CN105745223A

CN105745223A - 修饰的抗炎蛋白及使用方法

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Publication number: CN105745223A
Application number: CN201480061261.2A
Authority: CN
Inventors: A·劳卡斯; 安德鲁·里奇; 达雷·皮克尔灵
Original assignee: James Cook University
Current assignee: James Cook University
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2016-07-06
Also published as: CA2924220A1; AU2014324094B2; EP3046937A1; ZA201602304B; US10822395B2; JP2016532456A; US20210061886A1; US20160229905A1; US11976108B2; EP3046937A4; WO2015039189A1; AU2014324094A1

Abstract

修饰的Ac?TMP?2蛋白，其缺少通常存在于全长或野生型Ac?TMP?2蛋白中的一个或多个酸性C端氨基酸，并且还可缺少一个或多个N端氨基酸，同时保留位于或邻近所述N端的氨基酸序列C?S?C。所述修饰的Ac?TMP?2蛋白可以用于减轻或改善个体中的炎症的方法和组合物。炎症可以与消化道疾病(如慢性胃炎或炎症性肠病(如克罗恩病或溃疡性结肠炎))或呼吸系统疾病(如哮喘、肺气肿、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病)相关。

Description

修饰的抗炎蛋白及使用方法

发明领域

本发明涉及修饰的抗炎蛋白以及它们在治疗炎症中的用途。更具体地，本发明涉及修饰的钩虫蛋白在减轻、缓解和/或预防炎症中的用途。

发明背景

炎症是在对感知的损伤或威胁的应答中通过免疫系统启动的非特异性反应。其为区别于免疫系统更精确定制的适应性应答的先天性防御应答。炎症可以与免疫系统的适应性应答协同作用，这发展更缓慢，但靶向可能正引起局部损伤的有害物质(如病原体)更精确。

虽然炎症与感染有关，但其发生于针对许多类型的损伤、化学或微粒刺激物、细菌性或病毒性病原体、以及局部缺氧(缺血)的应答中，所述损伤包括物理创伤、烧伤(例如，来自辐射、热或腐蚀性材料)。炎症还与自身免疫疾病和过敏反应有关。炎症包括发红、热、肿胀和疼痛的经典症状，并且可伴随有发炎的器官或组织的功能降低。

虽然用于治疗炎症的许多方法是已知的，但它们均具有局限性，特别是关于广泛基础功效方面。因此，需要用于减轻、缓解和/或预防与多种原因相关的炎症的新方法。

发明概述

本发明涉及用于治疗和/或预防炎症和/或与炎症有关的疾病或病况的方法和组合物。

以广泛的形式来说，本发明涉及一种或多种修饰的蛋白(所述蛋白可源自或获自钩虫，包括但不限于犬钩虫(Ancylostomacaninum))在减轻、缓解和/或预防炎症和/或与炎症有关的疾病或病况(如哮喘和/或炎症性肠病)中的用途。

在一个方面，本发明提供了修饰的Ac-TMP-2蛋白，其缺少通常存在于全长或野生型Ac-TMP-2蛋白中的一个或多个N端和/或C端氨基酸。

适当地，修饰的Ac-TMP-2蛋白在N端或邻近N端具有氨基酸序列C-X-C。

适当地，当向个体施用时，修饰的Ac-TMP-2蛋白能够预防、减轻和/或缓解炎症。

在一个实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白包含SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白包含SEQIDNO:5中所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:5中所示的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。

该方面还提供了所述修饰的Ac-TMP-2蛋白的片段、变体和衍生物。

在另一方面，本发明提供了减轻或缓解个体中的炎症的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的第一提及的方面的修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括其片段、变体和衍生物)，从而减轻或缓解所述炎症。

在一个实施方案中，该方面还包括向个体施用至少一种其它药剂的步骤。

适当地，根据上文的实施方案，所述至少一种其它药剂选自：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂(例如抗TNFα剂、抗IL-5剂、抗IL-13剂、抗IL-17剂和抗IL-6R剂)、抗生素及其组合。

在一些实施方案中，炎症与个体的疾病、病症和/或病况有关或者继发于个体的疾病、病症和/或病况，特别是免疫学疾病、病症和/或病况。

在某些实施方案中，所述疾病为消化道疾病或呼吸系统疾病。

在其它实施方案中，所述疾病、病症和/或病况对基础疗法是难治的。

适当地，根据上文的实施方案，所述基础疗法包括施用选自以下的至少一种基础药剂：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂(例如抗TNFα剂、抗IL-5剂、抗IL-13剂、抗IL-17剂和抗IL-6R剂)、抗生素及其组合。

而在其它方面，本发明提供了预防个体中的炎症的方法，所述方法包括以下的步骤：向个体施用治疗有效量的第一提及的方面的修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括其片段、变体和衍生物)，从而预防炎症。

适当地，根据该实施方案，所述至少一种其它药剂选自：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂(例如抗TNFα剂、抗IL-5剂、抗IL-13剂、抗IL-17剂和抗IL-6R剂)、抗生素及其组合。

在另一方面，本发明提供了用于预防和/或治疗个体中的炎症性肠病的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的第一提及的方面的修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括其片段、变体和衍生物)，从而预防和/或治疗炎症性肠病。

在又一方面，本发明提供了用于预防和/或治疗个体中的呼吸系统疾病的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的第一提及的方面的修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括其片段、变体和衍生物)，从而预防和/或治疗呼吸系统疾病。

适当地，所述呼吸系统疾病选自：哮喘、肺气肿、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。优选地，所述呼吸系统疾病为哮喘。

优选地，所述个体为哺乳动物。

更优选地，所述个体为人。

本发明的又一方面提供了药物组合物，其包含治疗有效量的第一提及的方面的修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括其片段、变体和衍生物)，连同药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方案中，药物组合物还可以包含至少一种其它药剂。

所述至少一种其它药剂可以选自：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂(例如抗TNFα剂、抗IL-5剂、抗IL-13剂、抗IL-17剂和抗IL-6R剂)、抗生素及其组合。

适当地，所述药物组合物用于预防或治疗炎症和/或用于预防或治疗与炎症相关的疾病或病况。

本发明的又一方面提供了编码修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括其片段、变体和衍生物)的分离的核酸，所述修饰的Ac-TMP-2蛋白为第一提及的方面的修饰的Ac-TMP-2蛋白。

本发明的又一方面提供了包含上述方面的分离的核酸的遗传构建体。

本发明的另一其它方面提供了包含上述方面的遗传构建体的宿主细胞。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则单词“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包含所述的整体或整体群，但不排除任何其它整体或整体群。

本说明书中使用的不定冠词“一个/种(a)”和“一个/一种(an)”可以指一个实体或多个实体(例如蛋白)，并且不应被解读为或理解为局限于单个实体。

附图简述

图1.修饰的Ac-TMP-2(N端和C端部分)的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和核苷酸序列(SEQIDNO:3)。载体来源的氨基酸序列和核苷酸序列加粗表示，以及限制性位点来源的氨基酸序列和核苷酸序列下加双下划线。SEQIDNO:3的核苷酸序列下加单下划线。

图2.(i)修饰的Ac-AIP-2(C端部分，SEQIDNO:2)的氨基酸序列；(ii)修饰的Ac-AIP-2_Q48(C端部分，N-聚糖突变体，SEQIDNO:4)的氨基酸序列；(iii)修饰的Ac-AIP-2(N端和C端部分，SEQIDNO:1)的氨基酸序列；以及(iv)修饰的Ac-AIP-2(N端和C端部分，N-聚糖突变体，SEQIDNO:5)的氨基酸序列。载体来源的氨基酸序列加粗表示，以及限制性位点来源的氨基酸序列下加双下划线。Ac-AIP-2的氨基酸序列(即SEQIDNO:1、2、4和5)下加单下划线。

图3.纯化的重组天然Ac-TMP-2和修饰的Ac-TMP-2(SEQIDNO:1)保护免受TNBS诱导的体重减轻。

图4.纯化的重组天然Ac-TMP-2和修饰的Ac-TMP-2(SEQIDNO:1)保护免受TNBS诱导的结肠病理。

图5.钩虫重组Ac-AIP-2抑制鼠中OVA诱导的气道高反应性、肺部炎症、粘液产生以及胶原沉积。(A)实验程序的示意图。(B)将肺切片用苏木精和伊红(H&E)、过碘酸雪夫氏(PAS)或Masson氏三色染色。(C)通过测量对增加剂量的乙酰甲胆碱的应答中的阻力和顺应性的侵入性体积描记法来评估肺功能。(D)通过流式细胞术评估支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(E)和淋巴细胞(L)的频率。(E)肺中白介素-5(IL-5)、IL-6、IL-13和IL-17A的浓度。(F)OVA特异的血清免疫球蛋白(Ig)E和IgG2a的水平。结果代表五次独立实验的平均值。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。

图6.AIP-2主要被CD103⁺树突细胞(DC)捕获，并且诱导对OVA诱导的炎症的抑制关键的CCR9⁺调节性T细胞(T_reg)。(A-C)用AlexaFluor(AF)-647标记的Ac-AIP-2或PBS处理小鼠5天。(A)肠系膜淋巴结(MLN)中AIP-2-AF-647⁺细胞的频率。(B)MLN中捕获AIP-2的CD11c⁺细胞的流式细胞术分析。(C)用AIP-2或介质处理的小鼠中MLNDC亚群的扩增。(D，E)用AIP-2或介质每日处理小鼠，持续5天。收集指定的组织，用抗CD4、抗CD25、抗Foxp3和抗CCR9mAb染色并通过流式细胞术进行分析。(D)CD3⁺CD4⁺T细胞中Foxp3⁺细胞的频率。(E)CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T_reg群体中表达CCR9的细胞的频率。(F)用白喉毒素(DT)或PBS处理DEREG小鼠的实验程序的示意图。(G)通过流式细胞术进行的支气管肺泡灌洗液的细胞分析。(H)肺中白介素(IL)-5和IL-13的浓度。(I)血清中OVA-特异的免疫球蛋白(Ig)E和IgG2a的水平。结果代表三次独立实验的平均值。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001。

图7.来自肠系膜淋巴结(MLN)的Ac-AIP-2诱导的调节性T细胞对保护免受OVA诱导的肺部炎症是关键的。(A)MLN切除实验方法的示意图。(B，C)收集指定的组织，用抗CD4、抗CD25、抗Foxp3、抗CTLA-4和抗CCR9mAb染色并通过流式细胞术进行分析。(D)将MLN切除的小鼠致敏，用或不用AIP-2处理，以及用OVA激发的示意图。(E)通过侵入性体积描记法评估阻力和顺应性。(F)支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(E)和淋巴细胞(L)的频率。(G)肺中白介素(IL)-5和IL-13的浓度。(H)OVA特异的血清免疫球蛋白(Ig)E和IgG2a的水平。(I)MLN移植(tx)实验程序的示意图。(J)针对增加剂量的乙酰甲胆碱的应答中的阻力和顺应性。(K)BALF分析。(L)肺中IL-5和IL-13的浓度。结果代表两次独立实验的平均值。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001。n.d.–未检出。

图8.Ac-AIP-2的治疗性或预防性粘膜递送保护小鼠免受过敏性炎症，并离体抑制人中屋尘螨特异的T细胞的增殖。(A)在实验性鼠哮喘中作为预防性(p)或治疗性(th)方式鼻内施用AIP-2的示意图。(B)支气管肺泡灌洗液分析。(C)肺中白介素(IL)-5和IL-13的浓度。(D)OVA特异的血清免疫球蛋白(Ig)E和IgG2a的水平。(e)制备来自屋尘螨(HDM)致敏患者的全血，并用CFSE染色。在AIP-2或介质存在的情况下，将细胞与HDM提取物孵育5天。将细胞用人抗CD3和抗CD4染色，并通过流式细胞术分析CFSE稀释液。结果代表三次独立实验的平均值。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。

图9.犬钩虫排泄/分泌(ES)蛋白抑制OVA诱导的气道高反应性、肺部炎症、粘液产生以及胶原沉积。(A)将肺切片用苏木精和伊红(H&E)或过碘酸雪夫氏(PAS)染色。(B)支气管肺泡灌洗物细胞分析。(C)肺中白介素(IL)-5、IL-6、IL-13和IL-17A的浓度。(D)OVA特异的血清免疫球蛋白(Ig)E和IgG2a的水平。结果代表两次独立实验的平均值。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。

图10.Ac-AIP-2(dAIP-2)的变性恢复了OVA诱导的气道炎症。(A)通过测量针对增加剂量的乙酰甲胆碱的应答中的阻力和顺应性的侵入性体积描记法来评估肺功能。(B)通过流式细胞术评估支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞(E)和淋巴细胞(L)的频率。(C)肺中白介素-5(IL-5)、IL-6、IL-13和IL-17A的浓度。结果代表两次独立实验的平均值。*P≤0.05；**P≤0.01。

图11.腹膜内施用Ac-AIP-2未诱导注射部位处的细胞浸润。用AIP-2或PBS处理并用OVA或PBS激发的小鼠的腹膜中的细胞分类计数。(E)嗜酸性粒细胞，(L)淋巴细胞，(N)嗜中性粒细胞，(M)巨噬细胞。结果代表两次独立实验的平均值。

图12.Ac-AIP-2不保护免受疫苗接种(辅助的)诱导的Th1型炎症。(A)在用AIP-2腹膜内处理的小鼠的足跖施用含OVA的弗式完全佐剂的示意图。(B)腘淋巴结(PLN)的细胞性质。(C)在48小时，用抗CD3和抗CD28或OVA体外再刺激PLN细胞。数据显示了上清液中收集的IFN-γ、TNF-α和白介素(IL)-6的浓度，并通过FACSarray进行分析。结果代表两次独立实验的平均值。

图13.Ac-AIP-2诱导的保护不需要激活Toll样受体。(A)用或未用AIP-2处理，并用OVA或PBS激发的WT或MyD88^-/-Trif^-/-小鼠的支气管肺泡灌洗液分析。(B)肺中白介素(IL)-5和IL-13的浓度。结果代表两次独立实验的平均值。**P≤0.01；***P≤0.001；****P≤0.0001。

图14.Ac-AIP-2的处理引起肠系膜淋巴结(MLN)中树突细胞的选择性扩增。(A-C)用AIP-2或介质每日处理小鼠，持续5天。(A)将MLN细胞用表面标志物染色，并分析AIP-2-AlexaFluor647的表达。(B)收集指定的组织并计数。(C)将MLN细胞用指定的表面标志物染色，并通过流式细胞术进行分析。(D)将用偶联至AlexaFluor647的AIP-2或PBS处理的小鼠用表面和激活标志物染色，并通过流式细胞术进行分析。结果代表三次独立实验的平均值。**P≤0.01；***P≤0.001。

序列简述

SEQIDNO:1-图1和图2(Ac-AIP-2_NT)中修饰的Ac-TMP-2(N端和C端部分)的氨基酸序列。氨基酸序列下加单下划线。

SEQIDNO:2-图2(Ac-AIP-2_WT)中修饰的Ac-TMP-2(C端部分)的氨基酸序列。氨基酸序列下加单下划线。

SEQIDNO:3-图1中修饰的Ac-TMP-2(N端和C端部分)的核苷酸序列。核苷酸序列下加单下划线。

SEQIDNO:4-图2(Ac-AIP-2_Q48)中修饰的Ac-TMP-2(C端部分，N-聚糖突变体)的氨基酸序列。氨基酸序列下加单下划线。

SEQIDNO:5-图2(Ac-AIP-2_NTQ48)中修饰的Ac-TMP-2(N端和C端部分，N-聚糖突变体)的氨基酸序列。氨基酸序列下加单下划线。

发明详述

本发明涉及用于减轻、缓解和/或预防炎症和/或炎症性疾病或病况(如哮喘和/或炎症性肠病)的方法。

本发明至少部分基于这样的意外发现：源自或获自钩虫(包括但不限于犬钩虫)的一种或多种蛋白可以用于减轻、缓解和/或预防个体中的炎症和/或炎症性疾病或病况(如哮喘和/或炎症性肠病)。也已显示这些抗炎特性扩展至这些钩虫蛋白的特定修饰版本。

在具体的方面，本发明涉及修饰的Ac-TMP-2蛋白或者所述修饰的Ac-TMP-2蛋白的片段、变体或衍生物，其用于减轻、缓解和/或预防炎症和/或炎症性疾病或病况(如哮喘和/或炎症性肠病)的。适当地，所述修饰的Ac-TMP-2蛋白包含通常存在于Ac-TMP-2蛋白中的多个C端氨基酸的缺失或不存在。

出于本发明的目的，“分离的”意指已从其天然状态移出或者以其它方式经受人工操作的材料。分离的材料可大体上或基本不含在其天然状态下通常伴有的组分或者可以对其进行操作以使其与在其天然状态下通常伴有的组分一同处于人工状态。分离的材料包括天然形式或重组形式的材料。术语“分离的”还包含诸如“富含的”、“纯化的”和/或“合成的”的术语。合成的包括重组合成的和化学合成的。

“Ac-TMP-2”意指组织金属蛋白酶抑制剂-2，其为来自犬钩虫的排泄/分泌蛋白。Ac-TMP-2(UniProtKB/Swiss-Prot:#B1Q143)为244个氨基酸的多肽。在本文，Ac-TMP-2或TMP-2也可被称作抗炎蛋白-2(Ac-AIP-2或AIP-2)。

本文使用的“修饰的”(如在修饰的Ac-TMP-2中的)描述了与野生型或天然的Ac-TMP-2蛋白相比，包含一个或多个N端和/或C端氨基酸的替换、插入、添加和/或缺失的分离的多肽或蛋白，但不限于此。适当地，在基本上不减弱抗炎活性的情况下，可以缺少、不存在或缺失一个或多个C端氨基酸。通过非限制性实例的方式，修饰的Ac-TMP-2蛋白可以缺少通常存在于野生型或全长的Ac-TMP-2蛋白中的一个或多个酸性C端氨基酸。所述一个或多个酸性残基可包括一个或多个谷氨酸(Glu或E)和/或天冬氨酸(Asp或D)残基。例如，截短的多肽或蛋白可以缺少通常存在于全长或野生型Ac-TMP-2蛋白中的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、95个或更多个的C端氨基酸，优选包括酸性残基。

适当地，修饰的Ac-TMP-2蛋白包含神经突起生长导向因子结构域的某些或所有C端残基缺失的神经突起生长导向因子结构域。参照SEQIDNO:4和5，此类修饰的Ac-TMP-2蛋白的实例终止于氨基酸序列DERD(SEQIDNO:6)，尽管并不限于此。

在另外的或可选实施方案中，可以缺少、缺失或不存在一个或多个N端氨基酸。在一些实施方案中，N端氨基酸为可被缺失或用异源信号肽氨基酸序列替代的信号肽的N端氨基酸。本文描述的修饰的Ac-TMP-2蛋白可以缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个N端氨基酸。

适当地，修饰的Ac-TMP-2蛋白在N端或邻近N端包含氨基酸序列C-X-C。在SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5中所示的氨基酸序列中，该序列为C-S-C。就这一点而言，“位于或邻近N端”意指N端或在N端约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内。

虽然不希望受任何具体理论束缚，但提出，C端氨基酸可以单独或与某些N端氨基酸一起从野生型Ac-TMP-2缺失，只要保留位于或临近N端的C-X-C基序以允许插入MMP活性部位裂缝，随后抑制催化活性。

通过非限制性实例的方式，修饰的Ac-TMP-2可以为截短的多肽或蛋白，如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5的修饰的Ac-TMP-2。

虽然修饰的Ac-TMP-2蛋白和全长或野生型Ac-TMP-2蛋白都可被称作组织金属蛋白酶抑制剂，但是应当理解，修饰的Ac-TMP-2蛋白不一定具有该特定的生物活性。而且，即使修饰的Ac-TMP-2蛋白具有该生物活性，其对于蛋白的抗炎特性不一定是必要或必需的。

本文进一步考虑可以通过交联、片段化、变性、还原二硫化物或连接各种辅基(例如聚二乙醇化)来改变修饰的多肽或蛋白，虽然不限于此。

本文使用的“片段”描述了修饰的Ac-TMP-2蛋白的部分、结构域、区域或子序列，其包含修饰的Ac-TMP-2蛋白(如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5中所示的)的不多于6、10、12、15、20、30、40、5060、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210或220个连续氨基酸。

优选地，所述片段为“生物学活性片段”。在一些实施方案中，所述生物学活性片段具有修饰的Ac-TMP-2蛋白(如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所述的修饰Ac-TMP-2蛋白)的不少于10％，优选不少于25％，更优选不少于50％以及甚至更优选不少于75％、80％、85％、90％或95％的抗炎活性。可以利用本领域技术人员承认的通常用于鉴定此类活性的标准测试方法和生物分析来评价此类活性。

(蛋白的)“结构域”意指共有共同的结构特征、生理化学特征和功能特征的蛋白部分，例如疏水的、极性的、球状的、螺旋状的或神经突起生长导向因子样(NTR)结构域，或者特性，例如蛋白结合结构域、受体结合结构域、辅因子结合结构域等。

还考虑修饰的Ac-TMP-2蛋白的变体，其在修饰的Ac-TMP-2蛋白的氨基酸序列或其片段中包含一个或多个氨基酸替换、插入和/或缺失。

通常，以及涉及蛋白时，“变体”蛋白含有已被不同的氨基酸替代的一个或多个氨基酸。本领域众所周知，在不改变蛋白的活性性质的情况下，可以将某些氨基酸改变为具有大致上类似特性的其它氨基酸(即，保守替换)。

就这一点而言，可以改变一个或多个氨基酸以防止或抑制特定的翻译后修饰，如通过真核表达宿主(包括酵母和动物细胞)产生的翻译后修饰，因为它们可产生与人的蛋白不相同的糖基化模式，因而可引起患者的免疫原性反应。本发明考虑的具体变体的非限制性实例为非糖基化变体，其中糖基化位点的氨基酸被缺失或被其它氨基酸替代。例如，N-连接的糖基化位点可被突变成非糖基化氨基酸，如被突变成谷氨酰胺(Gln或Q)残基。例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)通常产生具有免疫原性的高甘露糖聚糖。鉴于前面所述，在SEQIDNO:4和5的修饰的Ac-TMP-2中进行N至Q的突变以移除真核表达系统中的N-连接的糖基化位点。

还将理解，在基本不改变修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段的生物活性的情况下，可将参考序列(如修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段)的一个或多个氨基酸残基修饰或缺失或者添加其它序列。可以使用本领域技术人员承认的通常用于鉴定此类活性的标准测试方法和生物分析来评价此类活性。

通过实例的方式，位于Ac-TMP-2N端的天然信号肽可以被选择的表达系统特异的信号序列(如酵母特异性信号序列)整体或部分替代，以例如靶向重组表达的Ac-TMP-2蛋白分泌至表达培养基。

术语“变体”包括修饰的Ac-TMP-2蛋白的肽模拟物和直系同源物。“肽模拟物”意指含有能够模拟或拮抗天然亲本肽的生物作用的非肽结构元件的分子。肽模拟物的实例包括肽骨架被一个或多个苯二氮分子取代的肽化合物(参见，例如，James等人,Science260:1937-42,1993)和“反-倒位(retro-inverso)”肽(参见，例如，美国专利第4,522,752号)。该术语还指除天然存在的氨基酸之外的部分，所述部分在构象上和功能上作为蛋白中特定氨基酸的代替而未显著程度上不利地干扰所述蛋白的功能。氨基酸模拟物的实例包括D-氨基酸。可以使用熟知的肽合成程序来制备被一个或多个D-氨基酸替换的蛋白。其它替换物包括具有含官能团的不同侧链的氨基酸类似物，如例如，β-氨丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟基苯丙氨酸、5-羟色氨酸、1-甲基组氨酸以及3-甲基组氨酸。

修饰的Ac-TMP-2蛋白的“直系同源物”意指来自其它肠蠕虫(即，钩虫、鞭虫和蛔虫)的修饰的TMP直系同源物，所述其它肠蠕虫包括人钩虫(如例如美洲板口线虫(Necatoramericanus)、十二指肠钩口线虫(Ancylostomaduodenale)和锡兰钩口线虫(Ancylostomaceylanicum))和猪的鞭虫(如例如猪鞭虫(Trichurissuis)和毛首鞭形线虫(Trichuristrichiura))。

在一个实施方案中，蛋白变体或直系同源物与参考氨基酸序列(如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5)共有至少70％，优选至少75％、80％或85％，以及更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

优选地，基于包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的氨基酸序列的参考序列的至少60％，更优选基于至少75％，更优选基于至少90％或更优选基于至少95％、98％或者基本上全长来测量序列同一性。

为了确定序列同一性百分比，可以通过计算机化执行算法(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin遗传软件包第7.0版,GeneticsComputerGroup,WI,USA)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过检验和由选择的各种方法中任何一种所产生的最佳比对(即，在比较窗口中产生最高同源性百分比)来进行氨基酸和/或核苷酸序列的最佳比对。还可参考如例如由Altschul等人，Nucl.AcidsRes.25:3389-402,1997公开的BLAST程序家族。

序列分析的详细讨论可见于Ausubel等人所著的《分子生物学实验指南》(“CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY”)第19.3单元(JohnWiley&SonsIncNY,1995-1999)。

可通过本领域技术人员已知的多种标准诱变程序产生变体蛋白。突变可涉及单个基因、基因模块或整个染色体的核苷酸序列的修饰，随后产生一种或多种突变蛋白。单基因中的变化可以是涉及DNA序列内单个核苷酸碱基的移除、添加或替换的点突变的结果，或者它们可以是涉及大量核苷酸的插入或缺失的变化的结果。

突变发生于暴露于化学或物理诱变剂之后。此类突变诱导剂包括电离辐射、紫外光和一系列不同的化学剂(例如烷化剂和多环芳香烃)，其全部都能够与核酸直接或间接(通常在某些代谢生物转化之后)相互作用。当受影响的DNA复制或修复时，由此类环境物质诱导的DNA损伤可导致碱基序列的修饰，并因此导致可随后反映于蛋白水平的突变。通过使用具体的靶向方法，突变也可以是定点的。

用于产生包含一种或多种突变的修饰的Ac-TMP-2的诱变程序包括但不限于：随机诱变(例如，基于通过插入已知的DNA片段而使基因失活的插入诱变、化学诱变、辐射诱变、易错PCR(CadwellandJoyce,PCRMethodssAppl.2:28-33,1992))和定点诱变(例如，利用编码期望的突变的DNA序列的特异性寡核苷酸引物序列)。定点诱变的其它方法公开于美国专利申请第5,220,007号；第5,284,760号；第5,354,670号；第5,366,878号；第5,389,514号；第5,635,377号和第5,789,166号。

还提供了修饰的蛋白的“衍生物”，包括其片段和变体。此类衍生物可包括化学修饰的蛋白(例如氨基酸侧链修饰)，化学交联的蛋白，修饰以包含抗生物素蛋白、生物素和其它结合部分、添加表位标签和/或融合配偶体(fusionpartner)(例如FLAG、血凝素、myc标签、GST或MBP、六聚组氨酸融合配偶体)、标记(例如放射性标记、荧光标记)和酶(例如HRP、碱性磷酸酶)的蛋白，尽管不限于此。

可以通过本领域技术人员已知的任何合适的程序来制备修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括片段、变体和衍生物)。

在一个实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括片段、变体和衍生物)通过化学合成产生。化学合成技术在本领域是众所周知的，尽管对于合适的方法的实例，技术人员可以参考Coligan等人编著的《蛋白质科学实验指南》(“CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE”)第18章(JohnWiley&SonsNY(1995-2001)。

在另一实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白(包括片段、变体和衍生物)被制备为重组蛋白。

虽然重组蛋白的产生在本领域是众所周知的，但是技术人员可以参考如例如下述中所描述的标准方案：Sambrook等人的《分子克隆实验指南》(ColdSpringHarborPress,1989)，特别是第16和17部分；Ausubel等人编著的《分子生物学实验指南》(“CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY”)(JohnWiley&Sons,Inc.1995-1999)，特别是第10和16章；以及Coligan等人编著的《蛋白质科学实验指南》(“CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE”)(JohnWiley&Sons，Inc.1995-1999)，特别是第1、5和6章。

因此，在另一方面，本发明提供编码修饰的Ac-TMP-2蛋白(如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:5中所示的)或所述修饰的Ac-TMP-2蛋白的片段、变体或衍生物的分离的核酸。

本文使用的术语“核酸”指单链或双链DNA和RNA。DNA包括基因组DNA和cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化RNA(autocatalyticRNA)。核酸也可为DNA-RNA杂交体。核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列通常包含包括A、G、C、T或U碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可以包含其它碱基，如肌苷、甲基胞嘧啶(methylycytosine)、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫代尿苷，尽管不限于此。

因此，在具体实施方案中，分离的核酸为cDNA。

在其它实施方案中，分离核酸为密码子优化的核酸。

本发明还提供了包含上述方面的分离的核酸的遗传构建体。

本发明还提供了包含上述方面的遗传构建体的宿主细胞。

适当地，遗传构建体包含促进分离的核酸表达的一种或多种其它核苷酸序列。此类其它核苷酸序列可以包括调控序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、剪接供体/受体序列、选择标志物(例如用于抗生素抗性)、信号肽、复制起点或者帮助在原核和/或真核宿主细胞中转化、增殖、选择和表达的其它核苷酸序列。在重组蛋白表达的背景下，本领域技术人员将会理解，合适的遗传构建体和宿主细胞在某种程度上是相互依赖的。遗传构建体至原核和/或真核宿主细胞的导入、表达蛋白的细胞的增殖和选择在本领域是众所周知的。

用于表达的合适的宿主细胞可以是原核的或真核的。例如，合适的宿主细胞可以是哺乳动物细胞(例如HeLa、HEK293T、Jurkat细胞)、酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、与杆状病毒表达系统一同使用或不与杆状病毒表达系统一同使用的昆虫细胞(例如Sf9、粉纹夜蛾(Trichoplusiani))或细菌细胞(如大肠杆菌)或牛痘病毒宿主。

在一方面，本发明提供了减轻或缓解个体中炎症的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的修饰的Ac-TMP-2蛋白或所述修饰的Ac-TMP-2蛋白的片段、变体或衍生物。

在另一方面，本发明提供了预防个体中炎症的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物。

“减轻”(如在减轻个体中的炎症中)意指与炎症有关的症状、方面或特征(例如发红、热、肿胀和/或疼痛)或者个体经历与炎症有关的症状、方面或特征的时长的减轻或缩短。此类减轻不需要对个体完全有益。“缓解”(如在缓解个体中的炎症中)意指与炎症有关的症状、方面或特征(例如发红、热、肿胀和/或疼痛)的严重程度或严重性的降低。此类缓解不需要对个体完全有益。可以使用普通技术人员已知的任何方法或标准来测定个体中炎症的减轻和/或缓解，包括定性和定量的方法和标准。

应当理解，减轻或缓解个体中的炎症是治疗个体中的炎症的方法。本文使用的“治疗(treating)”(或者“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)指炎症开始发展之后改善炎症的征象或症状的治疗干预。关于炎症，术语“改善”指任何可观察到的治疗的有益效果。可以使用普通技术人员已知的任何方法或标准来测定有益效果。

本文使用的“预防(preventing)”(或者“预防(prevent)”或“预防(prevention)”)指在炎症的症状、方面或特征发作之前起始的行动过程(如施用治疗有效量的修饰的Ac-TMP-2或其片段、变体或衍生物)，以预防或减轻所述症状、方面或特征。将会理解，此类预防不需要对个体完全有益。“预防性”治疗指出于降低炎症的症状、方面或特征发展的风险的目的，向未显示炎症征象或仅显示早期征象的个体施用的治疗。

本文使用的“炎症”指针对各种类型的损伤或感染的众所周知的局部应答，其特征是发红、热、肿胀和疼痛，并且通常还包括功能障碍或活动性降低。炎症代表了控制感染并预防其从最初的病灶蔓延的早期防御机制。炎症中的主要事件包括毛细血管扩张以增加血液流动、微脉管系统结构的变化(导致血浆和蛋白以及白细胞从循环逃离)以及白细胞从毛细血管移出并在损伤或感染部位积聚。

炎症通常与个体中的疾病、病症和/或病况有关或者继发于个体中的疾病、病症和/或病况，所述疾病、病症和/或病况包括免疫学疾病、病症和/或病况(如自身免疫疾病、病症和/或病况)和过敏反应。示例性的免疫学疾病、病症和/或病况包括但不限于：爱迪生氏病、强直性脊柱炎、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性脊髓炎(CRMO)、克罗恩病、脱髓鞘性神经病、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫氏病、古兰-巴雷综合征、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、胰岛素依赖型糖尿病(1型)、幼年型关节炎、川崎综合征、多发性硬化、重症肌无力、心肌梗死后综合征、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、特发性肺纤维化、赖特综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、血小板减少性紫癜(TTP)、溃疡性结肠炎、血管炎、白癜风以及韦格纳肉芽肿。

如本领域普通技术人员将会理解的，消化道疾病(例如慢性胃炎或炎症性肠病(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎))和呼吸系统疾病(例如哮喘、肺气肿、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD))具有炎性组分，因此特别适合于使用本公开的方法进行治疗。

因此，在一方面，本发明在于预防和/或治疗个体中的炎症性肠病的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的以上描述的修饰的Ac-TMP-2蛋白，从而预防和/或治疗所述炎症性肠病。

在一个实施方案中，所述炎症性肠病为克罗恩病或溃疡性结肠炎。

在相关方面，本发明在于预防和/或治疗个体中的呼吸系统疾病的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的以上描述的修饰的Ac-TMP-2蛋白，从而预防和/或治疗所述呼吸系统疾病。

在具体实施方案中，呼吸系统疾病选自：哮喘、肺气肿、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。在具体优选实施方案中，所述呼吸系统疾病为哮喘。

如本领域普通技术人员还将理解的，当疾病、病症和/或病况对基础疗法是难治的时，通常发生与个体中的疾病、病症和/或病况有关的或继发于个体中的疾病、病症和/或病况的炎症，所述基础疗法为例如包括下述的基础疗法：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂(例如抗TNFα剂、抗IL-5剂、抗IL-13剂、抗IL-17剂和抗IL-6R剂)、抗生素及其组合。“难治的”意指对治疗特别是一线治疗有抗性。

术语“个体”包括人类和兽医个体。例如，向个体施用可包括向人类个体或兽医个体的施用。优选地，所述个体为人。然而，根据本发明的治疗用途还可应用于哺乳动物，如家养动物和伴生动物、表演动物(如马)、家畜以及实验室动物。

“施用”意指通过选择的途径将组合物(例如，包含修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物的药物组合物)引入个体中。

术语“治疗有效量”描述了足以在正用指定药剂进行治疗的个体中实现期望的效果的该药剂的量。例如，其可以是减轻、缓解和/或预防炎症所需的包含修饰的Ac-TMP-2(或其片段、变体或衍生物)的组合物的量。在一些实施方案中，“治疗有效量”足以减轻或消除炎症的症状。在其它实施方案中，“治疗有效量”为足以实现期望的生物效应的量，例如有效降低与炎症有关的发红、热、肿胀和/或疼痛的量。

理想地，药剂的治疗有效量为足以诱导期望的结果但不在个体中引起大量的细胞毒性效应的量。用于减轻、缓解和/或预防炎症的药剂(例如修饰的Ac-TMP-2(或其片段、变体或衍生物))的有效量将取决于正被治疗的个体，任何相关疾病、病症和/或病况的类型和严重性以及治疗性组合物的施用方式。

在治疗疗程期间，可以以单剂量或多剂量的形式(例如每天)施用治疗有效量的包含修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)的组合物。然而，施用的频率取决于应用的制剂、正被治疗的个体、炎症的严重性以及疗法或组合物的施用方式。

在一些实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物还可包含融合配偶体(fusionpartner)氨基酸序列。所述融合配偶体氨基酸序列由遗传构建体有利地编码，以在重组蛋白的N端和/或C端表达。融合配偶体包括多聚组氨酸(例如His₆)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和表位标签(如FLAG、HA和myc标签)。融合配偶体有助于通过亲和树脂(例如金属离子、麦芽糖、谷胱甘肽树脂)或抗体(在表位标签的情况下)的方式鉴定和纯化重组表达的蛋白。

在某些实施方案中，治疗或预防炎症的方法和/或药物组合物可包含适合向个体施用的一种或多种其它药剂。除治疗有效量的修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)之外，可以向有需要的个体施用本领域技术人员已知的用于减轻、缓解和/或预防炎症(和/或用于治疗或预防与炎症相关的疾病、病症和/或病况)的一种或多种其它药剂的不同组合。即，除治疗有效量的修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)之外，可以向个体施用常规用于炎症的治疗和/或预防的一种或多种其它药剂。

例如，在某些实施方案中，为了减轻、缓解和/或预防炎症，可将非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂(特别是抗细胞因子/细胞因子受体抗体)(例如抗TNFα剂、抗IL-5剂、抗IL-13剂、抗IL-17剂和抗IL-6R剂)、抗生素以及它们的组合与修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)一同施用。

在某些实施方案中，一种或多种其它药剂为修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)提供保护作用。在其它实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)为一种或多种其它药剂提供保护作用。在其它实施方案中，一种或多种其它药剂为修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)的作用提供互补作用，优选地消除或减轻(和/或预防)与炎症相关的一种或多种症状的频率或严重性。

如本领域技术人员所熟知的，非类固醇抗炎药(NSAID)也被称作非类固醇抗炎剂(NSAIA)，其为具有止痛、退热和抗炎效果的药物，并且包括水杨酸盐(例如阿司匹林)和丙酸衍生物(例如布洛芬和萘普生)。

本领域众所周知氨基水杨酸盐用于治疗炎症性肠病(特别是溃疡性结肠炎)，并且其包括例如巴柳氮、美沙拉嗪、奥沙拉秦和柳氮磺胺吡啶。

如本领域技术人员所熟知的，皮质类固醇是与由肾上腺产生的激素皮质醇极其类似的药物。示例性的皮质类固醇包括但不限于：可的松、泼尼松、泼尼松龙和甲基泼尼松龙。

本领域众所周知免疫抑制剂用于治疗与某些疾病或病况相关的炎症，并且其包括例如药物环孢素、硫唑嘌呤和霉酚酸酯。

如本领域技术人员所熟知的，抗细胞因子/细胞因子受体剂(例如，抗TNFα剂、抗IL-5剂、抗IL-13剂、抗IL-17剂和抗IL-6R剂)包括但不限于小分子抑制剂和抗体。

在一些实施方案中，修饰的Ac-TMP-2(或其片段、变体或衍生物)与一种或多种其它药剂的组合在炎症的治疗和/或预防中产生协同效果。因此，本发明还包括增强药剂在治疗使用该药剂的任何病况(例如炎症以及任何相关疾病、病症和/或病况)中的治疗效力的方法。

在一个实施方案中，在施用一种或多种其它药剂之前施用修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)。在另一实施方案中，在施用一种或多种其它药剂之后施用修饰的Ac-TMP-2(或其片段、变体或衍生物)。在另一实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)与一种或多种其它药剂同时施用。在另一实施方案中，修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)的施用和一种或多种其它药剂的施用(依序或同时)导致炎症的减轻或缓解，所述减轻或缓解优于来自在另一种不存在的情况下修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)或一种或多种其它药剂的施用的此类减轻或改善。

如本领域技术人员所熟知的，可以结合治疗组合物，通过可用的任何常规方法/途径施用修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)和一种或多种其它药剂。此类方法包括但不限于：通过微针注射至特定的组织部位施用，如美国专利第6,090,790号中所述的；应用于炎症部位的局部乳霜、洗液或密封剂式敷料(sealantdressing)，如美国专利第6,054,122号中所述的；或者释放修饰的Ac-TMP-2(或其片段、变体或衍生物)的移植物，如国际公开WO99/47070中所述的。

就这一点而言，可将包含修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)以及任选地一种或多种其它药剂的组合物与适当地浸渍、包被或以其它方式包含所述组合物的生物材料、生物聚合物、无机材料(如羟基磷灰石或其衍生物)、外科植入物、假体、填疮、伤口敷料、敷布、绷带等结合施用，或者作为上述的组分施用。

适当地，所述组合物包含合适的药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选地，所述药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂适合于向哺乳动物施用，以及更优选地向人施用。

“药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂”意指可安全地用于全身施用的固体或液体填充物、稀释剂或包封物质。根据具体的施用途径，可以使用本领域熟知的多种载体。这些载体可选自：糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐类(如无机酸盐(其包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐)、有机酸盐(如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐))以及无热原水。

描述药学可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献为《雷明顿药物科学》(“Remington’sPharmaceuticalSciences”)(MackPublishingCo.NJUSA,1991)。

可以采用任何安全的施用途径，以向个体提供包含修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)以及任选地一种或多种其它药剂的组合物。例如，可以采用口服施用、直肠施用、肠胃外施用、舌下施用、颊部施用、静脉内施用、关节内施用、肌肉内施用、真皮内施用、皮下施用、吸入施用、鼻内施用、眼内施用、腹膜内施用、脑室内施用、经皮施用等途径。

剂型包括片剂、分散体(dispersion)、悬液、注射剂、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊、栓剂、气溶胶、经皮贴剂等。这些剂型还可包括为控制注射或植入专门设计的控制注射或植入的释放装置或改良以以此种形式另外起作用的植入物的其它形式。修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)以及任选地一种或多种其它药剂的受控释放可受例如用疏水聚合物(包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物(如羟丙基甲基纤维素))进行包被的影响。此外，受控释放可受利用其它聚合物基质、脂质体和/或微球的影响。

可以以与剂型兼容的方式以及以药学/治疗有效的量施用上文的组合物。在本发明的背景下，向个体施用的剂量应当足以在适当的时间段内，在个体中产生有益的应答(例如，炎症的减轻)。待施用的修饰的Ac-TMP-2蛋白(或其片段、变体或衍生物)的量可取决于待治疗的个体，包括其年龄、性别、体重和整体健康状况，根据本领域普通技术专从业者的判断的因素。

本文所描述的组合物还可包含表达载体，如病毒载体(例如牛痘病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体、以及源自单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的载体)。如根据美国专利5,929,040和美国专利5,962,427中所示的方法，在该方面也可应用基因疗法。

为了容易地理解本发明并将其投入实际应用，提供下述非限制性实施例。

实施例

实施例1

重组修饰的Ac-TMP-2抑制IBD(TNBS模型)

动物和TNBS诱导的结肠炎

在将六周龄的雄性瑞士C57Bl/6小鼠(体重20–25g，动物资源中心，珀斯，西澳大利亚)用于实验前，允许其适应七天。根据澳大利亚动物权利和法规标准饲养它们。涉及小鼠的所有程序均经詹姆斯库克大学动物伦理委员会批准。

如由Neurath等人(JExpMed.182:1281-90,1995)所述的，通过管腔内注射TNBS诱导结肠炎。简言之，使小鼠禁食24小时，其中可自由饮水。通过腹腔内注射(i.p.)氯胺酮(50μg/kg)与甲苄噻嗪(5μg/kg)的混合物将其麻醉。接下来，通过3.2cm长的软导管直肠内注射100μL含2.5mgTNBS的45％乙醇溶液。TNBS注射之后，将小鼠以45°的姿势倒置一分钟以预防TNBS溶液的渗漏，之后将其放回笼中，其中可自由获得食物和水。

实验方案

在第0天，小鼠接受单次腹膜内注射20μg天然的Ac-TMP-2、截短的Ac-TMP-2(SEQIDNO:1)或模拟PBS注射。五小时后，在轻微麻醉下，它们接受直肠内注射含2.5mgTNBS的45％乙醇溶液。从第0天至第3天，每天监测小鼠的体重减轻。在第3天，使小鼠安乐死，并收集结肠用于炎症的评估(结肠长度、壁增厚、水肿和溃疡)。

结果

修饰的Ac-TMP-2显示于图1中。在导致本发明的工作中，C端氨基酸序列GLEQKLISEEDLNSAVD与N端序列EAEAEF从野生型Ac-TMP2一起缺失。鉴于发明人的想法(TIMP似乎需要位于N端的C-X-C基序以允许插入MMP活性部位裂缝，并随后抑制催化活性)，对这些氨基酸的缺失进行研究。当与接受模拟注射的TNBS组相比时，如绘制为各组小鼠的平均值的绝对体重减轻(图3A)和体重减轻百分比(图3B)所示的，天然的Ac-TMP-2和修饰的(即截短的)Ac-TMP-2显著地保护小鼠免受体重减轻，。

进一步评估截短的Ac-TMP-2的结肠长度(图4A)和显微镜检查分数(图4B)。对于这两项测量，天然的Ac-TMP-2和截短的Ac-TMP-2提供了肠病理的显著减轻(图4)。在图4C中，截短的Ac-TMP-2的该保护效应在来自初始小鼠(A)、TNBS处理的小鼠(B)、天然的Ac-TMP-2处理的小鼠(C)和截短的Ac-TMP-2处理的小鼠(D)的结肠中也非常明显。

因此，与天然的Ac-TMP-2相比，截短的Ac-TMP-2在IBD的小鼠模型中表现出类似的保护特性。

实施例2

重组修饰的Ac-TMP-2(AIP-2)抑制哮喘

材料和方法

小鼠.3-12周龄的BALB/c.ARC小鼠购自动物资源中心(珀斯，澳大利亚)，并根据澳大利亚动物权利和法规标准在SPF条件下饲养。MyD88-TRIFFKO小鼠经来自WalterandElizaHallInstitute(墨尔本，澳大利亚)的L.Schofield，由S.Akira(大阪大学，日本)惠赠，其与DEREG小鼠(25)均饲养于位于澳大利亚，QLD，凯恩斯，詹姆斯库克大学(JCU)的动物设备中。所有的实验方案均经JCU动物伦理委员会批准。

试剂.如以前所述(16)的培养犬钩虫成年钩虫。收集上清液(AcES)并使用根据制造商的说明书的EndotrapBlue(Hyglos)或有某些微小改变的如以前所述的TritonX-114(Sigma)这两种方法中的一种去除内毒素(16)。使用别处描述的方法(31)，使重组的Ac-AIP-2在毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达为分泌蛋白。利用EcoRI和XbaI限制性位点，将编码Ac-AIP-2的成熟序列(氨基酸17-244)的cDNA克隆进pPICZαA(Invitrogen)的框中。根据制造商的说明书(Invitrogen)，通过SacI消化将重组质粒线性化，并通过电穿孔将其转化进毕赤酵母菌株X-33中。在含有zeocin的酵母提取物-蛋白胨-葡聚糖的平板上挑选转化子，并经蛋白质印迹评估重组蛋白的表达。按照制造商的说明书(Invitrogen)，使Western阳性克隆在摇瓶中生长，并用甲醇诱导重组的6×His标签Ac-AIP-2的表达。用镍亲和柱纯化重组融合蛋白，以及使用AmiconUltra离心浓缩器浓缩含有Ac-AIP-2的洗出液，并将缓冲液更换为PBSpH7.4。如使用鲎变形细胞溶解物(LAL)分析(Pierce)所测定的，AcES和Ac-AIP-2中的脂多糖含量在5ng/mg以下。如之前所述的，通过胰蛋白酶消化(1μg/ml)(Sigma)和热变性使AIP-2变性(16)。按照制造商的说明书(LifeTechnologies)，利用蛋白标记试剂盒用AlexFluor647标记AIP-2。屋尘螨提取物购自。针对CD3、CD4、CD25、CD19、B220、120G8、TCR、Foxp-3、CCR9、CD103、CTLA-4、F4/80、Siglec-F、Gr-1、CD11c、CD11b、IA/IE、CD80、CD86、IL-4、IL-5、IL-10以及IL-17A的单克隆抗体购自ebiosciences和BDBiosciences。

过敏性哮喘的AcES或AIP-2治疗和诱导.通过在第0天和第7天两次腹腔内注射20μg在2mg氢氧化铝(Alum)(Pierce)中的无内毒素的OVA(Hyglos)进行致敏。在第12天至第16天，用含1mg/kgAcES或AIP-2的PBS(LifeTechnologies，澳大利亚)处理小鼠。从第14天至第18天，利用超声波雾化器(VentalairMax，Allersearch)将小鼠每天暴露于OVA(0.2％)(Sigma)或PBS气溶胶20分钟。在第20天，分析小鼠的肺功能以及气道变应性疾病的标志。

气道高反应性.如以前所述的，在最后的气溶胶激发之后两天，使用Flexivent(SCIREQ,EmkaTechnologies)进行动态肺阻力和顺应性的侵入式测量(32)。简言之，将小鼠麻醉(50mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苄噻嗪)，切开气管并立即插入18-G导管，随后机械通风。将呼吸频率设置在150次呼吸/分钟，其中潮气量为0.2ml，并应用2mlH₂O的呼气末正压。用由喷雾器头(Aeroneb，Aerogen)产生的2.5-4.0μm的气溶胶颗粒尺寸，经雾化器气溶胶系统，以每10秒20次抽吸的速率施用增加浓度的乙酰甲胆碱(0-50mg/ml)，其中气溶胶递送的每次抽吸持续10毫秒。在施用随后剂量的乙酰甲胆碱之前恢复基线阻力。

BALF细胞分析.通过切断尾部的腔静脉使小鼠流血，并将插管插入气管中。用1ml温的PBS将肺洗涤3次。对于BALF分类细胞计数，将细胞用抗Siglec-f、抗Gr1、抗CD3和抗CD19mAbs(BDBiosciences)染色，并利用FACSCantoII流式细胞仪和FACSDiva软件，通过流式细胞术进行分析。将嗜酸性粒细胞界定为Siglec-F⁺CD3^-CD19^-，将嗜中性粒细胞界定为Gr-1^高CD3^-CD19^-，将淋巴细胞界定为CD3⁺CD19⁺，以及将肺泡巨噬细胞界定为大的自发荧光细胞。

血清抗体测量.通过ELISA测量血清OVA特异性IgG2a和IgE。将抗原包被的Maxisorp板(Nunc)与连续稀释的血清和生物素化的抗IgG2a或抗IgEmAbs(BD)孵育。将HRP偶联的链霉亲和素(BDBiosciences)和TMB(KPL)用于检测。

细胞因子分析.将肺样本在不含钙和镁的Hank’s平衡盐溶液以及磷酸酶与蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中均化。使用FACS阵列(BDBiosciences)，用细胞因子珠阵列(CBA)进行多重IL-5、IL-13、IL-17A和IFN-分析。

组织处理.使用MiltenyiGentleMACS，在含有2％胎牛血清(FCS)、400UI型胶原酶和1mg/mlI型DNA酶(LifeTechnologies)的RPMI1640培养基中处理气管、肺、肠系膜淋巴结(MLN)、外周淋巴结(臂部的、腹股沟和腘的)或脾脏，并在37℃孵育15分钟。通过70μm的细胞过滤器滤过细胞。用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。如以前所述(33)，在含有5％FCS、5mMEDTA和2mM二硫苏糖醇(DTT)的RPMI中消化之后获得siLP。简言之，移除派伊尔氏淋巴集结，并在搅拌下将组织碎片孵育30分钟。通过过滤去除肠上皮淋巴细胞，并将剩余物在含有5％FCS、400UI型胶原酶和1mg/mlI型DNA酶的RPMI中，于37℃进一步孵育30分钟。将小肠固有层细胞过滤并染色，以用于流式细胞术。

肠手术.用氯胺酮(50mg/kg)和甲苄噻嗪(5mg/kg)麻醉三周龄的BALB/c.ARC小鼠，并如以前所述移出小肠和大肠的MLN(26)。对于MLN切除(MLNrx)实验，在移出MLN之后，将肠放回腹部。对于MLN移植(MLNtx)实验，从AIP-2或PBS处理的供体中分离MLN。移出宿主小肠和大肠的MLN，并将供体MLN移植进该区域。在后续实验之前，允许小鼠恢复6周。

统计分析.使用重复测量的ANOVA来确定体积描记法测量的小鼠组之间的差异水平。通过不成对的双尾学生t-检验进行所有对的比较。显著性水平被设置在P值为0.05。

结果和讨论

免疫流行病学的观察突出了针对过敏性蠕虫感染的保护效应(1-3)。一项在埃塞俄比亚乡村的近13,000个个体的此类研究发现，通过用钩虫美州板口线虫感染，喘息的风险独立地降低，但其与病毒暴露不相关(4)。最近，已经在炎症性肠病(5-7)、多发性硬化(8)、哮喘(9)和鼻炎(2)的临床试验中，对用美州板口线虫或猪的鞭虫猪鞭虫进行实验感染的效力进行了评估。我们最近完成了开放性临床试验，其中将实验低剂量的钩虫感染与麸质微激发结合以显著提高乳糜泻患者的麸质耐受性(10)。针对麸质的提高的耐受性与肠中产生IFN-γ的肠上皮细胞的降低的频率以及Foxp3⁺调节性T细胞(T_reg)的增加的频率一致。虽然益生性蠕虫疗法已经在慢性炎症性病况的治疗中产生了实质性益处(11)，但是围绕用活的病原体进行实验性人类感染(12)及其作为治疗模式的潜在可扩展性的关注盛行。鉴定保护性蠕虫分子可以规避该问题，并促进用于治疗由免疫系统失调引起的一系列病症的蠕虫来源的生物制品的发展。极少蠕虫来源的免疫调节分子被表征，以及甚至更少数已证明能保护小鼠免受炎症性疾病(13，14)。我们之前表明，钩虫排泄/分泌产物(AcES)调节小鼠中化学诱导的结肠炎，并且其保护性部分为蛋白(15，16)。在本文，我们表明AcES保护免受实验性哮喘，并且该保护可能至少部分是由于我们称作AIP-2的蛋白的分泌。我们表明重组的AIP-2诱导肠系膜CD103⁺树突细胞的扩增，导致归巢至粘膜的T_reg的产生。而且，我们表明AIP-2在肠系膜淋巴样组织上产生促调节印记(imprint)，其促进针对过敏性哮喘的长期特异性保护。

已在Th1/17介导的疾病(以化学诱导的结肠炎为代表)的模型中报道了AcES诱导的保护(15，16)，但在主要的Th2介导的炎症(如气道变应性疾病)模型中未报道。在此，我们使小鼠对OVA/Alum致敏，并用腹膜内(i.p.)AcES或介质(PBS)进行处理。与介质处理的小鼠相比，在AcES处理的小鼠中，肺的支气管周围和血管周围的细胞浸润以及粘液分泌过多明显降低(图9a、b)。AcES处理后，肺Th2细胞因子(IL-5和IL-13)和促炎性细胞因子(IL-6和IL-17A)均降低(图9c)。IFN-γ的水平未检出(数据未显示)。与介质对照相比，在AcES处理的小鼠中，OVA特异的IgE和IgG2a的血清滴度明显降低(图9d)。AcES的蛋白质组学分析(17)揭示了两种基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)样蛋白Ac-TMP-1和TMP-2的丰富表达(18，19)。在Ac-TMP-2明显的金属蛋白酶抑制特性不存在的情况下(20)，以及为了避免混淆其建议的功能，基于本文描述的其抗炎特性，我们将它重新命名为犬钩虫抗炎蛋白-2(Ac-AIP-2或AIP-2)。

为了确定重组的AIP-2是否可以保护免受实验性哮喘，使小鼠针对OVA/alum致敏，用AIP-2、热变性/蛋白酶变性的AIP-2(dAIP-2)或介质进行处理，并用雾化的OVA或PBS激发(图5a、10)。用AIP-2处理的小鼠表现出肺支气管周围和血管周围细胞浸润、粘液分泌过多和胶原沉积的显著降低(图5b)。通过AIP-2处理，肺的阻力和顺应性显著地改善(图5c)，并且支气管肺泡灌洗液(BALF)的细胞分类计数显示出这些小鼠中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润的显著降低(图5d)。用dAIP-2处理小鼠未被保护免受气道炎症(图10a、b)，以及与介质和dAIP-2处理组相比，在AIP-2处理的组中，细胞因子水平显著较低(图5e、10c)。类似地，与对照相比，在AIP-2处理的小鼠中，OVA特异的IgE和IgG2a血清滴度显著较低(图5f)。AcES的注射(i.p.)导致腹膜的嗜酸性粒细胞增多(16)。为了证实AIP-2不诱导类似的作用(其可能解释气道细胞浸润的不存在)，收集来自用AIP-2处理的小鼠的腹膜灌洗物，并发现其含有与对照相同数量的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞(图11)。为了证实AIP-2不具有一般的免疫抑制能力，将小鼠用AIP-2或介质处理，然后在足跖中注射含OVA的弗式完全佐剂。收集腘淋巴结，进行细胞计数并用OVA体外再刺激(图12a)。在AIP-2处理的小鼠和介质对照小鼠中，细胞性质以及IFN-γ、IL-6和TNF-α的水平类似(图12b/c)。

在试图理解管理AIP-2介导的保护的细胞机制中，我们首先想要确定是否涉及toll样受体(TLR)信号转导。为了该目的，在野生型(WT)小鼠旁边，使B6.MyD88^-/-/Trif^-/-小鼠对OVA致敏并随后用AIP-2或介质处理。WT与激发之前用AIP-2或介质处理的B6.MyD88^-/-/Trif^-/-小鼠之间的BALF细胞分类计数以及肺IL-5和IL-13浓度无显著不同(图13)。

为了进一步探索AIP-2的细胞靶标，我们旨在鉴定治疗所靶向的特定组织。初始小鼠每天注射AIP-2或介质，持续5天。收集多种组织并分析，显示与臂部、腘和腹股沟的淋巴结，脾脏，派伊尔氏淋巴集结，小肠上皮细胞以及固有层相对比较，肠系膜淋巴结(MLN)细胞显著扩增(图14a)。为了鉴定MLN中与AIP-2相关以介导气道疾病的抑制的细胞群，将AIP-2用AlexaFluor647标记并如上注射。虽然处理时CD11c⁺树突细胞(DC)和CD19⁺B细胞的频率均显著增加(图14b)，但CD11c⁺细胞是捕获AIP-2的主要群体(图6a、14c)。进一步的分析表明AIP-2⁺CD11c⁺细胞中的大部分共表达CD103(图6b)，并且该群体在AIP-2处理之后选择性地扩增(图6c)。虽然分析的所有DC亚群中CD80和CD86的表达无差异，但AIP-2的施用引起了MHCII表达的显著降低(图14c)，该发现与对不同的钩虫TIMP样蛋白的早前报道一致(21)。

MLNCD103⁺DC和寄生性蠕虫诱导并维持耐受性的能力均被注意到(22-24)。因此，我们检查了AIP-2处理对CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞(T_reg)群体的影响。与介质相比，处理时我们观察到了气道和肠粘膜中T_reg的两倍增加(图6d)，其中T_reg表达肠归巢受体CCR9(图6e)。为了评估T_reg在由AIP-2诱导的针对气道炎症的保护中的作用，我们使用了B6.Foxp3^DTR(DEREG)小鼠。在foxp3基因座的控制下，DEREG小鼠表达白喉毒素(DT)受体-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白，其允许选择性且有效地缺失Foxp3+T_reg(25)。使DEREG小鼠对OVA致敏，将其暴露或不暴露于DT，用AIP-2或介质处理，并用雾化的OVA或PBS激发(图6f)。虽然在未用DT处理的DEREG小鼠中观察到了针对AIP-2处理的类似应答，但T_reg的特异性缺失完全地废除了这些小鼠中针对下述的保护：嗜酸性粒细胞增多和淋巴细胞至气道的浸润(图6g)、肺中IL-5和IL-13的产生(图6h)以及OVA特异的血清IgE和IgG2a的产生(图6i)。

MLN具有这样的特性：与视黄醛脱氢酶2和CD103⁺DC相互作用时允许初始T细胞转化为T_reg，在该时刻它们获得CCR9(22，26)。为了明确说明由AIP-2产生的免疫应答的起源，手术切除(rx)MLN，并允许小鼠恢复6周(26)，在这之后用AIP-2对其进行处理(图7a)。虽然在WT和MLNrx小鼠的周边之间未观察到CD4⁺Foxp3⁺细胞频率的大的差别，但是在MLNrx小鼠的气道和肠粘膜中T_reg显著降低(图7b)。小肠固有层中表达CCR9和CTLA-4的T_reg的显著降低支持AIP-2诱导源于肠系膜的新生T_reg的证据(图7c)。为了验证肠系膜在保护免受气道炎症中的关键作用，一旦恢复阶段完成，随后使经历或未经历MLNrx的小鼠对OVA致敏，用AIP-2或介质处理，并用OVA或PBS气溶胶激发(图7d)。用AIP-2处理的MLNrx小鼠不被保护免受气道高反应性、嗜酸性粒细胞的气道浸润、IL-5和IL-13以及OVA特异的血清IgE和IgG2a的肺部产生(图7e-h)。最后，为了检查AIP-2是否改变了MLN微环境，如之前所述用AIP-2或介质处理小鼠，以及将MLN手术移出并移植进初始受体来代替宿主的肠系膜组织(图7i)。恢复之后，使小鼠对OVA致敏，并用OVA或PBS气溶胶激发。移植之后九周，接受来自AIP-2处理的供体的MLNtx的小鼠仍被保护免受气道高反应性、肺嗜酸性粒细胞增多、BALF淋巴细胞浸润以及肺部IL-5和IL-13的产生(图7j-l)。

通常经肠胃外途径施用人的生物制品，但是侵入性较低的递送系统是可取的(27)。为了确定当直接递送至粘膜时，AIP-2是否可以预防气道炎症，我们将其作为弹丸鼻内施用至肺部(图8a)，因此，其诱导了针对嗜酸性粒细胞至肺的招募和肺中Th2细胞因子产生的显著保护(图8b、c)，以及OVA特异的血清IgE和IgG2a滴度的显著减少(图8d)。而且，为了确定一旦OVA诱导的气道炎症已确立，AIP-2是否可以抑制OVA-诱导的气道炎症，在首次施用OVA气溶胶之后两天开始每天用AIP-2注射小鼠，持续4天(图8a)。在气溶胶激发期间治疗性递送AIP-2，诱导了针对嗜酸性粒细胞招募至肺和肺中Th2细胞因子产生以及OVA特异的血清IgE的显著保护(图8b-d)。

最后，为了确定AIP-2是否具有作用于人细胞的免疫调节特性，从具有临床表征的房尘螨(HDM)过敏症的人个体分离PBMC。将细胞用CFSE标记，并在AIP-2或介质存在的情况下用HDM提取物刺激，持续5天。PBMC的HDM刺激导致在AIP-2存在的情况下显著减少的特异性增殖应答(图8e)。

综上所述，AIP-2通过新的作用机制提供了针对气道变应性炎症的有效保护，该新的作用机制涉及由MLN中的CD103⁺DC引起的T_reg的激活和扩增。AIP-2诱导的T_reg可能经历胸腺外分化，并可能因此通过对肺或肠中共生微生物群体组成的直接影响来控制粘膜Th2炎症(28，29)。AIP-2的作用机制与通常通过产生IL-10的2型巨噬细胞或对记忆T细胞上的电压门控钾通道的调控来抑制炎症的其它蠕虫重组蛋白的作用机制不同(13，14，30)。我们的发现显示了AIP-2重要且持久的作用，其促进调节性应答的产生而不引起一般的免疫抑制。AIP-2似乎通过在淋巴组织上产生长期印记而重置了针对调节性T细胞应答的效应物的平衡，对于纯化的蛋白之前尚未报道该现象。我们的研究突出了蠕虫重组蛋白的治疗潜力，其是比实验性蠕虫感染更合适且更容易调控的治疗模式。该生物制剂新类型对在工业化国家已达到令人担忧的流行的宽范围的炎症性疾病具有吸引力。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明局限于任一实施方案或特征的特定集合。因此本领域技术人员将会理解，在不脱离本发明的范围的情况下，鉴于当前的公开内容，可以对例示的具体实施方案做出各种改进和改变。

将本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献通过引用并入本文。

参考文献

1.P.J.Cooper,M.E.Chico,L.C.Rodrigues,M.Ordonez,D.Strachan,G.E.Griffin,T.B.Nutman,Reducedriskofatopyamongschool-agechildreninfectedwithgeohelminthparasitesinaruralareaofthetropics.J.AllergyClin.Immunol.111,995-1000(2003).

2.A.M.Croft,P.Bager,S.Kumar,Helminththerapy(worms)forallergicrhinitis.CochraneDatabaseSyst.Rev.4,CD009238(2012).

3.L.J.Wammes,H.Mpairwe,A.M.Elliott,M.Yazdanbakhsh,Helminththerapyorelimination:epidemiological,immunological,andclinicalconsiderations.LancetInfect.Dis.(2014).

4.S.Scrivener,H.Yemaneberhan,M.Zebenigus,D.Tilahun,S.Girma,S.Ali,P.McElroy,A.Custovic,A.Woodcock,D.Pritchard,A.Venn,J.Britton,IndependenteffectsofintestinalparasiteinfectionanddomesticallergenexposureonriskofwheezeinEthiopia:anestedcase-controlstudy.Lancet358,1493-1499(2001).

5.M.J.Broadhurst,J.M.Leung,V.Kashyap,J.M.McCune,U.Mahadevan,J.H.McKerrow,P.Loke,IL-22+CD4+TcellsareassociatedwiththerapeuticTrichuristrichiurainfectioninanulcerativecolitispatient.Sci.Transl.Med.2,60ra88(2010).

6.J.Croese,J.O'Neil,J.Masson,S.Cooke,W.Melrose,D.Pritchard,R.Speare,AproofofconceptstudyestablishingNecatoramericanusinCrohn'spatientsandreservoirdonors.Gut55,136-137(2006).

7.R.W.Summers,D.E.Elliott,J.F.Urban,Jr.,R.A.Thompson,J.V.Weinstock,Trichurissuistherapyforactiveulcerativecolitis:arandomizedcontrolledtrial.Gastroenterology128,825-832(2005).

8.J.O.Fleming,Helminthsandmultiplesclerosis:willoldfriendsgiveusnewtreatmentsforMS？J.Neuroimmunol.233,3-5(2011).

9.J.R.Feary,A.J.Venn,K.Mortimer,A.P.Brown,D.Hooi,F.H.Falcone,D.I.Pritchard,J.R.Britton,Experimentalhookworminfection:arandomizedplacebo-controlledtrialinasthma.Clin.Exp.Allergy40,299-306(2010).

10.J.Croese,S.Navarro,A.Clouston,L.McCann,A.Dougall,I.Ferreira,A.Susianto,P.O’Rourke,M.Howlett,J.McCarthy,C.Engwerda,D.Jones,A.LoukasA,Experimentalhookworminfectionandglutenmicro-challengepromotestoleranceinceliacdisease.J.AllergyClin.Immunol.inpress,(2014).

11.D.E.Elliott,J.V.Weinstock,Helminth-hostimmunologicalinteractions:preventionandcontrolofimmune-mediateddiseases.Ann.N.Y.Acad.Sci.1247,83-96(2012).

12.P.Adisakwattana,S.P.Saunders,H.J.Nel,P.G.Fallon,Helminth-derivedimmunomodulatorymolecules.Adv.Exp.Med.Biol.666,95-107(2009).

13.C.Schnoeller,S.Rausch,S.Pillai,A.Avagyan,B.M.Wittig,C.Loddenkemper,A.Hamann,E.Hamelmann,R.Lucius,S.Hartmann,AhelminthimmunomodulatorreducesallergicandinflammatoryresponsesbyinductionofIL-10-producingmacrophages.J.Immunol.180,4265-4272(2008).

14.S.Chhabra,S.C.Chang,H.M.Nguyen,R.Huq,M.R.Tanner,L.M.Londono,R.Estrada,V.Dhawan,S.Chauhan,S.K.Upadhyay,M.Gindin,P.J.Hotez,J.G.Valenzuela,B.Mohanty,J.D.Swarbrick,H.Wulff,S.P.Iadonato,G.A.Gutman,C.Beeton,M.W.Pennington,R.S.Norton,K.G.Chandy,Kv1.3channel-blockingimmunomodulatorypeptidesfromparasiticworms:implicationsforautoimmunediseases.FASEBJ.(2014).

15.N.E.Ruyssers,B.Y.DeWinter,J.G.DeMan,A.Loukas,M.S.Pearson,J.V.Weinstock,R.M.VandenBossche,W.Martinet,P.A.Pelckmans,T.G.Moreels,TherapeuticpotentialofhelminthsolubleproteinsinTNBS-inducedcolitisinmice.Inflamm.BowelDis.15,491-500(2009).

16.I.Ferreira,D.Smyth,S.Gaze,A.Aziz,P.Giacomin,N.Ruyssers,D.Artis,T.Laha,S.Navarro,A.Loukas,H.J.McSorley,Hookwormexcretory/secretoryproductsinduceinterleukin-4(IL-4)+IL-10+CD4+Tcellresponsesandsuppresspathologyinamousemodelofcolitis.Infect.Immun.81,2104-2111(2013).

17.J.Mulvenna,B.Hamilton,S.H.Nagaraj,D.Smyth,A.Loukas,J.J.Gorman,Proteomicsanalysisoftheexcretory/secretorycomponentoftheblood-feedingstageofthehookworm,Ancylostomacaninum.Mol.Cell.Proteomics8,109-121(2009).

18.B.Zhan,R.Gupta,S.P.Wong,S.Bier,D.Jiang,G.Goud,P.Hotez,MolecularcloningandcharacterizationofAc-TMP-2,atissueinhibitorofmetalloproteinasesecretedbyadultAncylostomacaninum.Mol.Biochem.Parasitol.162,142-148(2008).

19.B.Zhan,M.Badamchian,B.Meihua,J.Ashcom,J.Feng,J.Hawdon,X.Shuhua,P.J.Hotez,MolecularcloningandpurificationofAc-TMP,adevelopmentallyregulatedputativetissueinhibitorofmetalloproteasereleasedinrelativeabundancebyadultAncylostomahookworms.Am.J.Trop.Med.Hyg.66,238-244(2002).

20.C.Cantacessi,A.Hofmann,D.Pickering,S.Navarro,M.Mitreva,A.Loukas,TIMPsofparasitichelminths-alarge-scaleanalysisofhigh-throughputsequencedatasets.Parasit.Vectors6,156(2013).

21.C.Cuellar,W.Wu,S.Mendez,Thehookwormtissueinhibitorofmetalloproteases(Ac-TMP-1)modifiesdendriticcellfunctionandinducesgenerationofCD4andCD8suppressorTcells.PLoSNegl.Trop.Dis.3,e439(2009).

22.J.L.Coombes,K.R.Siddiqui,C.V.Arancibia-Carcamo,J.Hall,C.M.Sun,Y.Belkaid,F.Powrie,AfunctionallyspecializedpopulationofmucosalCD103+DCsinducesFoxp3+regulatoryTcellsviaaTGF-betaandretinoicacid-dependentmechanism.J.Exp.Med.204,1757-1764(2007).

23.U.G.Strauch,N.Grunwald,F.Obermeier,S.Gurster,H.C.Rath,LossofCD103+intestinaldendriticcellsduringcolonicinflammation.WorldJ.Gastroenterol.16,21-29(2010).

24.J.E.Allen,R.M.Maizels,Diversityanddialogueinimmunitytohelminths.Nat.Rev.Immunol.11,375-388(2011).

25.K.Lahl,C.Loddenkemper,C.Drouin,J.Freyer,J.Arnason,G.Eberl,A.Hamann,H.Wagner,J.Huehn,T.Sparwasser,SelectivedepletionofFoxp3+regulatoryTcellsinducesascurfy-likedisease.J.Exp.Med.204,57-63(2007).

26.M.Ahrendt,S.I.Hammerschmidt,O.Pabst,R.Pabst,U.Bode,Stromalcellsconferlymphnode-specificpropertiesbyshapingauniquemicroenvironmentinfluencinglocalimmuneresponses.J.Immunol.181,1898-1907(2008).

27.N.Skalko-Basnet,Biologics:theroleofdeliverysystemsinimprovedtherapy.Biol.TargetsTher.8,107-114(2014).

28.S.Z.Josefowicz,R.E.Niec,H.Y.Kim,P.Treuting,T.Chinen,Y.Zheng,D.T.Umetsu,A.Y.Rudensky,ExtrathymicallygeneratedregulatoryTcellscontrolmucosalTH2inflammation.Nature482,395-399(2012).

29.E.S.Gollwitzer,S.Saglani,A.Trompette,K.Yadava,R.Sherburn,K.D.McCoy,L.P.Nicod,C.M.Lloyd,B.J.Marsland,LungmicrobiotapromotestolerancetoallergensinneonatesviaPD-L1.Nat.Med.20,642-647(2014).

30.M.W.Robinson,R.Alvarado,J.To,A.T.Hutchinson,S.N.Dowdell,M.Lund,L.Turnbull,C.B.Whitchurch,B.A.O'Brien,J.P.Dalton,S.Donnelly,Ahelminthcathelicidin-likeproteinsuppressesantigenprocessingandpresentationinmacrophagesviainhibitionoflysosomalvATPase.FASEBJ.26,4614-4627(2012).

31.N.Ranjit,B.Zhan,D.J.Stenzel,J.Mulvenna,R.Fujiwara,P.J.Hotez,A.Loukas,AfamilyofcathepsinBcysteineproteasesexpressedinthegutofthehumanhookworm,Necatoramericanus.Mol.Biochem.Parasitol.160,90-99(2008).

32.S.Navarro,G.Cossalter,C.Chiavaroli,A.Kanda,S.Fleury,A.Lazzari,J.Cazareth,T.Sparwasser,D.Dombrowicz,N.Glaichenhaus,V.Julia,TheoraladministrationofbacterialextractspreventsasthmaviatherecruitmentofregulatoryTcellstotheairways.MucosalImmunol.4,53-65(2011).

33.B.Weigmann,I.Tubbe,D.Seidel,A.Nicolaev,C.Becker,M.F.Neurath,Isolationandsubsequentanalysisofmurinelaminapropriamononuclearcellsfromcolonictissue.Nat.Protocols2,2307-2311(2007).

Claims

1.修饰的Ac-TMP-2蛋白或者其片段、变体或衍生物，所述修饰的Ac-TMP-2蛋白缺少通常存在于全长或野生型Ac-TMP-2蛋白中的一个或多个N端和/或C端氨基酸。

2.如权利要求1所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白，其片段、变体或衍生物，所述修饰的Ac-TMP-2蛋白还缺少通常存在于全长或野生型Ac-TMP-2蛋白中的多个C端氨基酸，其中所述多个C端氨基酸包括一个或多个酸性氨基酸。

3.如权利要求1或权利要求2所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白，其片段、变体或衍生物，所述修饰的Ac-TMP-2蛋白在所述N端或邻近所述N端包含氨基酸序列C-X-C。

4.如权利要求1、2或3所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白，其片段、变体或衍生物，所述修饰的Ac-TMP-2蛋白包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5中所示的氨基酸序列或与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5中所示的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。

5.如任一前述权利要求所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白，当向个体施用时，其能够预防、减轻和/或缓解炎症。

6.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-5中任一项所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白或者其片段、变体或衍生物以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其还包含至少一种其它药剂。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述至少一种其它药剂选自：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂、抗生素及其组合。

9.用于减轻或缓解个体中的炎症的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的权利要求1-5中任一项所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白，或权利要求6所述的药物组合物，从而减轻或缓解所述炎症。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述炎症与所述个体中的疾病、病症和/或病况相关或者继发于所述个体中的疾病、病症和/或病况。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病、病症和/或病况对基础疗法是难治的。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述基础疗法包括施用选自以下的至少一种基础药剂：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂、抗生素及其组合。

13.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，至少在最初，施用所述修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物，辅以所述基础疗法。

14.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，至少在最初，施用所述修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物，辅以至少一种基础药剂，所述至少一种基础药剂以少于全剂量施用。

15.用于预防个体中的炎症的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的权利要求1-5中任一项所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物，或者权利要求6所述的药物组合物，从而预防所述炎症。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述炎症与所述个体中的疾病、病症和/或病况相关或者继发于所述个体中的疾病、病症和/或病况。

17.如权利要求10-14中任一项或权利要求16所述的方法，其中所述疾病、病症和/或病况为免疫学疾病、病症和/或病况。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述免疫学疾病、病症和/或病况选自：爱迪生氏病、强直性脊柱炎、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性脊髓炎(CRMO)、克罗恩病、脱髓鞘性神经病、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫氏病、古兰-巴雷综合征、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、胰岛素依赖型糖尿病(1型)、幼年型关节炎、川崎综合征、多发性硬化、重症肌无力、心肌梗死后综合征、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、特发性肺纤维化、赖特综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、血小板减少性紫癜(TTP)、溃疡性结肠炎、血管炎、白癜风以及韦格纳肉芽肿。

19.如权利要求10-14中任一项或权利要求16所述的方法，其中所述疾病为消化道疾病。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述疾病为慢性胃炎或炎症性肠病。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述炎症性肠病为克罗恩病或溃疡性结肠炎。

22.如权利要求10-14中任一项或权利要求16所述的方法，其中所述疾病为呼吸系统疾病。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病选自：哮喘、肺气肿、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。

24.用于预防和/或治疗个体中的炎症性肠病的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的权利要求1-5中任一项所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物，或者权利要求6所述的药物组合物，从而预防和/或治疗所述炎症性肠病。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述炎症性肠病为克罗恩病或溃疡性结肠炎。

26.用于预防和/或治疗个体中的呼吸系统疾病的方法，所述方法包括以下的步骤：向所述个体施用治疗有效量的权利要求1-5中任一项所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物，或者权利要求6所述的药物组合物，从而预防和/或治疗所述呼吸系统疾病。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述呼吸系统疾病选自：哮喘、肺气肿、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。

28.如权利要求9-27中任一项所述的方法，其还包括向所述个体施用至少一种其它药剂的步骤。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述至少一种其它药剂选自：非类固醇抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗细胞因子/细胞因子受体剂、抗生素及其组合。

30.如权利要求9-29中任一项所述的方法，其中所述个体为哺乳动物。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物为人。

32.分离的核酸，其编码权利要求1-5中任一项所述的修饰的Ac-TMP-2蛋白或其片段、变体或衍生物。

33.遗传构建体，其包含权利要求32所述的分离的核酸。

34.宿主细胞，其包含权利要求33所述的遗传构建体。