BR112016017766B1 - Método para preparar adalimumabe com galactosilação reduzida e método para reduzir a galactosilação de um adalimumabe - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A MODULAÇÃO DA GALACTOSILAÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE POR MEIO DE OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA Um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada ou um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo durante a cultura celular animal; um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada ou um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo suplementar asparagina a uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo durante a cultura celular animal; um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada ou um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo aumentar a osmolalidade de uma cultura celular animal que expressa uma proteína recombinante alvo e suplementar asparagina à mesma durante a cultura celular animal; e uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, que é preparada pelo método, são divulgados.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001]A presente invenção se refere a um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada ou a um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo aumentar a osmolali- dade de uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo durante a cultura celular animal; a um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada ou a um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo suplementar asparagina a uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo durante a cultura celular animal; a um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada ou a um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo aumentar a osmolalidade de uma cultura celular animal que expressa uma proteína recombinan- te alvo, e suplementar asparagina à mesma durante a cultura celular animal; e a uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, que é preparada pelo método.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[002]Anticorpos são proteínas que se ligam a antígenos, desse modo, interferindo com as ações dos antígenos ou removendo os antígenos. Como o mercado de anticorpo terapêutico é conhecido por apresentar um potencial significante, estudos intensivos são conduzidos sobre a expressão eficaz e produção de larga escala de anticorpos. Um dos pontos importantes na produção de anticorpos é a homogeneidade da população de anticorpos preparados. Em particular, na produção de anticorpos monoclonais, perfis de glicoforma são importantes para anticorpos mono- clonais constantes e reproduzíveis. Entretanto, muitas variáveis diferentes podem afetar os perfis glicosilados dos anticorpos monoclonais produzidos, e, assim, houve uma necessidade ao desenvolvimento de um método capaz de controlar constantemente a glicosilação da população preparada de anticorpos e o teor de isômeros de anticorpos.

[003]Um dos problemas importantes na produção comercial de anticorpos monoclonais é manter constantemente a qualidade dos anticorpos monoclonais produzidos em cada batelada. Embora existam diversos atributos de qualidade durante o processo de produção de anticorpo monoclonal, a galactosilação do anticorpo pode ser uma das qualidades mais importantes dentre os mesmos. Isto ocorre pelo fato de que a galactosilação pode afetar o processo de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), que é um dos maiores modos de ação (MOA) dos anticorpos monoclonais. A galactosilação é estabelecida usando galactose como uma unidade constitucional para a reação em cadeia de glicosilação por meio da ligação da mesma em proximidade a um açúcar de N-acetilglicosamina por intermédio de galactosil- transferase. Exemplos dos métodos para controlar a galactosilação podem incluir um método para adicionar manganês ou galactose a uma solução de cultura, etc. (Publicação de Pedido de Patente U.S. No 2012-0276631), mas ainda existe uma necessidade quanto ao desenvolvimento de um método para controlar a galactosilação de anticorpos.

DIVULGAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[004]Sob estas circunstâncias, os presentes inventores têm feitos muitos esforços para desenvolver um método para controlar eficazmente a galactosilação de proteínas recombinantes preparadas durante o processo de cultura de células animais que podem produzir as proteínas recombinantes. Como um resultado, os inventores descobriram que a galactosilação de proteínas recombinantes pode ser efi- cazmente modulada por meio do aumento da osmolalidade de uma solução de cultura de células animais ou suplementação de asparagina em um ponto no tempo particular do processo de cultura durante o processo de cultura das células animais. Adicionalmente, os inventores descobriram que quando asparagina é suplementada simultaneamente com um aumento da osmolalidade da solução de cultura de células animais, a galactosilação pode ser controlada sem redução no teor dos isômeros de anticorpos ácidos, de acordo com o aumento da osmolalidade, desse modo, concluindo a presente invenção.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[005]Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, incluindo aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[006]Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[007]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, incluindo suplementar asparagina a uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[008]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo suplementar asparagina a uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[009]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, incluindo aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo e suplementar asparagina à mesma durante o processo de cultura das células animais.

[010]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo e suplementar asparagina à mesma durante o processo de cultura das células animais.

[011]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína recombinante alvo preparada pelo acima método.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[012]O método da presente invenção apresenta uma vantagem de que o teor de galactose de uma proteína recombinante alvo pode ser eficazmente modulado a uma faixa desejada. Adicionalmente, o método da presente invenção, que abrange o aumento da osmolalidade e a adição de asparagina, apresenta o efeito de modular o teor de isômeros de anticorpos ácidos (variantes ácidas), assim como galactose. Consequentemente, o método da presente invenção pode ser eficazmente usado para a preparação de uma população desejada de anticorpos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[013]A FIG. 1 mostra um diagrama esquemático de um vetor de expressão de biossimilar do adalimumabe.

[014]A FIG. 2 mostra um ponto no tempo para injetar uma solução de cloreto de sódio (NaCl) aquosa durante o período de uma cultura de batelada alimentada.

[015]A FIG. 3 mostra um ponto no tempo para suplementar asparagina durante o período de uma cultura de batelada alimentada.

MELHOR MODO

[016]De modo a obter os objetivos acima, um aspecto da presente invenção fornece um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosila- ção modulada, incluindo aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[017]Especificamente, o método acima é um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, incluindo aumentar a osmola- lidade de uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo em um dia particular na cultura durante o processo de cultura das células animais.

[018]Na presente invenção, a cultura pode ser uma cultura de batelada alimentada, mas não é limitada à mesma.

[019]Conforme usado neste relatório, o termo “cultura de batelada alimentada” se refere a uma cultura celular em que a cultura celular inicial é iniciada por meio de um meio basal ou um meio de produção e a cultura é continuada, enquanto um meio de alimentação é contínua ou descontinuamente adicionado à cultura em qualquer tempo durante a fase de crescimento celular ou fase de produção de anticorpos.

[020]Conforme usado neste relatório, o termo “meio de cultura celular” ou “meio de cultura” se refere a uma solução de nutrientes para a manutenção, crescimento, proliferação ou expansão de células em um meio in vitro artificial, que é um lado externo de um organismo ou tecido multicelular. O meio de cultura celular pode ser otimizado para a cultura de células particulares, por exemplo, um meio basal preparado para suportar o crescimento celular, ou um meio de produção preparado para promover a produção de anticorpos monoclonais, e um meio concentrado preparado por meio da concentração de nutrientes em alta concentração. Os nutrientes e componentes do meio se referem aos componentes que constituem um meio de cultura celular e podem ser permutavelmente usados na presente invenção.

[021]Especificamente, “meio de cultura basal” ou “meio basal” se refere a um meio que pode suportar o crescimento mínimo de células. O meio basal não apenas fornece os sais inorgânicos padrão, por exemplo, zinco, ferro, magnésio, cálcio e potássio, mas também fornece elementos traço, vitaminas, fontes de energia, tampões e aminoácidos. Exemplos do meio basal incluem Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Meio Eagle Basal (BME), RPMI 1640, F-10 e F-12, mas não são limitados aos mesmos.

[022]Adicional e especificamente, os termos “meio de produção de cultura celular” ou “meio de produção” se referem a um meio que é usado para o propósito de otimizar a expressão de anticorpos monoclonais em um biorreator. A composição do meio de produção pode ser similar ou diferente daquela do meio basal, e quando é diferente, o meio de produção pode ser preparado por meio da concentração do meio basal ou adição de componentes particulares ao meio basal.

[023]Conforme usado neste relatório, os termos “meio de alimentação” e “meio de cultura adicional” podem se referir a um meio composto de um nutriente particular ou uma pluralidade de nutrientes, que são componentes concentrados de meio basal. Os componentes e concentrações do meio de alimentação podem ser preparados de forma variada, de acordo com as células que serão cultivadas.

[024]No processo de cultura acima, a fase de crescimento celular se refere a um período durante o qual as células crescem rapidamente depois da inoculação. No caso de células de ovário de hamster Chinês (CHO), é conhecido que o número de células aumenta mais ativamente em uma temperatura de 35 °C a 37 °C e em um pH de 7,0 a 7,3. Na presente invenção, os parâmetros de cultura durante a fase de crescimento celular foram 36,5 °C e no pH 7,1 ou pH 7,0.

[025]O termo “inoculação” se refere a uma semeadura de células em um meio, que é fornecida para cultura celular. Em particular, o meio pode ser fornecido antes da transferência das células ou pode ser simultaneamente fornecido com as células em um biorreator celular. Em uma cultura celular animal de larga escala, convencionalmente, um meio é antecipadamente fornecido e as células são transferidas em um biorreator depois de manter a temperatura e saturação de oxigênio em uma faixa pré-determinada.

[026]O termo “fase de produção de anticorpos” se refere a um período durante o qual as mudanças no processo são aplicadas para a otimização da produção de anticorpo monoclonal. Em particular, as mudanças no processo para otimizar a produção podem incluir diminuição de temperatura, troca de oxigênio dissolvido e mudança do meio.

[027]Na presente invenção, foi confirmado que o grau de mudanças na ga- lactosilação de proteínas recombinantes produzidas nas células animais que expressam proteínas recombinantes pode variar, de acordo com o ponto no tempo quando a osmolalidade do meio é aumentada. Isto é, quando a osmolalidade foi gradualmente aumentada durante o período de cultura, a diferença no grau de galactosila- ção não foi significante em comparação àquela do grupo em que a osmolalidade não foi aumentada. Ao contrário, quando a osmolalidade foi aumentada em um ponto no tempo particular durante a cultura, o teor de G0F foi significantemente aumentado, assim, confirmando que a galactosilação pode ser modulada e, especificamente, a galactosilação pode ser prevenida ou reduzida.

[028]Adicionalmente, na presente invenção, a etapa de aumentar a osmola- lidade é, preferivelmente, realizada durante o processo de cultura principal de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo, mas não é limitada à mesma.

[029]Conforme usado neste relatório, o termo “cultura principal” se refere a uma etapa de cultura em que a produção real de anticorpos monoclonais é realizada. É a etapa final do processo de cultura que foi iniciado com um frasco único de células e, após a conclusão da cultura principal, os anticorpos monoclonais produzidos são submetidos à purificação. A cultura principal pode ser distinguida do termo chamado “cultura de semeadura”, que é usado para o propósito de aumento gradual de um volume de cultura.

[030]A etapa de aumentar a osmolalidade pode ser realizada em um ponto no tempo particular da cultura durante o processo de cultura principal de células animais, especificamente, em qualquer dia na cultura durante a cultura principal do dia 1 ao dia 10, com base no dia 0 como o início da cultura principal; mais especificamente, em qualquer dia na cultura entre o dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10, com base no dia 0 como o início da cultura principal, e, mais especificamente, no dia 4 ou dia 7, com base no dia 0 como o início da cultura principal, mas não é limitada à mesma.

[031]Adicionalmente, a etapa de aumentar a osmolalidade pode ser realizada um tempo único durante o processo de cultura das células animais que expressam a proteína recombinante alvo.

[032]Adicionalmente, a etapa de aumentar a osmolalidade, embora não par-ticularmente limitada à mesma, pode ser realizada para apresentar a osmolalidade final em uma solução de cultura na faixa de 460 mOsm/kg a 500 mOsm/kg e, mais especificamente, na faixa de 460 mOsm/kg a 480 mOsm/kg, mas não é limitada à mesma. A osmolalidade final na solução de cultura se refere à osmolalidade que aparece no ponto no tempo de terminação de cultura, mas não é particularmente limitada à mesma.

[033]Adicionalmente, a etapa de aumentar a osmolalidade pode apresentar um aumento de osmolalidade alvo em uma solução de cultura na faixa de 400 mOsm/kg a 440 mOsm/kg e, mais especificamente, na faixa de 430 mOsm/kg a 440 mOsm/kg, mas não é limitada à mesma. O aumento de osmolalidade alvo na solução de cultura se refere ao nível de osmolalidade que será aumentada no ponto no tempo da realização da etapa de aumentar a osmolalidade, mas não é particular- mente limitado ao mesmo.

[034]Adicionalmente, o aumento da osmolalidade pode ser realizado usando pelo menos um método selecionado a partir do grupo que consiste de um método para suplementar cloreto de sódio ou cloreto de potássio a uma solução de cultura das células animais e um método para adicionar glicose à solução de cultura e, mais especificamente, usando um método para suplementar cloreto de sódio à solução de cultura, mas não é limitada ao mesmo.

[035]O método para suplementar cloreto de sódio a uma solução de cultura pode ser realizado por meio da adição de uma solução de cloreto de sódio aquosa 4 M à solução de cultura em um dia particular durante o progresso de uma cultura de batelada alimentada, desse modo, aumentando a osmolalidade em um certo nível, mas não é limitada ao mesmo. Quando a osmolalidade em uma solução de cultura, ou ainda mais, a osmolalidade em células, é aumentada pela adição de uma solução de cloreto de sódio aquosa, resulta no aumento da atividade de β-galactosidase, e, assim, a galactosilação de anticorpos monoclonais pode ser inibida.

[036]Conforme usado neste relatório, o termo “caldo de cultura” ou “meio de cultura” se refere a um líquido contendo células de cultura, que é incluído em um frasco de agitação ou biorreator. O caldo de cultura e o meio de cultura podem ser permutavelmente usados. Adicionalmente, a solução de cultura e o meio de cultura podem ser distinguíveis, dependendo da presença de células animais.

[037]Conforme usado neste relatório, a proteína recombinante pode ser um anticorpo e, preferivelmente, um anticorpo monoclonal.

[038]Conforme usado neste relatório, o termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo que pode ser formado por uma célula com sequência que codifica o anticorpo e reconhece um antígeno específico.

[039]O anticorpo da presente invenção, embora não limitado ao mesmo, pode, preferivelmente, incluir todos os anticorpos terapêuticos convencionalmente usa- dos na técnica e, especificamente, pode ser adalimumabe.

[040]Adicionalmente, o anticorpo acima é um conceito que abrange anticorpos de comprimento total e fragmentos de anticorpos e exemplos dos fragmentos de anticorpos incluem Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, etc. O Fv inclui as formas de Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv) e Fv de cadeia única (scFv). Fd se refere ao componente de cadeia pesada incluído em Fab.

[041]As células animais que podem expressar a proteína recombinante alvo podem incluir uma célula do tipo nativa ou transfectada capaz de expressar a proteína recombinante sem limitação. Para o propósito da presente invenção, as células animais podem ser capazes de expressar a proteína recombinante que se torna o objeto para modular o teor de galactose, por exemplo, uma linhagem celular de ovário de hamster Chinês (CHO) ou uma linhagem celular de mieloma de camundongo (NSO), mas não são limitados às mesmas.

[042]Adicionalmente, para modular a galactosilação do anticorpo monoclonal, a otimização de parâmetros de cultura, concentração de meio de cultura basal e alimentação adicional de meio de cultura otimizado pode ser incluída.

[043] Isto é, um método para modular a galactosilação dos anticorpos mono- clonais especificados acima, de acordo com o grau de exigência de modificação da galactosilação, pode ser aplicado depois da determinação da faixa de galactosilação para um anticorpo monoclonal desejado e análise da galactosilação do anticorpo monoclonal expressado por uma linhagem celular possuída.

[044]Especificamente, os exemplos da modificação que podem ser realizados na operação de um biorreator para a produção de anticorpos monoclonais com galactosilação modulada podem incluir a otimização de parâmetros de cultura, tais como oxigênio dissolvido (DO), grau de acidez (pH), temperatura de cultura, agitação, etc. Especificamente, no método existente, onde a cultura é realizada a 36,5 °C com oxigênio dissolvido a 30 % e pH 7,0 durante a fase de crescimento celular e a 30 °C com oxigênio dissolvido a 30 % e pH 7,0 durante a fase de produção de anticorpos, quando a cultura foi realizada depois da modificação da temperatura a 28 °C, oxigênio dissolvido a 20 % e grau de acidez ao pH 6,9, respectivamente, foi confirmado que a modulação da galactosilação dos anticorpos monoclonais é possível.

[045]Adicionalmente, para a modulação da galactosilação, um meio de cultura basal pode ser concentrado para ser usado. Especificamente, um meio de cultura que não contém componentes derivados de animal pode ser usado e um meio basal desenvolvido para uma cultura de batelada alimentada pode ser otimizado para modular a galactosilação de anticorpos monoclonais. Especificamente, quando o meio que foi preparado por meio da concentração do meio de cultura basal, por exemplo, em 0,8 vez ou 1,4 vez, foi usado na cultura principal, foi possível modular a galacto- silação dos anticorpos monoclonais.

[046]Adicionalmente, um meio de alimentação pode ser otimizado para modular a galactosilação. Na presente invenção, a galactosilação foi reduzida por meio da modulação da concentração de um meio de alimentação e otimização da concentração de componentes metálicos adicionados ao meio de alimentação.

[047]A galactosilação de uma proteína recombinante alvo preparada pelo método acima pode ser medida por meio da análise de perfil de N-glicano usando o dispositivo Q-TOF ou UPLC. A análise de perfil de N-glicano fornece várias informações, incluindo teor de G0F, índice de galactosilação (GI), cadeia pesada não glico- silada (NGHC), % de afucosilação, altos teores de manose, etc., e na presente invenção, a mudança no teor de G0F foi, na maioria das vezes, mencionada.

[048]Adicionalmente, o método da presente invenção pode ser aquele para preparar uma população de anticorpos com galactosilação reduzida. Isto é, é um método que pode ser aplicado durante a preparação de uma população de anticorpos, que apresenta um nível menor de galactosilação em relação ao valor analisado, depois da análise da galactosilação dos anticorpos monoclonais expressados pela linhagem celular possuída.

[049]Conforme usado neste relatório, o termo “população de anticorpos” se refere a um grupo de anticorpos que inclui anticorpos que podem apresentar vários teores de glicano e para o propósito da presente invenção, a população de anticorpos se refere a um grupo de anticorpos com galactosilação modulada, que inclui anticorpos galactosilados em uma razão alvo.

[050]Um outro aspecto da presente invenção fornece um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo aumentar a osmo- lalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[051]O método e cada um dos termos são os mesmos, conforme explicado acima.

[052]Especificamente, o método pode incluir aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombi- nante alvo em um dia particular na cultura durante o processo de cultura das células animais e os detalhes específicos são os mesmos, conforme explicado acima.

[053]Um outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, incluindo suplementar asparagina a uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[054]Os termos descritos são os mesmos, conforme explicado acima.

[055]Na presente invenção, foi confirmado que quando asparagina é suplementada a uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais, a galactosila- ção da proteína recombinante alvo pode ser modulada.

[056]Especificamente, asparagina pode ser adicionado na forma de um concentrado de asparagina ou um meio de cultura contendo asparagina.

[057]Adicionalmente, a suplementação de asparagina pode ser realizada várias vezes durante o processo de cultura das células animais que expressam a proteína recombinante alvo em um ponto no tempo particular do processo de cultura. Em particular, a suplementação de asparagina pode ser realizada a partir do dia 4 ao dia 10, com base no dia 0 como o início da cultura principal e, especificamente, a suplementação de asparagina pode ser realizada no dia 4, dia 7 e dia 10, com base no dia 0 como o início da cultura principal, desse modo, aumentando gradualmente a concentração de asparagina em uma solução de cultura.

[058]Quando asparagina é suplementada em um tempo único, existe uma desvantagem de que a concentração de NH4+ em uma solução de cultura aumenta rapidamente e o crescimento celular, desse modo, se torna retardado, e, consequentemente, o nível de expressão da proteína final é reduzido. Entretanto, quando aspa- ragina é adicionada em doses divididas durante a alimentação, de acordo com a presente invenção, existe uma vantagem de que uma quantidade desejada da proteína pode ser produzida durante a modulação da galactosilação sem a desvantagem acima.

[059]A suplementação de asparagina pode ser realizada, de modo que a concentração final de asparagina na solução de cultura das células animais possa estar na faixa de 27,6 mM a 33,6 mM.

[060]Especificamente, asparagina pode ser suplementada, de modo que a concentração final de asparagina na solução de cultura das células animais possa ser de 33,6 mM; por exemplo, asparagina pode ser suplementada, de modo que a concentração final de asparagina na solução de cultura das células animais possa ser ainda aumentada em 6 mM a 18 mM e, mais especificamente, asparagina pode ser suplementada três vezes por meio da adição sequencial da asparagina em concentrações de 6 mM, 12 mM e 18 mM, mas não é limitada à mesma.

[061]Quando o método é aplicado às células animais, ele induz a geração de íons amônio (NH4+), desse modo, aumentando a concentração de íons amônio nas células. Consequentemente, o pH da rede trans-golgi é aumentado e a atividade de β-galactosiltransferase é diminuída e a galactosilação do anticorpo monoclonal, desse modo, pode ser inibida.

[062]Adicionalmente, conforme descrito acima, para modular a galactosila- ção do anticorpo monoclonal, a otimização de parâmetros de cultura, concentração do meio de cultura basal e alimentação adicional do meio de cultura otimizado podem ser incluídos.

[063] Isto é, um método para modular a galactosilação dos anticorpos mono- clonais especificados acima, de acordo com o grau de exigência de modificação da galactosilação, pode ser aplicado depois da determinação da faixa de galactosilação para um anticorpo monoclonal desejado e análise da galactosilação do anticorpo monoclonal expressado por uma linhagem celular.

[064]Um outro aspecto da presente invenção fornece um método para modular a galactosilação de uma proteína recombinante alvo, incluindo suplementar aspa- ragina a uma solução de cultura de células animais que expressam uma proteína recombinante alvo durante o processo de cultura das células animais.

[065]O método e termos descritos são os mesmos, conforme explicado acima.

[066]Um outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar uma proteína recombinante alvo com galactosilação modulada, incluindo aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína recombinante alvo e suplementar asparagina à solução de cultura durante o processo de cultura das células animais.

[067]Os termos descrito são os mesmos, conforme explicado acima.

[068]Na presente invenção, foi confirmado que, quando asparagina foi adicionada a uma solução de cultura de células animais que expressam a proteína re- combinante alvo durante o aumento da osmolalidade da solução de cultura das células animais durante o processo de cultura das células animais, o teor de isômeros de anticorpos ácidos, que pode ser diminuído junto com o aumento na osmolalidade, foi aumentado junto com uma diminuição simultânea na galactosilação, de acordo com a adição de asparagina.

[069]No método acima, o aumento da osmolalidade e a suplementação de asparagina podem ser simultânea ou sequencialmente realizados. Por exemplo, a osmolalidade em uma solução de cultura pode ser aumentada por um método, tal como suplementação de cloreto de sódio, seguido por suplementação de asparagi- na; ou asparagina pode ser suplementada primeiro e depois a osmolalidade em uma solução de cultura pode ser aumentada por meio da adição de cloreto de sódio ou semelhantes; ou a suplementação de asparagina e o aumento da osmolalidade em uma solução de cultura podem ser simultaneamente aplicados.

[070]Em particular, o aumento da osmolalidade pode ser realizado por meio da aplicação dos métodos explicados acima.

[071]O aumento da osmolalidade pode ser realizado para apresentar a os- molalidade final na solução de cultura na faixa de 460 mOsm/kg a 500 mOsm/kg, e a suplementação de asparagina pode ser realizada para suplementar asparagina para ajustar a concentração final de asparagina na solução de cultura de células animais na faixa de 27,6 mM a 33,6 mM.

[072]Adicionalmente, a proteína recombinante pode ser um anticorpo, espe-cificamente, um anticorpo monoclonal, e o teor de isômeros de anticorpos ácidos da população de anticorpos preparados pelo método acima pode ser ajustado durante a modulação simultânea da galactosilação de um anticorpo recombinante alvo pelo método da presente invenção. Isto é, a galactosilação pode ser reduzida, de acordo com o aumento na osmolalidade e, simultaneamente, o teor de isômeros de anticorpos ácidos, que pode ser reduzido, de acordo com o aumento na osmolalidade, po- de ser aumentado pela adição de asparagina.

[073]Consequentemente, o método acima apresenta uma vantagem de que ele pode modular a galactosilação da população do anticorpo alvo, enquanto é capaz de ajustar simultaneamente o teor de isômeros de anticorpos ácidos da população do anticorpo alvo.

[074]Os isômeros de anticorpos ácidos são um tipo de isômero de anticorpo. Um isômero de anticorpo se refere a um anticorpo em que uma porção dos aminoá- cidos do anticorpo com atividade principal é modificada, devido à desaminação ou oxidação, e inclui isômeros de anticorpos ácidos e isômeros de anticorpos básicos. Exemplos incluem um isômero de anticorpo em que asparagina entre aminoácidos é convertida em aspartato por meio de desaminação, um isômero de anticorpo em que metionina é convertida em sulfato de metionina por oxidação, etc. Adicionalmente, quando glutamato está presente no N-terminal de uma cadeia pesada, o isômero de anticorpo, em que o glutamato é convertido em piroglutamato por meio da formação de um anel em pentágono, é incluído.

[075]A análise destes isômeros de anticorpos pode ser realizada por croma- tografia, etc., e na presente invenção, a análise foi realizada por meio de cromato- grafia de resina de troca catiônica. O teor de isômeros de anticorpos ácidos, principais e básicos varia amplamente, de acordo com as autocaracterísticas dos anticorpos monoclonais. O teor de isômeros de anticorpos de carga (variantes de carga) dos anticorpos monoclonais pode variar, de acordo com as condições de cultura de linhagens celulares que expressam os anticorpos monoclonais (parâmetros de cultura, meio de produção, etc.). Consequentemente, o método acima tem uma vantagem de que ele pode ajustar o teor desejado de galactose, ajustando simultaneamente o teor dos isômeros de anticorpos ácidos na faixa desejada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[076]Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos seguintes. Entretanto, estes Exemplos são apenas para propósitos ilustrativos e a invenção não é intencionada a ser limitada por estes Exemplos.

EXEMPLO 1: MODULAÇÃO DA GALACTOSILAÇÃO DEVIDO AO AUMENTO ARTIFICIAL DA OSMOLALIDADE

[077]Existem vários métodos para aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura durante o progresso de uma cultura de batelada alimentada, por exemplo, um método para adicionar um excesso de quantidade de glicose a uma solução de cultura, adicionar uma solução de cloreto de sódio aquosa a uma solução de cultura, etc. Na presente invenção, como um método representativo para aumentar a osmo- lalidade, um método para adicionar uma solução de cloreto de sódio aquosa 4 M a uma solução de cultura foi aplicado.

EXPLICAÇÃO DOS MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÕES DO MEIO

[078]Na presente invenção, o anticorpo monoclonal ao qual o aumento da osmolalidade de uma solução de cultura ou adição de asparagina foi aplicado é um biossimilar do anticorpo adalimumabe e o biossimilar do adalimumabe é um agente terapêutico para tratar artrite reumatoide e doença de Crohn desenvolvido pela Abbott. O biossimilar do adalimumabe DNA foi produzido por meio de amplificação por intermédio de PCR se referindo às sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo adalimumabe divulgado na Patente U.S. No 6.090.382, e pCB-Am2.77_v5.4 (FIG. 1) foi preparado usando o promotor de pGL3 CUCBin, um vetor desenvolvido pela LG Life Sciences Ltd., que depois foi transfec- tado na linhagem celular CHO-DXB11, desse modo, preparando uma linhagem celular capaz de expressar o biossimilar do adalimumabe. O pCUCBin desenvolvido pela LG Life Sciences Ltd. é um dos vetores divulgados na Patente Coreana No 101038126 (Novo promotor híbrido e vetor recombinante que inclui o promotor).

[079]O meio usado na presente invenção apresenta três tipos diferentes de um meio de cultura basal, um meio de produção (um meio de cultura principal) e um meio de alimentação (um meio de cultura adicional).

[080]O meio de cultura basal é um meio usado para o propósito de culturas de semeadura. O meio de produção é um meio usado na cultura realizada para produção de anticorpo principal (cultura principal) depois da cultura de semeadura e pode ser preparado por meio da concentração de um componente particular em um meio de cultura basal ou adição de um novo componente. Na presente invenção, um meio de cultura basal concentrado 1,4 vez foi usado como o meio de produção. O meio de alimentação é um meio de cultura que será adicionado para o propósito de promover o crescimento celular e aumentar a quantidade de expressão do anticorpo durante a cultura. Na presente invenção, um meio de cultura basal concentrado 3,3 vezes foi usado como o meio de alimentação. O meio de cultura basal, o meio de produção e o meio de alimentação são meios modificados de Meio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) e as composições do meio de cultura são mostradas na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Composições do meio de cultura basal

[081]O método de produção de anticorpos usado na presente invenção é um processo para cultivar células animais usando um biorreator e a cultura das células animais é um processo para o crescimento de células animais em um meio de cultura e possibilitar que as células animais expressem anticorpos por meio de um tratamento particular (por exemplo, diminuição da temperatura). Os métodos de cultura variadamente incluem uma cultura de batelada, uma cultura de batelada alimentada, uma cultura contínua, uma cultura de perfusão, etc., e o método de cultura usado na presente invenção para cultivar a linhagem celular do biossimilar do adalimumabe é uma cultura de batelada alimentada. A cultura de batelada alimentada é um método de cultura que progride em tal maneira que um meio de cultura adicional é adicionado pelo menos uma ou duas vezes em um dia particular na cultura durante a realização de uma cultura de produção.

[082]O método de cultura de batelada alimentada usado nos exemplos co- mumente ainda adiciona um meio de cultura adicional em uma quantidade correspondente a 5 % do volume da solução de cultura corrente de um meio de cultura quatro vezes no dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10 na cultura.

EXEMPLO 1.1: MUDANÇA NA GALACTOSILAÇÃO, DE ACORDO COM O PONTO NO TEMPO DE AUMENTO NA OSMOLALIDADE

[083]Uma cultura de batelada alimentada foi realizada em uma escala real de 30 mL usando um frasco de agitação de 250 mL. A estratégia de alimentação da cultura de batelada alimentada e o ponto no tempo para adicionar uma solução de cloreto de sódio aquosa foram similares àqueles ilustrados na FIG. 2. O caldo de cultura iniciou com uma osmolalidade de 320 mOsm/kg e foi artificialmente aumen- tado para 430 mOms/kg por meio de alimentação com uma solução de cloreto de sódio (NaCl) aquosa 4 M, desse modo, obtendo a osmolalidade final de 450 mOms/kg. Com respeito ao meio de cultura adicional, a primeira alimentação foi realizada no dia 1 na cultura e uma alimentação adicional foi realizada a cada 3 dias para um total de quatro alimentações. Entre as quatro alimentações, a solução de cloreto de sódio aquosa 4 M foi adicionada uma ou quatro vezes em doses divididas (a osmolalidade é gradualmente aumentada durante o período de cultura) para aumentar a osmolalidade do caldo de cultura. Após a conclusão da cultura, a quantidade de expressão e galactosilação do anticorpo monoclonal foram analisadas e os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2. Mudança na qualidade do anticorpo, de acordo com o ponto no tempo de aumento na osmo alidade *G0F( %) = G0F/(G0F + G1F + G2F)

[084]Como um resultado, conforme mostrado na Tabela 2, houve uma diferença na galactosilação do anticorpo monoclonal, de acordo com o ponto no tempo de alimentação da solução de cloreto de sódio aquosa 4 M. No caso de uma cultura com frasco de agitação, não é fácil ajustar diretamente o oxigênio dissolvido (DO) e o grau de acidez (pH) durante o processo de cultura e, assim, pode não existir uma grande diferença em G0F entre condições experimentais diferentes. Entretanto, na cultura realizada em um biorreator, o oxigênio dissolvido e o grau de acidez podem ser diretamente ajustados e, assim, a diferença em G0F pode ser maximizada.

EXEMPLO 1.2: MUDANÇA NA GALACTOSILAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL, DE ACORDO COM A MUDANÇA NA FAIXA DE AUMENTO NA OSMOLALIDADE

[085]O Exemplo 1.1 mostrou que a galactosilação do anticorpo monoclonal pode variar, de acordo com o ponto no tempo de aumento da osmolalidade de um caldo de cultura. Quando a alimentação da solução de cloreto de sódio aquosa foi realizada na 2a alimentação (dia 4 da cultura) e na 3a alimentação (dia 7 da cultura) de um meio de alimentação adicional, a G0F aumentou maximamente. Adicionalmente, uma cultura de batelada alimentada secundária usando um frasco de agitação foi realizada, de modo a examinar o efeito da diferença no nível de aumento da osmolalidade no caldo de cultura sobre a galactosilação do anticorpo monoclonal. A osmolalidade no estágio da cultura inicial foi de 320 mOsm/kg e a cultura foi realizada por meio da adição de uma quantidade variada de uma solução de cloreto de sódio aquosa 4 M a uma solução de cultura no dia 4 ou dia 7 da cultura, de acordo com o aumento alvejado da osmolalidade em uma maneira similar à cultura com frasco de agitação primária e a quantidade de expressão e galactosilação do anticorpo monoclonal foram analisadas. Tabela 3. Mudança em anticorpo qualidade de acordo com a diferença na faixa de aumento na osmolalidade *G0F( %) = G0F/(G0F + G1F + G2F)

[086]De acordo com o nível aumentado de osmolalidade da solução de cul- tura, a galactosilação do anticorpo monoclonal pareceu variar, de acordo com o nível de aumento na osmolalidade. Quando a osmolalidade do caldo de cultura foi aumentada para 480 mOsm/kg ou mais durante o progresso da cultura, o teor de G0F foi diminuído. Isto é, houve uma faixa apropriada de osmolalidade para aumentar maximamente o teor de G0F do anticorpo monoclonal (aumentado até 400 mOsm/kg a 480 mOsm/kg durante o progresso da cultura).

EXEMPLO 1.3: EXPERIMENTOS DE CONFIRMAÇÃO EM UM BIORREATOR

[087]Como um resultado da realização de experimentos de confirmação em um biorreator com base nos resultados das culturas com frasco de agitação primárias e secundárias, a mudança na galactosilação do anticorpo monoclonal, de acordo com as condições de aumento da osmolalidade, foi confirmada.

[088]A cultura foi realizada depois do aumento intencional da osmolalidade para 440 mOsm/kg, 500 mOsm/kg e 523 mOsm/kg por meio da adição de uma solução de cloreto de sódio (NaCl) aquosa 4 M a um caldo de cultura em um biorreator de 1,4 L com volume de trabalho de 1 L e na 2a alimentação (dia 4 da cultura), res-pectivamente. Tabela 4. Mudança na qualidade do anticorpo, de acordo com a diferença na faixa de aumento na osmolalidade em um biorreator *G0F( %) = G0F/(G0F + G1F + G2F)

[089]Quando a osmolalidade foi aumentada para 500 mOsm/kg ou mais na 2a alimentação (osmolalidade final de 549 mOsm/kg e 567 mOsm/kg), o teor de G0F foi diminuído. Em um experimento em um biorreator onde a osmolalidade foi aumentada para 440 mOsm/kg na 2a alimentação, o teor de G0F foi de 71,8 %.

EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE EXCESSO DE ÍONS AMÔNIO NA SOLUÇÃO DE CULTURA POR MEIO DE ADIÇÃO DE ASPARAGINA

[090]De acordo com os resultados experimentais (Tabela 5), quando um excesso de quantidade de asparagina foi adicionado a uma solução de cultura, a concentração de íons amônio (NH4+) na solução de cultura aumentou significantemente. A galactosilação do anticorpo monoclonal pode ser indiretamente modulada por um método que aumenta a concentração de íons amônio na solução de cultura por meio de adição de um excesso de quantidade de asparagina. Tabela 5. Aumento de amônio, de acordo com a adição de asparagina no caldo de cultura

EXEMPLO 2.1: UMA CULTURA DE BATELADA ALIMENTADA COM ADIÇÃO DE UM CONCENTRADO DE ASPARAGINA

[091]Uma cultura de batelada alimentada foi realizada em uma escala real de 30 mL usando um frasco de agitação de 250 mL. A estratégia de alimentação da cultura de batelada alimentada e o ponto no tempo da adição de uma solução de cloreto de sódio aquosa foram similares àqueles ilustrados na FIG. 3. O concentrado de asparagina foi preparado em uma concentração de 200 mM. O ponto no tempo para a injeção de um meio de cultura adicional foi dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10 da cultura e a adição do concentrado de asparagina foi realizada a cada alimentação a partir do ponto no tempo da 2a alimentação (dia 4 da cultura) (um total de 3 vezes). Após a conclusão da cultura, a quantidade de expressão e galactosilação do anticorpo monoclonal foram analisadas. Tabela 6. Mudança na galactosilação do anticorpo monoclonal, de acordo com a adição de asparagina *G0F( %) = G0F/(G0F + G1F + G2F)

[092]O teor de G0F foi aumentado, conforme asparagina foi adicionada à solução de cultura por meio da alimentação. Conforme a concentração de asparagina adicionada foi aumentada, a concentração final de NH4+ na solução de cultura também foi aumentada. A faixa de aumento do teor de G0F pela injeção de asparagina em um meio de produção 1X foi maior do que aquela em um meio de produção 1,4X. Quando a asparagina é adicionada de uma vez só no início da cultura, a concentração de NH4+ se torna alta a partir do início da cultura e, assim, retarda o crescimento celular e, consequentemente, diminui a quantidade de expressão dos anticorpos finais. Consequentemente, um método para adicionar uma dose dividida de asparagi- na no tempo de alimentação foi utilizado.

EXEMPLO 2.2: ALIMENTAÇÃO DE UM MEIO DE CULTURA ADICIONAL CONTENDO UM EXCESSO DE QUANTIDADE DE ASPARAGINA

[093]Em uma cultura de batelada alimentada usando um biorreator, diferente da cultura de batelada alimentada com frasco de agitação, um concentrado de aspa- ragina não foi preparado separadamente, mas incluído no meio de cultura adicional. Com base no projeto para suplementar um adicional de asparagina 6 mM nas alimentações, um meio de cultura adicional contendo asparagina 120 mM foi preparado e a alimentação foi realizada usando o mesmo. A cultura foi realizada em um biorreator de 1,4 L com volume de trabalho de 1 L e a quantidade de expressão e galactosilação do anticorpo monoclonal foram analisadas. Tabela 7. Experimento do biorreator usando um meio de cultura adicional com adição de um excesso de quantidade de asparagina

[094]A batelada em que um meio de cultura adicional com adição de um excesso de quantidade de asparagina foi usado mostrou um aumento de 10,2 % no teor de G0F. Considerando que a concentração de NH4+ na solução de cultura com adição de um excesso de quantidade de asparagina aumentou em 9,9 mM, a diminuição da galactosilação do anticorpo monoclonal foi confirmada, devido à mudança na concentração de NH4+ na solução de cultura. A osmolalidade aumentou na solução de cultura com a adição de um excesso de quantidade de asparagina em 58 mOsm/kg.

EXEMPLO 3: COMBINAÇÃO DE UM AUMENTO DA OSMOLALIDADE E ADIÇÃO DE ASPARAGINA

[095]A G0F do anticorpo monoclonal pode ser aumentada por meio de um aumento intencional da osmolalidade ou adição de asparagina durante uma cultura de batelada alimentada. O efeito da aplicação combinada do aumento da osmolali- dade e da adição de asparagina sobre a galactosilação do anticorpo monoclonal e isômeros de anticorpos de carga (variantes de carga) foi examinado.

EXEMPLO 3.1: EXPERIMENTO DE UMA APLICAÇÃO SIMULTÂNEA DO AUMENTO DE OSMOLALIDADE E ADIÇÃO DE ASPARAGINA EM UM BIORREATOR

[096]Uma cultura de batelada alimentada foi realizada em um biorreator de 1,4 L com volume de trabalho de 1 L aplicando simultaneamente o aumento da os- molalidade e a adição de asparagina. No caso de um biorreator, em que o aumento da osmolalidade e a adição de asparagina foram simultaneamente aplicados, a os- molalidade de um caldo de cultura foi aumentada até 423 mOsm/kg, considerando o efeito do aumento da osmolalidade pela adição de asparagina (adição de asparagina 120 mM a um meio de cultura adicional). Após a conclusão da cultura, a quantidade de expressão e galactosilação do anticorpo monoclonal foram analisadas. Tabela 8. Mudança na galactosilação por meio de uma aplicação simultânea do aumento de osmolalidade e adição d e asparac ina em um biorreator

[097]A diferença em G0F entre as duas condições diferentes, isto é, uma condição em que apenas a osmolalidade foi aplicada e uma condição em que uma combinação de osmolalidade e asparagina foi aplicada, não foi grande, mas o teor de G0F foi adicionalmente aumentado. Quando asparagina foi adicionada a um caldo de cultura, a porcentagem de isômeros de anticorpos ácidos (variantes ácidas) foi diminuída em comparação ao caldo cultivado sem adição de asparagina (Tabelas 6 e 7). Entretanto, quando uma combinação de osmolalidade e asparagina foi adicionada a um caldo de cultura, os isômeros de anticorpos ácidos (variantes ácidas) foram aumentados.

[098]Para aumentar o teor de G0F, métodos, tais como um aumento da os- molalidade, adição de asparagina e adição de asparagina simultaneamente com um aumento da osmolalidade, podem ser aplicados. Em particular, para aumentar a porcentagem dos isômeros de anticorpos ácidos (variantes ácidas) entre os perfis de carga, assim como o teor de G0F, parece ser mais útil utilizar uma estratégia que aplica o aumento da osmolalidade e a adição de asparagina ao mesmo tempo.

[099]Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que a presente invenção pode ser realizada em outras formas específicas sem divergir de seu espírito ou características essenciais. As formas de realização descritas devem ser consideradas em todos os respeitos apenas como ilustrativas e não restritivas. O escopo da presente invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas ao invés da descrição precedente. Todas as mudanças que ocorrem no significado e faixa de equivalência das reivindicações devem ser abrangidas no escopo da presente invenção.

Claims (10)

1. Método para preparar adalimumabe com galactosilação reduzida CARACTERIZADO pelo fato de que compreende aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células CHO, que expressam adalimumabe, em qualquer dia entre dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10 de uma cultura principal, com base no dia 0 como o início da cultura principal na cultura durante o processo de cultura das células CHO; em que o aumento da osmolalidade é realizado por um método de suple- mentação de cloreto de sódio ou cloreto de potássio à solução de cultura das células CHO; em que a osmolalidade inicial na solução de cultura está na faixa de 320 mOsm/Kg a 365 mOsm/kg; em que o aumento da osmolalidade é realizado para ajustar a osmolalidade final na solução de cultura para estar na faixa de 460 mOsm/Kg a 500 mOsm/Kg; em que a solução de cultura é otimizada para cultivar as células CHO e é selecionada do grupo consistindo em Meio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), meio modificado por IMDM, Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Meio Eagle Basal (BME), meio RPMI 1640, F-10 e F-12; em que a solução de cultura tem um pH de 7,0 a 7,3; e em que o meio modificado por IMDM é um meio consistindo em HEPES, bicarbonato de sódio, glicose, glutamina, cloreto de sódio, insulina, MTX, ácido L- ascórbico, biotina, cloreto de colina, ácido fólico, Sheff CHO mais pf acf (Kerry), ácido bórico, cloreto de cobalto hexa-hidratado, sulfato de cobre penta-hidratado, citrato férrico, cloreto de magnésio anidro, sulfato de manganês mono-hidratado, nitrato de potássio, selenita sódica penta-hidratada, e sulfato de zinco hepta-hidratado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura é realizada por uma cultura de batelada alimentada, uma cultura contínua ou uma cultura de perfusão.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento da osmolalidade é realizado no dia 4 ou dia 7, com base no dia 0 como o início da cultura principal.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é para preparar adalimumabe com galactosilação reduzida.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento da osmolalidade é realizado uma única vez durante o processo de cultura das células CHO que expressam o adalimumabe.

6. Método para reduzir a galactosilação de um adalimumabe CARACTERIZADO pelo fato de que compreende aumentar a osmolalidade de uma solução de cultura de células CHO, que expressam o adalimumabe, em qualquer dia entre dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10 de uma cultura principal, com base no dia 0 como o início da cultura principal na cultura durante o processo de cultura das células CHO; em que o aumento da osmolalidade é realizado por um método de suple- mentação de cloreto de sódio ou cloreto de potássio à solução de cultura das células CHO; em que a osmolalidade inicial na solução de cultura está na faixa de 320 mOsm/Kg a 365 mOsm/kg; em que o aumento da osmolalidade é realizado para ajustar a osmolalidade final na solução de cultura para estar na faixa de 460 mOsm/Kg a 500 mOsm/Kg; em que a solução de cultura é otimizada para cultivar as células CHO e é selecionada do grupo consistindo em Meio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), meio modificado por IMDM, Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Meio Eagle Basal (BME), meio RPMI 1640, F-10 e F-12; em que a solução de cultura tem um pH de 7,0 a 7,3; e em que o meio modificado por IMDM é um meio consistindo em HEPES, bicarbonato de sódio, glicose, glutamina, cloreto de sódio, insulina, MTX, ácido L- ascórbico, biotina, cloreto de colina, ácido fólico, Sheff CHO mais pf acf (Kerry), ácido bórico, cloreto de cobalto hexa-hidratado, sulfato de cobre penta-hidratado, citrato férrico, cloreto de magnésio anidro, sulfato de manganês mono-hidratado, nitrato de potássio, selenita sódica penta-hidratada, e sulfato de zinco hepta-hidratado.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda suplementar asparagina à solução de cultura durante o processo de cultura das células CHO.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento da osmolalidade e a suplementação de asparagina são realizados simultaneamente ou sequencialmente.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a suplementação de asparagina é para suplementar asparagina para ajustar a concentração final de asparagina na solução de cultura de células CHO para estar na faixa de 27,6 mM a 33,6 mM.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é para ajustar a galactosilação do adalimumabe e para ajustar o teor de isômeros de anticorpo ácido do adalimumabe preparado pelo método.