KR101525631B1 - 개 흉선 간질 림포포이에틴 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개 TSLP 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 기재하고 있다. 개 TSLP 단백질의 특이적 에피토프를 포함하는 단백질의 펩타이드 단편이 또한 기재되어 있다. 개 TSLP 단백질 및 관련된 펩타이드 단편은 면역학적 검정, 및 항-TSLP 항체를 유도하는 백신을 위한 항원으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 추가로, 개 TSLP 유전자, 개 TSLP 단백질, 및 관련된 펩타이드 단편을 제조하는 방법 및 사용하는 방법을 기재하고 있다.

개 TSLP 단백질, 암호화 핵산, 에피토프, 펩타이드 단편, 림포포이에틴

Description

개 흉선 간질 림포포이에틴 단백질 및 이의 용도{Canine thymic stromal lymphopoietin protein and uses thereof}

관련 출원에 대한 전후 참조

본 발명은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2006년 12월 14일 자로 출원된 미국 가특허원 제60/875,135호의 우선권을 청구하는 비-가특허원이며, 이의 내용은, 전문이 참고로 본원에 인용되어 있다.

발명의 분야

본 발명은 개 흉선 간질 림포포이에틴 단백질(canine thymic stromal lymphopoietin protein; 개 "TSLP"), 핵산 분자, 개 TSLP를 암호화하는 벡터(vector) 및 숙주 세포, 및 개 TSLP를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

아토피성 질환과 같은 즉시과민항체-매개된 장애로 고생하는 사람을 포함하는 동물은 IgE 항체를 포함하는 즉시형 알레르기 반응을 발현하는 유전적 경향을 갖는다. 다양한 유전 인자가 이러한 동물에서 보여지는 것으로 나타나는 표현형의 발현에 기여한다. 아토피성 질환에서 관찰되는 즉시형 과민성은 집 먼지 진드기[더마토파고이데스 피테로니스사이너스(Dermatophagoides pteronyssinus)], 꽃가루, 곰팡이, 및 비듬과 같은 특이적 알레르기항원에 대한 노출로부터 발생한다. 당연하게도, 아토피성 질환을 갖는 개개인들은 천식, 아토피성 피부염, 및 내부 IgE 방출과 관련된 다른 장애로 더욱 고생하기 쉽다.

알레르기성 피부염, 천식 등과 같은 아토피성 질환은 또한, 애완용 개를 포함하는 개 종에서 발생한다. 이러한 개들은 일반적으로 한 살 내지 세 살 사이에서 아토피의 징후를 보이기 시작한다. 잡종 품종을 포함하는 기타 종류의 개들이 또한, 이 상태로부터 고생하는 것으로 알려져 있지만, 질환의 유전적 특성으로 인하여, 골든 리트리버, 대다수의 테리어, 아이리시 세터(Irish setter), 라사 압소(Lhasa apsos), 달마시안, 불독 및 올드 잉글리시 쉽독(Old English sheep dog)을 포함하는 몇몇의 품종은 아토피로 고생하는 경향이 더 크다. 아토피, 아토피성 피부염의 하나 이상의 특정 유형의 빈도는 사람 및 개 둘 다에서 비슷하게 상당히 증가하고 있다.

아토피를 앓는 개들은 발, 사타구니, 귀, 겨드랑이 또는 사타구니 부분에서 대개 문지르고, 핥고, 씹고, 물거나 또는 긁어서, 탈모, 발적, 및 피부의 비후를 야기할 것이다. 몇몇 경우에는, 단지 하나의 알레르기로 이러한 가려움을 야기하지 않는 경우, 몇몇의 피부 상태가 합쳐져서 동물에게 가려움을 유발한다. 이러한 악화되는 문제점들은 공기 매개-알레르기항원(꽃가루 등), 음식 중의 알레르기항원, 및 기생충으로부터의 알레르기항원(벼룩 등)으로 인해 발생할 수 있다. 피부의 박테리아 및/또는 효모 감염은 또한, 가려움 감각을 증가시킬 수 있다.

아토피의 성가신 증상을 완화하는 하나의 간단한 수단은 자극 알레르기항원(들)을 회피하는 것이다. 불행하게도, 이러한 회피는 일반적으로 비현실적이다. 지금까지는, 수의사들은 경구 항히스타민제, 경구 또는 국소 코르티코스테로이드 소염제, 다른 면역 시스템 억제제, 예를 들면, 사이클로스포린 또는 타크롤리무스, 지방산 보충제, 및 알레르기항원 특이적 면역요법(동정된 항원의 주입이 필요함)을 투여함으로써 개 아토피성 피부염을 치료해왔다. 그러나, 이러한 치료법 중의 어느 것도 모든 경우에서 작용하지는 않는다. 또한, 이러한 치료법들은 고가이고/이거나 상당한 부작용을 야기시킨다. 따라서, 개 아토피성 피부염의 증상을 치료하거나 또는 억제하는 더 안전하고, 보다 효과적이며 보다 경제적인 접근법에 대한 지속적인 필요성이 존재한다.

포유류 면역 반응은 "면역 네트워크(immune network)"로 불리우는 일련의 복잡한 세포성 상호작용을 기본으로 한다. 많은 면역 반응은, 림프구, 매크로파아지(macrophage), 과립구 및 기타 세포의 네트워크-유사 상호작용 주위에서, 이들 세포성 상호작용을 매개/제어/조절하는데 결정적인 역할을 하는 사이토킨이라 불리는 가용성 단백질과 관련되어 있다. 따라서, 사이토킨 및 면역 세포는 다양한 면역 장애를 일으키는 특이적 생리학적 메카니즘 또는 경로를 조정하는 역할을 한다.

알레르기성 염증은 T 세포가 IL-4, IL-5, 및 IL-13과 같은 잘못조절된 TH2-기원한 사이토킨을 생산하도록 하는 복합체 면역학적 연쇄반응의 결과이다. 이러한 사이토킨은 기관지 과다항진, IgE 생산, 호산구, 및 점액 생산을 교대로 일으킨다[참조: 예를 들어, Busse and Lemanske, Jr. (2001) N. Engl. J. Med. 344:350-62; Holgate (2000) Br. Med. J. 320:231-234); 및 Renauld (2001) J. Clin. Pathol. 54:577-589)].

흉선 간질 림포포이에틴 단백질(TSLP)는 (i) 표면 IgM⁺ B 세포의 시험관내 발현, 및 (ii) B 및 T 세포 증식을 지지하는 인자로서 마우스에서 초기에 동정되었던 IL-7-유사 사이토킨이다(참조: Friend et al., 1994 Exp Hematology 22:321-328, see also, Levin et al., 1999, J. Immunol 162: 677-683). TSLP는 현재 IL-7R-알파 아단위 및 TSLP-R로 불리는 유일한 수용체 아단위를 포함하는 세포 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 상호작용은 골수 혈통 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 수지상세포와 같은 조혈 세포에서 STAT 활성 또는 흉선 및 활성-조절된 케모카인(TARC) 발현을 통해 시그날 전달(signal transduction)을 유발한다. (참조: 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 공동소유된 미국 특허 제6,890,734호).

또한, TLSP는 아토피성 피부염 및 천식과 같은 알레르기성 질환의 발병기전에서 마우스에서 상당한 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, TSLP 유전자의 발현이 피부에서 특이적으로 유도되는 유전자삽입 마우스는 염증성 피부 세포 침윤, 피부 귀소수용체를 발현하는 Th₂ CD4⁺ T 세포 내에서의 현격한 증가, 및 IgE의 상승된 혈청 수준을 함유하는 습진성 병변과 같은 아토피성 피부염의 면역학적 및 임상적 특징을 보여준다. 또한, 폐-특이적 TSLP 트랜스유전자를 발현하는 마우스의 폐는 백혈구의 중증 침윤, 배상세포 증식, 상피밑 섬유증, T 헬퍼형(helper type) 2 사이토킨에서의 증가, 및 IgE의 증가된 수준을 포함하는 천식의 면역학적 및 임상적 특징을 보여준다.

심(Sim) 등은 발현 클로닝(cloning)을 사용하는 쥐 TSLP의 cDNA 서열을 수득하였지만, 쥐 TSLP를 기본으로 하는 하이브리드화 프로브(hybridization probe)로 사람 동족을 클로닝할 수 없었다(참조: Sims et al. 2000, J exp Med, 192:671-680). 결과적으로, 사람 동족체는 상세한 EST 분석을 통해 동정되었다. 사람 TSLP 뉴클레오타이드 서열은 상응하는 마우스 서열과 단지 43%의 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

이에 따라, 아토피성 피부염 및 이의 관련된 임상적 징후를 포함하는, 개에서의 아토피성 질환을 위한 새롭고 보다 실용적인 치료 방법을 제공할 필요성이 남아 있다. 또한, 이러한 치료의 개발을 이끌어 낼 수 있는, 개에서의 아토피성 질환을 유도하는 면역학적 연쇄반응에 관련되는 인자를 분리할 필요성이 존재한다.

본원에서 참조문헌에 대한 인용은 이러한 참조문헌이 본 출원에 대한 "선행 기술"로서 이용가능하다는 인정으로서 해석되어서는 안된다.

발명의 요지

본 발명은 아토피성 피부염 및 이의 관련된 임상적 징후를 포함하는, 개에서의 아토피성 질환을 위한 새롭고 보다 실용적인 치료 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 아토피성 질환을 유도하는 면역학적 연쇄반응에 관련되는 신규한 분리된 및/또는 재조합 흉선 간질 림포포이에틴 단백질(TSLP) 단백질들을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 TLSP 단백질의 항원적 단편을 제공한다. 본 발명의 특정 국면에서, TSLP 단백질은 개 TSLP 단백질이다.

따라서, 본 발명은 28개의 아미노산 잔기 시그날 서열을 배제하는 서열 2의 아미노산 서열에 대한 80% 이상의 동질성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TSLP 단백질을 제공하고, 여기서 단백질이 백신으로서 개 대상체에게 투여되는 경우, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 개 TSLP 단백질을 결합하는 항체는 백신접종된 개 대상체로부터 수득한 개 혈청에서 검출가능하다. 관련된 양태에서, TSLP 단백질은 28개의 아미노산 잔기 시그날 서열을 배제하는 서열 2의 아미노산 서열에 대한 80% 이상의 동질성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 2의 아미노산을 포함하는 개 TSLP에 대해 길러진 항체와는 교차 반응한다.

또한, 본 발명은 에피토프-특이적 개 TSLP 모노클로날 항체에 결합하는 서열 2(28개의 아미노산 잔기 시그날 서열을 배제함)의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동질성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TSLP 단백질을 제공한다.

보다 특별한 양태에서, TSLP 단백질은 28개의 아미노산 잔기 시그날 서열을 배제하는 서열 2의 아미노산 서열에 대한 90% 이상의 동질성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 여전히 다른 양태에서, TSLP 단백질은 28개의 아미노산 잔기 시그날 서열을 배제하는 서열 2의 아미노산 서열에 대한 95% 이상의 동질성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 특이적 양태에서, TSLP 단백질은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 개 TSLP 단백질이다. 다른 양태에서, TSLP 단백질은 서열 2의 아미노산 잔기 29 내지 155를 포함하는 성숙한 개 TSLP 단백질이다.

또한, 본 발명의 TSLP 단백질의 항원 단편이 제공된다. 이러한 항원 단편은 서열 8 내지 101의 아미노산 서열로 개별로 정의된 하나 이상의 에피토프를 포함하 는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항원 단편은 서열 30, 31, 32, 및/또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 다른 양태에서, 항원 단편은 서열 30, 31, 32, 및/또는 34의 아미노산 서열의 중첩(overlap) 내에 포함되는 아미노산 서열, 즉, NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS(서열 118)을 가질 수 있다. 특별한 양태에서, 개 TSLP 단백질의 항원 단편은 항-사람 TSLP 모노클로날 항체를 결합할 수 있다. NPPDCLARIERLTLHRIRGCAS(서열 118)의 아미노산 서열의 항원 단편은 크기가 약 5 내지 약 21개 아미노산 잔기의 범위일 수 있다.

또한, 본 발명의 유효량의 특정한 TSLP 단백질, 이의 하나 이상의 항원 단편, 또는 이러한 전장(full-length) 단백질(들) 및 하나 이상의 이러한 단편의 조합을 포함할 수 있는 백신을 제공한다. 하나의 양태에서, TSLP 단백질은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 개 TSLP 단백질이다. 특정 양태에서, 백신은 서열 2의 아미노산 잔기 71 내지 92의 5 내지 22개의 인접(contiguous) 아미노산(본원에서 서열 118로서 나타냄)을 포함하는 개 TSLP 단백질의 하나 이상의 항원 단편을 포함한다. 이러한 항원 단편의 예는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 또는 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 본원에 기재된 에피토프를 포함한다. 본 발명의 모든 백신은 약제학적으로 허용되는 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 항-개 TSLP 항체를 유도하는 방법에서 사용될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 유효량의 백신으로 포유동물을 면역화함을 포함한다. 이 방법은 유효량의 백신으로 개를 면역화함을 포함하는, 아토피 개에서 알레르기성 증 상을 치료 또는 예방하는 방법 및/또는 개에서 TSLP 활성을 하향조절하는 방법을 임의로 포함한다. 완화된 알레르기성 증상은 알레르기성 피부염, 천식 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 다음과 같은 경로에 의해 투여될 수 있다: 근육내 주사, 피하 주사, 정맥내 주사, 피내 주사, 경구 투여, 비내 투여, 난절법(scarification), 및 이들의 조합.

또한, 본 발명은 본 발명의 TSLP 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 항원 단편을 제공한다. 하나의 이러한 양태에서, 핵산 분자는 서열 2의 아미노산 서열을 암호화한다. 이 유형의 특정 양태에서, 핵산 분자는 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 약 18개의 인접 뉴클레오타이드, 약 24개의 인접 뉴클레오타이드, 약 36개의 인접 뉴클레오타이드, 약 45개의 인접 뉴클레오타이드, 66개의 인접 뉴클레오타이드 또는 이 이상의 서열 1의 뉴클레오타이드 서열의 단편이 또한 본 발명의 일부이다. 엄격한 하이브리드화 조건하에 서열 1로 하이브리드화한 전장 TLSP 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 약 18개의 인접 뉴클레오타이드, 약 24개의 인접 뉴클레오타이드, 약 36개의 인접 뉴클레오타이드, 약 45개의 인접 뉴클레오타이드, 약 66개의 인접 뉴클레오타이드 또는 이 이상의 핵산이 또한 본 발명에 제공된다. 본 발명의 모든 핵산 분자 및 이의 단편은 이종 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 앞서 나타낸 핵산 분자 및/또는 이의 단편을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 추가로, 본 발명은 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 임의로 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다. 하나의 양태에서, 원핵 숙주 세포는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)이다. 이 유형의 특정 양태에서, 숙주 세포는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)-유도가능한 lacUV5 프로모터의 조절하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)/pLysS이다.

본 발명은 또한, 개 TSLP를 암호화하는 상기한 핵산 분자들 중의 하나, 예를 들어, 서열 1, 및/또는 이의 단편을 포함하는 재조합 바이러스 벡터 및/또는 노출된 DNA 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 예를 들어, 아토피성 피부염을 갖는 개 속으로 투여하기에 적합한 백신 중에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 TSLP 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 이러한 방법은 적합한 배양 배지 중에 본 발명의 숙주 세포를 항온처리함을 포함한다. 이 방법은 배양된 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 TSLP 단백질을 분리하고/하거나 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 수득한 분리된 및/또는 정제된 TSLP 단백질은 또한, 본 발명의 일부이다.

본 발명의 백신에 의해 하이브리도마 시스템에서 유도되는 항-TSLP 항체는 또한, 본 발명의 일부이다. 이러한 유형의 하나의 양태에서, 포유동물 하이브리도마 시스템이 사용된다. 특정 양태에서, 항체는 분리되고/거나 정제된다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 본 발명에 따라서, 비-개 종에서 유도되는 모노클로날 항체는 개 대상체 내로 주입되는 경우 최소의 항원이기 위해서, 개화(caninization)되도록 임의로 가공될 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 본 발 명에 따른 특정한 항체의 결합 도메인은 예를 들어, 절단에 의해 및/또는 재조합 Fv, Fab, 및 F(ab')₂ 결합 단백질로서 본래의 항체보다 더 작은 결합 단편으로 임의로 전환된다. 천연 생성 중쇄 항체(예: NANOBODIES®)의 독특한 구조적이고 작용적인 특성을 함유하는 항체-유도된 치료학적 단백질이 또한, 본 발명에 포함된다. 또한, TLSP에 대한 높은 친화성 또는 낮은 면역원성을 갖는 항체 대용물(antibody surrogate)[TSLP 수용체의 결합 일부로부터 제조된 아비머(avimer)]이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항-개 TSLP 항체/아비머는 유효량의 항-개 TSLP 항체를 투여함으로써 아토피를 갖는 개에서 알레르기성 증상을 치료하는 방법에 즉시 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 유효량의 비-TSLP 면역원을, 본 발명의 유효량의 TSLP 단백질, 이의 하나 이상의 항원 단편, 또는 전장 단백질 및 하나 이상의 이러한 단편의 조합물과 조합하여 포함하는 백신을 제공한다. 이 유형의 특정 양태에서, TSLP 단백질은 개 TSLP 단백질이다. 보다 특정 양태에서, 개 TSLP 단백질은 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 발명의 개 TSLP 단백질, 이의 단편 및/또는 개 TSLP에 의해 유도된 항체 및 이의 단편을 사용하는 진단 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 개로부터 표피 샘플을 수득하고, 이러한 표피 샘플에서 개 TSLP 단백질의 존재 여부를 측정함을 포함하는, 개에서의 아토피성 피부염의 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 이러한 국면 및 다른 국면은 다음 도면 및 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 것이다.

도 1은 개 TSLP 단백질을 발현하는 원핵 세포-유리 단백질 합성 시스템으로부터의 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 레인(Lane) 1: 단백질 표준; 레인 2: 총 단백질; 레인 3: 가용성 단백질; 레인 4: 불용성 단백질. TSLP 단백질 밴드는 화살표로 나타낸다.

도 2A는 개 TSLP 단백질을 발현하는 원핵 세포-유리 단백질 합성 시스템으로부터의 단백질의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 나타낸다. 단백질을 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 항-His(C 용어)/AP Ab와 반응시켰다. 레인 1: 단백질 표준; 레인 2: 총 단백질; 레인 3: 가용성 단백질; 레인 4: 불용성 단백질. 개 TSLP 단백질은 총 단백질 및 불용성 단백질에서 검출되었다(화살표로 나타낸 바와 같음).

도 2B는 개 TSLP 단백질을 발현하는 원핵 세포-유리 단백질 합성 시스템으로부터의 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 단백질을 사람 TSLP에 특이적인 랫트 모노클로날 항체와 반응시켰다. 레인 1: 단백질 표준; 레인 2: 총 단백질; 레인 3: 가용성 단백질; 레인 4: 불용성 단백질. 개 TSLP 단백질은 총 단백질 및 불용성 단백질에서 검출되었다(화살표로 나타낸 바와 같음).

도 3A는 이. 콜라이 숙주 세포로부터 TSLP의 발현 및 정제를 나타내고, 개 TSLP, 및 융합 파트너 GST 단백질 및 6 히스티딘 잔기 태그 사이에서 융합을 나타 내는 가용성 이. 콜라이 분획에서 존재하는 @ 61kd의 밴드를 보여준다. "M"은 단백질 표준(도 3A 내지 도 3D에서 모두 동일함)을 나타낸다. 레인 1 및 레인 2는 각각 IPTG 유도를 하거나 하지 않고 플라스미드 1265-93B를 함유하는 이. 콜라이 B121(DE3)pLysS의 가용성 분획이다. 화살표는 GST-TSLP-His 융합 단백질 밴드(도 3A 내지 3D에서 모두 동일함)를 나타낸다.

도 3B는 GST-TSLP-His 태그된 융합 단백질이 글루타티온 세파로스 4B 수지로 정제할 수 있음을 나타낸다. 레인 1 내지 3은 글루타티온 세파로스 4B 수지의 상이한 용출 분획을 나타낸다.

도 3C는 레인 B의 융합 단백질이 Ni-NTA 수지를 사용하여 추가로 정제할 수 있음을 나타낸다. 본 도면은 Ni-NTA 수지에 의한 글루타티온 세파로스 4B 정제 후, GST-TSLP-His 융합 단백질의 재-정제를 나타낸다. 레인 1은 Ni-NTA 수지를 통과하는 유동이고, 레인 2는 Ni-NTA 수지의 일레큐션(elecution)이다.

도 3D는 GST-TSLP-His 융합 단백질의 웨스턴 블롯을 나타내고, 융합 단백질이 항-GST 항체(제조원: GE 헬쓰케어, 제품 번호 제27457701호)로 인식됨을 확인한다.

도 4는 아토피성 피부염으로 진단받았던 개 번호 제10197호로부터 수득한 병변 피부 조직의 파라핀-매봉된 블록(paraffin embedded block)으로부터의 단면의 FITC 염색을 나타낸다. 위의 단면은 래빗 항-사람 TSLP 폴리클로날 항체와 반응시킨 다음, 반응을 스트렙타비딘-FITC(형광 이소티오시아네이트)로 가시화하였다. 형광 세기(밝은 영역)는 조직에서 존재하는 TSLP에 대한 래빗 항-사람 TSLP 폴리클 로날 항체의 결합을 나타낸다.

도 5A는 아토피성 피부염으로 진단받았던 개로부터 수득한 병변 피부 조직의 파라핀-매봉된 블록의 단면의 면역퍼옥시다제 염색을 나타낸다. 이 단면에서, 랫트 항-사람 TSLP 모노클로날 항체에 의한 피부 시험편의 표피 영역의 확산 염색[어두운 영역]이 존재한다.

도 5B는 대조군 단면을 나타낸다. 이 단면은 단지 인산염 완충된 대조군으로 처리한 아토피성 피부염으로 진단받았던 개로부터 수득한 병변 피부 조직의 파라핀-매봉된 블록이다.

도 6은 랫트 항-사람 TSLP 모노클로날 항체를 가진 개 TSLP 단백질의 에피토프 맵핑을 나타낸다. 특별히 흥미있는 피크는 에피토프 번호 22 내지 26(서열 29 내지 33)에서부터이다. 또한, 에피토프 22 내지 26은 N-말단 유도체화(derivatization)(피크 55까지)로 수행하여 결합 에피토프가 N-말단 잔기를 필요로하지 않음을 확인한다.

도 7은 개(서열 32) 및 에피토프 25(서열 3) TSLP 펩타이드 서열의 사람 유사체와의 비교를 나타낸다.

도 8A는 개 TSLP 유전자의 DNA 서열(서열 1)을 나타낸다.

도 8B는 도 8A로 나타낸 DNA 서열로 발현된 예상되는 TSLP 폴리펩타이드(서열 2)를 나타낸다. *는 초기 시그날 서열(잔기 1 내지 28)의 N-말단을 표시하고, 밑줄 그어진 잔기 71 내지 92(서열 118)는, 표 2의 중첩 에피토프 22 내지 26이 측정되는 도메인을 나타낸다.

아토피성 피부염("AD")은 Th2 매개된 알레르기성 염증 질환이다. 이 질환은 사람 및 개 환자에서 많은 유사한 임상적 특징으로 나타난다. 개에서 AD의 면역병인은 피부 병변에 관여하는 세포형 및 사이토킨과 관련하여 사람에서의 AD와 비교할 수 있다.

Th2 림프구에서 선택적으로 발현하는, CC 케모카인 수용체 4(CCR4)에 대한 TARC 리간드(CCL22)의 결합은 이들 세포의 알레르기성 병변으로의 선택적 이동을 유도한다. TARC 및 이의 수용체 CCR4는 개 AD 피부의 병변에서 상향조절되는 것으로 보고되어왔다. TSLP는 사람에서 TARC의 강한 유도인자(inducer)이기 때문에, TSLP는 개 AD의 병변 중에 존재할 수 있음을 가정하였다. 이에 따라, 사람 TSLP에 대해 생산된 항체를 AD 개 환자로부터 병변성 피부에 시험하였다. 이들 피부 샘플의 면역조직화학은 도 4에 나타낸 바와 같이, 병변 중의 항-사람 TSLP 항체와 반응성인 항원의 존재를 확인하였다. 그러나, 쥐 및 사람 TSLP를 암호화하는 유전자에 대한 개 올소로그(ortholog)를 동정하는 일은 본원에 기재된 바와 같이, 포유동물 종에서 TSLP의 핵산 및 아미노산 서열의 높은 분산도로 인하여 특히 어려움이 있는 것으로 입증되었다.

본 발명의 TSLP 및/또는 이의 하나 이상의 항원 단편으로 애완용 개를 면역화시키는 것은 내인성 TSLP 항원 수준을 감소시킴으로써 면역화된 개에서 천식 및/또는 아토피성 피부염에서 발생하는 것과 같은 하나 이상의 아토피 증상을 완화, 제거, 및/또는 예방하는 역할을 해야 한다. 또한, 개 TSLP 단백질은 애완용 개, 또는 다른 포유동물 종에서 연구 및/또는 진단 시약용 항-개 TSLP 항체를 유도하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 특정 예에서, 개 TSLP를 암호화하는 개 TSLP 단백질 및/또는 핵산은, 예를 들어, 조혈 세포에서 STAT 활성화, 또는 TARC 발현을 통해 면역-손상된 개의 면역 시스템의 요소를 상향조절하는 역할을 할 수 있다.

본 발명을 보다 완전히 이해하기 위해서, 다음 정의가 제공된다.

기재의 편리를 위해 단수 용어들의 사용은 이와 같이 제한하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩타이드"를 포함하는 조성물에 대한 언급은 이러한 폴리펩타이드의 하나 이상에 대한 언급을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "대략"은 용어 "약"과 상호교환적으로 사용되며, 값이 지정된 값의 20 퍼센트 내, 즉, "대략" 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드는 40 내지 60개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있음을 나타낸다.

용어 "결합 조성물"은, 예를 들면, 항체-항원 상호작용에서 개 TSLP에 대하여 특이성을 갖고 결합하는 분자를 나타낸다. 특이성은 더 많게 또는 더 적게 포함할 수 있고, 예를 들어, 특정 양태 또는 관련된 양태들의 그룹, 예를 들어, 개 TSLP 및/또는 개 항체에 특이적이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "개"는 달리 나타내지 않는 한, 애완용 개, 개 루퍼스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) 또는 개 파밀리아리스(Canis familiaris)를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드"는 용어 "단백질" 및 "펩타이드"와 호환가능하게 사용되고, 펩타이드 결합으로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 중합체를 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 상당한 단편 또는 분절을 포함하며, 약 8개 이상의 아미노산, 일반적으로 약 12개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 16개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 20개 이상의 아미노산, 특히 바람직한 양태에서, 약 30개 이상 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들어, 35, 40, 45, 50 등의 아미노산 잔기의 스트레치(stretch)를 포함한다. 이러한 단편은 모든 실제적 조합에서의 사실상 모든 위치, 예를 들어, 잔기 1, 2, 3 등에서 시작하고, 예를 들면, 155, 154, 153 등으로 끝나는 위치에서 시작 및/또는 종결하는 말단을 가질 수 있다.

임의로, 폴리펩타이드는 유전자 또는 mRNA에 의해 암호화되는 특정 아미노산 잔기가 부족할 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 mRNA 분자는 분할되는 폴리펩타이드의 N-말단 상 아미노산 잔기의 서열(즉, 시그날 서열)을 암호화할 수 있고, 이에 따라, 최종 단백질의 일부가 아닐 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 아미노산 서열은, 2개의 아미노산 서열이 아래 정의된 바와 같이 동일하고/하거나 중성 또는 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 제2 아미노산 서열에 대해 100% "상동성"이다. 따라서, 아미노산 서열은, 약 80%의 2개의 아미노산 서열이 동일하고/하거나 중성 또는 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 제2 아미노산 서열에 대해 약 80% "상동성"이다.

기능적으로 동등한 아미노산 잔기는 종종 보존적 아미노산 치환을 생성하는 서열 내의 잔기 대신 치환될 수 있다. 이러한 변경은 본원에 사용된 바와 같은 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"을 정의한다. 예를 들어, 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 침묵 변경을 야기하는, 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 서열 내의 아미노산을 위한 치환은 아미노산이 속한 부류의 다른 멤버로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 방향족 환 구조를 함유하는 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신이다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 이러한 변경은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정된 명백한 분자량, 또는 등전점에 영향을 미치는 것으로 예상되지 않을 것이다.

특히 바람직한 보존적 치환은 다음이다: 양성 전하가 유지될 수 있도록 하는Arg에 대한 Lys 및 이의 반대; 음성 전하가 유지될 수 있도록 하는 Asp에 대한 Glu 및 이의 반대; 유리 --OH가 유지될 수 있도록 하는 Thr에 대한 Ser; 및 유리 NH₂가 유지될 수 있도록 하는 Asn에 대한 Gln. 또한, 아미노산은 다음의 유사 그룹 (1) 프롤린, 알라닌, 글리신, 세린 및 트레오닌; (2) 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산, 및 아스파르트산; (3) 히스티딘, 리신, 및 아르기닌; (4) 시스테인; (5) 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌; 및 (6) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판 중에 위치될 수 있다.

관련된 양태에서, 2개의 고도의 상동성 DNA 서열은 이들 고유의 상동성, 또는 이들이 암호화하는 아미노산의 상동성으로 식별할 수 있다. 서열의 이러한 비교는 서열 데이타 뱅크에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 특정 양태에서, 2개의 고도의 상동성 DNA 서열은 약 80% 동질성, 보다 바람직하게는 약 90% 동질성 및 심지어 보다 바람직하게는 약 95% 동질성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 보다 특히, 2개의 고도의 상동성 아미노산 서열은 약 80% 동질성, 심지어 보다 바람직하게는 약 90% 동질성 및 심지어 보다 바람직하게는 약 95% 동질성을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 단백질 및 DNA 서열 비율 동질성은 동질성을 위한 정렬 디폴트 파라미터(alignment default parameter), 및 디폴트 파라미터를 가진 액셀리스(Accelrys)[미국 매사추세츠주 벌링톤(Burlington)] 및 클러스탈 더블유(Clustal W) 알고리즘으로부터 상업적으로 이용가능한 맥벡터 v9(MacVector v9)와 같은 소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다. [참조: 예를 들어, Thompson, et al,. 1994. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680]. 클러스탈 더블유는 예를 들어, EMBLI, 유로피안 바이오인포매틱스 인스티튜트(European Bioinformatics Institute)로부터 도스, 맥킨토시 및 유닉스 플랫폼을 자유롭게 다운로드 할 수 있다. 이러한 다운로드 링크는http://www.ebi.ac.uk/clustalw/이다. 또한, 이러한 이용가능한 프로그램 및 다른 프로그램을 사용하여 동일한 또는 유사한 디폴트 파라미터를 사용하여 서열 유사성을 측정할 수 있다.

"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산 분자"는 RNA, cDNA, 게놈 DNA 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 뉴클레오타이드를 포함하는 분자이다. 또한, 상기 용어는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중의 어느 하나를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 것으로 고려된다.

본 발명은 본 발명의 TSLP 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 하이브리드화하는 핵산을 제공한다. 핵산 분자는, 핵산 분자의 일본쇄 형(single strained form)이 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 상태하에 다른 핵산 분자에 어닐링(annealing)할 수 있는 경우, 다른 핵산 분자, 예를 들어, cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA에 대해 "하이브리드화가능한(hybridizable)"이다. [참조: Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)].

매우 엄격한 하이브리드화 상태는 최고의 T_m, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5X 또는 6XSSC에 상응한다. 하이브리드화의 엄격성에 의존하여 염기들 사이의 불일치가 가능할지라도 하이브리드화는 2개의 핵산이 상보적 서열을 함유함을 필요로 한다. 핵산을 하이브리드화시키는 적절한 엄격성은 핵산의 길이 및 상보의 정도 및 당해 분야에 공지된 변수들에 좌우된다. 2개 뉴클레오타이드 서열들 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 이러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드를 위한 T_m의 값도 더 커진다. 핵산 하이브리드화의 상대적 안정성(더 높은 T_m에 상응함)은 다음 순서로 감소된다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 하이브리드에 있어서, T_m을 계산하는 방정식이 강도를 유도해왔다[참조: Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)]. 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오타이드로 하이브리드화하는 경우, 불일치의 위치는 보다 중요해지고, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 이의 특이성을 결정한다.

바람직하게는 하이브리드화가능한 핵산에 대한 최소 길이는 약 12개 이상의 뉴클레오타이드; 보다 바람직하게는 약 18개 이상의 뉴클레오타이드이고; 길이는 심지어 보다 바람직하게는 약 24개 이상의 뉴클레오타이드; 및 가장 바람직하게는 약 36개 이상의 뉴클레오타이드이다. 특정한 양태에서, 용어 "표준 하이브리드화 조건"은 55℃의 T_m을 나타내고, 위에서 나타낸 바와 같은 조건들을 이용한다. 다른 특정한 양태에서, 엄격한 조건은 T_m이 하이브리드화 및 세척 조건 둘 다를 위해 각각 65℃임을 의미한다.

DNA "코딩 서열" 또는 "서열 암호화" 특정 단백질 또는 펩타이드는 적절한 조절 요소의 조절하에 위치되는 경우 시험관내 또는 생체 내에서 폴리펩타이드로 전사되고 번역되는 DNA 서열이다.

코딩 서열의 경계는 5'-말단에서의 개시 코돈(start codon) 및 3'-말단에서의 번역 정지 코돈으로 결정된다. 코딩 서열은 원핵세포 서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵(예를 들어, 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 번역 종결 서열은 대개 코딩 서열에 대한 3'로 위치할 것이다.

"작동가능하게 연결된(operably linked)"은 기재된 성분들이 이들의 통상의 기능을 수행하도록 구성되는 경우, 요소들의 배열을 나타낸다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소들은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 조절 요소들은 이들이 이의 발현을 지시하는 작용을 하는 한, 코딩 서열과 접촉할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 아직 번역되지 않은 전사된 서열을 중재하는 것이 프로모터와 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터는 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 고려할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서 "이종 뉴클레오타이드 서열"은 자연에서 천연적으로 형성되지 않은 핵산을 형성하는 재조합 방법에 의해 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 가해지는 뉴클레오타이드 서열이다. 이러한 핵산은 융합(예를 들어, 키메라) 단백질을 암호화할 수 있다. 따라서, 이종 뉴클레오타이드 서열은 조절적 및/또는 구조적 특성을 포함하는 단백질 및/또는 펩타이드를 암호화할 수 있다. 이러한 다른 양태에서, 이종 뉴클레오타이드 서열은 재조합 핵산이 발현된 후, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩타이드를 검출하는 수단으로서 작용하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있다. 여전히 다른 양태에서, 이종 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 수단으로서 작용할 수 있다. 이종 뉴클레오타이드 서열은 제한 부위, 조절 부위, 프로모터 등을 포함하는 비-코딩 서열을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "융합 단백질" 및 "융합 펩타이드"는 호환가능하게 사용되고, "키메라 단백질 및/또는 키메라 펩타이드" 및 융합 "인테인 단백질/펩타이드"를 포함한다. 융합 단백질은 다른 단백질, 예를 들어, 비-개 TSLP 단백질의 하나 이상의 부분과 펩타이드 결합을 통해 결합하는 본 발명의 개 TSLP 단백질의 하나 이상의 부분을 포함하고/하거나 개 TSLP 단백질의 2개 이상의 비인접 부분, 예를 들어, 개 TSLP 폴리펩타이드(예를 들어, 펩타이드 결합에서 합해진 서열 2의 아미노산 잔기 71 내지 75 및 101 내지 105로 이루어진 10개의 아미노산 잔기의 융합 펩타이드)에서 인접한-순차적 순서대로 자연적으로 발생하지 않는 에피토프의 조합을 포함한다. 바람직한 양태에서, 개 TSLP 단백질의 부분은 기능적이며, 즉 이의 항원성을 보유한다. 융합 단백질은 또한 마커 단백질, 또는 본 발명의 개 TSLP 단백질의 분리 및/또는 정제(예: FLAG 태그, 하기 실시예들 참조) 및/또는 항원성에서 도움을 주는 단백질이다.

본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자는 예를 들어, 개 TSLP 코딩 서열을 골조에 끼워서 결합된 비-개 TSLP 단백질의 하나 이상의 일부를 암호화하는 서열을 포함할 수 있고, 또한, 특이적 프로테아제, 예를 들어, 트롬빈 또는 요소 Xa를 위한 분할 부위, 바람직하게는 개 TSLP 서열과 비-개 TSLP 서열 사이의 연결에 또는 근처에 암호화할 수 있다. 특정한 양태에서, 융합 단백질은 원핵 세포에서 발현된다. 이러한 융합 단백질은 개 TSLP에 융합된 단백질 및/또는 태그에 특이적인 친화도 칼럼의 사용을 통해, 본 발명의 개 TSLP를 분리하는데 사용될 수 있다(아래 실시예 참조). 예를 들어, 정제된 개 TSLP는 이후에 위에서 언급한 바와 같은 분할 부위 및 단백질분해효소의 사용을 통해 융합 단백질로부터 방출될 수 있다.

"벡터" 또는 "복제 벡터"는, 다른 DNA 분절이 부착 또는 혼입되어 부착된 분절의 복제를 가져올 수 있는, 플라스미드, 바이러스, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘(replicon)이다. 당해 용어는 또한 목적하는 혼입되거나 부착된 DNA 분절을 포함하는 레플리콘을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 벡터는 미생물 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 통합가능한 DNA 단편, 및 숙주의 게놈 내로 핵산의 융합을 용이하게 할 수 있는 기타 비히클(vehicle)을 포함한다. 플라스미드는 대부분 흔히 사용되는 벡터이지만, 동등한 기능을 수행하고, 당해 분야에 공지되거나 또는 공지되어지는 모든 다른 벡터가 본원에 사용하기에 적합하다. [참조: Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 and Supplements, Elsevier, N. Y., and Rodriguez et al. (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA.].

본 발명의 개 TSLP 단백질을 벡터 내로 암호화하는 DNA의 삽입은 DNA 및 벡터 둘 다의 말단이 상용적 제한 부위를 포함하는 경우 용이하게 성취된다. 만약 이것이 수행될 수 없다면, 무딘 말단을 생산하는 엔도뉴클레아제 분할을 제한함으로써 발생되는 일본쇄 DNA 돌출(overhang)을 증해(digesting)시킴으로써 DNA 및/또는 벡터의 말단을 변형시키거나, 또는 적절한 DNA 폴리머라제로 일본쇄 말단 내부를 채움으로써 동일한 결과가 달성되도록 만들 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 목적하는 부위는, 예를 들어, 말단 상으로 뉴클레오타이드 서열(링커)을 결찰시킴으로써 생성할 수 있다. 이러한 링커는 목적하는 제한 부위를 정의하는 특이적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 제한 부위는 또한, 중합연쇄반응(PCR)을 사용하여 발생시킬 수 있다. [참조: Saiki et al., Science 239:487 (1988)]. 또한, 분할된 벡터 및 DNA 단편은 필요한 경우, 호모폴리메릭 테일링(homopolymeric tailing)함으로써 변형시킬 수 있다.

본 발명에 사용되는 재조합 발현 벡터는 전형적으로 본 발명의 개 TSLP 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 대개 상용적 숙주 세포에서 핵산의 발현을 조절할 수 있는 적절한 유전적 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 이의 항원 단편을 포함하는, 자가 복제 DNA 또는 RNA 작제물이다. 유전적 조절 요소는 원핵 프로모터 시스템 또는 진핵 프로모터 발현 조절 시스템을 포함할 수 있고, 전형적으로 전사적 프로모터, 전사의 시작을 조절하는 임의의 작동자, mRNA 발현의 수준을 상승시키는 전사 인핸서(enhancer), 적절한 리보솜 결합 영역을 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역을 종결시키는 서열을 포함한다. 발현 벡터는 또한, 벡터가 숙주 세포에 독립적으로 복제되도록 하는 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 발명의 개 TSLP 단백질을 암호화하는 핵산의 발현은 원핵 또는 진핵 세포 중의 하나에서 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.

"숙주 세포"는 외인성 핵산 분자를 일시적으로 또는 영구적으로 발현하고 포함할 수 있거나 또는 포함하는 세포이다. 세포는 이러한 외인성 DNA가 세포막 내로 도입되는 경우, 외인성 DNA에 의해 "형질전환"된다. 외인성 DNA는 세포의 게놈을 형성하는 염색체 DNA 내로 통합(공유결합으로 결합된)할 수 있거나 또는 통합할 수 없다. 예를 들어, 원핵생물 및 효모에서, 외인성 DNA는 플라스미드와 같은 에피좀 요소에 유지될 수 있다. 원핵 세포와 관련하여, 안정하게 형질전환된 세포는 외인성 DNA가 염색체 복제를 통해 딸세포에 의해 유전되도록 염색체 내로 통합되어 진다. 이러한 안정성은 외인성 DNA를 포함하는 딸세포의 개체수로 이루어지는 세포주 또는 클론을 확립하는 진핵 세포의 능력으로 입증된다.

원핵생물은 그람 음성 유기체 및 양성 유기체, 예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 섭틸리스(B. subtilis) 둘 다를 포함한다. 진핵생물은 동물 세포, 비-포유동물 기원, 예를 들어, 곤충 세포, 및 새, 및 포유동물 기원, 예를 들어, 사람, 영장류, 및 설치류 둘 다로부터의 확립된 조직 배양 세포주를 포함한다.

원핵 숙주-벡터 시스템은 많은 상이한 종을 위한 광범위하게 다양한 벡터를 포함한다. DNA를 증폭시키는 벡터는 pBR322 또는 많은 이의 유도체, 또는 pET42b(+) 발현 벡터[제조원: 노바겐(Novagen)]를 포함한다.

전형적으로 사용되는 원핵 발현 조절 서열은 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템[참조: Chang et al., Nature, 198:1056 (1977)], 예를 들어, pUC-시리즈, 트립토판(trp) 프로모터 시스템[참조: Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)], 예를 들어, (pBR322-trp), 람다 P_L 프로모터 시스템[참조: Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981)], 람다-pP 또는 pR 프로모터(pOTS), 아라비노스-유도가능한 프로모터[제조원: 인비트로겐(InVitrogen)], tac 프로모터[참조: De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128 (1983)], Ipp 프로모터(pIN-시리즈); 또는 ptac(pDR540)과 같은 하이브리드 프로모터로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 이러한 조절 서열을 함유하는 다수의 다른 발현 벡터는 또한, 당해분야에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. [참조: Brosius et al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", in Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, pp. 205-236.]

다른 원핵생물에서 사용할 수 있는, 이. 콜라이를 위해 적절한 것들에 대한 유전적으로 동등한 벡터가 또한, 본 발명의 TSLP 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다.

효모 및 고등 원핵 조직 배양 세포는 또한, 본 발명의 개 TSLP 단백질, 및/또는 항-개 TSLP 항체 및/또는 이러한 항체의 단편의 재조합 생산을 위한 숙주로서 고려된다. 곤충 바큘로바이러스 발현 시스템을 포함하는, 고등 원핵 조직 배양 세포주가 사용될지라도, 포유동물 세포가 바람직하다. 이러한 세포의 형질전환 또는 형질감염 및 번식은 일반적인 과정이 된다. 유용한 세포주의 예는 헬라(HeLa) 세포주, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, 베이비 랫트 신장(BRK) 세포주, 마딘-달비(Madin-Darby) 개 신장(MDCK) 세포주, 베로(Vero) 세포주, HEK-293 세포주 및 몽키(COS) 세포주를 포함한다.

이러한 세포주를 위한 발현 벡터는 일반적으로 예를 들어, 복제의 기원, 프로모터, 번역 개시 부위, RNA 스플라이스 부위(게놈 DNA가 사용되는 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위를 포함한다. 이러한 벡터는 또한, 선택 유전자 또는 증폭 유전자를 대개 포함한다. 적합한 발현 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스, SV40, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 사이토메갈로바이러스로서 공급원으로부터 유래되는 플라스미드, 바이러스, 또는 레트로바이러스 운반 프로모터일 수 있다. 적합한 발현 벡터의 대표적인 예는 pCR^®3.1 , pCDNA1 , pCD[참조Okayama et al., Mol. Cell Biol. 5:1136 (1985)], pMC1neo Poly-A[참조: Thomas et al., Cell 51:503 (1987)], pUC19, pREP8, pSVSPORT 및 이의 유도체, 및 pAC 373 또는 pAC 610과 같은 바큘로바이러스 벡터를 포함한다.

일단 발현되면, 본 발명의 개 TSLP는 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피 등[참조: 일반적으로 R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N. Y. (1982)]을 포함하는 당해 분야의 표준 과정에 따라 정제할 수 있다. 약 90 내지 95% 이상의 균질성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 균질성이 약제학적 용도를 위해 가장 바람직하다. 정제는 부분적일 수 있거나, 또는 바람직한 경우 균질성에 대해 부분적이다. 개 TSLP가 치료학적으로 사용되는 경우, 단백질은 엔도톡신이 실질적으로 존재하지 않아야 한다. 결합된 항-TSLP 항체 칼럼, 또는 결합된 TSLP-수용체 칼럼 상의 발현된 TSLP의 선택적 정제는 고도로 정제된 개 TSLP 단백질을 수득하는데 이용가능한 방법이다.

정제하기 위한 방법이 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산은 침전, 크로마토그래피, 초원심분리 및 다른 수단으로 정제시킬 수 있다. 펩타이드 뿐만 아니라 단백질 및 폴리펩타이드도 제조적 디스크-겔 전기영동, 등전 포커싱, HPLC, 역상 HPLC, 겔 여과, 이온 교환 및 분배크로마토그래피, 침전 및 염석 크로마토그래피, 추출 및 역류 분배를 포함하고, 이에 제한되지 않는 다양한 방법으로 정제할 수 있다. 몇몇 목적을 위해, 재조합 시스템 중의 폴리펩타이드를 생산하는 것이 바람직하고, 여기서 단백질은 정제를 용이하게 하는 추가의 서열 태그, 예를 들어, 폴리히스티딘 서열 또는 항체에 특이적으로 결합하는 서열, 예를 들어, FLAG^® 및 GST를 포함한다. 이어서 폴리펩타이드는 적절한 고체상 매트릭스에서 크로마토그래피에 의해 숙주세포의 조악한 용해질로부터 정제할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드에 대해 생산되는 항체 또는 이의 결합 단편은 정제 시약으로서 사용할 수 있다.

용매 및 전해질은 대개 생물학적 활성물의 보존을 위해 사용되는 유형의 생물학적으로 상용적 완충제일 것이고, 대개 생리학적 수성 용액일 것이다. 대개 용매는 중성 pH, 전형적으로 약 5 내지 10, 및 바람직하게는 약 7.5를 가질 것이다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 세제, 전형적으로 중성적인 비-변성 세제, 예를 들어, CHS(콜레스테릴 헤미석시네이트) 또는 CHAPS(3-[3 콜아미도프로필)디메틸암모니-o]-1-프로판 설포네이트), 또는 단백질의 구조적 또는 생리학적 특성의 상당한 분열을 피하기에 충분히 낮은 농도로 가해질 것이다. 다른 예에서, 거친 세제를 사용하여 상당한 변성에 영향을 미치도록 할 수 있다.

대안적으로, 이. 콜라이 또는 다른 박테리아로부터의 기능적 이종 단백질은 강한 변성제를 사용하는 가용화를 사용하여 포함 바디(inclusion body)로부터 분리될 수 있고, 이어서 리폴딩(refolding)될 수 있다. 당해 공지된 변성제는 간단히 예를 들면, 요소, 칼륨 티오시아네이트, 구아나딘 HCl("GuHCl"), 요오드산 칼륨, 및/또는 요오드산 나트륨 및 이의 조합을 포함한다. 바람직하게는, GuHCl은 알카리성 조건, 예를 들어 약 pH 8 하에, 예를 들어, 약 6 내지 약 8M 농도로 환원제로서 사용된다. 임의로 다른 환원제, 디티오트레이톨("DTT")은 단독 또는 GuHCl과 조합하여 사용된다. DTT가 사용되는 경우, 농도는 간단히 예를 들면, 약 50mM 내지 약 0.5mM DTT의 범위이다. 가용화 단계 동안에, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 환원제는 디설파이드 결합을 분리 또는 변성시키기 위해 존재하여야만 한다. 하나의 예시적 환원완충제는 0.1M 트리스 pH 8.0, 6M 구아니딘, 2mM EDTA, 및 0.3M DTE(디티오에리트리톨)이다.

탈변성은 전형적으로 산화제의 존재에서, 리폴딩 완충제(refolding buffer) 내로 변성되고 환원된 단백질을 희석(예를 들어, 100배)시켜 달성한다. 적절한 당해분야에 공지된 산화제를 사용할 수 있고, 단 이는 양호한 수율로 리폴딩을 보정하도록 한다. 예를 들어, 산화 및 리폴딩은 본원에 참조로 삽입된 문헌[참조: Saxena, et al., 1970, Biochemistry 9: 5015-5021]에 기재되고, 상기한 문헌[참조: Buchner, et al.]에 의해 특히 기재된 바와 같이 환원되고 산화된 형태로 저분자량 티올 시약에 의해 제공될 수 있다. 탈변성은 전형적으로 리폴딩 완충제 내로 변성되고 환원된 단백질을 희석(예를 들어, 100배)시킴으로써 달성된다. 하나의 예시적 리폴딩 완충제는 트리스 HCl 100mM, pH 10.0, 25mM EDTA, NaCl 0.1M, GSSG 551mg/L, 0.5M 아르기닌이다. GSSG는 글루타티온의 산화된 형태이다.

폴리펩타이드의 크기 및 구조는 일반적으로 실질적으로 안정한 상태이어야 하고, 대개 변성된 상태가 아니다. 폴리펩타이드는 4원 구조, 예를 들어, 가용성을 부여하기 위해서, 또는 지방 또는 세제와 연관되는 4원 구조의 다른 폴리펩타이드와 관련될 수 있다.

실질적으로 순수한은, 예를 들어, 단백질 문맥에서는, 전형적으로 단백질이 다른 오염된 단백질, 핵산, 또는 본래 공급원 유기체로부터 유도된 다른 생물학적인 것들이 없음을 의미한다. 순도는 표준 방법, 전형적으로 중량에 의해 분석할 수 있고, 대체로 약 40% 이상의 순도, 일반적으로 약 50% 이상의 순도, 종종 약 60% 이상의 순도, 전형적으로 약 80% 이상의 순도, 바람직하게는 약 90% 이상의 순도, 및 가장 바람직한 양태에서, 약 95% 이상의 순도일 것이다. 담체 또는 부형제가 종종 가해질 것이다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역검정, 조성물 분석, 생물학적 검정 및 당해분야에 공지된 다른 방법으로 측정할 수 있다. 작용적 국면으로부터, 본 발명에 따른 분리된 개 TSLP 단백질은 개 TSLP 단백질에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있도록 하기 위해서, 전구체 개 TSLP 단백질 및/또는 성숙한 개 TSLP 단백질을 포함하는, 다른 물질로부터 충분히 분리된 단백질이다.

폴리펩타이드 또는 단편의 가용성은 환경 및 폴리펩타이드에 의존한다. 많은 파라미터는 온도, 전해질 환경, 폴리펩타이드의 크기 및 분자 특성, 및 용매의 특성을 포함하는, 폴리펩타이드 가용성에 영향을 미친다. 전형적으로, 폴리펩타이드가 사용되는 온도는 약 4℃ 내지 약 65℃의 범위이다. 대개 온도는 약 18℃ 초과이다. 진단 목적을 위해, 온도는 대개 실온 또는 더 따뜻하게 될 것이지만, 검정에서 성분이 변성되는 온도 미만이 될 것이다. 치료학적 목적을 위해, 온도는 특정 상황 하에 온도가 본 장소 또는 시험관 내에서 오르거나 또는 낮아질 수 있을지라도, 대부분의 경우, 체온, 전형적으로 약 36℃ 내지 40℃(예를 들어, 개의 경우 약 39℃)일 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 특정 단백질에 관한 용어 "항원 단편"은 항원성인, 즉 면역글로불린(항체) 또는 T 세포 항원 수용체와 같은, 면역 시스템의 항원 인식 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 항원성인 단백질(전장 단백질로부터 단일 아미노산만큼 작게 결실되는 큰 단편을 포함함)의 단편이다. 예를 들어, 본 발명의 개 TSLP의 항원 단편은 항원성인 개 TSLP의 단편이다. 이러한 단편은 자체 면역원성, 즉, 단편이, 면역화하기 위해 담체 분자에 단편을 콘쥬게이팅(conjugating)한 후 TSLP 단백질에 대한 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 한, 담체 없이 면역 반응을 유도할 수 있도록 자체 면역원성일 필요는 없다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 항원 단편은 항체 및/또는 T 세포 수용체 인식을 위해 면역지배적이다.

특정 양태에서, 개 TSLP의 항원 단편은 5 내지 150개의 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 특정 양태에서, 개 TSLP의 항원 단편은 120개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 양태에서, 개 TSLP의 항원 단편은 10개 내지 120개의 아미노산 잔기를 포함한다. 여전히 다른 양태에서, 개 TSLP의 항원 단편은 20개 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함한다. 여전히 다른 양태에서, 개 TSLP의 항원 단편은 25개 내지 75개의 아미노산 잔기를 포함한다.

개 TSLP의 항원 단편은 재조합 공급원, 천연 공급원으로부터 분리된 단백질, 또는 화학적 합성을 통해 수득할 수 있다. 또한, 항원 단편은 재조합 발현을 통해 개 TSLP, 또는 이의 단편의 원핵 분해로 수득할 수 있거나, 또는 대안적으로, 펩타이드 합성을 통해 발생할 수 있다.

백신

본 발명은 또한, 본 발명의 유효량의 TSLP 단백질, 이의 하나 이상의 항원 단편, 또는 전장 단백질 및 하나 이상의 이러한 단편의 조합을 포함하는 백신을 제공한다. 예를 들어, 아래 표 2에서 열거한 것들과 같은, 개 TSLP 단백질 및/또는 이의 단편은 단백질- 또는 펩타이드-상용성 백신 조성물 중에 삽입될 수 있다. 이러한 백신 조성물은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 생리학적으로 상용성인 완충제 및 염수 등, 및 카보폴^®(CARBOPOL^®) 또는 에멀시겐^®(Emulsigen^®)과 같은 약제학적으로 허용되는 항원보강제를 포함할 수 있지만, 반드시 포함하지는 않는다.

백신 조성물은, 예를 들면, 개 대상체에서 TSLP 활성의 하향조절에 반응하는 질환 또는 장애의 임상적 징후를 치료하기 위해서, 이를 필요로 하는 개 대상체에서 내인성 항-TSLP 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 이와 관련하여, 본 발명의 백신은 또한, 예를 들어, TSLP를 과다 발현하는 개를 확인하기 위한 시험 키트(test kit)에서의 보조로서 개 TLSP를 스크리닝 및/또는 동정하기 위한 항혈청을 유도하는데 사용될 수 있다.

아래 표 2에서 기재된 것들과 같은 TSLP의 펩타이드, 및 이의 변이체는 개별적으로 또는 다양한 조합물 중에 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드는 화학적 또는 재조합 DNA 기술을 통해 담체로서 공지된 더 큰 단백질에 및/또는 서로 간에 작동가능하게 연결될 수 있다. 담체는 면역 반응의 표적물로서 숙주 동물에 의한 펩타이드 인식을 증진시키고, TSLP 펩타이드의 면역원성을 증가시키는 작용을 한다. 몇몇 담체는 당해 분야에 공지되어 있고, 파상풍 독, 디프테리아 독소, PhoP 단백질, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 베타 갈락토시다제, BHV-1 바이러스로부터의 gD 단백질, 광견병 바이러스로부터의 G 단백질, 개홍역 바이러스로부터의 F 단백질, 및 "범발(universal)" T 세포 에피토프의 중합반응으로 생산되는 것과 같은 합성 담체로부터의 파상풍 독소 또는 비-독성 C 단편을 포함한다.

면역원으로서 유용한 TSLP 단백질은 천연 TSLP 단백질의 표면 접근성, 친수성, 원자의 가동성 및 항원성과 같은 특성을 평가하는 공지된 알고리즘을 사용하여, 표 2에 기재된 것들, 및 이들의 변이체로부터 선택될 수 있다. 표 2에 나열된 펩타이드로부터의 에피토프, 및 이들의 변이체는 또한, 천연 TSLP 단백질과 반응하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 및 특히 TSLP 생물활성을 중화시킬 수 있는 항체와의 반응성을 기본으로 하여 선택될 수 있다. 이러한 항원은 표준 펩타이드 합성 기술을 사용하여 본원에 기재된 서열로부터 제조된 합성 펩타이드를 포함할 수 있고/있거나, 또는 대안적으로, 재조합 또는 천연 TSLP 단백질로부터 수득한 단편일 수 있다.

본 발명의 약제학적으로 허용되는 항원보강제는 천연공급원, 재조합체 공급원을 포함하는 다수의 공급원 중의 어느 하나로부터 수득될 수 있고/있거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 항원보강제로서 사용되는 화합물의 예는 알루미늄 화합물; 대사가능한(metabolizable) 및 대사가 가능하지 않은 오일; 블록 중합체(block polymer); ISCOM's(면역 자극 복합체); 비타민 및 무기질(비타민 E, 비타민 A, 셀레늄 및 비타민 B12를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다); 퀼 에이(Quil A)(사포닌); 프로인드 완전 항원보강제(Freund's complete adjuvant), 상표명 CARBOPOL^®(예: 상표명 CARBOPOL^® 941) 하에 시판되는 폴리알케닐 에테르 또는 디비닐 글리콜로 가교결합된 아크릴산계 중합체, 및 수 에멀젼(water emulsion; 상표명 Emulsigen^®하에 시판됨) 중에 균일하게 분산된 마이크론 크기 유적을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 때때로 면역 자극제로서 구체적으로 언급되는 항원보강제의 추가의 예는, 세균 및 진균 세포 벽 성분(예를 들어, 지다당질, 지단백질, 당단백질, 뮤라밀펩티드, 베타-1,3/1,6-글루칸), 식물로부터 기원한 다양한 복합 탄수화물(예를 들어, 글리칸, 아세만난), 동물로부터 기원한 다양한 단백질 및 펩타이드[예를 들어, 호르몬, 사이토킨, 공-자극 인자(co-stimulatory factor)], 및 바이러스 및 기타 공급원으로부터 기원한 신규 핵산(예를 들어, 이본쇄 RNA, CpG)을 포함한다. 또한, 앞서 언급한 물질들의 특정한 수의 조합물들은 보조 효과를 제공할 수 있으므로, 본 발명의 항원보강제를 형성할 수 있다.

본 발명의 백신은 다음과 같은 경로에 의해 투여될 수 있다: 근육내 주사, 피하 주사, 정맥내 주사, 피내 주사, 경구 투여, 비내 투여, 및 이들의 조합.

항체

또한, 본 발명은 본 발명의 개 TSLP 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 (mAb) 항체를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 면역글로불린 및/또는 이의 단편을 나타낸다. 천연 발생하는 면역글로불린은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화되는 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진다. 인식되는 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 고정 영역 유전자(mu constant region gene), 및 무수히 많은 수의 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 본 발명에 따른 항체(들)는 또한, 항체 단편, 즉, 항원-결합 단편, 예를 들어, Fv, Fab, 및 F(ab')₂, 가공된 일본쇄 결합 단백질[예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌 참조: Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) and Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988], 및 이작용성 하이브리드 항체[참조: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]을 포함한다. 문헌 참조: Hood et al., Immunology, Benjamin, N. Y., 2nd ed. (1984), Harlow and Lane, Antibodies . A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986), 본원에 모두 참조로 인용되어 있음.

예를 들어, 표준 방법을 사용하여, 본 발명의 개 TSLP 단백질에 의해 면역화되는 동물로부터 생산되는 혈청을 직접적으로 사용할 수 있거나, 또는 고정 단백질 A 또는 단백질 G와 같은 IgG-특이적 흡수제로 흡수 크로마토그래피 또는 혈장분리교환술과 같은 표준 방법을 사용하여 혈청으로부터 IgG 단편을 분리할 수 있다. 대안적으로, 모노클로날 항체를 제조할 수 있고, 임의로, 항원 결합 단편 또는 재조합 결합 단백질이 mAbs로부터 유도된다. 이러한 MAbs 또는 이의 단편은 임의로 당해 분야에 공지된 방법 또는 이의 올바른 변형법으로 각각 사람화(humanization)시킬 수 있거나, 또는 개화시킬 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "에피토프-특이적" 개 TSLP 항체는 다음 5개의 아미노산 서열: 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 및 서열 34 중의 하나 이상을 포함하는 에피토프를 포함하는 개 TSLP의 단편에 대해 발생한 항체이고, 또한, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및/또는 28개의 아미노산 잔기 시그날 서열을 배제하는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 결합한다. 특정 양태에서, 에피토프-특이적 개 TSLP 항체는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 개 TSLP 단백질을 선택적으로 결합하는 mAbs를 생산하는 하이브리도마는 공지된 기술로 생산된다. 일반적으로, 이 공정은 목적하는 항체를 생산하는 B-림프구로 세포주를 무한증식시키는 융합 과정을 포함한다. 대안적으로, 무한증식 항체-생산 세포주를 발생시키는 비-융합 기술, 예를 들어, 바이러스-유도된 형질전환[참조: Casali et al., Science 234:476 (1986)]이 사용될 수 있다. 무한증식 세포주는 대개 형질전환된 포유동물, 특히, 설치류, 소, 및 사람 기원의 골수종 세포이다. 매우 빈번하게, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주는 편리성 및 이용가능성의 문제로 사용된다.

항원이 주입된 포유동물로부터 항체-생산 림프구를 수득하기 위한 기술은 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 사람 기원의 세포가 사용되는 경우, 말초 혈액 림프구(PBLs)가 사용되거나 또는 비장 또는 림프절 세포가 비-사람 포유동물 공급원으로부터 사용된다. 숙주 동물에게 정제된 항원(사람 세포는 시험관 내에서 감작화된다)을 반복된 투여량으로 주입한 다음, 동물이 무한증식 세포주로 융합하기 위해 회수되기 전에 목적하는 항체-생산 세포를 발생하도록 한다. 또한, 융합하기 위한 기술이 당해 분야에 공지되어 있고, 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합제와 세포를 혼합시킴을 포함한다.

하이브리도마는 HAT(하이포크산틴-아미노프테린-티미딘) 선별과 같은 표준 방법으로 선택된다. 바람직한 항체를 분비하는 것들은 웨스턴 블롯팅(Western blotting), ELISA(효소-결합된 면역흡착 검정), RIA(방사면역검정) 등과 같은 표준 면역검정을 사용하여 선택한다. 항체는 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 배지로부터 회수한다[참조: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)].

많은 참조 문헌이 상기 기술을 적용하는데 있어서 안내서를 제공하는데 이용가능하다[참조: Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL., 1982)]. 모노클로날 항체 또한 잘 공지된 파아지 라이브러리 시스템을 사용하여 제조할 수 있다[참조: Huse, et al., Science 246:1275 (1989); Ward, et al., Nature, 341:544 (1989)].

이렇게 제조된 항체는, 폴리클로날 또는 모노클로날에 상관없이, 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 개 TSLP 단백질을 정제시키기 위한 잘 공지된 방법에 의해 고체 지지체에 결합된 고정 형태로 사용될 수 있다.

개 TSLP 단백질에 대한 항체도 또한 표준 방법에 의해 개 TSLP 단백질을 검출하거나 정량화하기 위한 면역검정에 대한 기본으로서 사용되거나, 표지되지 않거나 또는 표지될 수 있다. 사용된 특정 표지는 면역검정 유형에 좌우될 것이다. 사용할 수 있는 표지의 예는 ³²P, ¹²⁵I, ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사선표지; 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실 및 움벨리페론과 같은 형광성 표지; 루시페리아 및 2,3-디하이드로프탈라진디온과 같은 화학발광체; 및 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제, 라이소자임 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 효소를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

항체는 공지된 방법에 의해 이러한 표지들로 태그시킬 수 있다. 예를 들어, 알데하이드, 카보디이미드, 디말레이미드, 이미데이트, 석신이미드, 비스디아조화된 벤자딘 등과 같은 커플링제를 사용하여 항체를 형광성, 화학발광성 또는 효소 표지로 태그시킬 수 있다. 포함된 일반적인 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Immunoassay: A Practical Guide, 1987, Chan (Ed.), Academic Press, Inc., Orlando, FL]에 기술되어 있다. 이러한 면역검정은 예를 들면, 수용체를 정제시키는 동안 수득된 분획상에서 수행할 수 있다.

본 발명의 항체를 또한 사용하여 발현 클로닝 시스템에서 개 TSLP 단백질을 발현시키는 특정 cDNA 클론을 동정할 수 있다. 또한, 수용체의 리간드-결합 부위에 대해 특이적인 중화 항체를 길항제(억제제)로서 사용하여 개 TSLP 단백질 기능을 차단하거나 하향조절할 수 있다. 이러한 중화 항체는 통상의 실험을 통하여 용이하게 확인할 수 있다.

개 TSLP 단백질 활성의 길항작용은 완전한 항체 분자, 또는 Fab, Fc, F(ab)₂, 및 Fv 단편과 같은 공지된 항원 결합 단편을 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 단편의 정의는 상기 기술되어 있거나, 또는 예를 들면, 문헌[참조: Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982); Parham, Chapter 14, in Weir, ed. Immunochemistry, 4th Ed. (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986)]으로부터 찾을 수 있다. 항체 단편, 예를 들면, Fab 단편[참조: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)], Fv 단편[참조: Hochman et al., Biochemistry 12:1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15:1591 (1976); Ehrlich et al., 미국 특허 제4,355,023호] 및 항체 절반 분자(antibody half molecules)(참조: Auditore-Hargreaves, 미국 특허 제4,470,925호)의 사용 및 생성은 또한 기술되어 있다. 공지된 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 기초로 하여 재조합체 Fv 단편을 제조하는 방법은 또한 문헌[참조: Moore et al. (미국 특허 제4,642,334호) 및 Pluckthun [Bio/Technology 9:545 (1991)]에 기술되어 있다. 또한 이들은 표준 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명은 또한 항원으로서 상기 기술한 항체를 사용하여 제조된 폴리클로날 및 모노클로날 둘다의 항-유전자형 항체를 포함한다. 이러한 항체는 리간드의 구조를 모사할 수 있으므로 유용하다.

비-개 포유동물 또는 비-개 하이브리도마 시스템으로부터 발생한 항체는 개에게 주입되는 경우, 즉, 개화될 수 있는 경우, 실질적으로 비항원으로 표현하기 위해서 임의로 가공될 수 있다. 사람에게 치료학적 투여를 위해 덜 면역원이도록 하는 동물로부터의 모노클로날 항체를 변형시키는 방법(사람화)은 적극적으로 추구되어 왔으며, 다수의 공보[예를 들어, Antibody Engineering : A practical Guide. Carl A.K. Borrebaeck ed. W. H. Freeman and Company, 1992; Reichman, L. et al., "Reshaping human antibodies for therapy", Nature 332: 323-327 (1988)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-개 포유동물의 모노클로날 항체, 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체는 수용체 숙주에 대해 표준 쥐 모노클로날 항체보다 덜 면역적으로 보여지는 항체를 달성하기 위해서, 개 항체 또는 이의 서열로 키메라화한다. [참조: 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,593,861호, "Dog-Mouse Heterohybridoma and Gene Fragment Coding for Constant Region of Canine Immunoglobulins"].

또한, 와써맨(Wasserman) 및 카프라(Capra)[참조: [Biochem. 16: 3160 (1977)]는 개 IgM 및 개 IgA 중쇄 둘 다의 가변 영역의 아미노산 서열을 측정하였다. 또한, 이들은 개 IgA로부터 카파 경쇄 아미노산 서열을 측정하였다[참조: Wasserman and Capra, Immunochem. 15: 303 (1978)]. 맥컴버(McCumber) 및 카프라[참조: Mol. Immunol. 16: 565 (1979)]는 개 mu 쇄의 완전한 아미노산 서열을 기재하였다. 탕(Tang) 등[참조: Vet. Immunology lmmunopathology 80: 259 (2001)]은 단일 개 IgG-A 감마 쇄 cDNA 및 4개의 개 IgG-A 감마 쇄 단백질 서열을 기재하였다. 탕 등[상기 참조]은 또한, 사람, 마우스, 피그, 및 소 IgG의 보존 영역으로부터 고안된 변성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 가진 개 비장 cDNA 라이브러리의 PCR 증폭을 기재하였다. 또한, 크라(Krah) 등[참조: 본원에 참조로 혼입되고, 2004년 9월 16일자로 공개된 미국 특허 공보 제20040181039호]은 비-개 항체를 개화(caninizing)하기 위한 하나의 방법을 자세히 기재하였다.

개 TSLP 유전자의 분리

A. 초기 시도

개 TSLP를 동정하는 초기의 시도는 BLAT(캘리포니아 산타 크루즈 대학교, 퍼블릭 게놈 데이터베이스)로부터 수집된 랫트, 침팬지 및 레서스(Rhesus) TSLP cDNA 서열과 함께, 클로닝된 사람, 및 마우스 TSLP cDNA 서열의 서열 정렬을 기준으로 하였다. 침팬지 TSLP는 아미노산 수준에서 사람 TSLP와 100% 동일하지만, 레서스 TSLP는 성숙한 단백질에서 사람 TSLP와 90% 이상 상동성(12/151 잔기가 상이함)을 갖는다. 그러나, 사람 및 비-사람 영장류 TSLP 단백질 및 cDNA 서열은 쥐 TSLP 서열과 매우 상이하다. 사람 및 마우스 TSLP cDNA 서열은 단지 43%의 상동성을 포함하고, 이들 종 사이의 낮은 스트린젠시(stringency) 교차-종 하이브리드화를 통한 클로닝을 허용하지 않는다. 또한, 랫트 TSLP 서열은 마우스 TSLP와 비교하여 성숙한 단백질의 아미노산 잔기 서열 중의 39/121 변화를 나타내었고, 이는 심지어 가깝게 관련된 쥐 종들 사이의 TSLP 서열도 상당히 상이함을 나타낸다.

불행하게도, 본원에 기재된 바와 같이, 개 TSLP 서열은 또한, 별개의 쥐 및 유사 영장류 서열 모두와 상이함이 입증되었다. 따라서, 낮은 스트린젠시 교차-종 하이브리드화를 통해 개 TSLP를 수득하는 것이 성공적이지 않음이 입증되었다. 실제로, 사람, 마우스, 랫트, 및 원숭이 서열 정보를 사용하는 네스트 PCR 방법(nested PCR strategy)에서의 개 TSLP 올소로그를 클로닝하려는 시도에서 고안되어진 프라이머는 심지어 개 TSLP에 상응했던 단일 밴드로 동정하는데 실패하였다.

B. 개 TSLP 유전자의 성공적인 분리

이용가능하도록 수집된 개 게놈 데이터베이스[게놈 샷건(shotgun) 서열분석법으로부터 유도됨; 산타 크루즈(Santa Cruz), 캘리포니아 대학에 의해 공지되어 이용가능함)를 사람 TSLP 서열과 조사하여 개 TSLP의 엑손(exon) 1 및 4의 부분 동정을 유도시켰다. 간결하게는, 상당한 서열 상동성의 몇가지 히트(hit)를 초기 조사에서 동정하였다(참조: 하기 "히트" 1 내지 6). 이의 서열을 수집한 다음, 개 TSLP 유전자의 일부 전기적 서열을 연장하고 수집하기 위한 쿼리(query)로서 사용하였다.

히트 1:

스코어 = 60.8 비트 (146), 예상치 = 1e-08

동질성 = 33/58 (56%), 파지티브 = 39/58 (67%), 갭(Gap) = 1/58 (1%)

서열 102: 사람 TSLP

서열 103; >gi|36323560|gb|AACN010632090.1 | 개 파밀리아리스(Canis familiaris)

ctg19866851299046, 총 게놈 샷건 서열 길이 = 1007

히트 2:

스코어 = 59.7 비트 (143), 예상치 = 3e-08

동질성 = 30/42 (71%), 파지티브 = 33/42 (78%)

프레임 = -1

서열 104: 사람 TSLP

서열 105 >gi | 36314527|gb|AACN010674832.1 개 파밀리아리스

ctg19866851282529, 총 게놈 샷건 서열 길이 = 963

히트 3:

스코어 = 42.0 비트 (97), 예상치 = 0.006

동질성 = 21/44 (47%), 파지티브 = 27/44 (61 %)

프레임 = -2

서열 106: 사람 TSLP

서열 107 >gi|36442813|gb|AACN011084208.11 개 파밀리아리스

ctg19866851499233, 총 게놈 샷건 서열 길이 = 370

히트 4:

스코어 = 38.9 비트 (89), 예상치 = 0.047

동질성 = 15/32 (46%), 파지티브 = 22/32 (68%)

판독 프레임 = +1

서열 108: 사람 TSLP

서열 109 >gi|36211043|gb|AACN010354273.1 | 개 파밀리아리스

ctg19866851087147, 총 게놈 샷건 서열 길이 = 1369

히트 5:

스코어 = 42.0 비트 (97), 예상치 = 0.006

동질성 = 21/44 (47%), 파지티브 = 27/44 (61 %)

판독 프레임 = -2

(서열 110 : 사람 TSLP

서열 x111 >gi|36211043|gb|AACN010354273.1 | 개 파밀리아리스

ctg19866851087147, 총 게놈 샷건 서열 길이 = 1369

히트 6:

스코어 = 38.9 비트 (89), 예상치 = 0.047

동질성 = 15/32 (46%), 파지티브 = 22/32 (68%)

프레임 = +1

서열 112: 사람 TSLP

서열 113: >gi|36211043|gb|AACN010354273.1 | 개 파밀리아리스

ctg19866851087147, 총 게놈 샷건 서열 길이 = 1369

사람, 원숭이, 랫트 및 마우스 TSLP로 전자적으로 작제된 서열을 비교하여, TSLP의 개 올소로그의 일부로서 이 서열을 확인하면서, 보존된 인트론(intron)/엑손 경계 및 실질적 서열 동질성을 입증하였다. PCR 프라이머는 이러한 발견을 기초로 이후에 고안되었으며, 유전자의 결실된 세그먼트를 증폭하는데 사용되었다. 2개의 부분 오버랩핑 클론은 개 활성화된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) cDNA 라이브러리로부터 더블 네스트(double nest) PCR로 수득하였다. 네스트 PCR로 전체 개 TSLP cDNA를 여는 추가의 시도 또는 5' 또는 3' 말단을 향해 서열을 연장하도록 시도하는 것이 성공적이지 않았다. 그러나, 이러한 클론으로부터 연장된 서열 정보를 사용하여, 상기한 라이브러리로부터 순수한 DNA 서열과 매뉴얼 조합으로 합해진 개 전체 게놈 샷건 서열 데이터(캘리포니아 산타 크루즈 대학교) 상의 데이터베이스 검색을 반복적으로 하여 전장 개 TSLP cDNA의 전기적 조합을 이끌었다. 이어서, cDNA 서열의 물리적 클론을 시험관내에서 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.

결과적으로, 당해 분야의 분자 클로닝 기술의 흐름 및 상태를 사용하여, 사람, 마우스, 랫트 또는 원숭이 서열로부터 직접적으로 개 TSLP 서열을 유도하는 것이 불가능하였다. 수집된 사람, 마우스, 랫트 및 NHP TSLP 유전자를 사용하고, 분자 PCR 클로닝 기술과 합해진, 게놈 데이터베이스 상의 인트론/엑손 경계 수행 및 서열 동질성을 사용하는 복잡하게 반복되는 데이터베이스 검색은 개 TSLP를 암호화하는 유전자의 확인을 이끌었다.

일단 수득되면, 개 TSLP는 성숙한 사람 TSLP 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 58/132 변화(61% 동질성)를 나타내고, 성숙한 마우스 TSLP 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 83/129 변화(33% 동질성)를 나타낸다(아래 참조).

개 파밀리아리스(Canis familiaris) 및 사람 TSLP 성숙한 단백질 사이의 서열 비교

스코어 = 167 비트 (423), 예상치 = 1e-40

동질성 = 85/139 (61%), 파지티브 = 101/139 (72%)

서열 114: 개 파밀리아리스 TSLP

서열 115: 사람 TSLP

개 파밀리아리스 ( Canis familiaris ) 및 쥐 TSLP 성숙한 단백질 사이의 서열 비교

스코어 = 72.0 비트 (175), 예상치 = 7e-12

동질성 = 46/138 (33%), 파지티브 = 67/138 (48%), 갭 = 8/138 (5%)

서열 116: 개 파밀리아리스 TSLP

서열 117: 마우스 TSLP

따라서, 앞서 기재한 난점을 극복함으로써, 본 발명은 현재 개 TSLP를 암호화하는 DNA 서열 및 암호화된 개 TSLP 단백질을 제공한다. 개 TSLP 단백질 및 이의 특정 단편은 단백질 상의 다양한 에피토프, 선형 및 입체형태적 에피토프 둘 다에 대한 항체를 생산하기 위한 유용한 항원(예를 들어, 면역원)이다. 또한, 개 TSLP를 암호화하는 DNA는, 백신접종된 동물의 세포에서의 TSLP를 발현하는데 적합한 동물 바이러스 벡터 또는 플라스미드의 형태 또는 "나형(naked)" DNA로서든지 상관없이, 면역화 및/또는 조사 시약으로서 TSLP 단백질을 생산하기 위한 벡터 및 숙주 세포를 제공하고, 항-TSLP 항체를 생산하는 DNA-기초 백신을 제공하는데 유용하다.

이에 따라 수득된 개 TSLP 유전자 서열은 도 8A(서열 1)에 나타내어지고, 예상 발현된 TSLP 단백질은 도 8B(서열 2)에 나타내어진다. 잔기 1 내지 28은 시그날 서열을 나타내고, 잔기 29 내지 155는 성숙한 단백질을 나타낸다.

동종 TSLP 단백질을 동정하기 위한 검정

또한, 본 발명은 28개 아미노산 잔기 시그날 서열을 배제하는 서열 2의 아미노산 서열에 대해 80% 이상 동질성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TSLP 단백질을 제공하고, 여기서, 이를 백신으로서 개에게 투여하는 경우, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 개 TSLP 단백질을 결합하는 항체를 생산한다. 이러한 TSLP 단백질의 항원 단편이 또한 제공된다.

실제로, 잠정적 TSLP 단백질이 본 발명의 TSLP임을 증명하는 하나의 방법은, 이러한 단백질이 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 개 TSLP에 결합하는 항체를 생성할 수 있는지를 시험하는 것이다. 하나의 이러한 방법은 잠정적 TSLP-GST 항원의 5 내지 500μg의 범위의 다양한 용량으로 개를 백신접종(예: 주사)하는 것이다. 이러한 항원은 리하이드로겔(Rehydrogel)과 같은 수산화알루미늄-계 항원보강제 중에 제형화될 수 있다. 이어서, 0일, 21일, 및 42일째에 개에게 3회 근육내로 주사한다. 혈청 샘플을 0일, 21일, 42일, 및 63일째에 백신접종된 개 및 대조군(백신접종되지 않은) 개로부터 수집한다.

항원으로 백신접종된 개 중의 항체의 유도는 다음과 같은 ELISA 검정으로 평가할 수 있다: 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 개 TSLP 단백질은 피복 완충제(중탄산나트륨 pH 9.0) 중에 5㎍/ml로 희석한 다음, 96 웰 플레이트(제조원: Pierce)의 100㎕/웰에서 현탁시킨다. 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리시킨다. 이후, 플레이트를 0.05% Tween-20(PBST)을 함유하는 인산 완충용 염수로 3회 세척한다. 이어서, 차단 완충액(PBST 중의 2% 탈지유) 200㎕를 각 웰에 가한 다음, 플레이트를 60분 동안 실온에서 항온처리한다. 이어서, 플레이트를 PBST로 3회 세척한다. 이후, 시험 개 항혈청 1:100 희석액 중의 100㎕/웰을 적절한 웰의 맨 윗줄에 가한다. 이어서, 혈청 샘플을 적절한 플레이트 위치에 10배 희석시킨다. 실온에서 60분 동안 플레이트를 항온처리한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척한다.

이후, 고트 항-개 IgG[제조원: 베틸 래보러토리스(Bethyl Laboratories)]를 결합한 홀스-래디쉬 퍼옥시다제(horse-radish peroxidase)의 1:20,000 희석액의 100㎕/웰을 각각의 웰에 가한다. 이어서, 플레이트를 실온에서 60분 동안 항온처리한다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 다음, TMB 기질[3,3', 5,5' 테트라메틸 벤지딘, 제조원, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 코포레이티드(Sigma chemical co.)] 100㎕/웰을 모든 웰에 가한다. 50㎕/웰의 0.18M 황산을 가함으로써 정지되기 직전에 실온에서 10 내지 20분 동안 색 반응이 발현되도록 둔다.

모든 웰의 흡광도(O.D)를 ELISA 플레이트 판독기[제품명: 써모 맥스(Thermo Max), 제조원: 미국 캘리포니아 써니배일 소재의 몰레큘러 디바이스(Molecular Device)]를 사용하여 파장 450nm에서 측정한다. 잠정적 TSLP 항원을 주사한 개에게서 수득한 혈청 샘플은 검출가능한 것으로 고려되고, 이로써, 검정이 O.D를 생산하는 경우, 면역화되기 직전에 개로부터 수득한 혈청 샘플에 의해 생산되는 배경과 동등하거나 또는 3배 이상의 값인 경우, 항원은 본 발명의 TSLP 단백질로서 확인된다. 유사하게, TSLP 항원에 대한 상대적 항체 역가는 O.D를 생산하는 최고 혈청 희석액을 기준으로 하여 측정할 수 있다. 값은 항원으로 면역화시키기 직전 개로부터 수득한 혈청 샘플에 의해 생산한 배경과 동등하거나 또는 3배 이상이다.

개 TSLP 단백질의 특이적 에피토프에 대한 항체

항체는 자연적으로 발생하는 형태 및 재조합 형태 둘 다에서, 종, 다형, 또는 대립 변이체를 포함하는 개 TSLP 단백질의 다양한 에피토프, 및 이의 단편으로 생산할 수 있다. 추가로, 항체는 자연 또는 변성된 버전을 포함하는 활성 형 또는 불활성 형으로 개 TSLP로 생산할 수 있다. 항-유전형 항체가 또한 고려된다.

항원의 미리예정된 단편에 대해, 결합 단편 및 일본 쇄 버젼을 포함하는 항체는 당해-표준 항원보강제와 함께, 및/또는 면역원성 단백질에 접합시킨 개 TSLP 및/또는 이의 단편을 가진 동물을 면역화함으로써 생산할 수 있다. 이렇게 면역화된 동물은 개 TSLP 활성을 하향조절하기 위해서 면역화되는 개일 수 있다.

적절한 숙주, 예를 들어, Balb/c와 같은 마우스의 근교배 균주는 전형적으로, 표준 항원보강제, 및 표준 마우스 면역 프로토콜(참조: 상기한 Harlow 및 Lane)을 사용하여 선택된 단백질을 면역화시킨다. 항원보강제는 백신의 투여 전에, 투여와 함께, 또는 투여 후에 표적 동물에 투여될 수 있다.

대안적으로, 본원에 기재된 서열로부터 기원하고, 담체 단백질에 접합된 합성 펩타이드는 면역원으로 사용될 수 있다. 폴리클로날 혈청을 수집한 다음, 면역검정(예를 들면, 고체 지지체 상에 상기 면역원을 고정시킨 고체상 면역 검정)에서 상기 면역원 단백질에 대한 역가(titer)를 구한다. 역가가 1 x 10⁴ 이상인 폴리클로날 항혈청을 선택한 후, Harlow 및 Lane(상기 참조, pp.570-573)이 기술한 바와 같은 결합 경쟁 면역 검정(competitive binding immunoassay)을 이용하여, 기타의 IL-7 군 구성원(예를 들면, 설치류 IL-7)에 대한 교차 반응성을 시험한다. 바람직하게는, 이러한 결정에 하나 이상의 기타 IL-7 군 구성원을 예를 들어, 영장류 IL-7과 결합하여 사용한다. IL-7 군 구성원은 재조합 단백질로서 생산하고, 본원에 기재된 바와 같이 표준 분자 생물학 및 단백질 화학 기술을 사용하여 분리시킬 수 있다.

경쟁 결합 형식 중의 면역검정은 교차반응성(crossreactivity) 결정을 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 서열 2의 단백질은 고체 지지체에 고정될 수 있다. 검정에 가해진 단백질은 고정된 항원에 대한 항혈청의 결합과 경쟁한다. 고정된 단백질에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 상기한 단백질의 능력은 서열 2의 아미노산 생성을 포함하는 단백질과 비교된다. 상기한 단백질에 대한 교차 반응성 비율은 표준 계산법을 사용하여 계산한다. 상기 나열된 각각의 단백질과 10% 미만 교차반응성을 갖는 항혈청을 선택하고, 모은다. 이후에, 교차-반응 항체를 상기 나열한 단백질과 면역흡수시켜 모은 항혈청으로부터 제거한다.

이어서, 면역흡수되고 모은 항혈청을 상기한 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정에 사용하여 면역원성 단백질(서열 2의 IL-7 유사 단백질)을 제2 단백질과 비교한다. 이러한 비교를 수행하기 위해서, 2개의 단백질을 넓은 범위의 농도에서 각각 검정한 다음, 고정된 단백질에 대한 항혈청의 결합의 50%를 억제하도록 요구되는 각각의 단백질의 양을 결정한다. 요구되는 제2 단백질의 양이, 요구되는 단백질 또는 선택되는 단백질의 단백질 양의 2배 미만인 경우, 제2 단백질은 면역원에 대해 발생한 항체에 특이적으로 결합한다고 한다.

본 발명의 항체는 또한, 진단 용도에서 유용할 수 있다. 포획 또는 비-중화 항체로서, 수용체에 대한 결합을 억제하지 않고 항원에 결합하는 능력을 위해 스크리닝할 수 있다. 중화 항체로서, 이들은 경쟁 결합 검정에서 유용할 수 있다. 이들은 또한, 개 TSLP 단백질 또는 이의 수용체를 정량하거나 또는 검출하는데 유용할 것이다. [참조: 예를 들어, Chan (ed. 1987) Immunology : A Practical Guide , Academic Press, Orlando, FIa.; Price and Newman (eds. 1991) Principles and Practice of Immunoassay , Stockton Press, N.Y.; 및 Ngo (ed. 1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, N. Y.]. 교차 흡수, 결손, 또는 다른 수단이 정의된 선택성, 예를 들어, 유일하거나 또는 분배된 종 특이성의 제제를 제공할 것이다. 이들은 항원의 다양한 그룹을 동정하는 시험을 위한 기초가 될 수 있다.

또한, 본 발명의 항원 결합 단편을 포함하는 항체는 항원에 결합하는 잠재적 길항제일 수 있고, 예를 들어, 생물학적 반응을 유도할 수 있는 수용체에 대한 기능적 결합을 억제할 수 있다. 또한, 이들 항체는 직접 또는 링커로 간접적으로 다른 치료학적 제제 또는 약물과 결합할 수 있고, 약물을 표적화할 수 있다.

본원에 기재된 서열로부터 기원하고, 담체 단백질에 대해 접합한 합성 펩타이드는 면역원으로 사용될 수 있다. 특정 경우에, 항원 단편은 면역원으로 사용되는 융합되거나 또는 공유결합으로 결합된 폴리펩타이드로서, 다른 물질, 특히 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 항원 및 이의 단편은 키홀 림펫 헤모시아닌, 소혈청알부민, 파상풍 독소 등과 같은 다양한 면역원에 융합되거나 또는 공유결합적으로 결합될 수 있다. 참조: 폴리클로날 항혈청을 제조하는 방법이 기재된, Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions , Dover Publications, New York; Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistrv, vol. 1, Academic Press, New York; 및 Harlow and Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, CSH Press, NY.

몇몇의 예에서, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등과 같은 다양한 포유동물 숙주로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하는 기술의 기재는 다음 문헌[참조: 모노클로날 항체를 생성시키는 하나의 방법을 나타내고 있는, Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 및 이에 인용된 문헌; Harlow and Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies : Principles and Practice (2d ed.), Academic Press, New York; 및 특히, Kohler and Milstein (1975) in Nature 256:495-497]에서 찾을 수 있다.

다른 적절한 기술이 시험관 내에서 항원 폴리펩타이드에 대한 림프구의 노출 또는 대안적으로는 파지 또는 유사 벡터에서 항체의 라이브러리의 선택에 관여한다 [예를 들어, 참조: Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; 및 Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546.]. 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체는 키메라, 개화된, 및/또는 사람화된 항체를 포함하는, 변형 없이 또는 변형시켜 사용할 수 있다.

종종, 검출가능한 시그날을 제공하는 물질을 결합시킴으로써, 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체를 표지화시킨다. 이러한 결합은 공유적 또는 비공유적으로 성취할 수 있다. 매우 다양한 표지 및 접합 기술이 알려져 있으며, 과학 문헌 및 특허 문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 적합한 표지로는, 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제인자, 형광 잔기, 화학주성 잔기, 자기 입자 등이 포함된다. 이러한 표지의 이용을 나타내는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,227,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한, 재조합 면역글로불린 또는 키메라 면역글로불린을 제조할 수 있거나[참조: Cabilly, 미국 특허 제4,816,567호; Moore 등, 미국 특허 제4,642,334호; 및 Queen 등 (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:10029-10033] 또는 유전자삽입 마우스[참조: Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15 146-156]에서 제조할 수 있다. 이들 문헌은 참조로 본원에 인용되어 있다.

또한, 본 발명의 항체는, 상기 단백질의 분리시 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 상기 항체가 고형 지지물에 결합하는 칼럼을 제조할 수 있다[참조: 예를 들면, Wilchek 등 (1984) Meth. Enzymol. 104:3-55]. 대안적으로, 고체 지지체에 결합된 항원을 사용하여 상응하는 항체를 정제할 수 있다.

또한, 각각의 개 TSLP에 대해 생성된 항체는, 항-유전형 항체를 생성하는 데에 유용할 것이다. 이러한 항체는, 각 항원의 발현과 관련된 다양한 면역학적 조건들을 검출 또는 진단하는 데에 유용할 것이다.

RNA 억제

개 TSLP를 생산하는 세포 중의 개 TSLP를 암호화하는 RNA와의 간섭(interference)은 TSLP의 생물학적 활성을 억제하는 추가의 수단이고, 결과적으로, 아토피성 피부염과 같은 다수의 TSLP-관련된 장애를 치료하는 수단이다. 이러한 목적을 위해, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 적절한 전달 벡터 내의 화학적으로 합성되거나 또는 클로닝된 이본쇄 RNA 분자는 TSLP를 암호화하는 내인성 mRNA 수준을 감소시키는 목표와 함께 TSLP mRNA를 활성적으로 생산하는 세포 내로 도입시킬 수 있다. 이들 RNA 분자의 도입(외인적으로 전달된 분자 또는 RNA 전사 후, 목적하는 세포 내로 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 도입하는 경우) 이후에, siRNA로 불리우는 짧은 뉴클레오타이드 단편 내로 리보뉴클레아제 III형 단백질의 분할 활성을 통하여 수행된다. 이들 siRNA 단편은 RISC(RNA-유도된 사일런싱 복합체)로 불리우는 뉴클레아제-함유 다-단백질 복합체 내로 혼입되고, RNA 헬리카제의 활성을 통해 이중 siRNA의 풀기(unwinding) 결과로서 활성화된다. 현재 일본쇄 siRNA 쇄는 표적 mRNA에 대한 RISC 복합체를 안내하고, 이어서, 분할된 다음, 결과적으로, RISC의 엔도뉴클레아제 활성에 의해 분해된다.

보다 특히, TSLP 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 플라스미드는 다수의 상업적으로 이용가능한 진핵 플라스미드 중의 하나에서 클로닝되고, TSLP 유전자 또는 이의 단편의 전사는 적절한 프로모터, 예를 들어, CMV 또는 SV40 프로모터로 구동된다. 이어서, 정제된 플라스미드 DNA(1 내지 100 ug)를 아토피성 피부염으로 특징되는 피부 병변 또는 주위 영역 내로 주사한다. TSLP mRNA 중의 상당한 감소를 유발하는데 필요한 횟수로 플라스미드 DNA의 주사를 반복시킬 수 있다. 상기 감소는 감염된 영역의 피부 생검을 수득하고, 정량적 PCR과 같은 방법에 의한 TSLP mRNA의 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다.

본 발명의 다음 제조적 실시예는 본 발명의 추가의 이해를 제공하는 역할을 하지만, 본 발명의 유효한 범위를 어떠한 방식으로라도 제한하려는 의미는 아니다.

실시예 1

개 TSLP DNA 및 단백질 서열

개 TSLP를 발현하는 개 유전자는 위에서 자세하게 기재한 바와 같이, 전기 데이터베이스에서 수집한 데이타를 사용하는 반복되는 과정 및 분자 생물학 방법을 사용하여 동정하였다.

결과

개 TSLP 유전자 서열은 도 8A(서열 1)로 나타내고, TSLP 단백질을 발현하는 예상 단백질은 도 8B(서열 2)로 나타낸다. *로 표시된 도 8B(서열 2)의 잔기 1 내지 28번은 시그날 서열을 나타내고, 잔기 29 내지 155번은 성숙한 단백질을 나타낸 다.

실시예 2

개 TSLP의 클로닝 및 발현

개 TSLP를 암호화하는 DNA를 본원에 기재된 바와 같이 동정한 다음, 당해 표준 방법 pDONR221[제조원: 인비트로겐 게이트웨이 시스템(Invitrogen Gateway System)] 공여자 벡터 내로 클로닝하였다. 유전자 조립 및 공여자 벡터 내로의 클로닝을 DNA 2.0으로 명명되는 임상시험수탁기관에서 수행한 다음, 동정시킨 게놈 개 TSLP 유전자를 함유하는 pDONR221.G03276으로 명명되는 플라스미드를 작제하였다. 성숙한(즉, 시그날 서열 없음) 개 TSLP 단백질을 암호화하는 DNA는 Nco I 및 EcoR V 영역을 각각 함유하는 2개의 프라이머를 사용하여 pDONR221.G03276으로부터 PCR-증폭되었다.

프라이머

#1: 5' AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACTGTGAC-3' (서열 4); 및

#2: 5'-AAAATAGATATCTGAAATGCGACTGAAACGACG-3' (서열 5).

Nco I 및 EcoR V 분해시킨 후, PCR 생성물을 벡터 pIVEX 1.3 WG[제조원: 로슈 어플라이드 사이언시스(Roche Applied Sciences), 제품번호 3728803]의 Nco I 및 Sma I 부위 내로 삽입시켰다. 이는 C-말단에서 6개의 His 잔기("His6 tag")와 융합된 성숙한 개 TSLP를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 생성시켰다. 삽입체의 코렉트 서열(correct sequence)을 함유하는 플라스미드를 플라스미드 1265-93.D로 명명하였다. 플라스미드 1265.93.D는 제조업자의 권고사항(제조원: 로슈 어플라이드 사이언시스, 제품번호 3064859)에 따라, RTS 프로테오마스터 인스트루먼트에서 TSLP를 발현하는데 사용되어졌다. 도 1에서 도시된 바와 같이, @16 kDa의 밴드는 레인 2 및 4(화살표)에서 명백해졌다. 웨스턴 블롯 실험(도 2A 및 도 2B 참조)은, 상기 밴드가 항-His 태그 항체(도 2A 참조), 및 사람 TSLP에 특이적인 랫트 모노클로날 항체(도 2B 참조)에 특이적으로 반응하였음을 나타낸다.

실시예 3

숙주 세포로부터의 개 TSLP 의 생산

이. 콜라이에서 재조합 TSLP 단백질을 발현하기 위해서, cTSLP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 시그날 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 결여하고 있는 TSLP)을 NcoI 및 Hind III 부위를 각각 함유하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머와 함께, 주형으로서 플라스미드 1265-66C를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.

정방향 프라이머

5'-AATAATCCATGGCATACAATTTCATTGACTGTGAC-3 (서열 6)

역방향 프라이머

5'-ACATAAAAGCTTTGAAATGCGACTGAAACGACG-3' (서열 7)

Nco I 및 Hind III 분해 후, PCR 생성물을 pET42b(+) 발현 벡터[제조원: 노바겐(Novagen)]의 NcoI/HindIII 부위 내로 삽입시켰다. 상기 과정을 N 말단에서는 GST 태그와 융합되고 C 말단에서는 6xHis 태그와 융합된 성숙한 cTSLP를 암호화하는 플라스미드를 생성하였다. 삽입체의 코렉트 서열을 함유하는 플라스미드는 1265-93B로서 명명된다. GST-TSLP-His 융합 단백질의 발현은 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)-유도가능한 lacUV5 프로모터의 조절하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)/pLysS에서 수행하였다. 플라스미드 1265-93B를 수반하는 이. 콜라이 세포는 30℃에서 0.6의 O.D 600으로 성장한 이후에, 단백질 발현을 0.5mM IPTG를 가하고, 추가로 30℃에서 2시간 동안 배양하여 유도하였다. SDS-PAGE는 가용성 이. 콜라이 분획에 존재하는 코렉트 사이즈(약 61 kDa)를 가진 단백질 밴드(화살표)를 나타낸다(도 3A 참조). 웨스턴 블롯은, 발현된 단백질이 항-GST 항체와 반응하였음을 나타낸다(도 3D 참조). GST-TSLP-His 단백질은 글루타티온 세파로스 4B 수지로 정제할 수 있다.(도 3B 참조). Ni-NTA 수지로 추가 정제시킨 후, GST-TSLP 단백질의 대부분은 (도 3C)를 거쳐 칼럼 유동물 중에 함유된다.

실시예 4

개 TSLP 의 면역형광 검출

개 피부 및 편도 조직 중의 개 TSLP 단백질의 발현은 사람 TSLP 단백질에 대해 생성된 래빗 폴리클로날 항체를 사용하여 면역조직화학("IHC")으로 측정되었다. 면역조직화학은 아토피성 피부염, 피부홍반성루프스, 다형홍반, 및 연접부수포성표피박리증을 포함하는 다양한 피부 질환으로 진단되는 개의 피부 및, 염수가 주사된 정상적인 개 피부로부터 수득한 파라핀-매봉된 조직 블록에서 수행되었다. 또한, TSLP 단백질 발현은 2마리의 개로부터의 냉동된 편도 조직에서 측정되었다. IHC에 의한 TSLP 발현을 측정하기 위한 과정은 다음과 같다:

I. 단면의 제조:

1. 매봉된 피부 샘플을 가진 파라핀 블록을 5 내지 7 마이크론의 두께로 단면화하고, 부착을 촉진하도록 폴리-L-리신으로 처리한 슬라이드 상에 두었다.

2. 단면을 크실렌으로 탈-파라핀화시킨 다음, 일련의 에탄올 용액으로 재수화시켰다.

3. 항원 회수를 시트르산 완충액[실험실 극초단파를 사용하여 약 99 내지 100℃에 도달하도록 25분 동안 0.5ml/리터의 농도에서 Tween-20을 함유하는 10mM 시트르산 나트륨] 속에서 수행하였다. 이 과정은 파라핀-매봉 과정 동안에 차폐되는 조직 단면의 항원성을 회복하는 과정이다.

II. 면역염색:

1. 단면을 항체의 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 실온에서 1시간 동안 인산염 완충 용액(PBS) 중에 희석된 10% 정상 돈키 혈청 중에 배양하였다.

2. 과량의 혈청을 조심히 제거한 다음, 단면을 PBS 중에 희석된 래빗 항체(1:100)로 덮은 후, 습윤 체임버(chamber)에서 4℃에서 밤새, 또는 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.

3. 이후에, 단면을 조심히 진탕시키면서, PBS 속에서 5분 동안 2회 세정하였다.

4. 과량의 PBS를 조심히 제거한 다음, 단면을 습윤 체임버에서 실온에서 30분 동안 PBS 중의 1:5000으로 희석된 바이오티닐화된 돈키 항-래빗 IgG 항체로 덮었다.

5. 이후에, 단면을 조심히 진탕시키면서, PBS 중에 5분 동안 2회 세정하였다.

6. 과량의 PBS를 조심히 제거한 다음, 단면을 실온에서 30분 동안 5㎍/ml의 농도에서 PBS 중의 스트렙타비딘-플루오레세인 이소티오시아네이트(스트렙타비딘-FITC) 접합체 속에서 항온처리하였다.

7. 이후에, 단면을 조심히 진탕시키면서, PBS 중에 5분 동안 2회 세정하였다.

8. 이후에, 단면을 2 내지 3분 동안 헤모톡실린으로 역염색하였다.

9. 이후에, 단면을 형광 현미경 하에 검사하였다.

10. 관련 이미지를 촬영하였다.

11. 시험 대조군은 초기 항-TSLP 항체, 또는 초기 항-TSLP 항체를 정상적인 래빗 항체로 대체하는 것의 생략을 포함하였다.

아래 표 1은 IHC 시험의 결과를 요약한다.

다양한 피부 질환을 가진 개로부터의 피부 조직의 파라핀-매봉된 블록 상에서 수행되는 래빗 항-사람 TSLP를 사용한 면역조직화학

질환 상태(블록의 총 수)	파지티브 블록	네가티브 블록
AD 병변 피부 (* n=10)	8	2
PBS를 주사한 정상 피부 (n=5)	1	4
연접부수포성표피박리증 (n=2)	2	0
개 피부홍반성루프스 (n=3)	0	3
다형홍반 (n=3)	2	1
* n=동물의 수

AD로 진단된 개의 피부 조직의 80%에서 TSLP 발현이 검출되었지만, 염수를 주사한 정상적인 피부 조직에서는 단지 20%의 TSLP 발현이 검출되었다. 또한, TSLP는 다형홍반을 가진 개의 조직의 66%, 및 유전적 피부 질환, 연접부수포성표피박리증을 가진 개의 조직의 100%에서 각각 검출되었다. 피부홍반성루프스를 가진 개의 피부 조직에서 TSLP 단백질은 발현되지 않았다. 파라핀-매봉된 피부 조직에서, TSLP의 발현은 땀샘에서 검출되었다. 냉동된 개 편도 조직에서의 TSLP의 발현은 층을 이루는 편평상피 및 관련 침샘에서 검출되었다. 개 피부 샘플에서 파지티브 IHC 염색의 예는 아토피성 피부염으로 진단된 개로부터의 파라핀-매봉된 피부 조직 샘플을 나타내는 도 4에 도시된다.

실시예 6

개 TSLP 의 면역퍼옥시다제 검출

아토피성 피부염으로 진단된 개의 피부로부터 제조된 파라핀-매봉된 조직 블록 중의 개 TSLP 단백질의 발현을 또한, 검출 방법으로서 면역퍼옥시다제 염색을 사용하여 면역조직화학으로 측정하였다. 상기 방법에서, 사람 TSLP 단백질에 대해 생성되는 에피토프-특이적인 랫트 모노클로날 항체는 초기 항체로서 사용되었다. 면역퍼옥시다제 염색으로 TSLP 발현을 측정하는 과정은 다음과 같다:

특별한 시약

정상적인 신생 송아지 혈청: #N-4762 Sigma

파라핀-매봉된 피부 조직

초기 항체: 랫트 항-사람 TSLP mAb 랫트 IgG2a

제2 항체: 래빗 항-랫트 IgG(바이오티닐화된): 미국 캘리포니아주 벌링게임(Burlingame) 소재의 BA-4000 벡터 랩(Vector lab).

검출 시약: 스트렙타비딘-HRP: 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재의 #43-8323 자이메드 랩스(Zymed Labs).

AEC 기질 키트(kit): 미국 샌 라몬 소재의 바이오게넥스(Biogenex) #HK 129-5K.

1. 단면 표본 4 내지 6㎛

2. 실온에서 10분 동안 공기 건조시킨다.

3. 아세톤 중에 10분 동안 고정시킨다.

4. PBS(0.01 인산염 완충된 염수) 중에 3분 동안 세정한다.

5. 0.1% 나트륨 아지드와 함께, 7 내지 10분 동안 0.3% 과산화수소 속에서 항온처리함으로써 퀀칭(quenching)한다.

6. PBS 중에 5분 동안 세정한다.

7. 습윤 체임버에서 20분 동안 1% 정상적인 신생 송아지 혈청으로 단면을 차단한다.

8. 슬라이드를 배액(drain)하고, 실온에서 2시간 동안 1:100 희석액에서 초기 항체를 적용시킨다.

9. 5분 동안 세정한다.

10. 실온에서 습윤 체임버에서 30분 동안 제2 항체(래빗 항-랫트 IgG @ 1:400)를 적용한다.

11. 5분 동안 세정한다.

12. 배액하고, 실온에서 30분 동안 검출 시약(스트렙타비딘-HRP @ 1:400)을 적용한다.

13. 2x5분 동안 세정한다.

14. AEC를 2.5분 동안 적용한다. 목적하는 염색 강도 및 배경에 따라 조절한다.

15. 헤마톡실린으로 역염색한 다음, 계수한다.

AD를 가진 개로부터의 개 피부 조직의 세트를 개 TSLP 항체에 특이적인 에피토프를 사용하여 IHC에 의해 시험하였다. 도 5에서 나타낸 결과는, 상기 항체가 사람 TSLP를 가진 항원성 에피토프를 공유하는 분자와 반응함을 나타낸다. 개 AD 피부 표본의 염색은 표피가 두꺼워지는 만성 염증 영역에서 강하였다. 상기 패턴은 사람 AD 피부 병변에서 TSLP 발현의 위치에 대해 공지된 곳과 일치하며, 추가로, 개 피부 AD 병변 중의 인식된 분자가 개 TSLP임을 제안한다. 상이한 단백질(림프구 단백질)에 대해 특이적인 상이한 랫트 모노클로날 또는 PBS로 염색은 관측되지 않았다.

실시예 7

개 TSLP 의 에피토프 맵핑( mapping )

TSLP 활성을 중화시킬 수 있는 백신에 포함하기 위해 유용한 개 TSLP 상의 에피토프를 동정하기 위해서, 개 TSLP 단백질 서열을 기준으로 하는 오버랩핑 펩타이드의 세트를 합성한 다음, 중화하는 항-사람 TSLP 모노클로날 항체와 반응하는 능력에 대해 시험하였다. 상기한 목적을 위해, 2개의 아미노산에 의해 갈라져 나온 각각의 15개 아미노산 길이의 오버랩핑 펩타이드의 세트를 MIMOTOPES(미국 미네소타주 미네아폴리스)에서 핀 상에서 합성하였다. 이들 펩타이드의 서열은 표 2에서 나열된다. 펩타이드 1 내지 57번은 배열 NH2-PEPTIDE-PIN에서 아미드화된 말단으로 합성하였다. 펩타이드 58 내지 94번(모 펩타이드 1 내지 37번의 중복)는 배열 ACETYL-PEPTIDE-PIN에서 아세틸화된 말단으로 제조되었다.

표 2에서 나열된 펩타이드를 운반하는 핀은 제조업자의 권고 과정[참조: 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 미모토페스(Mimotopes)]에 따라 ELISA 검정 포맷에서 시험되었다. 도 6에서 도시된 바와 같이, 아미노산 서열 NH2-ARIERLTLHRIRGCA(서열 32)을 갖는 펩타이드 # 25(에피토프 25)는 PAB100 모노클로날 항체에 대해 최고 반응성을 갖는다. 상기 펩타이드 서열과 상응하는 추정 사람 TSLP 펩타이드 서열과의 비교는 도 7에 도시되어 있다.

본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 의한 범위로 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기재된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 앞서 기재된 것으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

추가로, 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진, 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이며, 기재를 위해 제공된 것임이 이해되어야 한다.

다양한 공보가 본원에 인용되고, 이러한 기재는 전문이 본원에 참조로 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Schering-Plough Ltd. <120> CANINE THYMIC STROMAL LYMPHOPOIETIN PROTEIN AND USES THEREOF <130> IP-9396 <140> PCT/US2007/025318 <141> 2007-12-11 <150> 60/875,135 <151> 2006-12-14 <160> 118 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 468 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 1 atggtgcctg atgccctgct gagcgtgctg agcgtgttct ttaggaagat cttcgtcttg 60 cagctggtag ggctggtgct aacctacaat ttcattgact gtgactttga gaagattaga 120 tggaagtatc aggaagtcat ttaccaagcc ctggagaaat acatggatgg gaccaggagc 180 acggagttca gccaccccgt gtactgcgcg aacccgcccg actgcctggc caggatcgag 240 cggctcaccc tgcaccgcat ccgcggctgc gcgtcgggcg cccgggaggc cttcgccgag 300 gggacggtcg ccgcgctcgc cgccgagtgc ccgggctacg ccgcagcgcc gataaataat 360 acccaggcaa agaagaaaag aaaaaaaaga ggagtcacaa caaataaatg ccgggaacaa 420 gtcgcacact taatagggct gtggcgtcgt ttcagtcgca tttcatag 468 <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Met Val Pro Asp Ala Leu Leu Ser Val Leu Ser Val Phe Phe Arg Lys 1 5 10 15 Ile Phe Val Leu Gln Leu Val 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 aaaatagata tctgaaatgc gactgaaacg acg 33 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 aataatccat ggcatacaat ttcattgact gtgac 35 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 acataaaagc tttgaaatgc gactgaaacg acg 33 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 8 Tyr Asn Phe Ile Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 9 Phe Ile Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 10 Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 11 Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 12 Glu 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Glu Arg 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 28 Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 29 Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 30 Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 31 Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 32 Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 33 Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 34 Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 35 Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 36 His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 37 Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 38 Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 39 Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 40 Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 41 Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 42 Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 43 Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 44 Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 45 Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 46 Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Ile Asn 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 47 Ala Ala Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Ile Asn Asn Thr 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 48 Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Ile Asn Asn Thr Gln Ala 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 49 Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Ile Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 50 Tyr Ala Ala Ala Pro Ile Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 51 Ala Ala Pro Ile Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys Lys Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 52 Pro Ile Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 53 Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Gly Val Thr 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 54 Thr Gln Ala Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Gly Val Thr Thr Asn 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 55 Ala Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Gly Val Thr Thr Asn Lys Cys 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 56 Lys Lys Arg Lys Lys Arg Gly Val Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 57 Arg Lys Lys Arg Gly Val Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 58 Lys Arg Gly Val Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val Ala His 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 59 Gly Val Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val Ala His Leu Ile 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 60 Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val Ala His Leu Ile Gly Leu 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 61 Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val Ala His Leu Ile Gly Leu Trp Arg 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 62 Cys Arg Glu Gln Val Ala His Leu Ile Gly Leu Trp Arg Arg Phe 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 63 Glu Gln Val Ala His Leu Ile Gly Leu Trp Arg Arg Phe Ser Arg 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 64 Val Ala His Leu Ile Gly Leu Trp Arg Arg Phe Ser Arg Ile Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 65 Tyr Asn Phe Ile Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 66 Phe Ile Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 67 Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 68 Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 69 Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile Tyr Gln Ala Leu 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 70 Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 71 Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys Tyr Met 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 72 Tyr Gln Glu Val Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys Tyr Met Asp Gly 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 73 Glu Val Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys Tyr Met Asp Gly Thr Arg 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 74 Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys Tyr Met Asp Gly Thr Arg Ser Thr 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 75 Gln Ala Leu Glu Lys Tyr Met Asp Gly Thr Arg Ser Thr Glu Phe 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 76 Leu Glu Lys Tyr Met Asp Gly Thr Arg Ser Thr Glu Phe Ser His 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 77 Lys Tyr Met Asp Gly Thr Arg Ser Thr Glu Phe Ser His Pro Val 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 78 Met Asp Gly Thr Arg Ser Thr Glu Phe Ser His Pro Val Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 79 Gly Thr Arg Ser Thr Glu Phe Ser His Pro Val Tyr Cys Ala Asn 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 80 Arg Ser Thr Glu Phe Ser His Pro Val Tyr Cys Ala Asn Pro Pro 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 81 Thr Glu Phe Ser His Pro Val Tyr Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 82 Phe Ser His Pro Val Tyr Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 83 His Pro Val Tyr Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 84 Val Tyr Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 85 Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 86 Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 87 Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 88 Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 89 Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 90 Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly 1 5 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 91 Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg 1 5 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 92 Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 93 His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 94 Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly 1 5 10 15 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 95 Gly Cys Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val 1 5 10 15 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 96 Ala Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 97 Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 98 Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu 1 5 10 15 <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 99 Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro 1 5 10 15 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 100 Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 101 Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala 1 5 10 15 <210> 102 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys Ile Phe Ile Leu Gln Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys 20 25 30 Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr 35 40 45 Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe 50 55 <210> 103 <211> 55 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 103 Leu Ile Ile Cys Ser Val Ser Val Phe Arg Lys Ile Phe Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asn Phe Ile Asp Cys Asp Phe Glu 20 25 30 Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys 35 40 45 Tyr Met Asp Gly Val Ser Glu 50 55 <210> 104 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val 1 5 10 15 Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp 20 25 30 Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln 35 40 <210> 105 <211> 39 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 105 Gln Ile Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Gly Val 1 5 10 15 Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val Ala His Leu Ile Gly Leu Trp 20 25 30 Arg Arg Phe Ser Arg Ile Ser 35 <210> 106 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Leu Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala 20 25 30 Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn 35 40 <210> 107 <211> 44 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 107 Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala 20 25 30 Ala Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Val Ser 35 40 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr 1 5 10 15 Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile 20 25 30 <210> 109 <211> 32 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 109 Thr Pro Gly Cys Gly Ile Cys Ala Lys Glu Ala Ala Ala Leu Gly Trp 1 5 10 15 Phe Cys Ala Leu Ser Val Trp Cys Pro Gly Trp Ala Gln Thr Gln Val 20 25 30 <210> 110 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Leu Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala 20 25 30 Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn 35 40 <210> 111 <211> 44 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 111 Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ser Gly Ala Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala 20 25 30 Ala Glu Cys Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Val Ser 35 40 <210> 112 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr 1 5 10 15 Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile 20 25 30 <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 113 Thr Pro Gly Cys Gly Ile Cys Ala Lys Glu Ala Ala Ala Leu Gly Trp 1 5 10 15 Phe Cys Ala Leu Ser Val Trp Cys Pro Gly Trp Ala Gln Thr Gln Val 20 25 30 <210> 114 <211> 139 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 114 Arg Lys Ile Phe Val Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asn 1 5 10 15 Phe Ile Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val 20 25 30 Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys Tyr Met Asp Gly Thr Arg Ser Thr Glu 35 40 45 Phe Ser His Pro Val Tyr Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg 50 55 60 Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala 65 70 75 80 Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys 85 90 95 Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Ile Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys Lys 100 105 110 Arg Lys Lys Arg Gly Val Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val Ala 115 120 125 His Leu Ile Gly Leu Trp Arg Arg Phe Ser Arg 130 135 <210> 115 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Arg Lys Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp 1 5 10 15 Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr 20 25 30 Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu 35 40 45 Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu 50 55 60 Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala 65 70 75 80 Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys 85 90 95 Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys 100 105 110 Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser 115 120 125 Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg 130 135 <210> 116 <211> 137 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 116 Arg Lys Ile Phe Val Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asn 1 5 10 15 Phe Ile Asp Cys Asp Phe Glu Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Gln Glu Val 20 25 30 Ile Tyr Gln Ala Leu Glu Lys Tyr Met Asp Gly Thr Arg Ser Thr Glu 35 40 45 Phe Ser His Pro Val Tyr Cys Ala Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg 50 55 60 Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg Ile Arg Gly Cys Ala Ser Gly Ala 65 70 75 80 Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gly Thr Val Ala Ala Leu Ala Ala Glu Cys 85 90 95 Pro Gly Tyr Ala Ala Ala Pro Ile Asn Asn Thr Gln Ala Lys Lys Lys 100 105 110 Arg Lys Lys Arg Gly Val Thr Thr Asn Lys Cys Arg Glu Gln Val Ala 115 120 125 His Leu Ile Gly Leu Trp Arg Arg Phe 130 135 <210> 117 <211> 131 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 117 Arg Ser Leu Phe Ile Leu Gln Val Leu Val Arg Met Gly Leu Thr Tyr 1 5 10 15 Asn Phe Ser Asn Cys Asn Phe Thr Ser Ile Thr Lys Ile Tyr Cys Asn 20 25 30 Ile Ile Phe His Asp Leu Thr Gly Asp Leu Lys Gly Ala Lys Phe Glu 35 40 45 Gln Ile Glu Asp Cys Glu Ser Lys Pro Ala Cys Leu Leu Lys Ile Glu 50 55 60 Tyr Tyr Thr Leu Asn Pro Ile Pro Gly Cys Pro Ser Leu Pro Asp Lys 65 70 75 80 Thr Phe Ala Arg Arg Thr Arg Glu Ala Leu Asn Asp His Cys Pro Gly 85 90 95 Tyr Pro Glu Thr Glu Arg Asn Asp Gly Thr Gln Glu Met Ala Gln Glu 100 105 110 Val Gln Asn Ile Cys Leu Asn Gln Thr Ser Gln Ile Leu Arg Leu Trp 115 120 125 Tyr Ser Phe 130 <210> 118 <211> 22 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 118 Asn Pro Pro Asp Cys Leu Ala Arg Ile Glu Arg Leu Thr Leu His Arg 1 5 10 15 Ile Arg Gly Cys Ala Ser 20

Claims (25)

1. 서열 번호 2의 아미노산 잔기 29 내지 155번을 포함하는 분리된 또는 재조합 개 흉선 간질 림포포이에틴 단백질(TSLP).
2. 제1항의 TSLP를 포함하되, GST-TSLP-His의 구조를 갖는 융합 단백질.
3. 제1항의 분리된 또는 재조합 TSLP 또는 제2항의 융합 단백질을 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산 분자.
4. 제3항에 있어서, 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 핵산 분자.
5. 제3항의 분리된 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
6. 약제학적으로 허용 가능한 항원보강제 및 제1항의 분리된 또는 재조합 TSLP, 제2항의 융합 단백질, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유효량의 면역원을 포함하는 조성물.
7. 비-인간 포유동물을 유효량의 제6항의 조성물로 면역화시키는 것을 포함하는 비-인간 포유동물에서 항-TSLP 항체의 유도 방법.
8. 개를 유효량의 제6항의 조성물로 면역화시키는 것을 포함하는 아토피를 갖는 개의 알레르기성 증상을 치료하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 알레르기성 증상은 알레르기성 피부염 또는 천식을 포함하는 방법.
10. 제6항의 조성물을 포함하는 백신.
11. 제10항의 백신에 의하여, 비-인간 포유동물 또는 포유동물 하이브리도마 시스템으로부터 생산되는 항-개 TSLP 항체.
12. 제11항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 항-개 TSLP 항체.
13. 제12항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 개화된(caninized) 것인 항-개 TSLP 항체.
14. 유효량의 제11항의 항-개 TSLP 항체를 아토피를 갖는 개에 투여하는 알레르기성 증상의 치료 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 알레르기성 증상은 알레르기성 피부염 또는 천식을 포함하는 방법.
16. 약제학적으로 허용 가능한 항원보강제 및 제5항의 발현 벡터를 포함하는 유효량의 면역원을 포함하는 조성물.
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