ES2277839T3 - Adn y polipeptidos de il-1 eta. - Google Patents

Abstract

Un ADN seleccionado del grupo constituido por: (a) ADN que comprende el polinucleótido de la SEC ID Nº 1; (b) ADN que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2; (c) ADN que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2; y (d) ADN que es degenerado, como resultado del código genético, de un ADN definido en (a)-(c), en el que el ADN codifica un polipéptido que se une a un miembro de la familia de receptores de IL-1.

Description

ADN y polipéptidos de IL-1 eta.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención está dirigida a nuevos polipéptidos de IL-1 eta purificados y aislados y a fragmentos de los mismos, a los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, a procesos para la producción de formas recombinantes de dichos polipéptidos, a anticuerpos generados contra estos polipéptidos, a péptidos fragmentados derivados de estos polipéptidos y a usos de los mismos.

Descripción de la técnica relacionada

La interleucina-1 (IL-1) es un miembro de un gran grupo de citocinas cuya función primaria es mediar las respuestas inmune e inflamatoria. Hay siete miembros conocidos de la familia de IL-1, que incluyen IL-1 alfa (IL-1\alpha), IL-1 beta (IL-1\beta), antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra), IL-1 delta (IL-1\delta), IL-1 épsilon (IL-1\varepsilon), IL-1 zeta (IL-1\xi) e IL-18 (previamente conocido como IGIF y a veces IL-1 gamma). La IL-1, que se secreta por macrófagos, es realmente una mezcla de IL-1\beta mayoritariamente y algo de IL-1\alpha (Abbas et al. 1994). Las IL-1\alpha e IL-1\beta, que se producen en primer lugar como precursores de 33 kDa que carecen de una secuencia señal, se procesan adicionalmente mediante escisión proteolítica produciendo formas activas secretadas, cada una de aproximadamente 17 kDa. Adicionalmente, el precursor de 33 kDa de IL-1\alpha es también activo. Ambas formas de IL-1 son los productos de dos genes diferentes localizados en el cromosoma 2. Aunque las dos formas son menos de un 30% homólogas entre sí, ambas se unen a los mismos receptores y tienen actividades similares.

El IL-1ra, una forma biológicamente inactiva de IL-1, es estructuralmente homólogo de IL-1 y se une a los mismos receptores. Adicionalmente, el IL-1ra se produce con una secuencia señal que permite una secreción eficaz a la región extracelular, donde compite competitivamente con IL-1 (Abbas et al., 1994).

La familia de ligandos IL-1 se une a una familia de dos receptores de IL-1, que son miembros de la superfamilia de Ig. Los receptores de IL-1 incluyen el receptor de tipo I de 80 kDa (IL-1RI) y un receptor de tipo II de 68 kDa (IL-1RII). Los ligandos IL-1 pueden unirse también a un fragmento proteolítico soluble de IL-1RII (sIL-1RII) (Colotta et al., 1993).

La fuente principal de IL-1 es el macrófago o el fagocito mononuclear activados. Otras células que producen IL-1 incluyen células epiteliales y endoteliales (Abbas et al., 1994). La secreción de IL-1 por macrófagos ocurre después de que el macrófago encuentre e ingiera bacterias gram-negativas. Dichas bacterias contienen moléculas de lipopolisacárido (LPS), también conocido como endotoxina, en la pared celular bacteriana. Las moléculas de LPS son los componentes activos que estimulan a los macrófagos a producir factor de necrosis tumoral (TNF) e IL-1. En este caso, la IL-1 se produce en respuesta a la producción de LPS y TNF. A bajas concentraciones, el LPS estimula los macrófagos y activa las células B y otras respuestas de huésped necesarias para eliminar la infección bacteriana; sin embargo, a altas concentraciones, el LPS puede causar grave daño de tejido, choque e incluso
muerte.

Las funciones biológicas de la IL-1 incluyen activar células endoteliales vasculares y linfocitos, la destrucción de tejido local y la fiebre (Janeway et al., 1996). A bajos niveles, la IL-1 estimula a macrófagos y células endoteliales vasculares a producir IL-6, regula positivamente moléculas sobre la superficie de células endoteliales vasculares para aumentar la adhesión de leucocitos y activa indirectamente los leucocitos inflamatorios al estimular a fagocitos mononucleares y otras células a producir ciertas quimiocinas que activan leucocitos inflamatorios. Adicionalmente, la IL-1 está implicada en otras respuestas inflamatorias tales como la inducción de prostaglandinas, óxido nítrico sintetasa y metaloproteinasas. Estas funciones de IL-1 son cruciales durante infecciones microbianas de bajo nivel. Sin embargo, si la infección microbiana progresa, la IL-1 actúa sistémicamente induciendo fiebre, estimulando a los fagocitos microbianos a producir IL-1 e IL-6, aumentando la producción de proteínas séricas a partir de hepatocitos, y activando el sistema de coagulación. Adicionalmente, la IL-1 no causa necrosis hemorrágica de tumores, suprime la división de células madre de médula ósea, y la IL-1 es letal para los seres humanos a altas concentraciones.

El documento EP 0879889 A2 discute los múltiples usos de un miembro ejemplar de la familia de IL-1. En esta publicación, se da a conocer que los polipéptidos de IL-1 delta pueden utilizarse para el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo inflamación crónica y aguda, artritis, septicemia, enfermedad autoinmune, rechazo de transplante, enfermedad de injerto contra huésped, infección, apoplejía, isquemia, síndrome de enfermedad respiratoria aguda, reestenosis, lesión cerebral, SIDA, enfermedades óseas, cáncer, aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer. Otras enfermedades para las que pueden utilizarse miembros de la familia de IL-1 para tratamiento son enfermedad inflamatoria intestinal, mieloma múltiple, esclerosis múltiple, asma, alergia, osteoporosis, pancreatitis, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica, enfermedad cardiaca, incluyendo infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedad de Lyme, enfermedad periodontal, sepsis, golpe de calor, glomerulonefritis, osteoartritis, formación de granuloma, parto pretérmino y uveitis.

Dada la importante función de la IL-1, existe la necesidad en la técnica de miembros adicionales de las familias de ligando IL-1 y receptor de IL-1. Además, a la vista del continuo interés en la investigación de proteínas y el sistema inmune, el descubrimiento, identificación y papeles de nuevas proteínas (tales como la IL-1 eta humana de la invención) y sus inhibidores están a la vanguardia de la biología molecular y bioquímica modernas. A pesar del creciente cuerpo de conocimientos, sigue existiendo la necesidad en la técnica de conocer la identidad y función de las proteínas implicadas en las respuestas celular e inmune.

Sumario de la invención

La invención ayuda a satisfacer estas diversas necesidades de la técnica proporcionando los polinucleótidos aislados y los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos para el nuevo ligando de la familia de IL-1 denominado "IL-1 eta". Por tanto, en un aspecto, la invención está dirigida a un ADN seleccionado del grupo constituido por: (a) ADN que comprende el polinucleótido de la SEC ID Nº 1; (b) ADN que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2; (c) ADN que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2; y (d) ADN que es degenerado, como resultado del código genético, de un ADN definido en (a)-(c), en el que el ADN codifica un polipéptido que se une a un miembro de la familia de receptores de IL-1.

Tanto las moléculas polinucleotídicas de ADN monocatenarias como bicatenarias están abarcadas por la invención. Otras moléculas polinucleotídicas incluyen aquellas que hibridan con un ADN bicatenario desnaturalizado que comprende toda o una porción de la SEC ID Nº 1 y/o un ADN que codifica las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEC ID Nº 2, aquellas que derivan mediante mutagénesis in vitro de moléculas polinucleotídicas que comprenden la secuencia de SEC ID Nº 1, aquellas que son degeneradas de moléculas polinucleotídicas que comprenden la secuencia de SEC ID Nº 1, y aquellas que son variantes alélicas de ADN de la invención. La invención abarca un vector de expresión que comprende el ADN de la invención y una célula huésped transformada con este vector.

Los polinucleótidos observados anteriormente pueden utilizarse para identificar polinucleótidos que codifican proteínas que tienen actividades asociadas a ligandos y receptores de la familia de IL-1. Por tanto, los polinucleótidos de IL-1 eta pueden utilizarse para identificar el receptor de IL-1 eta al codificar la proteína IL-1 eta.

Además, estos polinucleótidos pueden utilizarse para identificar los cromosomas humanos con los que están asociados los polinucleótidos. Por tanto, los polinucleótidos de IL-1 eta pueden utilizarse para identificar el cromosoma humano 2. En consecuencia, estos polinucleótidos pueden utilizarse también para cartografiar genes en el cromosoma humano 2; para identificar genes asociados a ciertas enfermedades, síndromes u otras afecciones humanas asociadas al cromosoma humano 2; y para estudiar la transducción de señal celular y el sistema inmune.

Los oligonucleótidos con sentido o antisentido de los polinucleótidos de la SEC ID Nº 1 pueden utilizarse para inhibir la expresión del ADN de la invención.

La invención abarca también polipéptidos aislados y fragmentos de IL-1 eta codificados por estas moléculas de polinucleótido, incluyendo porciones de polipéptido soluble de la SEC ID Nº 2. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido seleccionado del grupo constituido por: (a) un polipéptido que comprende el polipéptido de la SEC ID Nº 2; y (b) un polipéptido que comprende un polipéptido que es al menos un 80% idéntico al polipéptido de la SEC ID Nº 2; en el que el polipéptido se une a un miembro de la familia de receptores de IL-1. La invención proporciona también un polipéptido que comprende un polipéptido codificado por el ADN de la invención. La invención abarca adicionalmente un método para la producción de un polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped de la invención en condiciones que causen la expresión del polipéptido. El método puede comprender adicionalmente recuperar el polipéptido a partir del medio de cultivo. Especialmente, la expresión de estos polipéptidos en bacterias, células de levadura, planta, insecto y animal está abarcada por la invención.

En general, los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para estudiar procesos celulares tales como regulación inmune, proliferación celular, muerte celular, migración celular, interacción célula a célula y respuestas inflamatorias. Además, estos polipéptidos pueden utilizarse para identificar proteínas asociadas a ligandos IL-1 eta.

Además, estos polipéptidos pueden utilizarse en ensayos para examinar inhibidores potenciales de la actividad asociada a moléculas contraestructurales polipeptídicas, y como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades mediadas por moléculas contraestructurales polipeptídicas. Adicionalmente, estos polipéptidos pueden utilizarse en el diseño de inhibidores (por ejemplo, receptores modificados por ingeniería genética que actúan como inhibidores) de los mismos.

Pueden utilizarse las secuencias polinucleotídicas de IL-1 eta, las secuencias de aminoácidos predichas del polipéptido o fragmentos del mismo, o una combinación de las secuencias de aminoácidos predichas del polipéptido y fragmentos del mismo en la búsqueda en una base de datos electrónica para ayudar a la identificación de polinucleótidos y/o proteínas en la muestra.

La invención proporciona también un anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido de la invención. Por tanto, los anticuerpos policlonales o monoclonales aislados que se unen a estos polipéptidos están también abarcados por la invención, además del uso de estos anticuerpos para ayudar a purificar los polipéptidos de la invención.

Descripción detallada de la invención

Las moléculas polinucleotídicas abarcadas en la invención incluyen la siguiente secuencia de nucleótidos:

1

La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por la secuencia de nucleótidos de la invención incluye:

2

El descubrimiento de los polinucleótidos de IL-1 eta de la invención posibilita la construcción de vectores de expresión que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican los polipéptidos respectivos, y células huésped transfectadas o transformadas con los vectores de expresión. La invención posibilita también el aislamiento y purificación de polipéptidos de IL-1 eta biológicamente activos y fragmentos de los mismos. En aún otra realización, los polinucleótidos u oligonucleótidos de los mismos pueden utilizarse como sondas para identificar polinucleótidos que codifican proteínas que tienen actividades asociadas. Por tanto, la IL-1 eta puede utilizarse para identificar actividades asociadas a ligandos de la familia de IL-1. Además, los polinucleótidos u oligonucleótidos de los mismos de IL-1 eta pueden utilizarse para identificar cromosomas humanos 2. De forma similar, estos polinucleótidos u oligonucleótidos de los mismos pueden utilizarse para cartografiar genes en el cromosoma humano 2 y para identificar genes asociados a ciertas enfermedades, síndromes u otras afecciones humanas asociadas al cromosoma humano 2. Por tanto, los polinucleótidos u oligonucleótidos de los mismos de IL-1 eta pueden utilizarse para identificar glaucoma, displasia ectodérmica, diabetes mellitus insulinodependiente, síndrome de la piel arrugada, leucemia de células T/linfoma y distrofia muscular tibial. Finalmente, los oligonucleótidos monocatenarios con sentido o antisentido de estos polinucleótidos pueden utilizarse para inhibir la expresión de polinucleótidos codificados por IL-1 eta.

La IL-1 eta y los fragmentos solubles de la misma pueden utilizarse para activar y/o inhibir la activación de células endoteliales vasculares y linfocitos, inducir y/o inhibir la inducción de la destrucción de tejido local y fiebre (Janeway et al., 1996), inhibir y/o estimular a macrófagos y células endoteliales vasculares a producir IL-6, inducir y/o inhibir la inducción de prostaglandinas, óxido nítrico sintetasa y metaloproteinasas, y regular positivamente y/o inhibir la regulación positiva de moléculas sobre la superficie de células endoteliales vasculares. Además, estos polipéptidos y péptidos fragmentados pueden utilizarse también para inducir y/o inhibir la inducción de mediadores inflamatorios tales como los factores de transcripción NF-\kappaB y AP-1, MAP quinasas JNK y p38, COX-2, iNOS y todas las actividades estimuladas por estas moléculas.

Además, estos polipéptidos y péptidos fragmentados pueden utilizarse como marcadores de peso molecular y como controles para la fragmentación de péptidos, y la invención incluye los kits que comprenden estos reactivos. Finalmente, estos polipéptidos y fragmentos de los mismos pueden utilizarse para generar anticuerpos, y dichos anticuerpos pueden utilizarse para purificar polipéptidos de IL-1 eta.

Moléculas polinucleotídicas

En una realización particular, la invención se refiere a ciertas secuencias de nucleótidos aisladas que están libres de material endógeno contaminante. Una "secuencia de nucleótidos" designa una molécula polinucleotídica en forma de un fragmento separado o de un componente de un constructo polinucleotídico mayor. La molécula polinucleotídica se ha derivado de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración que posibilite la identificación, manipulación y recuperación de sus secuencias de nucleótidos componentes mediante métodos bioquímicos estándar (tales como los expuestos por Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Dichas secuencias se proporcionan y/o se construyen preferiblemente en forma de un marco abierto de lectura no interrumpido por secuencias internas no traducidas o intrones, que están típicamente presentes en genes eucarióticos. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en 5' o 3' de un marco abierto de lectura, en el que las mismas no interfieran con la manipulación o expresión de la región de codificación. En otro aspecto, la invención proporciona ADN que comprende los restos de nucleótidos 112 a 585 de la SEC ID Nº 1.

Los polinucleótidos de la invención incluyen ADN en forma tanto monocatenaria como bicatenaria, así como el ARN complementario del mismo. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de los mismos. El ADN genómico puede aislarse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, utilizando el ADNc de la SEC ID Nº 1, o un fragmento adecuado del mismo, como sonda.

Las moléculas de ADN de la invención incluyen genes completos así como polinucleótidos y fragmentos de los mismos. El gen completo puede incluir el péptido señal N-terminal. Otras realizaciones incluyen ADN que codifica una forma soluble, por ejemplo, que codifica el dominio extracelular de la proteína, con o sin el péptido señal.

Los polinucleótidos de la invención derivan preferiblemente de fuentes humanas, pero la invención incluye aquellos derivados de especies no humanas también.

Están abarcados por la presente invención clones de ADNc que tienen la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 1, aislados como se describe en el ejemplo 1. El polipéptido codificado por los nucleótidos 112-585 de la SEC ID Nº 1 se muestra en la SEC ID Nº 2. Esta secuencia identifica la IL-1 eta de la SEC ID Nº 2 como un miembro de la familia de IL-1.

Debido a la degeneración conocida del código genético, en la que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, un ADN puede variar del mostrado en la SEC ID Nº 1 y seguir codificando un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2. Dicho ADN variante puede ser el resultado de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que ocurren durante la amplificación por PCR), o puede ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

La invención proporciona por tanto ADN aislado seleccionado de: (a) ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 1; (b) ADN que comprende los nucleótidos 112-585 de la SEC ID Nº 1; (c) ADN que codifica los polipéptidos de la SEC ID Nº 2; (d) ADN capaz de hibridación con un ADN de (a)-(c) en condiciones de rigor moderado y que codifica polipéptidos de la invención; (e) ADN que es el complemento capaz de hibridación con un ADN de (a)-(c) en condiciones de rigor alto y que codifica polipéptidos de la invención, y (f) ADN que es degenerado, como resultado el código genético, de un ADN definido en (a), (b), (c), (d) o (e), y que codifica polipéptidos de la invención. El ADN que codifica fragmentos de los polipéptidos de la SEC ID Nº 2 que son biológicamente activos, por ejemplo se unen a receptor de IL-1, está abarcado por la invención. Por supuesto, los polipéptidos codificados por dichas secuencias de ADN están abarcados por la invención.

Como se utiliza en la presente memoria, las condiciones de rigor moderado pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica basándose, por ejemplo, en la longitud del ADN. Las condiciones básicas se exponen por Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., vol. 1, pág. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), e incluyen el uso de una solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa de 5 x SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, 6 x SSC aproximadamente a 42ºC (u otra solución de hibridación similar, tal como solución de Stark, en aproximadamente 50% de formamida aproximadamente a 42ºC) y condiciones de lavado de aproximadamente 60ºC, 0,5 x SSC, 0,1% de SDS. Las condiciones de alto rigor pueden determinarse también fácilmente por el experto en la técnica basándose, por ejemplo, en la longitud del ADN. Generalmente, dichas condiciones se definen como las condiciones de hibridación anteriores, y con el lavado aproximadamente a 68ºC, 0,2 x SSC, 0,1% de SDS. El experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración salina de la solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario según factores tales como la longitud de la sonda.

Se incluye abarcado también por la invención ADN que codifica fragmentos polipeptídicos y ADN que codifica polipéptidos que comprenden sitio(s) de N-glicosilación inactivado(s), sitio(s) de procesamiento de proteasa inactiva-
do(s), o sustitución(es) de aminoácido(s) conservativa(s), como se describe a continuación.

En otra realización, las moléculas polinucleotídicas de la invención incluyen también polinucleótidos que son al menos un 80% idénticos a un ADN nativo. Se contemplan también realizaciones en las que un polinucleótido incluye una molécula que es al menos un 90% idéntica, al menos un 95% idéntica, al menos un 98% idéntica, al menos un 99% idéntica, o al menos un 99,9% idéntica a un polinucleótido nativo.

La identidad porcentual puede determinarse mediante inspección visual y cálculo matemático. Como alternativa, la identidad porcentual de dos secuencias polinucleotídicas puede determinarse comparando la información de secuencia utilizando el programa informático GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible en el University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds, "Atlas of Protein Sequence and Structure", National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco); y (3) sin penalización por huecos terminales. Pueden utilizarse también otros programas utilizados por un experto en la técnica de la comparación de secuencias.

La invención proporciona polinucleótidos aislados útiles en la producción de polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden prepararse mediante cualquiera de una serie de técnicas convencionales. Un ADN que codifica un polipéptido de la invención, o fragmento deseado del mismo, puede subclonarse en un vector de expresión para la producción del polipéptido o fragmento. Ventajosamente, el ADN se fusiona con un ADN que codifica un péptido líder o señal adecuado. Como alternativa, el fragmento deseado puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas conocidas. Los fragmentos de ADN pueden producirse también mediante digestión con endonucleasa de restricción de un ADN clonado completo, y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Si es necesario, pueden ligarse oligonucleótidos que reconstruyen la terminación 5' ó 3' hasta un punto deseado a un fragmento de ADN generado mediante digestión con enzima de restricción. Dichos oligonucleótidos pueden contener adicionalmente un sitio de escisión por endonucleasa de restricción cadena arriba de la secuencia de codificación deseada, y sitúan un codón de iniciación (ATG) en la terminación N de la secuencia de codificación.

El bien conocido procedimiento de reacción en cadena con polimerasa (PCR) puede emplearse también para aislar y amplificar un ADN que codifica un fragmento de proteína deseado. Los oligonucleótidos que definen las terminaciones deseadas del fragmento de ADN se emplean como cebadores 5' y 3'. Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de ADN amplificado en un vector de expresión. Las técnicas de PCR se describen en Saiki et al., Science 239: 487 (1988); "Recombinant DNA Methodology", Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pág. 189-196; y "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990).

Polipéptidos y fragmentos de los mismos

La invención abarca polipéptidos y fragmentos de los mismos en diversas formas, incluyendo aquellas de origen natural o producidas mediante diversas técnicas tales como procedimientos que implican la tecnología de ADN recombinante. Dichas formas incluyen, pero sin limitación, derivados, variantes y oligómeros, así como proteínas de fusión o fragmentos de las mismas.

Los polipéptidos de la invención incluyen proteínas completas codificadas por las secuencias polinucleotídicas expuestas anteriormente. Los polipéptidos particularmente preferidos de IL-1 eta comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2.

Los polipéptidos de la invención pueden secretarse y, por tanto, ser solubles. Los polipéptidos solubles pueden secretarse por las células en las que se expresan. En general, los polipéptidos solubles pueden identificarse (y distinguirse de las contrapartidas no solubles unidas a membrana) separando del medio de cultivo células intactas que expresan el polipéptido deseado, por ejemplo, mediante centrifugación, y ensayando en el medio (sobrenadante) la presencia del polipéptido deseado. La presencia de polipéptido en el medio indica que el polipéptido se secretó por las células, y por tanto es una forma soluble de la proteína.

En una realización, los polipéptidos solubles y fragmentos de los mismos comprenden todo o parte del dominio extracelular, pero carecen de la región transmembrana que causaría la retención del polipéptido sobre una membrana celular. Un polipéptido soluble puede incluir el dominio citoplasmático, o una porción del mismo, a condición de que el polipéptido se secrete por la célula en la que se produce.

En general, el uso de formas solubles en ventajoso para ciertas aplicaciones. Se facilita la purificación de los polipéptidos a partir de las células huésped recombinantes, ya que los polipéptidos solubles se secretan por las células. Además, los polipéptidos solubles son generalmente más adecuados para administración intravenosa.

La invención proporciona también polipéptidos y fragmentos del dominio extracelular que retienen una actividad biológica deseada. Las realizaciones particulares están dirigidas a fragmentos polipeptídicos de la SEC ID Nº 2 que retienen la capacidad de unirse a los análogos, sustratos o contraestructuras ("pareja de unión") nativos. Dicho fragmento puede ser un polipéptido soluble, como se describe anteriormente. En otra realización, los polipéptidos y fragmentos incluyen ventajosamente regiones que están conservadas en la familia del ligando IL-1 y la del receptor de IL-1 como se describen anteriormente.

Se proporcionan también en la presente memoria fragmentos polipeptídicos que comprenden al menos 20, o al menos 30, aminoácidos contiguos de las secuencias de SEC ID Nº 2. Pueden emplearse también fragmentos polipeptídicos como inmunógenos para generar anticuerpos.

Se proporcionan en la presente memoria las variantes de origen natural, así como variantes derivadas de los polipéptidos y fragmentos.

Las variantes pueden exhibir secuencias de aminoácidos que son al menos un 80% idénticas. Se contemplan también realizaciones en las que un polipéptido o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica, al menos un 95% idéntica, al menos un 98% idéntica, al menos un 99% idéntica, o al menos un 99,9% idéntica al polipéptido preferido o fragmento del mismo. La identidad porcentual puede determinarse mediante inspección visual y cálculo matemático. Como alternativa, la identidad porcentual de dos secuencias proteicas puede determinarse comparando la información de secuencia utilizando el programa informático GAP, basado en el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Bio. 48: 443, 1970) y disponible en el University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de puntuaciones blosum62, como se describe por Henikoff y Henikoff (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1992); (2) un peso de hueco de 12; (3) un peso de longitud de hueco de 4; y (4) sin penalización por huecos terminales. Pueden utilizarse también otros programas utilizados por un experto en la técnica de la comparación de
secuencias.

Las variantes de la invención incluyen, por ejemplo, aquellas que son el resultado de eventos de ayuste alternado de ARNm o de escisión proteolítica. El ayuste alternado de ARNm puede proporcionar, por ejemplo, una proteína truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble de origen natural, de la proteína. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en las terminaciones N o C tras la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína (generalmente 1-5 aminoácidos terminales). Se contemplan también en la presente memoria proteínas en las que las diferencias en las secuencias de aminoácidos son atribuibles a polimorfismo genético (variación alélica entre individuos productores de la proteína).

Las variaciones adicionales dentro del alcance de la invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear derivados de los mismos formando conjugados covalentes o de agregación con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, grupos fosfato, acetilo y similares. Los derivados covalentes pueden prepararse ligando los restos químicos con grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos o en la terminación N o la terminación C de un polipéptido. Se contemplan en la presente memoria conjugados que comprenden agentes de diagnóstico (detectables) o terapéuticos unidos a los mismos, como se discute con más detalle a continuación.

Otros derivados incluyen conjugados covalentes o de agregación de los polipéptidos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante síntesis en cultivo recombinante en forma de fusiones N-terminales o C-terminales. Los ejemplos de proteínas de fusión se discuten a continuación con respecto a los oligómeros. Además, las proteínas de fusión pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente de EE.UU. nº 5.011.912 y en Hopp et al., Biol. Technology 6: 1204, 1988. Uno de dichos péptidos es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, posibilitando un ensayo rápido y una purificación sencilla de la proteína recombinante expresada. Un hibridoma de múrido, designado 4E11, produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido FLAG® en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la patente de EE.UU. 5.011.912. La estirpe celular de hibridoma 4E11 se ha depositado en la American Type Culture Collection con el número de acceso HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido FLAG® están disponibles en Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.

Entre los polipéptidos variantes proporcionados en la presente memoria están las variantes de polipéptidos nativos que retienen la actividad biológica nativa o un equivalente sustancial de la misma. Es un ejemplo una variante que se une esencialmente con la misma afinidad de unión que lo hace la forma nativa. La afinidad de unión puede medirse mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, como los descritos en la patente de EE.UU. nº 5.512.457 y como se expone a continuación.

Las variantes incluyen polipéptidos que son sustancialmente homólogos de la forma nativa, pero que tienen una secuencia de aminoácidos diferente de la de la forma nativa debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Las realizaciones particulares incluyen, pero sin limitación, polipéptidos que comprenden de una a diez deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos, cuando se comparan con una secuencia nativa.

Un aminoácido dado puede reemplazarse, por ejemplo, por un resto que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de dichas sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí; las sustituciones de un resto polar por otro, tales como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn; o las sustituciones de un resto aromático por otro, tales como Phe, Trp o Tyr entre sí. Son bien conocidas otras sustituciones conservativas que implican, por ejemplo, sustituciones de regiones completas que tienen características de hidrofobicidad similares.

De forma similar, los ADN de la invención incluyen variantes que difieren de una secuencia de ADN nativo debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones, pero que codifican un polipéptido biológicamente activo.

La invención incluye adicionalmente polipéptidos de la invención con o sin un patrón de glicosilación nativo asociado. Los polipéptidos expresados en sistemas de expresión de levadura o mamífero (por ejemplo, células COS-1 o COS-7), pueden ser similares o ser significativamente diferentes de un polipéptido nativo en el peso molecular y el patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de los polipéptidos de la invención en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas. Además, una preparación dada puede incluir múltiples especies glicosiladas diferencialmente de la proteína. Los grupos glicosilo pueden retirarse mediante métodos convencionales, en particular, aquellos que utilizan glicopeptidasa. En general, los polipéptidos glicosilados de la invención pueden incubarse con un exceso molar de glicopeptidasa (Boehringer Mannheim).

Correspondientemente, los constructos de ADN que codifican diversas adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de restos o secuencias terminales o internas, están abarcados por la invención. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular polipeptídico pueden modificarse para evitar la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido en sistemas de expresión de mamífero y levadura. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las sustituciones, adiciones o deleciones apropiadas de la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes darán como resultado la prevención de la unión de restos de carbohidrato a la cadena lateral de Asn. La alteración de un solo nucleótido, elegido de modo que el Asn se reemplace por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Como alternativa, la Ser o Thr puede reemplazarse por otro aminoácido, tal como Ala. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen los descritos en la patente de EE.UU. 5.071.972 y el documento EP 276.846.

En otro ejemplo de variantes, los nucleótidos que codifican restos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden alterarse causando que los restos de Cys se eliminen o reemplacen por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras plegamiento o renaturalización.

Se preparan otras variantes mediante la modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes, para potenciar la expresión en sistemas de levadura en los que está presente la actividad proteasa KEX2. El documento EP 212.914 da a conocer el uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 se inactivan eliminando, añadiendo o sustituyendo restos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg, eliminando la aparición de estos restos básicos adyacentes. Los apareamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles de escisión por KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un enfoque conservativo y preferido para inactivar sitios KEX2.

Están abarcados por la invención oligómeros o proteínas de fusión que contienen polipéptidos de IL-1 eta. Dichos oligómeros pueden estar en forma de multímeros ligados covalentemente o ligados no covalentemente, incluyendo dímeros, trímeros u oligómeros superiores. Como se observa anteriormente, los polipéptidos preferidos son solubles, y por tanto estos oligómeros pueden comprender polipéptidos solubles. En un aspecto de la invención, los oligómeros mantienen la capacidad de unión de los componentes polipeptídicos y proporcionan para ello sitios de unión divalentes, trivalentes, etc.

Una realización de la invención está dirigida a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos unidos mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados con los polipéptidos. Dichos péptidos pueden ser engarces peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de los polipéptidos unidos a los mismos, como se describe con más detalle a continuación.

Como una alternativa, se prepara un oligómero utilizando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados con diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo, por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991); Byrn et al., (Nature 344: 677, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, supl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11, 1992).

Una realización de la presente invención está dirigida a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando un polipéptido de la invención con un polipéptido Fc derivado de un anticuerpo. Se inserta una fusión génica que codifica la proteína de fusión polipéptido/Fc en un vector de expresión adecuado. Las proteínas de fusión polipéptido/Fc se expresan en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y se permiten ensamblar en moléculas muy parecidas a anticuerpos, tras de lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los restos Fc, proporcionando moléculas divalentes.

El término "polipéptido Fc" como se utiliza en la presente memoria incluye formas nativas y de muteína de polipéptidos constituidos por la región Fc de un anticuerpo que comprende cualquiera o todos los dominios CH de la región Fc. Se incluyen también las formas truncadas de dichos polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la
dimerización. Los polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido Fc derivado de un anticuerpo de IgG1 humano.

Un polipéptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporada a la presente memoria como referencia, es un polipéptido monocatenario que se extiende desde la región de bisagra N-terminal hasta la terminación C nativa de la región Fc de un anticuerpo de IgG1 humano. Otro polipéptido de Fc útil es la muteína de Fc descrita en la patente de EE.UU. 5.457.035 y en Baum et al., (EMBO J., 13: 3992-4001, 1994). La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto porque el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe una afinidad reducida por los receptores de Fc.

Las proteínas de fusión anteriormente descritas que comprenden restos de Fc (y oligómeros formados a partir de las mismas) ofrecen la ventaja de una purificación sencilla mediante cromatografía de afinidad frente a columnas de proteína A o proteína G.

En otras realizaciones, los polipéptidos de la invención pueden sustituirse por la porción variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo. Si las proteínas de fusión se preparan tanto con cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero con hasta cuatro regiones extracelulares polipeptídicas.

Como alternativa, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos, con o sin engarces peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los engarces peptídicos adecuados están los descritos en las patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233. Puede insertarse una secuencia de ADN que codifica un engarce peptídico deseado entre, y en el mismo marco de lectura que, las secuencias de ADN de la invención, utilizando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica el engarce puede ligarse entre las secuencias. En realizaciones particulares, una proteína de fusión comprende de dos a cuatro polipéptidos solubles de la invención, separados por engarces peptídicos.

Otro método para preparar los oligómeros de la invención implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988), y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas están péptidos de origen natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan.

El dominio de cremallera (también designado en la presente memoria como dominio que oligomeriza o que forma oligómero) comprende una repetición heptamérica, a menudo con cuatro o cinco restos de leucina intercalados con otros aminoácidos. Son ejemplos de dominios de cremallera los encontrados en el factor de transcripción de levadura GCN4 y la proteína de unión a ADN termoestable encontrados en hígado de rata (C/EBP; Landschulz et al., Science 243: 1681, 1989). Dos proteínas transformantes nucleares, fos y jun, exhiben también dominios de cremallera, como el producto génico del proto-oncogén de múrido c-myc (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios de cremallera que forman preferiblemente heterodímeros (O'Shea et al., Science 245: 646, 1989, Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1989). El dominio de cremallera es necesario para la actividad biológica (unión de ADN) en estas proteínas.

Las proteínas fusogénicas de varios virus diferentes, incluyendo paramixovirus, coronavirus, virus del sarampión y muchos retrovirus, poseen también dominios de cremallera (Buckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990). Los dominios de cremallera en estas proteínas víricas fusogénicas están cerca de la región transmembrana de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cremallera podrían contribuir a la estructura oligomérica de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de las proteínas víricas fusogénicas está implicada en la formación de poros de fusión (Spruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3523, 1991). Se ha reseñado también recientemente que los dominios de cremallera desempeñan un papel en la oligomerización de factores de transcripción por choque térmico (Rabindran et al., Science 259: 230, 1993).

Los dominios de cremallera se pliegan en forma de superhélices paralelas cortas (O'Shea et al., Science 254: 539, 1991). La arquitectura general de la superhélice paralela se ha caracterizado bien, con un empaquetamiento de "protuberancias en huecos" como propuso Crick en 1953 (Acta Crystallogr. 6: 689). El dímero formado por un dominio de cremallera se estabiliza por la repetición heptamérica, designada (abcdefg)_{n} según la notación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293, 1975), en la que los restos a y d son generalmente restos hidrófobos, siendo d una leucina, que se alinean en la misma cara de una hélice. Habitualmente, aparecen restos cargados de forma opuesta en las posiciones g y e. Por tanto, en una superhélice paralela formada por dos dominios de cremallera helicoidales, las "protuberancias" formadas por las cadenas laterales hidrófobas de la primera hélice se empaquetan en los "huecos" formados entre las cadenas laterales de la segunda hélice.

Los restos en la posición d (a menudo leucina) contribuyen a grandes energías de estabilización hidrófoba, y son importantes para la formación de oligómero (Krystek et al., Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991). Lovejoy et al. (Science 259: 1288, 1993) reseñaron recientemente la síntesis de un haz de \alpha-hélices tricatenario en el que las hélices van arriba-arriba-abajo. Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrófoba proporciona la fuerza impulsora principal para la formación de superhélices a partir de monómeros helicoidales. Estos estudios indican también que las interacciones electrostáticas contribuyen a la estequiometría y geometría de las superhélices. Se encuentra una discusión adicional de la estructura de las cremalleras de leucina en Harbury et al. (Science 262: 1401, 26 de noviembre de 1993).

Se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína tensioactiva pulmonar D (SPD) descrita en Hoppe et al. (FEBS Letters 344: 191, 1994). El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada con la misma se describe en Fanslow et al., (Semin. Immunol. 6: 267-278, 1994). Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido soluble fusionado con un péptido de cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y el oligómero soluble que forma se recupera a partir del sobrenadante de cultivo.

Ciertos restos de cremallera de leucina forman preferiblemente trímeros. Es un ejemplo la cremallera de leucina derivada de proteína tensioactiva pulmonar D (SPD), como se describe en Hoppe et al., (FEBS Letters 344: 191, 1994) y en la patente de EE.UU. 5.716.805. Este péptido de cremallera de leucina derivado de SPD pulmonar comprende la secuencia de aminoácidos Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr.

Otro ejemplo de una cremallera de leucina que promueve la trimerización es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg, como se describe en la patente de EE.UU. 5.716.805. En una realización alternativa, se añade un resto Asp N-terminal; en otra, el péptido carece del resto Arg N-terminal.

Los fragmentos de los péptidos de cremallera anteriores que retienen la propiedad de promover la oligomerización pueden emplearse también. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen, pero sin limitación, péptidos que carecen de uno o dos de los restos N-terminales o C-terminales presentados en las secuencias de aminoácidos anteriores. Las cremalleras de leucina pueden derivar de péptidos de cremallera de leucina de origen natural, por ejemplo, mediante sustitución(es) conservativa(s) en la secuencia de aminoácidos nativa, en los que se retiene la capacidad del péptido de promover la oligomerización.

Pueden emplearse otros péptidos derivados de proteínas triméricas de origen natural para preparar oligómeros triméricos. Como alternativa, pueden emplearse péptidos sintéticos que promueven la oligomerización. En realizaciones particulares, los restos de leucina en un resto de cremallera de leucina se reemplazan por restos de isoleucina. Dichos péptidos que comprenden isoleucina pueden designarse como cremalleras de isoleucina, pero están abarcados por el término "cremalleras de leucina" como se emplea en la presente memoria.

Producción de polipéptidos y fragmentos de los mismos

La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la invención puede conseguirse mediante cualquier técnica adecuada incluyendo, pero sin limitación, las siguientes:

La presente invención proporciona también vectores de clonación y expresión recombinante que contienen ADN, así como células huésped que contienen los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden ADN pueden utilizarse para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el ADN. Un método para producir polipéptidos comprende cultivar células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que codifica el polipéptido, en condiciones que promuevan la expresión del polipéptido, y recuperar después los polipéptidos expresados a partir del cultivo. El experto en la técnica reconocerá que el procedimiento para purificar los polipéptidos expresados variará según factores tales como el tipo de células huésped empleadas, y si el polipéptido está unido a membrana o es una forma soluble que se secreta por la célula huésped.

Puede emplearse cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen un ADN que codifica un polipéptido o fragmento de la invención, ligado operativamente a secuencias de nucleótidos reguladoras transcripcionales o traduccionales adecuadas, tales como las derivadas de un gen de mamífero, microbio, virus o insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o potenciadores transcripcionales, un sitio de unión ribosómico de ARNm y secuencias apropiadas con control de la iniciación y terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencia de nucleótidos están ligadas operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de ADN. Por tanto, una secuencia de nucleótidos promotora está ligada operativamente a una secuencia de ADN si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN. Se incorporan generalmente al vector de expresión un origen de replicación, que confiere la capacidad de replicar en las células huésped deseadas, y un gen de selección mediante el que se identifican los
transformantes.

Además, puede incorporarse a los vectores de expresión una secuencia que codifica un péptido señal apropiado (nativo o heterólogo). Puede fusionarse una secuencia de ADN de un péptido señal (líder secretor) en fase con la secuencia polinucleotídica de la invención de modo que el ADN se transcriba inicialmente, y el ARNm se traduzca, en una proteína de fusión que comprenda el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped pretendidas promueve la secreción extracelular del polipéptido. El péptido señal se escinde del polipéptido tras la secreción del polipéptido desde la célula.

El experto en la técnica reconocerá también que la(s) posición(es) en la(s) que el péptido señal se escinde puede(n) diferir de la(s) predicha(s) por el programa informático, y puede(n) variar según factores tales como el tipo de células huésped empleadas para expresar un polipéptido recombinante. Una preparación proteica puede incluir una mezcla de moléculas proteicas que tienen diferentes aminoácidos N-terminales como resultado de la escisión del péptido señal en más de un sitio.

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos incluyen procariotas, células de levadura o eucarióticas superiores. Las células de mamífero o insecto se prefieren generalmente para uso como células huésped. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y mamífero se describen, por ejemplo, en Pouwels et al., "Cloning Vectors: A Laboratory Manual", Elsevier, Nueva York (1985). Podrían emplearse también sistemas de traducción libres de células para producir polipéptidos utilizando ARN derivados de los constructos de ADN dados a conocer en la presente memoria.

Los procariotas incluyen organismos gram-negativos o gram-positivos. Las células huésped procarióticas adecuadas para transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas otras especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un polipéptido puede incluir un resto de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met N-terminal puede escindirse del polipéptido recombinante expresado.

Los vectores de expresión para uso en células huésped procarióticas comprenden generalmente uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Un gen marcador seleccionable fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requisito autotrófico. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procarióticas incluyen aquellos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona por tanto un medio sencillo para identificar células transformadas. Se insertan un promotor apropiado y una secuencia de ADN en el vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.).

Las secuencias promotoras utilizadas habitualmente para vectores de expresión de células huésped procarióticas recombinantes incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275: 615, 978; y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980 y el documento EP-A-36776) y el promotor tac (Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procarióticas particularmente útil emplea un promotor del fago \lambdaP_{L} y una secuencia represora termolábil cl857ts. Los vectores de plásmido disponibles en la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambdaP_{L} incluyen el plásmido pHUB2 (residente en E. coli cepa JMB9, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E. coli RR1, ATCC 53082).

Como alternativa, los polipéptidos pueden expresarse en células huésped de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). Pueden emplearse también otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura contendrán a menudo una secuencia origen de replicación de un plásmido de levadura 2 \mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otras, promotores de metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en Hitzeman, documento EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Pueden construirse vectores lanzadera replicables tanto en levadura como en E. coli insertando secuencias de ADN de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen y origen de replicación Amp^{r}) en los vectores de levadura anteriormente descritos.

La secuencia líder factor \alpha de levadura puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido. La secuencia líder factor \alpha se inserta a menudo entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. Véanse, por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982 y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Son conocidas por el experto en la técnica otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes a partir de huéspedes de levadura. Una secuencia líder puede modificarse cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.

Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por los expertos en la técnica. Se describe uno de dichos protocolos por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona los transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consiste en 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de casaminoácidos, 2% de glucosa, adenina 10 mg/ml y uracilo 20 mg/ml.

Las células huésped de levadura transformadas mediante vectores que contienen una secuencia promotora ADH2 pueden hacerse crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es aquel que consiste en 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementado con adenina 80 mg/ml y uracilo 80 mg/ml. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio.

Los sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o insecto pueden emplearse también para expresar polipéptidos recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisan por Luckow y Summers, Biol. Technology 6: 47 (1988). Pueden emplearse también estirpes celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de estirpes celulares de huésped mamífero adecuadas incluyen la estirpe COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y estirpes celulares BHK (ATCC CRL 10), y la estirpe celular CV 1/EBNA derivada de la estirpe celular CV 1 de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70), como se describe por McMahan et al., (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Se han descrito métodos establecidos para introducir ADN en células de mamífero (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pág. 15-69). Pueden utilizarse protocolos adicionales que utilizan reactivos comercialmente disponibles, tales como reactivo lipídico lipofectamina (Gibco/BRL) o reactivo lipídico lipofectamina-plus, para transfectar células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987). Además, puede utilizarse electroporación para transfectar células de mamífero utilizando procedimientos convencionales, tales como los de Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La selección de transformantes estables puede realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al., Meth. In Enzymology 185: 487-511, 1990, describe varios esquemas de selección, tales como resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa huésped adecuada para selección por DHFR puede ser la cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980). Puede introducirse un plásmido que expresa el ADNc de DHFR en la cepa DX-B11, y sólo las células que contienen el plásmido pueden crecer en los medios selectivos apropiados. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden incorporarse a un vector de expresión incluyen ADNc que confieren resistencia a antibióticos tales como G418 e higromicina B. Las células que albergan el vector pueden seleccionarse basándose en la resistencia a estos compuestos.

Las secuencias de control transcripcional y traduccional para vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden extraerse de genomas víricos. Las secuencias promotoras y secuencias potenciadoras utilizadas habitualmente derivan de virus de polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma vírico de SV40, por ejemplo el origen SV40, promotores temprano y tardío, sitios potenciadores, de ayuste y poliadenilación, pueden utilizase para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores víricos tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir de un genoma vírico en forma de un fragmento, que puede contener también un origen de replicación vírico (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Kaufman, Meth. In Enzimology, 1990). Pueden utilizarse también fragmentos de SV40 menores o mayores, a condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hasta el sitio BglI localizado en el sitio de origen de replicación vírico SV40.

Las secuencias de control adicionales que se muestra que mejoran la expresión de genes heterólogos a partir de vectores de expresión de mamífero incluyen elementos tales como el elemento de secuencia aumentador de la expresión (EASE) derivado de células CHO (Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pág. 529-534 y la solicitud PCT WO 97/25420) y los ARN del líder tripartito (TPL) y el gen VA de adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257: 13475-13491, 1982). Las secuencias de sitio de entrada interna de ribosoma (IRES) de origen vírico permiten que los ARNm dicistrónicos se traduzcan eficazmente (Oh y Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3: 295-300, 1993; Ramesh et al., Polynucleotides Research 24: 2697-2700, 1996. Se ha mostrado que la expresión de un ADNc heterólogo como parte de un ARNm dicistrónico seguido del gen de un marcador seleccionable (por ejemplo, DHFR) mejora la transfectabilidad del huésped y la expresión del ADNc heterólogo (Kaufman, Meth. In Enzymology, 1990). Lo vectores de expresión ejemplares que emplean ARNm dicistrónicos son pTR-DC/GFP, descrito por Mosser et al.,
Biotechniques 22: 150-161, 1997 y p2A5I, descrito por Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pág. 529-534.

Se ha descrito un vector de alta expresión útil, pCAVNOT, por Mosley et al., Cell 59: 335-348, 1989. Pueden construirse otros vectores de expresión para uso en células huésped de mamífero como se da a conocer por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983). Puede construirse un sistema útil para la expresión estable a alto nivel de ADNc de mamífero en células epiteliales mamarias de múrido C127 sustancialmente como se describe por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Se ha depositado un vector de alta expresión útil, PMSLV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312: 768, 1984, como ATCC 39890. Se describen vectores de expresión de mamífero útiles adicionales en el documento EP-A-0367566 y en el documento WO 91/18982. En aún otra alternativa, los vectores pueden derivar de retrovirus.

Puede utilizarse otro vector de expresión útil, pFLAG®. La tecnología FLAG® está centrada en la fusión de un péptido marcador hidrófilo FLAG®de bajo peso molecular (1 kDa) con la terminación N de una proteína recombinante expresada por vectores de expresión pFLAG®.

Con respecto a los péptidos señal que pueden emplearse, el péptido señal nativo puede reemplazarse por un péptido señal o secuencia líder heterólogo, si se desea. La elección del péptido señal o líder puede depender de factores tales como el tipo de células huésped en las que el polipéptido recombinante se vaya a producir. Para ilustrar, los ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen las secuencias señal de interleucina 7 (IL-7) descritas en la patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal del receptor de interleucina 2 descrita en Cosman et al., Nature 312: 768 (1984); el péptido señal receptor de interleucina 4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal receptor de tipo I de interleucina 1 descrito en la patente de EE.UU. 4.968.607; y el péptido señal receptor de tipo II de interleucina 1 descrito en el documento EP 460.846.

La invención incluye también métodos de aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de los mismos.

Los polipéptidos o fragmentos de los mismos "aislados" abarcados por esta invención son polipéptidos o fragmentos que no están en un entorno idéntico al entorno en el que se encuentra o encuentran en la naturaleza. Los polipéptidos "purificados" o fragmentos de los mismos abarcados por esta invención están esencialmente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, en forma de un producto de purificación de sistemas de expresión recombinantes tales como los descritos anteriormente o en forma de un producto purificado a partir de una fuente no recombinante tal como células y/o tejidos de origen natural.

En una realización preferida, la purificación de polipéptidos recombinantes o fragmentos puede conseguirse utilizando fusiones de polipéptidos o fragmentos de la invención con otro polipéptido para ayudar a la purificación de polipéptidos o fragmentos de la invención. Dichas parejas de fusión pueden incluir poli-His u otros péptidos de identificación antigénica descritos anteriormente, así como los restos Fc descritos anteriormente.

Con respecto a cualquier tipo de célula huésped, como es conocido por el experto en la técnica, los procedimientos para purificar un polipéptido recombinante o fragmento variarán según factores tales como el tipo de células huésped empleadas y si el polipéptido recombinante o fragmento se secreta o no al medio de cultivo.

En general, el polipéptido recombinante o fragmento puede aislarse a partir de las células huésped si no se secreta, o a partir del medio o del sobrenadante si es soluble y se secreta, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación por salado, intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, de purificación por afinidad o de exclusión por tamaño. En cuanto a modos específicos de realizar estas etapas, el medio de cultivo puede concentrarse en primer lugar utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados habitualmente en la purificación de proteína. Como alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Además, puede emplearse una etapa de cromatoenfoque. Como alternativa, puede emplearse una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba. Las matrices adecuadas pueden ser restos fenilo u octilo unidos a resinas. Además, puede emplearse cromatografía de afinidad con una matriz que se une selectivamente a la proteína recombinante. Los ejemplos de dichas resinas empleadas son columnas de lectina, columnas de tinte y columnas quelantes de metal. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC-FI) que emplean medios de HPLC-FI hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice o resina polimérica que tiene grupos metilo, octilo, octildecilo u otros alifáticos pendientes) para purificar adicionalmente los polipéptidos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, son bien conocidas y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada y purificada.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína de unión a polipéptido de la invención, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos de la invención, para purificar por afinidad polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden retirarse de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo en un tampón de elución altamente salino, y después dializarse en un tampón menos salino para uso, o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o retirarse competitivamente utilizando el sustrato de origen natural del resto de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la invención.

En este aspecto de la invención, las proteínas de unión a polipéptido, tales como los anticuerpos anti-polipéptido de la invención u otras proteínas que pueden interaccionar con el polipéptido de la invención, pueden unirse a un soporte en fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o sustrato similar adecuado para identificar, separar o purificar células que expresan polipéptidos de la invención sobre su superficie. La adherencia de las proteínas de unión a polipéptido de la invención a una fase sólida en contacto con la superficie puede conseguirse mediante cualquier medio. Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con estas proteínas de unión a polipéptido y mantenerse en el recipiente de incubación mediante un campo magnético. Se ponen en contacto suspensiones de mezclas celulares con la fase sólida que tiene dichas proteínas de unión a polipéptido sobre la misma. Las células que tienen polipéptidos de la invención sobre su superficie se unen a la proteína de unión a polipéptido fijada, y después se retiran por lavado las células no unidas. Este método de unión por afinidad es útil para purificar, examinar o separar de la solución aquellas células que expresan polipéptido. Son conocidos métodos de liberación de células seleccionadas positivamente de la fase sólida, y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Dichas enzimas son preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células, y se dirigen preferiblemente a escindir la pareja de unión de la superficie celular.

Como alternativa, pueden incubarse en primer lugar mezclas de células sospechosas de contener células que expresan polipéptido de la invención con una proteína de unión a polipéptido biotinilado de la invención. Los periodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración para asegurar una unión suficiente a los polipéptidos de la invención. La mezcla resultante se pasa después a través de una columna empaquetada con perlas recubiertas con avidina, con lo que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de las células de unión a polipéptido con las perlas. El uso de perlas recubiertas con avidina es conocido en la técnica. Véase Berenson et al., J. Cell. Biochem., 10D: 239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de las células unidas se realiza utilizando métodos convencionales.

El grado deseado de pureza depende del uso pretendido de la proteína. Se desea un grado relativamente alto de pureza cuando el polipéptido ha de administrarse in vivo, por ejemplo. En dicho caso, los polipéptidos se purifican de tal modo que no son detectables bandas de proteína correspondientes a otras proteínas tras análisis mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE-SDS). Se reconocerá por un experto en el campo pertinente que pueden visualizarse múltiples bandas correspondientes al polipéptido mediante PAGE-SDS debido a la glicosilación diferencial, el procesamiento post-traduccional diferencial y similares. Lo más preferiblemente, el polipéptido de la invención se purifica hasta homogeneidad sustancial, como se indica por una sola banda de proteína tras análisis por PAGE-SDS. La banda de proteína puede visualizarse mediante tinción con plata, tinción con azul de Coomasie o (si la proteína está radiomarcada) mediante autorradiografía.

En los polipéptidos purificados de la invención (incluyendo proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes, oligómeros y otras formas) puede ensayarse la capacidad de unirse a la pareja de unión en cualquier ensayo adecuado, tal como un ensayo de unión convencional. Para ilustrar, el polipéptido puede estar marcado con un reactivo detectable (por ejemplo, un radionucleido, cromóforo, enzima que cataliza una reacción colorimétrica o fluorométrica y similar). El polipéptido marcado se pone en contacto con células que expresan la pareja de unión. Se lavan después las células para retirar el polipéptido marcado no unido, y se determina la presencia de marcaje unido a célula mediante una técnica adecuada, elegida según la naturaleza del marcaje.

Es un ejemplo de un procedimiento de ensayo de unión el siguiente. Se construye un vector de expresión recombinante que contiene ADNc de la pareja de unión utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Se transfectan células CV1-EBNA-1 en discos de 10 cm^{2} con el vector de expresión recombinante. Las células CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresan constitutivamente antígeno 1 nuclear de EBV impulsadas por el potenciador/promotor inmediato-temprano CMV. CV1-EBNA-1 derivaba de la estirpe celular de riñón de mono verde africano CV-1 (ATCC CCL 70), como se describe por McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Se cultivan las células transfectadas durante 24 horas, y se dividen las células de cada disco en una placa de 24 pocillos. Después de cultivar durante 48 horas adicionales, se lavan las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/pocillo) con BM-NFDM, que es medio de unión (RPMI 1640 que contiene albúmina de suero bovino 25 mg/ml, azida de sodio 2 mg/ml, Hepes 20 mM, pH 7,2) al que se ha añadido leche desecada desgrasada 50 mg/ml. Se incuban después las células durante 1 hora a 37ºC con diversas concentraciones de, por ejemplo, una proteína de fusión polipéptido soluble/Fc preparada como se expone anteriormente. Se lavan después las células y se incuban con una concentración a saturación constante de una ^{125}I-IgG de ratón anti-humana en medio de unión con agitación suave durante 1 hora a 37ºC. Después de un extenso lavado, se liberan las células mediante tripsinación.

La IgG de ratón anti-humana empleada anteriormente está dirigida contra la región Fc de IgG humana y puede obtenerse en Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se marca con yodo radiactivo utilizando el método de cloramina T estándar. El anticuerpo se unirá a la porción Fc de cualquier proteína de polipéptido/Fc que se haya unido a las células. En todos los ensayos, se ensaya la unión no específica de ^{125}I-anticuerpo en ausencia de proteína de fusión de Fc/Fc, así como en presencia de proteína de fusión de Fc y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo de IgG de ratón anti-humano no marcado.

Se cuantifica el ^{125}I-anticuerpo unido a célula en un contador Packard Autogamma. Se generan los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) con RS/1 (BBN Software, Boston, MA) funcionando en un ordenador Microvax.

Otro tipo de ensayo de unión adecuado es un ensayo de unión competitiva. Para ilustrar, puede determinarse la actividad biológica de una variante ensayando la capacidad de la variante de competir con la proteína nativa por la unión con la pareja de unión.

Los ensayos de unión competitiva pueden realizarse mediante metodología convencional. Los reactivos que pueden emplearse en ensayos de unión competitiva incluyen polipéptidos radiomarcados de la invención y células intactas que expresan la pareja de unión (endógena o recombinantemente). Por ejemplo, puede utilizarse un fragmento de IL-1 eta soluble radiomarcado para competir con una variante de IL-1 eta soluble por la unión a receptores de IL-1 eta de superficie celular. En lugar de células intactas, podría sustituirse una proteína de fusión de pareja de unión soluble/Fc unida a una fase sólida mediante interacción de la proteína A o proteína G (sobre la fase sólida) por el resto Fc. Las columnas de cromatografía que contienen proteína A y proteína G incluyen las disponibles en Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.

Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza una pareja de unión soluble radiomarcada, tal como una proteína de fusión receptor de IL-1 eta soluble/Fc, y células intactas que expresan la pareja de unión. Pueden obtenerse resultados cualitativos mediante ensayos de unión competitiva a placa autorradiográfica, mientras que pueden utilizarse gráficas de Scatchard (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) para generar resultados cuantitativos.

El polipéptido de IL-1 eta de la presente invención puede utilizarse también como ensayo de examen para compuestos y moléculas pequeñas que inhiben la activación (antagonistas) del polipéptido de IL-1 eta de la presente invención. Por tanto, los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para identificar antagonistas, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Los antagonistas pueden ser sustratos naturales o modificados, ligandos, enzimas, receptores, etc. del polipéptido de IL-1 eta, o pueden ser miméticos estructurales o funcionales del polipéptido de IL-1 eta. Los antagonistas pueden ser adicionalmente moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos y oligonucleótidos antisentido.

Una realización de un método para identificar compuestos que antagonizan el polipéptido de IL-1 eta es poner en contacto un compuesto candidato con células que responden al polipéptido de IL-1 eta y observar la unión o estimulación o inhibición de una respuesta funcional. Podría compararse después la actividad de las células que se pusieron en contacto con el compuesto candidato con células idénticas que no se pusieron en contacto mediante la actividad del polipéptido de IL-1 eta, y podrían identificarse los agonistas y antagonistas de polipéptido de IL-1 eta. Una realización adicional más de la presente invención proporciona un método de identificación de compuestos que inhiben la síntesis o secreción de IL-1 eta mediante la puesta en contacto del compuesto candidato con células que expresan el polipéptido de IL-1 eta y midiendo la producción de IL-1 eta. La medida de la producción de IL-1 eta podría realizarse mediante una serie de métodos bien conocidos, tales como medir la cantidad de proteína presente (por ejemplo, un ELISA) o de actividad de proteína.

Uso de polinucleótidos u oligonucleótidos de IL-1 eta

Entre los usos de los polinucleótidos de la invención está el uso de fragmentos polinucleotídicos u oligonucleótidos como sondas o cebadores. Dichos fragmentos comprenden generalmente al menos aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras realizaciones, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o al menos 60, nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN.

Debido a que los homólogos de la SEC ID Nº 1 de otras especies de mamífero están contemplados en la presente memoria, pueden utilizarse sondas basadas en la secuencia de ADN humano de SEC ID Nº 1 para examinar bibliotecas de ADNc derivadas de otras especies de mamífero utilizando técnicas de hibridación interespecie convencio-
nales.

Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos expuestas anteriormente, pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones en cadena con polimerasa (PCR), mediante las que se aíslan y amplifican fragmentos de ADN.

Pueden utilizarse por los expertos en la técnica todos o una porción de los polinucleótidos de IL-1 eta de la SEC ID Nº 1, incluyendo oligonucleótidos, utilizando técnicas bien conocidas para identificar el cromosoma humano 2, así como el locus específico del mismo, que contiene el ADN de miembros de la familia del ligando IL-1. Las técnicas útiles incluyen, pero sin limitación, utilizar la secuencia o porciones, incluyendo oligonucleótidos, como sonda en diversas técnicas bien conocidas tales como cartografía de hibridación por radiación (alta resolución), hibridación in situ con dispersión cromosómica (resolución moderada) e hibridación por transferencia Southern con estirpes celulares híbridas que contienen cromosomas humanos individuales (baja resolución).

Por ejemplo, los cromosomas pueden cartografiarse mediante hibridación por radiación que implica utilizar PCR y el panel Genebridge4 del Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research de 93 híbridos de radiación
(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_{-}STS_{-}releases/july97/rhmap/genebridge4.html). Los cebadores de PCR se encuentran dentro del gen de interés y amplifican un producto a partir del ADN genómico humano, pero no amplifican el ADN genómico de hámster. Los resultados de las PCR se convierten en un vector de datos que se envía al sitio de internet de cartografía por radiación de Whitehead/MIT (http://www-seq.wi.mit.edu). Los datos se puntúan, y se proporciona la asignación y posicionamiento cromosómicos en el mapa híbrido por radiación respecto a marcadores de sitio de secuencia marcada (STS) conocidos. El siguiente sitio web proporciona información adicional sobre la cartografía híbrida por radiación: http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/07-97.INTRO.html).

La SEC ID Nº 1 de ADN se ha cartografiado mediante hibridación por radiación en la región 2q11-12 del cromosoma humano 2. El cromosoma humano 2 está asociado a enfermedades específicas que incluyen, pero sin limitación, glaucoma, displasia ectodérmica, diabetes mellitus insulinodependiente, síndrome de la piel arrugada, leucemia de células T/linfoma y distrofia muscular tibial. Por tanto, los polinucleótidos de la SEC ID Nº 1 o un fragmento de los mismos pueden utilizarse por un experto en la técnica, utilizando técnicas bien conocidas, para analizar anormalidades asociadas a la cartografía génica del cromosoma 2. Esto posibilita distinguir afecciones en las que este marcador está redistribuido o eliminado. Además, los nucleótidos de la SEC ID Nº 1 o un fragmento de los mismos pueden utilizarse como marcador posicional para cartografiar otros genes de localización desconocida.

El ADN puede utilizarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades defectivas o insuficientes de los genes correspondientes a los polinucleótidos de la invención. La descripción en la presente memoria de las secuencias de nucleótidos nativas permite la detección de genes defectivos, y el reemplazo de los mismos por genes normales. Los genes defectivos pueden detectarse en ensayos de diagnóstico in vitro, y mediante la comparación de una secuencia de nucleótidos nativa dada a conocer en la presente memoria con la de un gen derivado de una persona sospechosa de albergar un defecto en este gen.

Otros fragmentos útiles de los polinucleótidos incluyen oligonucleótidos antisentido o con sentido que comprenden una secuencia polinucleotídica monocatenaria (de ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm (con sentido) o ADN (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o con sentido según la presente invención comprenden un fragmento de ADN (SEC ID Nº 1). Dicho fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o con sentido basándose en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) y van der Krol et al., (BioTechniques 6: 958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o con sentido a secuencias polinucleotídicas diana da como resultado la formación de dúplex que bloquean o inhiben la expresión de proteína mediante uno de varios medios, incluyendo la degradación potenciada del ARNm por ARNasaH, la inhibición del ayuste, la terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden utilizarse por tanto para bloquear la expresión de proteínas. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido comprenden adicionalmente oligonucleótidos que tienen cadenas principales de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otros enlaces de azúcar tales como los descritos en el documento WO 91/06629) y en los que dichos enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (concretamente, capaces de resistir la degradación enzimática), pero retienen especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias de nucleótidos diana.

Otros ejemplos de oligonucleótidos con sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están ligados covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia polinucleotídica diana, tal como poli(L-lisina). Todavía más, pueden unirse agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos a oligonucleótidos con sentido o antisentido para modificar especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o con sentido por la secuencia de nucleótidos diana.

Los oligonucleótidos antisentido o con sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia polinucleotídica diana mediante cualquier método de transferencia génica incluyendo, por ejemplo, lipofección, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación, o utilizando vectores de transferencia génica tales como el virus de Epstein-Barr.

Los oligonucleótidos con sentido o antisentido pueden introducirse también en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero sin limitación, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se unen a receptores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando de unirse a su molécula o receptor correspondiente, ni bloquea la entrada del oligonucleótido con sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.

Como alternativa, puede introducirse un oligonucleótido con sentido o antisentido en una célula que contiene la secuencia polinucleotídica diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido con sentido o antisentido-lípido se disocia preferiblemente dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Uso de polipéptidos y polipéptidos fragmentados de IL-1 eta.

Cada uno de los polipéptidos de la invención encuentra uso como reactivo de purificación de proteína. Los polipéptidos pueden unirse a un material de soporte sólido y utilizarse para purificar las proteínas pareja de unión mediante cromatografía de afinidad. En realizaciones particulares, se une un polipéptido (en cualquier forma descrita en la presente memoria que sea capaz de unirse a la pareja de unión) a un soporte sólido mediante procedimientos convencionales. Como ejemplo, están disponibles columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionarán con los grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos de las proteínas (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Como alternativa, se une una proteína polipéptido/Fc (como se discute anteriormente) a columnas de cromatografía que contienen proteína A o proteína G mediante interacción con el resto Fc.

El polipéptido encuentra también uso en la purificación o identificación de células que expresan la pareja de unión sobre la superficie celular. Los polipéptidos se unen a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o sustrato adecuado similar. Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con los polipéptidos y mantenerse en un recipiente de incubación mediante un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células que contienen células que expresan la pareja de unión se ponen en contacto con la fase sólida que tiene los polipéptidos sobre ella. Las células que expresan la pareja de unión sobre la superficie celular se unen a los polipéptidos fijados y las células no unidas se retiran después por lavado.

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Como alternativa, los polipéptidos pueden conjugarse con un resto detectable, e incubarse después con células para ensayar la expresión de la pareja de unión. Después de la incubación, se retira el material marcado no unido y se determina la presencia o ausencia del resto detectable sobre las células.

En una alternativa adicional, se incuban mezclas de células sospechosas de contener células que expresan la pareja de unión con polipéptidos biotinilados. Los periodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración para asegurar una unión suficiente. La mezcla resultante se pasa después a través de una columna empaquetada con perlas recubiertas con avidina, mediante la que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de las células deseadas a las perlas. Son conocidos procedimientos para el uso de perlas recubiertas con avidina (véase Berenson, et al., J. Cell. Biochem., 10D: 239, 1986). El lavado para retirar el material no unido y la liberación de las células unidas se realizan utilizando métodos convencionales.

Los polipéptidos encuentran uso también en la medida de la actividad biológica de la proteína pareja de unión en términos de su afinidad de unión. Los polipéptidos pueden emplearse por tanto por los que realizan estudios de "garantía de calidad", por ejemplo, para monitorizar la vida útil y la estabilidad de la proteína en diferentes condiciones. Por ejemplo, los polipéptidos pueden emplearse en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína pareja de unión que se ha almacenado a diferentes temperaturas o producido en diferentes tipos de célula. Las proteínas pueden utilizarse también para determinar si se retiene la actividad biológica después de la modificación de una proteína pareja de unión (por ejemplo, modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La afinidad de unión de la proteína pareja de unión modificada se compara con la de una proteína pareja de unión no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones sobre la actividad biológica de la pareja de unión. La actividad biológica de una proteína pareja de unión puede evaluarse por tanto antes de utilizarse en un estudio de investigación, por ejemplo.

Los polipéptidos encuentran también uso como vehículos para suministrar agentes unidos a los mismos a células que portan la pareja de unión. Los polipéptidos pueden utilizarse por tanto para suministrar agentes de diagnóstico o terapéuticos a dichas células (o a otros tipos celulares que se encuentra que expresan la pareja de unión sobre la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo.

Los agentes detectables (de diagnóstico) y terapéuticos que pueden unirse a un polipéptido incluyen, pero sin limitación, toxinas, otros agentes citotóxicos, fármacos, radionucleidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica y similares, eligiéndose el agente particular según la aplicación pretendida. Entre las toxinas están ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadoras ribosómicas, micotoxinas tales como tricotecenos, y derivados y fragmentos (por ejemplo, monocatenarios) de los mismos. Los radionucleidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero sin limitación, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Los ejemplos de radionucleidos adecuados para uso terapéutico son ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu.

Dichos agentes pueden unirse al polipéptido mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. El polipéptido comprende grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos que pueden reaccionar con grupos funcionales en un agente deseado formando enlaces covalentes, por ejemplo. Como alternativa, la proteína o agente puede derivatizarse generando o uniéndose a un grupo funcional reactivo. La derivatización puede implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para unir diversas moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Son conocidas una serie de técnicas para radiomarcar proteínas. Los metales radionucleidos pueden unirse a polipéptidos utilizando un agente quelante bifuncional adecuado, por ejemplo.

Por tanto, se preparan conjugados que comprenden polipéptidos y un agente de diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente ligado covalentemente). Los conjugados se administran o se emplean de otro modo en una cantidad apropiada para la aplicación particular.

Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades defectivas o insuficientes de los polipéptidos. Adicionalmente, los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno resultante (directa o indirectamente) de un exceso del polipéptido. Los polipéptidos de la presente invención pueden administrarse a un mamífero aquejado por dichos trastornos.

Los polipéptidos pueden emplearse también para inhibir una actividad biológica de la pareja de unión en procedimientos in vitro o in vivo. Por ejemplo, puede utilizarse un polipéptido de IL-1 eta purificado para inhibir la unión de IL-1 eta endógena a su receptor de superficie celular.

Los polipéptidos de la invención pueden administrarse a un mamífero para tratar un trastorno mediado por la pareja de unión. Dichos trastornos mediados por la pareja de unión incluyen afecciones causadas (directa o indirectamente) o exacerbadas por la pareja de unión.

Las composiciones de la presente invención pueden contener un polipéptido en cualquier forma descrita en la presente memoria, tal como proteínas nativas, variantes, derivados, oligómeros y fragmentos biológicamente activos. En realizaciones particulares, la composición comprende un polipéptido soluble o un oligómero que comprende polipéptidos solubles de la invención.

Se proporcionan en la presente memoria composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido de la presente invención, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptables. Los polipéptidos pueden formularse según métodos conocidos utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Pueden combinarse mezclados, como único material activo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, soluciones tamponadas con acetato y fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16ª ed., 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Además, dichas composiciones pueden complejarse con polietilenglicol (PEG), iones metálicos o incorporarse a compuestos poliméricos tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, dextrano, etc., o incorporarse a liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, acromatocitos o esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo, y por tanto se eligen según la aplicación pretendida.

Las composiciones de la invención pueden administrarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, por vía tópica, parenteral o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa o intramuscular, incluyendo también administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión. Se contempla también la liberación sostenida a partir de implantes. Un experto en la técnica pertinente reconocerá que las dosificaciones adecuadas variarán, dependiendo de factores tales como la naturaleza del trastorno que se va a tratar, el peso corporal del paciente, la edad y el estado general, y la vía de administración. Las dosis preliminares pueden determinarse según ensayos animales, y el escalado de las dosificaciones para administración humana se realiza según prácticas aceptadas en la técnica.

Se contemplan también composiciones que comprenden polinucleótidos en formulaciones fisiológicamente aceptables. El ADN puede formularse para inyección, por ejemplo.

Otro uso del polipéptido de la presente invención es como herramienta de investigación para estudiar los efectos biológicos como resultado de interacciones de IL-1 eta con su pareja de unión, o de la inhibición de estas interacciones, sobre diferentes tipos celulares. Los polipéptidos pueden emplearse también en ensayos in vitro para detectar IL-1 eta, la pareja de unión o la interacción entre los mismos.

Otra realización de la invención se refiere a usos de los polipéptidos de la invención para estudiar la transducción de señal celular. Los ligandos de la familia de IL-1 desempeñan un papel crucial en la protección contra la infección y las respuestas inflamatorias inmunes, que incluyen transducción de señal celular, activación de células endoteliales vasculares y linfocitos, inducción de citocinas inflamatorias, proteínas de fase aguda, hematopoyesis, fiebre, resorción ósea, prostaglandinas, metaloproteinasas y moléculas de adhesión. Con el aumento continuo del número de miembros de la familia de IL-1 conocidos, un esquema de clasificación adecuado es aquel basado en comparar la estructura polipeptídica así como la función (propiedades de activación y reguladora). Por tanto, IL-1 eta, como otros ligandos de la familia de IL-1 (IL-1\alpha, IL-1\beta e IL-18), estará probablemente implicado en muchas de las funciones observadas anteriormente, así como en promover respuestas inflamatorias y por lo tanto, quizás, estará implicado en la causa y el mantenimiento de enfermedades inflamatorias y/o autoinmunes tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal y psoriasis. Como tales, las alteraciones en la expresión y/o activación de los polipéptidos de la invención pueden tener profundos efectos sobre una pluralidad de procesos celulares incluyendo, pero sin limitación, la activación o inhibición de respuestas específicas celulares y proliferación. La expresión de IL-1 eta clonado o de mutantes funcionalmente inactivos del mismo puede utilizarse para identificar el papel que desempeña una proteína particular en la mediación de eventos de señalización específicos.

La señalización celular mediada por IL-1 implica a menudo una cascada de activación molecular durante la cual un receptor propaga una señal mediada por receptor de ligando activando específicamente quinasas intracelulares que fosforilan los sustratos diana. Estos sustratos pueden ser quinasas ellos mismos, que se activan después de la fosforilación. Como alternativa, pueden ser moléculas adaptadoras que facilitan la señalización cadena abajo mediante interacción proteína-proteína después de la fosforilación. Independientemente de la naturaleza de la(s) molécula(s) de sustrato, pueden utilizarse versiones funcionalmente activas expresadas de IL-1 eta y sus parejas de unión para identificar cuál(es) sustrato(s) se reconocía(n) y activaba(n) por los polipéptidos de la invención. Como tales, estos nuevos polipéptidos pueden utilizarse como reactivos para identificar nuevas moléculas implicadas en las rutas de transducción de señal.

Anticuerpos

Se proporcionan en la presente memoria anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos de la invención. Dichos anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos mediante los sitios de unión a antígeno del anticuerpo (en contraposición con la unión no específica). Por tanto, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., como se exponen anteriormente pueden emplearse como "inmunógenos" para producir anticuerpos inmunorreactivos con los mismos. Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., contienen determinantes antigénicos o epítopos que desencadenan la formación de anticuerpos.

Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos por una sola sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos por secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena polipeptídica que se ponen en estrecha proximidad tras el plegamiento proteico (C.A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 3: 9 (Garland Publishing Inc., 2ª ed., 1996)). Debido a que las proteínas plegadas tienen superficies complejas, el número de epítopos disponibles es bastante numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína y a impedimentos estéricos, el número de anticuerpos que se une realmente a los epítopos es menor que el número de epítopos disponibles (C.A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 2: 14 (Garland Publishing Inc., 2ª ed. 1996)). Los epítopos pueden identificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a epítopos antigénicos de los polipéptidos de la invención. Dichos epítopos son útiles para crear anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, como se describe con más detalle a continuación. Adicionalmente, los epítopos de los polipéptidos de la invención pueden utilizarse como reactivos de investigación, en ensayos y para purificar anticuerpos de unión específica a partir de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes a partir de hibridomas cultivados. Dichos epítopos o variantes de los mismos pueden producirse utilizando técnicas bien conocidas en la técnica tales como síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o utilizando tecnología de ADN recombinante.

En cuanto a los anticuerpos que pueden desencadenarse por los epítopos de los polipéptidos de la invención, tanto si los epítopos se han aislado como si permanecen como parte de los polipéptidos, pueden prepararse tanto anticuerpos policlonales como monoclonales mediante técnicas convencionales. Véanse, por ejemplo, "Monoclonal Antibodies: Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses", Kennet et al. (ed), Plenum Press, Nueva York (1980), y "Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow and Land (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988).

Las estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos de los polipéptidos de la invención están también contempladas en la presente memoria. Dichos hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Un método para producir dicha estirpe celular de hibridoma comprende inmunizar un animal con un polipéptido; recoger células de bazo del animal inmunizado; fusionar dichas células de bazo con una estirpe celular de mieloma, generando así células de hibridoma; e identificar una estirpe celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse mediante técnicas convencionales.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de múrido. Dichos anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo de múrido (o sólo el sitio de unión a antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Como alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de múrido y un fragmento de la región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y modificados adicionalmente por ingeniería genética incluyen los descritos en Riechmann et al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et al. (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick et al. (Biol. Technology 7: 934, 1989) y Winter y Harris (TIPS 14: 139, mayo de 1993). Los procedimientos para generar anticuerpos transgénicamente pueden encontrarse en el documento GB 2.272.440, las patentes de EE.UU. nº 5.569.825 y 5.545.806, y patentes relacionadas que reivindican prioridad de las mismas.

Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales, están también abarcados por la presente invención. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab y F(ab')_{2}. Se proporcionan también fragmentos de anticuerpo y derivados producidos mediante técnicas de ingeniería genética.

En una realización, los anticuerpos son específicos de los polipéptidos de la presente invención y no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas. Los procedimientos de examen mediante los que pueden identificarse dichos anticuerpos son bien conocidos, y pueden implicar cromatografía por inmunoafinidad, por ejemplo.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la invención, in vitro o in vivo. Los anticuerpos pueden emplearse también para purificar polipéptidos o fragmentos de la invención mediante cromatografía por inmunoafinidad.

Aquellos anticuerpos que pueden bloquear adicionalmente la unión de los polipéptidos de la invención a la pareja de unión pueden utilizarse para inhibir una actividad biológica que es el resultado de dicha unión. Dichos anticuerpos de bloqueo pueden identificarse utilizando cualquier procedimiento de ensayo adecuado, tal como ensayando en anticuerpos la capacidad de inhibir la unión de IL-1 eta a ciertas células que expresan los receptores de IL-1 eta. Como alternativa, los anticuerpos de bloqueo pueden identificarse en ensayos de la capacidad de inhibir un efecto biológico que es el resultado de la unión de los polipéptidos de la invención a sus parejas de unión en células diana. En los anticuerpos puede ensayarse la capacidad de inhibir la lisis celular mediada por IL-1 eta o mediada por la pareja de unión, por ejemplo.

Dicho anticuerpo puede emplearse en un procedimiento in vitro, o administrarse in vivo para inhibir una actividad biológica mediada por la entidad que generó el anticuerpo. Por tanto, pueden tratarse los trastornos causados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interacción de los polipéptidos de la invención con la pareja de unión. Un método terapéutico implica la administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad eficaz para inhibir una actividad biológica mediada por la pareja de unión. Los anticuerpos monoclonales se prefieren generalmente para uso en dichos métodos terapéuticos. En una realización, se emplea un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno.

En los anticuerpos pueden examinarse las propiedades agonistas (concretamente, miméticas de ligando). Dichos anticuerpos, tras la unión a receptor de superficie celular, inducen efectos biológicos (por ejemplo, transducción de señales biológicas) similares a los efectos biológicos inducidos cuando IL-1 se une a receptores de IL-1 de superficie celular. Los anticuerpos agonistas pueden utilizarse para activar células endoteliales vasculares y linfocitos, inducir la destrucción de tejido local y fiebre (Janeway et al., 1996), estimular a macrófagos y células endoteliales vasculares a producir IL-6, y regular positivamente moléculas sobre la superficie de células endoteliales vasculares.

Se proporcionan en la presente memoria composiciones que comprenden un anticuerpo que está dirigido contra polipéptidos de la invención, y un diluyente, excipiente o vehículo fisiológicamente aceptable. Los componentes adecuados de dichas composiciones son como se describen anteriormente para las composiciones que contienen polipéptidos de la invención.

Se proporcionan también en la presente memoria conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo, de diagnóstico) o terapéutico, unido al anticuerpo. Los ejemplos de dichos agentes se presentan anteriormente. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o in vivo.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden hacerse variaciones de la invención caracterizada por los ejemplos, especialmente, a la luz de las enseñanzas de las diversas referencias citadas en la presente memoria.

Ejemplo 1 Aislamiento de los polinucleótidos de IL-1 ETA

Se clonó ADN genómico humano que contiene una porción cadena arriba de un ADNc dado a conocer en el documento EP 0879889A2, y se extendió en la dirección 3'. Se secuenció el ADN genómico y se examinó la homología potencial con la sección C-terminal de miembros de la familia de IL-1. Se localizó una región con el potencial de codificar homología con la sección C-terminal de los miembros de la familia de IL-1, y se da a conocer como los polinucleótidos 375 a 585 de la SEC ID Nº 1. Se sintetizaron cebadores de PCR que contenían el codón de paro en el cebador 3' o inverso, y el ATG iniciador del ADNc de IL-1 eta (SEC ID Nº 1 del documento EP 0879889A2) en el cebador 5' o con sentido. Utilizando estos cebadores, se amplificó ADNc de IL-1 eta de la primera cadena de ADNc preparada a partir de ARNm de amígdala humana. Se realizó la PCR utilizando protocolos estándar.

Ejemplo 2 Uso de polipéptidos de IL-1 eta purificados

Se recubren diluciones en serie de muestras que contienen IL-1 eta (en NaHCO_{3} 50 mM, llevada a pH 9 con NaOH) sobre placas de microvaloración de E.I.A. de fondo plano de 96 pocillos Linbro/Titertek (ICN Biomedicals, Inc., Aurora, OH) a 100:1/pocillo. Después de la incubación a 4ºC durante 16 horas, se lavan los pocillos seis veces con 200:1 de PBS que contiene 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween). Se incuban después los pocillos con la pareja de unión FLAG® a 1 mg/ml en PBS-Tween con 5% de suero de ternero fetal (FCS) durante 90 minutos (100:1 por pocillo), seguido de lavado como anteriormente. A continuación, se incuba cada pocillo con anti-FLAG® (anticuerpo monoclonal M2 a 1 mg/ml en PBS-Tween que contiene 5% de FCS durante 90 minutos (100:1 por pocillo), seguido de lavado como anteriormente. Posteriormente, se incuban los pocillos con un anticuerpo policlonal de cabra específico anti-mIgG1 conjugado con peroxidasa de rábano picante (una dilución 1:5000 de la solución madre comercial en PBS-Tween que contiene 5% de FCS) durante 90 minutos (100:1 por pocillo). Se obtiene el anticuerpo conjugado con HRP en Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama. Se lavan después los pocillos seis veces, como anteriormente.

Para el desarrollo de un ELISA, se añade a los pocillos una mezcla de sustratos [100:1 por pocillo de una premezcla 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y solución B de peroxidasa (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)]. Después de una suficiente reacción de color, se termina la reacción enzimática mediante la adición de H_{2}SO_{4} 2 N (50:1 por pocillo). Se determina la intensidad de color (que indica la unión a receptor de ligando) midiendo la extinción a 450 nm en un lector de placas V Max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ejemplo 3 Secuencias de aminoácidos

La secuencia de aminoácidos de IL-1 eta se determinó mediante la traducción de las secuencias de nucleótidos completas de SEC ID Nº 1.

Ejemplo 4 Secuencias de ADN y de aminoácidos

La secuencia de nucleótidos de IL-1 eta aislada y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma se presentan en las SEC ID Nº 1 y 2. La secuencia del fragmento de ADN de IL-1 eta aislado mediante PCR corresponde a los nucleótidos 1 a 585 de la SEC ID Nº 1, que codifica los aminoácidos 1 a 157 de la SEC ID Nº 2.

La secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 porta una homología significativa con otros miembros de la familia del ligando IL-1 conocidos.

Ejemplo 5 Anticuerpos monoclonales que se unen a polipéptidos de la invención

Este ejemplo ilustra un método para preparar anticuerpos monoclonales que se unen a IL-1 eta. Los inmunógenos adecuados que pueden emplearse para generar dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, polipéptido IL-1 eta purificado o un fragmento inmunogénico del mismo tal como el dominio extracelular, o proteínas de fusión que contienen IL-1 eta (por ejemplo, una proteína de fusión IL-1 eta soluble/Fc).

La IL-1 eta purificada puede utilizarse para generar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con la misma, utilizando técnicas convencionales tales como las descritas en la patente de EE.UU. 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con inmunógeno de IL-1 eta emulsionado en coadyuvante completo de Freund, y se inyectan cantidades en el intervalo de 10-100 g por vía subcutánea o intraperitoneal. Diez a doce días después, se refuerzan los animales inmunizados con IL-1 eta adicional emulsionado en coadyuvante incompleto de Freund. Se refuerzan periódicamente los ratones después de ello con un esquema de inmunización semanal a bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero mediante punción retroorbital o corte en la punta de la cola para ensayar anticuerpos de IL-1 eta mediante ensayo de transferencia de mancha, ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzima) o inhibición de la unión del receptor de IL-1 eta.

Después de la detección de un título de anticuerpo apropiado, se proporciona a los animales positivos una última inyección intravenosa de IL-1 eta en solución salina. Tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se recogen células de bazo y se fusionan las células de bazo con una estirpe celular de mieloma de múrido, por ejemplo NSI, o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma que se siembran en múltiples placas de microvaloración en un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) selectivo para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de célula de bazo.

Se examina en las células de hibridoma mediante ELISA la reactividad frente a IL-1 eta purificada mediante adaptaciones de las técnicas dadas a conocer en Engvall et al. (Immunochem., 8: 871, 1971) y en la patente de EE.UU. 4.703.004. Es una técnica de examen preferida la técnica de captura de anticuerpo descrita en Beckmann et al. (J. Immunol. 144: 4212, 1990). Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse por vía intraperitoneal en ratones BALB/C singénicos para producir ascitis que contiene altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-IL-1 eta. Como alternativa, pueden hacerse crecer células de hibridoma in vitro en matraces o frascos rotativos mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de ratón pueden purificarse mediante precipitación con sulfato de amonio, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Como alternativa, puede utilizarse también la cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, así como la cromatografía de afinidad basada en la unión a IL-1 eta.

Ejemplo 6 Análisis de transferencia Northern

La distribución en tejido de IL-1 eta se investiga mediante análisis de transferencia Northern del modo siguiente. Se añade una alícuota de una ribosonda radiomarcada a dos transferencias Northern de tejido humano múltiple diferentes (Clontech, Palo Alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA). Se hibridan las transferencias en 10 x Denhardts, Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 900 mM, 0,1% de pirofosfato de sodio, 1% de SDS, ADN de esperma de salmón 200 \mug/ml. Se realiza la hibridación durante una noche a 63ºC en formamida al 50% como se describe anteriormente (March et al., Nature 315: 641-647, 1985). Se lavan después las transferencias con 2 x SSC, 0,1% de SDS a 68ºC durante 30 minutos. Se determinan las células y tejidos con los niveles más altos de ARNm de IL-1 eta en comparación con el control sondeando con una sonda específica de \beta-actina.

Ejemplo 7 Ensayo de unión

La IL-1 eta completa puede expresarse, y ensayarse la capacidad de unirse a receptores de IL-1 eta. El ensayo de unión puede realizarse del modo siguiente.

Se emplea en el ensayo una proteína de fusión que comprende un péptido de cremallera de leucina fusionado con la terminación N de un polipéptido de IL-1 eta soluble (LZ-IL-1 eta). Se prepara un constructo de expresión esencialmente como se describe para la preparación del constructo de expresión FLAG®(IL-1 eta) en Wiley et al. (Immunity, 3: 673-682, 1995); excepto porque el ADN que codifica el péptido FLAG® se reemplazó por una secuencia que codifica una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización. El constructo, en el vector de expresión pDC409, codifica una secuencia líder derivada de citomegalovirus humano, seguida por el resto de cremallera de leucina fusionado con la terminación N de un polipéptido de IL-1 eta soluble. Se expresa el LZ-IL-1 eta en células CHO y se purifica a partir del sobrenadante de cultivo.

El vector de expresión designado pDC409 es un vector de expresión de mamífero derivado del vector pDC406 descrito en McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821-2832, 1991). Los rasgos añadidos a pDC409 (comparados con pDC406) incluyen sitios de restricción únicos adicionales en el sitio de clonación múltiple (mcs); tres codones de paro (uno en cada marco de lectura) colocados cadena abajo del mcs; y un promotor de polimerasa T7, cadena abajo del mcs, que facilita la secuenciación del ADN insertado en el mcs.

Para la expresión de la proteína IL-1 eta humana completa, se amplifica la región de codificación entera (concretamente, la secuencia de ADN presentada en la SEC ID Nº 1) mediante reacción en cadena con polimerasa (PCR). El molde empleado en la PCR es el clon de ADNc aislado de ADNc de primera cadena de amígdala, como se describe en el ejemplo 1. El ADN aislado y amplificado se inserta en el vector de expresión pDC409, proporcionando un constructo designado pDC409-IL-1 eta.

El polipéptido IL-1 eta se emplea para ensayar la capacidad de unirse a células huésped que expresan receptores de IL-1 eta recombinantes o endógenos, como se discute anteriormente. Las células que expresan el receptor de IL-1 eta se cultivan en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, penicilina, estreptomicina y glutamina. Se incuban las células con LZ-IL-1 eta (5 mg/ml) durante aproximadamente 1 hora. Después de la incubación, se lavan las células para retirar el LZ-IL-1 eta no unido y se incuban con un anticuerpo monoclonal anti-LZ biotinilado (5 mg/ml) y estreptavidina conjugada a ficocritrina (1:400) antes del análisis de exploración celular activada por fluorescencia (FACS). Se realizó el análisis citométrico en un FACscan (Becton Dickinson, San José, CA).

Las células que expresan receptores de IL-1 eta mostraron una unión significativamente potenciada de LZ-IL-1 eta comparadas con las células de control que no expresan receptores de IL-1 eta.

Ejemplo 8 Análisis de expresión

Se examinaron ADNc de primera cadena presentes en Clontech (Palo Alto, CA), paneles de ADNc de tejido múltiple humano I (nº de cat. K1420-1) y II (nº de cat. K1421-1) y el panel inmune humano (nº de cat. K1426-1) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores con sentido y antisentido. Se diseñaron los cebadores para extender intrones, de modo que los productos que surgen del ADN genómico y del ADNc pudieran distinguirse. En algunos casos, se utilizaron cebadores anidados en una segunda reacción de PCR. La presencia de un producto de amplificación para cada combinación de gen/tejido se determinó mediante análisis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio.

Como alternativa, se aislaron tipos celulares individuales a partir de sangre periférica humana y se realizaron estimulaciones (Kubin et al., Blood 83(7): 1847-1855 (1994); Kubin et al., J. Exp. Med. 180 (1): 211-222 (1994)). Se incubaron células NK con IL-12 (R&D Biosystems; 1 ng/ml) durante 2 horas ó 4 horas. Las células T no se estimularon o se estimularon con anti-CD3 (anticuerpo OKT-3 inmovilizado sobre plástico a 5 ng/ml) o con la combinación de anti-CD3 y anti-CD28 (el anticuerpo anti-CD28 era CD248 utilizado en forma soluble en forma de una dilución 1:500 de fluido ascítico) durante 30 minutos o 4 horas. Los monocitos no se estimularon, o se estimularon con LPS (Sigma, 1 \mug/ml) durante 2 ó 3 horas. Las células B no se estimularon, o se estimularon la combinación de SAC al 0,05% y el trímero CD40L 500 ng/ml (Immunex) e IL-4 5 ng/ml (Immunex) durante 3,5 ó 4 horas. Se estimularon las células dendríticas con LPS como para los monocitos durante 2 ó 4 horas. Después del aislamiento de ARN y la síntesis de ADNc de primera cadena, se realizaron amplificaciones por PCR y análisis en gel.

La Tabla 1 resume los datos de expresión de IL-1 eta derivados mediante análisis por PCR de un panel de ADNc de primera cadena de Clontech. En la tabla, un "-" indica que se buscó el ARNm pero no se encontró. Los resultados de expresión positivos se designan por una "A".

TABLA I

3

<110> IMMUNEX CORPORATION

\hskip1cm

SIMS, John E.

\hskip1cm

RENSHAW, Blair R.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> ADN Y POLIPÉPTIDOS DE IL-1 ETA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 2932-WO

\vskip0.400000\baselineskip

<140> por asignar

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 25-05-2000

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/162.331

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 29-10-1999

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/135.758

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 25-05-1999

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver 2.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 585

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (112)...(585)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

5

Claims (10)

1. Un ADN seleccionado del grupo constituido por:

(a) ADN que comprende el polinucleótido de la SEC ID Nº 1;

(b) ADN que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2;

(c) ADN que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2; y

(d) ADN que es degenerado, como resultado del código genético, de un ADN definido en (a)-(c), en el que el ADN codifica un polipéptido que se une a un miembro de la familia de receptores de IL-1.

2. ADN que comprende los restos de nucleótidos 112-585 de la SEC ID Nº 1.

3. ADN que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

4. Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

(a) un polipéptido que comprende el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y

(b) un polipéptido que comprende un polipéptido que es al menos un 80% idéntico al polipéptido de la SEC ID Nº 2;

en el que el polipéptido se une a un miembro de la familia de receptores de IL-1.

5. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2.

6. Un polipéptido que comprende un polipéptido codificado por el ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

7. Un vector de expresión que comprende el ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

8. Una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 7.

9. Un método para producir un polipéptido, comprendiendo el método cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 en condiciones que causen la expresión del polipéptido.

10. Un anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.