in
einigen Fällen sogar mehr als 90 %.

Der erfindungsgemäss angegebene Natriumphosphatpuffer stellt eine Lösung von 0,827 g NaH₂POj₁^H₂O und 33»916 g

₂^"12H₂O in destilliertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter dar.

Das verbliebene Verhältnis an diesen SH-Gruppen, einfach bezeichnet mit Restaktivität, wie es hier angewandt wird,
lässt sich wie folgt definieren:

Der Komplex gemäss der Erfindung und weiterer SH-haltiger Verbindungen wird bei einer bestimmten Temperatur in einem Natriumphosphatpuffer (0,1m, pH 8,0) inkubiert. Ali- _: quote Teile werden in Abständen abgenommen und unmittelbar wird der Gehalt an aktiven SH-Gruppen der Proben bestimmt. Der maximal erhältliche Gehalt wird zu 100 (%) gesetzt und der Gehalt an aktiven SH-Gruppen jeder Probe wird als Prozentsatz, bezogen auf diesen Maximalgehalt, angegeben.

Die Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen stellt eine
graphische Darstellung dar, welche das Ausmass der Autoxidation des Komplexes aus reduziertem Glutathion und Dextran, erhalten nach Beispiel 1, und das Ausmass der Autoxidation des als Ausgangsmaterial dienenden reduzierten Glutathions darstellt.

In Fig. 1 zeigt die Abszissenachse die Inkubationszeit in Stunden und die Ordinatenachse zeigt das Restverhältnis der aktiven SH-Gruppen. Es ergibt sich klar aus einem Ver-

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gleich des Restverhältnisses des Komplexes gemäss der Erfindung (gezeigt durch « ■ ) und desjenigen des reduzierten Glutathione (angegeben durch -o-o*-), dass beim erfindungsgemässen Komplex die Stabilität des reduzierten Glutathione gegenüber Autoxidation markant verbessert ist. In diesem Beispiel ist das Hestverhältnis an aktivem SH (40° C, 6 Stunden) des Komplexes gemäss der Erfindung etwa 87 %. Andererseits beträgt beim reduzierten Glutathion das Restverhältnis etwa 40 %, was einen Abiall auf weniger als die fiälfte des Komplexes darstellt. Weiterhin wird im Verlauf von 8 Stunden das Restverhältnis des.Komplexes gemäss der Erfindung noch bei einem Wert von etwa 80 % gehalten, während im Fall des reduzierten Glutathione das Restverhältnis auf hinab zu etwa 20 % verringert wird. Das gleiche Ergebnis wie im Fall des reduzierten Glutathione wird mit einem alleinigen Gemisch aus reduzierten Glutathion und aktiviertem Sextran erhalten, wenn dies auch in den Zeichnungen nicht gezeigt ist.

Der Komplex aus Polysaccharid oder Derivat hiervon mit reduziertem Glutathion gemäss der Erfindung hat ausser der markant erhöhten Stabilität gegenüber Autoxidation auch eine überlegene Schutz- oder Stabilisierwirkung gegenüber Autoxidation von weiteren SH-haltigen Verbindungen.

In den Fig. 3 bis 5 sind graphische Darstellungen angegeben» welche das Ausmass der Autoxidation con Cysteamin (Fig. 3), Penicillamin (Fig. 4) und reduziertem Glutathion (Fig. 5) sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit des Komplexes (reduzierter Glutathion-itextran-Komplex), erhalten nach Beispiel i, darstellen. In diesen Figuren zeigt die Abszissenachse die Inkubationszeit in Minuten und die Ordinatenachse das SH-Restverhältnis (%) der vorstehenden Verbindungen an. Es ergibt sich klar, aus einem Vergleich des Restverhältnisses in Gegenwart des Komplexes gemäss der Er-

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findung (angegeben durch -·-·-) mit dem Restverhältnis der vorstehenden SH-haltigen Verbindung allein (angegeben durch -o-o-), dass der erfindungsgemässe Komplex eine überlegene Schutz- oder Stabilisierwirkung gegenüber Autoxidation von anderen Verbindungen mit -SH-Gruppen zeigt· Bei diesen Versuchen trat kaum irgendeine Autoxidation der -SH-Gruppen des Komplexes gemäss der Erfindung auf.

Das vorstehende Restverhältnis wurde nach Auflösung der Probe in Natriumphosphatpuffer (O₁Im₁ pH 8,0) in Gegenwart von Kupfersulfat (5 x 10"'m) und einer Inkubation bei 37° C bestimmt. Der SH-Gehalt wurde durch eine amperometrisehe Silbertitration bestimmt.

In der Fig. J wurde das verbliebene -SH-Verhältnis von Cysteamin Null innerhalb von 60 Minuten» während im Fall der erfindungsgemassen Komplexes zu einer Endkonzentration von 1 χ 10" m das Restverhältnis noch bei etwa 85 % nach 60 Minuten gehalten wurde. Selbst nach Verlauf von 120 Minuten wurde die Aktivität noch bei etwa 50 % gehalten.

In der Fig. 4 nahm die Aktivität von Penicillamin auf etwa 15 % als SH-Restverhältnis in 60 Minuten ab, während in Gegenwart des erfindungsgemassen Komplexes die Aktivität bei etwa 90 % im Verlauf von 60 Minuten gehalten wurde. Selbst nach 240 Minuten wurde die Aktivität bei etwa 50 % gehalten.

Gemäss Fig. 5 nahm die Aktivität des reduzierten Glutathione (Endkonzentration 1 χ 10~*m) auf etwa 20 % als SH-Restverhältnis in 160 Minuten ab, während in Gegenwart des Komplexes gemäss der Erfindung die Aktivität noch bei etwa 90 % gehalten wurde und selbst nach Verlauf von 240 m Minuten das Restverhältnis bei einem so hohen Wert wie etwa 85 % gehalten wurde.

Sie vorstehend aufgeführten markanten Verbesserungen und Erhöhungen der Aktivität oder Eignung von reduziertem

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Glutathion im erfindungsgemässen Komplex aus Polysaccharid oder deren Derivat mit reduziertem Glutathion und der hohe ßtabilisiereffekt auf die Aktivität oder Eignung weiterer Verbindungen mit -SH-Gruppen sind völig unerwartet und überraschend im Hinblick auf Eigenschaften» die durch die üblichen Komplexe aus Biopolymeren und Polysacchariden gezeigt werden.

Diese Eigenschaften des Komplexes gemäss der Erfindung sind vorteilhaft beispielsweise bei Anwendung von reduziertem Glutathion für medizinische Zwecke in Flüssigkeitsform wie Injektionspräparaten, da das reduzierte Glutathion kurz vor dem Gebrauch gelöst werden muss und verwendet werden muss, bevor seine Aktivität verringert ist. Gemäss der Erfindung kann diese ungünstige Beschränkung vermieden werden. Der Effekt der Stabilisation der Aktivität weiterer SH-haltiger Verbindungen ergibt auch einen synergistisehen Effekt zur Stabilisation weiterer SH-haltiger Verbindungen oder der Erhöhung der Aktivität dieser Verbindungen. Dieser Effekt kann nicht nur bei medizinischen Gebrauch, sondern auch auf anderen Fachgebieten ausgenützt werden.

Einige Beispiele für medizinischen Gebrauch der Komplexe gemäss der Erfindung sind nachfolgend angegeben.

Zunächst wurde die Schutzeignung der Komplexe gemäss der Erfindung gegen Strahlungsschädigung mit derjenigen von reduziertem Glutathion verglichen, wie folgt:

8 Wochen alte weibliche Mäuse vom ddY-Typ (30 in einer Gruppe) wurden völlig mit 160 KV-Röntgenstrahlen (Cu 0,5 mm 4- Al 0,5 mm-Filter, Dosierungsausmass 21,7 R/Min.) zu einer Gesamtdosierung von 650 R bestrahlt. Weiterhin wurde der in Beispiel 1 erhaltene Komplex aus reduziertem Glutathion und Dextran in 2 ml einer isotonischen Natriumchloridlösung gelöst. 60 oder 120 Minuten vor der Bestrahlung wurde die erhaltene Lösung intraperitoneal zu einer Dosierung von

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25 mg (als Glutathion) je Maus (zwei Gruppen) verabfolgt. Andererseits wurde das reduzierte Glutathion in gleicher Weise unmittelbar vor der Bestrahlung oder 60 Minuten vor derselben verabfolgt (zwei Grippen)· Als Eontrolle wurden 2 ml lediglich einer isotonischen Natriumchloridlösung introperitoneal 60 Minuten vor der Bestrahlung verabfolgt (eine Gruppe). Im Hinblick auf diese fünf Gruppen wurde der Effekt jeder der verabfolgten Verbindungen durch das Ausmass der Überlebens nach einem Verlauf von 30 Tagen seit der Bestrahlung bewertet. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

In der Fig. 2 bezeichnet das Symbol K-¹W eine

Gruppe, an die der Komplex aus reduziertem Glutathion-Dextran 60 Minuten vor der Röntgenbestrahlung verabfolgt wurde« das Symbol ^...,^ä. eine Gruppe, die dieser Komplex 120 Minuten vor der Röntgenbestrahlung verabfolgt wurde, das Symbol X-X eine Gruppe, an die reduziertes Glutathion unmittelbar vor der Röntgenbestrahlung verabfolgt wurde, das Symbol O O ^eine Gruppe, die das reduzierte Glutathion 60 Minuten vor der Röntgenbestrahlung verabfolgt wurde, und das Symbol > 9 bedeutet die Kontrollgruppe.

Vie aus Fig. 2 ersichtlich, ist das Überlebensausmass der Mäuse nach der Bestrahlung mit Röntgenstrahlen weit grosser in der Gruppe, an die der Komplex gemäss der Erfindung verabfolgt wurde, als bei der Gruppe, an die reduziertes Glutathion verabfolgt wurde. Es ergibt sich daraus, dass der Komplex aus reduziertem Glutathion und Dextran gemäss der Erfindung mehr wirksamer als reduziertes Glutathion als Schutzmittel gegenüber Strahlungsschädigung auf Grund von radioaktiven Strahlen unter Einschluss von Röntgenstrahlen verwendet werden kann.

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Die prophylaktische Aktivität des Komplexes gemäss der Erfindung auf eine Schädigung der Leber wurde mit derjenigen von reduziertem Glutathion verglichen. Die Leberschädigung wurde durch Verabfolgung von D-Galactosamin-hydrochlorid induziert.

Weibliche Vister-Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 120 g (10 in eine Gruppe), welche 2 Stunden gefastet hatten, wurden verwendet. Drei Gruppen wurden bereitet. An eine Gruppe wurde intravenös eine Lösung verabfolgt, die durch Auflösung von 10 mg reduziertem Glutathion in 1 ml einer isotonischen Natriumchloridlösung erhalten worden war. An eine weitere Gruppe wurde in gleicher Weise eine Lösung von 160 mg des Komplexes aus reduziertem Glutathion und Dextran (10 mg als reduziertes Glutathion),erhalten nach Beispiel 1, der in der gleichen Weise wie vorstehend hergestellt worden war, verabfolgt. Eine weitere Gruppe wurde lediglich mit 1 ml einer isotonischen Natriumchloridlösung versetzt. 1 Stunde nach der Verabfolgung wurde eine durch Auflösung von 50 mg D-Galactosamin-hydrochlorid in 1 ml einer isotonischen Natriumchloridlösung und Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7»0 mit O,1n-Natriumhydroxid erhaltene Lösung intraperitoneal verabfolgt.

Nach Verlauf von 22 Stunden seit der Verabfolgung des D-Galactosamin-hydroChlorids wurde das Blut aus der Abdominalaorta extrahiert. GOT, GPT, Bilirubin und Glucose im Plasma wurden bestimmt. Weiterhin wurde die Leber ausgeschnitten und Lipidfett und Neutralfett wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

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Tabelle I

Bedingungen zur Leber-Feucht· Behandlung der gewicht (g) Ratten

Plasma- Plasma- Plaoma- Plasma- Gesamt-

GOT GPT Glucose Gesamt- lipide

(Kannen ü.) (Karmen U.) (mg/dl) biliru- (mg/g

bin Feucht-(mg/dl) leber)

Kontrollgruppe 3,1+0,09

Gruppe, an die lediglich D-GaIN verabfolgt war

4,9+0,20

ο Gruppe, an die

co D-GaIN nach der

ao G-SH-Verabfolgung 4,8+0,08

^ω Verabreicht ~

⁰⁰ wurde

ο Gruppe, an die

co D-GaIN nach der

ο G-D-Verabreichung »,

^ verabfolgt wurde ^

128+75

33+30

113+24 0,13

54+7

405+444

158+312 98+24 0,22 103+31

Neutralfett (mg/g Feuchtleber)

26+6

3515+1547 1792+822 59+12 0,32 165+19 127+17

1994+2016 898+918 82+16 0,33 167+24 129+19

73+28

D-GaIN : D-Galactosamin·HCl-SaIz

G-SH: Reduziertes Glutathion

G-D: Reduzierter Glutathion-Dextran-Komplex

cn co co

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Wie sich klar aus Tabelle I ergibt, tritt in der Gruppe, an die lediglich D-Galactosamin-hydrochlorid verabfolgt wurde, eine markante Zunahme an Plasma-GOT, Plasma-GPT, Plasma Bilirubin und Leberlipid- und Neutralfett auf und eine Abnahme der Menge an Plasma-glucose auf Grund der Schädigung der Leber, Andererseits sind in der vorhergehend mit reduziertem Glutathion oder Komplex aus reduziertem Glutathion und Dextran verabfolgten Gruppe die Neigungen zur Erhöhung oder Absenkung gehemmt. Es ergibt sich, dass das Ausmass der Hemmung besonders hervorragend in den mit dem erfindungsgemassen Komplex aus reduziertem Glutathion und Sextran verabfolgten Gruppe im Vergleich zu der mit dem reduzierten Glutathion behandelten Gruppe sind.

Hinsichtlich des Hemmeffektes auf die Bildung von Fettlebern bei Hatten durch Athionamid ist der Komplex aus reduziertem Glutathion und Dextran weitüberlegen gegenüber reduziertem Glutathion. Deshalb lässt sich der Komplex aus reduziertem Glutathion und Dextran gemäss der Erfindung als wirksame Medizin gegenüber Leberschädigungen einsetzen.

Der erfindungsgemässe Komplex ist auch brauchbar, als Behandlungsmittel für Abfallwasser zur Entfernung von Schwermetallen und/oder aromatischen Halogenverbindungen aus einem Abfallwasser, das diese enthält, indem die verbesserte und erhöhte Aktivität oder Fähigkeit auf Grund der -SH-Gruppen ausgenützt wird. Die Verbindungen sind auch als Behandlungsmittel zum Einfangen und zur Zurückgewinnung von Schwermetallen aus Flüssigkeiten, die diese Schwermetalle enthalten, wirksam.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemassen Komplexe aus Polysacchariden oder deren Derivaten und reduziertem Glutathion wird nachfolgend abgehandelt:

Gemäss der Erfindung kann der Komplex durch Umsetzung eines Polysaccharides oder dessen mit einem Aktiviermittel

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aus der Gruppe von Cyanogenhalogeniden, organischen Cyansäureestern und Alkylestern von Halogencarbonsäuren aktivierten Derivaten hergestellt werden. Besonders gute Ergebnisse können erhalten werden, falls diese Reaktion unter sauren Bedingungen bei einem pH-Wert von weniger als 7 ausgeführt wird. Die Anwendung der Polysaccharide oder deren Derivate, die mit Alkylestern von Halogencarbonsäuren aktiviert sind, wird gegenüber denjenigen, welche mit Cyanogenhalogeniden oder organischen Cyansäureestern aktiviert sind, bevorzugt. ,

Beispiele für Aktiviermittel sind Cyanogenhalogenide oder organische Cyansäureester, wie Cyanogenbromid, Cyanogen j odid, Cyanogenchlorid, Phenylcyanat oder 2,2,2-Trichloräthylcyanat und niedere Alkylester, vorzugsweise Cj- bis C^-Niedrig-alkylester, von Chlor- oder Bromkohlensäuren, wie Methylchlorcarbonat, Äthylchlorcarbonat oder Äthylbromcarbonat. I

Beispiele für Polysaccharide oder deren Derivate, die mit den vorstehenden Aktiviermitteln aktiviert werden können, ; umfassen neutrale Polysaccharide, wie Sextran, Stärke, Amylopectin, Amylose, Dextrin, Cellulose, Glycogen, Inulin, , Mannen, Laminaran oder Xylan, hydrierte Derivate dieser Polysaccharide, Hydroxyalkylderivate dieser Polysaccharide, . Carboxyalkylderivate dieser Polysaccharide, sulfatisierte , Derivate dieser Polysaccharide und sauren Polysaccharide, wie Chondroitinsulfat, Carrageenan oder Agaropectin.

Beispiele für bevorzugte hydrierte Derivate sind hydrier-* tes Dextran, hydrierte Stärke, hydrierte Amylose, hydriertes , Amylopectin, hydriertes Dextrin und hydriertes Glycogen. Beispiele für bevorzugte Hydroxyalkylderivate umfassen Hydroxyäthylstärke, Hydroxyäthyldextran, Hydroxyäthylamylose, Hydroxyäthylamylopectin, Hydroxyäthylglycogen, Hydroxy-

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äthylmannan, Hydroxymethyldextran, Hydroxypropyldextran, Hydroxymethylstärke oder Hydroxypropylstärke, wobei die Alkylgruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele für bevorzugte Carboxyalkylderivate sind Carboxymethyldextran, Carboxymethylcellulose, Carboxymethylstärke, Carboxymethylamylose, Carboxymethyldextrin, Carboxyäthyldextran oder Carboxyäthylcellulose, wobei die Alkylgruppe 1 bis Kohlenstoffatome enthält. Beispiele für bevorzugte sulfatisierte Derivate sind Dextransulfat, Amylopectinsulfat, Amylosesulfat, Stärkesulfat, Cellulosesulfat, Inulinsulfat, Mannansulfat, Laminaransulfat oder Xylansulfat.

Vorzugsweise ist der Substitutionsgrad der Hydroxyalkylgruppe, Carboxyalkylgruppe oder Schwefelsäuregruppe in den vorstehenden Derivaten etwa 0,05 bis etwa 1,0 Mol Je Struktursaccharideinheit des Polysaccharides. Im Fall von Dextran, können native Dextrane und deren teilweise hydrolysierte Produkte mit Eigenviskosität, bestimmt in Wasser bei 25° C, von etwa 1,5 bis etwa 0,03 /dl/g7 eingesetzt werden.

Das Verhältnis von aktiviertem Polysaccharid oder dessen Derivat zu dem reduzierten umzusetzenden Glutathion ist nicht besonders beschränkt, sondern kann in gewünschter Weise gewählt werden. Üblicherweise beträgt jedoch das Gewichtsverhältnis von Polysaccharid oder dessen Derivat zu dem reduzierten Glutathion 1 zu etwa 0,05 bis etwa 0,5·

Die Umsetzung kann durch Verrohren der beiden Ausgangsmaterialien in einem wässrigen Medium bei einem pH-Wert von vorzugsweise weniger als 7% stärker bevorzugt 6 + 0,5 bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 40° C während etwa 1 bis 48 Stunden ausgeführt werden. Falls Polysaccharide .oder deren mit Alkylhelogencarbonaten aktivierte Derivate verwendet werden, wird die Reaktion vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 0 bis etwa 25° C, stärker bevorzugt weniger als 5° C während etwa 1 bis 24 Stunden ausgeführt.

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Sie Umsetzung kann in einem wässrigen Medium, beispielsweise in einen 1m-Essigsäurepuffer (pH 4,5 bis 5,5), einem O,2m-Natriumcitratpuffer (pH 5»5 bis 6,5) oder einem O,2m-Natriumphosphatpuffer (pH 6,0 bis 7,0) durchgeführt werden.

Das Reaktionsprodukt kann durch Ausfällung mit einem mit Wasser mischbarem organischen schlechten Lösungsmittel für das Produkt, wie aliphatischen Alkoholen, oder aus einem Nicht-Lösungsmittel für das Produkt, wie Aceton, gesammelt werden. Durch Wiederholung eines Kreislaufes der Auflösung des Niederschlages in Wasser und Wiederausfällung desselben aus einer geeigneten Menge von Aceton kann der Niederschlag gereinigt werden. Gewünschtenfalls kann die Reinigung auch nach einem Gelfiltrationverfahren ausgeführt werden. Falls das Reaktionsprodukt wasserunlöslich ist, kann es durch Filtration oder Zentrifugalabtrennung mit anschliessendem gründlichen Waschen mit Wasser gereinigt werden.

Der erhaltene Komplex des reduzierten Glutathione gemäss der Erfindung kann durch Massnahmen wie Trocknung im Vakuum, Sprühtrocknung oder Lyophylisierung getrocknet werden.

Die aktivierten Polysaccharide oder deren Derivate, die als Ausgangsverbindungen beim erfindungsgemassen Verfahren eingesetzt werden, können nach verschiedenen Verfahren erhalten werden.

Falls sie mit Cyanogenhalogeniden oder organischen Cyanaten aktiviert werden, kann die Umsetzung durch Zugabe eines derartigen Aktiviermittel zu einer wässrigen Lösung oder einer wässrigen Dispersion eines Polysaccharides oder dessen Derivates, Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf die alkalische Seite, vorzugsweise etwa 9»5 bis 11,5 durch Zusatz einer geeigneten alkalischen Substanz, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid unter Rühren des Gemisches

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während etwa 1 bis etwa 60 Hinuten bei einer niederen Temperatur von etwa 0 bis etwa 30° C ausgeführt werden. Vorzugsweise wird die wässrige Lösung oder Dispersion des Polysaccharides oder dessen Derivates vorgehend mit einer schwach-alkalischen Substanz, wie Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat zur Einstellung von dessen pH-Wert auf etwa 7,0 bis 9»0 behandelt.

Falls ein Alkylhalogencarbonat als Aktiviermittel eingesetzt wird, wird die Umsetzung vorzugsweise in Gegenwart eines tertiären Amins unter Anwendung von Dimethylsulfoxid als Flüssigmedium durchgeführt. Beispiele für andere flüssige Medien sind Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran, Toluol, Chloroform und Äthylacetat. Beispiele für tertiäre Amine sind Triäthylamin und Tri-n-butylamin.

Allgemein besteht der Komplex aus dem Polysaccharid oder dessen Derivat mit dem reduzierten Glutation aus einem festen Pulver, das eine weisse bis hellgelbe Farbe hat. Der Gehalt an reduziertem Glutathion dieses Komplexes kann in geeigneter Weise durch Änderung solcher Faktoren, wie Ausmass der Aktivierung des aktivierten Polysaccharide oder dessen Derivates oder der Konzentration des aktivierten FoIysaccharide und/oder des reduzierten Glutathions zum Zeitpunkt der Ausbildung des Komplexes variiert werden, üblicherweise beträgt der Gehalt an reduzierten Glutathion etwa bis etwa 200 mg/g, bestimmt durch Bestimmung des SH-Gruppengehaltes gemäss der amperometrisehen Silbertitration oder durch Bestimmung des Schwefelgehaltes gemäss einem Sauerstoff verbrennungsverfahren. Komplexe mit einem höheren Gehalt an reduziertem Glutathion können durch Erhöhung des Ausmasses der Aktivierung hergestellt werden, welche durch Erhöhung des pH-Wertes (jedoch weniger als 7) und/oder Verlängerung der Reaktionszeit bei der Aktivierungsreaktion oder durch Erhöhung der Konzentration des aktivierten Polysaccharides

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und/oder des reduzierten Glutathione bei der Umsetzung zur Bildung des Komplexes hergestellt werden können.

Sie folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen.

Beispiel 1

1 g Dextran nit einer Eigenviskosität, gemessen in Wasser von 25° C, von 0,039 £<H/g7 wurde in 10 ml einer O,1m-Lösung von Natriumbicarbonat gelöst. Getrennt wurden-1 g Cyanogenbromid in 30 ml destilliertem Wasser unter Rühren und Kühlung der Lösung bei 3° C gelöst. Wenn das Cyanogenbromid gelöst war, wurde die vorstehende Dextranlösung in die Cyanogenbromidlösung unter Rühren eingegossen. Dann wurde der pH-Wert der Mischlösung rasch auf 11,0 durch Zusatz einer wässrigen 4n-Lösung von Natriumhydroxid eingeregelt. Es wurde fortgesetzt während 8 Minuten bei 3° C gerührt. Während dieses Zeitraumes wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches bei 10,9 bis 11,1 unter Anwendung einer wässrigen 4n-Lösung von Natriumhydroxid gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch in 240 ml von kaltem Aceton unter Rühren gegossen. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und 240 ml kaltes Aceton wurden in 4 Anteilen zur Wäsche zugesetzt. Das erhaltene Produkt wurde zu 40 ml einer O,2m-Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,5)* die 100 mg reduziertes Glutathion enthielt, zugesetzt und das Gemisch bei 25° C während 16 Stunden gerührt. Nach der Umsetzung wurden 240 ml kaltes Aceton zugegeben und der erhaltene Niederschlag auf einem Glasfilter abfiltriert. Das Produkt wurde in 4 ml einer 1m-Essigsäure gelöst und durch Gelfiltration unter Anwendung einer Sephadex-G-25-Kolonne filtriert, wobei eine 1m-Essigsäure als Lösungsmittel verwendet wurde. Die Ultraviolettabsorption bei 190 mn jeder Fraktion des Ablaufes wurde bestimmt. Por-

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tionen unter Einschluss des ersten Gipfels wurden gesammelt und lyophylisiert, so dass 0,85 g eines hellgelben wasserlöslichen pulverartigen Produktes mit einem Gehalt von 70 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten wurden. Die Restaktivität des reduzierten Glutathione nach 6 Stunden betrug 87 %. ·

Beispiel 2

10 ml eines O,1m-Natriumbicarbonate mit einem Gehalt von 1 g Dextran mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Wasser von 25° C, von 0,069 /dl/g7 wurden mit 30 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1,5 g Cyanogenjodid vermischt und die Mischlösung unter Rühren während 5 Minuten bei 3° C unter Beibehaltung von ihrem pH-Wert bei 10,9 bis 11,1 unter Anwendung einer wässrigen 4n-Lösung von Natriumhydroxid umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch in 240 ml kaltem Aceton unter Rühren gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und 240 ml Aceton in 4 Anteilen zur Wäsche des Niederschlages zugegeben. Das erhaltene Produkt wurde zu 40 ml eines O,2m-Natriumphosphatpuffers (pH 6,5)» der 100 mg reduziertes Glutathion enthielt, zugesetzt und das Gemisch wurde während 18 Stunden bei 25° C gerührt. Nach der Umsetzung wurden 240 ml kaltes Aceton zur Bildung des Niederschlages zugefügt. Der Niederschlag wurde mit 240 ml Aceton, die in 4 Anteilen zugesetzt wurden, gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 0,8 g eines weissen pulverförmigen wasserlöslichen Produktes mit einem Gehalt von 65 mg/g am reduzierten Glutathion erhalten wurden. Die Restaktivität des reduzierten Glutathione nach 6 Stunden betrug 89 %·

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Beispiel 3

1 g Dextran mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Wasser von 25° C, von 0,176 ^äl/g/ wurde in 40 ml einer wässrigen O,1m-Lösung von Natriumbicarbonat gelöst und 0,8 6 Phenylcyanat wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 3° C während 4 Minuten unter Beibehaltung seines pH-Wertes bei 10,4 bis 10,6 unter Anwendung einer wässrigen 4n-Lösung von Natriumhydroxid gerührt. Dann wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wiederholt und 0,75 β eines weissen, pulverförmigen wasserlöslichen Produktes mit einem Gehalt von 10 mg/g an reduziertem Glutathion wurden erhalten. Die Bestaktivität an reduziertem Glutathion nach 6 Stunden betrug 70 %.

Beispiel 4

10 ml einer Ο,ΐιη-Natriumbicarbonatlösung mit einem Gehalt von 1 g Dextran mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Wasser von 25° C, von 0,176 Z3l/g7 wurden mit 30 ml einer I wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1,0 g Cyanogenbromid vermischt. Das Gemisch wurde bei 3° C während 7 Minuten unter ' Beibehaltung des pH-Wertes auf 10,4 bis 10,6 unter Anwendung ' einer wässrigen 4n-Nätriumhydroxidlösung gerührt. Dann wurde ' das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wiederholt, wobei ^! 0,8 g eines weissen pulverförmigen wasserunlöslichen Produk- ^; tes mit einem Gehalt von 15 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten wurden. Die Restaktivität des reduzierten Glutathione nach 6 Stunden betrug 75 %.

Beispiel 5 ^!

10 g Dextran mit einer Eigenviskosität, gemessen in i Wasser von 25° C, von 0,039 Z3l/g7 wurden in 100 ml Dimethyl-

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sulfoxid gelöst und 27 ml Triethylamin und 16 ml Dioxan wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde auf unterhalb 5° C abgekühlt. Während die Reaktionstemperatur unterhalb 5° C gehalten wurde, wurden 10 ml Äthylchlorcarbonat tropfenweise zu dem Gemisch im Verlauf von 2 Minuten zugesetzt. 6 Minuten später wurde das Reaktionsgemisch in 500 ml Äthyläther gegossen. Der erhaltene Niederschlag wurde zweimal mit 100 ml Äthyläther gewaschen und in 25 ml an 90%igem Äthanol gelöst. Das in Äthanol unlösliche Material wurde abfiltriert. Zu dem Filtrat wurden dann 100 ml Äther zugesetzt und der Niederschlag im Vakuum getrocknet, wobei 10 g Dextrancarbonat erhalten wurden. 1 g des Dextrancarbonats wurde in 10 ml einer O,2m-Natriumphosphatpuff erlö sung (pH 6,5) gelöst und 200 mg reduziertes Glutathion wurden zugesetzt. Während der pH-Wert bei 6,5 gehalten wurde, wurde die Umsetzung bei Raumtemperatur während 7 Stunden ausgeführt. Nach Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf 5,5 wurden 60 ml Methanol zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wurde in 10 ml Wasser gelöst und 60 ml Methanol wurden zur erneuten Ausfällung und Reinigung des Niederschlages zugegeben. Dieser wurde dann unter Anwendung von Methanol pulverisiert und im Vakuum getrocknet, wobei 1 g eines weissen pulverförmigen wasserlöslichen Produktes mit einem Gehalt von 110 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten wurde. Die Restaktivität des erhaltenen Glutathions nach 6 Stunden betrug 80 %.

Beispiel 6

10 g Hydroxyäthylstärke mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Wasser von 25° C, von 0,14 /dl/g7 (Substitutionsausmass an Hydroxyäthylgruppen, 0,52 je Anhydroglucoseinheit) wurden in 100 ml Dimethylsulfoxid gelöst und 27 ml Triäthyl-

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amin und 16 ml Dioxan wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde auf unterhalb 5° C abgekühlt. Unter Beibehaltung der Reaktionstemperatur unterhalb 5° C wurden 10 ml Äthylchlorcarbonat zu dem Reaktionsgemisch tropfenweise zugegeben. 2 Minuten später wurde das Reaktionsgemisch in 500 ml Äthyläther gegossen. Der erhaltene Niederschlag wurde zweimal mit 100 ml Äthyläther gewaschen und zweimal mit 200 ml 90%igem Äthanol gewaschen. Bas erhaltene Produkt wurde mit wasserfreiem Äthanol und Äther entwässert und im Vakuum getrocknet, wobei 9)0 g Hydroxyäthylstarkecarbonat erhalten wurden.

1 g des Hydroxyäthylstarkecarbonats wurden in 20 ml eines O,2m-Natriumphosphatpuffers (pH 6,5) gelöst und 200 mg reduziertes Glutathion wurden zugesetzt. Sie Umsetzung wurde bei Raumtemperatur während 7 Stunden unter Beibehaltung des pH-Vertes des Reaktionssystems bei 6,5 ausgeführt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch abgetrennt, erneut ausgefällt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 gereinigt, wobei 0,9 g weisses, pulverförmiges wasserlösliches Produkt mit einem Gehalt von 21 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten wurden. Die Restaktivität an reduziertem Glutathion nach 6 Stunden betrug 72 %.

Beispiel 7

10 ml einer wässrigen O,1m-Lösung an Natriumbicarbonat mit einem Gehalt von 1 g hydriertem Dextran, hergestellt aus Dextran mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Wasser von 25° 0 von 0,039 Zdl/g7 wurden mit 10 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 0,5 g Cyanogenbromid vermischt. Das Gemisch wurde bei 3° C während 13 Minuten unter Beibehaltung seines pH-Wertes bei 10,5 bis 10,9 unter Anwendung einer wässrigen 4n-Lösung von Natriumhydroxid gerührt. Dann

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wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wiederholt, wobei Jedoch die Menge des reduzierten Glutathione zu 200 mg und die Menge des O,2m-Natriumphosphatpuffers (pH 6,5) zu 10 ml geändert wurden. Dabei wurden 0,75 g eines weissen pulverförmiger wasserlöslichen Produktes mit einem Gehalt von 80 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten. Die Restaktivität an reduziertem Glutathion nach 6 Stunden betrug 88 %.

Beispiel 8

20 ml einer wässrigen O,1m-Lösung von Natriumbicarbonat mit einem Gehalt von 1 g technisch erhältlicher löslicher Stärke wurden mit 20 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1,0 g Cyanogenbromid vermischt. Unter Beibehaltung des pH-Wertes des Reaktionssystems bei 10,5 bis 10,9 unter Anwendung einer wässrigen 4n-Lösung von Natriumhydroxid wurde das Gemisch bei unterhalb 5° C während 13 Minuten verrührt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch in 240 ml kaltem Aceton unter Rühren gegossen. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und mit 240 ml jeweils an Wasser und Aceton, zugesetzt in 4 Anteilen, gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde mit 250 mg an reduziertem Glutathion in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch der Zentrifugalabscheidung überlassen. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 200 ml jeweils von Wasser, 50%igem Methanol und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 0,5 g eines weissen pulverförmigen Produktes mit 69 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten wurden. Die Restaktivität des reduzierten Glutathione nach 6 Stunden betrug 88 %.

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Beispiel 9

10 ml einer wässrigen 0,1m-Lösung von Natriumbicarbonat mit einem Gehalt von 1 g Dextransulfat mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Im-Natriumchloridlösung bei 25° C, von 0,027 /~dl/g/ (Substitutionsausmass der Sulfatgruppe O_t32 je Anhydroglucoseeinheit) wurden mit 20 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1 g Cyanogenbromid vermischt und das Gemisch bei unterhalb 3° C während 6 Minuten gerührt« wobei dessen pH-Wert bei 10,9 bis 11,1 unter Anwendung einer wässrigen 4n-Lösung an Natriumhydroxid gehalten wurde. Nach der Umsetzung wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wiederholt, wobei jedoch die Menge des O,2m-Natriumphosphatpuffers (pH 6,5) zu 10 ml geändert wurde. Dabei wurden 0,91 g| eines weissen pulverförmiger! wasserlöslichen Produktes mit einem Gehalt von 80 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten. Die Restaktivität des reduzierten Glutathione nach 6 Stunden betrug 92 %.

Beispiel 10

10 ml einer wässrigen 0,1m-LÖsung von Natriumbicarbonat mit einem Gehalt an Carboxymethyldextran-Natriumsalz (Substitutionsgrad der Carboxymethylgruppe 0,15 Mol je Anhydroglucoseeinheit) mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Im-Natriumchloridlösung, von 0,04? /sll/g7 wurden mit 20 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1 g Cyanogenbromid vermischt und das Gemisch unterhalb 3° C während 6 Minuten unter Beibehaltung von dessen pH-Wert bei 10,9 bis 11,1 unter Anwendung einer 4n-Natriumhydroxidlösung gerührt. Nach der Umsetzung wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 8 angewandt, so dass 0,6 g eines weissen pulverförmigen Produktes mit einem Gehalt von 78 mg/g an reduziertem Glutathion er-

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halten wurden, Die Restaktivität an reduziertem Glutathion nach 6 Stunden betrug 80 %.

Beispiel 11

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 5 wurde wiederholt, wobei Jedoch 10 g Hydroxyäthyldextran (Ausmass der Hydroxyäthylgruppe 0,20 je Anhydroglucoseeinheit), das aus Dextran mit einer Eigenviskosität, bestimmt in Wasser von 25° C₁ von 0,039 Zdl/g7 erhalten worden war, angewandt wurden. Dabei wurden 0,8 g eines weissen pulverförmigen wasserlöslichen Produktes mit einem Gehalt von 100 mg/g an reduziertem Glutathion erhalten. Die Restaktivität an reduziertem Glutathion nach 6 Stunden betrug 84 %.

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Claims

Patentansprüche

f 1. Komplex aus einem Polysaccharid oder dessen Derivat sit reduziertem Glutathion mit einem Infrarotabsorptions-Spektrum ohne Absorptionsgipfel bei etwa 2500 cm , welcher im Infrarotabsorptionsspektrum des reduzierten Glutathione auftritt.

2. Komplex nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Beetverhältnis an aktivem SH-Gruppen von mindestens 50 %, wenn er bei 40° C während 6 Stunden in einem JJatriumphosphatpuffer (0,1m, pH 8,0) in Gegenwart von FeCl, (1,2 χ 10"^m) inkubiert wird.

J. Komplex nach Anspruch 1 oder 2, dadurch, gekennzeichnet, dass das Polysaccharid oder dessen Derivat aus einer der folgenden Verbindungen Dextran, Stärke, Amylopectin, Amylose, Dextrin, Cellulose, Glycogen, Inulin, Mannan, Lasinaran, Xylan, hydrierten Derivaten dieser Polysaccharide, Hydroxyalkylderivaten dieser Polysaccharide, Carboxyalkylderivaten dieser Polysaccharide, sulfatisierten Derivaten dieser Polysaccharide und/oder sauren Polysacchariden besteht.

4. Stabilisator für Thiolgruppen, enthaltend als aktiven Bestandteil einen Komplex eines Folysaccharids oder dessen Derivats mit reduziertem Glutathion, der in seinem Infrarotabsorptionsspektrum keinen Absorptionsgipfel bei etwa 2500 cm" besitzt, welcher im Infrarotabsorptionsspektrum des reduzierten Glutathione auftritt·

5· Stabilisator nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex ein Restverhältnis an aktiven SH-Gruppen von mindestens 50 % besitzt, wenn er bei 40° C während 6 Stunden in einem Natriumphosphatpuffer (0,1m, pH 8,0) in Gegenwart von FeCl₃. (1,2 χ 10"^-m) inkubiert wird.

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6. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Polysacchariden oder deren Derivaten mit reduziertem Glutathion, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polysaccharid oder dessen Derivat, welches mit einem Aktiviermittel aus der Gruppe von Cyanogenhalogeniden, organischen Cyansäureestern oder Alkylestern von Halogenkohlensäuren aktiviert worden ist, mit reduziertem Glutathion unter sauren Bedingungen bei einem pH-Wert von weniger als 7 umgesetzt wird.

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