JP2010509321A - 種々の炎症状態の治療用の新規な組成物 - Google Patents

Abstract

サイトカインＩＬ−１８をターゲットとすることにより、喘息やアトピー性皮膚炎等、種々の炎症状態の症状軽減或いは誘発予防に用いられる方法。ＩＬ−１８又はその分裂片を含むワクチンが、それを必要とする哺乳類に投与される。

Description

本発明は、サイトカインＩＬ−１８をターゲットとする、種々の炎症状態の症状軽減或いは誘発予防用の方法に関する。本発明は一般に哺乳類に用いられるワクチンに関するが、その好適な実施態様は人間、犬、猫又は馬に用いられるワクチンに関する。従って以下、一般的に、且つヒト、ネコ、ウマ又はイヌに用いられるかかるワクチンに関して本発明を述べる。

ここ数１０年の間、免疫系の機能不全により引き起こされる幾つかの疾患は現代医学の大きな課題となっている。そのような問題には、アレルギー性疾患と自己免疫疾患の２つがある。アレルギーは人では過去２０〜３０年の間に殆ど流行病になっており、アトピー性又はＩｇＥ媒介アレルギーが主要形態である。アレルギーはまた、犬、猫や馬等の多くの家畜にとっても重要な問題である。だが、ＩｇＥの係り合いはここでは、十分に文献化されていない。アトピー性アレルギーの良く知られたタイプには人の場合、毛皮アレルギー、アレルギー性鼻炎、浮遊粉塵ダニアレルギー、昆虫毒物アレルギー、外因性喘息及び多種の食物アレルギーがある。加えて、我々の家畜の多くは同様のアレルゲンに対するアレルギーを患う。多くの自己免疫疾患はまた頻度が増えており、種々の自己免疫疾患に罹った全人数は３〜５％と推定されている。これ等２つの免疫関連疾患はそれによって、人口の略２５％に影響を及ぼす。

アレルギー性と自己免疫性の両疾患は我々の免疫系における機能不全により引き起こされもので、多くの共通する調節機構をもつ。種々の病原に対する正常なサイトカイン調節免疫応答の幾つかもまた、これ等の疾患過程に深く関係しているようである。サイトカイン、即ち我々の免疫系の調節のために重要な成長及び分化因子がそれによって、介入のための潜在的標的の役目をし得るのである。

獣医学における１つの、困難な特定問題は、犬の重いアトピー性皮膚炎である。獣医師全外来の略５０％は、アトピー性皮膚炎が主要因子である皮膚問題によるものである。人間内科でも、同様の状況がある。しかしここでは、状態は重症喘息である。殆どの重症例に対して、現存する治療法の何れも十分な臨床効果を示していない。犬の重い皮膚炎での状況では、これ等犬の多くは、安楽死させなければならない。従って、医療の重要度の高い、満たされていない必要性がある。

人間及び家畜におけるＩｇＥ媒介性アレルギーに対する可能性のある治療戦略、即ちＩｇＥに対するワクチン接種に本発明者等は多年に亘って取り組んできた（非特許文献１〜５）。だが、犬のようにＩｇＥレベルが非常に高い場合（非特許文献６）、この戦略には明らかな限界がある。これ等の限界は主として、還流するＩｇＥの高い濃度により引き起こされる強い耐性効果による。加えて、大量の標的分子が除去されなければならないとき、良好な臨床効果を得ることは困難である。従って、ＩｇＥに対するワクチン接種によりこの目的に犬で到達することは殆ど不可能であると本発明者等は見ている（非特許文献６）。新しい、革新的な戦略が開発されなければならない。そこで、この問題に対する１つの可能性のある解決策として、１つの重要な前炎症性サイトカインＩＬ−１８に対するワクチン接種を本発明者等は提示する。

ＩＬ−１８はＩＬ−１２と共に、細胞媒介性免疫の極めて重要な誘発物質であることが証明されているサイトカインである。細胞媒介性免疫に関する効果は大部分、ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）及び他の細胞数種によるインターフェロン―ガンマ生成の誘発が媒介するものである。加えて、ＩＬ−１８は最近、ＩｇＥ生成の重要な誘発物質でもあり、アレルギーの誘発に係る２つの重要なサイトカインＩＬ−４及びＩＬ−13に類似する症状を誘発することが証明されている。この発見は、ＩＬ−１８もまた適応免疫、液性免疫応答の第２の重要な腕で働きをすることを示す。この腕はＴＨ２型の免疫として分類される。ケラチノサイト特定遺伝子からの促進因子による遺伝子の遺伝形質転換コピーの導入によるケラチノサイトにおけるＩＬ−１８の過剰生成は結果として、遺伝子導入マウスにアトピー性皮膚炎数種を生じる（非特許文献７）。ＩＬ４信号法の結果としての遺伝子数個の転写活性に係る信号形質導入遺伝子ＳＴＡＴ６の欠失は、ＩＬ−１８によるこの効果に影響を及ぼさない（非特許文献７）。ＩＬ−１８もまた、喘息様症状を誘発し、ＹＨ２媒介炎症性状態数種に係わり得ることが示されている（非特許文献７）。このことはＩＬ−１８を、特にアトピー性皮膚炎及び喘息に対する新規な治療戦略のための極めて興味あるターゲットにする。更に、ＩＬ−１８の効力のあるインターフェロン―ガンマ誘発効果のため、このサイトカインもまた、多くの自己免疫障害において極めて重要な効果を有して、これ等の型の炎症性状態に対しても興味あるターゲットとなり得る。ここに、ＩＬ−１８依存性炎症を調整し、人間の重篤な喘息や犬のアトピー性皮膚炎の管理における重要な一歩となり得る、新規な方法が記述される。

従来技術
ＩＬ−１８の活性をブロックするために単一クローン抗体又は可溶性レセプタを用いるその使用を記載した特許出願が提出されている（ＷＯ０１５８９５６Ａ２）。ＩＬ−１８を標的とするこれ等戦略は、患者の余命に対して例えば２〜４週間毎に行う高純度組換え蛋白質の注入に依存する。この出願に記載されているように、ワクチンは単クローン抗体又は可溶性レセプタでの治療に要する量と比較して、多分１/１００００と少ない、いっそう小規模での組換え蛋白質の注入で得られるため、従来技術を大きく改良するものとなり得るものである。ワクチンはおそらく、上記のような単クローン抗体又は可溶性レセプタの、ひときわ高頻度での投与と比較して、１年に１〜４回の投与のみで良いであろう。

ＷＯ０１５８９５６Ａ２

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本発明の目的は、ＩＬ−１８による過剰活性で生じた種々の炎症性状態を治療する適切、且つ経済的な方法を提供することにある。ＩＬ−１８（又はＩＬ−1８の部分）及び異種担体蛋白質から成る融合蛋白質をもつワクチンでの治療は、遊離ＩＬ−１８のレベルを低下させ、それによりＩＬ−１８の過剰解放により生じた症状を低減する。

上記目的は本発明により、接種対象種からの全アミノ酸配列をもつ蛋白質又はＩＬ−１８、又は上記アミノ酸配列のアミノ酸５より大きい分裂片を、その原形又は多量体化形にて含むことを特徴とするワクチンによって達成される。この蛋白質は任意選択として、１つ又は複数の異種単体蛋白質に、任意選択としてアジュバントを含むことにより結合させることができる。

イヌＩＬ−１８のヌクレオチド及び対応アミノ酸配列を示す。 ヒトＩＬ−１８のヌクレオチド及び対応アミノ酸配列を示す。 マウス及びイヌＩＬ−１８に対して作成された３つの異なる構成の概略画像で、１つは融合パートナとしての寄生虫である日本住血吸虫からのＧＳＴ、他の２つの異形は融合パートナとしてのＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）からの細菌性チオレドキシンでのものである。図はまた、免疫研究のために用いられた精製ＧＳＴマウスＩＬ−１８融合蛋白質を示す。

対ＩＬ−１８抗体は、活性免疫、所謂ワクチン接種（注射）によりホスト内に作成される。調整ＩＬ−１８分子をホストに注入すると、ホストの免疫系はそれ自身のＩＬ−１８に対して向けられる多クローン性抗体反応を発生し、それによりその潜在的に過剰なＩＬ−１８生成作用を下方に調整する。ホストの免疫系が修正自己蛋白質を非自己蛋白質として認識するように抗体を修正することが極めて重要である。これは、非自己アミノ酸領域を治療対象種からのＩＬ−１８又はその選ばれた領域に共有結合することにより達成することができる。次いで、非自己領域内のペプチドが非耐性Ｔ細胞を吸着及び活性化し、これが潜在的に自己反応性Ｂ細胞に対して助力を与える。

自己蛋白質のこの修正をするために可能な戦略が少なくとも４つある。１つの方法は、原核又は真核発現系において、非自己蛋白質と、自己ＩＬ−１８のアミノ酸の全体又は５を超える選ばれた分裂片との間に融合蛋白質を生成することである。図１のイヌ及びヒトＩＬ−１８で例示されるようにＩＬ−１８のオープンリーディングフレームはその場合、初めに細菌性、菌性又は真核融合蛋白質ベクターにクローン化される。この融合タンパク質構成は次いで、哺乳類又は原核生物であるホストに移入され、所望の融合タンパク質を生成する。融合パートナはここで、１０個のアミノ酸から数百ｋＤまでのどんな大きさのどんな非自己蛋白質でも良い。だが通常は、自己蛋白質と略同サイズの融合パートナを用いるのが好ましい。

或いはまた、免疫優性ペプチドをＩＬ−１８構造に挿入し、外部ペプチドの両側に自己ＩＬ−１８配列をもつ融合蛋白質を生じさせることができる。

第３の代替として、非修正ＩＬ−１８を哺乳類又は原核生物ホストにホスト細胞系に生成させ、次いで化学結合により単体蛋白質に共有結合で取り付けることができる。

第４の代替は我々の考えでは優先度がより少ないものの、ＩＬ−１８配列の選ばれた領域を合成ペプチドとして生成し、次いでこれ等のペプチドを化学結合により外部単体分子に結合するものである。この第４の代替は通常、患者への注入後に、自生の、適切に折り重なる蛋白質に対する結合活性が低いことを示す抗体反応を結果として生じ、それにより臨床効果を低減させる。

生成に引き続いて、ワクチン抗体は精製され、発熱因子含有量及び他の異物の潜在的含有量に付いて検査される。自己エピトープに対して十分に強い免疫応答を得るため、ワクチン抗体は次いで、患者に注入した後、アジュバントと混合される。患者に投与した後、ワクチンはワクチン抗体に対して免疫応答を誘発する。ワクチン抗体には自己エピトープが有るため、この蛋白質はターゲット分子、ここではＩＬ−１８に対して抗体応答を誘発し、それにより患者におけるこの蛋白質のレベルを低下させる。

実施例
マウスと犬の両融合ＩＬ−18を、原核細胞ホストに生成した。このワクチンの３つの異なる変形、１つは融合パートナとしての寄生虫である日本住血吸虫からのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、他の２つの異形は融合パートナとしてのＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）からの細菌性チオレドキシン、を構成した（図２）。治療的対ＩＬ−１８応答を誘発するこの融合蛋白質の効力を検査するため、マウスＧＳＴ−ＩＬ−１８融合蛋白質をアジュバントと共にマウスに注入した。３週間後にマウスは一定ブースター量のワクチンを受け取り、治療５週間後にこれ等マウスからの血清を、対ＩＬ−１８抗体の生成量に対して検査した。ワクチンは全検査マウスで対ＩＬ−１８の有意レベルの生成を誘発した。これは、試験動物に相当量の対ＩＬ−１８の生成を誘発する能力がワクチンにあることを示している。

Claims (6)

1. ＩＬ−１８又はその少なくとも一分裂片と、薬剤として適格なアジュバントを含んで成るワクチン。
2. その原形又は多量体化形のＩＬ−１８の少なくとも一分裂片が担体分子に結合されて成る請求項１に記載のワクチン。
3. ＩＬ−１８がヒト、イヌ、ネコ又はウマのＩＬ−１８である請求項１又は２に記載のワクチン。
4. 医療用ＩＬ−１８ワクチン。
5. 請求項１に記載のワクチンの作製方法であって、ＩＬ−１８のｃＤＮＡ又はゲノム配列、又はアミノ酸６以上をコード化するその一領域をクローン化し、該クローンを適宜ベクターに結紮し、該ベクターを真核又は原核宿主細胞に形質転換して、全ＩＬ−１８配列又はその一領域をその原形、又は突然変異又は多量体化形にて含む融合蛋白質を作製し、そして得られた融合蛋白質を、純化し、そして任意選択として適宜アジュバントと混合することを特徴とする方法。
6. 医療用ワクチンの製造のため、治療対象種からのＩＬ−１８の全体又は一部と、異種担体蛋白質から成る融合タンパク質を用いるその使用。

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