DE60032598T2

DE60032598T2 - Il-1 eta dna und polypeptide

Info

Publication number: DE60032598T2
Application number: DE60032598T
Authority: DE
Inventors: John E. Seattle SIMS; Blair R. Renton RENSHAW
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: US20040210038A1; CA2374513C; WO2000071720A1; DK1183362T3; US20040203116A1; JP4623342B2; CY1107594T1; US20020147310A1; DE60032598D1; PT1183362E; ATE349526T1; US20090232816A1; US7235637B2; US6753166B2; JP2003500055A; AU5163500A; US7223565B2; ES2277839T3; EP1183362A1; CA2374513A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung ist auf neuartige, gereinigte und isolierte IL-1 eta Polypeptide und Fragmente davon, auf Polynukleotide, welche solche Polypeptide kodieren, auf Verfahren für die Herstellung rekombinanter Formen solcher Polypeptide, auf gegen diese Polypeptide erzeugte Antikörper, auf von diesen Polypeptiden abgeleitete fragmentierte Peptide, und auf Verwendungen davon gerichtet.
Beschreibung des Standes der Technik
Interleukin-1 (IL-1) ist ein Mitglied einer großen Gruppe von Cytokinen, deren primäre Aufgabe Immun- und entzündliche Antworten zu vermitteln ist. Es gibt sieben bekannte IL-1 Familienmitglieder, welche IL-1 Alpha (IL-1α), IL-1 Beta (IL-1β), IL-1 Rezeptorantagonist (IL-1ra), IL-1 Delta (IL-1δ), IL-1 Epsilon (IL-1ε), IL-1 Zeta (IL-ζ) und IL-18 (bisher als IGIF und manchmal als IL-1 Gamma bekannt). IL-1, welches von Makrophagen abgesondert wird, ist eigentlich eine Mischung aus größtenteils IL-1β und etwas IL-1α (Abbas et al., 1994). IL-1α und IL-1β, welche zuerst als 33 kD Vorläufer, denen eine Signalsequenz fehlt, produziert werden, werden durch proteolytische Spaltung weiter bearbeitet, um die abgesonderten, aktiven Formen, mit jeweils etwa 17 kD zu erzeugen. Zusätzlich ist auch der 33 kD Vorläufer von IL-1α aktiv. Beide IL-1 Formen sind die Produkte von zwei unterschiedlichen Genen, die auf Chromosom 2 lokalisiert sind. Obwohl die zwei Formen weniger als 30 Prozent homolog zueinander sind, binden sie beide an denselben Rezeptor und weisen eine ähnliche Aktivitäten auf.
IL-1ra, eine biologisch inaktive Form von IL-1, ist strukturell zu IL-1 homolog und bindet an dieselben Rezeptoren. Zusätzlich wird IL-1ra mit einer Signalsequenz erzeugt, die die effektive Sekretion in die extrazelluläre Region ermöglicht, wo es kompetitiv mit IL-1 konkurriert (Abbas et al., 1994).
Die IL-1 Ligandenfamilie bindet an eine Familie von zwei IL-1 Rezeptoren, die Mitglieder der Ig Superfamilie sind. IL-1 Rezeptoren umfassen den 80 kDa Typ I Rzeptor (IL- 1RI) und einen 68 kDa Typ II Rezeptor (IL-1RII). IL-1 Liganden können auch an ein lösliches proteolytisches IL-1RII Fragment (sIL-1RII) binden (Colotta et al., 1993).
Die Hauptquelle von IL-1 ist der aktivierte Makrophage oder der mononukleäre Phagozyt. Zu anderen IL-1 produzierenden Zellen zählen Epithel- und Endothelzellen (Abbas et al., 1994). Die IL-1 Sekretion aus Makrophagen tritt auf, nach dem die Makrophagen mit Gramnegativen Bakteria zusammenstoßen und diese aufnehmen. Solche Bakteria enthalten Lipopolysaccharid (LPS)-Moleküle, auch als Endotoxin bekannt, in der bakteriellen Zellwand. LPS Moleküle sind die aktiven Komponenten, die Makrophagen stimulieren, um Tumornekrosefaktor (TNF) und IL-1 zu erzeugen. In diesem Fall wird IL-1 als Antwort auf die LPS und TNF-Produktion erzeugt. Bei niederen Konzentrationen stimuliert LPS Makrophagen und aktiviert B-Zellen und andere Wirtsantworten, die benötigt werden, um die bakterielle Infektion zu eliminieren; bei hohen Konzentrationen kann LPS jedoch schwere Gewebeschädigung, Schock und sogar den Tod hervorrufen.
Zu den biologischen Funktionen von IL-1 zählen das Aktivieren von vaskulären Endothelzellen und Lymphozyten, die lokale Gewebezerstörung, und Fieber (Janeway et al., 1996). Bei niederen Konzentrationen stimuliert IL-1 Makrophagen und vaskuläre Endothelzellen, um IL-6 zu erzeugen, reguliert Moleküle auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen hinauf, um die Leukozytenadhäsion zu erhöhen, und aktiviert indirekt entzündliche Leukozyten, indem mononukleäre Phagozyten und andere Zellen stimuliert werden, um bestimmte Chemokine zu erzeugen, die entzündliche Leukozyten aktivieren. Zusätzlich ist IL-1 an anderen entzündlichen Reaktionen beteiligt, wie etwa der Induktion von Prostaglandinen, Stickoxidsynthase, und Metalloproteinasen. Diese IL-1 Funktionen sind während mikrobiellen Infektionen auf niedrigem Niveau ausschlaggebend. Wenn jedoch die mikrobielle Infektion eskaliert, wirkt IL-1 durch Induzieren von Fieber, Stimulieren mononukleärer Phagozyten, um IL-1 und IL-6 herzustellen, Erhöhen der Produktion von Serumproteinen aus Hepatozyten, und Aktivieren des Koagulationssystems systemisch. Zusätzlich ruft IL-1 nicht die hämorrhagische Nekrose von Tumoren hervor, unterdrückt die Knochenmark-Stammzellenteilung, und IL-1 ist bei hohen Konzentrationen für Menschen tödlich.
EP 0 879 889 A2 diskutiert mehrfache Verwendungen eines beispielhaften Mitglieds der IL-1 Familie. In dieser Veröffentlichung ist offenbart, dass IL-1 Delta-Polypeptide für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten, einschließlich chronischer und akuter Entzündung, Arthritis, Blutvergiftung, Autoimmunerkrankung, Transplantatabstoßung, Transplantat versus Wirt-Krankheit, Infektion, Schlaganfall, Ischämie, akutes respiratorisches Krankheitssyndrom, Restenose, Gehirnverletzung, AIDS, Knochenkrankheit, Krebs, Atherosklerose und Alzheimer-Krankheit, verwendet werden können. Andere Krankheiten für welche IL-1 Familienmitglieder für die Behandlung verwendet werden können sind entzündliche Darmkrankheit, multiples Myelom, Multiple Sklerose, Asthma, Allergie, Osteoporose, Pankreatitis, akute myelogene Leukämie, chronische myelogene Leukämie, Herzkrankheit, einschließlich Myokardinfarkt und kongestive Herzinsuffizienz, Lyme-Krankheit, Parodontalerkrankung, Sepsis, Hitzeschlag, Glomerulonephritis, Osteoarthritis, Granulomabildung, vorzeitige Wehen und Uveitis.
Angesichts der wichtigen Funktion von IL-1 gibt es einen Bedarf im Stand der Technik an zusätzlichen Mitgliedern der IL-1 Ligandenfamilie und der IL-1 Rezeptorfamilie. In Anbetracht des anhaltenden Interesses an der Proteinforschung und des Immunsystems sind weiters die Entdeckung, Identifizierung und Aufgaben von neuen Proteinen (wie das humane IL-1 eta der Erfindung) und ihrer Inhibitoren an der vordersten Stelle der modernen Molekularbiologie und Biochemie. Trotz des wachsenden Wissens gibt es nach wie vor einen Bedarf im Fachgebiet, die Identität und Funktion von Proteinen, die an zellulären und Immunreaktionen beteiligt sind, zu entdecken.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung hilft beim Erfüllen dieser verschiedenen Bedürfnissen im Stand der Technik durch Bereitstellen der isolierten Polynukleotide und der Polypeptide, die durch diese Polynukleotide kodiert sind, für den neuartigen IL-1 Familienliganden mit der Bezeichnung „IL-1 eta". Folglich ist die Erfindung in einem Aspekt auf eine DNA gerichtet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA, die das Polynukleotid der SEQ ID NR: 1 aufweist; (b) DNA, die ein Polynukleotid aufweist, das das Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 2 kodiert; (c) DNA, die ein Polynukleotid aufweist, das eine Aminosäuresequenz kodiert, die wenigstens 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2; und (d) DNA, die als Folge des genetischen Codes zu einer DNA degeneriert ist, die in (a)–(c) definiert ist, wobei die DNA ein Polypeptid kodiert, das an ein IL-1 Rezeptorfamilienmitglied bindet.
Sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA Polynukleotid-Moleküle sind durch die Erfindung umfasst. Andere Polynukleotid-Moleküle umfassen jene, die an eine denaturierte, doppelsträngige DNA, die die gesamte oder einen Teil der SEQ ID NR: 1 und/oder eine DNA, die die in SEQ ID NR: 2 dargelegte Aminosäure-Sequenzen kodiert, hybridisiert, jene, die durch in vitro Mutagnese von Polynukleotid-Molekülen, die die Sequenz der SEQ ID NR: 1 aufweisen, abgeleitet sind, jene, die von den Polynukleotiden, die die Sequenz der SEQ ID NR: 1 aufweisen, degeneriert sind, und jene, die alle Varianten der DNA der Erfindung sind.
Die Erfindung umfasst einen Expressionsvektor, welcher die DNA der Erfindung aufweist und eine Wirtszelle, die mit einem solchen Vektor transformiert ist.
Die oben erwähnten Polynukleotide können verwendet werden, um Polynukleotide zu identifizieren, die Proteine mit einer mit IL-1 Familienliganden und Rezeptoren assoziierten Aktivität kodieren. Somit können IL-1 eta Polynukleotid verwendet werden, um den IL-1 eta Rezeptor durch Kodieren des IL-1 eta Proteins zu identifizieren.
Zusätzlich können diese Polynukleotide verwendet werden, um die menschlichen Chromosome, mit welchen die Polynukleotide assoziiert sind, zu identifizieren. Folglich können die IL-1 eta Polynukleotide verwendet werden, um das menschliche Chromosom 2 zu identifizieren. Dementsprechend können diese Polynukleotide auch verwendet werden, um Gene auf dem menschlichen Chromosom 2 zu kartieren; um Gene zu identifizieren, die mit bestimmten Krankheiten, Syndromen, oder anderen mit dem menschlichen Chromosom 2 assoziierten menschlichen Zuständen assoziiert sind, und um die Zellsignalübertragung und das Immunsystem zu studieren.
Sense oder Antisense Oligonukleotide der Polynukleotide der SEQ ID NR: 1, können verwendet werden, um die Expression der DNA der Erfindung zu inhibieren.
Die Erfindung umfasst auch isolierte Polypeptide und Fragmente von IL-1 eta, wie sie durch diese Polynukleotid-Moleküle kodiert sind, einschließlich löslicher Polypeptid-Abschnitte der SEQ ID NR: 2. Somit bietet die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das das Polypeptid der SEQ ID NR: 2 enthält; und (b) einem Polypeptid, das ein Polypeptid aufweist, das wenigstens 80% identisch ist mit dem Polypeptid der SEQ ID NR: 2; wobei das Polypeptid ein IL-1 Rezeptorfamilienmitglied bindet. Die Erfindung bietet auch ein Polypeptid, das ein durch die DNA der Erfindung kodiertes Polypeptid aufweist. Die Erfindung umfasst weiters ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, welches das Kultivieren einer Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen aufweist, die die Expression des Polypeptids bewirken. Das Verfahren weist weiters das Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium auf. Insbesondere wird die Expression dieser Polypeptide in Bakterien, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder tierischen Zellen durch die Erfindung umfasst.
Im Allgemeinen können die Polypeptide der Erfindung verwendet werden, um die zellulären Vorgänge wie Immunregulation, Zellproliferation, Zelltod, Zellmigration, Zell-Zell-Wechselwirkung, und entzündliche Reaktionen zu untersuchen. Zusätzlich können diese Polypeptide verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die mit IL-1 eta Liganden assoziiert sind.
Zusätzlich können diese Polypeptide in Untersuchungen benutzt werden, um auf wirksame Aktivitätsinhibitoren, die mit Polypeptid-Counter-Strukturmolekülen assoziiert sind, zu screenen und als therapeutische Wirkstoffe für die Behandlung von Krankheiten, die durch Polypeptid-Counter-Strukturmolekülen vermittelt sind. Weiters können diese Polypeptide in der Entwicklung von Inhibitoren (z.B. biotechnologisch-hergestellte Rezeptoren, die als Inhibitoren wirken) davon verwendet werden.
Die IL-1 eta Polynukleotidsequenzen, die vorhergesagten Aminosäure-Sequenzen des Polypeptids oder Fragmente davon, oder eine Kombination der vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Polypeptids und Fragmente davon können beim Abfragen einer elektronischen Datenbank verwendet werden, um bei der Identifikation von Proben-Polynukleotide und/oder Proteinen zu helfen.
Die Erfindung stellt auch einen Antikörper bereit, der mit einem Polypeptid der Erfindung immunoreaktiv ist. Somit sind isolierte polyklonale oder monoklonale Antikörper, die an diese Polypeptide binden, ebenfalls durch die Erfindung umfasst, zusätzlich zu der Verwendung dieser Antikörper, um beim Reinigen der Polypeptide der Erfindung zu helfen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Polynukleotidmoleküle, die von der Erfindung umfasst sind, weisen die folgenden Nukleotidsequenzen auf Name: IL-1 eta
Die Aminosäure-Sequenz der durch die Nukleotid-Sequenz der Erfindung kodierten Polypeptide enthalten: Name: IL-1 eta (Polypeptid)
Die Entdeckung der IL-1 eta Polynukleotide der Erfindung ermöglicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, welche die Polynukleotidsequenzen aufweisen, die die entsprechenden Polypeptide kodieren, und Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert sind. Die Erfindung ermöglicht auch die Isolierung und Reinigung von biologisch aktiven IL-1 eta Polypeptiden und Fragmenten davon. In noch einer anderen Ausführungsform können die Polynukleotide oder Oligonukleotide davon als Sonden verwendet werden, um Polynukleotide, die Proteine mit assoziierten Aktivitäten kodieren, zu identifizieren. Somit kann IL-1 eta verwendet werden, um Aktivitäten zu identifizieren, die mit IL-1 Familienliganden assoziiert sind. Zusätzlich können die Polynukleotide oder Oligonukleotide davon von IL-1 eta verwendet werden, um die menschlichen Chromosome 2 zu identifizieren. In ähnlicher Weise können diese Polynukleotide oder Oligonukleotide davon verwendet werden, um Gene auf den menschlichen Chromosomen 2 zu kartieren, und um Gene zu identifizieren, die mit bestimmten Krankheiten, Syndromen oder anderen menschlichen Zuständen assoziiert sind, die mit menschlichen Chromosomen 2 in Verbindung stehen. Folglich können die Polynukleotide oder Oligonukleotide davon von IL-1 eta verwendet werden, um Glaukom, ektodermale Dysplasie, Insulin-abhängigen Diabetes mellitus, Faltenhaut-Syndrom, T-Zell Leukämie/Lymphoma und tibiale Muskeldystrophie zu identifizieren. Schließlich können einzelsträngige Sense oder Antisense-Oligonukleotide von diesen Polynukleotiden verwendet werden, um die Expression von Polynukleotiden zu inhibieren, die durch IL-1 eta kodiert sind.
Das IL-1 eta und die löslichen Fragmente davon können verwendet werden, um vaskuläre Endothelzellen und Lymphozyten zu aktivieren und/oder deren Aktivierung zu inhibieren, um die lokale Gewebezerstörung und Fieber zu induzieren und/oder deren Induktion zu inhibieren (Janeway et al., 1996), um Makrophagen und vaskuläre Endothelzellen zu inhibieren und/oder stimulieren, um IL-6 zu erzeugen, um Prostaglandine, Stickoxidsynthase, und Metalloproteinasen zu induzieren und/oder deren Induktion zu inhibieren, und um die Moleküle auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen hinauf zu regulieren und/oder die Aufwärtsregulierung zu inhibieren. Zusätzlich können diese Polypeptide und fragmentierten Polypeptide auch verwendet werden, um entzündliche Mediatoren, wie Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1, MAP Kinasen JNK und p38, COX-2, iNOS, und alle der durch diese Moleküle stimulierten Aktivitäten zu induzieren und/oder die Induktion zu inhibieren.
Zusätzlich können diese Polypeptide und fragmentierten Peptide auch als Molekulargewichts-Marker und als Kontrollen für die Peptid-Fragmentierung verwendet werden und die Erfindung umfasst die Ausrüstungssätze, die diese Reagenzien aufweisen. Schließlich können diese Polypeptide und Fragmente davon verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, und solche Antikörper können verwendet werden, um IL-1 eta Polypeptide zu reinigen.
POLYNUKLEOTID-MOLEKÜLE
In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung bestimmte isolierte Nukleotidsequenzen, die frei von verunreinigendem endogenem Material sind. Eine „Nukleotidsequenz" betrifft ein Polynukleotidmolekül in Form eines getrennten Fragments oder als Komponente eines größeren Polynukleotidkonstrukts. Das Polynukleotidmolekül wurde von DNA oder RNA abgeleitet, die zumindest einmal in einer im Wesentlichen reinen Form und in einer Menge oder Konzentration isoliert wurde, die eine Identifikation, Manipulation und Gewinnung der Nukleotidsequenzen deren Komponenten mittels biochemischer Standardverfahren ermöglicht (wie jene, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 dargelegt sind). Solche Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserahmens, der durch interne nicht-translatorische Sequenzen, oder Introns, nicht unterbrochen ist, die in typischen eukaroyotischen Genen vorhanden sind, bereitgestellt und/oder konstruiert. Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' von einem offenen Leserahmen vorliegen, wo die gleichen nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Region interferieren. In einem anderen Aspekt bietet die Erfindung DNA, die die Nukleotidreste 112 bis 585 der SEQ ID NR: 1 aufweist.
Polynukleotide der Erfindung schließen DNA in sowohl einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form, sowie das RNA-Komplement davon ein. DNA schließt, zum Beispiel, cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, durch PCR amplifizierte DNA, und Kombinationen davon ein. Genomische DNA kann durch herkömmliche Techniken isoliert werden, z.B., unter Verwendung der cDNA der SEQ ID NR: 1 oder eines geeigneten Fragments davon als eine Sonde.
Die DNA Moleküle der Erfindung beinhalten Gene voller Länge sowie Polynukleotide und Fragmente davon. Die Gene voller Länge können das N-terminale Signalpeptid einschließen. Andere Ausführungsformen beinhalten DNA, die eine lösliche Form kodiert, z.B. die die extrazelluläre Domäne des Proteins, mit oder ohne Signalpeptid kodiert.
Die Polynukleotide der Erfindung sind vorzugsweise von menschlichen Quellen abgeleitet, jedoch schließt die Erfindung jene ebenso mit ein, die von nicht-menschlichen Spezies abgleitet sind.
Umfasst durch die vorliegende Erfindung sind cDNA Klone mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1, die wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert wird. Das durch die Nukleotide 112–585 der SEQ ID NR: 1 kodierte Polypeptid ist in SEQ ID NR: 2 gezeigt. Diese Sequenz identifiziert das IL-1 eta der SEQ ID NR: 2 als ein Mitglied der IL-1 Familie.
Aufgrund der bekannten Degeneriertheit des genetischen Kodes, worin mehr als ein Kodon dieselbe Aminosäure kodieren kann, kann eine DNA von der in den SEQ ID NR: 1 gezeigten abweichen und dennoch ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 kodieren. Eine solche abweichende DNA kann von versehentlichen Mutationen (die z.B. während der PCR-Amplifizierung auftreten) resultieren, oder kann das Produkt einer absichtlichen Mutagenese einer nativen Sequenz sein.
Die Erfindung bietet isolierte DNA ausgewählt aus: (a) DNA, die die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1 aufweisen, (b) DNA, die die Nukleotide 112–585 der SEQ ID NR: 1 aufweisen; (c) DNA, die die Polypeptide der SEQ ID NR: 2 kodieren; (d) DNA, die in der Lage ist, an eine DNA von (a)–(c) unter Bedingungen mäßiger Stringenz hybridisieren und welche Polypeptide der Erfindung kodiert; (e) DNA, die das Komplement ist, und zum Hybridisieren an eine DNA von (a)–(d) unter Bedinungen hoher Stringenz in der Lage ist und welche Polypeptide der Erfindung kodiert, und (f) DNA, die als Folge des genetischen Codes zu einer DNA degeneriert ist, die in (a), (b), (c), (d) oder (e) definiert ist, und welche Polypeptide der Erfindung kodieren. DNA, die Fragmente der Polypeptide der SEQ ID NR: 2 kodiert, die biologisch aktiv sind, z.B. die an IL-1 Rezeptor binden, sind ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst. Natürlich sind Polypeptide, die durch solche DNA Sequenzen kodiert sind, durch die Erfindung umfasst.
Wie hierin verwendet, können Bedingungen mäßiger Stringenz leicht durch einen Durchschnittsfachmann basierend zum Beispiel auf der Länge der DNA bestimmt werden. Die grundlegenden Bedingungen sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1, S. 1.101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) dargelegt, und beinhalten die Verwendung einer Vorwaschlösung für die Nitrozellulose-Filter 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), Hybridisierungsbedingungen von etwa 50% Formamid, 6XSSC bei etwa 42°C (oder einer anderen ähnlichen Hybridisierungslösung, wie etwa Stark's Lösung in etwa 50% Formamid bei etwa 42°C), und Waschbedingungen von etwa 60°C, 0,5X SSC, 0,1% SDS. Bedingungen hoher Stringenz können ebenfalls leicht durch den Durchschnittsfachmann basierend auf, zum Beispiel, der Länge der DNA, bestimmt werden. Im Allgemeinen sind solche Bedingungen als Hybridisierungsbedingungen, wie oben, definiert, und mit Waschen bei ungefähr 68°C, 0,2X SSC, 0,1% SDS. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur und Waschlösung-Salzkonzentration nach Bedarf, wie z.B. gemäß Faktoren, wie der Länge der Sonde, eingestellt werden können Ebenfalls durch die Erfindung umfasst, ist eine DNA, die Polypeptidfragmente kodiert und DNA, die Polypeptide kodieren, die inaktivierte N-Glycosylierungsstellen, inaktivierte Protease-Bearbeitungsstellen, oder konservative Aminosäure-Substitutionen aufweisen, wie unten beschrieben ist.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die Polynukleotid-Moleküle der Erfindung auch Polynukleotide, die zumindest 80% identisch sind zu einer nativen DNA sind. Ebenfalls umfasst sind Ausführungsformen, in welchen ein Polynukleotid ein Molekül enthält, das zumindest 90% identisch, zumindest 95% identisch, zumindest 98% identisch, zumindest 99% identisch oder zumindest 99,9% identisch zu einer nativen Sequenz ist.
Die prozentuelle Identität kann durch visuelle Begutachtung und mathematische Berechungen bestimmt werden. Alternativ kann die prozentuelle Identität von zwei Polynukleotidsequenzen durch Vergleichen der Sequenzinformationen unter Verwendung des GAP Computerprogramms, Version 6,0, das von Devereux et al., (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) beschrieben und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist, bestimmt werden. Die bevorzugten Voreinstellungen für das GAP-Programm beinhalten: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (enthält einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten) für Nukleotide, und die gewichtete Vergleichsmatirx von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg. Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353–358, 1979 beschrieben ist; (2) einen Strafpunkt von 3,0 für jede Lücke und einen zusätzlichen Strafpunkt von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) kein Strafpunkt für Endlücken. Andere Programme, die von Fachleuten auf dem Gebiet des Sequenzvergleichs verwendet werden, können ebenso eingesetzt werden.
Die Erfindung bietet isolierte Polynukleotide, die in der Herstellung von Polypeptiden nützlich sind. Solche Polypeptide können durch irgendeine einer Vielzahl von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Ein DNA, die ein Polypeptid der Erfindung kodiert, oder ein gewünschtes Fragment davon, kann in einen Expressionsvektor für die Herstellung des Polypeptids oder Fragments subkloniert werden. Die DNA Sequenz wird vorteilhafterweise mit einer DNA fusioniert, die eine geeignete Leitsequenz oder ein geeignetes Signalpeptid kodiert. Alternativ kann das gewünschte Fragment mittels bekannter Techniken chemisch synthetisiert werden. DNA Fragmente können auch durch Restriktionendonuklease-Verdau einer klonierten DNA Sequenz voller Länge und Isolieren durch Elektrophorese in einem Agarosegel hergestellt werden. Wenn notwendig können Oligonukleotide, die den 5' oder 3' Terminus bis zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, an ein DNA Fragment, das durch Restriktionsenzymverdau erzeugt wurde, ligiert werden. Solche Oligonukleotde können zusätzlich eine Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle stromaufwärts von der gewünschten kodierenden Sequenz enthalten und positionieren ein Startkodon (ATG) an dem N-Terminus der kodierenden Sequenz.
Das bekannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahren kann auch eingesetzt werden, um eine DNA, die ein gewünschtes Proteinfragment kodiert, zu isolieren und zu amplifizieren. Oligonukleotide, die die gewünschten Termini des DNA Fragments definieren, werden als 5' und 3' Primer eingesetzt. Die Oligonukleotide können zusätzlich Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, um die Einfügung des amplifizierten DNA Fragments in einen Expressionsvektor zu erleichtern. PCR-Techniken sind in Saiki et al., Science, 239:487, (1988): Recombinant DNA Methodology, Wu et al., Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego, (1989), S. 189–196; und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Hrsg., Academic Press, Inc., 1990, beschrieben.
Polypeptide und Fragmente davon
Die Erfindung umfasst Polypeptide und Fragmente davon in verschiedenen Formen, einschließlich jener, die natürlich vorkommen oder durch verschiedene Techniken hergestellt sind, wie etwa Verfahren, die die rekombinante DNA Technologie einbinden. Zu solchen Formen zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Derivate, Varianten, oder Oligomere sowie Fusionsproteine oder Fragmente davon.
Zu den Polypeptiden der Erfindung zählen Proteine voller Länge, die durch die oben dargelegten Polynukleotidsequenzen kodiert werden. Besonders bevorzugte Polypeptide von IL-1 eta weisen die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID NR: 2 auf.
Die Polypeptide der Erfindung können sezerniert werden und sind somit löslich. Lösliche Polypeptide sind zum Sezernieren aus den Zellen, in welchen sie exprimiert werden, in der Lage. Im Allgemeinen können lösliche Polypeptide durch Trennen der intakten Zellen, die das gewünschte Polypeptid exprimieren, von dem Kulturmedium, z.B. durch Zentrifugation, und Untersuchen des Mediums (Überstand) auf die Gegenwart des gewünschten Polypeptids identifiziert (und von nicht löslichen Membran-gebundenen Gegenstücken unterschieden) werden. Die Gegenwart des Polypeptids in dem Medium deutet darauf hin, dass das Polypeptid aus den Zellen sezerniert wurde und somit eine lösliche Form des Proteins ist.
In einer Ausführungsform weisen die löslichen Polypeptide und Fragmente davon die gesamte oder Teile der extrazellulären Domäne auf, es fehlt ihnen jedoch die Transmembranregion, die die Zurückhaltung des Polypeptids an der Zellmembran verursachen würde. Ein lösliches Polypeptid kann die cytoplasmatische Domäne, oder einen Teil davon, enthalten, solange das Polypeptid aus den Zellen, in welchen es produziert wird, sezerniert wird.
Im Allgemeinen ist die Verwendung löslicher Formen für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Polypeptide aus rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Polypeptide aus den Zellen sezerniert werden. Weiters sind lösliche Polypeptide im Allgemeinen für die intravenöse Verabreichung geeigneter.
Die Erfindung bietet auch Polypeptide und Fragmente der extrazellulären Domäne, die eine gewünschte biologische Aktivität beibehalten. Besondere Ausführungsformen sind auf Polypeptid-Fragmente der SEQ ID NR: 2 gerichtet, die die Fähigkeit an native Verwandte, Substrate oder Gegenstrukturen („Bindungspartner") zu binden, beibehalten. Solch ein Fragment kann ein lösliches Polypeptid, wie oben beschrieben, sein. In einer anderen Ausführungsform enthalten die Polypeptide und Fragment vorteilhafterweise Regionen, die in den IL-1 Liganden und der IL-1 Rezeptorfamilie, wie oben beschrieben, konserviert sind.
Ebenfalls bereitgestellt hierin sind, Polypeptidfragmente, die zumindest 20, oder zumindest 30, zusammenhängende Aminosäuren der Sequenzen der SEQ ID NR: 2 aufweisen. Peptidfragmente können auch als Immunogene, beim Herstellen von Antikörpern eingesetzt werden.
Natürlich vorkommende Varianten sowie abgeleitete Varianten der Polypeptide und Fragmente sind hierin bereitgestellt.
Varianten können Aminosäuresequenzen aufweisen, die zumindest 80% identisch sind. Ebenfalls berücksichtigt sind Ausführungsformen, in welchen ein Polypeptid oder Fragment eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die zumindest 90% identisch, zumindest 95% identisch, zumindest 98% identisch, zumindest 99% identisch oder zumindest 99,9% identisch ist zu dem bevorzugten Polypeptid oder Fragment davon. Die prozentuelle Identität kann durch visuelle Inspektion und mathematische Berechnung bestimmt werden. Alternativ kann die prozentuelle Identität von zwei Proteinsequenzen durch Vergleichen der Sequenzinformation unter Verwendung des GAP Computerprogramm, basierend auf dem Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Bio 48:443, 1970) und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist, bestimmt werden. Die bevorzugten Voreinstellungen für das GAP-Programm beinhalten: (1) eine Scoring-Matrix, blosum62, wie von Henikoff und Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915, 1992) beschrieben; (2) ein Lückengewicht von 12; (3) ein Gewicht für die Lückenlänge von 4; und (4) keinen Strafpunkt für Endlücken. Andere Programme, die von einem Fachmann auf dem Gebiet des Sequenzvergleiches verwendet werden, können auch eingesetzt werden.
Die Varianten der Erfindung beinhalten, zum Beispiel, jene, die von alternativen mRNA-Spleißvorgängen oder einer proteolytischen Spaltung resultieren. Alternatives Spleißen von mRNA kann, zum Beispiel, ein verkürztes, jedoch biologisch aktives Protein ergeben, wie z.B. eine natürlich vorkommende, lösliche Form des Proteins. Variationen, die der Proteolyse zugeschrieben werden können, beinhalten, zum Beispiel, Unterschiede in den N- oder C-Termini bei der Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen, aufgrund der proteolytischen Entfernung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren von dem Protein (im Allgemeinen zwischen 1–5 terminalen Aminosäuren). Proteine, in welchen Aminosäure-Sequenzunterschiede dem genetischen Polymorphismus (allelische Variation unter Individuen, die das Protein erzeugen) zuzuschreiben sind, sind ebenfalls hierin vorgesehen.
Zusätzliche Varianten innerhalb des Umfangs der Erfindung beinhalten Polypeptide, die modifiziert werden können, um Derivate davon durch Bilden kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Anteilen, wie Glycosyl-Gruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetyl-Gruppen und dergleichen, zu erzeugen. Kovalente Derivate können durch Verbinden der chemischen Anteile mit funktionellen Gruppen von Aminosäuren-Seitenketten oder an dem N-Terminus oder C-Terminus eines Polypeptids hergestellt werden. Konjugate, die diagnostische (detektierbare) oder therapeutische Wirkstoffe, die daran angeheftet sind, aufweisen, werden hierin in Erwägung gezogen, wie unten detaillierter diskutiert ist.
Andere Derivate beinhalten kovalente oder aggregative Konjugate der Polypeptide mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Beispiele von Fusionsproteinen sind unten im Zusammenhang mit Oligomeren diskutiert. Fusionsproteine können weiters hinzugefügte Peptide aufweisen, um die Reinigung und Identifikation zu erleichtern. Zu solchen Peptiden zählen, zum Beispiel, poly-His oder die im U.S. Patent No. 5.011.912 und in Hopp et al. Bio/Technology, 6:1204, 1988 beschriebenen antigenen Identifikationspeptide. Ein solches Peptid ist das Flag^®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NR: 11), welches hoch antigen ist und ein Epitop bereitstellt, welches durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper reversibel gebunden wird, was eine schnelle Untersuchung ermöglicht und die Reinigung von exprimiertem rekombinantem Protein erleichtert. Ein als 4E11 bezeichnetes murines Hybridom erzeugt einen monoklonalen Antikörper, der das Flag^®-Peptid in der Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Metallkationen, wie im U.S. Patent 5.011.912 beschrieben, bindet. Die 4E11 Hybridom-Zelllinie wurde bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer HB 9259 hinterlegt. Monoklonale Antikörper, die das Flag^®-Peptid binden, sind von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Divison, New Haven Connecticut erhältlich.
Unter den hierin bereitgestellten Polypeptid-Varianten sind Varianten von nativen Polypeptiden, die die native biologische Aktivität oder das substantielle Äquivalent davon beibehalten. Ein Beispiel ist eine Variante, die im Wesentlichen mit der gleichen Bindungsaffinität bindet, wie es die native Form tut. Die Bindungsaffinität kann durch herkömmliche Verfahren, z. B. wie in U.S. Patent No 5.512.457 beschrieben und wie unten dargelegt ist, gemessen werden.
Zu Varianten zählen Polypeptide, die im Wesentlichen homolog zu der nativen Form sind, aber welche eine Aminosäure-Sequenz aufweisen, die sich von der der nativen Form, aufgrund von einer oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen, unterscheidet. Besondere Ausführungsformen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polypeptide, die eine bis zehn Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäure-Resten aufweisen, wenn sie mit einer nativen Sequenz verglichen werden.
Eine gegebene Aminosäure kann, zum Beispiel, durch einen Rest mit ähnlichen physiochemischen Charakteristika ersetzt werden. Beispiele von solchen konservativen Substitutionen umfassen Substitutionen von einem aliphatischen Rest durch einen anderen, wie Ile, Val, Leu, oder Ala für einander, Substitutionen von einem polaren Rest durch einen anderen, wie zwischen Lys und Arg, Glu und Asp, oder Gln und Asn; oder Substitutionen von einem aromatischen Rest durch einen anderen, wie Phe, Trp, oder Tyr für einander. Andere konservative Substitutionen, die beispielsweise Substitutionen von ganzen Regionen mit ähnlichen Hydrophobizität-Charakteristica einschließen, sind bekannt.
Ähnlicherweise beinhalten die DNAs der Erfindung Varianten, die sich von einer nativen DNA-Sequenz aufgrund einer oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterscheiden, jedoch ein biologisch aktives Polypeptid kodieren.
Die Erfindung beinhaltet weiters Polypeptide der Erfindung mit oder ohne assoziierten Glycosylierung nativen Musters. In Hefe oder Säugetier-Expressionsystemen (z.B., COS-1 oder COS-7 Zellen) exprimierte Polypeptide können zu einem nativen Polypeptid in Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster, abhängig von der Wahl des Expressionssystems, ähnlich oder wesentlich verschieden sein. Die Expression von Polypeptiden der Erfindung in bakteriellen Expressionsystemen, wie E. coli, liefert nicht-glycosylierte Moleküle. Eine gegebene Zubereitung kann weiters mehrere unterschiedlich glycosylierte Spezies des Proteins enthalten. Glycosyl-Gruppen können durch herkömmliche Verfahren entfernt werden, insbesondere jenen, die Glycopeptidase benutzten. Im Allgemeinen können glycosylierte Polypeptide der Erfindung mit einem molaren Überschuss an Glycopeptidase (Boehringer Mannheim) inkubiert werden.
Dementsprechend sind ähnliche DNA Konstrukte, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäuren-Resten oder Sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen kodieren, durch die Erfindung umfasst. Zum Beispiel können N-Glycosylierungsstellen in der extrazellulären Domäne des Polypeptids modifiziert werden, um die Glycosylierung zu verhindern, was die Expression eines reduzierten Kohlenhydrat-Analogons in Säugetier- und Hefe-Expressionsystemen ermöglicht. Die N- Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind durch ein Aminosäure Triplett Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X eine beliebige Aminosäure, außer Pro ist und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen zu der Nukleotidsequenz, die diese Tripletts kodiert, werden zu der Verhinderung der Anlagerung on Kohlenhydratresten an die Asn-Seitenkette führen. Die Änderung eines einzelnen Nukleotids, welches so ausgewählt ist, dass Asn zum Beispiel durch eine unterschiedliche Aminosäure ersetzt wird, ist ausreichend, um eine N-Glycoslyierungsstelle zu inaktivieren. Alternativ kann das Ser oder Thr durch eine andere Aminosäure, wie Ala, ersetzt sein. Bekannte Verfahren für das Inaktivieren der N-Glycosylierungsstellen in Proteinen beinhalten jene, die im U.S Patent 5.071.972 und EP 276.846 beschrieben sind.
In einem anderen Beispiel von Varianten können Nukleotide, die Cys-Reste kodieren, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind, verändert werden, um zu bewirken, dass Cys-Reste deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Ausbildung von inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei der Faltung oder Renaturierung zu verhindern.
Andere Varianten werden durch Modifizierung von benachbarten zweiwertigen Aminosäure-Resten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen, in welchen KEX2 Protease-Aktivität vorhanden ist, zu erhöhen. EP 212.914 offenbart die Verwendung einer ortsspezifischen Mutagenese, um die KEX2-Protease-Bearbeitungsstellen in einem Protein zu inaktivieren. KEX2-Protease-Bearbeitungsstellen werden durch Deletieren, Addieren oder Substituieren von Resten, um Arg-Arg, Arg-Lys, und Lys-Arg-Paare zu verändern, um das Auftreten von diesen benachbarten basischen Resten zu eliminieren, inaktiviert. Lys-Lys-Paarungen sind wesentlich weniger empfänglich gegenüber einer KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für das Inaktivieren von KEX2-Stellen dar.
Durch die Erfindung umfasst sind Oligomere oder Fusionsproteine, die IL-1 eta Polypeptide enthalten. Solche Oligomere können in Form von kovalent-gebundenen oder nicht-kovalent-gebundenen Multimeren sein, einschließlich Dimeren, Trimeren oder höhere Oligomeren. Wie oben erwähnt ist, sind bevorzugte Polypeptide löslich und folglich können diese Oligomere lösliche Polypeptide aufweisen. In einem Aspekt der Erfindung bewahren die Oligomere die Bindungsfähigkeit der Polypeptid-Komponenten und bieten dafür zwei-, dreiwertige, etc. Bindungsstellen.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf Oligomere gerichtet, die mehrere Polypeptide aufweisen, die über kovalente oder nicht-kovalente Interaktionen zwischen Peptidanteilen verbunden sind, die an die Polypeptide fusioniert sind. Solche Peptide können Peptidlinker (Spacer) oder Peptide, die Oligomerisierung-fördernde Eigenschaften aufweisen, sein. Leucin-Zipper und bestimmte von Antikörper abgeleitete Polypeptide sind unter den Peptiden, die die Oligomerisierung von daran angelagerten Polypeptiden fördern, wie detaillierter unten beschrieben ist.
Als eine Alternative wird ein Oligomer unter Verwendung von Polypeptiden, die von Immunglobulinen abgleitet sind, hergestellt. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die bestimmte heterologe Polypeptide, die mit verschiedenen Abschnitten von Antikörperabgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind, aufweisen, wurde z.B. in Ashkenazi et al., (PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344:677, 1990); und Hollenbaugh und Aruffo, („Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins," in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, Seiten 10.19.1–10.19.11, 1992) beschrieben.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein Dimer gerichtet, das zwei Fusionsproteine aufweist, die durch Fusionieren eines Polypeptids der Erfindung an ein von einem Antikörper abgeleitetes Fc-Polypeptid hergestellt wurde. Eine Genfusion, die das Polypeptid/Fc Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expresssionsvektor eingeführt. Polypeptid/Fc Fusionsproteine werden in Wirtszellen, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert sind, exprimiert, und es wird ihnen ermöglicht, sich ähnlich wie Antikörpermoleküle zusammenzulagern, woraufhin sich Zwischenketten-Disulfidbindungen zwischen den Fc-Anteilen ausbilden, um zweiwertige Moleküle zu ergeben.
Der Begriff „Fc Polypeptid", so wie hierin verwendet, umfasst native und Muteinformen von Polypeptiden, die aus der Fc-Region eines Antikörpers aufgebaut sind, der eine beliebige oder alle der CH-Domänen der Fc-Region ausweist. Verkürzte Formen solcher Polypeptide, die die Hinge-Region enthalten, die die Dimerisierung fördert, sind ebenfalls eingeschlossen. Bevorzugte Polypeptide weisen ein Fc-Polypeptid auf, welches von einem humanen IgG1-Antikörper abgeleitet ist.
Ein geeignetes Fc-Polypeptid, beschrieben in der PCT Anmeldung WO 93/10151, hierin durch Bezugnahme aufgenommen, ist ein einkettiges Polypeptid, welches sich von der N-terminalen Hinge-Region bis zu dem nativen C-Terminus der Fc Region eines menschlichen IgG1 Antikörpers erstreckt. Ein anderes nützliches Fc-Polypeptid ist das im U.S. Patent 5.457.035 und in Baum et al., (EMBO J. 13:3992–4001, 1994) beschriebene Fc-Mutein. Die Aminosäure-Sequenz dieses Muteins ist identisch zu der der nativen Fc-Sequenz, die in WO 93/10151 dargestellt ist, mit der Ausnahme, dass die Aminosäure 19 von Leu auf Ala, Aminosäure 20 von Leu zu Glu, und Aminosäure 22 von Gly zu Ala geändert wurde. Das Mutein zeigt eine verringerte Affinität für Fc-Rezeptoren.
Die oben-beschriebenen Fusionsproteine, die Fc-Anteile (und daraus gebildete Oligomere) aufweisen, bieten den Vorteil einer leichten Reinigung durch Affinitätschromatographie an Protein A oder Protein G-Säulen.
In anderen Ausführungsformen können die Polypeptide der Erfindung durch den variablen Abschnitt einer schweren oder leichten Kette eines Antikörpers ersetzt werden. Wenn Fusionsproteine sowohl mit den schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein Oligomer mit bis zu vier Polypeptid-extrazellulären-Regionen zu bilden.
Alternativ ist das Oligomer ein Fusionsprotein, welches mehrere Polypeptide, mit oder ohne Peptidlinker (Spacer-Peptide) aufweist. Unter den geeigneten Peptidlinkern sind jene, die in den U.S. Patenten 4.751.180 und 4.935.233 beschrieben sind. Eine DNA Sequenz, die einen gewünschten Peptidlinker kodiert, kann zwischen, und in den gleichen Leserahmen wie, die DNA Sequenzen der Erfindung unter Verwendung einer beliebigen geeigneten konventionellen Technik eingeführt werden. Zum Beispiel kann ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, welches den Linker kodiert, zwischen die Sequenzen ligiert werden. In besonderen Ausführungsformen weist ein Fusionsprotein von zwei bis vier lösliche Polypeptide der Erfindung, die durch Peptidlinker getrennt sind, auf.
Ein anderes Verfahren zum Herstellen von Oligomeren der Erfindung schließt die Verwendung eines Leucin-Zippers ein. Leucin-Zipper-Domänen sind Peptide, die die Oligomerisierung der Proteine, in welchen sie gefunden werden, fördern. Leucin-Zipper wurden ursprünglich in mehreren DNA-Bindungsproteinen (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988) identifiziert, und sind seit damals in einer Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen gefunden worden. Unter den bekannten Leucin-Zippers sind natürlich vorkommende Peptide und Derivate davon, die dimerisieren oder trimerisieren.
Die Zipper-Domäne (hierin auch als oligomerisierende oder Oligomer-bildende Domäne bezeichnet) weist eine sich wiederholende Sequenz von sieben Aminosäuren (heptad repeat) auf, die häufig mit vier bis fünf Leucin-Resten, die mit anderen Aminosäuren durchsetzt sind, aufweisen. Beispiele von Zipper-Domänen sind jene, die in dem Hefe-Transkriptionsfaktor GCN4 gefunden werden und einem in Rattenleber gefundenen hitzestabilen DNA-Bindungsprotein (C/EBP; Landschulz et al., Science, 243:1681, 1989). Zwei Kerntransformierende Proteine, fos und jun, weisen ebenfalls Zipper-Domänen auf, ebenso wie das Genprodukt des murinen Protoonkogens, c-myc (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988). Die Produkte der nuklearen Onkogene fos und jun weisen Zipper-Domänen auf, die vorzugsweise Heterodimere bilden (O'Shea et al., Science, 245:646, 1989; Turner und Tijan, Science, 243:1689, 1989). Die Zipper-Domäne ist für die biologische Aktivität (DNA Bindung) in diesen Proteinen notwendig.
Die fusogenen Proteine mehrere unterschiedlicher Viren, einschließlich Paramyxovirus, Coronavirus, Masernvirus und viele Retroviren, besitzen auch Zipper-Domänen (Buckland und wird, Nature, 338:547, 1989; Britton, Nature, 353:394, 1991; Delwart und Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses, 6:703, 1990). Die Zipper-Domänen in diesen fusogenen viralen Proteinen sind in der Nähe der Transmembranregion der Proteine; es ist vorgeschlagen worden, dass die Zipper-Domänen zu der oligomeren Struktur der fusogenen Proteine beitragen könnten. Die Oligomerisierung von fusogenen viralen Proteinen ist in der Fusionsporenbildung eingebunden (Spruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3523, 1991). Es ist kürzlich von Zipper-Domänen berichtet worden, dass sie eine Rolle in der Oligomerisierung von Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren (Rabindran el al., Science, 25:230, 1993) spielen.
Zipper-Domänen falten als kurze, parallele coiled coils (O'Shea et al., Science, 254:539, 1991). Die allgemeine Architektur von parallelen coiled coils sind gut charakterisiert worden, mit einer „Knauf in Loch" (knobs-into-holes)-Packung, wie von Crick in 1953 (Acta Crystallogr. 6:689) vorgeschlagen wurde. Das durch eine Zipper-Domäne gebildete Dimer wird durch das „heptad repeat" stabilisiert, mit der Bezeichung (abcdefg)_n gemäß der Notation von McLachlan und Stewart (J. Mol. Biol., 98:293, 1975), bei welcher die Reste a und d im Allgemeinen hydrophobe Reste sind, wobei d Leucin ist, das sich auf der gleichen Fläche der Helix anreiht. Für gewöhnlich treten entgegengesetzt-gelandene Reste an den Positionen g und e auf. Somit sind in einer parallelen coiled Coil, die aus zwei helikalen Zipper-Domänen gebildet ist, die durch die hydrophoben Seitenkette der ersten Helix gebildeten „Knäufe" in die durch die Seitenketten der zweiten Helix gebildeten „Löcher" gepackt.
Die Reste an Position d (häufig Leucin) tragen eine hohe hydrophobe Stabilisierungsenergie bei, und sind für die Oligomer-Bildung wichtig (Krystek et al., Int. J. Peptide Res., 38:229, 1991). Lovejoy et al. (Science, 259:1288, 1993) haben vor kurzem über die Synthese eines dreisträngigen α-helikalen Bündels berichtet, in welchem die Helices nach oben-oben-unten verlaufen. Ihre Studien bestätigten, dass die hydrophobe Stabilisierungserergie, die Hauptantriebskraft für die Bildung von coiled coils aus helikalen Monomeren bereitstellt. Diese Studien weisen auch darauf hin, dass elektrostatische Interaktionen zu der Stoichiometrie und Geometrie von coiled coils beitragen. Eine weitere Erörterung der Struktur von Leucin-Zippers kann in Harbury et al. (Science, 262:1401, 26. November 1993) gefunden werden.
Beispiele von Leucin-Zipper-Domänen, die für das Herstellen löslicher oligomerer Proteine geeignet sind, sind in der PCT-Anmeldung WO 94/10308 beschrieben, und der vom Lungen-oberflächenaktiven Protein D (SPD) abgeleitete Leucin-Zipper ist in Hoppe et al. (FEBS Letters, 344:191, 1994) beschrieben. Die Verwendung eines modifizierten Leucin-Zippers, der eine stabile Trimerisierung eines daran fusionierten heterologen Proteins ermöglicht, wird in Fanslow et al., (Semin. Immunol., 6:267–278, 1994) beschrieben. Rekombinante Fusionsproteine, die ein an ein Leucin-Zipper-Peptid fusioniertes lösliches Polypeptid aufweisen, werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert, und das sich bildende lösliche Oligomer wird aus dem Kulturüberstand gewonnen.
Bestimmte Leucin-Zipper-Anteile bilden vorzugsweise Trimere. Ein Beispiel ist ein Leucin-Zipper, der vom Lungen-oberflächenaktiven Protein D (SPD) abgeleitet ist, wie in Hoppe et al. (FEBS Letters, 344:191, 1994) und im U.S. Patent 5.716.805 beschrieben ist. Dieses Lungen-SPD-abgeleitete Leucin-Zipper-Peptid weist die Aminosäuresequenz Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr auf.
Ein anderes Beispiel eines Leucin-Zippers, der die Trimerisierung fördert, ist ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg aufweist, wie im U.S. Patent 5.716.805 beschrieben ist. Bei einer alternativen Ausführungsform wird ein N-terminaler Asp-Rest hinzugefügt; in einer anderen, fehlt dem Peptid der N-terminale Arg-Rest.
Fragmente der vorangehenden Zipper-Peptide, die die Eigenschaften des Förderns der Oligomerisierung beibehalten, können auch eingesetzt werden. Zu Beispielen von solchen Fragmenten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Peptide, denen ein oder zwei der N-terminalen oder C-terminalen Reste, die in den vorangehenden Aminosäure-Sequenzen vorhanden sind, fehlen. Leucin-Zippers können von natürlich vorkommenden Leucin-Zipper-Domänen abgeleitet sein, z.B. mittels konservativen Substitutionen) in der natürlichen Aminosäuresequenz, wobei die Fähigkeit des Peptids, die Oligomerisierung zu fördern, beibehalten wird.
Andere Peptide, die von natürlich vorkommenden trimeren Proteinen abgeleitet sind, können beim Herstellen trimerer Oligomere eingesetzt werden. Alternativ können synthetische Peptide, die die Oligomerisierung fördern, eingesetzt werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Leucin-Reste in einem Leucin-Zipper-Anteil durch Isoleucin-Reste ersetzt. Solche Isoleucin aufweisenden Peptide können als Isoleucin-Zippers bezeichnet werden, sind aber durch den Begriff „Leucin-Zippers", wie hierin eingesetzt, umfasst.
Herstellung von Polypeptiden und Fragmenten davon
Expression, Isolierung und Reinigung der Polypeptide und Fragmente der Erfindung kann durch jede geeignete Technik erreicht werden, einschließlich der folgenden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein:
Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante DNA enthaltende Klonierungs- und Expressionsvektoren bereit, sowie eine Wirtszelle, die die rekombinanten Vektoren enthält. DNA enthaltende Expressionsvektoren können verwendet werden, um die durch die DNA kodierten Polypeptide oder Fragmente der Erfindung herzustellen. Ein Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden weist das Kultivieren von mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der das Polypeptid kodiert, transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids fördern, und dann das Gewinnen des exprimierten Polypeptids aus der Kultur auf. Der Fachmann wird erkennen, dass das Verfahren zum Reinigen der exprimierten Polypeptide in Abhängigkeit von Faktoren wie der Art der eingesetzten Wirtszellen, und ob das Polypeptid Membran-gebunden oder eine lösliche Form ist, die aus der Wirtszelle sezerniert wird, variieren wird.
Jedes geeignete Expressionssystem kann eingesetzt werden. Die Vektoren enthalten eine wirkungsmäßig an geeignete transkriptionale oder translatorische regulatorische Nukleotidsequenzen gebundene DNA, die ein Polypeptid oder Fragment der Erfindung kodiert, wie jene die von einem Säugetier-, mikrobiellen, viralen oder Insektengen abgeleitet sind. Zu Beispielen von regulatorischen Sequenzen zählen Transkriptionspromotoren, Operatoren, oder Enhancer, eine mRNA ribosomale Bindungsstelle, und geeignete Sequenzen, die die Transkription und Translation-Initiierung und Termination steuern. Nukleotidsequenzen sind wirkungsmäßig verbunden, wenn sich die regulatorische Sequenz funktionell auf die DNA Sequenz bezieht. Somit ist eine Promotor-Nukleotidsequenz wirkungsmäßig mit einer DNA Sequenz verbunden, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der DNA Sequenz steuert. Ein Replikationsursprung, der die Fähigkeit verleiht, in den gewünschten Wirtszellen zu replizieren, und ein Selektionsgen, durch welches Transformanten identifiziert werden, sind im Allgemeinen in dem Expressionsvektor eingebaut.
Zusätzlich kann eine ein geeignetes Signalpeptid (nativ oder heterolog) kodierende Sequenz in die Expressionsvektor eingebaut werden. Eine DNA Sequenz für ein Signalpeptid (Leitsequenz) kann im Rahmen an die Polynukleotidsequenz der Erfindung fusioniert sein, sodass die DNA anfänglich transkribiert wird, und die mRNA, in das Fusionsprotein, welches das Signalpeptid aufweist, translatiert wird. Ein Signalpeptid, welches in der beabsichtigten Wirtszelle funktionell ist, fördert die extrazelluläre Sekretion des Polypeptids. Das Signalpeptid wird von dem Polypeptid bei der Sekretion des Polypeptids aus der Zelle abgespalten.
Der Fachmann wird auch erkennen, dass die Position(en), an welcher(n) das Signalpeptid gespalten wird, von der(n) durch Computerprogramme vorausgesagten abweichen kann, und gemäß Faktoren wie der Art der zum Exprimieren eines rekombinanten Polypeptids eingesetzten Wirtszelle variieren kann. Eine Proteinzubereitung kann eine Mischung von Proteinmolekülen mit unterschiedlichen N-terminalen Aminosäuren enthalten, was daher resultiert, dass das Signalpeptid an mehr als einer Stelle gespalten wird.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von Polypeptiden umfassen Prokaryoten, Hefe, oder höhere eukaryotische Zellen. Säugetier- oder Insektenzellen sind im Allgemeinen für die Verwendung als Wirtszellen bevorzugt. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit Bakterien, Pilz, Hefe und Säugetierzell-Wirten sind zum Beispiel in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985 beschrieben. Zellfreie Translationssysteme könnten auch eingesetzt werden, um Polypeptide unter Verwendung von RNAs, die von hierin offenbarten DNA Konstrukten abgeleitet sind, herzustellen.
Zu Prokaryoten zählen gram-negative oder gram-positive Organismen. Zu geeigneten prokaryotischen Wirtszellen für die Transformation zählen, zum Beispiel, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. In einer prokaryotischen Wirtszelle, wie etwa E. coli, kann ein Polypeptid einen N-terminalen Methionin-Rest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu fördern. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren für die Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen weisen im Allgemeinen ein oder mehrere phänotypisch-selektierbare Markergene auf. Ein phänotypisch-selektierbares Markergen ist, zum Beispiel, ein Gen, das ein Protein kodiert, welches antibiotische Resistenz verleiht oder das eine autotrophe Anforderung bereitstellt. Zu Beispielen von nützlichen Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen zählen jene, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind, wie etwa der Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017). pBR 322 enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit einfache Mittel für das Identifizieren von transformierten Zellen bereit. Ein geeigneter Promotor und eine DNA Sequenz werden in den pBR322 Vektor eingeführt. Zu anderen kommerziell erhältlichen Vektoren zählen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Zu Promotorsequenzen, die häufig für rekombinante prokaryotische Wirtszell-Expressionsvektoren verwendet werden, zählen β-Lactamase (Penicillinase), Lactose Promotorsystem (Chang et al., Nature, 275:615, 1978; und Goeddel et al., Nature, 281:544, 1979), Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acid Res., 8:4057, 1980; und EP-A-36776) und tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 412, 1982). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellen-Expressionssystem wendet einen Phage λP_L Promotor und eine cI857ts thermolabile Repressorsequenz an. Zu Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, die Derivate des λP_L Promotors einschließen, zählen Plasmid pHUB2 (innewohnend in E. coli Stamm JMB9, ATCC 37092) und pPLc28 (innewohnend in E. coli RR1, ATCC 53082)
Alternativ können die Polypeptide in Hefe-Wirtszellen, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces (z.B. S. cerevisiae) exprimiert werden. Andere Hefegattungen, wie Pichia oder Kluyveromyces können auch eingesetzt werden. Hefevektoren werden häufig eine Replikationsursprungssequenz des 2μ Hefeplasmids, eine autonom replizierende Sequenz (ARS: autonomously relicating sequence), eine Promotorsequenz, Sequenzen für Polyadenylierung, Sequenzen für die Transkriptionstermination und ein selektierbares Markergen enthalten. Zu geeigneten Promotor-Sequenzen für Hefevektoren zählen unter anderem die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldahyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phospho-Glucose-Isomerase, und Glucokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung in der Hefe-Expression sind weiters in Hitzeman, EPA-73.657 beschrieben. Eine andere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300:724, 1982) beschrieben wurde. In sowohl Hefe als auch E. coli replizierbare Shuttle-Vektoren können durch Einfügen von DNA Sequenzen aus pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r-Gen und Replikationsursprung) in den obenbeschriebenen Hefe-Vektor konstruiert werden.
Die Hefe α-Faktor Leitsequenz kann für die direkte Sekretion des Polypeptids verwendet werden. Die α-Faktor Leitsequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die Strukturgensequenz eingefügt. Siehe z.B. (Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Andere Leitsequenzen, die für das Erleichtern der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leitsequenz kann in der Nähe ihres 3' Endes modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies wird die Fusion der Leitsequenz an das Strukturgen erleichtern.
Hefe-Transformationsprotokolle sind den Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll selektiert für Trp⁺ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoffliase, 0,5% Casamino Säuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die mit Vektoren, die eine ADH2-Promotor-Sequenz enthalten, transformiert sind, können für die Expressionsinduktion in einem „reichen" Medium gezüchtet werden. Ein Beispiel für ein reiches Medium ist eines, welches aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, und 1 % Glucose, ergänzt mit 80μg/m1 Adenin und 80 μg/ml Uracil besteht. Die Aufhebung der Unterdrückung des ADH2-Promotors tritt ein, wenn die Glucose im Medium erschöpft ist.
Säugetier oder Insekten-Wirtszellsysteme können auch eingesetzt werden, um rekombinante Polypeptide zu exprimieren. Bacculovirus-Systeme für die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden von Luckow und Summers. Bio/Technology 6:47 (1988) beschrieben. Etablierte Zelllinien mit Säugetierursprung können ebenfalls eingesetzt werden. Zu Beispielen von geeigneten Säugetier-Wirtszelllinien zählen die COS-7 Linie von Affennieren-Zellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127 Zellen, 3T3 Zellen (ATCC CCL 163), chinesische Hamsterovarium-Zellen (CHO), HeLa Zellen, und BHK (ATCC CRL 10) Zelllinien, und die CV1/EBNA Zelllinie, die aus der Nierenzelllinie CV1 von Afrikanischen Grünen Meerkatzen (ATCC CCL 70) abgeleitet ist, wie von Mc Mahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben ist.
Etablierte Verfahren, um DNA in Säugetierzellen einzuführen, wurden beschrieben (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, Seiten 15–69). Zusätzliche Protokolle unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzien, wie etwa Lipofectamin-Lipidreagens (Gibco/BRL) oder Lipofectamin-Plus Lipdreagens, können verwendet werden, um Zellen zu transfizieren (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413–7417, 1987). Zusätzlich kann die Elektroporation verwendet werden, um Säugetierzellen unter Verwendung konventioneller Prozeduren zu transfizieren, wie jene in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Die Selektion von stabilen Transformanten kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie zum Beispiel, Resistenz gegenüber zytotoxischen Arzneimitteln. Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185:487–511, 1990, beschreiben mehrere Selektionsschemata, wie Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Resistenz. Ein geeigneter Wirtsstamm für die DHFR Selektion kann der CHO Stamm DX-B11 sein, welcher DHFR-defizient ist (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216–4220, 1980). Ein Plasmid, das die DHFR cDNA exprimiert, kann in den Stamm DX-B11 eingeführt werden, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können in den entsprechenden selektiven Medien wachsen. Andere Beispiele von selektierbaren Markern, die in einen Expressionsvektor eingebaut werden können, beinhalten cDNAs, die Antibiotika-Resistenz verleihen, wie G418 und Hygromycin B. Zellen, die den Vektor enthalten, können auf der Basis der Resistenz gegenüber diesen Verbindungen selektiert werden.
Transkriptionale und translatorische Steuersequenzen für Säugetier-Wirtszell-Expressionsvektoren können von viralen Genomen herausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotor-Sequenzen und Enhancer-Sequenzen sind von Polyoma-Virus, Adenovirus-2, Simian-Virus 40 (SV40), und humanem Cytomegalievirus abgeleitet. DNA Sequenzen, die vom SV40 viralen Genom abgeleitet sind, wie zum Beispiel, SV40 Ursprung, früher und später Promotor, Enhancer, Spleiß, und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, da beide leicht aus einem viralen Genom als ein Fragment erhalten werden können, das ebenfalls den viralen Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; und Kaufman, Meth in Enzymology, 1990). Kürzere oder längere SV40 Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp lange Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle in Richtung BgII-Stelle erstreckt, die im SV40 viralen Replikationsursprung lokalisiert ist, ist eingeschlossen.
Zusätzliche Steuersequenzen, die gezeigt haben, die Expression von heterologen Genen von Säugetier-Expressionsvektoren zu verbessern, beinhalten solche Elemente wie das Expression-Anreicherungs-Sequenz-Element (EASE), welches von CHO-Zellen abgeleitet ist (Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, S. 529–534, 1997; und PCT Anmeldung WO 97/25420 ) und den dreiteiligen Leiter (TPL) und VA Gen RNAs vom Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475–13491, 1982). Die internen Ribosomeneintrittsstellen (IRES)-Sequenzen viralen Ursprungs erlauben die effektive Translation von dicistronischen mRNAs (Oh und Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295–300, 1993; Ramesh et al., Polynucleotides Research 24:2697–2700, 1996). Es wurde gezeigt, dass die Expression einer heterologen cDNA als Teil einer dicistronischen mRNA, gefolgt von einem Gen für einen selektierbaren Marker (z.B., DHFR) die Transfizierbarkeit des Wirtes und die Expression der heterologen cDNA verbessert (Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Beispielhafte Expressionsvektoren, die dicistronische mRNAs verwenden, sind pTR-DC/GFP, beschrieben von Mosser et al. Biotechniques 22:150–161, 1997, und p2A5I, beschrieben von Morris et al., Animal Cell Technology 1997, S. 529–534.
Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, pCAVNOT, ist von Mosley et al., Cell 59:335–348, 1989 beschrieben worden. Andere Expressionsvektoren für Verwendung in Säugetier-Wirtszellen können wie von Okayama und Berg., (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart, konstruiert werden. Ein nützliches System für die stabile Expression auf hohem Niveau von Säugetier cDNAs in C127 murinen Brustepithelzellen können im Wesentlichen wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) beschrieben, konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, von Cosman et al. Nature 312:768, 1984, beschrieben, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetier-Expressionsvektoren sind im EP-A-0367566 und im WO 91/18982 beschrieben. Bei einer noch anderen Alternative können die Vektoren von Retroviren abgeleitet sein.
Ein weiterer nützlicher Expressionsvektor, pFLAG^®, kann verwendet werden. FLAG^® Technologie richtet sich auf die Fusion eines hydrophilen pFLAG^®-Markerpeptids mit niederem Molekulargewicht (1 kD) an den N-Terminus eines rekombinanten Proteins, welches durch den pFLAG^®-Expressionsvektor exprimiert wird.
Hinsichtlich der Signalpeptide, die verwendet werden können, kann das native Signalpeptid durch ein heterologes Signalpeptid oder eine Leitsequenz, falls gewünscht, ersetzt werden. Die Wahl des Signalpeptids oder der Leitsequenz hängt von Faktoren wie z.B. der Art der Wirtszellen, in welchen das rekombinante Polypeptid produziert wird, ab. Zu Beispielen von heterologen Singalpeptiden; die in Säugetier-Wirtszellen funktionell sind, zählen die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), beschrieben im U.S. Patent 4.965.195; die Signalsequenz für Interleukin-2-Rezeptor, beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768 (1984); das Interleukin-4 Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben im EP 367.566 ; das Typ I Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben im U.S. Patent 4.968.607; und das Typ II Interleukin-I Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben in EP 460.846 .
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Isolieren und Reinigen der Polypeptide und Fragmente davon.
Die „isolierten" Polypeptide oder Fragmente davon, die durch diese Erfindung umfasst sind, sind Polypeptide oder Fragmente, die nicht in einer Umgebung sind, die identisch zu einer Umgebung ist, in welcher es oder sie in der Natur gefunden werden können. Die „gereinigten" Polypeptide oder Fragmente davon, die durch diese Erfindung umfasst sind, sind im Wesentlichen frei von der Assoziation mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, zum Beispiel, als ein Reinigungsprodukt von rekombinanten Expressionssystemen, wie jene die oben beschrieben sind oder als ein gereinigtes Produkt aus einer nicht-rekombinanten Quelle wie etwa natürlich vorkommende Zellen und/oder Gewebe.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Reinigung von rekombinanten Polypeptiden oder Fragmenten unter Verwendung von Fusionen von Polypeptiden oder Fragmenten der Erfindung an andere Polypeptide, um bei der Reinigung der Polypeptide oder Fragmente der Erfindung zu helfen, erreicht werden. Solche Fusionspartner können das poly-His oder andere antigene Identifikationspeptide, die oben beschrieben sind, sowie die früher beschriebenen Fc-Anteile enthalten.
Im Bezug auf eine beliebige Art von Wirtszelle, wie dem Fachmann bekannt ist, variieren die Verfahren zum Reinigen eines rekombinanten Polypeptides oder Fragments in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Art der eingesetzten Wirtszelle und ob das rekombinante Polypeptid oder Fragment in das Kulturmedium sekretiert wird oder nicht.
Im Allgemeinen kann das rekombinante Polypeptid oder Fragment aus der Wirtszellen, falls es nicht sezerniert wird, oder aus dem Medium oder Überstand, falls es löslich ist und sezerniert wird, isoliert werden, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrierungs-, Aussalzungs-, Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkungs-, Affinitätsreinigungs- oder Größenausschußchromatographie-Schritten. Um diese Wege, um diese Schritte zu erreichen, zu spezifizieren, kann das Kulturmedium unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel, einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, zuerst konzentriert werden. Im Anschluss an den Konzentrierungsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie ein Gelfiltrationsmedium, aufgetragen werden. Alternativ kann ein Anionenaustauscherharz eingesetzt werden, zum Beispiel, eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethyaminoethyl (DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose, oder andere Arten sein, die häufig in der Proteinreinigung eingesetzt werden. Alternativ kann ein Kationenaustauscherschritt verwendet werden. Zu geeigneten Kationenaustauschern zählen verschiedene unlösliche Matrizen, die Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen aufweisen. Zusätzlich kann ein Chromatofokussierungsschritt angewendet werden. Alternativ kann ein hydrophober Wechselwirkungschromatographie-Schritt eingesetzt werden. Geeignete Matrizen können an Harz gebundene Phenyl- oder Octyl-Anteile sein. Zusätzlich kann Affinitätschromatographie mit einer Matrix, die das rekombinante Protein selektiv bindet, verwendet werden. Zu Beispielen von solchen eingesetzten Harzen zählen Lektin-Säulen, Farbstoff-Säulen, und Metall-chelatbildende Säulen. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Schritte (RP-HPLC), die hydrophobe RP-HPLC Medien (z.B. Silicagel oder Polymerharz mit anhängenden Methyl, Octyl, Octyldecyl oder anderen aliphatischen Gruppen) verwenden, eingesetzt werden, um die Polypeptide weiter zu reinigen. Einige oder alle der zuvorgenannten Reinigungsschritte, in verschiedenen Kombinationen, sind bekannt und können verwendet werden, um ein isoliertes und gereinigtes rekombinantes Protein bereitzustellen.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu benutzen, die ein Polypeptid-bindendes Protein der Erfindung aufweist, wie ein gegen die Polypeptide der Erfindung erzeugte monoklonaler Antikörper, um die exprimierten Polypeptide affinitätszureinigen. Diese Polypeptide können von einer Affinitätssäule mittels herkömmlicher Techniken entfernt werden, d.h. in einem Hochsalz-Elutionspuffer und dann für die Verwendung in einen Niedersalzpuffer dialysiert werden oder durch Ändern des pH-Wertes oder anderer Komponenten, in Abhängigkeit der eingesetzten Affinitätsmatrix, oder durch kompetitives Entfernen unter Verwendung des natürlich-vorkommenden Substrats des Affinitätsanteils, wie ein von der Erfindung abgeleitetes Polypeptid.
In diesem Aspekt der Erfindung können Polypeptid-bindende Proteine, wie die Anti-Polypeptid Antikörper der Erfindung oder andere Proteine, die mit dem Polypeptid der Erfindung interagieren, an einen Festphasenträger gebunden werden, wie eine Säulenchromatographiematrix oder ein ähnliches Substrat, das für das Identifizieren, Trennen oder Reinigen von Zellen geeignet ist, die die Polypeptide der Erfindung auf ihre Oberfläche exprimieren. Das Anheften von Polypeptid-bindenden Proteinen der Erfindung an eine Festphasen-Kontatkfläche kann durch ein beliebiges Mittel erreicht werden. Zum Beispiel können magnetische Mikrokügelchen mit diesen Polypeptid-bindenden Proteinen überzogen werden und im Inkubationsgefäß durch ein magnetisches Feld gehalten werden. Suspensionen von Zollmischungen werden mit der Festphase in Kontakt gebracht, die solche Polypeptid-bindenden Proteine darauf aufweist. Zellen mit Polypeptiden der Erfindung auf ihrer Oberfläche binden an das fixierte Polypeptid-bindende Protein und ungebundene Zellen werden dann weggewaschen. Dieses Affinitätsbindungsverfahren ist für das Reinigen, Screenen oder Abtrennen solcher Polypeptid-exprimierenden Zellen aus Lösung nützlich. Verfahren zum Freisetzten von positiv ausgewählten Zellen von der Festphase sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel die Verwendung von Enzymen. Solche Enzyme sind vorzugsweise für die Zellen nicht-toxisch und nicht-schädlich und sind vorzugsweise darauf gerichtet, die Zell-Oberflächen-Bindungspartner zu spalten.
Alternativ können Mischungen von Zellen, die verdächtigt werden, Polypeptid-exprimierende Zellen der Erfindung zu enthalten, zuerst mit einem biotinyliertem Polypeptid-bindenden Protein der Erfindung inkubiert werden. Die Inkubationsperioden sind üblicherweise zumindest eine Stunde lang, um eine ausreichende Bindung an die Polypeptide der Erfindung sicherzustellen. Die resultierende Mischung wird dann durch eine mit Avidin-beschichteten Kügelchen gepackte Säule geleitet, wobei die hohe Affinität von Biotin für Avidin die Bindung der Polypeptid-bindenden Zellen an die Kügelchen bereitstellt. Die Verwendung von Avidin-beschichteten Kügelchen ist im Stand der Technik bekannt. Siehe Berenson et al., J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). Auswaschen von ungebundenem Material und die Freisetzung von den gebunden Zellen wird mittels herkömmlicher Verfahren durchgeführt.
Der gewünschte Reinheitsgrad hängt von der beabsichtigten Verwendung des Proteins ab. Ein relativ hoher Reinheitsgrad ist wünschenswert, wenn das Polypeptid in vivo verabreicht werden soll. In einem solchen Fall werden die Polypeptide so gereinigt, dass keine Proteinbanden, die anderen Proteinen entsprechen, bei der Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nachweisbar sind. Es ist für einen Fachmann des entsprechenden Fachgebietes erkennbar, dass mehrere dem Polypeptid entsprechenden Banden durch SDS-PAGE visualisiert werden können, aufgrund unterschiedlicher Glycosylsierung, unterschiedlicher posttranslatorischer Bearbeitung, und dergleichen. Am meisten bevorzugt wird das Polypeptid der Erfindung im Wesentlichen zur Homogenität gereinigt, wie durch eine einzelne Proteinbande bei der Analyse mittels SDS-PAGE angezeigt wird. Die Proteinbande kann durch Silberfärbung, Coomassie-Blue-Färbung oder (wenn das Protein radioaktiv markiert ist) durch Autoradiographie visualisiert werden.
Die gereinigten Polypeptide der Erfindung (einschließlich von Proteinen, Polypeptiden, Fragmenten, Varianten, Oligomeren und anderen Formen) können auf ihre Fähigkeit, den Bindungspartner zu binden, in jeglicher geeigneten Untersuchung, wie etwa einer herkömmlichen Bindungsuntersuchung, getestet werden. Um dies zu illustrieren, können die Polypeptide mit einem nachweisbaren Reagenz (z.B. einem Radionuklid, Chromophor, Enzym, welches eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysiert, oder dergeichen) markiert sein. Das markierte Polypeptid wird mit Zellen, die den Bindungpartner exprimieren, in Kontakt gebracht. Die Zellen werden dann gewaschen, um ungebundes, markiertes Polypeptid zu entfernen, und das Vorhandensein von Zell-gebundener Markierung wird durch eine geeignete Technik, die in Abhängigkeit von der Natur der Markierung ausgewählt ist, bestimmt.
Ein Beispiel einer Bindungsuntersuchungsprozedur ist wie folgt. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der die Bindungspartner cDNA enthält, wird unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt. CV1-EBNA-1 Zellen in 10 cm² Platten werden mit dem rekombinanten Expressionsvektor transfiziert. CV-1/EBNA-1 Zellen (ATCC CRL 10478) exprimieren konstitutiv das EBV-Kernantigen-1, angetrieben von dem CMV-unmittelbar-frühen Enhancer/Promotor. CV1-EBNA-1 wurde von der afrikanischen Grünen Meerkatzen-Nierenzelllinie CV-1 (ATCC CCL 70), wie von McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben, abgeleitet.
Die transfizierten Zellen wurden für 24 Stunden kultiviert, und die Zellen in jeder Platte werden dann in eine 24-Kammer-Platte aufgeteilt. Nach dem Kultivieren für zusätzliche 48 Stunden werden die transfizierten Zellen (etwa 4 × 10⁴ Zellen/Kammer) mit BM-NFDM gewaschen, welches Bindungsmedium ist (RPMI 1640, welches 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes pH 7,2 enthält), zu welchem 50 mg/ml fettfreie Trockenmilch hinzugegeben wurde. Die Zellen werden dann für 1 Stunde bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von, zum Beispiel, einem löslichen Polypeptid/Fc Fusionprotein, das wie oben dargelegt hergestellt wurde, inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit einer konstanten sättigenden Konzentration von einem ¹²⁵I Maus-anti-Mensch IgG in Bindungsmedium unter sanftem Agitieren bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Nach einem extensiven Waschen wurden die Zellen mittels Trypsinisierung freigesetzt.
Der oben eingesetzte Maus-anti-Human IgG ist gegen die Fc Region von humanem IgG gerichtet und kann von Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, erhalten werden. Der Antikörper wird unter Verwendung des Standard Choramin-T-Verfahrens radioiodiniert. Der Antikörper wird an den Fc-Teil eines beliebiegen Polypeptid/Fc-Proteins, welches an Zellen gebunden hat, binden. In allen Untersuchungen wird die nicht-spezifische Bindung von ¹²⁵I-Antikörper in der Abwesenheit von Fc Fusionprotein/Fc, sowie in der Gegenwart des Fc Fusionsproteins und einem 200-fachen molaren Überschuss an unmarkiertem Maus-anti-Human IgG Antikörper untersucht.
Zell-gebundener ¹²⁵I-Antikörper wurde auf einem Packard Autogamma-Zähler quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660, 1949) werden auf einem RS/1 (BBN Software, Boston, MA), das auf einem Microvax Computer läuft, erzeugt.
Eine andere Art einer geeigneten Bindungsuntersuchung ist eine kompetitive Bindungsuntersuchung. Um dies zu illustrieren, kann die biologische Aktivität einer Variante durch Untersuchen der Fähigkeit der Variante, mit dem nativen Protein um die Bindung an den Bindungspartner zu konkurrieren, bestimmt werden.
Kompetitive Bindungsuntersuchungen können durch herkömmliche Methoden durchgeführt werden. Reagenzien, die in kompetitiven Bindungsuntersuchungen eingesetzt werden können, umfassen radiomarkierte Polypeptide der Erfindung und intakte Zellen, die den Bindungspartner (endogen oder rekombinant) exprimieren. Zum Beispiel kann ein radiomarkiertes, lösliches IL-1 eta Fragment verwendet werden, um mit einer löslichen IL-1 eta-Variante um die Bindung an Zolloberflächen IL-1 eta Rezeptoren zu konkurrieren. Anstelle von intakten Zellen könnte man diese durch ein lösliches Bindungspartner/Fc-Fusionsprotein, welches durch die Wechselwirkung von Protein A oder Protein G (auf der Festphase) mit dem Fc Anteil an eine Festphase gebunden ist, austauschen. Zu Chromatographie-Säulen, die Protein A oder Protein G enthalten, zählen jene, die von Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ. erhältlich sind.
Eine andere Art einer kompetitiven Bindungsuntersuchung nutzt radiomarkierte lösliche Bindungspartner, wie ein lösliches IL-1 eta Rezeptor/Fe-Fusionprotein und intakte Zellen, die den Bindungspartner exprimieren. Qualitative Ergebnisse können durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsuntersuchungen erhalten werden, während Scatchard-Plots (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660, 1949) benutzt werden können, um quantitative Ergebnisse zu erzeugen.
Das IL-1 eta Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch als eine Screening-Untersuchung für Verbindungen und kleine Moleküle, die die Aktivierung von (Antagonisten) der IL-1 eta Polypeptide der vorliegenden Erfindung inhibieren, verwendet werden. Somit können Polypeptide der Erfindung verwendet werden, um Antagonisten von, zum Beispiel, Zellen, zellfreien Zubereitungen, chemischen Bibliotheken, und natürlichen Produktmischungen zu identifizieren. Die Antagonisten können natürliche oder modifizierte Substrate, Liganden, Enzyme, Rezeptoren, etc. der IL-1 eta Polypeptide sein, oder können strukturelle oder funktionelle Mimetika des IL-1 eta Polypeptids sein. Die Antagonisten können weiters kleine Moleküle, Peptide, Antikörper und Antisense-Oligonukleotide sein.
Eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Identifizieren von Verbindungen, die IL-1 eta Polypeptid antagonisieren, ist das in Kontakt bringen einer Kandidaten-Verbindung mit Zellen, die auf IL-1 eta Polypeptid reagieren und Beobachten der Bindung, oder Stimulation oder Inhibierung einer funktionellen Reaktion. Die Aktivität der Zellen, die mit der Kandiatenverbindung kontaktiert wurden, könnten dann mit den identischen Zellen, die nicht für die IL-1 eta Polypeptid-Aktivität kontaktiert wurden, verglichen werden und IL-1 eta Polypeptid-Agonisten und Antagonisten könnten identifiziert werden. Eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die die Synthese oder Sekretion von IL-1 eta inhibieren, indem die Kandidatenverbindung mit Zellen in Kontakt gebracht werden, die IL-1 eta Polypeptid exprimieren und Messen der IL-1 eta Produktion. Die Messung der IL-1 eta Produktion können durch eine Vielzahl von weithin bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie Messen der Menge an vorhandenem Protein (z.B. ELISA) oder der Aktivität des Proteins.
Verwendung von IL-1 eta Polynukleotiden oder Oligonukleotiden
Unter den Verwendungen von Polynukleotiden der Erfindung ist die Verwendung von Polynukleotid-Fragmenten oder Oligonukleotiden als Sonden oder Primer. Solche Fragmente weisen im Allgemeinen zumindest etwa 17 zusammenhängende Nukleotide einer DNA Sequenz auf. In anderen Ausführungsformen weist ein DNA Fragment zumindest 30, oder zumindest 60 zusammenhängende Nukleotide einer DNA-Sequenz auf.
Da Homologe der SEQ ID NR: 1, von anderen Säugetierspezies, hierin betrachtet werden, können Sonden, die auf der humanen DNA Sequenz der SEQ ID NR: 1 basieren, verwendet werden, um cDNA Bibliotheken, die von anderen Säugetierspezies abgeleitet sind, unter Verwendung herkömmlicher Kreuz-Spezies-Hybridisierungstechniken zu durchsuchen.
Unter Verwendung der Kenntnis des genetischen Kodes zusammen mit den oben dargelegten Aminosäuresequenzen können Sätze von degenerierten Oligonukleotiden hergestellt werden. Solche Oligonukleotide sind als Primer, z.B. in Polymerase Kettenreaktionen (PCR) nützlich, wobei DNA Fragmente isoliert und amplifiziert werden.
Alle oder ein Teil der Polynukleotide von IL-1 eta der SEQ ID NR: 1, einschließlich Oligonukleotide, können von Fachleuten verwendet werden, um mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren das humane Chromosom 2, sowie den spezifischen Locus darauf, der die DNA der IL-1 Ligandenfamilienmitglieder enthält, zu identifizieren. Zu nützlichen Techniken zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Verwendung der Sequenz oder Teile, einschließlich von Oligonukleotiden, als eine Sonde in verschiedenen bekannten Techniken wie der Radiation-Hybrid-Kartierung (hohe Auflösung), in-situ Hybridisierung an Chromosomenverteilungen (mäßige Auflösung), und Southern Blot-Hybridisierung an Hybrid-Zelllinien, die individuelle humane Chromosomen enthalten (niedere Auflösung).
Zum Beispiel können Chromosomen durch Radiation-Hybridisierung kartiert werden, die die Verwendung von PCR und der Whitehead Institute/MIT Center für Genome Research Genebrdige 4 Gruppe von 93 Radiation-Hybriden einschließt (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS-releases/july97/rhmap/genebridge4.html). Die PCR Primer liegen innerhalb des Gens von Interesse und amplifizieren ein Produkt der humanen genomischen DNA, amplifizieren jedoch keine genomische Hamster DNA. Die Ergebnisse der PCRs werden in einen Daten-Vektor umgewandelt, welcher der Whitehead/MIT Radiation Kartierungsseite (Mapping site) im Internet (http://www-seq.wi.mit.edu) vorgelegt wurde. Die Daten werden bewertet und die chromosomale Zuordnung und Platzierung in Bezug auf bekannte Sequenz-Tag-Stellen (STS)-Marker auf der Radiation-Hybridkarte wird bereitgestellt. Die folgende Internetseite (web site) bietet zusätzliche Information über die Radiation-Hybrid-Kartierung: http://www-genome.wi.mit.edu/flp/distribution/human_STS-releases/july97/07-97.INTRO.html).
Die DNA SEQ ID NR: 1 wurde durch Radiation-Hybridisierung an die 2q11-12 Region des menschlichen Chromosoms 2 kartiert. Das menschliche Chromosom 2 ist mit spezifischen Krankheiten assoziiert, zu welchen, ohne darauf beschränkt zu sein, Glaucom, ektodermale Dysplasie, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Faltenhaut (Wrinkly-Skin-Syndrom), T-Zellen Leukämie/Lymphom, und tibiale Muskeldystrophie zählen. Somit können die Polynukleotide der SEQ ID NR: 1 oder ein Fragment davon durch einen Fachmann unter Verwendung von bekannten Techniken verwendet werden, um Anormalitäten, die mit Genkartierung des Chromosoms 2 assoziiert sind, zu analysieren. Dadurch wird ermöglicht, Bedingungen, bei welchen dieser Marker umgeordnet oder deletiert ist, zu unterscheiden. Zusätzlich können Nukleotide der SEQ ID NR: 1 oder ein Fragment davon als ein positioneller Marker verwendet werden, um andere Gene an unbekannten Stellen zu kartieren.
Die DNA kann bei der Entwicklung von Behandlungen für jede Krankheit, die (direkt oder indirekt) durch defekte, oder unzureichende Mengen der Gene, die den Polynukleotiden der Erfindung entsprechen, vermittelt sind, verwendet werden. Die Offenbarung hierin von nativen Nukleotid-Sequenzen erlaubt die Ermittlung von defekten Genen, und den Austausch davon mit normalen Genen. Defekte Gene können in in vitro diagnostischen Untersuchungen und durch Vergleich einer hierin offenbarten nativen Nukleotidsequenz mit der eines Gens, welches von einer Person stammt, von der vermutet wird, dass sie einen Defekt in diesem Gen trägt, ermittelt werden.
Andere nützliche Fragmente der Polynukleotide schließen Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide ein, welche eine einzelsträngige Polynukleotid-Sequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die in der Lage sind, an Ziel mRNA (Sinn) oder DNA (Gegensinn)-Sequenzen zu binden. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung weisen ein Fragment der DNA (SEQ ID NR:1) auf. Solch ein Fragment weist im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nukleotide, vorzugsweise etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide auf. Die Fähigkeit ein Gegensinn- oder ein Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz, die ein gegebenes Protein kodiert, abzuleiten, ist zum Beispiel in Stein und Cohen, (Cancer Res., 48:2659, 1998) und van der Krol et al. (BioTechniques, 6:958, 1988) beschrieben.
Bindung von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Polynukleotidsequenzen führt zu der Bildung von Duplexen, die die Proteinexpression durch eines von mehreren Mitteln blockiert oder inhibiert, einschließlich des verstärkten Abbaus der mRNA durch RNAseH, der Inhibierung des Spleißens, der vorzeitigen Termination der Transkription oder Translation, oder durch andere Mittel. Die Gegensinn-Oligonukleotide können somit verwendet werden, um die Expression von Proteinen zu blockieren. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide weisen weiters Oligonukleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Rückgraten (oder andere Zuckerbindungen, wie jene, die in WO 91/06629 beschrieben sind) auf, und wobei solche Zuckerbindungen gegenüber endogenen Nukleasen resistent sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (d.h. in der Lage einem enzymatischen Abbau zu widerstehen), aber bewahren die Sequenzspezifität, um in der Lage zu sein, an die Ziel- Nukleotidsequenzen zu binden.
Andere Beispiele von Sinn oder Gegensinn-Oligonukleotiden schließen jene Oligonukleotide ein, die kovalent an organische Anteile gebunden sind, wie jene, die in WO 90/10448 beschrieben sind, und andere Anteile, die die Affinität der Oligonukleotide für eine Ziel-Polynukleotid-Sequenz, wie ein poly-(L-Lysin) erhöhen. Weiters noch können Einlagerungsmittel, wie Ellipticin, und Alkylanzien oder Metallkomplexe an die Sinn oder Gegensinn-Oligonukleotide angelagert werden, um die Bindungsspezifitäten der Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide für die Ziel-Nukleotidsequenz zu modifizieren. Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, die die Ziel-Polynukleotid-Sequenz enthält, mittels irgendeines Gentransfer-Verfahrens eingeführt werden, einschließlich, zum Beispiel, Lipofektion, CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation, oder durch Verwenden von Gentransfer-Vektoren, wie Epstein-Barr-Virus.
Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, die die Ziel-Polynukleotid-Sequenz enthält, durch Bilden eines Konjugats mit einem Ligandenbindungsmolekül eingeführt werden, wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Zu geeigneten Ligandenbindungsmoleküle zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine, oder andere Liganden, die an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise beeinträchtigt die Konjugation des Ligandenbindungsmoleküls die Fähigkeit des Ligandenbindungsmoleküls nicht wesentlich, um an das entsprechende Molekül oder Rezeptor zu binden, oder blockiert den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotids oder ihrer konjugierten Version in die Zelle.
Alternativ kann ein Sinn- oder ein Gegensinn-Oligonukleotid in eine Zelle, die die Ziel-Polynukleotid-Sequenz enthält, durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipid-Komplexes eingeführt werden, wie in WO 90/10448 beschrieben ist. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipid-Komplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase aufgelöst.
VERWENDUNG VON IL-1 ETA POLYPEPTIDEN UND FRAGMENTIERTEN POLYPEPTIDEN
Jedes der Polypeptide der Erfindung findet als ein Proteinreinigungsreagenz Verwendung. Die Polypeptide können an ein festes Trägermaterial angelagert werden, und verwendet werden, um die Bindungspartnerproteine durch Affinitätschromatographie zu reinigen. In besonderen Ausführungsformen wird ein Polypeptid (in einer beliebigen hierin beschriebenen Form, die in der Lage ist, die Bindungspartner zu binden) an einen Feststoffträger durch konventionelle Verfahren angelagert. Als ein Beispiel sind Chromatographie-Säulen, die funktionelle Gruppe enthalten, die mit funktionellen Gruppen von Aminosäure-Seitenketten der Proteine reagieren werden, erhältlich (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Bei einer Alternative wird ein Polypeptid/Fc-Protein (wie oben diskutiert) an Protein A oder Protein G-enthaltende Chromatographie-Säulen durch die Wechselwirkung mit dem Fc-Anteil angelagert.
Das Polypeptid findet auch beim Reinigen oder Identifzieren von Zellen, die den Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimieren, Verwendung. Polypeptide werden an eine Festphase, wie eine Säulenchromatographiematrix oder ein ähnlich geeignetes Substrat gebunden. Zum Beispiel können magnetische Mikrokügelchen mit den Polypeptiden beschichtet werden und durch ein Magnetfeld in einem Inkubationsgefäß gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen, die die Bindungspartner-exprimierenden Zellen enthalten, werden mit der Festphase mit den Polypeptiden darauf in Kontakt gebracht. Zellen, die den Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimieren, binden an die fixierten Polypeptide, und ungebundene Zellen werden dann weggewaschen.
Alternativ können die Polypeptide an einen detektierbaren Anteil konjugiert sein und dann mit den Zellen, die auf die Bindungspartner-Expression getestet werden sollen, inkubiert werden. Nach der Inkubation wird ungebundenes, markiertes Material entfernt und die Gegenwart oder die Abwesenheit des detektierbaren Anteils auf den Zellen wird bestimmt.
In einer weiteren Alternative werden Mischungen von Zellen, von denen vermutet wird, dass sie Bindungspartner-exprimierende Zellen enthalten, mit biotinylierten Polypeptiden inkubiert. Die Inkubationsperioden sind üblicherweise zumindest 1 Stunde lang, um eine ausreichende Bindung sicherzustellen. Die resultierende Mischung wird dann durch eine mit Avidin-beschichteten Kügelchen gepackten Säule geleitet, wobei die hohe Affinität von Biotin für Avidin die Bindung der gewünschten Zellen an die Kügelchen bereitstellt. Verfahren zum Verwenden von Avidin-beschichteten Kügelchen sind bekannt (siehe Berenson et al., J. Cell. Biochem. 10D:239, 1986). Das Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und die Freisetzung der gebundenen Zellen werden mittels herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Polypeptide finden auch Verwendung beim Messen der biologischen Aktivität des Bindungspartnerproteins bezüglich ihrer Bindungsaffinität. Die Polypeptide können folglich von jenen eingesetzt werden, die „Qualitätssicherungs"-Studien durchführen, z.B. um die Haltbarkeit und Stabilität von Protein unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Zum Beispiel können die Polypeptide in Bindungsaffinitätsstudien eingesetzt werden, um die biologische Aktivität eines Bindungpartnerproteins, welches bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert oder in unterschiedlichen Zellarten erzeugt wurde, zu messen. Die Proteine können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach der Modifizierung eines Bindungspartnerproteins beibehalten wird (z.B. durch chemische Modifizierung, Verkürzung, Mutation, etc.). Die Bindungsaffinität des modifizierten Bindungspartnerproteins wird mit der eines unmodifizierten Bindungspartnerproteins verglichen, um nachteilige Auswirkungen der Modifikationen auf die biologische Aktivität des Bindungspartners zu ermitteln. Die biologische Aktivität eines Bindungspartners kann somit bestimmt werden, bevor es zum Beispiel in einer Forschungsstudie verwendet wird.
Die Polypeptide finden auch Verwendung als Träger für Abgabemittel, die daran angeheftet sind, an Zellen, die den Bindungspartner tragen. Die Polypeptide können somit verwendet werden, um diagnostische oder therapeutische Wirkstoffe an solche Zellen (oder an andere Zellarten, bei denen festgestellt wurde, dass sie den Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimieren) in in vitro oder in vivo Verfahren abzugeben.
Zu detektierbaren (diagnostischen) und therapeutischen Wirkstoffen, die an ein Polypeptid angeheftet werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Toxine, andere cytototoxische Wirkstoffe, Arzneimittel, Radionuklide, Chromophore, Enzyme, die eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysieren, und dergleichen, wobei der bestimmte Wirkstoff gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt ist. Unter den Toxinen sind Ricin, Abrin, Diphterietoxin, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, Ribosomeninaktivierende Proteine, Mycotoxine, wie Trichothecenen, und Derivate und Fragmente (z.B. Einzelketten) davon. Zu für die diagnostische Verwendung geeigneten Radionukliden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, ¹²³I, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br. Zu Beispielen von Radionukliden, die für die therapeutische Verwendung geeignet sind, zählen ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu, und ⁶⁷Cu.
Solche Wirkstoffe können an das Polypeptid durch jedes beliebige geeignete, herkömmliche Verfahren angeheftet werden. Das Polypeptid weist funktionelle Gruppen an den Aminosäure-Seitenketten auf, die mit funktionellen Gruppen auf dem gewünschten Wirkstoff reagiert werden können, um zum Beispiel kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ kann das Protein oder der Wirkstoff derivatisiert werden, um eine gewünschte reaktive funktionelle Gruppe zu erzeugen oder anzuheften. Die Derivatisierung kann die Anheftung eines der bifunktionellen Kopplungsreagenzien, die für das Anheften verschiedener Moleküle an Proteine erhältlich sind, einschließen (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Eine Reihe von Techniken für das Radiomarkieren von Proteinen ist bekannt. Radionuklid-Metalle können an die Polypeptide mittels zum Beispiel eines geeigneten bifunktionellen Chelatbildners angeheftet werden.
Konjugate, die Polypeptide und einen geeigneten diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoff (vorzugsweise kovalent gebunden) aufweisen, werden auf diese Weise hergestellt. Die Konjugate werden in einer Menge verabreicht oder anderweitig eingesetzt, die für die bestimmte Anwendung angemessen ist.
Polypeptide der Erfindung können beim Entwickeln von Behandlungen für jede Krankheit, die (direkt oder indirekt) durch defekte, oder unzureichende Mengen der Polypeptide vermittelt sind, verwendet werden. Weiters können die Polypeptide der Erfindung beim Entwickeln von Behandlungen für jede Krankheit, die (direkt oder indirekt) von einem Überschuss des Polypeptids herrührt, verwendet werden. Diese Polypeptide der vorliegenden Erfindung können einem Säugetier verabreicht werden, welches an einer solchen Krankheit leidet.
Die Polypeptide können auch beim Inhibieren einer biologischen Aktivität des Bindungspartners in in vitro oder in vivo Prozeduren eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein gereinigtes IL-1 eta Polypeptid verwendet werden, um die Bindung von endogenem IL-1 eta an seinen Zelloberflächen-Rezeptor zu inhibieren.
Polypeptide der Erfindung können einem Säugetier verabreicht werden, um eine Bindungspartner-vermittelte Krankheit zu behandeln. Zu solchen Bindungspartner-vermittelten Krankheiten zählen Zustände, die (direkt oder indirekt) durch den Bindungspartner hervorgerufen oder verschlimmert werden.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid in jeder hierin beschriebenen Form enthalten, wie native Proteine, Varianten, Derivate, Oligomere, und biologisch aktive Fragmente. In besonderen Ausführungsformen weisen die Zusammensetzungen ein lösliches Polypeptid oder eine Oligomer auf, welches lösliche Polypeptide der Erfindung enthält.
Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung enthalten, in Kombination mit anderen Komponenten, wie ein physiologisch-akzeptables Verdünnungsmittel, Träger oder Exzipient, sind hierin bereitgestellt. Die Polypeptide können gemäß bekannten Verfahren, die verwendet werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, formuliert werden. Sie können in Beimischungen kombiniert werden, entweder als das einzige aktive Material oder mit anderen bekannten aktiven Materialien, die für eine gegebene Indikation geeignet sind, mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln (z.B. Salzlösung, Tris-HCl, Acetat, und Phosphat-gepufferte Lösungen), Konservierungsmitteln (z.B., Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Solubilisatoren, Adjuvansien und/oder Träger. Zu geeigneten Formulierungen für pharmazeutische Zusammensetzungen zählen jene, die in Remington's Pharmaceutical Science, 16. Ausgabe, 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA beschrieben sind.
Zusätzlich können solche Zusammensetzungen mit Polyethylenglycol (PEG), Metallionen komplexiert sein, oder in polymere Verbindungen, wie Polyessigsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele, Dextran etc. eingebaut sein, oder in Liposome, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellare oder mulitlamellare Vesikeln, Erythrozytenschatten oder Sphäroblasten enthalten sein. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, Löslichkeit, Stabilität, in vivo Freisetzungsrate, und in vivo Klärungsrate beeinflussen, und werden somit gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können in jeder geeigneten Art und Weise verabreicht werden, z.B., topisch, parenteral, oder durch Inhalation. Der Begriff „parenteral" umfasst Injektion, z.B. durch subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Wege, ebenso eingeschlossen ist die lokale Verabreichung, z.B. an der Stelle der Krankheit oder Verletzung. Die verzögerte Freisetzung aus Implantaten ist ebenfalls vorgesehen. Ein Fachmann auf dem entsprechenden Gebiet wird erkennen, dass geeignete Dosierungen in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Natur der zu behandelnden Krankheit, dem Körpergewicht des Patienten, Alter, und dem allgemeinen Gesundheitszustand, und dem Verabreichungsweg variieren werden. Vorläufige Dosierungen können entsprechend von Tierversuchen bestimmt werden, und die Skalierung von Dosierungen für die menschliche Verabreichung wird gemäß der im Stand der Technik akzeptierten Gewohnheiten durchgeführt.
Zusammensetzungen, die die Nukleinsäuren in physiologisch akzeptablen Formulierungen aufweisen, sind ebenfalls vorgesehen. DNA kann zum Beispiel für die Injektion formuliert sein.
Eine andere Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung ist als ein Forschungswerkzeug für das Untersuchen der biologischen Wirkungen, die von der Wechselwirkung von IL-1 eta, mit ihren Bindungspartner, oder von der Inhibierung dieser Wechselwirkungen auf unterschiedlichen Zellarten herrühren. Polypeptide können auch in in vitro Untersuchungen für das Detektieren von IL-1 eta, des entsprechenden Bindungspartners oder der Wechselwirkung davon eingesetzt werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendungen der Polypeptide der Erfindung, um die Zellsignalübertragung zu untersuchen. IL-1 Familienliganden spielen eine zentrale Rolle im Schutz gegen Infektion und Immun-entzündlichen Reaktionen, die eine zelluläre Signalübertragung, das Aktivieren vaskulärer Endothelzellen und Lymphozyten, die Induktion von entzündlichen Zytokinen, Akut-Phase-Proteine, Hämatopoiese, Fieber, Knochenresorption, Prostaglandine, Metalloproteinasen, und Adhäsionsmoleküle beinhalten. Mit dem kontinuierlichen Anstieg der Zahl an bekannten IL-1 Familienmitgliedern, basiert ein geeignetes Klassifikationsschema auf dem Vergleich der Polypeptidstruktur sowie der Funktion (Aktivierungs- und regulatorische Eigenschaften). Somit wäre es wahrscheinlich, dass IL-1 eta, wie andere IL-1 Familienliganden (IL-1α, IL-1β und IL-18) sowohl in einige der oben erwähnten Funktionen eingebunden wären als auch entzündliche Reaktionen fördern können und vielleicht deshalb in die Ursache und Erhaltung einer entzündlichen und/oder Autoimmunerkrankung, wie rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, und Psoriasis eingebunden sind. Als solches können Änderungen in der Expression und/oder Aktivierung der Polypeptide der Erfindung schwere Auswirkungen auf eine Unmenge von zellulären Vorgängen haben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Aktivierung oder Inhibierung von zellspezifischen Reaktionen und Proliferation. Die Expression von kloniertem IL-1 eta oder von funktionell inaktiven Mutanten davon, kann verwendet werden, um die Rolle eines bestimmten Proteins zu identifizieren, die es beim Vermitteln spezifischer Signalisierungsvorgängen spielt.
Die IL-1 vermittelte zelluläre Signalübertragung schließt häufig eine molekulare Aktivierungskaskade ein, während welcher ein Rezeptor ein Ligand-Rezeptor-vermitteltes Signal durch spezifisches Aktivieren von intrazellulären Kinasen, die Zielsubstrate phosphorylieren, verbreitet. Diese Substrate können selbst Kinasen sein, welche im Anschluss an die Phosphorylierung aktiviert werden. Alternativ können sie Adaptor-Moleküle sein, die die stromabwärtige Signalübertragung durch Protein-Protein-Wechselwirkung im Anschluss an die Phosphorylierung fördern. Unabhängig von der Natur des(r) Substratmoleküle, können exprimierte funktionell-aktive Formen IL-1 eta und ihre Bindungspartner verwendet werden, um festzustellen, welche Substrate durch die Polypeptide der Erfindung erkannt und aktiviert wurden. Als solches können diese neuartigen Polypeptide als Reagenzien verwendet werden, um neuartige Moleküle zu identifizieren, die in Signalübertragungswege eingebunden sind.
Antikörper
Antikörper, die mit den Polypeptiden der Erfindung immunoreaktiv sind, werden hierin bereitgestellt. Solche Antikörper binden spezifisch an die Polypeptide über die Antigenbindungsstellen des Antikörpers (im Gegensatz zu nicht-spezifischer Bindung). Somit können die Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsproteine, etc, wie oben dargelegt, als „Immunogene" zum Herstellen von damit immunoreaktiven Antikörpern eingesetzt werden. Spezifischer enthalten die Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsproteine, etc. antigene Determinanten oder Epitope, die die Bildung von Antikörpern auslösen.
Diese antigenen Determinanten oder Epitope können entweder linear oder konformativ (diskontinuierlich) sein. Lineare Epitope bestehen aus einem einzigen Abschnitt von Aminosäuren des Polypeptids, während konformative oder diskontinuierliche Epitope aus Aminosäuren-Abschnitten von unterschiedlichen Regionen der Polypeptidkette bestehen, die bei der Proteinfaltung in unmittelbare Nähe gebracht werden (C.A. Janeway, Jr. und P. Travers, Immuno Biology, 3:9 (Garland Publishing Inc., 2. Ausgabe, 1996). Da gefaltete Proteine komplexe Oberflächen aufweisen, ist die Anzahl der verfügbaren Epitope recht zahlreich; jedoch aufgrund der Konformation des Proteins und der sterischen Hinderung ist die Zahl der Antikörper, die tatsächlich an die Epitope binden, kleiner als die Zahl der verfügbaren Epitope (C.A. Janeway, Jr. und P. Travers, Immuno Biology, 2:14 (Garland Publishing Inc., 2. Ausgabe, 1996). Epitope können durch jedes der im Stand der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden.
Folglich betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung antigene Epitope der Polypeptide der Erfindung. Solche Epitope sind für das Züchten von Antikörpern, insbesondere monoklonale Antikörper nützlich, wie detaillierter unten beschrieben ist. Zusätzlich können die Epitope der Polypeptide der Erfindung als Forschungreagenzien, in Untersuchungen, und zum Reinigen von spezifisch bindenden Antikörpern aus Substanzen, wie polyklonalen Sera oder Überständen von kultivierten Hybridomen verwendet werden. Solche Epitope oder Varianten davon können mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie Festphasen-Synthese, chemische oder enzymatische Spaltung von Polypeptiden, oder mittels rekombinanter DNA Technologie hergestellt werden.
Wie bei den Antikörpern, die durch die Epitope der Polypeptide der Erfindung ausgelöst werden, können auch wenn die Epitope isoliert wurden oder Teil des Polypeptids bleiben, sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper mittels herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Siehe zum Beispiel, Monoclonal Antibodies, Hybridoms: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al., (Hrsg.), Plenum Press, New York, 1980; und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Land (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
Hybridom-Zelllinien, die für die Polypeptide der Erfindung spezifische monoklonale Antikörper erzeugen, sind hierin ebenfalls vorgesehen. Solche Hybridome können durch herkömmliche Techniken erzeugt und identifiziert werden. Ein Verfahren zum Erzeugen einer solchen Hybridom-Zelllinie weist das Immunisieren eines Tieres mit einem Polypeptid, das Ernten der Milzzellen von dem immunisierten Tier; das Fusionieren der Milzzellen mit einer Myelom-Zelllinie, wodurch Hybridom-Zellen erzeugt werden, und das Identifizieren einer Hybridom-Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der das Polypeptid bindet, auf. Der monoklonale Antikörper kann durch konventionelle Techniken gewonnen werden.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen chimäre Antikörper, z.B humanisierte Versionen eines murinen monoklonalen Antikörpers ein. Solche humanisierte Antikörper können durch bekannte Techniken hergestellt werden, und bieten den Vorteil einer reduzierten Immunogenität, wenn die Antikörper Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform weist ein humanisierter monoklonaler Antikörper die variable Region eines murinen Antikörpers (oder nur die Antigenbindungsstelle davon) und eine von einem menschlichen Antikörper stammende konstante Region auf. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörper-Fragment die Antigen-Bindungsstelle eines murinen monoklonalen Antikörpers und ein Fragment der variablen Region (die Antigenbindungsstelle fehlt), das von einem menschlichen Antikörper stammt, aufweisen. Verfahren für die Herstellung von chimären und weiteren konstruierten monoklonalen Antikörper schließen jene ein, die in Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS, 84:3439, 1987) Larrick et al. (Bio/Technology, 7:934, 1989), und Winter und Harris, (TIPS, 14:139, Mai 1993) beschrieben sind. Verfahren zum transgenen Herstellen von Antikörpern können in GB 2.272.440, in US Patent Nos. 5.569.825 und 5.545.806 und verwandten Patenten, die von diesen die Priorität beanspruchen, gefunden werden.
Antigen-bindende Fragmente der Antikörper, die durch herkömmliche Techniken hergestellt werden können, sind durch die vorliegende Erfindung ebenfalls umfasst. Zu Beispielen solcher Fragmente zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fab und F(ab')₂- Fragmente. Mittels Gentechnik hergestellte Antikörper-Fragmente und Derivate werden ebenfalls bereitgestellt.
In einer Ausführungsform sind die Antikörper für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung spezifisch und reagieren nicht mit anderen Proteinen kreuz. Screening-Verfahren durch welche solche Antikörper identifiziert werden können, sind bekannt und können, zum Beispiel, Immunaffinitätschromatographie, einschließen.
Die Antikörper der Erfindung können in Untersuchungen verwendet werden, um das Vorhandensein der Polypeptide oder Fragmente der Erfindung, entweder in vitro oder in vivo zu ermitteln. Die Antikörper können auch zum Reinigen der Polypeptide oder Fragmente der Erfindung durch Immunäffinitätschromatographie eingesetzt werden.
Jene Antikörper, die zusätzlich die Bindung der Polypeptide der Erfindung an die Bindungspartner blockieren können, können verwendet werden, um eine biologische Aktivität zu inhibieren, die von einer solchen Bindung herrührt. Solche Blockierungsantikörper können unter Verwendung jeder geeigneten Untersuchungsprozedur, wie zum Beispiel durch Testen der Antikörper auf die Fähigkeit, die Bindung von IL-1 eta an bestimmte Zellen, die die IL-1 eta Rezeptoren exprimieren, zu inhibieren, identifiziert werden. Alternativ können Blockierungsantikörper in Untersuchungen auf die Fähigkeit, eine biologische Wirkung zu inhibieren, die von der Bindung der Polypeptide der Erfindung an ihre Bindungspartner an Zielzellen herrührt, identifiziert werden. Antikörper können, zum Beispiel, auf die Fähigkeit, die IL-1 eta-vermittelte, oder Bindungspartner-vermittelte Zelllyse zu inhibieren, untersucht werden.
Ein solcher Antikörper kann in einem in vitro Verfahren eingesetzt werden, oder in vivo verabreicht werden, um eine biologische Aktivität zu inhibieren, die durch die Einheit, die den Antikörper erzeugte, vermittelt wird. Krankheiten, die durch die Wechselwirkung der Polypeptide der Erfindung mit dem Bindungspartner hervorgerufen oder verschlimmert werden (direkt oder indirekt), können folglich behandelt werden. Ein therapeutisches Verfahren schließt die in vivo Verabreichung eines Blockierungsantikörpers an ein Säugetier in einer Menge ein, die wirksam ist, eine Bindungspartner-vermittelte biologische Aktivität zu inhibieren. Monoklonale Antikörper werden im Allgemeinen für die Verwendung in solchen therapeutischen Verfahren bevorzugt. In einer Ausführungsform wird ein Antigen-bindendes Antikörper-Fragment eingesetzt.
Antikörper können auf agonistische (d.h. Ligand-imitierende) Eigenschaften gescreent werden. Solche Antikörper induzieren bei der Bindung an Zelloberflächen-Rezeptor biologische Wirkungen (z.B. Übertragung von biologischen Signalen), ähnlich zu den induzierten biologischen Wirkungen, wenn IL-1 an die Zelloberflächen IL-1 Rezeptoren bindet.
Agonistische Antikörper können verwendet werden, um vaskuläre Endothelzellen und Lymphozyten zu aktivieren, um lokale Gewebszerstörung und Fiber zu induzieren (Janeway et al., 1996), um Makrophagen und vaskuläre Endothelzellen zu stimulieren, um IL-6 zu erzeugen, und um Moleküle auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen hinauf zu regulieren.
Zusammensetzungen, die einen gegen Polypeptide der Erfindung gerichteten Antikörper und ein physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel, Exzipient oder Träger enthalten, sind hierin vorgesehen. Geeignete Komponenten solcher Zusammensetzungen sind oben für Zusammensetzungen, die Polypeptide der Erfindung enthalten, beschrieben
Ebenfalls hierin vorgesehen sind Konjugate, die einen nachweisbaren (d.h. diagnostischen) oder therapeutischen Wirkstoff, der an den Antikörper angelagert ist, aufweisen. Beispiele von solchen Wirkstoffen sind oben dargestellt. Die Konjugate finden in in vitro oder in vivo-Verfahren Verwendung.
Die folgenden Beispiele sind zur Illustration und nicht als Einschränkung vorgesehen. Der Fachmann wird erkennen, dass Variationen der in den Beispielen ausgeführten Erfindung gemacht werden können, insbesondere angesichts der Lehre der verschiedenen hierin zitierten Referenzen.
Beispiel 1: Isolierung der IL-1 eta Polynukleotide
Humane genomische DNA, die einen stromaufwärtigen Abschnitt einer cDNA, die in EP0879889A2 offenbart ist, enthält, wurde kloniert und in die 3' Richtung verlängert. Die genomische DNA wurde sequenziert und auf potentielle Homologie zu dem C-terminalen Abschnitt von IL-1 Familienmitgliedern untersucht. Eine Region mit dem Potential, mit Homologie an den C-terminalen Abschnitt von IL-1 Familienmitgliedern zu kodieren, wurde lokalisiert und ist als Polynukleotide 375 bis 585 der SEQ ID NR: 1 offenbart. PCR Primer wurden synthetisiert, die das Stoppkodon in dem 3' oder Umkehrprimer und das Anfangs-ATG der IL-1 eta cDNA (SEQ ID NR: 1 von EP 0879889 A2 ) in dem 5' oder Sinn-Primer enthalten. Unter Verwendung dieser Primer wurde IL-1 eta cDNA von Frist-Strand-cDNA amplifiziert, die von humaner Mandel mRNA hergestellt wurde. PCR wurde unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt.
Beispiel 2: Verwendung von gereinigten IL-1 eta Polypeptiden
Linbro/Titerteck 96 Flachboden-Kammer-E.I.A. Mikrotitrationsplatten (ICN Biomedicals Inc, Aurora, OH) werden mit seriellen Verdünnungen von IL-1 eta enthaltenden Proben (in 50 mM NaHCO₃, mit NaOH auf pH 9 gebracht) bei 100:1/Kammer beschichtet. Nach der Inkubation bei 4°C für 16 Stunden wurden die Kammern sechsmal mit 200:1 0,05% Tween-20 enthaltendem PBS (PBS-Tween) gewaschen. Die Kammern werden dann mit Flag^®-Bindungspartner mit 1 mg/ml in PBS-Tween mit 5% fötalem Kälberserum (FCS) für 90 Minuten (100:1 pro Kammer) inkubiert, gefolgt von Waschen wie oben angegeben. Als nächstes wird jede Kammer mit Anti-Flag^® (monoklonaler Antikörper M2 mit 1 mg/ml in 5% FCS enthaltendem PBS-Tween für 90 Minuten (100:1 pro Kammer) inkubiert, gefolgt von Waschen wie oben angegeben. Im Anschluss daran werden die Kammern mit einem polyklonalen Ziegen-anti-mIgG1-spezifischen Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antikörper (eine 1:5000 Verdünnung der kommerziellen Stammlösung, in 5% FCS enthaltendem PBS-Tween) für 90 Minuten (100:1 pro Kammer) inkubiert. Der HRP-konjugierte Antikörper wird von Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama erhalten. Die Kammern wurden dann, wie oben, sechsmal gewaschen.
Für die Entwicklung des ELISAs, wird eine Substratmischung [100:1 pro Kammer einer 1:1 Vormischung des TMB Peroxidase-Substrats und Peroxidase Lösung B (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)] zu den Kammern hinzugefügt. Nach einer ausreichenden Farbreaktion wird die enzymatische Reaktion durch Zugage von 2N H₂SO₄ (50:1 pro Kammer) beendet. Die Farbintensität (zeigt die Ligand-Rezeptor-Bindung an) wird durch Messen der Extinktion bei 450nm auf einem V Max Plattenlesegerätes (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) bestimmt.
Beispiel 3: Aminosäure-Sequenz
Die Aminosärue-Sequenz von IL-1 eta wurde durch Translation der vollständigen Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 bestimmt.
Beispiel 4: DNA und Aminosäure-Sequenzen
Die Nukleotidsequenz der isolierten IL-1 eta und die Aminosäure-Sequenz, die dadurch kodiert ist, sind in den SEQ ID NR: 1 und 2 dargestellt. Die Sequenz des IL-1 eta DNA Fragment, das durch PCR isoliert wurde, entspricht den Nukleotiden 1 bis 585 der SEQ ID NR: 1, die die Aminosäuren 1 bis 157 der SEQ ID NR: 2 kodieren.
Die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID NR: 2 trägt signifikante Homologie zu anderen bekannten IL-1 Ligand-Familienmitgliedern.
Beispiel 5: Monoklonale Antikörper, die Polypeptide der Erfindung binden
Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren zum Herstellen monoklonaler Antikörper, die IL-1 eta binden. Zu geeigneten Immunogenen, die zum Erzeugen solcher Antikörper eingesetzt werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, gereinigtes IL-1 eta Polypeptid oder ein immunogenes Fragment davon, wie die extrazelluläre Domäne, oder Fusionsproteine, die IL-1 eta (z.B. ein lösliches IL-1 eta/Fc Fusionsprotein) enthalten.
Gereinigtes IL-1 eta kann verwendet werden, um damit immunoreaktive monoklonale Antikörper mittels konventioneller Techniken, wie jene, die im U.S. Patent 4.411.993 beschrieben sind, herzustellen. In Kürze, Mäuse werden mit IL-1 eta Immunogen immunisiert, welches in kompletten Freund's Adjuvans emulgiert ist, und in Mengen im Bereich von 10–100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert wird. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem IL-1 eta, welches in unvollständigem Freund's Adjuvans emulgiert ist, aufgefrischt. Die Mäuse werden dann periodisch nach einen wöchentlichen oder zwei-wöchentlichen Immunisierungsplan aufgefrischt. Serumproben werden periodisch durch retroorbitale Blutabnahme oder Schwanzspitzenentfernung (tail-tip excision) genommen, um auf IL-1 eta Antikörper durch Dot-Blot-Untersuchungen, ELISA (Enzymgebundene-Immunadsorptionsuntersuchung) oder Inhibierung der IL-1 eta Rezeptorbindung zu testen.
Im Anschluss an die Detektion eines geeigneten Antikörpertiters werden positive Tiere mit einer letzten intravenösen Injektion von IL-1 eta in Salzlösung versorgt. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, die Milzzellen geerntet und die Milzzellen mit einer murinen Myelom-Zelllinie, z.B., NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert. Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, welche in mehrere Mikrotiterplatten in einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin)-selektiven Medium ausplattiert werden, um die Vermehrung der nicht-fusionierten Zellen, der Myelom-Hybride und der Milzzellen-Hybride zu inhibieren.
Die Hybridom-Zellen werden mittels ELISA auf Reaktivität gegen gereinigtes IL-1 eta durch Anpassung der in Engvall et al., (Immunochem. 8:871, 1971) und im U.S. Patent 4.703.004, offenbarten Techniken gescreent. Eine bevorzugte Screeinig-Technik ist die in Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212, 1990) beschriebene Antikörper-Einfang-Technik. Positive Hybridom-Zellen können intraperitoneall in syngene BALB/c Mäuse injiziert werden, um Asziten zu erzeugen, die hohe Konzentrationen an Anti-IL-1 eta monoklonalen Antikörper enthalten. Alternativ können Hybridom-Zellen in vitro in Flaschen oder Rollerflaschen durch verschiedene Techniken gezüchtet werden. In Maus-Asziten erzeugte monoklonale Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Ausfällung, gefolgt von Gelauschluss-Chromatographie gereinigt werden. Alternativ kann Affinitätschromatographie, die auf der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G basiert, ebenfalls verwendet werden, wie auch die Affinitätschromotagraphie basierend auf der Bindung an IL-1 eta verwendet werden kann.
Beispiel 6: Northern Blot Analyse
Die Gewebeverteilung von IL-1 eta wird durch Northern Blot-Analyse untersucht, wie folgt. Ein Aliquot einer radiomarkierten Ribosonde wird zu zwei unterschiedlichen humanen multiplen Gewebe Northern Blots (Clontech, Palo Alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA) hinzugefügt. Die Blots werden in 10X Denhardts, 50 mM Tris pH 7,5, 900 mM NaCl, 0,1% Na Pyrophosphat, 1 % SDS, 200 μg/ml Lachssperma DNA hybridisiert. Die Hybridisierung wird über Nacht bei 63°C in 50% Formamid durchgeführt, wie zuvor beschrieben (March et al., Nature 315:641–647, 1985). Die Blots werden dann mit 2X SSC, 0,1% SDS bei 68°C für 30 Minuten gewaschen. Die Zellen und Gewebe mit den höchsten Konzentrationen an IL-1 eta mRNA werden durch Vergleich zu einer Kontrollsondierung mit einer β-Actin-spezifischen Sonde bestimmt.
Beispiel 7: Bindungsuntersuchung
IL-1 eta voller Länge kann exprimiert und auf die Fähigkeit, IL-1 eta Rezeptoren zu binden, getestet werden. Die Bindungsuntersuchung kann wie Folgt ausgeführt werden.
Ein Fusionsprotein, welches ein an den N-Terminus eines löslichen IL-1 eta Polypeptids (LZ-IL-1 eta) fusioniertes Leucin-Zipper-Peptid aufweist, wird in der Untersuchung eingesetzt. Ein Expressionskonstrukt wird im Wesentlichen wie in Wiley et al. (Immunity, 3:673–682, 1995) für die Herstellung des FLAG^®(IL-1 eta) Expressionskonstrukts beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, dass DNA, die das FLAG^®-Peptid kodiert, durch eine Sequenz, die einen modifizierten Leucin-Zipper kodiert, der die Trimerisierung ermöglicht, ersetzt wurde. Das Konstrukt, im Expressionsvektor pDC409, kodiert eine Leitsequenz, welche vom humanen Cytomegalievirus stammt, gefolgt von dem an den N-Terminus eines löslichen IL-1 eta Polypeptids fusionierten Leucin-Zipper-Anteil. Das LZ-IL-1 eta wird in CHO-Zellen exprimiert, und aus dem Kulturüberstand gereinigt.
Der als pDC409 bezeichnete Expressionsvektor ist ein Säugetier-Expressionsvektor, der von dem pDC406 Vektor, beschrieben in McMahan et al. (EMBO J., 10:2821–2832, 1991) abgeleitet ist. Zu den Merkmalen die dem pDC409 (im Vergleich zu pDC406) hinzugefügt wurden, zählen zusätzliche Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle (mcs); drei Stoppkodons (eines in jedem Leserahmen), die stromabwärts der mcs platziert sind; und ein T7 Polymerase-Promotor, stromabwärts der mcs, der die Sequenzierung der in die mcs eingefügten DNA erleichtert.
Für die Expression des humanen IL-1 eta Proteins voller Lälnge wird die gesamte kodierende Region (d.h., die in SEQ ID NR: 1 dargestellte DNA Sequenz) durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die in der PCR eingesetzte Matrize ist der aus der Mandel First-Strand cDNA isolierte cDNA Klon, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die isolierte und amplifizierte DNA wird in den Expressionsvektor pDC409 eingefügt, um ein als pDC409-IL-1 eta bezeichnetes Konstrukt zu ergeben.
IL-1 eta Polypeptid wird verwendet, um auf die Fähigkeit zu testen, an die Wirtszellen, die IL-1 eta-Rezeptoren rekombinant oder endogen exprimieren, zu binden. IL-1 eta Rezeptor exprimierende Zellen werden in mit 10% fötalem bovinem Serum, Penicillin, Streptomycin, und Glutamin ergänztem DMEM kultiviert. Zellen werden mit LZ-IL-1 eta (5 mg/ml) für etwa 1 Stunde inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation werden die Zellen gewaschen, um ungebundenes LZ-IL-1 eta zu entfernen und vor der Analyse durch Fluoreszenz-aktivierte Zellscanning (FACS) mit biotinyliertem anti-LZ monoklonalem Antikörper (5 mg/ml) und Phycoerythrin-konjugiertem Streptavidin (1:400) inkubiert. Die zytometrische Analyse wird auf einem FACscan (Beckton Dickinson, San Jose, CA) durchgeführt.
Die IL-1 eta Rezeptoren exprimierenden Zellen zeigten eine signifikant höhrer Bindung des IL-1 eta, im Vergleich zu den Kontrollzellen, die keine IL-1 eta Rezeptoren exprimieren.
Beispiel 8: Expressionsanalyse
First-Strand cDNAs, die in den Clontech (Palo Alto, CA) human multiplen Gewebe cDNA Panellen I (Kat. Nr. K1420-1) und II (Kat-Nr. K1421-1) und der humane Immungruppe (Kat-Nr. K1426-1) vorhanden sind, wurden durch PCR Amplifikation unter Verwendung von Sinn- und Gegensinn Primern verwendet. Die Primer wurde so konstruiert, dass die die Introns umspannen, so dass Produkte, die von genomischer DNA und cDNA stammen, unterschieden werden können. In einigen Fällen wurden verschachtelte Primer in einer zweiten PCR Reaktion verwendet. Die Gegenwart eines Amplifikationsproduktes für jede Gen/Gewebe-Kombination wurde durch die Analyse in Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid gefärbt sind, bestimmt.
Alternativ wurden individuelle Zelltypen aus humanem peripheren Blut isoliert und Stimulationen wurden durchgeführt (Kubin et al., Blood 83(7):1847–55 (1994); Kubin et al., J. Exp. Med 180(1):211–22 (1994)). NK Zellen wurden mit IL-12 (R&D Biosystems; 1 ng/ml) für entweder 2 Stunden oder 4 Stunden inkubiert. T Zellen wurden nicht stimuliert oder mit Anti- CD3 (OKT-3 Antikörper, auf Kunststoff mit 5 ng/ml immobilisiert) oder mit der Kombination von Anti-CD3 und Anti-CD28 (der Anti-CD28 Antikörper war CD248, verwendet in löslicher Form als eine 1:500 Verdünnung von Aszitenfluid) für 30 Minuten oder 4 Stunden stimuliert. Monozyten wurden nicht stimuliert, oder mit LPS (Sigma, 1 ug/ml) für 2 oder 3 Stunden stimuliert. B Zellen wurden nicht stimuliert, oder mit der Kombination von 0,05% SAC und 500 ng/ml CD40L Trimer (Immunex) und 5 ng/ml IL-4 (Immunex) für 3,5 oder 4 Stunden stimuliert. Dendritische Zellen wurden mit LPS, wie für Monozyten, für 2 oder 4 Stunden stimuliert. Nach der Isolation von RNA und Synthese von First-Strand cDNA, wurden PCR Amplifikationen und Gel-Analyse durchgeführt.
Tabelle I fasst die IL-1 eta Expressionsdaten zusammen, die durch PCR Analyse von einer Gruppe von First-Strand cDNAs von Clontech stammen. In der Tabelle zeigt ein „-„ an, dass die mRNA gesucht, jedoch nicht gefunden wurde. Positive Expressionsergebnisse sind durch ein „A" angezeigt. Tabelle 1
Sequenzliste

Claims

DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA, die das Polynucleotid der SEQ ID NR:1 aufweist; (b) DNA die ein Polynucleotid aufweist, das das Polypeptid gemäß SEQ ID NR:2 kodiert; (c) DNA die ein Polynucleotid aufweist, das eine Aminosäuresequenz kodiert, die wenigstens 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR:2; und (d) DNA, die als Folge des genetischen Codes zu einer DNA degeneriert ist, die in (a)–(c) definiert ist, wobei die DNA ein Polypeptid kodiert, das an IL-1 Rezeptorfamilienmitglieder bindet.
DNA, welche die Nucleotidreste 112–585 der SEQ ID NR:1 enthält.
DNA, welche ein Polynucleotid aufweist, das das Polypeptid der SEQ ID NR:2 kodiert.
Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das das Polypeptid der SEQ ID NR:2 enthält; und (b) einem Polypeptid, das ein Polypeptid aufweist, das wenigstens 80% identisch ist mit dem Polypeptid der SEQ ID NR:2; wobei das Polypeptid ein IL-1 Rezeptorfamilienmitglied bindet.
Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR:2 aufweist.
Polypeptid, das ein Polypeptid aufweist, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1–3 kodiert ist.
Expressionsvektor, der die DNA nach einem der Ansprüche 1–3 enthält.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 7 transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, welches Verfahren das Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen aufweist, die die Expression des Polypeptids bewirken.
Antikörper, der mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 4 bis 6 immunreaktiv ist.