ES2965077T3 - Métodos para modular los perfiles de producción de proteínas recombinantes - Google Patents

Métodos para modular los perfiles de producción de proteínas recombinantes Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para cultivar una célula huésped que expresa una proteína recombinante en un medio de cultivo celular suplementado con alimentos que comprenden cantidades efectivas de ácido valérico, mediante lo cual la viabilidad de las células y la producción de dicha proteína aumentan con respecto a las células cultivadas con alimentos. que no comprende ácido valérico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para modular los perfiles de producción de proteínas recombinantes
Campo de la invención
La invención pertenece al campo del cultivo celular. En particular, el campo de la invención es el cultivo de una célula huésped que expresa una proteína recombinante en un medio de cultivo celular complementado con una alimentación que comprende cantidades eficaces de ácido valérico.
Antecedentes de la invención
En los últimos 20 años, las empresas biofarmacéuticas han hecho muchos esfuerzos por descubrir compuestos que pudieran estimular el crecimiento celular y la productividad de proteínas recombinantes. Muchos autores informaron del efecto positivo de pequeños aditivos sobre la productividad específica, a menudo porque detienen el cultivo celular en G0 [1], que es la fase más importante para la producción. Entre ellos, los ácidos carboxílicos tienen un gran impacto en el comportamiento del cultivo. Se descubrió que inhibían la actividad de HDAC1 (histona desacetilasa 1) [2]. Pero añadir productos químicos al cultivo, incluso si puede aumentar los títulos, a menudo conduce a una calidad reducida. Estos productos químicos también tienen actividades citotóxicas y apoptóticas. Por tanto, muchos enfoques tenían como objetivo comparar diferentes ácidos carboxílicos y estudiar su efecto sobre el título y la calidad para encontrar los menos perjudiciales para las proteínas. Por ejemplo, Park et al. (Biotechnol. J. 2016, 11, 487-496) utilizaron ácido valérico en un medio de cultivo celular en el contexto del cultivo de células recombinantes de ovario de hámster chino (CHO) para procesos de fabricación de anticuerpos recombinantes, y demostraron que inhibiendo el crecimiento celular, pero aumentando la producción de mAb, se obtuvo la "concentración máxima de mAb" (MMC) más alta cuando se añadió ácido valérico al medio de cultivo celular en el día 0 del cultivo celular, es decir, el ácido valérico estaba presente en el medio al inicio del cultivo.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de condiciones de cultivo y métodos de producción que permitan el cultivo seguro de células huésped con una mayor producción de proteínas recombinantes. La presente invención aborda esta necesidad proporcionando métodos y composiciones para aumentar la producción de una proteína recombinante, al mismo tiempo que se mejora la viabilidad de las células huésped.
Sumario de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la densidad de células viables (A); la viabilidad (B); y el título (C) para las células huésped que expresan la proteína P1 cultivadas con diferentes concentraciones de ácido valérico y diferentes tiempos de alimentación. La leyenda de todas las Figuras 1A, 1B y 1C se informa en la Figura 1D.
La Figura 2 muestra la densidad de células viables (A); la viabilidad (B); y el título (C) para las células huésped que expresan el anticuerpo P2 cultivadas con ácido valérico 1,5 mM añadido en diferentes momentos. La leyenda de todas las Figuras 2A, 2B y 2C se muestra en la Figura 2D.
En ambas figuras: AV = ácido valérico y DL = día laborable (es decir, el día del cultivo en donde el cultivo celular se alimenta con ácido valérico)
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la materia de la presente memoria. Tal como se utilizan en la presente memoria, se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la presente invención. El término "comprende" se utiliza generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes. Además, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la expresión "que comprende" puede incluir realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "y/o" utilizado en una frase como "A y/o B" en la presente memoria pretende incluir "A y B", "A o B", "A" y "B".
La expresión "cultivo celular" o "cultivo" se refiere al crecimiento y propagación de célulasin vitro,es decir, fuera de un organismo o tejido. Las condiciones de cultivo adecuadas para las células de mamíferos se conocen en la técnica, tales como las enseñadas en Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies (2005) [3]. Las células de mamífero pueden cultivarse en suspensión o unidas a un sustrato sólido.
Las expresiones "medio de cultivo celular', "medio de cultivo", "medio", y cualquier forma plural de las mismas, se refieren a cualquier medio en donde se pueden cultivar células de cualquier tipo. Un "medio basal" se refiere a un medio de cultivo celular que contiene todos los ingredientes esenciales útiles para el metabolismo celular. Esto incluye, por ejemplo, aminoácidos, lípidos, fuentes de carbono, vitaminas y sales minerales. El medio DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco), RPMI (medio Roswell Park Memorial Institute) o medio F12 (medio F12 de Ham) son ejemplos de medios basales disponibles comercialmente. Alternativamente, dicho medio basal puede ser un medio patentado totalmente desarrollado internamente, también denominado en la presente memoria "medio químicamente definido" o "medio de cultivo químicamente definido", en donde todos los componentes pueden describirse en términos de fórmulas químicas y están presentes a concentraciones conocidas. El medio de cultivo puede estar exento de proteínas y/o exento de suero, y puede complementarse con cualquier compuesto adicional tal como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, dependiendo de las necesidades de las células en cultivo.
Las expresiones "medio de alimentación" o " alimentación " (y el plural de los mismos) se refieren a un medio (o a una composición) utilizado como complemento durante el cultivo para reponer los nutrientes que se consumen y/o para suministrar nutrientes adicionales y/o compuestos adicionales necesarios durante el cultivo celular (por ejemplo, para potenciar o mejorar el crecimiento celular y la producción de proteína recombinante). El medio de alimentación puede ser un medio de alimentación disponible comercialmente o un medio de alimentación patentado (en la presente memoria, alternativamente, medio de alimentación definido químicamente). Cuando a los medios de cultivo sólo se deben suministrar compuestos adicionales específicos, como por ejemplo ácido valérico, la alimentación puede contener sólo este compuesto, preferiblemente en forma líquida.
Las expresiones "biorreactor" o "sistema de cultivo" se refieren a cualquier sistema en donde se pueden cultivar células, tal como en modo continuo, discontinuo o semicontinuo. Este término incluye, entre otros, matraces, matraces estáticos, matraces giratorios, tubos, tubos de agitación, botellas de agitación, bolsas onduladas, biorreactores, biorreactores de fibra, biorreactores de lecho fluidizado y biorreactores de tanque agitado con o sin microportadores. Alternativamente, la expresión "sistema de cultivo" también incluye placas de microtitulación, capilares o placas de múltiples pocillos. Se puede utilizar cualquier tamaño de biorreactor, por ejemplo desde 0,1 mililitros (0,1 ml, escala muy pequeña) hasta 20000 litros (20000 L o 20 kL, gran escala), como 0,1 ml, 0,5 ml, 1 ml, 5 ml, 0,01 L, 0,1 L, 1 L, 2 L, 5 L, 10 L, 50 L, 100 L, 500 L, 1000 L (o 1 kL), 2000 L (o 2 kL), 5000 L (o 5 kL), 10000 L (o 10 kL), 15000 L (o 15 kL) o 20000 L (20 kL).
El término "cultivo semicontinuo" se refiere a un método de cultivo de células, en donde hay un bolo o un aporte continuo del medio de alimentación para reponer los nutrientes que se consumen y/o un aporte de nutrientes adicionales y/o compuestos adicionales necesarios durante el cultivo celular (por ejemplo, para potenciar o mejorar el crecimiento celular y la producción de proteína recombinante). Esta técnica de cultivo celular tiene capacidad para obtener altas densidades celulares, del orden de más de 10*10® a 30*10® células/ml, dependiendo de la formulación del medio, la línea celular y otras condiciones de crecimiento celular. Se puede crear y mantener una condición de cultivo bifásico mediante una variedad de estrategias de alimentación y formulaciones de medios.
Alternativamente, se puede utilizar un cultivo continuo. El cultivo continuo es aquel en donde el cultivo celular recibe medio de alimentación nuevo y al mismo tiempo se retira el medio gastado. El aporte puede ser continuo, escalonado, intermitente o una combinación de cualquiera o de todos ellos. Las tasas de aporte pueden ser desde menos de un volumen de trabajo hasta muchos volúmenes de trabajo por día. Preferiblemente, las células se retienen en el cultivo y el medio gastado que se retira está sustancialmente exento de células o tiene significativamente menos células que el cultivo. El aporte se puede lograr mediante varias técnicas de retención celular que incluyen la centrifugación, sedimentación o filtración [4].
Cuando se utilizan los métodos y/o las técnicas de cultivo celular de la presente invención, las proteínas recombinantes generalmente se secretan directamente en el medio de cultivo. Una vez que dichas proteínas se secretan en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se pueden concentrar primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente.
Como se usa en la presente memoria, la "densidad celular" se refiere al número de células en un volumen determinado de medio de cultivo. La "densidad celular viable" se refiere al número de células vivas en un volumen concreto de medio de cultivo, según lo determinado mediante ensayos de viabilidad estándar. Se considerará que la densidad celular se mantiene si está en el rango de aproximadamente -10% a 10% en comparación con la condición de cultivo de control (es decir, células cultivadas con una alimentación que no contiene ácido valérico ni ningún otro inductor).
Las expresiones "viabilidad" o "viabilidad celular" se refieren a la relación entre el número total de células viables y el número total de células en cultivo. La viabilidad suele ser aceptable siempre que sea al menos del ®0% en comparación con el inicio del cultivo (sin embargo, el umbral aceptable puede determinarse en cada caso). La viabilidad se utiliza a menudo para determinar el momento de la recogida. Por ejemplo, en el cultivo semicontinuo, la recogida se puede realizar una vez que la viabilidad alcanza el ®0% o después de 14 días de cultivo.
La expresión "título" se refiere a la cantidad o concentración de una sustancia, en este caso la proteína recombinante de interés, en disolución. Es una indicación del número de veces que la disolución se puede diluir y aún contener cantidades detectables de la molécula de interés. Se calcula de forma rutinaria, por ejemplo, diluyendo en serie (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc.) la muestra que contiene la proteína de interés y luego utilizando el método de detección apropiado (colorimétrico, cromatográfico, etc.) en cada dilución que se analiza para determinar la presencia de niveles detectables de la proteína de interés. El título también se puede medir con medios como fortéBIO Octet<®>o con Biacore C<®>, como se usa en la sección de ejemplos, o mediante cualquier otro medio conocido por el experto.
Las expresiones "título más alto" o "producción aumentada" y los equivalentes de los mismos significan que el título aumenta en al menos un 10% en comparación con la condición de cultivo de control. El título se considerará mantenido si está en el rango de -10% a 10% en comparación con la condición de cultivo de control. Las expresiones "título más bajo" y equivalentes de los mismos significan que el título disminuye en al menos un 10% en comparación con la condición de cultivo de control (es decir, células cultivadas con alimentaciones que no contienen ácido valérico ni ningún otro inductor).
El término "proteína", como se usa en la presente memoria, incluye péptido y polipéptido, y se refiere a un compuesto que comprende dos o más residuos de aminoácidos. Una proteína según la presente invención incluye, entre otros, una citocina, un factor de crecimiento, una hormona, una proteína de fusión, un anticuerpo o un fragmento de los mismos. Una proteína terapéutica se refiere a una proteína que puede usarse o que se usa en la terapia.
La expresión "proteína recombinante" significa una proteína producida mediante técnicas recombinantes. Las técnicas recombinantes están dentro del conocimiento del experto [5].
El término "anticuerpo", y su forma plural "anticuerpos", incluye, entre otros, anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión al antígeno, tales como F(ab')<2>, fragmentos proteolíticos Fab, y fragmentos de la región variable de cadena sencilla (scFv). También se incluyen anticuerpos o fragmentos intactos modificados genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos o completamente humanos, fragmentos scFv y Fab, así como péptidos y polipéptidos sintéticos de unión al antígeno.
Las expresiones inmunoglobulina "humanizada" (o "anticuerpo humanizado") se refieren a una inmunoglobulina que comprende una región estructural humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (generalmente de ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona la región estructural se denomina "aceptor" (humanización mediante el injerto de CDR no humanas en regiones humanas estructurales y constantes, o incorporando todos los dominios variables no humanos en regiones constantes humanas (quimerización)). No es necesario que estén presentes las regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85-90%, preferiblemente aproximadamente un 95% o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR y unos pocos residuos de la región constante de la cadena pesada si se necesita la modulación de las funciones efectoras, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. A través de la humanización de los anticuerpos, se puede aumentar la semivida biológica y se reduce la posibilidad de reacciones inmunes adversas tras la administración a seres humanos. La expresión inmunoglobulina "completamente humana" (o anticuerpo "completamente humano") se refiere a una inmunoglobulina que comprende tanto una región estructural humana como CDR humanas. No es necesario que estén presentes las regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85-90%, preferiblemente aproximadamente un 95% o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina completamente humana, excepto posiblemente unos pocos residuos de la región constante de la cadena pesada si se necesita la modulación de las funciones efectoras o las propiedades farmacocinéticas, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de la inmunoglobulina humana natural. En algunos casos, se pueden introducir mutaciones de aminoácidos dentro de las CDR, las regiones estructurales o la región constante, para mejorar la afinidad de unión y/o reducir la inmunogenicidad y/o mejorar las propiedades bioquímicas/biofísicas del anticuerpo.
La expresión "anticuerpo recombinante" (o "inmunoglobulina recombinante") significa un anticuerpo producido mediante técnicas recombinantes. Debido a la importancia de las técnicas de ADN recombinante en la generación de anticuerpos, no es necesario limitarse a las secuencias de aminoácidos que se encuentran en los anticuerpos naturales; los anticuerpos pueden rediseñarse para obtener las características deseadas. Las variaciones posibles son muchas y van desde el cambio de solo uno o unos pocos aminoácidos hasta el rediseño completo, por ejemplo, del dominio variable o de la región constante. Los cambios en la región constante, en general, se realizarán con el fin de mejorar, reducir o alterar características, como la fijación del complemento (p. ej., la citotoxicidad dependiente del complemento, CDC), la interacción con los receptores de Fc y otras funciones efectoras (p. ej., la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, ADCC), las propiedades farmacocinéticas (p. ej. la unión al receptor de Fc neonatal; FcRn). Se realizarán cambios en el dominio variable para mejorar las características de unión al antígeno. Además de los anticuerpos, las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de otras formas que incluyen, por ejemplo, las formas de cadena simple o Fv, Fab y (Fab')<2>, así como diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos híbridos multivalentes o multiespecíficos.
El término "porción de anticuerpo" se refiere a un fragmento de una cadena o anticuerpo intacto o de longitud completa, normalmente la región de unión o variable. Dichas porciones, o fragmentos, deben mantener al menos una actividad de la cadena/anticuerpo intacto, es decir, son "porciones funcionales" o "fragmentos funcionales". Si mantienen al menos una actividad, preferiblemente mantienen la propiedad de unión al objetivo. Los ejemplos de porciones de anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos) incluyen, entre otros, "Fv de cadena simple", "anticuerpos de cadena simple", "Fv" o "scFv". Estos términos se refieren a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios variables de las cadenas pesada y ligera, pero carecen de las regiones constantes, todo dentro de una única cadena polipeptídica. Generalmente, un anticuerpo de cadena simple comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que le permite formar la estructura deseada que permitiría la unión al antígeno. En realizaciones específicas, los anticuerpos de cadena simple también pueden ser biespecíficos y/o humanizados.
Un "fragmento Fab" está compuesto por una cadena ligera y los dominios variable y CH1 de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab'" que contiene una cadena ligera y una cadena pesada y que contiene más de la región constante, entre los dominios CH1 y CH2, de modo que se puede formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas, se denomina molécula F(ab')<2>. Un "F (abV contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de modo que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas. Habiendo definido algunos términos importantes, ahora es posible centrar la atención en las realizaciones particulares de la presente invención.
Los ejemplos de anticuerpos conocidos que pueden producirse según la presente invención incluyen, entre otros, adalimumab, alemtuzumab, belimumab, bevacizumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, denosumab, eculizumab, golimumab, infliximab, natalizumab, ofatumumab, omalizumab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, siltuximab, tocilizumab, trastuzumab, ustekinumab o vedolizomab.
Las expresiones "agente inductor", "inductor" o "potenciador de la productividad" se refieren a un compuesto que permite un aumento de la producción de proteínas cuando se añade a cultivos celulares. Por ejemplo, uno de los inductores conocidos para la producción deE. colies el IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido) y los inductores para la producción de CHO son, entre otros, butirato de sodio, doxiciclina o dexametasona.
El término "sujeto" pretende incluir (pero sin limitación) mamíferos tales como seres humanos, perros, vacas, caballos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos o ratas. Más preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
La presente descripción presenta métodos que buscan aumentar la producción de una proteína recombinante evitando al mismo tiempo la disminución de la viabilidad celular durante un período de producción. La presente invención se basa en la optimización de las condiciones de cultivo celular para la fabricación de proteínas, como la producción de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, lo que da como resultado una mayor producción de una proteína recombinante y al mismo tiempo evita la disminución de la viabilidad celular durante un período de producción.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que en condiciones de cultivo celular complementadas durante el proceso de cultivo con ácido valérico, se puede aumentar la producción de una proteína recombinante (es decir, se aumenta el título) y se evita una disminución sustancial o significativa de la viabilidad celular durante un período de producción. Así, durante el ciclo de producción del cultivo celular, cuando es deseable aumentar el título de una proteína recombinante que se está produciendo, el cultivo celular puede complementarse con al menos una alimentación que comprende o consiste en ácido valérico. De hecho, los cultivos celulares complementados con ácido valérico en al menos una alimentación, en diferentes concentraciones y tiempos, proporcionaron (1) un porcentaje significativamente mayor de células G0/G1 y (2) un aumento del título, en comparación con un cultivo celular similar no complementado con ácido valérico.
El ácido valérico, o ácido pentanoico, es un ácido alquilcarboxílico de cadena lineal con la fórmula química C<5>H<10>O<2>.
En un aspecto, la invención proporciona un método para la producción de una proteína recombinante, y dicho método comprende cultivar una célula huésped de mamífero que expresa dicha proteína recombinante en un medio de cultivo celular complementado, el día 5 después del inicio del cultivo, con al menos una alimentación que comprende una cantidad eficaz de ácido valérico, en donde la concentración del complemento de ácido valérico en el medio de cultivo celular es de aproximadamente 1 mM a 2 mM.
La expresión "cantidad eficaz de ácido valérico" corresponde a la cantidad de ácido valérico añadida a un cultivo celular (o a un medio de cultivo celular) como complemento (es decir, una alimentación que consiste únicamente en ácido valérico en forma líquida) o como componente de la alimentación (es decir, junto con los nutrientes necesarios para el cultivo celular), que aumentará la expresión de la proteína recombinante en las células huésped, y posiblemente también aumentará o al menos mantendrá la viabilidad celular, en una cantidad detectable en comparación con células huésped similares cultivadas sin ácido valérico en las alimentaciones. El ácido valérico no está presente ni se añade a un medio de cultivo celular al inicio del cultivo. El ácido valérico se añade preferentemente a un cultivo celular (o a un medio de cultivo celular), como complemento o como componente de la alimentación, a una concentración de aproximadamente 1,5 mM. En algunas realizaciones, la concentración de ácido valérico puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM (concentración de ácido valérico una vez en el medio de cultivo del sistema de cultivo). Por ejemplo, pero no a modo de limitación, ajustando la concentración de ácido valérico se puede modular (es decir, aumentar) la producción de la proteína recombinante secretada.
Como se usa en la presente memoria, la frase "la viabilidad celular no disminuye sustancial o significativamente", cuando se compara con células cultivadas sin ácido valérico o cualquier otro inductor, significa que la viabilidad celular no disminuye más de aproximadamente un 15% en comparación con los cultivos de control (es decir, las células cultivadas con nutrientes que no contienen ácido valérico ni ningún otro inductor).
Para los fines de esta invención, el medio de cultivo celular es un medio adecuado para el crecimiento de células animales, tales como células de mamíferos, en el cultivo celularin vitro.Las formulaciones de los medios de cultivo celular son muy conocidas en la técnica. Los medios de cultivo celular pueden complementarse con componentes adicionales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas y factores de crecimiento, según las necesidades de las células en cultivo.
Preferiblemente, los medios de cultivo celular están exentos de componentes animales; pueden estar exentos de suero y/o exentos de proteínas.
En el contexto de la invención en su conjunto, el medio de cultivo celular se complementa con ácido valérico de forma semicontinua o de forma continua, preferentemente de manera semicontinua. La adición de un complemento de ácido valérico puede basarse en el título intermedio medido.
En una realización de la presente invención en su conjunto, la célula huésped es una célula huésped de mamífero (también denominada en la presente memoria célula de mamífero) que incluye, entre otras, líneas celulares HeLa, Cos, 3T3, de mieloma (por ejemplo NS0, SP2/0) y células de ovario de hámster chino (CHO), como las células CHO-S y las células CHO-k1. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de ovario de hámster chino (CHO), tal como una célula CHO-S y una célula CHO-k1.
En el contexto de la invención en su conjunto, la célula de mamífero recombinante se cultiva en un sistema de cultivo tal como un biorreactor. El biorreactor se inocula con células viables en un medio de cultivo. Dicho medio de cultivo se complementa con ácido valérico tras el inicio del cultivo, preferentemente cuando las células han alcanzado la fase estacionaria. Preferiblemente, el medio de cultivo está exento de suero y/o de proteínas. Una vez inoculadas en el biorreactor de producción, las células recombinantes pasan por una fase de crecimiento exponencial. La fase estacionaria (es decir, la fase de producción) se puede mantener usando un proceso semicontinuo con alimentación(es) en bolo de un medio de alimentación complementado con ácido valérico o de una alimentación que consiste únicamente en ácido valérico en forma líquida. Preferiblemente, los nutrientes están exentos de suero y/o de proteínas. La alimentación en bolo complementaria normalmente comienza poco después de que las células se inoculen en el biorreactor, en un momento en donde se anticipa o determina que el cultivo celular necesita la alimentación. Por ejemplo, las alimentaciones complementarias que comprenden o consisten en ácido valérico pueden comenzar en o alrededor del día 6 o 7 del cultivo. El cultivo puede recibir una, dos, tres o más alimentaciones en bolo que comprenden o consisten en ácido valérico durante la fase de crecimiento. La complementación con ácido valérico se puede realizar de forma semicontinua y/o continua. El medio de cultivo puede comprender un azúcar, como por ejemplo glucosa, o estar complementado con un azúcar, como por ejemplo glucosa. Dicha complementación con azúcar puede realizarse al inicio del cultivo, en forma semicontinua y/o continua.
El método según la presente invención se puede utilizar en la presente descripción que no forma parte de la invención para mejorar la producción de proteínas recombinantes en procesos de cultivo de múltiples etapas. En un proceso de múltiples etapas, las células se cultivan en dos o más fases distintas. Por ejemplo, las células se cultivan primero en una o más fases de crecimiento, en condiciones que mejoran la proliferación y viabilidad celular, y luego se transfieren a la(s) fase(s) de producción, en condiciones que mejoran la producción de proteínas. En un proceso de cultivo de varias etapas, algunas condiciones pueden cambiar de una etapa (o una fase) a otra: composición del medio, cambio de pH, cambio de temperatura, etc. La fase de crecimiento se puede realizar a una temperatura más alta que en la fase de producción. Por ejemplo, la fase de crecimiento se puede realizar a una primera temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 38 °C, y luego la temperatura se cambia para la fase de producción a una segunda temperatura de aproximadamente 29 °C a aproximadamente 37 °C, preferiblemente de aproximadamente 34 °C a aproximadamente 36,5 °C. Los cultivos celulares se pueden mantener en la fase de producción durante días o incluso semanas antes de la recogida.
Las líneas celulares (también denominadas "células recombinantes" o "células huésped") utilizadas en la invención están diseñadas genéticamente para expresar una proteína de interés comercial o científico. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos y vectores para la ingeniería genética de células y/o líneas celulares para expresar un polipéptido de interés; por ejemplo, se ilustran diversas técnicas en Ausubel et al. (1988 y actualizaciones; [6]) o Sambrook et al. (1989 y actualizaciones; [5]). Los métodos de la invención se pueden usar en la presente descripción que no forma parte de la invención para cultivar células que expresan proteínas recombinantes de interés. Las proteínas recombinantes normalmente se secretan en el medio de cultivo del que pueden recuperarse. Las proteínas recuperadas pueden entonces purificarse, o purificarse parcialmente, usando procesos y productos conocidos disponibles de proveedores comerciales. Las proteínas purificadas pueden entonces formularse como composiciones farmacéuticas. Las formulaciones adecuadas para las composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences (1995 y actualizaciones; [7]). En el contexto de la invención en su conjunto, la proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, tal como un anticuerpo humano (o completamente humano) o porción de unión al antígeno del mismo, un anticuerpo humanizado o porción de unión al antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico o porción de unión al antígeno del mismo, una proteína de fusión, un factor de crecimiento, una hormona o una citocina. Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente memoria es susceptible de variaciones y modificaciones distintas a las específicamente descritas.
La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Materiales y métodos
I. Células, expansión celular y crecimiento celular
1) Células
Los ensayos se realizaron con 2 líneas de células CHO:
- Células CHO-S que expresan una proteína de fusión P1, en la presente memoria "Células P1". "P1" es una proteína de fusión IgG1, que comprende una parte dirigida contra una proteína de membrana (parte IgG) unida a una segunda parte dirigida contra una proteína inmunitaria soluble. Su punto isoeléctrico (pl) es aproximadamente 6,3-7,0.
- Células CHO-K1 que expresan un anticuerpo monoclonal P2, en la presente memoria "Células P2". "P2" es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra un receptor que se encuentra en la membrana celular. Su punto isoeléctrico (pl) es aproximadamente 9,20-9,40.
2) Expansión celular
La expansión celular se realizó en tubos en un medio adecuado para la expansión celular. Los ensayos en los cultivos semicontinuos comenzaron después de al menos una semana de expansión.
3) Inoculación
Las células que expresaban tanto P1 como P2 se inocularon a 0,2x106 células viables por mililitro (ml).
4) Condiciones de cultivo semicontinuo
Todos los ensayos se realizaron en cultivo semicontinuo. Las células huésped se cultivaron en un sistema semicontinuo, ya sea en microplacas ("Placa de pocillos profundos", "DWP") o en tubos Spin®, y se incubaron a 36,5 °C, 90% de humedad relativa, 5% de CO<2>y agitación a 320 rpm durante 14 días.
Se preparó una disolución madre de ácido valérico en un medio patentado de producción estándar. La concentración de ácido valérico de esta disolución madre fue de 195 mM. La disolución madre se usó para complementar los medios para probar diferentes concentraciones de ácido valérico desde el comienzo del cultivo (día 0; concentraciones probadas: 1, 1,5 y 2 mM). La disolución también se usó como alimentación para aportar el ácido valérico al cultivo en diferentes momentos durante el cultivo semicontinuo (día 3, 4, 5 o 7). Cuando la disolución se usó como alimentación, la concentración objetivo en el cultivo fue siempre 1,5 mM.
II. Métodos analíticos
La densidad de células viables y la viabilidad se midieron con el citómetro de flujo Guava easyCyte® o con el ViCell. Los títulos de anticuerpos se midieron con un aparato fortéBIO Octet® o Biacore C®.
Resultados
a.Experimentos con células P1
Para comprender mejor la capacidad del ácido valérico para los cultivos semicontinuos, se probó la complementación en los medios (en el momento "0") o por separado en las alimentaciones (en diferentes momentos, es decir, los días 3, 4, 5 o7).El crecimiento celular se vio significativamente afectado.
Se utilizaron diferentes concentraciones en el día 0. Cuanto mayor fue la concentración, menor fue la densidad máxima de células viables (Figura 1A). La viabilidad se mantuvo durante más tiempo que en el experimento de control, pero debido a la baja densidad celular el título final no mejoró (Figuras 1B y 1C).
Cuando se añadió ácido valérico en diferentes días de alimentación, ya al día siguiente se pudo observar un efecto evidente. La tasa de crecimiento celular se ralentizó cuando se añadió ácido valérico en el día 3, pero se mantuvo en general cuando se añadió ácido valérico en los días 5 o 7, en comparación con el control (Figura 1A). Sin embargo, como se muestra en la Figura 1B, esto no tuvo impacto en la viabilidad celular hasta el día 11. A partir del día 12, la viabilidad del cultivo se prolongó en comparación con los experimentos de control. Como se muestra en la Figura 1C, aunque la tasa de crecimiento celular cuando se añadió ácido valérico en el día 3 fue menor que la del control, el título se vio afectado positivamente por la adición de ácido valérico (Figura 1C). Este impacto positivo se observó cualquiera que fuera el día en que se añadió ácido valérico. En el día 12, por ejemplo, el aumento del título fue de aproximadamente el 20% para el ácido valérico en el día 3 o 7 y de aproximadamente el 30% para el ácido valérico en el día 5, en comparación con el control. El diámetro celular también pareció verse afectado (datos no mostrados) y estuvo relacionado con la productividad específica. Si se favoreciera que las células permanecieran en un estado G0/G1, es probable que dirigieran una mayor parte de su consumo de energía hacia la producción de proteínas.
En este experimento pareció claro que la adición de ácido valérico al medio en el día 0 no mejoró la productividad del proceso. Por el contrario, la adición de ácido valérico en este momento tuvo un impacto muy negativo tanto en la densidad celular como en el título. En cuanto a la adición como alimentación, el momento de la adición pareció desempeñar un papel importante y se investigó más a fondo.
b. Experimentos con células P2
En este experimento se probó la adición de ácido valérico 1,5 mM al cultivo los días 03, 04 o 05. Para este experimento se utilizó una línea celular CHO-k1 (células P2) para confirmar que el ácido valérico tiene el mismo efecto que en las células CHO-S (células P1 como se analizó en el punto a.).
La densidad máxima de células viables disminuyó cuando el ácido valérico se añadió más pronto durante el cultivo, en comparación con el control (Figura 2A). Sin embargo, esto no tuvo ningún impacto en la viabilidad celular, en comparación con el control (Figura 2B). En cuanto al experimento previo con células P1, la viabilidad se mantuvo en comparación con el control hasta el día 12 y luego se prolongó en comparación con el cultivo de control, a partir del día 13. Esta observación fue independiente del momento de la adición del ácido valérico. Además, aunque el título fue comparable al control hasta el día 12, a partir del día 13, el título continuó aumentando en comparación con el control (Figura 2C). Por ejemplo, el día 17, el título aumentó aproximadamente un 25% para el ácido valérico en el día 3 o 7 y aproximadamente un 35% para el ácido valérico en el día 5, en comparación con el control. El resultado fue que las células pudieron producir durante un período más largo y el experimento podría prolongarse aún más (hasta el día 20). En este ejemplo, la mejora de la productividad se volvió significativa después del día 17 y se obtuvieron casi 5 g/l con las condiciones óptimas, en lugar de 0,9 g/l para el cultivo de control sin ácido valérico (datos no mostrados).
Conclusiones
Los inventores han demostrado que la adición de ácido valérico al medio en el día 0 no mejoró la productividad del proceso. Por el contrario, la adición de ácido valérico en este momento tuvo un impacto muy negativo tanto en la densidad celular como en el título. Sin embargo, sorprendentemente han demostrado que cuando se añade ácido valérico como alimentación en el día 3 o después, se puede aumentar el título, sea cual sea la línea celular o la molécula que se va a producir. A medida que se prolonga la viabilidad, las células son capaces de producir durante un período más largo, aumentando aún más el nivel de producción de proteínas, como los anticuerpos. La concentración exacta de ácido valérico que se añadirá a los medios de cultivo celular deberá determinarse caso por caso, aunque parece muy prometedora una concentración de 1,5 mM. Esta determinación se puede realizar sin implicar ninguna habilidad inventiva, basándose en las enseñanzas de la presente invención. El experto también entenderá que puede usar ácido valérico en cualquier método para producir cualquier proteína tal como un anticuerpo o proteínas de fusión.
Referencias
[1] M. Butler, "Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals", págs. 283-291, 2005.
[2] G. Bora-tatar, D. Dayangag-erden, A. S. Demir, S. Dalkara, y K. Yelekgi, "Bioorganic & Medicinal Chemistry Molecular modifications on carboxylic acid derivatives as potent histone deacetylase inhibitors: Activity and docking studies", Bioorg. Med. Chem., vol. 17, n°. 14, págs. 5219-5228,2009.
[3] Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Sadettin Ozturk, Wei-Shou Hu, ed., CRC Press (2005).
[4] Voisard et al., 2003, Biotechnol. Bioeng. 82:751-765.
[5] Sambrook et al., 1989 y actualizaciones, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press.
[6] Ausubel et al., 1988 y actualizaciones, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Wiley & Sons, Nueva York.
[7] Remington's Pharmaceutical Sciences, 1995, 18a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la producción de una proteína recombinante, y dicho método comprende cultivar una célula huésped de mamífero que expresa dicha proteína recombinante en un medio de cultivo celular complementado, en el día 5 después del inicio del cultivo, con al menos una alimentación que comprende una cantidad eficaz de ácido valérico, en donde la concentración del complemento de ácido valérico en el medio de cultivo celular es de aproximadamente 1 mM a 2 mM.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
3. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, tal como un anticuerpo humano o una porción de unión al antígeno del mismo, un anticuerpo humanizado o una porción de unión al antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico o una porción de unión al antígeno del mismo, una proteína de fusión recombinante, un factor de crecimiento, una hormona o una citoquina.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la concentración del complemento de ácido valérico en el medio de cultivo celular es de aproximadamente 1,5 mM.
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