JP2008521837A - タンパク質アレルゲン誘導体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、アレルゲン活性が低下した野生型タンパク質アレルゲン誘導体を生成する方法に関するものである。本発明は、アレルゲン活性を有する野生型タンパク質アレルゲンを用意する工程と、上記野生型タンパク質アレルゲンを、アレルゲン活性が低下した、またはアレルゲン活性が欠失した２つのフラグメントにスプライシングし、上記２つのフラグメントを逆方向に再結合する工程を含むことを特徴としている。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、野生型タンパク質アレルゲンのアレルゲン活性を低下させる方法、新規アレルゲン誘導体、およびアレルギー予防接種に関するものである。
アレルギーは、通常は無害である外来（すなわち、非自己）物質（“アレルゲン”）に対する反応能力の、遺伝的あるいは後天的な特異的変化である。アレルギーは、影響を受けた器官系（皮膚、結膜、鼻、咽頭、気管支粘膜、胃腸管）における炎症反応と、アレルギー性鼻炎、結膜炎、皮膚炎、アナフィラキシーショック、および喘息などの即時性の病徴と、喘息の後期反応やアトピー性皮膚炎などの慢性的な病気の徴候と関連している。
Ｉ型アレルギーは遺伝的に決められている過敏性疾患であり、産業化した世界人口のおよそ２０％に影響を与えている。Ｉ型アレルギーの病態生理学的な顕著な特徴は、ほかの無害な抗原（アレルゲン）に対する免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の産出である。
現在、アレルギーを引き起こす原因に対する唯一の治療法は、アレルゲン特異的な免疫療法である。アレルゲン特異的な免疫療法では、アレルゲン特異的な反応を引き起こさなくするために、一回の投薬量を増加させながら患者に投薬を行う。アレルゲン特異的な免疫療法の臨床効果を示すいくつかの研究がある一方で、その基礎をなすメカニズムは完全には明らかになっていない。
アレルゲン特異的な免疫療法の最大の欠点は、環境由来のアレルゲン抽出物の使用に依存していることである。環境中のアレルゲン抽出物を、少なくとも産業生産レベルまで規格化するのは、不可能ではないにしろ難しい。また、そのような環境中のアレルゲン抽出物は、異なったアレルゲン性および非アレルゲン性の化合物からなりたっている。このために、投与した抽出物に特定のアレルゲンが含まれていないという可能性がある。さらに悪い場合には、含まれる成分に対する新しいＩｇＥ特異性を、治療している間に患者が作り出す可能性もありうる。抽出物に基づく免疫療法のほかの欠点は、生物学的に活性なアレルゲン調製物の投与は、アナフィラキシー性の副作用を引き起こすことがあるという事実によるものである。
分子生物学の技術を、アレルゲンの特徴づけの分野に応用することにより、環境中のアレルゲンに関連のあるすべてをコードするｃＤＮＡを単離することができ、組み換えアレルゲンを生成することができるようになった。このような組み換えアレルゲンを用いることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断方法（たとえば、血清中のアレルゲン特異的なＩｇＥ抗体の検出）、あるいはｉｎ ｖｉｖｏの検査により、個々の患者における反応性の特徴を決めることが可能となった。この技術に基づき、アレルギー、特にＩ型アレルギーに対する患者の免疫感作の特徴に合わせた、構成物質に基づく新規な予防接種方策を発展させることが可能になったようである。しかしながら組み換えアレルゲンは、それらに対応する自然界の物質に類似しているため、組み換えアレルゲンもまた重大なアレルゲン活性を呈していた。組み換えアレルゲンは、野生型アレルゲンのアレルゲン活性を非常によく模倣している。したがって、環境由来のアレルゲンを投与する免疫療法においてみられるような、アレルゲン活性に関連するすべての障害は、組み換えアレルゲンにおいてもみられた。よって免疫療法を改善するためには、組み換えアレルゲンのアレルゲン活性を低下させる必要がある。それにより、アナフィラキシー性の副作用を引き起こす危険性をわずかにして、投与するアレルゲンの一回の投与量を増加させることができるようになる。
Ｔ細胞のエピトープのみを含むペプチドの投与は、アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性だけに影響を与えるということはこれまで示唆されている。Ｔ細胞エピトープは、無傷のアレルゲンが抗原提示細胞によりタンパク質分解されて生じた低分子ペプチドである。そのようなＴ細胞エピトープは合成ペプチドとして産出可能である。Ｔ細胞エピトープを用いてこれまでにおこなった試験では、芳しくない実験結果および低い効果しか得られなかった。Ｔ細胞ペプチドに基づいた免疫療法において低い効果しか得られなかった原因の説明として、いくつか考えられる。第一に、活性ではなくＴ細胞寛容を獲得するのに適した量を投与することが難しいという可能性がある。第二に、低分子のＴ細胞エピトープペプチドは生体内における半減期が短い可能性がある。第三に、アトピー性の個々の患者におけるＩｇＥ産生は記憶免疫応答であるという多くの証拠があることである。記憶免疫応答は、新たなクラススイッチを必要とせず、したがってＴ細胞由来のサイトカインによっては制御されない。Ｔ細胞エピトープの投与だけに基づいている免疫療法の手法は、それゆえ、アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性を調節しているかもしれないが、すでにクラススイッチした記憶Ｂ細胞によるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の産出にほとんど影響を及ぼしていないかもしれない。
組み換えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成により、低アレルゲン性アレルゲン誘導体または断片を産出することがさらに示唆されている。そのような誘導体あるいは断片は、Ｔ細胞エピトープを有しており、天然のアレルゲンに対するＩｇＥの認識と競合するＩｇＧ抗体を誘導できる。アレルゲンのタンパク質分解により低分子アレルゲン断片が生じることは２０年以上前に示されている。低分子のアレルゲン断片は、部分的にＩｇＥ結合能を保持しているが、即時型の免疫応答を引き起こすことはない。アレルゲンのタンパク質分解を制御および規格化するのは難しいが、分子生物学はＩｇＥ結合ハプテンを産出する新たな手法を切り開いた。そのようなＩｇＥ結合ハプテンは、アナフィラキシー効果の危険性を低下させる能動免疫化、および、受動免疫療法に実用的である。受動免疫療法は、アレルゲンと接触するよりも前にエフェクター細胞に結合したＩｇＥを飽和させることにより、アレルゲンにより誘導される仲介物質の放出を阻止する。
遺伝子工学により、低アレルゲン性のアレルゲンの変形を産出することがさらに示唆されていた。これは、アレルゲンは自然界では、数アミノ酸残基のみが異なるアイソフォーム、および／または、構造が異なりＩｇＥとの結合能が低いアイソフォームとして存在するという観察結果に基づくものである。たとえば、カバノキの主要な花粉アレルゲンＢｅｔ Ｖ １の遺伝子工学によるオリゴマー化は、アレルゲン活性が大幅に低下した組み換え三量体を生み出した。別の例として、点変異の導入は、アレルゲン構造における立体構造の変化を引き起こして非連続性のＩｇＥエピトープを分離させるか、またはＩｇＥ結合能に直接影響を及ぼすことが示唆されている(Valenta et al., Biol.Chem.380 (1999), 815-824)。
また、アレルゲンを複数の部分（たとえば、２つの部分）に断片化させると、生来の折りたたみ構造に類似の構造が失われるために、アレルゲンのＩｇＥ結合能およびアレルゲン活性がほぼ完全に欠損することが示された。たとえば、Ｂｅｔ ｖ １に関しては、Vrtala et al. (J.Clin.Invest.99 (1997), 1673-1681)、Ｂｅｔ ｖ ４に関しては、Twardosz et al. (BBRC 239 (1997), 197-204)、Ａｌｎ ｇ ４に関しては、Hayek et al. (J. Immunol.161 (1998), 7031-7039)、ウシ鱗屑アレルゲン（bovine dander allergen）に関してはZeiler et al. (J.Allergy Clin. Immunol.100 (1997), 721-727)、Ｌｅｐ ｄ ２に関しては、Elfman (Int.Arch.Allergy Immunol.117 (1998), 167-173))、Ｐｈｌ ｐ ７に関しては、Westritschnig (J.Immunol.172 (2004), 5684-5692)などである。
非連続性／立体配座のＩｇＥエピトープを主として含んでいるタンパク質の断片化は、アレルゲンのＩｇＥ結合能を大幅に低下させる。この知見に基づき、そのような低アレルゲン性のアレルゲン断片は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて防御免疫応答を引き起こすことが可能であるかどうか、従来技術において研究されており、以下の文献に示されている。Westritschnig et al. (Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003), 495-500)。
本発明は、上記知見に基づいて改善したアレルギー免疫療法の方法および手段を提供することを目的とする。本方法は、効果的であり、アナフィラキシーショックの危険が低下しており、容易に個々の患者の必要性に適用し、その必要性に合わせることができ、かつ容易に産業上の規模まで変換されるだろう。
したがって、本発明は、アレルゲン活性が低下した野生型タンパク質アレルゲン誘導体を生成する方法であって、アレルゲン活性を有する野生型タンパク質アレルゲンを用意する工程と、アレルゲン活性が低下した、またはアレルゲン活性が欠如した２つのフラグメントに上記野生型タンパク質アレルゲンを分割する工程と、逆方向に上記２つのフラグメントを再結合する工程とを含むことを特徴としている。
本発明に係る方法は、初期不連続／高次構造ＩｇＥエピトープを含有するタンパク質を断片化することによって、アレルゲンのＩｇＥ結合能の実質的な低下が引き起こされるという事実に基づいている。しかし、特定のアレルゲンのフラグメントは、抗原性が非常に低いため、防御抗体応答を生じない（Westritschnig et al., (2004)）。
本発明に係る新規かつ定義されたタンパク質アレルゲン誘導体は、Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープに基づいた手法を組み合わせた利点を提供する。同時に、フラグメントのみのワクチン接種、またはフラグメントの精密な処理（例えば、ＩｇＥ結合ハプテンおよび３つ以上のフラグメントの混合）による不都合は、本発明のアレルゲン誘導体には存在しない。
事実、野生型アレルゲンに非常によく似た（構成成分が完全に一致する）構造（言い換えれば、野生型アレルゲンの全てのアミノ酸に関して類似した構造）において得られる最適の結果が、本発明においても示されている。しかしながら、上記構造のアレルゲンは、アレルゲン活性を有していない（または、アレルゲン活性が十分に低下している）。もちろん、アレルゲン誘導体を生成する間に、いくつかのアミノ酸残基の欠失（削除）または追加（挿入）があればよく、またフラグメントを直接結合する代わりに架橋により結合する場合であっても、依然として本発明の利点は保持される。
このアレルゲン活性の低下または欠如は、公知のまたは一般的な手法にしたがって、アレルゲンを特定のフラグメントに分割することによって達成される。この一般的な手法に加えて、アレルゲンの２つのフラグメントを、逆方向に再結合する。これによって、アレルゲンの有する本来の関連構造情報を全て含むが（本発明に係るアレルゲン誘導体において、アレルゲンのアミノ酸配列は完全、またはほぼ完全に含まれる）、野生型アレルゲンと比較してアレルゲン活性をほとんど残していないアレルゲン誘導体を提供する。
本発明に係るこれらのｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ型の誘導体は、個々のアレルギー患者に対して好適であり、かつ効果的な免疫療法を可能にする。また、上記誘導体を用いることによって、一連の工程の規模を容易に拡大可能である。本発明に係る誘導体は、患者のＩｇＥと野生型アレルゲンとの結合をブロックする保護ＩｇＧ抗体を誘導し、アレルゲンが誘導する好塩基球脱顆粒を阻害する。
本発明の方法は、組換えＤＮＡ技術に特に適している。ひとたび誘導体が遺伝子工学によって生成されれば、好適な宿主における導入遺伝子発現によって、産業上規模の多量の誘導体を容易に得ることができる。本発明に係るアレルゲン誘導体は、高い発現能力を有する宿主において生成されることが好ましい。
本発明に係る変異した好適なアレルゲンは、例えば、www.allergen.org/List.htmに基づいており、全ての主要なタンパク質アレルゲンが含まれる。本発明に係るアレルゲンとして特に好ましいアレルゲングループとして、プロフィリン、特にＰｈｌ ｐ １２、カンバアレルゲン、特にＢｅｔ ｖ ４、チリダニアレルゲン、特にＤｅｒ ｐ２、貯蔵庫ダニアレルゲン、特にＬｅｐ ｄ ２、およびオオアワガエリアレルゲン、特にＰｈｌ ｐ ７、および表１に示すアレルゲンが挙げられる。
表１は、本発明に係るフラグメントの移し替えによって変異される好適なアレルゲンである（参考文献も含む）。
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アレルゲン活性の顕著な低下は、本発明に係るスプライシング／ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ型変異により得ることができる。上記の方法によれば、野生型タンパク質アレルゲンから、上記活性をほとんど消失させることができる。本発明の好適な実施態様において、上記野生型アレルゲンと比較したときの上記誘導体によるＩｇＥ結合能の抑制低下率が、少なくとも１０％、好ましくは２０％、さらに好ましくは３０％であることによって、上記誘導体のアレルゲン活性の低下を評価する。好適な評価方法は、下記の実施例において示す。
また、アレルゲン活性の低下を特定するための好適な方法として、ＩｇＥ結合の測定も使用可能である。点染色した上記誘導体に対して、アレルギー患者の血清ＩｇＥ抗体が結合しないことによって、最も顕著にアレルゲン活性の低下を評価することができる。この方法についても、下記実施例において示す。
本発明に係る生成方法によって得られた誘導体は、薬学的に許容される添加剤と容易に組み合わせることが可能であり、医薬調整物とすることができる。
本発明に係る誘導体は、好適なワクチン補助剤と組み合わせることによって、薬学的に許容されるワクチン調整物とすることが好ましい。
好適な実施態様によれば、本発明に係る誘導体は、当該誘導体を混合ワクチンとするために、さらなるアレルゲンを組み合わせることが可能である。上記アレルゲンは、野生型アレルゲン、特に野生型アレルゲンの混合物、組換え野生型アレルゲンの混合物、野生型タンパク質アレルゲン誘導体の混合物、またはこれらの混合物であることが好ましい。上記混合物は、特定の患者のニーズ（アレルゲンの特徴）に対して特異的に用いることができる。
好適な実施態様において、上記調整物は、アレルゲン抽出物をさらに含有している。
本発明に係る他の態様によれば、アレルゲン誘導体は、１からＺのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する野生型タンパク質アレルゲンのアレルゲン誘導体であって、上記誘導体は、野生型アレルゲンの２つのフラグメントを、Ｎ末端からＣ末端に向かう方向に隣接して含有し、Ｎ末端側の当該フラグメントは、Ｘ〜Ｚのアミノ酸からなるアミノ酸配列により示され、Ｃ末端側の当該フラグメントは、１〜Ｘのアミノ酸からなるアミノ酸配列によって示されるものであることを特徴としている。上記２つの野生型アレルゲンのフラグメントは、アレルゲン活性が低下または欠失している。
本発明に係るアレルゲン誘導体において、上記Ｘ〜Ｚのアミノ酸からなるアミノ酸配列、および上記１〜Ｘのアミノ酸からなるアミノ酸配列は、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも６０アミノ酸からなるを特徴としていることが好ましい。
上記Ｘ〜Ｚのアミノ酸からなるアミノ酸配列と、上記１〜Ｘのアミノ酸からなるアミノ酸配列とは、その全長において、５０％未満、好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満相違することが、より一層好ましい。
特に好ましい本発明に係るアレルゲン誘導体は、アレルゲンＩ型、好ましくは表Ａのアレルゲン、より好ましくは、オオアワガエリ（Phelum pratense）花粉、特にＰｈｌ ｐ １２、カンバ（Betula verrucosa）花粉、特にＢｅｔ ｖ ４、スズメバチ（Vespula vulgaris）毒、アシナガバチ（Polistes annularis）毒、カベイラクサ花粉、ライグラス花粉、チリダニアレルゲン、特にＤｅｒ ｐ ２などから選択される。
本発明に係る誘導体は、１つのアレルゲンだけでなく、２つ以上のアレルゲンを含有するアレルゲン組成物であることが好ましい。上記誘導体は、アレルゲン抽出物と混合することもできる。アレルゲン抽出物は、非加工の抽出物中における特定のアレルゲンの不足を代用するために、本発明の誘導体によって補われる。アレルゲンの混合物は、アレルギー反応を示すアレルゲンが１つだけでない患者に対して、特に必要とされている。したがって、上記誘導体をさらに（他の）アレルゲンと混合して、混合ワクチンとして提供することも好適である。
したがって、本発明に係るアレルゲン誘導体は、アレルゲン組成物、特に野生型アレルゲンの混合物、組換え野生型アレルゲンの混合物、野生型タンパク質アレルゲン誘導体の混合物またはそれらの混合物に、野生型アレルゲンを混合することが好ましい。アレルゲン組成物は、同一および／または異なるアレルゲンならびに／あるいはそのイソ型もしくは突然変異体のいずれかであり、医薬品中の野生型タンパク質アレルゲンまたは組換えアレルゲンと比較して全体的にアレルゲン活性が低下したものである。
上記医薬品は、アレルゲン抽出物をさらに含有していることが好ましい。
本発明に係るアレルゲンまたはアレルゲン組成物は、薬学的に許容される添加剤を含有していることが好ましい。
本発明の他の態様は、アレルゲン特異的免疫療法の調整医薬として本発明に係るアレルゲン誘導体を使用することに関する。
本発明のさらに他の態様は、受動免疫のための調整医薬として本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物を使用することに関する。
本発明の他の態様は、予防免疫のための調整医薬として本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物を使用することに関する。
本発明に係るアレルゲン誘導体および組成物は、アレルギーを効果的に抑制するための各個人の予防免疫接種に使用することができる。本発明に係るアレルゲン誘導体および組成物、例えばＤｅｒ ｐ ２アレルゲン誘導体は、野生型アレルゲンに比べてアレルギー性免疫反応が低下しているため、好ましくない副作用を生じることはない。上記医薬品の利点は、１から３歳の幼児に対して投与できることである。幼児がアレルゲンと接触するより前に予防接種することによって、上記幼児におけるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の形成を阻害できる。
調整医薬は、例えば、補助剤、希釈剤、防腐剤などの好適な成分をさらに含有していることが好ましい。
本発明の好適な実施態様によれば、調整医薬は、投与量に対して組換えアレルゲン誘導体を１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜２００μｇ含有することが好ましい。好適な投与方法には、一般的な予防接種として、またはアレルギー免疫療法特有の予防接種として説明および提案されている全ての標準的な投与方法が含まれる。例えば、経口投与、経皮投与、静脈内投与、経鼻投与、および粘膜経由による投与などである。本発明に係る調整医薬を効果的な量投与することによりアレルギーを治療および予防する方法も、本発明の範疇である。
本発明の他の態様は、本発明に係るアレルゲン誘導体を生成する方法であって、本発明に係るアレルゲン誘導体をコードするＤＮＡを用意する工程と、上記ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する工程と、上記宿主細胞において上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離する工程とを含むことを特徴としている。
上記宿主は、高い発現能力を有していることが好ましい。
本明細書において用いる「高い発現能力を有する宿主」とは、培養液１Ｌあたり少なくとも１０ｍｇ、好ましくは少なくとも１５ｍｇ、より好ましくは少なくとも２０ｍｇの量の目的とするタンパク質を発現する宿主を意味している。もちろん、発現能力は、選択した宿主および発現システム（例えば、ベクター）にも依存している。本発明における宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｕｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または植物細胞（ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）（例えば、タバコ由来）などであることが好ましい。
もちろん、本発明に係るアレルゲン誘導体は、特に、化学合成または準化学合成といった、他の好適な方法によっても生成できる。
本発明の他の態様は、本発明に係る方法によって得られる第１の野生型プロフィリン分子から得られるプロフィリン誘導体、または本発明に係る第１の野生型プロフィリン分子のアレルゲン誘導体を、第２の野生型プロフィリン分子によって引き起こされるアレルギー疾患を予防または治療するための調整医薬を生成するために用いることに関する。
驚くべきことに、本発明に係る第１の野生型プロフィリン分子のプロフィリン誘導体によって生じた抗体は、他の野生型プロフィリン分子に対しても結合するようになる。したがって、上記誘導体は、多数のアレルギー疾患の治療または予防に用いることができる。上記プロフィリン誘導体は、わずか１つまたは２つの抗原性分子によりそれぞれの免疫を付与し得る広域ワクチンとして用いることができる。プロフィリンは、ほぼ全ての真核細胞において示されるアレルゲンであり、かつ、経口摂取後の口腔アレルギー症（かゆみ、ならびに唇および舌の腫れ）だけでなく呼吸器アレルギー（例えば、鼻の結膜、喘息）を引き起こす汎アレルゲンである。
例えば、組み換えたＰｈｌ ｐ １２誘導体であるＭＰ１２は、植物由来の食品と同様に花粉におけるプロフィリンを認識して免疫性を付与した後、ＩｇＧ抗体を誘導する。ＭＰ１２により誘導された抗体は、患者血清ＩｇＥの花粉由来プロフィリンに対する結合を阻害し、さらに植物食品に由来するプロフィリンに対する血清ＩｇＥの結合も阻害する。このように、他の組換えプロフィリン分子と同様に、ＭＰ１２も、プロフィリンアレルギーに起因する花粉−食品交差性感作の治療のために好適である。
好適な実施形態によれば、上記第１および上記第２のプロフィリン分子は、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｂｅｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｎａ ｃ、Ａｐｉ ｇ ４、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ｃｏｒ ａ ２、およびＤａｕ ｃ ４からなる群より選択される。
特に、これらのアレルゲンは、それらの構造的な相似性のため、本発明に係る使用に好都合である。しかし、相互に構造的な相似性を共有する他のアレルゲンであっても、それ相応に使用できることは明らかである。
上記第１のプロフィリン分子は、Ｐｈｌ ｐ １２であることが好ましく、上記第２のプロフィリン分子は、Ｂｅｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｎａ ｃ、Ａｐｉ ｇ ４、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ｃｏｒ ａ ２、およびＤａｕ ｃ ４からなる群より選択されることが好ましい。
特に、Ｐｈｌ ｐ １２の誘導体を広域ワクチンとして用いることができることが、実験において示されている。特に好適な誘導体は、融合タンパク質からなる。すなわち、野生型Ｐｈｌ ｐ １２の１番目〜７７番目のアミノ酸のＮ末端に、７８番目〜１３１番目のアミノ酸を融合する（図１参照）。
本明細書において開示した、および本発明に係る方法によって得られるＢｅｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｎａ ｃ、Ａｐｉ ｇ ４、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ｃｏｒ ａ ２、およびＤａｕ ｃ ４のプロフィリン誘導体は、プロフィリンアレルギーに起因する花粉−食品交差性感作の治療および予防の少なくとも一方に用いることが好ましい。
本発明は、下記実施例および図面によってさらに説明するが、それによって限定されるものではない。
実施例１〜５において、アレルゲンとしてプロフィリンを用いて、本発明の原理を例示した。プロフィリンは、オオアワガエリ花粉由来プロフィリン（ｔｉｍｏｔｈｙ ｇｒａｓｓ ｐｏｌｌｅｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎ）Ｐｈｌ ｐ１２を用いた。実施例６〜１１は、主要なダニアレルゲンＤｅｒ ｐ２（ヤケヒョウヒダニ：Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）に関連する実施例である。実施例１２および１３では、オオアワガエリ花粉ではなく他の源に由来するプロフィリンとＰｈｌ ｐ１２との交差反応性を示している。実施例１２および１３では、他のプロフィリンに起因するアレルギー病に対するワクチンとして、Ｐｈｌ ｐ１２誘導体を用いたときの適合性を、結果として明らかにした。
〔実施例１：オオアワガエリ花粉由来プロフィリンからの低アレルギー性誘導体の特定〕
ａ）オオアワガエリ花粉プロフィリン Ｐｈｌ ｐ１２からの低アレルギー性変異体の生成、発現および精製
Ｐｈｌ ｐ１２誘導体を再構成する技術として、オーバーラップＰＣＲ法を用いた。ｐｅｔ１７ｂ発現ベクターでサブクローニングしたオオアワガエリ花粉 Ｐｈｌ ｐ１２をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲのテンプレートとして用いた。ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位とオーバーラップする配列、およびＣ末端６ヒスチジン残基をコードする配列を含む２つのＰＣＲフラグメントを生成するために、以下のプライマーを用いた。これらの配列は、タンパク質を精製するためのものである。フラグメント１を、ＭＤＥ−１プライマー：５’ＣＡＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＴＣＡＴＣ３’、およびＭＤＥ−２プライマー：５’ＧＴＡＣＧＴＣＴＧＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＧＴＴＣＡＡＣ３’を用いて生成した。フラグメント２を、ＭＡＢＣ−１プライマー：５’ＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣＡＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＧＡＣＧ３’、およびＭＡＢＣ−２プライマー：５’ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡ３’を用いて生成した。ついで、上述したように得られた両方のＰＣＲ産物を、プライマーＭＤＥ−１およびＭＡＢＣ−２を用いたオーバーラップＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。このオーバーラップＰＣＲ反応は、Ｐｈｌ ｐ１２誘導体（例えばＭＰ１２）をコードするｃＤＮＡを生成するために行った（図１に概略図を示した。）。ＭＰ−１２をコードするＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりクローニングし、ＤＮＡ配列をＤｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｈｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。
タンパク質を精製するために、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素をもちいたｐｅｔ１７ｂ発現ベクターシステムにより、ＭＰ−１２をコードするｃＤＮＡをサブクローニングし、再びＤｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｈｃｈ）によりＤＮＡ配列を確認した。
タンパク質を精製するために、液体培地中の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｅａｓｔ Ｋｅｗ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）内でＭＰ−１２を発現させた。大腸菌をアンピシリン １００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地中で、ＯＤ６００が０．４になるまで成長させた。イソプロピル−ｂ−チオガラクトピラノシドを添加して組換えタンパク質の発現を最終濃度１ｍＭまで誘導し、さらに、３７℃で４時間培養した。培地 ５００ｍｌから遠心分離によって大腸菌細胞を取り出し、バッファＡ（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ 尿素、ｐＨ７．５）中に再懸濁した。２０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎ）に移し、ｐＨ値が低下したバッファＡを用いて、６ヒスチジンで標識したタンパク質を溶出した。ｐＨ４．９でタンパク質を溶出した後、６〜０Ｍ 尿素を含むｐＨ７．５のバッファＡに対して徐々に透析することによって、タンパク質を再フォールディングさせた。遠心実験により示されるように、ＭＰ１２が溶解したところで、リン酸塩バッファ（ＰＢＳ）に対して最終透析工程を行った。
タンパク質の精製度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を用いて定量した。
ｂ）二次構造分析
Ｊａｓｃｏ Ｊ−７１５分光偏光計で、２０℃で平衡状態になるパス長０．１ｃｍの細胞を用いて、円偏光二色性（ＣＤ）測定を行った。スキャニング速度１００ｎｍ／ｍｉｎ、解像度０・５ｎｍでスペクトルを記録した。結果を３回のスキャニング結果の平均値とした。同様の条件下で得たＭｉｌｌｉＱスペクトルに対応して減算することによって、最終的なスペクトルを基準調整した。結果を二次構造評価プログラムＪ−７００に適合させた。
二次構造評価プログラムの結果は、相当な量の誘導体の二次構造を示した。Ｐｈｌ ｐ１２のスペクトルは、２１８ｎｍで最小値を示し、２００ｎｍより下で最大値を超えた。一方、誘導体の最小値は、より小さい波長にシフトし、零交差曲線は２００ｎｍよりも少なかった（図２）。この実験結果は、誘導体内のランダムコイル二次構造部分が増加していることを示している。
ｃ）ポリプロリンに対する親和性が欠落した低アレルギー性Ｐｈｌ ｐ１２誘導体
ポリプロリンに対する親和性は、様々な生物由来のプロフィリンに共通する特徴である。低アレルギー性Ｐｈｌ ｐ１２誘導体であるＭＰ１２は、ポリプロリンに結合せず、それゆえに変化した生化学特性を示すことが明らかにされた。
ＰＢＳ中の精製した組換えＭＰ１２のほぼ５ｍｇに対して、ＰＢＳで平衡状態にしたポリプロリン−ＣｎＢｒ充填活性化アガロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）処理を行った。カラムにつかない画分を回収した後、カラムを３容量（ＰＢＳ）で洗浄し、２Ｍまたは６Ｍ 尿素をそれぞれ含む５×１ｍｌＰＢＳを用いて溶出した。流れ落ちたもの、洗浄物、および溶出物から１０ｍｌ分別し、１４％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。そして、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ染色してタンパク質を可視化した（図３）。その結果、ポリプロリン結合部位の欠落は、Ｐｈｌ ｐ１２の一次構造の再編成に起因することが示された。
〔実施例２：ＭＰ１２のＩｇＥ結合能の減少〕
ａ）大幅に低下したＩｇＥ結合能を示すＭＰ１２
２４人のプロフィリン感受性患者からの血清を点染色分析することによって、組換えＭＰ１２のＩｇＥ結合能を、組換えＰｈｌ ｐ１２の野生型のＩｇＥ結合能と比較した（図４）。Ｐｈｌ ｐ１２およびＭＰ１２は、コントロールとして用いたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と同様に、ニトロセルロース上に点染色され、２４人のプロフィリン感受性患者の血清で検出された。１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、ＩｇＥ抗体に対する結合を検出した。全ての患者において、Ｐｈｌ ｐ１２野生型のＩｇＥ反応性が見られた。一方、２４人の患者において、ＭＰ１２またはコントロールとして用いたタンパク質ＨＳＡがＩｇＥに対して反応した患者は２４人中１人もいなかった（図４）。
ＭＰ１２のＩｇＥ結合能の減少量に対して、液相抑制を行った。６人のプロフィリン感受性患者から得た目的の血清を、１０ｍｇのＰｈｌ ｐ１２およびＭＰ１２のいずれかと共にプレインキュベートし、ついでＰｈｌ ｐ１２（５ｍｇ／ｍｌ）を結合させたＥＬＩＳＡプレートと共にインキュベートした。アルカリフォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって、ＩｇＥ抗体への結合を検出した。
ＩｇＥ結合抑制を、以下の式により算出した：
抑制（％）＝１００×（（Ａ−Ｂ）／Ａ）；
ここで、Ａは血清をＢＳＡと共にインキュベートした後に得られるＯＤ値を表し、Ｂは血清をＰｈｌ ｐ１２またはＭＰ１２と共にそれぞれインキュベートした後のＯＤ値を表している。
ＩｇＥのＰｈｌ ｐ１２対する結合を抑制するＭＰ１２の抑制能を、表２において百分率として示した。ＭＰ１２に対する抑制率は、２０〜４０％の範囲内で、平均すると３１．２％であった。一方。Ｐｈｌ ｐ１２が達する抑制率は、７６〜９１％（平均８６％）であった。
Figure 2008521837
表２は、Ｐｈｌ ｐ１２およびＭＰ１２を用いた、固定したＰｈｌ １２に対する抗体結合の抑制の結果を示している。ＩｇＥ抗体結合は、６人のプロフィリン感受性患者からの血清を、野生型Ｐｈｌ ｐ１２またはＭＰ１２と共にプレインキュベートすることによって抑制された。抗体結合の平均抑制率を算出し、表中に示した。
ｂ）ＭＰ１２が示す減少したアレルゲン活性
ついで、プロフィリンアレルギー患者の好塩基性白血球からのヒスタミン放出誘因能を、再構成したＰｈｌ ｐ１２と野生型Ｐｈｌ ｐ１２とにおいて比較した。
ヘパリン処理したオオアワガエリ花粉アレルギー患者の血液サンプルから、デキストラン沈降により顆粒球を単離した。単離後、様々な濃度に調整したＰｈｌ ｐ１２、ＭＰ１２、またはコントロールとして用いるモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）と共に、細胞をインキュベートした。上清に放出されたヒスタミンを、放射線免疫検定法（Immunotech）により測定した。細胞を凍結解凍した後、総ヒスタミン量を決定した。結果を重複測定の平均値として示し、総ヒスタミン量の比率を表している。
図５に例示するように、Ｐｈｌ ｐ１２によって、両患者からの好塩基球におけるヒスタミン放出は、添加量に依存して強く誘導された。そして、最大ヒスタミン放出をもたらす濃度は１０−５〜１０−４ｍｇ／ｍｌであった。一方、１０〜２ｍｇ／ｍｌの濃度において、ＭＰ１２と共にインキュベートした細胞からはヒスタミン放出が観察されなかった。これは、アレルゲン活性が１０００倍以上減少したことを示している。さらに、ＭＰ１２添加後の好塩基球からの最大ヒスタミン放出量は、野生型Ｐｈｌ ｐ１２によって達する最大量よりも低いと考えられる。
〔実施例３：他の花粉由来のプロフィリンと同様に野生型Ｐｈｌ ｐ１２を認識するＩｇＧ抗体の、ＭＰ１２免疫による誘導〕
再構成Ｐｈｌ ｐ１２による免疫によって、野生型Ｐｈｌ ｐ１２および他の花粉由来のプロフィリンに反応するＩｇＧ抗体が誘導されるかどうかを実験するために、フロイントの完全および不完全アジュバント（２００ｍｇ／注入）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｋｉｓｓｌｅｇｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ウサギをＰｈｌ ｐ１２またはＭＰ１２により３回免疫した。血清サンプルを４週間間隔で得た。得られた血清を、分析するまで−２０℃で保存した。
ＭＰ１２およびＰｈｌ ｐ１２のＩｇＧ抗体誘導反応性を、ＥＬＩＳＡによって調べた（図６）。カバ（Ｂｅｔ ｖ ２）およびヨモギ由来のプロフィリンと同様に、Ｐｈｌ ｐ１２を用いてＥＬＩＳＡプレート（５ｍｇ／ｍｌ）上をコーティングし、ウサギ抗血清を１：２０００〜１：６４０００の間で順次希釈調整したものと共にインキュベートした。１：１０００に希釈した、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギ抗血清（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、結合したウサギ抗体を検出した。
ＭＰ１２はＩｇＧ抗Ｐｈｌ ｐ１２抗体反応を誘導した。この結果は野生型Ｐｈｌ ｐ１２で誘導したものに匹敵した（図６Ａ）。さらに、ＩｇＧ抗体を誘導したＰｈｌ ｐ１２およびＭＰ１２は、カバおよびヨモギ由来プロフィリンと交差反応した（図６Ｂおよび図６Ｃ）。
〔実施例４：抗ＭＰ１２抗体による、芝花粉アレルギー患者から得た血清ＩｇＥの完全なＰｈｌ ｐ１２に対する結合抑制〕
アレルギー患者のＩｇＥがＰｈｌ ｐ１２に結合するのを抑制する、ＭＰ１２誘導ウサギＩｇＧの可能性をＥＬＩＳＡ競合分析によって調査した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｒｏｓｋｌｉｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をＰｈｌ ｐ１２（１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、それぞれ１：２５０で希釈した抗ＭＰ１２抗血清、またはＰｈｌ ｐ１２抗血清と共にプレインキュベートした。また、コントロールとして、それぞれに対応する免疫前の血清と共にＰｈｌ ｐ１２をプレインキュベートした。洗浄後、７人のＰｈｌ ｐ１２感受性芝花粉アレルギー患者からの血清を１：３に希釈したものと共にプレートをインキュベートした。ついで、モノクローナルラット抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を１：１０００に希釈し、これを用いて処理した後、１：２０００に希釈したＨＲＰ結合ヒツジ抗ラットＩｇ抗血清（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理することによって、結合ＩｇＥ抗体を検出した。抗ペプチドまたは抗変異抗血清と共にプレインキュベートすることによるＩｇＥ結合抑制率を、次式により算出した：
％ＩｇＥ結合抑制＝１００−ＯＤＩ／ＯＤＰ×１００
ここでＯＤＩおよびＯＤＰは、ウサギ免疫血清および対応する免疫前血清と共に、それぞれプレインキュベートした後の吸光度を表している。表３に示すように、抗Ｐｈｌ ｐ１２抗体用いて達したＰｈｌ ｐ１２に対する患者由来ＩｇＥ結合抑制は、３０．２〜６６．７％の間であった（平均抑制率４９．８％）。同様に、ＭＰ１２に対する抗体を用いた場合、１０．８〜２７．６％（平均抑制率２０．８％）の範囲の抑制を示し、抗Ｐｈｌ ｐ１２のＩｇＥ反応性が大幅に減少したことを観察した（表３）。
Figure 2008521837
表３は、アレルギー患者から得たＩｇＥのｒＰｈｌ ｐ１２への結合のウサギ抗体による抑制を示している。７人のＰｈｌ ｐ１２アレルギー患者から得たＩｇＥのｒＰｈｌ ｐ１２結合抑制率を、ウサギ抗血清（ウサギ抗Ｐｈｌ ｐ１２、抗ＭＰ１２）と共にプレインキュベートすることによって調査し、平均抑制率を算出して示した。
〔実施例５：抗ＭＰ１２抗血清による好塩基球脱顆粒の抑制〕
ペプチド刺激ＩｇＧ抗体の生物学上の関連性および有効な保護活性を、アレルゲン特異的ＩｇＥを導入したラット好塩基球白血球（ＲＢＬ）細胞を用いた確立した細胞モデルシステムにおいて調査した。
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を９６ウエル組織培養プレートに播種した（４×１０４細胞／ウエル）後、７％ ＣＯ２の雰囲気下において、３７℃で２４時間インキュベートした。プロフィリン反応ＩｇＥを含むマウス血清を用いて、最終希釈１：３０で２時間、受動感作を行った。タイロード液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、ｐＨ ７．２）中で細胞層を２回洗浄することによって、結合していない抗体を除去した。事前にＰｈｌ ｐ１２特異的マウスＩｇＥを導入したＲＢＬ細胞をｒＰｈｌ ｐ１２（０．００５ｍｇ／ｍｌ）にさらした。Ｐｈｌ ｐ１２免疫ウサギおよびＭＰ１２免疫ウサギから得たウサギ抗血清、またはこれらに対応する免疫前血清０、２、５、７．５または１０％ ｖ／ｖと共に、タイロード液中でＰｈｌ ｐ１２を３７℃で２時間プレインキュベートした。
プレインキュベートしたＰｈｌ ｐ１２を、湿気のある雰囲気下において３７℃で３０分間、ＲＢＬ細胞に添加し、上清を８０ｍＭ ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）と共に、クエン酸塩バッファ（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）中において、３７℃で１時間インキュベートすることによって、β−ヘキソサミニダーゼ活性を分析した。グリシンバッファ（０．２Ｍ グリシン、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．７）１００ｍｌを添加することによって反応を終了した。蛍光マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ、Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、λｅｘ：３６０／λｅｍ：４６５ ｎｍで、蛍光度を測定した。結果を、細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共に細胞を溶菌した後の蛍光単位および総β−ヘキソサミニダーゼ放出率として記録した。
図７に例示するように、様々な濃度のウサギ抗ＭＰ１２抗体（２〜１０％ ｖ／ｖ）、およびウサギ抗Ｐｈｌ ｐ１２抗体、それぞれと共にＰｈｌ ｐ１２をプレインキュベートすることによって、Ｐｈｌ ｐ１２特異的マウスＩｇＥを事前に導入したＲＢＬ細胞からのｒＰｈｌ ｐ１２刺激中間物の放出の量依存的抑制が導かれた。免疫前Ｉｇと同じ濃度でアレルゲンをプレインキュベートしたとき、好塩基球脱顆粒の抑制は観察されなかった。
〔実施例６：ヤケヒョウヒダニアレルゲン Ｄｅｒ ｐ ２（Ｄｅｒ ｐ ２ハイブリッド）由来低アレルギー誘導体の発現、精製および特定〕
ハウスダストダニ（ＨＤＭ）アレルギーは、全てのアレルギー患者の５０％以上に影響する、世界中で最も一般的なアレルギーに属する。ヤケヒョウヒダニは、ヨーロッパにおいて、ハウスダスト中のアレルゲンの最も重要な原因として同定された。
これまでに、２０グループのダニアレルゲンが特定されており、グループ２のアレルゲンが、主要なダニアレルゲンとして同定された。このグループ２のアレルゲンに対して、８０％以上のダニアレルギー患者が感受性を示し、これらのアレルゲンは主にダニの排泄物に存在している。グループ２のアレルゲンは、当初、高いＩｇＥ結合活性を有する１４０００〜１８０００Ｄａのアレルゲンとして特定された。Ｄｅｒ ｐ ２をコードするｃＤＮＡクローンの単離および分析によって、Ｄｅｒ ｐ ２は、１２９アミノ酸残基を有するアレルゲンを含むことが明らかになった。このアレルゲンの算出された分子量は１４０００Ｄｓであり、Ｎ−グリコシル化部位を有していない。グループ２のアレルゲンは、３つのジスルフィド結合を含んでおり、２つの逆平行βシートを構成している。Ｄｅｒ ｐ ２のＴ細胞エピトープは、タンパク質の全領域に位置しており、ＩｇＥエピトープはコンフォメーションになることが示された。
海産物に対して新しいＩｇＥ反応活性を誘発したのと同様に(van Ree, R., et al. (1996) Allergy 51:108)、天然のダニ抽出物を用いた免疫療法の研究は、ＨＤＭ抽出物を用いた免疫療法中に生じるかもしれない系統面の危険な影響を明らかにしている(Akcakaya, N., et al. (2000) Ann Allergy Asthma Immunol 85:317)。
抽出物を基本とした免疫療法の欠点を克服するために、様々な方策が低アレルギー性アレルゲン誘導体の開発に適用されている。Ｄｅｒ ｐ ２の場合、部位直接変異によるジスルフィド結合を破壊する、Ｎ末端およびＣ末端を毛質させてジスルフィド結合を破壊する、または変異を導入することによって、ＩｇＥ反応性が低下した変異体が開発された。しかしながら、これらの生物学的活性には疑問がある。
以下に例示する、グループ２アレルゲンであるヤケヒョウヒダニ(Ｄｅｒ ｐ ２)の２つの組換えフラグメントを合成した。このフラグメントは、１〜５３アミノ酸および５４〜１２９アミノ酸を含み、Ｂ細胞エピトープの配座が破壊されている。さらに、２つのｒＤｅｒ ｐ ２を、ＰＣＲを基礎としたｇｅｎｅ−ＳＯＥｉｎｇ法によって逆オーダーで組み替えて、組換えＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド分子（５４〜１２９＋１〜５３アミノ酸）を構築した。
Ｄｅｒ ｐ ２の２つの組換えフラグメントは、１〜５３アミノ酸および５４〜１２９アミノ酸を含み、実施例１に概要を示したように、これらのフラグメントはＰＣＲ増幅により構築した（図８参照のこと）。Ｄｅｒ ｐ ２ハイブリッド分子を、ＰＣＲを基礎としたｇｅｎｅ−ＳＯＥｉｎｇ法によって逆オーダー（５４〜１２９＋１〜５３アミノ酸）で合成した(Linhart et al., FASEB J.16 (2002), 1301-1303)。
ａ）Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２フラグメント、およびＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドの大腸菌内における発現および精製
ヒスチジン標識したＤｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２フラグメント（１〜５３アミノ酸＋５４〜１２９アミノ酸）、およびＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド（５４〜１２９＋１〜５３アミノ酸）をコードするｃＤＮＡを、表４に示したプライマー（ＭＷＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＰＣＲ増幅により合成した。また、Ｄｅｒ ｐ ＲＮＡから逆転写することによって、Ｄｅｒ ｐ ２ｃＤＮＡを得た。
Figure 2008521837
表４には、フォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）およびオーバーラッププライマーを示した。ＥｃｏＲＩ部位およびＮｄｅＩ部位に下線を付した。ヒスチジンタグをコードする核酸を、太線の斜体文字で示した。
プライマー１および４をｒＤｅｒ ｐ ２ ｃＤＮＡの増幅にもちいた。ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント１（１〜５３アミノ酸）をコードするｃＤＮＡの増幅にはプライマー１および２を用いた。そして、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント２（５４〜１２９アミノ酸）をコードするｃＤＮＡの増幅には、プライマー３および４を用いた。ｒＤｅｒ ｐ ２ ハイブリッドをプライマー２および３、ならびに２つのオーバーラッププライマー５および６を用いて、ＰＣＲを基礎としたｇｅｎｅ−ＳＯＥｉｎｇ法によって合成した。上流のプライマーはＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含み、下流プライマーは、６つのヒスチジンコドンと同様にＥｃｏＲＩを含む。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ゲルによって精製し、プラスミドｐＥＴ１７ｂのＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。塩化カルシウム法を用いて、プラスミドをＸＬ−１ Ｂｌｕｅで染色した大腸菌に形質転換した。プラスミドＤＮＡをＮｕｃｅｌｏＢｏｎｄ ＡＸ ｋｉｔ−ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離し、ｃＤＮＡの挿入配列を自動シークエンシングシステム（ＭＷＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて両ＤＮＡ鎖の配列を確認した。
Ｃ末端ヘキサヒスチジン尾部を含む組換えタンパク質を、液体培地中のＢＬ２１（ＤＥ３）で染色した大腸菌内で発現させた。ＯＤ６００を１で、３７℃で５時間、０．５ｍＭのｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を用いて発現誘導した。４℃で、４，０００×ｇ、１５分間遠心分離することによって、細胞を回収した。
１１の液体培地から得た微生物ペレットを、２５ｍＭ イミダゾール １０ｍｌ、ｐＨ７．４、０．１％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に再懸濁し、リゾチーム１００μｇを用いて、室温で３０分間処理した。凍結および解凍（−７０℃／＋５０℃）サイクルを３回行うことによって、細胞を溶解し、室温で１０分間１μｇのＤＮａｓｅＩと共にインキュベートすることによって、ＤＮＡを分解した。そして、細胞破砕物を４℃で３０分間、１０，０００×ｇで遠心分離することによって取り除いた。ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１を可溶な破砕物中から得て、自然な条件下で、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂アフィニティカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通して精製した。
ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント２、およびｒＤｅｒ ｐ ２ ハイブリッドを封入体のペレット中から得た。このペレットを、室温で６０分間、ｐＨ８の条件下で、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌに可溶であった。
不溶な残留物を遠心分離（１０，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４°Ｃ）によって取り除き、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント２、およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドを変質した条件下で、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂アフィニティカラムを通して精製した(QIAGEN)。
９０％以上の精製された組換えタンパク質を含む画分を、ｐＨ７の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４に対して透析し、最終タンパク質濃度をＭｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を用いて決定した。
上述したハイブリッド分子の構造は、Ｄｅｒ ｐ ２の２つのβシートの少なくとも１つ、およびＣ８およびＣ１１９の間のジスルフィド結合が崩壊していた。それゆえに、Ｄｅｒ ｐ ２のＩｇＥエピトープの今フォメーションが破壊され、主要なＴ細胞エピトープは保存されていた。バンドに見られるように、ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体は、明白な蓄積が生じた大腸菌で過剰発現した（図９の第１レーン）。ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント１を可溶画分において検出した。一方、他のタンパク質は、不溶な封入体画分に蓄積していたが、尿素には可溶であった。ｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体を、ニッケルアフィニティクロマトグラフィにより精製し、大腸菌培養液１Ｌ当り２０〜３０ｍｇタンパク質が得られた。（図９、第２レーン）。透析によりリフォールディングした後、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント１、およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド０．５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度の生理学バッファ中に溶解した。一方、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント２は、０．１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度の生理学バッファ中に溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果は、タンパク質が９０％以上精製され、モノマー構造および二量体構造として分離したことを示した（図９、第２レーン）。
ｂ）ｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体のマトリックス支援レーザ脱離および飛行イオン化時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法による分析
レーザ脱離質量スペクトルを、飛行時間Ｃｏｍｐａｃｔ ＭＡＬＤＩ ＩＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｋｒａｔｏｓ、Ｕ．Ｋ．；ｐｉＣＨＥＭ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて線形モードで得た。１０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（６０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸が溶解している）中に溶解したサンプルを、マトリックスとして用いた。サンプルの準備のために、タンパク質およびマトリックス溶液を１：１で含む混合液を標的上に堆積し、空気乾燥した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による４つのタンパク質の分析によって、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント１、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント２、およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドの分子量が、それぞれ１５０７２．９Ｄａ、６８０６．７Ｄａ、９２１６．３Ｄａ、および１５００１．８Ｄａであることが明らかになった。この結果は、これたのタンパク質のアミノ酸配列から算出した理論上の分子量と一致する（図１０）。
ｃ）円偏光二色性（ＣＤ）分析
ＪＡＳＣＯ Ｊ７１５分光偏光計を用いて、製造者が推奨した方法にしたがってネオジムガラスを用いて波長を測定し、精製した組換えタンパク質ＣＤスペクトルを記録した。２回蒸留した室温の水に溶解したｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体（ｃ＝０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ）のＣＤ測定を行った。０．１ｃｍのパス長を有する円形の石英キュペットを用いて、解像度０．２ｎｍ、スキャン速度５０ｎｍ／分でスペクトルを記録した。少なくとも３回のスキャンデータを蓄積し、スペクトルを信号平均した。その結果を、一定の波長で残留した楕円率の平均として示した。
精製した組換えＤｅｒ ｐ ２の遠紫外線ＣＤスペクトルは、２１７ｎｍに負のバンドを示した。これは、βシートコンフォメーションを意味している（図１１）。対照的に、ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体のＣＤスペクトルは、これらのタンパク質が主としてフォールディングしていないことを示した。ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１は、２００ｎｍまでの負のバンドによって特定される、典型的なランダムコイルコンフォメーションを示した。また、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント２は、顕著なランダムコイルコンフォメーションを示したが、信号の輝度は非常に低かった。ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドのスペクトルは、少量のβシート構造と共に、主としてランダムコイルコンフォメーションを吸着した（図１１）。円偏光二色性分析によって、３次元コンフォメーションが破壊されていることが確認された。野生型ｒＤｅｒ ｐ ２と比較してｒＤｅｒ ｐ ２誘導体において、βシート構造の欠落または減少が見られた。
〔実施例７：ＩｇＥ結合能が大きく減少した組換えＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド（ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド）〕
精製した組換えＤｅｒ ｐ ２、フラグメント１（１〜５３アミノ酸）およびフラグメント２（５４〜１２９アミノ酸）の２つのｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント、ならびにｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドについて、非変性点染色分析によりＩｇＥ反応性を調べた。精製したタンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ）を２マイクロリットル、およびコントロールとしてＢＳＡを、ニトロセルロース膜片（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に点在させた。点染色したタンパク質を含むニトロセルロース片を、バッファＡ（４０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．５、０．５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ、０．０５％［ｗ／ｖ］ＮａＮ３）中に固定し、ダニアレルギー患者の血清、非アレルギー患者の血清（１：１０に希釈）、または血清を含まないバッファＡと共にインキュベートした。ＩｇＥ抗体結合を。１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出し、オートラジオグラフィにより可視化した。
非変性点染色分析によって、野生型アレルゲンｒＤｅｒ ｐ ２のＩｇＥ結合能を、２つのｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント、およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドと比較した。１７のダニアレルギー個体の血清（第１〜１７レーン）において、ニトロセルロースに点在したｒＤｅｒ ｐ ２に対するＩｇＥ反応が異なっていることを示した。一方、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１に対するＩｇＥ反応は、ほとんど検出されなかった。３つの血清だけが、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント２に対して非常に弱い結合を示し、また、２つの血清だけがｒＤｅｒ ｐ ２ ハイブリッドに反応した（図１２）。血清を含まないバッファと同様に、非アレルギー個体の血清は、ｒＤｅｒ ｐ ２またはｒＤｅｒ ｐ ２誘導体に対してＩｇＥ反応を示さなかった（図１２、第１８および１９レーン）。コントロールタンパク質として用いたＢＳＡに対するＩｇＥ反応は検出されなかった（図１２）。コンフォメーションの欠失、およびそれによるコンフォメーションＩｇＥエピトープの欠失（実施例７参照のこと）の結果として、ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体は、野生型ｒＤｅｒ ｐ ２と比較したＩｇＥ結合能が、ほぼ完全に失われたことが示された。
〔実施例８：ＣＤ ２０３ｃ発現によって測定したｒＤｅｒ ｐ ２誘導体の減少したアレルゲン活性〕
ヘパリンで処理した血液サンプルをアレルギー患者から得た。様々な濃度のｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメント、ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、またはＰＢＳ中において、血液サンプル（１００μｌ）を３７℃で１５分間インキュベートした。Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ，Ａ．Ｗ．らによるＪ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１０：１０２（２００２）に記載の方法で、ＣＤ ２０３ｃ発現を測定した。上記文献には、ＣＤ ２０３ｃのアップレギュレーションが、アレルゲン刺激好塩基球活性および脱顆粒のための代用マーカーとして記載されている。それゆえに、ハウスダストダニアレルギー患者の好塩基球においてＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを測定することによって、組換えｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント、およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドの各アレルギー反応活性を比較した（図１３および１４）。図１３に、代表的な３人の患者の結果を示す。調査した各患者において、１０μｇ／ｍｌの野生型ｒＤｅｒ ｐ ２と共にインキュベートした好塩基球は、顕著にＣＤ ２０３ｃ発現をアップレギュレートした。一方同じ濃度の個々のフラグメント、または２つのフラグメントの等モル混合物とインキュベートした好塩基球は、アップレギュレートしなかった（図１３）。加えて異なる濃度（５μｇ／ｍｌ〜０．３２ｎｇ／ｍｌ）のｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドを１：５で希釈し、同じ１０人の患者の好塩基球をさらした。図１４に、代表的な６人の患者の結果を示す。４０ｎｇ／ｍｌおよび５０００ｎｇ／ｍｌの間の濃度において、ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドにさらした好塩基球がＣＤ ２０３ｃをアップレギュレートした。一方、野生型ｒＤｅｒ ｐ ２は、８ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度ですでにＣＤ ２０３ｃのアップレギュレートを引き起こした。１０人中８人の患者において、ｒＤｅｒ ｐ ２と比較してｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドの好塩基球活性化能が１０倍以上減少した。
抗ヒトＩｇＥ抗体は、全ての患者の好塩基球において、ＣＤ ２０３ｃ発現のアップレギュレーションを引き起こした。一方、バッファのみでは、アップレギュレートしなかった（図１３および１４）。
ダニアレルギー患者の好塩基球におけるＣＤ ２０３ｃ発現の測定によって、ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドの生物学的活性が野生型ｒＤｅｒ ｐ ２と比較して減少していることが示され、ｒＤｅｒ ｐ ２ フラグメントでは生物学的活性が見られないことが示された。さらに、ＲＢＬ細胞を用いた好塩基球活性分析の結果は、誘導体で刺激したＩｇＥ Ａｂｓのアナフィラキシーが減少していることを示した。この結果は、免疫療法に用いたとき、低アレルギー性ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体が、野生型Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲンと比較して、ＩｇＥが介在する副作用をより低減することを示唆している。
〔実施例９：野生型ｒＤｅｒ ｐ ２アレルゲンと同様に、マウス中においてｒＤｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＧ抗体を刺激するｒＤｅｒ ｐ ２誘導体〕
８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの５つのグループに対して、それぞれ精製した５μｇのタンパク質（ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント２、またはｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド）を用いて免疫し、２００μｌのＡｌｕＧｅｌ−Ｓ（ＳＥＲＶＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２０週間を通じて４週間間隔で首の皮下に吸着させた。血液サンプルを各免疫処理の１日前に採取し、−２０で保存した。
ＰＢＳ（ｃ＝５μｇ／ｍｌ）中で希釈したｒＤｅｒ ｐ ２を用いて、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）を４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ；０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて２回洗浄し、ブロッキングバッファ（ＰＢＳＴ；１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ）を用いて室温で３時間固定した。Ｄｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＧ１を測定するために、０．５％ ｗ／ｖ ＢＳＡを含むＰＢＳＴでマウス血清を１：１０００に希釈した。ウエル毎に１００μｌの希釈溶液を加え、４℃で一晩おいた。
プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、Ｖｒｔａｌａ，Ｓ．らによるＪ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９８：９１３（１９９６）に記載されているように、モノクローナルラット抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて処理した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を追加し、結合したＩｇＧ１抗体を検出した。
ｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体で免疫したマウスから得た血清サンプル中で、Ｄｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＧ１レベルを測定した（図１５）。ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体と同様に、ｒＤｅｒ ｐ ２は抗原性であり、２回目の免疫後のマウス（８週目）においてＩｇＧ１反応を刺激した（図１５）。２回目の免疫後に、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドによって刺激したＩｇＧ１反応は、ｒＤｅｒ ｐ ２で刺激したものよりもさらに高かった（図１５）。最後の免疫後に、ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体で刺激したＩｇＧ１反応は、野生型ｒＤｅｒ ｐ ２分子で刺激したものに匹敵した（図１５）。
〔実施例１０：ダニアレルギー患者ＩｇＥの野生型ｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合を抑制する、ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体で免疫刺激したＩｇＧ１抗体〕
ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）を、１００μｌの精製したｒＤｅｒ ｐ ２でコーティングし、ＰＢＳで希釈して、濃度を５μｇ／ｍｌにした後、４℃で一晩おいた。ＰＢＳＴで２回洗浄し、ブロッキングバッファ（ＰＢＳＴ；１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ）を用いて室温で３時間固定した後、抗ｒＤｅｒ ｐ ２抗血清、抗ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１抗血清、抗ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント２抗血清、または抗ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド抗血清、あるいは対応する免疫前血清と共に、プレートを４℃で一晩インキュベートした。０．５％ ｗ／ｖ ＢＳＡを含むＰＢＳＴでマウス抗血清を１：２０で希釈し、ウサギ抗血清を１：１００で希釈した。参考文献４４および４５に記載されているように、プレートを洗浄後、ダニアレルギー患者の血清を１：１０で希釈した溶液と共に、４℃で一晩インキュベートし、０．５％ ｗ／ｖ ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１：２５００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、ＵＳＡ）を用いて、結合したヒトＩｇＥを検出した。ＩｇＥ結合抑制率を次式にしたがって算出した。
１００−（ＯＤｓ／ＯＤｐ）×１００
ここで、ＯＤｓおよびＯＤｐは免疫血清および免疫前血清と共にプレインキュベートした後の消衰係数をそれぞれ表している。
ｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体で免疫刺激したマウスＩｇＧ１抗体について、ダニアレルギー患者ＩｇＥのｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合抑制能を、ＥＬＩＳＡ競合実験により調べた。
マウスＩｇＧ抗体による、アレルギー患者ＩｇＥの野生型ｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合抑制率を表５および表６に示す。
マウス抗ｒＤｅｒ ｐ ２抗体により得られた抑制率は、６１〜８７％の間であった（平均７５％）。一方、マウス抗ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド抗体、抗Ｄｅｒ ｐ ２フラグメント１抗体、および抗Ｄｅｒ ｐ ２フラグメント２抗体は、血清ＩｇＥの野生型ｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合を、それぞれ４７〜７６％（平均６２％）、４８〜６６％（平均５４％）、および２４〜５２％（平均４１％）抑制した（表５）。
Figure 2008521837
追加の実験において、精製したｒＤｅｒ ｐ ２および３つのｒＤｅｒ ｐ ２誘導体でウサギを免疫した。ウサギ抗血清による、ダニアレルギー患者ＩｇＥのｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合抑制能もまた、マウス血清から得たのと同様にＥＬＩＳＡ抑制分析により試験した（表６）。ウサギ抗ｒＤｅｒ ｐ ２抗体は、患者ＩｇＥのｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合を４７〜８９％（平均６６％）抑制した。一方、抗ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド抗体は、ヒトＩｇＥ結合を２０〜８６％（平均５９％）抑制した。ウサギ抗ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１抗体による抑制率は、２６〜７０％（平均５２％）であり、ウサギ抗ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント２抗体による抑制率は、３２〜５４％（平均４２％）であった。抗フラグメント１抗体および抗フラグメント２抗体の混合物を用いた場合において、患者ＩｇＥの野生型ｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合の抑制率は、平均５５％までわずかに増加したのみであった（表６）。
Figure 2008521837
マウスを免疫することによって、３つのすべてのｒＤｅｒ ｐ ２誘導体が、ＩｇＧ抗体反応刺激能を示し、抗原性が明らかになった。ダニアレルギー患者ＩｇＥのＤｅｒ ｐ ２に対する結合は、各ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体によって刺激したＩｇＧ抗体によって抑制された。しかしながら、２つの独立したフラグメントによって刺激したＩｇＧ抗体、およびフラグメント１および２の混合物によって刺激したＩｇＧ抗体と比較して、ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドによって刺激したＩｇＧ抗体はより高い抑制脳を示した。ブロックされた抗体は、組換えアレルゲンを用いたＳＩＴにおける主要な役割を担っていることが示されたので、これらの結果は重要である。
ＥＬＩＳＡ抑制分析により示されたように、マウスを免疫することによって刺激した抗ｒＤｅｒ ｐ ２抗体および抗ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体抗体は、アレルギー患者ＩｇＥのｒＤｅｒ ｐ ２に対する結合を抑制した。
〔実施例１１：野生型ｒＤｅｒ ｐ ２に基づいたワクチンと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応性が低下したｒＤｅｒ ｐ ２誘導体に基づいたワクチン〕
細胞培養培地(１００ｍｌ ＲＰＭＩ １６４９、１０％ ＦＣＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、２ｍＭ ピルビン酸塩ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ)中のラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）細胞（ｓｕｂｌｉｎｅ ＲＢＬ−２Ｈ３）を、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）（１００μｌ：４×１０４細胞）上に播種し、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で一晩おいた。
ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント２およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドを用いて３７℃で２時間免疫したマウスから得た血清２μｌを、細胞に導入した。ついで、細胞を２００μｌのタイロード／ＢＳＡバッファ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ ７．２）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｕｓｔｒｉａ）で２回洗浄し、ｒＤｅｒ ｐ ２（ｃ＝０．３μｇ／ｍｌ）で刺激した。１０μｌの１０％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、総βヘキソサミニダーゼ放出を誘導した。
βヘキソサミニダーゼの放出量を測定するために、５０μｌの分析溶液(８０μＭ ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを含むｐＨ４．５の０．１Ｍ クエン酸塩バッファ)を、５０μｌの上清と共に、５％の二酸化炭素雰囲気下、３７℃で1時間インキュベートした。
１００μｌのグリシンバッファ(０．２Ｍ グリシン、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ １０．７)を添加することによって反応を終了し、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ７０００、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、λｅｘ：３６０ｎｍ λｅｍ：４６５ｎｍで蛍光度を測定した。結果を、総βヘキソサミニダーゼ放出率の平均として示した。
ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体をワクチン接種することによって、野生型Ｄｅｒ ｐ ２アレルゲンに対するアレルギー免疫反応が誘導されるかどうかを調査するために、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１、ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント２、およびｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドそれぞれを用いて、マウスを免疫した。ついで、ＲＢＬ脱顆粒実験により野生型ｒＤｅｒ ｐ ２アレルゲンに対するアレルギー反応量を決定するために、マウスから得た血清サンプルをＲＢＬ細胞に導入するのに用いた。マウス抗ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント１抗体、抗ｒＤｅｒ ｐ ２フラグメント２抗体、および抗ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド抗体を導入したＲＢＬ細胞において、野生型ｒＤｅｒ ｐ ２アレルゲンにより得られたβヘキソサミニダーゼ放出は、それぞれ０〜１６．６％（平均６．４％）、０．２〜２８．６％（平均１３．２％）、および４．７〜３７．１％（平均１８．３％）であった。一方、野生型抗ｒＤｅｒ ｐ ２抗体を導入したＲＢＬ細胞は、野生型ｒＤｅｒ ｐ ２で刺激した後、３５〜３９％（平均３７％）βヘキソサミニダーゼを放出した（図１６）。
〔実施例１２：野生型Ｐｈｌ ｐ１２、他の花粉由来プロフィリン、および植物−食品由来プロフィリンを認識する、ＭＰ１２刺激ＩｇＧ抗体〕
ＭＰ１２で免疫した後誘導された抗体が、食品に派生する植物由来のプロフィリンと同様に、花粉由来プロフィリンを認識するか否かを実験するために、ＥＬＩＳＡ実験を行った。
オオアワガエリ花粉由来プロフィリン（Ｐｈｌ ｐ１２）、カバ花粉由来プロフィリン（Ｂｅｔ ｖ ２）、ヨモギ由来花粉由来プロフィリン（Ａｒｔ ｖ ４）、ならびに異なる植物食品由来プロフィリン（カシューナッツ（Ａｎａ ｃ）、セロリ（Ａｐｉ ｇ ４）、バナナ（Ｍｕｓ ｘｐ １）、ヘーゼルナッツ（Ｃｏｒ ａ ２）、およびニンジン（Ｄａｕ ｃ ４））を用いて、ＥＬＩＳＡプレート（５μｇ／ｍｌ）上をコーティングし、１：２０００〜１：６４０００まで順次希釈したウサギ抗血清と共にインキュベートした。ＰＯＸ標識したロバ抗ウサギ抗血清を用いて、結合したウサギ抗体を検出した。
野生型Ｐｈｌ ｐ１２による誘導と比較して、ＭＰ１２はＩｇＧ抗体反応を誘導した（図１７）。Ｐｈｌ ｐ１２およびＭＰ１２で刺激したＩｇＧ抗体の両方が、花粉（芝、木、水草）由来プロフィリン、および植物由来食品プロフィリンに対して交差反応した（図１７）。
〔実施例１３：木および水草由来のプロフィリン、ならびに植物食品プロフィリンと同様に、完全Ｐｈｌ ｐ１２に対する、芝花粉アレルギー患者の血清ＩｇＥ結合を抑制する抗ＭＰ１２抗体〕
ＭＰ１２で刺激したウサギＩｇＧが、Ｐｈｌ ｐ１２、他の花粉由来プロフィリン、および植物食品由来プロフィリンに対するアレルギー患者ＩｇＥの結合を抑制するか否かを、ＥＬＩＳＡ競合実験により調査した。
オオアワガエリ由来プロフィリン（ｒＰｈｌ ｐ１２）、カバ由来プロフィリン（ｒＢｅｔ ｖ １）、ニンジン由来プロフィリン（ｒＤａｕ ｃ ４）、ヘーゼルナッツ由来プロフィリン（ｒＣｏｒ ａ ２）、バナナ由来プロフィリン（ｒＭｕｓ ｘｐ １）、およびカシューナッツ由来プロフィリン（ｒＡｎａ ｃ １）により、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をコーティングした。各プレートを、１：５０で希釈した抗Ｐｈｌ ｐ１２抗血清、抗ＭＰ１２抗血清、およびコントロールとしてこれらに対応する免疫前血清と共にプレインキュベートした。洗浄後、１：３に希釈した、８つのプロフィリン感受性患者の血清と共にプレートをインキュベートし、１：２５００に希釈したヤギ由来ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＥ抗血清（ＫＰＬ、ＵＳＡ）を用いて、結合したＩｇＥ抗体を検出した。抗Ｐｈｌ ｐ１２抗血清および抗ＭＰ１２抗血清と共にプレインキュベートすることによって抑制されたＩｇＥ結合の抑制率を、次式にしたがって算出した。
ＩｇＥ結合抑制率（％）＝１００−ＯＤＩ／ＯＤＰ×１００
ここで、ＯＤＩおよびＯＤＰは、ウサギ免疫血清および対応する免疫前血清とプレインキュベートした後の吸光度をそれぞれ表している（表７）。
Figure 2008521837
Ｐｈｌ ｐ１２刺激抗体およびＭＰ１２刺激抗体による、オオアワガエリ花粉プロフィリンに対するＩｇＥ結合の平均抑制率は、それぞれ８３．８％および７２．３％で、ほぼ同様であった（表７）。カバ花粉プロフィリン（Ｂｅｔ ｖ ２）に対するＩｇＥ結合は、Ｐｈｌ ｐ１２刺激抗体（平均抑制率６４．８％）よりもＭＰ１２特異的抗体（平均抑制率７４．５％）によって強く抑制された。植物食品プロフィリンに対するＩｇＥ結合の抑制率は、両方の抗血清において非常に似通っていた（Ｃｏｒ ａ ２：抗Ｐｈｌ ｐ１２刺激ＩｇＧによる平均抑制率６２．３％、抗ＭＰ１２刺激ＩｇＧによる平均抑制率５８．１％；Ｄａｕ ｃ ４：抗Ｐｈｌ ｐ１２刺激ＩｇＧによる平均抑制率７３．３％、抗ＭＰ１２刺激ＩｇＧによる平均抑制率７４．６％；Ａｎａ ｃ １：抗Ｐｈｌ ｐ１２刺激ＩｇＧによる平均抑制率５６．８％、抗ＭＰ１２刺激ＩｇＧによる平均抑制率５３．６％）。バナナプロフィリン（Ｍｕｓ ｘｐ １）に対するＩｇＥ結合のみが、抗Ｐｈｌ ｐ１２刺激ＩｇＧによる抑制率（７１．４％）よりも、抗ＭＰ１２刺激ＩｇＧによる抑制率（３６．１％）が低かった（表７）。
プロフィリンは、すべての真核生物細胞に発現する代表的なアレルゲンである。それゆえに、呼吸器系アレルギー（例えば、鼻結膜炎、ぜんそく）を引き起こし得る全アレルゲンの代表的なものでもある。同様に、感作された患者における薬物の経口投与後の口腔アレルギー症候群（唇および舌の痒みおよび腫れ）を引き起こし得るアレルゲンの代表的なものでもある。
再構成Ｐｈｌ ｐ１２誘導体であるＭＰ１２は、植物食品由来プロフィリンと同様に花粉由来プロフィリンを認識するように免疫したＩｇＧ抗体を誘導する。ＭＰ１２刺激抗体は、患者血清ＩｇＥの花粉由来プロフィリンに対する結合と同様に、植物食品由来プロフィリンに対する結合も抑制した。それゆえに、ＭＰ１２は、プロフィリンアレルギーに起因する花粉−食品交差性感作の治療に適している。
ＭＰ１２（本発明にしたがって再入れ換えをおこなったＰｈｌ ｐ １２アレルゲン）の一次構造を、野生型のＰｈｌ ｐ １２と比較して模式的に表した図である。 野生型Ｐｈｌ ｐ １２とＭＰ１２とのＣＤスペクトルを示した図であり、Ｐｈｌ ｐ １２および誘導体ＭＰ１２の平均残基楕円率[θ]（ｙ軸）をある一定の幅における波長（ｘ軸）に対して示した図である。 ポリプロリンカラムに通した組み換えＭＰ１２の画分を、１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシー染色した図であり、レーンＭは分子量マーカーであり、レーン１は流出画分であり、レーン２〜４は洗浄画分であり、レーン５、６は溶出画分であり、分子量（ｋＤａ）は左端に示している。 ニトロセルロース膜にドット状に載せたＰｈｌ ｐ １２およびＭＰ１２のＩｇＥに対する反応性を調べた図であり、ドット状に載せたタンパク質と、ネガティブコントロールであるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とを、２４人のＰｈｌ ｐ １２アレルギー性患者からの血清と反応させており（レーン１〜２４）、レーンＮはコントロールである非アレルギー性の人由来のものであり、結合したＩｇＥ抗体は抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出した。 ２人のＰｈｌ ｐ １２アレルギー性患者における好塩基球ヒスタミン放出の誘導結果を示した図であり、患者の顆粒球をさまざまな濃度（ｘ軸）のＰｈｌ ｐ １２（四角）およびＭＰ１２（丸）と反応させ、上清に放出された全ヒスタミンの百分率をｙ軸に示している。 オオアワガエリ花粉、カバノキ花粉、およびヨモギ花粉由来のプロフィリンに対するウサギ抗血清の反応性を示した図であり、Ｐｈｌ ｐ １２（ひし形）およびＭＰ１２（四角）に対するウサギ抗血清の、Ｐｈｌ ｐ １２（Ａ）、Ｂｅｔ ｖ ２（Ｂ）および、ヨモギプロフィリン（Ｃ）に対する反応性をＥＬＩＳＡにより試験した結果であり、血清の希釈率をｘ軸に、対応するＯＤ値をｙ軸に示しており、対応する免疫前血清はいずれの反応性試験にも示していない。 ｒＰｈｌ ｐ １２により誘導される好塩基球の脱顆粒を、抗ｒＰｈｌ ｐ １２（Ｐ１２）および抗ＭＰ１２により誘導されるＩｇＧによって阻害した結果を表す図であり、ラット好塩基球は、Ｐｈｌ ｐ １２特異的マウスＩｇＥにより、すでに負わされていた。 Ｄｅｒ ｐ ２ハイブリッド（本発明にしたがって再入れ換えしたＤｅｒ ｐ ２アレルゲン）の生成と一次構造をＤｅｒ ｐ ２野生型と比較して模式的に表した図である。 Ｈｉｓタグ−タンパク質としてｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体を発現しているＢＬ２１（ＤＥ３）のタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシー染色をした図であり、レーン１は抽出物であり、レーン２は精製ｒＤｅｒ ｐ ２、精製ｒＤｅｒ ｐ ２断片１、断片２および精製ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドであり、レーンＭは分子量マーカーである。 精製ｒＤｅｒ ｐ ２および精製ｒＤｅｒ ｐ ２誘導体の質量分光法分析の結果を示した図であり、ｘ軸はそれぞれ質量／電荷の比であり、シグナル強度を、最も強いシグナルに対する百分率としてｙ軸に示している。 精製組み換えＤｅｒ ｐ ２、精製ｒＤｅｒ ｐ ２断片および精製ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドの遠紫外線ＣＤスペクトルを表した図であり、タンパク質のスペクトルは、一定の波長（ｘ軸）に対する平均残基楕円率（ｙ軸）として表している。 組み換えＤｅｒ ｐ ２および組み換えＤｅｒ ｐ ２誘導体のＩｇＥ認識を示した図であり、ドットブロットした組み換えＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２断片、ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッドおよびＢＳＡを用いて、ダニアレルギーをもつ１７人からの血清（レーン１〜１７）、非アレルギー性の人からの血清（レーン１８）、血清を含まないバッファー（レーン１９）に関して、ＩｇＥの反応性の試験をおこない、結合したＩｇＥを１２５Ｉラベルした抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出し、オートラジオグラフィーにより可視化した。 組み換えＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体による好塩基球の活性化をＣＤ２０３ｃの発現を指標に測定した結果であり、１０人のダニアレルギー性患者から採取した血液試料を、それぞれ１０μｇ／ｍｌの、組み換えｒＤｅｒ ｐ ２、それぞれのＤｅｒ ｐ ２断片、各断片の混合物、αＩｇＥ、もしくはバッファーと反応させて、ＣＤ２０３ｃの発現をＦＡＣＳ分析により測定して平均蛍光指数（ＭＦＩ）として表し、代表として３人の患者の結果を示している。 組み換えＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体による好塩基球の活性化をＣＤ２０３ｃの発現を指標に測定した結果であり、同じ１０人のダニアレルギー性患者から採取した血液試料を、複数の濃度のｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ２ハイブリッド、αＩｇＥ、もしくはバッファーと反応させており（ｘ軸）、ＣＤ２０３ｃの発現はＦＡＣＳ分析により測定して刺激指数（ＳＩ）として表し、代表として６人の患者の結果を示している。 マウスにｒＤｅｒ ｐ ２およびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体の免疫を付与することにより誘導したＤｅｒ ｐ ２特異的ＩｇＧ１の進展を示した図であり、５匹のマウスのグループそれぞれに対して、精製したｒＤｅｒ ｐ ２もしくは精製したｒＤｅｒ ｐ ２誘導体により免疫を付与して、誘導されたＩｇＧ１抗体をＥＬＩＳＡによって測定し、マウス血清中のＩｇＧ１抗体のレベルに対応した光学密度値（ＯＤ ４０５ｎｍ）をｙ軸に示した結果を、値の５０％が箱の内部に含まれ、はずれ値がバーの外側にある箱ひげ図として示しており、箱の中にある線は中間値を示し、白丸と星印は各マウス群のはずれ値と極値とを示している。 ＲＢＬ細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼ放出により可視化した、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｒＤｅｒ ｐ ２誘導体の低アレルゲン活性を示した図であり、ｒＤｅｒ ｐ ２野生型アレルゲンおよびｒＤｅｒ ｐ ２誘導体による免疫付与前（免疫前血清）および免疫付与後（免疫血清）から得られたマウス血清をラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）細胞に与え、ｒＤｅｒ ｐ ２によりβ−ヘキソサミニダーゼの放出を誘導し、全β−ヘキソサミニダーゼ放出量に対する百分率をｙ軸に示した（各マウス群の５つの血清における平均値±ＳＤ）。 オオアワガエリ花粉（Ｐｈｌ ｐ １２）、カバノキ花粉（Ｂｅｔ ｖ ２）、ヨモギ花粉（Ａｒｔ ｖ ４）、カシューナッツ（Ａｎａ Ｃ）、セロリ（Ａｐｉ ｇ ４）、バナナ（Ｍｕｓ ｘｐ １）、ハシバミの実（Ｃｏｒ ａ ２）、およびニンジン（Ｄａｕ ｃ ４）からのプロフィリンに対するウサギ抗血清の反応性を示した図であり、Ｐｈｌ ｐ １２（ひし形）およびＭＰ１２（四角）に対する抗血清の上記プロフィリンに対する反応性をＥＬＩＳＡにより試験した結果を、血清の希釈率をｘ軸に、対応するＯＤ値をｙ軸に示しており、対応する免疫前血清はどの反応性試験においても示していない。

Claims (29)

  1. アレルゲン活性が低下した野生型タンパク質アレルゲン誘導体を生成する方法であって、
    アレルゲン活性を有する野生型タンパク質アレルゲンを用意する工程と、
    上記野生型タンパク質アレルゲンを、アレルゲン活性が低下した、またはアレルゲン活性が欠如した２つのフラグメントにスプライシングする工程と、
    上記２つのフラグメントを逆方向に再結合する工程とを含むことを特徴とする方法。
  2. 上記誘導体は、宿主によって組換えタンパク質として生成され、当該宿主は特に高い発現能力を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 上記野生型タンパク質アレルゲンは、Ｐｈｌ ｐ １２に代表されるプロフィリン、Ｂｅｔ ｖ ４に代表されるカンバアレルゲン、Ｄｅｒ ｐ ２に代表されるチリダニアレルゲン、Ｌｅｐ ｄ ２に代表される貯蔵庫ダニアレルゲン、およびＰｈｌ ｐ ７に代表されるオオアワガエリアレルゲンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 上記野生型アレルゲンと比較したときの上記誘導体によるＩｇＥ結合能の抑制低下率が、少なくとも１０％、好ましくは２０％、さらに好ましくは３０％であることによって、上記誘導体のアレルゲン活性の低下を評価することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. アレルゲンに感作した患者の血清ＩｇＥ抗体が、点染色した上記誘導体に対して結合しないことによって、上記誘導体のアレルゲン活性の低下を評価することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 上記誘導体を薬学的に許容される添加剤と組み合わせて、医薬調整物とすることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 上記誘導体を適当なワクチン補助剤と組み合わせて、薬学的に許容されたワクチン調整物とすることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 上記誘導体をさらなるアレルゲンと組み合わせて、混合ワクチン調整物とすることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 上記アレルゲンは、野生型アレルゲンであり、好ましくは野生型アレルゲンの混合物、組換え野生型アレルゲンの混合物、野生型タンパク質アレルゲン誘導体の混合物またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 上記調整物は、アレルゲン抽出物をさらに含有していることを特徴とする請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. １からＺのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する野生型タンパク質アレルゲンのアレルゲン誘導体であって、
    上記誘導体は、野生型アレルゲンの２つのフラグメントを、Ｎ末端からＣ末端に向かう方向に隣接して含有し、Ｎ末端側の当該フラグメントは、Ｘ〜Ｚのアミノ酸からなるアミノ酸配列により示され、Ｃ末端側の当該フラグメントは、１〜Ｘのアミノ酸からなるアミノ酸配列によって示されるものであり、当該２つのフラグメントは、アレルゲン活性が低下または欠落していることを特徴とするアレルゲン誘導体。
  12. 上記Ｘ〜Ｚのアミノ酸からなるアミノ酸配列、および上記１〜Ｘのアミノ酸からなるアミノ酸配列は、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも６０アミノ酸からなることを特徴とする請求項１１に記載のアレルゲン誘導体。
  13. 上記Ｘ〜Ｚのアミノ酸からなるアミノ酸配列と、上記１〜Ｘのアミノ酸からなるアミノ酸配列とは、その全長において、５０％未満、好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満相違することを特徴とする請求項１１または１２に記載のアレルゲン誘導体。
  14. 上記野生型アレルゲンは、Ｉ型アレルゲン、好ましくは表１に示すのアレルゲン、より好ましくはＰｈｌ ｐ１２に代表されるオオアワガエリ（Phelum pratense）花粉アレルゲン、Ｂｅｔ ｖ ４に代表されるカンバ（Betula verrucosa）花粉アレルゲン、スズメバチ（Vespula vulgaris）毒アレルゲン、アシナガバチ（Polistes annularis）毒アレルゲン、カベイラクサ花粉アレルゲン、ライグラス花粉アレルゲン、Ｄｅｒ ｐ ２に代表されるチリダニアレルゲン、またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１１から１３のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体。
  15. 請求項１１から１４のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体と、さらなるアレルゲン、好ましくは野生型アレルゲン、より好ましくは野生型アレルゲンの混合物、組換え野生型アレルゲンの混合物、野生型タンパク質アレルゲン誘導体の混合物またはそれらの混合物とを含有していることを特徴とするアレルゲン組成物。
  16. アレルゲン抽出物をさらに含有していることを特徴とする請求項１５に記載のアレルゲン組成物。
  17. 薬学的に許容される添加剤をさらに含有していることを特徴とする請求項１５または１６に記載のアレルゲン組成物。
  18. 請求項１１から１７のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物を、アレルゲン特異的免疫療法の調整医薬として使用する使用方法。
  19. 請求項１１から１７のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物を、受動免疫のための調整医薬として使用する使用方法。
  20. 請求項１１から１７のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物を、予防免疫のための調整医薬として使用する使用方法。
  21. 上記調整医薬は、補助剤、希釈剤、防腐剤またはこれらの混合物をさらに含有することを特徴とする請求項１８から２０のいずれか１項に記載の使用方法。
  22. 上記組換えアレルゲン誘導体を１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５〜２００μｇ含有することを特徴とする請求項１８から２１のいずれか１項に記載の使用方法。
  23. 請求項１１から１７のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体を生成する方法であって、
    請求項１１から１７のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体をコードするＤＮＡを用意する工程と、
    上記ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換する工程と、
    上記宿主細胞において上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離する工程とを含むことを特徴とする方法。
  24. 上記宿主細胞は、高い発現能力を有していることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項１１から１７のいずれか１項に記載のアレルゲン誘導体を、化学合成により生成することを特徴とするアレルゲン誘導体の生成方法。
  26. 請求項１から１０または２３から２５のいずれか１項に記載の方法によって得られる第１の野生型プロフィリン分子から得られるプロフィリン誘導体、または
    請求項１１から１４のいずれかに記載された第１の野生型プロフィリン分子のアレルゲン誘導体を、
    第２の野生型プロフィリン分子によって引き起こされるアレルギー疾患を予防または治療するための調整医薬を生成するために用いる使用方法。
  27. 上記第１および上記第２の野生型プロフィリン分子は、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｂｅｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｎａ ｃ、Ａｐｉ ｇ ４、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ｃｏｒ ａ ２、およびＤａｕ ｃ ４からなる群より選択されることを特徴とする請求項２６に記載の使用法。
  28. 上記第１の野生型プロフィリン分子はＰｆｌ ｐ １２であり、かつ上記第２のプロフィリン分子は、Ｂｅｔ ｖ ２、Ａｒｔ ｖ ４、Ａｎａ ｃ、Ａｐｉ ｇ ４、Ｍｕｓ ｘｐ １、Ｃｏｒ ａ ２、およびＤａｕ ｃ ４からなる群より選択されることを特徴とする請求項２６に記載の使用法。
  29. プロフィリンアレルギーに寄与する花粉と食品との交差性感作の治療および予防の少なくとも一方のための調整医薬の生成に用いることを特徴とする請求項２７または２８に記載の使用法。
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