JP2012090647A - イヌの胸腺間質リンホポエチンタンパク質およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、イヌTSLPタンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸を開示する。また、イヌTSLPタンパク質の特異的なエピトープを含むタンパク質のペプチド断片を開示する。イヌTSLPタンパク質および関連のペプチド断片は、免疫学的アッセイおよび抗TSLP抗体を誘発するワクチンに対する抗原として使用し得る。さらに、本発明は、イヌTSLP遺伝子、イヌTSLPタンパク質および関連のペプチド断片を作製および使用する方法を開示する。
【選択図】なし
Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2006年12月14日に出願された、米国仮出願第60/875,135号(この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される)の優先権を主張する本出願である。
本発明は、イヌの胸腺間質リンホポエチン(lymphopoietin)タンパク質(イヌ“TSLP”)、イヌTSLPをコードする核酸分子、ベクターおよび宿主細胞、ならびにイヌTSLPを作製および使用する方法に関する。
アトピー性疾患などのレアギン介在障害を患う動物(例えば、ヒト)は、IgE抗体に関わる即時型アレルギー反応を発症する遺伝的傾向を有する。複数の遺伝因子が、そのような動物で見られる、結果として生じる表現型の発現に関与する。アトピー性疾患において観察される即時型過敏症は、チリダニ類(Dermatophagoides pteronyssinus)、花粉、カビおよび鱗屑などの特定のアレルゲンへの曝露から生じる。当然のことながら、アトピー性疾患を有する個体は、喘息、アトピー性皮膚炎、および内因性のIgE放出に関連した他の障害をより患う可能性がある。
(項目1)
胸腺間質リンホポエチンタンパク質(TSLP)またはその抗原性断片であって、該TSLPタンパク質が28アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号2のアミノ酸配列に80%以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、該TSLPタンパク質が配列番号2のアミノ酸を含むイヌTSLPに対して惹起された抗体と交差反応性である、胸腺間質リンホポエチンタンパク質またはその抗原性断片。
(項目2)
前記TSLPがエピトープ特異的イヌTSLP抗体と結合する、項目1に記載のTSLP。
(項目3)
イヌTSLPである、項目1に記載のTSLP。
(項目4)
配列番号2のアミノ酸残基29〜155を含む、項目3に記載のイヌTSLPタンパク質。
(項目5)
前記断片が配列番号8〜101またはその2つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目4に記載のイヌTSLPタンパク質の抗原性断片。
(項目6)
配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34またはその2つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目5に記載の抗原性断片。
(項目7)
前記抗原性断片が
(項目8)
薬学的に許容されるアジュバント、ならびに有効量の、項目1に記載のTSLPタンパク質、該TSLPタンパク質の抗原性断片およびその組合せから成る群から選択される免疫原を含むワクチン。
(項目9)
前記TSLPタンパク質の抗原性断片が配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34またはその組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目8に記載のワクチン。
(項目10)
項目1に記載のTSLPタンパク質をコードする核酸分子。
(項目11)
項目4に記載のTSLPタンパク質をコードする、またはその抗原性断片をコードする核酸分子。
(項目12)
配列番号1のヌクレオチド配列を含む、項目11に記載の核酸分子。
(項目13)
項目11に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
(項目14)
項目13に記載の発現ベクターを含むワクチン。
(項目15)
適切な培地で宿主細胞を培養することを含む、TSLPタンパク質を生成する方法であって、該宿主細胞が項目13に記載の発現ベクターを含み、該TSLPタンパク質が発現される、方法。
(項目16)
培養した前記宿主細胞または前記培地から前記TSLPタンパク質を単離することを更に含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
項目8に記載のワクチンの有効量で哺乳動物を免疫化することを含む、該哺乳動物において抗TSLP抗体を誘発する方法。
(項目18)
項目8に記載のワクチンの有効量でイヌを免疫化することを含む、該イヌにおけるTSLP活性を下方制御する方法。
(項目19)
項目8に記載のワクチンの有効量でイヌを免疫化することを含む、アトピーのイヌにおけるアレルギー症状を治療または予防する方法。
(項目20)
前記アレルギー症状がアレルギー性皮膚炎または喘息を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
項目8に記載のワクチンによって哺乳動物において、または哺乳動物のハイブリドーマ系において誘発される抗イヌTSLP抗体。
(項目22)
項目21に記載の抗イヌTSLP抗体の有効量を投与することを含む、アトピーのイヌにおけるアレルギー症状を治療する方法。
(項目23)
非TSLP免疫原の有効量を更に含む、項目8に記載のワクチン。
(項目24)
非TSLP免疫原の有効量を更に含む、項目9に記載のワクチン。
(項目25)
イヌから表皮試料を得ることと、該表皮試料において項目4に記載のイヌTSLPタンパク質の存在を測定することとを含む、該イヌにおけるアトピー性皮膚炎を診断する方法。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図および詳細な説明を参考とすることによって、より良く理解されるであろう。
本発明は、さらに、本発明のTSLPタンパク質、1つ以上のその抗原性断片、または全長タンパク質と1つ以上のそのような断片の組合せの有効量を含むワクチンを提供する。例えば、下記の表2に列挙したようなイヌTSLPタンパク質および/またはその断片を、タンパク質またはペプチド適合性のワクチン組成物中に取り込ませることができる。そのようなワクチン組成物は、当該技術分野において周知であり、例えば、生理的適合性の緩衝液および生理食塩水など、ならびにCARBOPOL(登録商標)またはEmulsigen(登録商標)などの薬学的に許容されるアジュバントを含み得るが、必ずしも含む必要はない。
また本発明は、本発明のイヌTSLPタンパク質と特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル(mAb)抗体を含む。本明細書で使用する、“抗体”という用語は、免疫グロブリンおよび/またはその断片を意味する。自然発生の免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドから成る。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。また、本発明による1つ以上の抗体は、抗体断片、すなわち、抗原結合フラグメント(例えば、Fv、FabおよびF(ab’)2)、改変一本鎖結合タンパク質(例えば、Hustonら、Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879−5883(1988)およびBirdら、Science,242,423−426(1988)、参考として本明細書で援用される)、および二機能性ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchiaら、Eur.J.Immunol.17,105(1987))を含有する。一般的に、Hoodら、Immunology,Benjamin,N.Y.,2nd ed.(1984)、Harlow and Lane,Antibodies.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)およびHunkapiller and Hood,Nature,323,15−16(1986)(これらすべてを参考として本明細書で援用される)を参照。
A.最初の試み
イヌTSLPを同定するための最初の試みは、BLAT(公共ゲノムデータベースUniversity of California,Santa Cruz)から組み立てられたラット、チンパンジーおよびアカゲザルTSLP cDNA配列によるクローン化ヒトおよびマウスTSLP cDNA配列の配列アラインメントに基づいていた。チンパンジーTSLPは、アミノ酸レベルでヒトTSLPと100%同一であるが、アカゲザルTSLPでは、成熟タンパク質においてヒトTSLPと90%以上(12/151の残基が異なる)の相同性を有する。しかし、ヒトおよびヒト以外の霊長類のTSLPタンパク質およびcDNA配列は、ネズミTSLP配列と非常に異なる。ヒトおよびマウスTSLP cDNA配列は、相同性がわずかに43%であるので、これらの種間における低いストリンジェンシーの異種間ハイブリッド形成によるクローン化はできない。さらに、ラットTSLP配列は、マウスTSLPと比較して、成熟タンパク質のアミノ酸残基配列に39/121の変化を示し、このことは、近縁種のネズミ種間でさえ、TSLP配列が著しく異なっていることを示している。
次に、利用可能な、ヒトTSLP配列を用いて組み立てられたイヌゲノムデータベース(全体のゲノムショットガン配列決定に由来する。University of California,Santa Cruzによって一般的に公開されている)により、イヌTSLPのエキソン1および4の部分的な同定に至った。簡単に述べると、重要な配列相同性のいくつかのヒットが、この最初の検索で同定された(下記の“ヒット”1〜6を参照)。これらの配列は、集められ、イヌTSLP遺伝子の部分的な電子配列を拡張および組み立てるための検索配列(query)として使用した。
また本発明は、28アミノ酸残基のシグナル配列を除き、配列番号2のアミノ酸配列に80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むTSLPタンパク質であって、これらをワクチンとしてイヌに投与すると、配列番号2のアミノ酸配列を含有するイヌTSLPタンパク質を結合する抗体を産生する、TSLPタンパク質を提供する。また、そのようなTSLPタンパク質の抗原性断片も提供する。
抗体は、自然発生の形態、および組換えの形態における、種、多型または対立遺伝子変異体、およびその断片を含むイヌTSLPタンパク質の様々なエピトープに対して産生し得る。さらに、抗体は、自然のまたは変性された異変体を含む、活性化形態または不活性化形態のいずれかにおける、イヌTSLPに対して産生し得る。抗イディオタイプ抗体も、企図される。
イヌTSLPを産生する細胞内でのイヌTSLPをコードするRNAとの干渉は、TSLPの生物活性を阻害し、その結果として、アトピー性皮膚炎などの多くのTSLP関連の障害を治療する更なる手法である。このために、化学的に合成されるか、または適切な送達ベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター)内でクローン化される二重鎖RNA分子を、TSLPをコードする内因性mRNA濃度を減少させる目的で、能動的にTSLP mRNAを産生する細胞内に導入することができる。これらRNA分子の挿入後(所望の細胞へのプラスミドまたはウイルスベクターの挿入後の、外部から送達された分子またはRNAの転写の場合)、これらは、短いヌクレオチド断片(siRNAと呼ばれる)へのリボヌクレアーゼIII型タンパク質の開裂活性を通して処理される。次に、これらsiRNA断片は、RNAヘリカーゼの活性化によるsiRNA二重鎖の巻き戻しの結果として活性化されるRISC(RNA−Induced Silencing Complex)と呼ばれるヌクレアーゼ含有多タンパク質複合体に組み込まれる。ここで、一本鎖siRNA鎖が、RISC複合体をその標的のmRNAへ導いたあと、RISCのエンドヌクレアーゼの活性によって切断され、続いて分解される。
イヌTSLP DNAおよびタンパク質配列
イヌTSLPを発現するイヌ遺伝子を、電子データベースでのデータマイニングおよび上記で詳述したような分子生物学方法を使用した反復的なプロセスによって同定した。
イヌのTSLP遺伝子配列を、図8A(配列番号1)に図示し、TSLPタンパク質を発現する予測タンパク質を、図8B(配列番号2)に図示する。星印によって示される図8Bの残基1〜28(配列番号2)は、シグナル配列を表し、残基29〜155は、成熟タンパク質を表す。
イヌTSLPのクローニングおよび発現
イヌTSLPをコードするDNAを、本明細書に記載のように同定し、ドナーベクターの当該技術分野標準法pDONR221(Invitrogen Gateway System)にクローン化した。遺伝子の組み立ておよびドナーベクターへのクローニングを、DNA2.0と呼ばれる受託臨床試験実施機関で実施し、この結果、同定したゲノムイヌTSLP遺伝子を含有するpDONR221.G03276と呼ばれるプラスミドを構築した。成熟した(すなわち、シグナル配列なしで)イヌTSLPタンパク質をコードするDNAを、それぞれNco IおよびEcoR V部位を含有する2種のプライマーを使用してpDONR221.G03276からPCRで増幅した。
宿主細胞からのイヌTSLPの生成
大腸菌で組換えTSLPタンパク質を発現させるために、cTSLPをコードするヌクレオチド配列(すなわち、シグナル配列をコードするTSLPを欠いているヌクレオチド)を、それぞれNco IおよびHind III部位を含有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーと共に、テンプレートとしてプラスミド1265−66Cを使用して、PCRによって増幅した。
イヌTSLPの免疫蛍光検出
イヌの皮膚および扁桃組織におけるイヌTSLPタンパク質の発現を、ヒトTSLPタンパク質に対して産生されるウサギポリクローナル抗体を使用して、免疫組織化学検査(「IHC」)によって測定した。免疫組織化学検査は、生理食塩水を注射した正常なイヌの皮膚、および様々な皮膚疾患(アトピー性皮膚炎、皮膚エリテマトーデス、多形性紅斑および接合部型表皮水疱症など)と診断されたイヌの皮膚から得られたパラフィン包埋組織に対して実施した。さらに、TSLPタンパク質の発現を、2匹のイヌから得られた凍結扁桃組織において測定した。IHCによりTSLP発現を測定する手順は以下の通りである。
1.皮膚試料を埋め込まれたパラフィンブロックを、5〜7ミクロンの厚さに切断し、接着を促進するためにポリ−L−リジンで処理したスライドにのせた。
1.切片を、抗体の非特異的結合を減少させるために、リン酸緩衝液(PBS)に希釈した10%通常のロバ血清中で1時間インキュベートした。
イヌTSLPの免疫ペルオキシダーゼ検出
また、アトピー性皮膚炎と診断されたイヌの皮膚から調製されたパラフィン包埋組織ブロックにおけるイヌTSLPタンパク質の発現を、検出法として免疫組織化学検査を使用した免疫ペルオキシダーゼ染色によって測定した。この方法においては、ヒトTSLPタンパク質に対して惹起されたエピトープ特異的ラットモノクローナル抗体を、一次抗体として使用した。免疫ペルオキシダーゼ染色によってTSLP発現を測定するための手順は、以下の通りであった。
通常の新生子ウシ血清:#N−4762 Sigma
パラフィン包埋皮膚組織
一次抗体:ラット抗ヒトTSLP mAbラットIgG2a
二次抗体:ラビット抗ラットIgG(ビオチン化):BA−4000 Vector Lab、米国カリフォルニア州バーリンゲーム
検出試薬:ストレプトアビジン−HRP:#43−8323 Zymed Labs、米国カリフォルニア州サンフランシスコ
AEC基質キット:Biogenex #HK129−5K、米国カリフォルニア州サンラモン
1.切片試料4〜6um。
2.空気乾燥10分、室温。
3.アセトン中で10分固定。
4.PBS(0.01リン酸緩衝生理食塩水)中で3分すすぐ。
5.0.1%アジ化ナトリウムを含む0.3%過酸化水素中での7〜10分間のインキュベーションによってクエンチする。
6.PBS中で5分すすぐ。
7.湿室において切片を1%通常の新生子ウシ血清で20分ブロックする。
8.スライドを排水し、室温で、1:100の希釈で一次抗体を2時間加える。
9.5分すすぐ。
10.湿室において室温で二次抗体(ラビット抗ラットIgG@1:400)を30分加える。
11.5分すすぐ。
12.排水し、室温で検出試薬(ストレプトアビジン−HRP@1:400)を30分間加える。
13.2×5分すすぐ。
14.AECを2.5分加える。所望の染色強度およびバックグラウンドに従って調整する。
15.ヘマトキシリンで対比染色し、マウントする。
イヌTSLPのエピトープマッピング
TSLP活性を中和することができるワクチンへの包含に有用であるイヌTSLP上のエピトープを同定するために、イヌTSLPタンパク質配列に基づいた重複ペプチドのセットを合成し、中和する抗ヒトTSLPモノクローナル抗体と反応するこれらの能力について試験した。この目的のために、それぞれが15アミノ酸長で、2アミノ酸ずつずれた重複ペプチドを、MIMOTOPES(米国ミネソタ州ミネアポリス)においてピン上に合成した。これらペプチドの配列を表2に列挙する。ペプチド1〜57を、構成NH2−PEPTIDE−PINで、アミド化された末端で合成した。ペプチド58〜94(親ペプチド1〜37の複製)を、構成ACETYL−PEPTIDE−PINで、アセチル化された末端で作製した。
Claims (20)
- 胸腺間質リンホポエチンタンパク質(TSLP)またはその抗原性断片を含む融合タンパク質であって、該TSLPが28アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号2のアミノ酸配列に90%以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、該TSLPが配列番号2のアミノ酸を含むイヌTSLPに対して惹起された抗体と交差反応性である、融合タンパク質。
- 前記TSLPがエピトープ特異的イヌTSLP抗体と結合する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記TSLPがイヌTSLPである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記イヌTSLPが配列番号2のアミノ酸残基29〜155を含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
- イヌTSLPの抗原性断片を含む融合タンパク質であって、該抗原性断片が配列番号64のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
- 前記抗原性断片が配列番号8〜63および65〜101またはその2つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を更に含み、そして、該抗原性断片がエピトープ特異的イヌTSLP抗体に結合する、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 胸腺間質リンホポエチンタンパク質(TSLP)またはその抗原性断片を含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該TSLPが28アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号2のアミノ酸配列に90%以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、該TSLPが配列番号2のアミノ酸を含むイヌTSLPに対して惹起された抗体と交差反応性である、核酸分子。
- 請求項7に記載の核酸分子であって、前記TSLPがイヌTSLPであり、該イヌTSLPが配列番号2のアミノ酸残基29〜155を含む、核酸分子。
- 配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の核酸分子。
- 請求項7に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項8に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項9に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- イヌTSLPの抗原性断片を含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該抗原性断片が配列番号64のアミノ酸配列を含む、核酸分子。
- 前記抗原性断片が配列番号8〜63および65〜101またはその2つ以上の組合せから成る群から選択されるアミノ酸配列を更に含み、そして、該抗原性断片がエピトープ特異的イヌTSLP抗体に結合する、請求項13に記載の核酸分子。
- 請求項13に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項14に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 適切な培地で宿主細胞を培養することを含む、融合タンパク質を生成する方法であって、該宿主細胞が請求項11に記載の発現ベクターを含み、該融合タンパク質が発現される、方法。
- 培養した前記宿主細胞または前記培地から前記融合タンパク質を単離することを更に含む、請求項17に記載の方法。
- 融合タンパク質を含む組成物を用いて得られる、哺乳動物において、または哺乳動物のハイブリドーマ系において誘発される抗イヌ胸腺間質リンホポエチンタンパク質(TSLP)抗体であって、ここで、該融合タンパク質が、胸腺間質リンホポエチンタンパク質(TSLP)またはその抗原性断片を含み、該TSLPが28アミノ酸残基のシグナル配列を除く配列番号2のアミノ酸配列に90%以上同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗体がモノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体がイヌ化されている、抗イヌTSLP抗体。
- 請求項19に記載の抗イヌTSLP抗体の有効量を投与することを含む、アトピーのイヌにおけるアレルギー症状を治療する方法。
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